CN111971294A

CN111971294A - 使用芽孢杆菌系统产生肉毒神经毒素

Info

Publication number: CN111971294A
Application number: CN201980016806.0A
Authority: CN
Inventors: 董民; 陶亮
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-11-20
Also published as: KR20200115584A; CA3089834A1; EP3746464A1; WO2019152380A1; US20210040467A1; JP2021517825A

Abstract

本文中描述了包含编码肉毒神经毒素(BoNT)的核苷酸序列的芽孢杆菌(Bacillus)细胞和产生所述BoNT的方法。

Description

使用芽孢杆菌系统产生肉毒神经毒素

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年1月30日提交且标题为“PRODUCTIONOF BOTULINUM NEUROTOXINS USING BACILLUS SYSTEMS”的美国临时申请No.62/623715的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

肉毒神经毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生的致死性毒素。这些毒素可特异性地靶向多种脊椎动物的神经元末端，阻断神经元递质释放，并引起通常称为“肉毒中毒(botulism)”的松弛性瘫痪。BoNT的神经元阻断活性可用于治疗性目的，尤其是用于神经元相关疾病，例如睑痉挛、斜视、上运动神经元综合征、发汗(sweating)、颈肌张力障碍和慢性偏头痛。BoNT还广泛用于化妆品工业。

发明内容

本公开内容的一些方面提供了在芽孢杆菌(Bacillus)中重组产生肉毒神经毒素(BoNT)的方法，该方法包括在适合于表达BoNT的条件下培养包含编码BoNT的核苷酸序列的芽孢杆菌细胞。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列在表达载体中。在一些实施方案中，表达载体选自：pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT 255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC-His1622、pC-Strep1622、pN-His-TEV1622、pN-Strep-TEV1622、pN-StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC-HIS1623hp、pN-His-TEV1623hp、pSP-LipA-hp、pSP-YocH-hp、p3STOP1623-2RBShp、pC-STREP1623hp、pN-STREP-Xa1623hp、pN-STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7-SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE-S和pRB374。

在一些实施方案中，BoNT在N或C端与融合结构域融合。在一些实施方案中，融合结构域是亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌中表达。

在一些实施方案中，BoNT选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En，及其变体。在一些实施方案中，BoNT是非催化活性BoNT。在一些实施方案中，BoNT是全长BoNT。在一些实施方案中，BoNT是嵌合BoNT。在一些实施方案中，BoNT包含与SEQ ID NO二1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BoNT包含SEQID NO：1至139中任一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，该方法还包括将编码BoNT的核苷酸序列递送到芽孢杆菌细胞中。在一些实施方案中，通过转化、转导、缀合和电穿孔来递送编码BoNT的核苷酸序列。

在一些实施方案中，该方法还包括从芽孢杆菌细胞中纯化BoNT。在一些实施方案中，通过亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、或其组合来纯化BoNT。

在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是野生型细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是经改造的细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌是蛋白酶缺陷型芽孢杆菌细胞。

本公开内容的另一些方面提供了包含编码肉毒神经毒素(BoNT)的核苷酸序列的芽孢杆菌细胞。在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌中表达。在一些实施方案中，BoNT选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En，及其变体。在一些实施方案中，BoNT是非催化活性BoNT。在一些实施方案中，BoNT是全长BoNT。在一些实施方案中，BoNT是嵌合BoNT。在一些实施方案中，BoNT包含与SEQ ID NO：1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BoNT包含SEQ ID NO：1至139中任一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞选自：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌以及短芽孢杆菌。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是野生型细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是经改造的细胞。在一些实施方案中，芽孢杆菌是蛋白酶缺陷型芽孢杆菌细胞。

附图说明

附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在不同的图中示出的每个相同或几乎相同的组分由相同的数字表示。出于清楚的目的，并非每个组分均可在每个附图中进行标记。在附图中：

图1：细菌界的有根系统发育树。埃希菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属和梭菌属(Clostridium)用框突出显示。芽孢杆菌属和梭菌属属于厚壁菌门(Firmicute phylum)。

图2A至2B：图2A：BoNT/A(左)和BoNT/B(右)的表面电荷分析。图2B：BoNT/A(左)和BoNT/B(右)的表面疏水性分析。

图3：示出了iBoNT/B在大肠杆菌(E.coli)中的表达模式的Western印迹。抗BoNT/B多克隆抗体用于检测。

图4A至4B：图4A：iBoNT/B在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的表达模式的Western印迹。图4B：从枯草芽孢杆菌中纯化iBoNT/B。示出了SDS-PAGE和WB二者。抗BoNT/B多克隆抗体用于WB。

图5：来自枯草芽孢杆菌的经纯化的iBoNT/A、iBoNT/B、iBoNT/C和iBoNT/D用SDS-PAGE示出。

具体实施方式

肉毒神经毒素(BoNT)是由肉毒梭菌产生的致死性毒素。这些毒素可特异性地靶向多种脊椎动物的神经元末端，阻断神经元递质释放，并引起通常称为“肉毒中毒(botulism)”的松弛性瘫痪。在另一方面，所述毒素的这种特性可用于治疗性目的，尤其是用于神经元相关疾病。自20世纪60年代开始，已探究了BoNT在治疗神经元疾病中的效力，并且BoNT现已广泛用于治疗多种神经元疾病，包括但不限于睑痉挛、斜视、上运动神经元综合征、发汗、颈肌张力障碍和慢性偏头痛。BoNT还广泛用于化妆品工业。在1989年12月，BOTOX(首个BoNT产品)被美国食品与药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床治疗。

用于医学和化妆品目的的所有商业BoNT产品均从其天然宿主肉毒梭菌(C.botulinum)中纯化。该过程耗时且昂贵。此外，肉毒梭菌中的遗传操作极为困难，这一直是开发经改造全长BoNT的障碍。大肠杆菌(Escherichia coli)细胞是用于表达经改造蛋白质的最常用细菌宿主。在测试大肠杆菌中BoNT的表达和产生之后，发现大肠杆菌缺乏良好表达大蛋白质(如BoNT，尤其是某些亚型和经改造/嵌合的毒素)的能力，这可能是大规模工业生产的障碍。

本文中提供了包含编码肉毒神经毒素(BoNT)的核苷酸序列的芽孢杆菌细胞，以及在适合于表达BoNT的条件下通过培养所述芽孢杆菌细胞来产生BoNT的方法。

本文中所述的“肉毒神经毒素(BoNT)”是指通过阻断神经递质从神经元释放而发挥作用从而引起瘫痪的细菌毒素家族。本文中所述的术语“BoNT”涵盖由肉毒梭菌和由其他细菌物种产生但在结构和功能上属于BoNT家族的神经毒素及其任意片段或变体。由肉毒梭菌产生的BoNT包括八种主要血清型：BoNT/A-G(例如，如Schiavo et al.，Physiol Rev 80，717-766(2000)中所述，其通过引用并入本文)，和BoNT/X(例如，如Zhang et al.，NatureCommunications，8，Article number：14130(2017)中所述，其通过引用并入本文)。每个BoNT血清型均可具有亚型。例如，BoNT/A具有8种亚型：BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5、BoNT/A6、BoNT/A7和BoNT/A8。类似地，BoNT/B也具有8种亚型：BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7和BoNT/B8。已发现，除肉毒梭菌之外的细菌物种也产生属于BoNT家族(即具有与由肉毒梭菌产生的BoNT相似的结构或功能)的神经毒素。例如，在屎肠球菌(Enterococcus faecium)中鉴定出BoNT家族神经毒素并将其命名为“BoNT/En”(例如，如Zhang et al.，2018，Cell Host and Microbe，23：1-8，Doi：10.1016/j.chom.2017.12.018中所述，其通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，BoNT是全长BoNT。与野生型BoNT相比，“全长”BoNT是指不具有任何截短的BoNT。与野生型BoNT相比，全长BoNT可包含另一些类型的突变，例如，氨基酸替换或融合结构域。在一些实施方案中，BoNT是天然存在的野生型BoNT，例如，本文中所述和本领域已知的任一种BoNT。在一些实施方案中，BoNT是野生型BoNT的变体。先前已经描述了BoNT变体。例如，具有增强的与靶细胞的结合的BoNT变体描述于PCT申请公开WO2017214447中，其通过引用并入本文。在另一个实例中，BoNT是非催化活性的变体，例如，如PCT申请公开WO 2018009903中所述，其通过引用并入本文。

BoNT包含通过接头区域连接的重链(本文中称为“BoNT-HC”)和轻链(本文中称为“BoNT-LC”)。当BoNT被加工成其成熟形式时，在接头区域中发生蛋白水解切割。BoNT-LC包含切割BoNT底物的蛋白酶结构域，而BoNT-HC包含介导BoNT进入细胞的重链N端(H_N)易位结构域和重链C端(H_C)受体结合结构域。已显示嵌合BoNT可发挥天然存在的BoNT的功能。“嵌合BoNT”是指包含来自不同BoNT血清型的结构域的BoNT。在一些实施方案中，嵌合BoNT可包含来自一种BoNT(例如，BoNT/A-G、BoNT/X和BoNT/En中的任一种)的蛋白酶结构域(LC)和易位结构域(H_N)以及来自不同BoNT(例如，来自BoNT/A-G、BoNT/X和BoNT/En中的任一种，LC和H_N所来自的那些除外)的受体结合结构域(H_C)。在一些实施方案中，嵌合BoNT包含另一些变异，例如氨基酸替换。一些非限制性的示例性嵌合BoNT提供于表1中。

在一些实施方案中，使用本文中所述方法产生的BoNT包含与SEQ ID NO二1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，使用本文中所述方法产生的BoNT包含SEQID NO二1至139中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，使用本文中所述方法产生的BoNT由SEQ ID NO：1至139中任一个的氨基酸序列组成。可使用本文中所述方法产生的BoNT的一些非限制性的示例性氨基酸序列提供于表1中。

在一些实施方案中，BoNT在N或C端与融合结构域融合。“融合结构域”是指通过酰胺键附加(append)至BoNT的多肽序列。在一些实施方案中，融合结构域是亲和标签。本文中使用的“亲和标签”是指可与物质或部分特异性结合的多肽序列，例如，包含与Ni²⁺特异性结合的六个组氨酸的标签。可将亲和标签附加至蛋白质以促进其分离。亲和标签通常通过本领域技术人员已知的重组DNA技术与蛋白质融合。使用亲和标签以促进蛋白质分离在本领域也是公知的。根据本公开内容可使用的合适的亲和标签包括但不限于His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

本公开内容的另一些方面提供了编码本文中所述的BoNT的核苷酸序列。“核苷酸序列”是共价连接在一起的至少两个核苷酸，并且在一些情况下，可包含磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“骨架”)。核苷酸序列可以是DNA(基因组和/或cDNA二者)、RNA或杂交体，其中核苷酸序列包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如，人工或天然)的任意组合，以及碱基的任意组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与SEQ ID NO：1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％同一性。在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与SEQ ID NO：1至139中任一个具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌细胞中表达。密码子优化方法是本领域已知的，并且可如本文中所提供的使用。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏好GC含量以提高mRNA稳定性或减少二级结构；使可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行(base run)最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；在所编码蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或移动(shuffle)蛋白质结构域；插入或缺失限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以使蛋白质的多个结构域正确折叠；或者以降低或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务器是本领域已知的-一些非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(MenloPark CA)和/或专有方法的服务器。在一些实施方案中，使用优化算法对开放阅读框(open reading frame，ORF)序列进行优化。

在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码BoNT的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％或小于60％序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码BoNT的天然存在或野生型mRNA序列)共享60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。“启动子”是指核苷酸序列的控制区，在该区域核苷酸序列的其余部分的转录的起始和速率被控制。启动子驱动表达或驱动其调节的核苷酸序列的转录。启动子还可包含亚区域(sub-region)，在该区域调节蛋白和调节分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合。启动子可以是组成型的、诱导型的、激活型的、阻遏型的、组织特异性的或其任意组合。当启动子相对于其调节的核苷酸序列处于正确的功能位置和取向以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，该启动子被认为是“可操作地连接的”。

启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5’非编码序列来获得。这样的启动子可被称为“内源性的”。

在一些实施方案中，编码核苷酸序列可置于重组或异源启动子的控制下，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常与所编码的序列无关的启动子。这样的启动子可包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；以及非“天然存在的”合成启动子或增强子，例如如包含不同转录调节区的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变的启动子或增强子。除合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)来产生序列(参见美国专利No.4,683,202和美国专利No.5,928,906)。

在一些实施方案中，启动子是“诱导型启动子”，其是指特征在于当存在诱导物信号时、受诱导物信号影响时或与诱导物信号接触时调节(例如，起始或激活)转录活性的启动子。诱导物信号可以是以某种方式接触诱导型启动子以在调节诱导型启动子的转录活性中具有活性的内源性或正常的外源性条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质。因此，核酸的“调节转录的信号”是指作用于诱导型启动子的诱导物信号。调节转录的信号可激活转录或使其失活，这取决于所使用的调节系统。转录的激活可包括直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏物失活来间接作用于启动子。相反地，转录的失活可包括直接作用于启动子以阻止转录，或通过激活随后作用于启动子的阻遏物来间接作用于所述启动子。在一些实施方案中，在细胞状态分类器的遗传回路中使用诱导型启动子导致基因产物的条件性表达或“延迟”表达。

诱导物信号的施用或去除导致可操作连接的核苷酸序列转录的激活与失活之间的转换。因此，与核苷酸序列可操作地连接的启动子的激活状态是指当启动子主动调节核苷酸序列的转录(即，表达所连接的核苷酸序列)时的状态。相反地，与核苷酸序列可操作地连接的启动子的失活状态是指当启动子不主动调节核苷酸序列的转录(即，不表达所连接的核苷酸序列)时的状态。

本公开内容的诱导型启动子可通过一种或更多种生理条件，例如光、pH、温度、辐射、渗透压、盐梯度、细胞表面结合的变化，和一种或更多种外在或内在诱导剂的浓度来诱导(或抑制)。外在诱导物信号或诱导剂可包括但不限于氨基酸和氨基酸类似物、糖类和多糖、核酸、蛋白质转录激活物和阻遏物、细胞因子、毒素、基于石油的化合物、含金属的化合物、盐、离子、酶底物类似物、激素、或其组合。

本公开内容的诱导型启动子包括本文中所述或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的一些实例包括但不限于化学/生物化学调节和物理调节的启动子，例如醇调节的启动子；四环素调节的启动子(例如，脱水四环素(anhydrotetracycline，aTc)响应性启动子和另一些四环素响应性启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白(tetR)、四环素操纵基因序列(tetO)和四环素反式激活蛋白融合蛋白(tTA))；类固醇调节的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮素受体的启动子以及来自类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)；金属调节的启动子(例如，来源于来自酵母菌、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和螯合金属离子的蛋白质)基因的启动子)；发病机制调节的启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)诱导的)；温度/热诱导型启动子(例如，热激启动子)和光调节的启动子(例如，来自植物细胞的光响应性启动子)。

在一些实施方案中，本公开内容的诱导物信号是N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)，其是参与细菌群体感应的一类信号传导分子。群体感应是细菌之间通信的方法，其使得能够根据群体密度协调基于群体的行为。AHL可跨细胞膜扩散并且在一定的pH值范围内在生长培养基中稳定。AHL可与转录激活物例如LuxR结合并刺激来自同源启动子的转录。

在一些实施方案中，本公开内容的诱导物信号是脱水四环素(aTc)，其是不表现出抗生素活性并被设计成例如在细菌中与四环素控制基因表达系统一起使用的四环素衍生物。

在一些实施方案中，本公开内容的诱导物信号是异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，其是别乳糖的分子模拟物，是触发乳糖操纵子转录的乳糖代谢物，并且因此被用于诱导其中基因在乳糖操纵基因的控制之下的蛋白质表达。IPTG与乳糖阻遏物结合，并以别构方式从乳糖操纵基因释放四聚体阻遏物，从而允许乳糖操纵子中的基因(例如编码β-半乳糖苷酶(催化β-半乳糖苷水解为单糖的水解酶)的基因)的转录。硫(S)原子产生细胞不可水解的化学键，从而防止细胞代谢或降解诱导物。IPTG(例如，浓度为100μM至1.0mM)是蛋白质表达的有效诱导物。使用的浓度取决于所需的诱导强度，以及所使用的细胞或质粒的基因型。如果存在过量产生乳糖阻遏物的突变体lacIq，则可能需要更高浓度的IPTG。在蓝白筛选(blue-white screen)中，IPTG与X-gal一起使用。蓝白筛选允许在克隆实验中鉴定出已用重组质粒而不是非重组质粒转化的菌落。

另一些诱导型启动子系统是本领域已知的，并且可根据本公开内容使用。

在一些实施方案中，本公开内容的诱导型启动子来自原核细胞(例如，细菌细胞)。用于原核细胞的诱导型启动子的一些实例包括但不限于噬菌体启动子(例如，Pls1con、T3、T7、SP6、PL)和细菌启动子(例如，Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac、Pm)，或其杂交体(例如，PLlacO、PLtetO)。根据本公开内容使用的细菌启动子的一些实例包括但不限于正调节大肠杆菌启动子，例如正调节σ70启动子(例如，诱导型pBad/araC启动子、Lux盒右侧启动子(Lux cassette right promoter)、经修饰的λPrm启动子、plac Or2-62(正)、具有额外REN位点的pBad/AraC、pBad、P(Las)TetO、P(Las)CIO、P(Rhl)、Pu、FecA、pRE、cadC、hns、pLas、pLux)、σS启动子(例如，Pdps)、σ32启动子(例如，热激)和σ54启动子(例如，glnAp2)；负调节大肠杆菌启动子，例如负调节σ70启动子(例如，启动子(PRM+)、经修饰的λPrm启动子、TetR-TetR-4CP(Las)TetO、P(Las)CIO、P(Lac)IQ、RecA_DlexO_DLacO1、dapAp、FecA、Pspac-hy、pcI、plux-cI、plux-lac、CinR、CinL、葡萄糖控制的、修饰的Pr、经修饰的Prm+、FecA、Pcya、rec A(SOS)、Rec A(SOS)、EmrR_调节的、BetI_调节的、pLac_lux、pTet_Lac、pLac/Mnt、pTet/Mnt、LsrA/cI、pLux/cI、LacI、LacIQ、pLacIQ1、pLas/cI、pLas/Lux、pLux/Las、具有LexA结合位点的pRecA、反向BBa_R0011、pLacI/ara-1、pLacIq、rrnB P1、cadC、hns、PfhuA、pBad/araC、nhaA、OmpF、RcnR)、σS启动子(例如，具有替代σ因子σ38的Lutz-Bujard LacO)、σ32启动子(例如，具有替代σ因子σ32的Lutz-Bujard LacO)和σ54启动子(例如，glnAp2)；负调节枯草芽孢杆菌启动子，例如可阻遏的枯草芽孢杆菌σA启动子(例如，革兰氏阳性IPTG诱导型、Xyl、hyper-Spank)和σB启动子。另一些诱导型微生物启动子可根据本公开内容使用。

表达效率可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等增强。另外，可选择以所期望的特定方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株(例如，芽孢杆菌)。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。例如，本文中所述的BoNT表达为单基因产物(例如，表达为单多肽链)，并随后在接头区域中进行蛋白水解切割以被加工成其成熟形式。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列被并入到载体(例如，克隆载体或表达载体)中。“载体”是指这样的核酸(例如，DNA)，其用作将遗传物质(例如，经改造的核酸)人工携带到例如其可在其中复制和/或表达的细胞中的载剂。在一些实施方案中，载体是附加体型载体(episomal vector)(参见，例如，Van Craenenbroeck K.etal.Eur.J.Biochem.267,5665,2000，其通过引用并入本文)。载体的一个非限制性实例是质粒。质粒是能够在宿主细胞中自主复制的双链且通常呈环状的DNA序列。质粒载体通常包含允许质粒在宿主中半独立复制的复制起点以及转基因插入物。质粒可具有更多特征，包括例如“多克隆位点”(其包含用于插入核酸插入物的核苷酸突出端)，以及插入物任一侧的多个限制性酶共有位点。载体的另一个非限制性实例是病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、辅助依赖性腺病毒系统、杂交腺病毒系统、单纯疱疹病毒、痘病毒、慢病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus))。在一些实施方案中，病毒载体来源于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)。在一些实施方案中，病毒载体来源于单纯疱疹病毒(herpessimplex virus，HSV)。

另外，载体可包含例如以下的一些或全部：选择标志物基因，例如，赋予芽孢杆菌细胞抗生素抗性的基因。合适的载体和用于产生包含转基因的载体的方法是本领域公知并且可获得的。

在细菌系统中，取决于所表达多肽的预期用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量的这样的蛋白质时，为了产生本文中所述多肽的药物组合物，指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体可能是期望的。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther et al.(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones，”EMBOJ.2：1791-1794)，其中编码序列可单独地连接到载体中并与lac Z编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye gt al.(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene OfEscherichia Coli，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110：Van Heeke et al.(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等。pGEX载体也可用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)的融合蛋白。一般而言，这样的融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠结合随后在存在游离谷胱甘肽的情况下进行洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。

pGEX载体被设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可单独地克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。

在一些实施方案中，载体适于在芽孢杆菌细胞中表达BoNT。适合于在芽孢杆菌细胞中表达蛋白质(例如，BoNT)的表达载体是可商购获得的。例如，Mibitec GmbH(德国)提供了适合于在芽孢杆菌中进行蛋白质表达的许多表达载体，包括pHT01(＃PBS001)、pHT08(＃PBS003)、pHT09(＃PBS004)、pHT10(＃PBS005)、pHT43(＃PBS002)、pHT253(＃PBS013)、pHT254(＃PBS014)、pHT255(＃PBS015)、pNZ8901(＃PBS031)、pNZ8902(＃PBS032)、pNZ8910(＃PBS033)、pNZ8911(＃PBS034)、pWH1520(＃BMEG03)、pMM1522(＃BMEG10)、pMM1525(＃BMEG 11)、pHIS1522(＃BMEG 12)、pHIS1525(＃BMEG 13)、pSTREP1525(＃BMEG 14)、pSTREPHIS1525(＃BMEG 15)、pC-His1622(＃BMEG 20)、pC-Strep1622(＃BMEG 21)、pN-His-TEV1622(＃BMEG 22)、pN-Strep-TEV1622(＃BMEG 23)、pN-StrepXa1622(＃BMEG 24)、pSTOP1622(＃BMEG 25)、p3STOP1623hp(＃BMEG 30)、pC-HIS1623hp(＃BMEG31)、pN-His-TEV1623hp(＃BMEG 32)、pSP-LipA-hp(＃BMEG 33)、pSP-YocH-hp(＃BMEG 34)、p3STOP1623-2RBShp(＃BMEG 35)、pC-STREP1623hp(＃BMEG 36)、pN-STREP-Xa1623hp(＃BMEG 37)、pN-STREP_TEV1623hp(＃BMEG 38)、pMGBm19(＃BMEG 39)、pPT7(＃BMEG T710)、pPT7-SPlipA(＃BMEG T711)和pPconst1326(＃BMEG 45)。Takara Bio Inc.(日本)提供了枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达系统(＃3380)，包括表达载体pBES。此外，ATCC提供了用于芽孢杆菌表达的载体pRB374(＃ATCC77374)。本领域技术人员能够选择合适的表达载体。

本文中所述的产生BoNT的方法包括在适合于表达BoNT的条件下培养包含编码BoNT的核苷酸序列的芽孢杆菌细胞。在一些实施方案中，该方法还包括将编码BoNT的核苷酸序列递送到芽孢杆菌细胞。使用标准分子生物学技术来制备和递送重组表达载体，并培养芽孢杆菌细胞。可通过常规技术(例如，电穿孔、转化、转导或缀合)将包含编码BoNT的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞，并随后通过常规技术培养所得芽孢杆菌细胞以产生本文中所述的BoNT。

芽孢杆菌细胞可在适当的温度(例如，16℃至42℃)下培养适当量的时间(例如，4至72小时)。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞在16、18、20、25、30、35、37、40或42℃下培养。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞培养4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72小时或更长时间。可使用适合于芽孢杆菌细胞的任何标准培养基(例如，卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani，LB)培养基)。如果BoNT的表达由诱导型启动子驱动，则培养基还可包含激活诱导型启动子的适当浓度的诱导物。

一旦BoNT已重组表达，则其可通过本领域已知的任何方法进行纯化，例如，通过色谱法(例如，亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、或其组合)、离心、差别溶解度或者通过用于纯化多肽的任何其他标准技术。

使用本文中所述方法产生的BoNT基本上不含(例如，至少80％、90％、95％、97％、99％或99.5％不含)其他蛋白质和/或其他多肽(例如，其他芽孢杆菌蛋白质)。在一些实施方案中，分离的多肽100％不含其他蛋白质和/或其他多肽(例如，芽孢杆菌蛋白质)。本文中所述的方法提供了高产量的完整BoNT。“完整”意指BoNT产物基本上不含截短的产物(例如，由于翻译中止或蛋白酶切割而产生的那些)。如本文中所示，在一些实施方案中，可从1升经LB培养的枯草芽孢杆菌中获得约5至10mg蛋白质。

使用本文中的方法产生的BoNT具有与天然存在的BoNT相当的生物活性(例如，在靶细胞识别、易位和/或底物切割方面)。具有“相当的生物活性”意指使用本文中所述方法产生的BoNT具有天然存在的BoNT的生物活性(例如，在靶细胞识别、易位和底物切割方面)的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，使用本文中所述方法产生的BoNT具有天然存在的BoNT的生物活性(例如，在靶细胞识别、易位和底物切割方面)的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。

在本文中所述的方法中用于BoNT表达的宿主细胞是芽孢杆菌细胞。可使用的一些示例性芽孢杆菌细胞包括但不限于：酸快生芽孢杆菌(B.acidiceler)、酸居芽孢杆菌(B.acidicola)、产酸芽孢杆菌(B.acidiproducens)、嗜酸热芽孢杆菌(B.acidocaldarius)、抗酸土芽孢杆菌(B.acidoterrestris)、伊奥利亚岛芽孢杆菌(B.aeolius)、空气芽孢杆菌(B.aerius)、嗜气芽孢杆菌(B.aerophilus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、农业芽孢杆菌(B.agri)、艾丁湖芽孢杆菌(B.aidingensis)、秋叶氏芽孢杆菌(B.akibai)、嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、藻居芽孢杆菌(B.algicola)、溶藻芽孢杆菌(B.alginolyticus)、嗜碱固氮芽孢杆菌(B.alkalidiazotrophicus)、碱性氮芽孢杆菌(B.alkalinitrilicus)、碱性沉积物芽孢杆菌(B.alkalisediminis)、碱土芽孢杆菌(B.alkalitelluris)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis)、香鱼海槽芽孢杆菌(B.alveayuensis)、蜂房芽孢杆菌(B.alvei)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜氨芽孢杆菌[2](B.aminovorans[2])、溶淀粉芽孢杆菌(B.amylolyticus)、安德里森芽孢杆菌(B.andreesenii)、解硫胺素芽孢杆菌(B.aneurinilyticus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、海水芽孢杆菌(B.aquimaris)、沙地芽孢杆菌(B.arenosi)、黄硒芽孢杆菌(B.arseniciselenatis)、砷芽孢杆菌(B.arsenicus)、金橙色芽孢杆菌(B.aurantiacus)、田间芽孢杆菌(B.arvi)、阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai)、风井氏芽孢杆菌(B.asahii)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、太阳海岸芽孢杆菌(B.axarquiensis)、固氮芽孢杆菌(B.azotofixans)、产氮芽孢杆菌(B.azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(B.badius)、罕见芽孢杆菌(B.barbaricus)、巴达维亚芽孢杆菌(B.bataviensis)、北京芽孢杆菌(B.beijingensis)、食苯芽孢杆菌(B.benzoevorans)、柏林芽孢杆菌(B.beringensis)、伯克利芽孢杆菌(B.berkeleyi)、贝弗里奇芽孢杆菌(B.beveridgei)、博戈里亚芽孢杆菌(B.bogoriensis)、嗜硼芽孢杆菌(B.boroniphilus)、波茨坦芽孢杆菌(B.borstelensis)、短芽孢杆菌(B.brevis Migula)、食丁酸芽孢杆菌(B.butanolivorans)、卡纳维拉尔芽孢杆菌(B.canaveralius)、嗜碳芽孢杆菌(B.carboniphilus)、科研中心芽孢杆菌(B.cecembensis)、解纤维芽孢杆菌(B.cellulosilyticus)、中孢芽孢杆菌(B.centrosporus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、恰甘诺湖芽孢杆菌(B.chagannorensis)、解几丁质芽孢杆菌(B.chitinolyticus)、软骨酸芽孢杆菌(B.chondroitinus)、千叶短芽孢杆菌(B.choshinensis)、长安芽孢杆菌(B.chungangensis)、食物芽孢杆菌(B.cibi)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克氏芽孢杆菌(B.clarkii)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、考卉纳芽孢杆菌(B.coahuilensis)、科氏芽孢杆菌(B.cohnii)、堆肥芽孢杆菌(B.composti)、解凝乳芽孢杆菌(B.curdlanolyticus)、环庚基脂环酸芽孢杆菌(B.cycloheptanicus)、细胞毒素芽孢杆菌(B.cytotoxicus)、大理芽孢杆菌(B.daliensis)、腐叶芽孢杆菌(B.decisifrondis)、脱色芽孢杆菌(B.decolorationis)、沙漠芽孢杆菌(B.deserti)、河冠壁虎芽孢杆菌(B.dipsosauri)、钻特省芽孢杆菌(B.drentensis)、土中芽孢杆菌(B.edaphicus)、爱媛芽孢杆菌(B.ehimensis)、赤子芽孢杆菌(B.eiseniae)、结束芽孢杆菌(B.enclensis)、植物内芽孢杆菌(B.endophyticus)、根尖内生芽孢杆菌(B.endoradicis)、混料芽孢杆菌(B.farraginis)、苛求芽孢杆菌(B.fastidiosus)、封丘芽孢杆菌(B.fengqiuensis)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、弯曲芽孢杆菌(B.flexus)、小孔芽孢杆菌(B.foraminis)、福氏芽孢杆菌(B.fordii)、美丽芽孢杆菌(B.formosus)、强壮芽孢杆菌(B.fortis)、气孔芽孢杆菌(B.fumarioli)、绳索状芽孢杆菌(B.funiculus)、纺锤芽孢杆菌(B.fusiformis)、嗜乳豆芽孢杆菌(B.galactophilus)、解半乳糖苷芽孢杆菌(B.galactosidilyticus)、加里西亚芽孢杆菌(B.galliciensis)、明胶芽孢杆菌(B.gelatini)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、人参芽孢杆菌(B.ginsengi)、人参土芽孢杆菌(B.ginsengihumi)、人参土壤芽孢杆菌(B.ginsengisoli)、解葡糖芽孢杆菌(B.glucanolyticus)、戈登氏芽孢杆菌(B.gordonae)、哥蒂氏芽孢杆菌(B.gottheilii)、草芽孢杆菌(B.graminis)、盐敏芽孢杆菌(B.halmapalus)、嗜盐碱芽孢杆菌(B.haloalkaliphilus)、盐虫芽孢杆菌(B.halochares)、盐反硝化芽孢杆菌(B.halodenitrificans)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、嗜盐芽孢杆菌(B.halophilus)、盐糖芽孢杆菌(B.halosaccharovorans)、解半纤维素芽孢杆菌(B.hemicellulosilyticus)、马粪海胆芽孢杆菌(B.hemicentroti)、黑布施泰因芽孢杆菌(B.herbersteinensis)、堀越氏芽孢杆菌(B.horikoshii)、堀崎芽孢杆菌(B.horneckiae)、花园芽孢杆菌(B.horti)、惠州芽孢杆菌(B.huizhouensis)、土地芽孢杆菌(B.humi)、花津滩芽孢杆菌(B.hwajinpoensis)、病研所芽孢杆菌(B.idriensis)、印度芽孢杆菌(B.indicus)、婴儿芽孢杆菌(B.infantis)、深层芽孢杆菌(B.infernus)、异常芽孢杆菌(B.insolitus)、无敌芽孢杆菌(B.invictae)、伊朗芽孢杆菌(B.iranensis)、伊氏芽孢杆菌(B.isabeliae)、伊斯隆恩西斯芽孢杆菌(B.isronensis)、咸海鲜芽孢杆菌(B.jeotgali)、好热地芽孢杆菌(B.kaustophilus)、哥本芽孢杆菌(B.kobensis)、郭霍氏芽孢杆菌(B.kochii)、木芥子形芽孢杆菌(B.kokeshiiformis)、韩国芽孢杆菌(B.koreensis)、库尔勒芽孢杆菌(B.korlensis)、韩研所芽孢杆菌(B.kribbensis)、克鲁氏芽孢杆菌(B.krulwichiae)、右旋乳酸芽孢杆菌(B.laevolacticus)、幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、慢性病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜木质素芽孢杆菌(B.ligniniphilus)、岸滨芽孢杆菌(B.litoralis)、盐地芽孢杆菌(B.locisalis)、路西法芽孢杆菌(B.luciferensis)、浅黄芽孢杆菌(B.luteolus)、藤黄芽孢杆菌(B.luteus)、澳门芽孢杆菌(B.macauensis)、软化芽孢杆菌(B.macerans)、马阔里芽孢杆菌(B.macquariensis)、马氏芽孢杆菌(B.macyae)、马特加芽孢杆菌(B.malacitensis)、解甘露醇糖芽孢杆菌(B.mannanilyticus)、黄海芽孢杆菌(B.marisflavi)、死海芽孢杆菌(B.marismortui)、马尔马里斯芽孢杆菌(B.marmarensis)、马赛芽孢杆菌(B.massiliensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、仙草芽孢杆菌(B.mesonae)、甲醇芽孢杆菌(B.methanolicus)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)、米氏芽孢杆菌(B.migulanus)、莫哈韦芽孢杆菌(B.mojavensis)、胶胨样芽孢杆菌(B.mucilaginosus)、壁芽孢杆菌(B.muralis)、马丁教堂芽孢杆菌(B.murimartini)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、长野芽孢杆菌(B.naganoensis)、南海芽孢杆菌(B.nanhaiensis)、南海沉积物芽孢杆菌(B.nanhaiisediminis)、尼氏芽孢杆菌(B.nealsonii)、内氏芽孢杆菌(B.neidei)、雷州芽孢杆菌(B.neizhouensis)、农研所芽孢杆菌(B.niabensis)、烟酸芽孢杆菌(B.niacini)、休闲地芽孢杆菌(B.novalis)、海泥芽孢杆菌(B.oceanisediminis)、奥德赛芽孢杆菌(B.odysseyi)、奥哈芽孢杆菌(B.okhensis)、奥飞騨温泉芽孢杆菌(B.okuhidensis)、蔬菜芽孢杆菌(B.oleronius)、稻壳芽孢杆菌(B.oryzaecorticis)、大岛芽孢杆菌(B.oshimensis)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、巴基斯坦芽孢杆菌(B.pakistanensis)、淡粉色芽孢杆菌(B.pallidus)、淡粉色芽孢杆菌、人参地土壤芽孢杆菌(B.panacisoli)、人参地块芽孢杆菌(B.panaciterrae)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、副短芽孢杆菌(B.parabrevis)、近弯芽孢杆菌(B.paraflexus)、巴氏芽孢杆菌(B.pasteurii)、巴塔哥尼亚芽孢杆菌(B.patagoniensis)、皮尔瑞俄芽孢杆菌(B.peoriae)、珀塞波尔芽孢杆菌(B.persepolensis)、桃色芽孢杆菌(B.persicus)、佩尔瓦格芽孢杆菌(B.pervagus)、海绵芽孢杆菌(B.plakortidis)、抱川芽孢杆菌(B.pocheonensis)、蓼属植物芽孢杆菌(B.polygoni)、多黏芽孢杆菌(B.polymyxa)、日本丽金龟芽孢杆菌(B.popilliae)、假嗜碱芽孢杆菌(B.pseudalcalophilus)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、假真菌芽孢杆菌(B.pseudomycoides)、耐冷芽孢杆菌(B.psychrodurans)、噬冷芽孢杆菌(B.psychrophilus)、冷解糖芽孢杆菌(B.psychrosaccharolyticus)、忍冷芽孢杆菌(B.psychrotolerans)、尘埃芽孢杆菌(B.pulvifaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、抗净化芽孢杆菌(B.purgationiresistens)、厚壁芽孢杆菌(B.pycnus)、青岛芽孢杆菌(B.qingdaonensis)、庆笙氏芽孢杆菌(B.qingshengii)、罗伊氏芽孢杆菌(B.reuszeri)、球状根芽孢杆菌(B.rhizosphaerae)、井水芽孢杆菌(B.rigui)、农庄芽孢杆菌(B.ruris)、沙福芽孢杆菌(B.safensis)、盐芽孢杆菌(B.salarius)、需盐芽孢杆菌(B.salexigens)、喜盐芽孢杆菌(B.saliphilus)、施氏芽孢杆菌(B.schlegelii)、沉积物芽孢杆菌(B.sediminis)、硒砷芽孢杆菌(B.selenatarsenatis)、还原硒酸盐芽孢杆菌(B.selenitireducens)、西岸芽孢杆菌(B.seohaeanensis)、莎车芽孢杆菌(B.shacheensis)、沙氏芽孢杆菌(B.shackletonii)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)、B.silvestris、简单芽孢杆菌(B.simplex)、青贮窖芽孢杆菌(B.siralis)、史氏芽孢杆菌(B.smithii)、土壤芽孢杆菌(B.soli)、土壤红树芽孢杆菌(B.solimangrovi)、盐土芽孢杆菌(B.solisalsi)、宋克伦芽孢杆菌(B.songklensis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、耐热芽孢杆菌(B.sporothermodurans)、嗜热嗜脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、平流层芽孢杆菌(B.stratosphericus)、地下芽孢杆菌(B.subterraneus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大安芽孢杆菌(B.taeanensis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、热南极芽孢杆菌(B.thermantarcticus)、嗜热嗜气芽孢杆菌(B.thermoaerophilus)、热嗜淀粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)、热小链芽孢杆菌(B.thermocatenulatus)、热阴沟芽孢杆菌(B.thermocloacae)、嗜热粪生芽孢杆菌(B.thermocopriae)、嗜热脱氮芽孢杆菌(B.thermodenitrificans)、热葡糖苷芽孢杆菌(B.thermoglucosidasius)、热乳芽孢杆菌(B.thermolactis)、噬热芽孢杆菌(B.thermoleovorans)、嗜热芽孢杆菌(B.thermophilus)、热红芽孢杆菌(B.thermoruber)、嗜热球形芽孢杆菌(B.thermosphaericus)、溶硫胺芽孢杆菌(B.thiaminolyticus)、产硫芽孢杆菌(B.thioparans)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、天神氏芽孢杆菌(B.tianshenii)、三脚芽孢杆菌(B.trypoxylicola)、多斯加尼芽孢杆菌(B.tusciae)、强壮芽孢杆菌(B.validus)、死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)、威氏芽孢杆菌(B.vedderi)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、越南芽孢杆菌(B.vietnamensis)、原野芽孢杆菌(B.vireti)、热口水芽孢杆菌(B.vulcani)、和光芽孢杆菌(B.wakoensis)、韦施泰凡芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)、厦门芽孢杆菌(B.xiamenensis)、小溪芽孢杆菌(B.xiaoxiensis)和湛江芽孢杆菌(B.zhanjiangensis)。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌或短芽孢杆菌。

在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌和短芽孢杆菌。

在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞是野生型细胞(即，未经遗传修饰的细胞)。在一些实施方案中，芽孢杆菌细胞被改造成蛋白酶缺陷型的(例如，通过使芽孢杆菌细胞中编码蛋白酶的一种或更多种基因失活)。蛋白酶缺陷型芽孢杆菌用于表达重组蛋白已例如在Fahnestock et al.，Appl Environ Microbiol.1987Feb；53(2)：379-384中描述，其通过引用并入本文。

表1：一些示例性、非限制性的BoNT氨基酸序列

通过以下实施例将更充分地理解本文中所公开技术的一些实施方案、优点、特征和用途。实施例旨在举例说明本公开内容的一些益处并描述一些特定的实施方案，但不旨在例示本公开内容的全部范围，并且因此不限制本公开内容的范围。

实施例

肉毒梭菌是革兰氏阳性菌，其在进化上接近于模型细菌枯草芽孢杆菌，但在遗传上远离大肠杆菌(图1)。在本研究中，探索了在芽孢杆菌中表达BoNT的可能性。使用芽孢杆菌作为表达宿主存在如下数个优点：(1)芽孢杆菌物种在进化上更接近于肉毒梭菌(BoNT的天然宿主)得多。因此，芽孢杆菌物种可为这些毒素的蛋白质翻译和偶联折叠提供更好的内部环境。一个已知的实例是TcdA/B毒素可在巨大芽孢杆菌中而不在大肠杆菌中良好地表达。(2)枯草芽孢杆菌是经充分研究的细菌模型生物体；在该细菌物种中，遗传操作是高度可修改的。因此，当使用该细菌作为宿主时，蛋白质工程将是可行的。(3)使用枯草芽孢杆菌时的细胞培养和蛋白质纯化的成本相对较低。因此，该系统非常适合于大规模蛋白质生产。(4)枯草芽孢杆菌被认为是人中常见的肠共生体，并且通常被认为是GRAS(公认安全(general recognized as safe))生物体。食品与药品监督管理局(FDA)表示，来自枯草芽孢杆菌的非产毒性和非致病性菌株的蛋白质产物可广泛获得并已安全用于多种食品应用中。在芽孢杆菌细菌中已成功产生的产物包括淀粉酶、透明质酸、聚羟基链烷酸酯和许多抗生素。由于重组蛋白表达技术的不可预测性，是否可在芽孢杆菌中以高产量产生完整且具有活性的BoNT尚待检验。

结果：

先前已解决了全长BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E的晶体结构，给出了这些分子的整体图。未在这些150kd的分子内发现许多二硫键，这表明氧化的环境或另外的氧化辅因子对于BoNT的产生不是必不可少的；这是可以预期的，因为肉毒梭菌是厌氧细菌。在这些毒素(例如BoNT/A和BoNT/B)中，疏水性和亲水性残基的表面分布均相对均匀(图2A至2B)。

使用iBoNT/B(“i”是指非活性形式，所述形式在其酶结构域处包含R370A/Y373F突变)作为BoNT的一个实例，并且分析了其在大肠杆菌中的表达模式。通常，尽管改变了表达条件，包括生长温度、诱导物浓度和培养基，但使用大肠杆菌均获得了非常少的产物。因此，iBoNT/B在大肠杆菌中的低产量可能主要是因为宿主的固有缺陷。为了验证这一点，在大肠杆菌中表达与N端或C端His-标签融合的iBoNT/B。无论标签在何处连接，细胞裂解物中大量的iBoNT/B产物均以较短片段存在。对于C端经标记的iBoNT/B，通过Ni-NTA珠进行的纯化去除了大多数的较短片段。相比之下，在IMAC纯化之后，保留了N端经标记的iBoNT/B的所有片段(图3)。这些结果指示iBoNT/B在大肠杆菌中的低产量主要是由翻译期间非预期的提前终止所致。

接下来，通过Western印迹在枯草芽孢杆菌中分析了iBoNT/B的表达模式。与在大肠杆菌中不同，大多数所表达的iBoNT/B作为完整的全长蛋白质存在(图4A至4B)。粗略估计，可从1升经LB培养的枯草芽孢杆菌中获得约5至10mg蛋白质；而在大肠杆菌中表达时，通常产量为＜0.5mg/L培养物。当在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中测试包含iBoNT/A催化结构域、BoNT/A易位结构域和BoNT/B结合结构域的嵌合iBoNT/AB的表达时，也获得了相同的表型(数据未示出)。这些结果表明对于BoNT表达，枯草芽孢杆菌总体上是更好的表达宿主。

接下来，创建另一些肉毒神经毒素(包括iBoNT/A、iBoNT/C、iBoNT/D)的表达质粒，并在枯草芽孢杆菌中测试这些蛋白质的表达。如所预期地，所有这些蛋白质均能够在枯草芽孢杆菌中以不错的产量产生(图5)。

总结：

在此，开发了新方案以在枯草芽孢杆菌中以改善的蛋白质品质和产量表达全长BoNT。该方案可用于产生全长BoNT及其变体以用于科学研究、产生活性毒素以用于医学治疗或化妆品，以及开发天然/重组的类毒素疫苗。

等同方案和范围

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围并不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求书中阐述的那样。

除非指出相反或者在其他情况下从上下文中明显，否则没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。除非指出相反或者在其他情况下从上下文中明显，否则如果存在一个、多于一个或全部组成员，则在组的两个或更多个成员之间包含“或/或者”的权利要求或描述被认为符合要求。在两个或更多个组成员之间包含“或/或者”的组的公开内容提供了其中存在恰好一个组成员的实施方案、其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中存在全部组成员的实施方案。为简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

应理解，本公开内容涵盖其中将来自一个或更多个权利要求或来自说明书的一个或更多个相关部分的一个或更多个限制、要素、条款或描述性术语引入到另一个权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，引用另一权利要求的权利要求可被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求书中记载组合物的情况下，应理解，除非另有说明或者除非对于本领域普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致，否则包括根据本文中所公开的任一种制造或使用方法或者根据本领域中已知的方法制造或使用组合物的方法(如果有的话)。

在要素以列表(例如，以马库什组形式)表示的情况下，应理解还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可从该组中移除。还应注意，术语“包含/包括”旨在是开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应理解，一般而言，在实施方案、产品或方法被称为包含特定要素、特征或步骤的情况下，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或者基本上由这样的要素、特征或步骤组成的实施方案、产品或方法。为简洁起见，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另有说明或者在其他情况下从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显，否则表示为范围的值在一些实施方案中可假定为所述范围内的任何特定值至所述范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为简洁起见，每个范围中的值在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应理解，除非另有说明或者在其他情况下从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显，否则表示为范围的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与该范围下限的单位的十分之一相同的准确度表示。

在提供网站的情况下，URL地址作为非浏览器可执行的代码提供，括号中是相应网址的句点(periods)。实际的网址不包含括号。

另外，应理解，本公开内容的任何具体实施方案可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可明确地从任何一个或更多个权利要求中排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或更多个权利要求中排除。为简洁起见，本文中未明确阐述其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims

1.产生肉毒神经毒素(BoNT)的方法，所述方法包括在适合于表达BoNT的条件下培养包含编码所述BoNT的核苷酸序列的芽孢杆菌(Bacillus)细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中所述编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。

3.权利要求2所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述编码BoNT的核苷酸序列在表达载体中。

5.权利要求4所述的方法，其中所述表达载体选自：pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT 255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC-His1622、pC-Strep1622、pN-His-TEV1622、pN-Strep-TEV1622、pN-StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC-HIS1623hp、pN-His-TEV1623hp、pSP-LipA-hp、pSP-YocH-hp、p3STOP1623-2RBShp、pC-STREP1623hp、pN-STREP-Xa1623hp、pN-STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7-SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE-S和pRB374。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述BoNT在N或C端与融合结构域融合。

7.权利要求6所述的方法，其中所述融合结构域是亲和标签。

8.权利要求7所述的方法，其中所述亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌中表达。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述BoNT选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En，及其变体。

11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述BoNT是非催化活性BoNT。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述BoNT是全长BoNT。

13.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述BoNT是嵌合BoNT。

14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述BoNT包含与SEQ ID NO：1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

15.权利要求14所述的方法，其中所述BoNT包含SEQ ID NO：1至139中任一个的氨基酸序列。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括将所述编码BoNT的核苷酸序列递送到所述芽孢杆菌细胞中。

17.权利要求16所述的方法，其中通过转化、转导、缀合和电穿孔来递送所述编码BoNT的核苷酸序列。

18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其还包括从所述芽孢杆菌细胞中纯化所述BoNT。

19.权利要求18所述的方法，其中通过亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、或其组合来纯化所述BoNT。

20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。

21.权利要求20所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是野生型细胞。

22.权利要求20所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是经改造的细胞。

23.权利要求22所述的方法，其中所述芽孢杆菌是蛋白酶缺陷型芽孢杆菌细胞。

24.芽孢杆菌细胞，其包含编码肉毒神经毒素(BoNT)的核苷酸序列。

25.权利要求24所述的芽孢杆菌细胞，其中所述编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。

26.权利要求25所述的芽孢杆菌细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。

27.权利要求24至26中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述编码BoNT的核苷酸序列在表达载体中。

28.权利要求27所述的芽孢杆菌细胞，其中所述表达载体选自：pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC-His1622、pC-Strep1622、pN-His-TEV1622、pN-Strep-TEV1622、pN-StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC-HIS1623hp、pN-His-TEV1623hp、pSP-LipA-hp、pSP-YocH-hp、p3STOP1623-2RBShp、pC-STREP1623hp、pN-STREP-Xa1623hp、pN-STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7-SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE-S和pRB374。

29.权利要求24至28中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT在N或C端与融合结构域融合。

30.权利要求29中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述融合结构域是亲和标签。

31.权利要求30所述的芽孢杆菌细胞，其中所述亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

32.权利要求24至31中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌中表达。

33.权利要求24至32中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En，及其变体。

34.权利要求24至33中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT是非催化活性BoNT。

35.权利要求24至34中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT是全长BoNT。

36.权利要求24至32中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT是嵌合BoNT。

37.权利要求24至36中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT包含与SEQ ID NO：1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。

38.权利要求37所述的芽孢杆菌细胞，其中所述BoNT包含SEQ ID NO：1至139中任一个的氨基酸序列。

39.权利要求24至38中任一项所述的芽孢杆菌细胞，其中所述芽孢杆菌细胞选自：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌和短芽孢杆菌。

40.权利要求39所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是野生型细胞。

41.权利要求39所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞是经改造的细胞。

42.权利要求41所述的方法，其中所述芽孢杆菌是蛋白酶缺陷型芽孢杆菌细胞。