CN101184770A - 用于靶向神经细胞的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种转运蛋白，其通过修饰肉毒杆菌所产神经毒素的重链而得到，其中(i)该蛋白能以与天然神经毒素相比更高或更低的亲和力特异性地与神经细胞结合；(ii)该蛋白具有与天然神经毒素相比增强或减弱的神经毒性，所述神经毒性优选通过HDA分析法进行测定；并且/或者(iii)与天然神经毒素相比，该蛋白显示出与中和抗体更低的亲和力。本发明还涉及生产该蛋白的方法以及该蛋白在化妆品组合物和药物组合物中的用途。

Description

用于靶向神经细胞的载体
技术领域
本发明涉及一种转运蛋白，它能以比肉毒杆菌(Clostridium botulinum)形成的神经毒素更高或更低的亲和力与神经元结合。该转运蛋白适宜通过受体介导的胞吞作用而被吸收。该蛋白可用作转运手段将其它化学物质(例如蛋白酶)从酸性内体小室(endosomal compartment)转移进入神经元胞质液，该蛋白酶不能生理学地穿过质膜而渗入神经细胞胞质液。本发明特别涉及一种转运蛋白用于导入神经递质释放抑制剂的用途。
背景技术
神经细胞通过胞吐作用释放递质。胞内泡囊的膜与细胞质膜的融合被称作胞吐作用。在该加工过程中，泡囊内含物同时地排至突触间隙。这两种膜的融合由钙进行调控，与与蛋白质突触结合蛋白(synaptotagmin)发生反应。在其它辅因子的共同作用下，突触结合蛋白控制着下述三种所谓的融合蛋白的状态：SNAP-25(25K突触体相关蛋白)、小突触泡蛋白2(synaptobrevin 2)和突触融合蛋白1A(syntaxin 1A)。SNAP-25仅松弛地结合在细胞质膜上，而突触融合蛋白1A和小突触泡蛋白2被整合进入细胞质和/或泡囊膜中。这三种蛋白彼此相互结合至胞内钙浓度增加的程度，两种膜也彼此相互接近并最终融合在一起。在释放胆碱能神经元乙酰胆碱情况下，会引发肌肉收缩、排汗以及其它胆碱能激发反应。
上述的融合蛋白是由肉毒杆菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、巴拉蒂梭菌(C.baratii)和破伤风梭菌(C.tetani)形成的梭菌毒素的轻链(LC)的靶分子(底物)。
厌氧型革兰氏阳性细菌肉毒杆菌产生7种不同血清型的梭菌神经毒素。后者被称为肉毒毒素(BoNT/A到BoNT/G)。其中，特别是BoNT/A和BoNT/B会导致人和动物神经性麻痹的机能障碍，称为肉毒中毒。土壤中可以发现肉毒杆菌的孢子，但是在家庭自制食物保存时不正确的灭菌和密封也会导致其生长，很多肉毒中毒案例可归于此因。
BoNT/A是所有已知的生物活性物质中最具活性的。少至5-6pg的纯化BoNT/A代表一个最低致死剂量MLD(Multiple Lethal Dose)。每个体重为18-20g的雌性Swiss Webster小鼠腹膜内注射后，杀死一半的一个单位(Engl.：单位U)BoNT定义为MLD。7种免疫活性不同的BoNT得到表征，它们被表示为BoNT/A、B、C1、D、E、F和G，并可以通过与血清型特异抗体的中和实验而区分。就引起的麻痹严重程度和持续时间而言，在被影响的动物种类中不同血清型的BoNT是不同的。这样，针对麻痹来讲，以大鼠为例，BoNT/A的效价是500倍于BoNT/B。另外，已经证明在灵长类动物中480U/kg体重的BoNT/B剂量是无毒的。同等量的BoNT/A相当于该物质在灵长类动物中致死量(LD)的12倍。另一方面，对大鼠进行注射BoNT/A后麻痹持续时间比注射BoNT/E后长10倍。
BoNTs用于治疗神经肌肉失调，通过骨骼肌机能亢进得到表征，是由病理性活动过度的周围神经引起的。BoNT/A已经被美国食品与药品管理局批准用于治疗眼睑痉挛、斜视、多汗症，皱纹和半面痉挛。与BoNT/A相比，残留的BoNT血清型明显地有效性较小，并且显示出效价持续时间更短。周围肌肉注射给药BoNT/A的临床疗效通常在一周之内即可很明显。通过一种单一BoNT/A肌肉注射的症状抑制持续期通常为约3-6个月。
梭菌神经毒素特异性水解不同的融合组织的蛋白质。BoNT/A、C1和E分解SNAP-25，而BoNT/B、D、F、G以及破伤风神经毒素(TeNT)攻击泡囊相关膜蛋白(vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)2--又称为小突触泡蛋白2-。BoNT/C1可以进一步分解突触融合蛋白1A。
梭菌属细菌释放神经性毒素，其为单链多肽，都含1251-1315个氨基酸。然后内源性蛋白酶在限定位置处将每一种这些蛋白质分裂为两条链(切断)，但是这两条残留的链仍通过二硫桥连在一起。这样的双链蛋白质又称为全毒素(holotoxins)(参见Shone et al.(1985)，Eur.J.Biochem.151，75-82)。这两条链有不同的功能。较小的片段，即轻链(light chain，LC)为Zn2+依赖性内切蛋白酶，而较大的单元，即重链(heavy chain，HC)代表轻链的转运手段。通过用内肽酶处理HC，产生两个50kDa的片段(参见Gimenez et al.(1993)，J.Protein Chem.12，351-363)。该氨基末端的一半(HN-片段)在较低pH值下整合进入膜内，并使得LC能够渗入神经细胞胞质液内。而羧基端的一半(HC片段)结合于复合物聚唾液酸神经节苷脂(polysialogangliosides)，该结合在神经细胞膜中排他性地发生，并且迄今为止未鉴定蛋白质受体(Halpern et al.(1993)，Curr Top Microbial Immunol 195，221-241)。后者解释了梭菌神经毒素的高神经选择性(neuroselectivity)。晶态结构证实BoNT/A去掉了三个结构域，其可以通过三个步骤的作用机制进行调和(参见Lacy et al.(1998)，Nat.Struct.Biol.5，898-902)。此外，这些数据得出这样一种结论：在Hc片段内部有两个自主性的亚单元(亚结构域)存在，每个25kDa。存在两个功能型亚结构域的第一个证据是由TeNT的Hc片段的氨基端(HCN)和羧基端一半(Hcc)产生的，其表达为重组体形式，并且显示HCC-结构域、而不是HCN结构域与神经元细胞结合(参见Herreros et al.(2000)，Biochem.J.347，199-204)。在后期，BoNT/A和B的HCC-结构域中一个单一的神经节苷脂(ganglioside)结合位点被定位并表征(参见Rummelet al.(2004)，Mol.Microbiol.51，631-643)。BoNT/B和G上用于与被定义为BoNT/B和G的蛋白质受体的突触结合蛋白I和II相结合的位点，也同样被限定为BoNT/B和G的HCC-结构域区域(参见Rummel et al.(2004)，J Biol Chem 279，30865-70)。但是该文件并没有揭示与BoNT/B和G的结合袋相关的氨基酸。
在生理条件下，HC片段与神经元的神经节苷脂结合，这是通过受体介导的胞吞作用被吸收到细胞内部，并通过内体小室(endosomal compartment)到达固有的泡囊循环(vesiclecirculation)。在早期内体(early endosomes)的酸性介质中，HN片段渗入泡囊膜并形成小孔。每种通过二硫桥与HC连接的物质(X)将通过胞内氧化还原系统从HC分裂出来，进入二硫桥并使其还原。X最终将出现在胞质液中。
对梭菌神经毒素来说，HC是LC的载体，其在最后的步骤中于胞质液内裂解它的特异性底物。融合蛋白的复合物形成和分解周期中断，并且因此抑制了乙酰胆碱的释放。其结果是，横纹肌无力，并且汗腺停止分泌。单独的BoNT血清型的活性期各不相同，并且取决于胞质液内完整LC的存在。由于所有的神经元都具有梭菌神经毒素受体，所以不仅乙酰胆碱的释放会受影响，而且P物质、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、内啡肽以及其它递质和激素的释放也可能会受影响。
胆碱能传递被优先阻断，这可以通过在外围的HC进入神经元的事实得到解释。中心突触通过不能复盖有蛋白质的血脑屏障而得到保护。
在配体受体研究中，BoNT/B和G的HCC-结构域中特定的氨基酸残基被取代，用以确定和表征蛋白质受体的结合袋，以便进而改变它与蛋白质受体的亲和性。突变的BoNT/B和G的HC片段的亲和力通过谷胱甘肽-S-转移酶沉淀实验(GST-pull-down实验)中的突触结合蛋白来确定。进行相同突变的HC随后分别耦合于LC-B或LC-C。这些构建体的效价通过分离的小鼠神经-肌肉标本的手段进行分析(Hemi-Diaphragm-Assay，半隔膜分析法，HDA)。该标本中将会发现有膈神经，它由胆碱能运动神经元组成，并且代表梭菌神经毒素的最重要的生理学目的。随后，BoNT/A的低压区HCC-结构域中单个氨基酸被替代，近似地定位于BoNT/B和G的蛋白受体结合袋位点。全长的BoNT/A单一突变体也同样通过HAD分析其修饰后的结合力，并给出修饰配体-蛋白受体相互作用的提示。
在更多近年来的实践中，BoNT/A复合物，也被称为原毒素A，已经被用于治疗运动肌张力障碍，以及用于减少过度的交感神经活性(参见Benecke et al.(1995)，Akt.Neurol.22，209ff)，并且用于止痛和减轻偏头痛(参见Sycha et al.(2004)，J.Neurol.251，19-30)。这种复合物由神经毒素、多种血凝素和一种无毒性无血细胞凝聚作用的蛋白质组成。在生理pH值下这种复合物在几分钟内就会分离。得到的神经毒素是该复合物的唯一组分，与治疗相关，并可以减轻症状。由于深部的神经性疾病并未被治疗，这种复合物需要每隔3到4个月注射一次。取决于注射的异种蛋白质的数量，一些患者产生了特异性BoNT/A-抗体。这些患者变得对神经毒素有抵抗力。一旦抗原敏感细胞识别出神经毒素并且形成抗体，相关的记忆细胞可以保存若干年。由于此原因，用活性尽可能高的制剂、尽可能小的剂量治疗病人是很重要的。此外这种制剂不包含任何别的细菌源蛋白质，因为它们可以作为免疫佐剂。这样的物质会会引诱巨噬细胞，巨噬细胞会同时识别免疫佐剂和神经毒素，将它们递至淋巴细胞，于是通过产生免疫球蛋白产生而应答。因而，只有极度纯净的不包含任何异种蛋白质的产品才可以用于治疗。患者对神经毒素的抵抗力，从分子层面上看，主要是基于中和抗体的存在。
发明内容
下面的内容中，本发明提供了一种转运蛋白(Trapo)，它可以克服迄今为止已知方法中存在的上述问题。
通过一种新的转运蛋白达到了该目标，这种转运蛋白可以通过修饰由肉毒杆菌产生的神经毒素重链而得到。其中
(i)该蛋白质以比天然神经毒素更高或者更低的亲和力与神经细胞结合；
(ii)该蛋白质具有与天然神经毒素相比增强的或者减弱的神经毒性，该神经毒性优选通过半隔膜分析法确定；并且/或者
(iii)与天然神经毒素相比，该蛋白质显示出与中和抗体更低的亲和力。
根据本发明的一个优选实施方式，提供一种转运蛋白，其以比肉毒杆菌产生的天然神经毒素更高或者更低的亲和力与神经细胞结合。
根据本发明的另一个优选实施方式，提供一种转运蛋白，它通过修饰肉毒杆菌产生的神经毒素HC而得到，该蛋白特异性地以比天然神经毒素更强或更弱的亲和力而结合于神经细胞。该转运蛋白适宜通过胞吞作用被这些细胞吸收。
另外，根据本发明的一个优选实施方式，提供一种转运蛋白，它通过修饰肉毒杆菌产生的神经毒素的HC而得到，通过取代其暴露在表面的氨基酸，特别是在神经节苷脂结合袋和蛋白受体结合袋处的氨基酸，该转运蛋白与中和抗体进行的结合就不再容易进行。
下面，对术语进行了定义，以便于理解本申请的内容。
“以比天然神经毒素更强或更弱的亲和力结合于神经细胞”。在本案中，天然神经毒素优选指肉毒杆菌产生的神经毒素。本文中的天然神经毒素优选是从肉毒杆菌获得的肉毒杆菌神经毒素A和/或肉毒杆菌神经毒素B和/或肉毒杆菌神经毒素G。以重组体形式从大肠杆菌E.coli获得的肉毒杆菌神经毒素，其尤其含有与天然的肉毒杆菌神经毒素相同的氨基酸序列，以同一种药理学方式作用于天然的肉毒杆菌神经毒素，并且称为重组体肉毒杆菌神经毒素野生型。本案中提及的神经细胞指胆碱能运动神经元。优选该转运蛋白特异性地结合于与细胞质膜相关的分子、跨膜蛋白、突触泡囊蛋白、突触结合蛋白家族或者突触泡囊糖蛋白2(synapticvesicle glycoproteins，SV2)的蛋白质，优选突触结合蛋白I和/或突触结合蛋白II和/或SV2A，SV2B或SV2C，特别优选人突触结合蛋白I和/或人突触结合蛋白II和/或人SV2A，SV2B或SV2C。优选在体活外测定该结合，特别优选通过采用在实施例中详细阐明的GST-pull-down分析法进行确定。
“该蛋白具有与天然的神经毒素相比增强的或者减弱的神经毒性”。在本案中，天然神经毒素指肉毒杆菌产生的神经毒素。本文中的天然神经毒素优选是指从肉毒杆菌获得的肉毒杆菌神经毒素A和/或肉毒杆菌神经毒素B和/或肉毒杆菌神经毒素G。以重组体形式从大肠杆菌E.coli获得的肉毒杆菌神经毒素，其尤其含有与天然的肉毒杆菌神经毒素相同的氨基酸序列，以同一种药理学方式作用于天然的肉毒杆菌神经毒素，并且称为重组体肉毒杆菌神经毒素野生型。本案中提及的神经细胞指胆碱能运动神经元。神经毒性优选借助于现有技术中已知的半隔膜分析法(HDA)进行确定。突变体的神经毒性优选用Habermann等人描述的方法(参见Habermann et al.Naunyn Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.311(1980)33-40)进行确定。
“中和抗体”。中和抗体抗肉毒杆菌神经毒素是已知的(
Figure A20068001378100111
H，Wohlfarth K，Frevert J，Dengler R，Bigalke H.Botulinum A toxin therapy：neutralizing and nonneutralizingantibodies--therapeutic consequences，Exp.Neurol.1997Sep；147(1)：96-102)。研究发现，中和神经毒素的抗体尤其可与神经毒素的活性中心例如神经毒素HCC-结构域内的神经节苷脂结合袋和蛋白质受体结合袋相互作用。如果在不消极地削弱神经毒素功能的同时，通过氨基酸取代来修饰该神经毒素中结合袋的周围表面，中和抗体就会丢失它们的结合位点，并且突变的神经毒素就不再会被中和。
术语“肉毒杆菌产生的神经毒素重链的修饰”。肉毒杆菌产生的神经毒素重链(HC)的氨基酸和/或核酸序列通常购自公开的可进入的数据库，用于每一种已知的血清型A至G(也请参见表1)。本文中的修饰指：删除、添加至少一个氨基酸，将其插入氨基酸序列中，或者天然神经毒素中至少一个氨基酸被另一个天然或非天然氨基酸替代，和/或对规定氨基酸序列中的某个氨基酸进行翻译后修饰。本文中的翻译后修饰包括糖基化、乙酰化、酰基化、脱胺化、磷酸化、异戊二烯化、糖基磷脂酰基肌醇化、以及为本领域技术人员所熟知的进一步修饰。
肉毒杆菌产生的神经毒素的重链包含3个亚结构域，即，位于氨基端的大小为50kDa的易位结构域HN、其后的25kDa大小的HCN-结构域、以及位于羧基端的大小为25kDa的HCC-结构域。HCN-与HCC-结构域一起标示为HC-片段。从表1明显可知单独血清型相应的各个亚亚结构域的氨基酸部分及其变化。
“神经节苷脂受体”
肉毒杆菌神经毒素的重链HCs表现出对外周神经细胞的高亲和性，主要通过与聚唾液酸神经节苷脂复合物--由一个以上唾液酸组成的糖脂类--的相互作用而进行调节(参见Halpern etal.(1995)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.195，221-41；WO 2006/02707)。结合于其上的轻链LCs因此仅能到达该种类型细胞并仅在这些细胞中具有活性。BoNT/A和B仅仅结合一个神经节苷脂分子GT1b。
对BoNT/B和BoNT/G而言，蛋白质受体为突触结合蛋白I和突触结合蛋白II。对BoNT/A而言，蛋白质受体为突触泡囊糖蛋白2(SV2)，优选是SV2A、SV2B和SV2C。
目前已发现13种属于突触结合蛋白家族的异型体。它们的特征是都具有两个可结合羧基末端Ca2+的C2-结构域、一个可将突触结合蛋白锚定在突触泡囊膜中的中心跨膜结构域(TMD)、以及一个具有不同长度的氨基末端。在Ca2+离子流入之后突触泡囊与细胞质膜的融合就被启动，从而突触结合蛋白的腔内氨基末端会显露在细胞外，并可能成为BoNT/B和G的受体锚。与此类似地，SV2异型体的第四个腔内域在胞吐作用后，也可以在细胞外与BoNT/A相互作用。
结合袋的单个氨基酸突变的特征是，通过特异突变修饰后使其与蛋白受体的结合变得困难或者被抑制。为达到此目的，在大肠杆菌中表达BoNT/B和BoNT/G的HC-片段，并且以重组体形式在假定的结合袋中进行分离，以作为野生型，或者与单个氨基酸进行取代反应(突变型/取代型)。对于为了在体外研究BoNT/B和BoNT/G之间、以及突触结合蛋白I和突触结合蛋白II之间的相互作用，在GST-pull-down试验中，各自的GST-突触结合蛋白-融合蛋白分别与不同量的各自的BoNT/B或BoNT/G的HC-片段进行孵育，并进行相分离。游离的HC-片段仍留在分离后的上清中，而结合的BoNT HC-片段与GST-突触结合蛋白-融合蛋白一起，可以在固相中探测到。将各个HC-片段分别用全长的BoNT/B和BoNT/G替代后，GST-pull-down试验显示出相同的结果。
本文发现，当神经节苷脂复合物和具有跨膜蛋白结构域的突触结合蛋白I都存在时，野生型BoNT/B才会结合；而无论是否有跨膜结构域以及是否有神经节苷脂复合物存在，突触结合蛋白II都可以结合。通过BoNT/B的蛋白质受体结合位点上特定取代的氨基酸，有可能显著增强或减弱它与两种突触结合蛋白分子间的相互作用(图1)。
另外，研究显示，对于野生型BoNT/G与突触结合蛋白I和II的结合而言，对于无论突触结合蛋白I和II是否具有跨膜结构域、以及是否存在神经节苷脂复合物的每一种情形，结合都会发生。通过在BoNT/G的蛋白质受体结合位点上进行与BoNT/B类似的特定氨基酸取代，可以有可能显著增强或减弱它与两种突触结合蛋白分子I和II间的相互作用(图2)。
全长形式的野生型BoNT/A、B和G的效价通过HAD进行了确定，并绘制了剂量-效应曲线图(图3和6)。不同的全长形式的BoNT/A、B和G单一突变体的效价随后也通过HAD进行了测定(图6)，并且通过采用的效价函数相对于野生型BoNT/B和G的效价进行了绘图(图4和5)。例如，在BoNT/B中，用天冬氨酸取代第1118位的缬氨酸或者用谷氨酸取代第1192位的赖氨酸，会导致其效价减小为＜2％。以此相反，将第1183位的酪氨酸分别用亮氨酸或精氨酸进行取代的突变会使BoNT/B的效价显著增加(图4)。将第1256位的酪氨酸修饰为苯丙氨酸同样导致效价增加，而将第1200位的谷氨酸用谷胺酰胺、赖氨酸或酪氨酸进行取代的突变会导致BoNT/G的效价发生相当大的减弱(图5)。对于BoNT/A，将第1207位的丝氨酸修饰为精氨酸或酪氨酸会使其效价增加，而将第1260位的赖氨酸取代为谷氨酸的突变会导致BoNT/A效价的剧烈减弱(图6)。
根据一个优选实施方式，该转运蛋白显示出与天然神经毒素相比至少高15％或者至少低15％的亲和力。该转运蛋白优选可显示出与天然神经毒素相比至少高或者低至少50％的亲和力，特别优选显示出高或者低至少80％的亲和力，并且特别优选显示出高或者低至少90％的亲和力。
根据一个优选实施方式，对HC的修饰发生在给定神经毒素的HC-片段区域。如果修饰包含取代、删除、插入或添加，其中后者可以通过本领域技术人员熟知的本文中的方法例如特异性基因突变法进行。本文中对天然神经毒素中的氨基酸的修饰可以使用天然或非天然的氨基酸。原则上氨基酸被划分为不同的物化组。天冬氨酸和谷氨酸属于带负电荷的氨基酸。组氨酸，精氨酸和赖氨酸属于带正电荷的氨基酸。天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸属于极性氨基酸。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸属于非极性氨基酸。组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中含有芳香族的侧链集团。一般优选将某一氨基酸用属于另一个物化组的氨基酸取代。
根据本发明的一个优选实施方式，该运转蛋白为肉毒杆菌神经毒素血清型A到G。本文中天然神经毒素的氨基酸序列可以从对公众开放的数据库中获得，如下所示：
表1：氨基酸序列数据库编号和七种肉毒杆菌神经毒素的亚结构域分布
Figure A20068001378100141
Figure A20068001378100151
对于这些肉毒杆菌神经毒素的HC-片段，优选对下述蛋白质中氨基酸位置处的氨基酸进行修饰：
肉毒杆菌神经毒素血清型A的第867至1296位，
肉毒杆菌神经毒素血清型B的第866至1291位，
肉毒杆菌神经毒素血清型C1的第864至1291位或者1280位，
肉毒杆菌神经毒素血清型D的第860至1276位或者1285位，
肉毒杆菌或者丁酸梭菌(C.butyricum)神经毒素血清型E的第843至1251位或者1252位，
肉毒杆菌或者巴拉蒂梭菌(C.baratii)神经毒素血清型F的第861至1274位，第862至1280位或者1278位和第854至1268位，
肉毒杆菌神经毒素血清型G的第861至1297位。
因此，优选对上述位置中的至少一种氨基酸进行翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或利用天然或非天然氨基酸进行取代。
根据一个优选实施方式，神经性毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型A。在本例中，优选肉毒杆菌神经毒素血清型A中下述位置处的至少一种氨基酸进行翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或利用天然或非天然氨基酸进行取代：位于1195位的苏氨酸、1196位的精氨酸、1199位的谷氨酸、1204位的赖氨酸、1205位的异亮氨酸、1206位的亮氨酸、1207位的丝氨酸、1209位的亮氨酸、1213位的天冬氨酸、1217位的亮氨酸、1255位的苯丙氨酸、1256位的精氨酸、1258位的异亮氨酸和/或1260位的赖氨酸。特别优选对肉毒杆菌神经毒素血清型A蛋白序列中的第1196位的精氨酸，1199位的谷氨酸，1207位的丝氨酸，1255位的苯丙氨酸，1256位的精氨酸，1258位的异亮氨酸和/或1260位的赖氨酸进行上述修饰。特别是，优选将第1207位的丝氨酸用精氨酸或者酪氨酸取代，以及将1260位的赖氨酸用谷氨酸取代。
根据一个优选实施方式，神经性毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型B。在本案中，优选肉毒杆菌神经毒素血清型B中下述位置处的至少一种氨基酸进行翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或利用天然或非天然氨基酸进行取代：位于1113位的赖氨酸、1114位的天冬氨酸、1116位的丝氨酸、1117位的脯氨酸、1118位的缬氨酸、1182位的苏氨酸、1183位的酪氨酸、1186位的苯丙氨酸、1188位的赖氨酸、1191位的谷氨酸、1192位的赖氨酸、1193位的亮氨酸、1194位的苯丙氨酸、1204位的苯丙氨酸、1243位的苯丙氨酸、1245位的谷氨酸、1254位的赖氨酸、1255位的天冬氨酸和1256位的色氨酸。特别优选对肉毒杆菌神经毒素血清型B蛋白序列中的第1118位的缬氨酸、1183位的酪氨酸、1191位的谷氨酸、1192位的赖氨酸、1245位的谷氨酸和1256位的色氨酸进行上述修饰。特别是，优选将第1183位的酪氨酸和1191位的谷氨酸用亮氨酸取代。
根据另一个优选实施方式，神经性毒素是肉毒杆菌神经毒素血清型G。在本例中，优选肉毒杆菌神经毒素血清型G中下述位置处的至少一种氨基酸进行翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或利用天然或非天然氨基酸进行取代：位于1121位的苯丙氨酸、1123位的赖氨酸、1124位的丙氨酸、1125位的丝氨酸、1126位的甲硫氨酸、1190位的缬氨酸、1191位的亮氨酸、1194位的丝氨酸、1196位的谷氨酸、1199位的苏氨酸、1200位的谷氨酸、1201位的亮氨酸、1202位的苯丙氨酸、1212位的苯丙氨酸、1248位的苯丙氨酸、1250位的赖氨酸、1251位的天冬酰胺和1262位的酪氨酸。特别优选对肉毒杆菌神经毒素血清型G蛋白序列中的第1126位的甲硫氨酸、1191位的亮氨酸、1199位的苏氨酸、1200位的谷氨酸、1250位的赖氨酸和1262位的酪氨酸进行上述修饰。特别是，优选将第1262位的酪氨酸取代为苯丙氨酸。
本发明提供的转运蛋白显示出其蛋白质结合结构域具有增加或减小的亲和性，特别是对于属于突触结合蛋白家族的分子或者属于突触泡囊糖蛋白2的分子而言。
本发明的另一个实施方式涉及一种组合物，包含根据本发明所述的转运蛋白和至少一种间插分子(X)。该间插分子可以是一种小的有机分子、一种肽或一种蛋白质；优选通过肽键、酯键、醚键、硫键、二硫键或者碳-碳键与转运蛋白共价结合。
另外，这种间插分子包括所有已知的治疗用活性物质。细胞静止剂、抗生素、抗病毒剂，但是本文优选免疫球蛋白。
在一个优选实施例中，该转运蛋白是一种蛋白酶，分解一种或者多种神经递质释放组织蛋白质，蛋白酶选自由肉毒杆菌神经毒素的LC组成的神经毒素组，特别是血清型A、B、C1、D、E、F和G或者肉毒杆菌神经毒素的LC的蛋白水解活性片段。特别是血清型A、B、C1、D、E、F和G的神经毒素，该片段显示出至少0.01％的天然蛋白酶的蛋白质分解活性、优选至少5％、特别优选至少50％、特别是至少90％。优选转运蛋白和蛋白酶来自同一种血清型的肉毒杆菌神经毒素，特别是优选转运蛋白的HN结构域，并且蛋白酶衍生于肉毒杆菌神经毒素血清型A。蛋白酶的序列可以从可进入的数据库中获得，其数据库编号显示在表1中。蛋白酶的蛋白质分解活性通过底物分离动力学的方法进行测定(参见Binz et al(2002)，Biochemistry 41(6)，1717-23)。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种用于生产转运蛋白的工艺。在本案中，第一步提供了编码转运蛋白的核酸。本文中的编码核酸是指RNA，DNA或者它们的混合物。鉴于其核酸酶抗性(nuclease resistance)，可以比如通过插入硫代磷酸酯(phosphorthioate)键进一步修饰该核酸。该核酸可以从起始核酸(starting nucleic acid)生产出来，后者可以例如通过从基因组或者cDNA的克隆-数据库中获取。另外，核酸还可以直接通过固相合成而生产出来。适合的方法是本领域技术人员所熟知的。假定对例如通过定点特定突变可以产生对起始核酸的特异性修饰，导致至少在氨基酸水平上的添加、插入、删除和/或取代。然后将核酸有效地与适当的启动子连接。用于在已知表达系统中表达的合适启动子是本领域技术人员所熟知的。在本案中，启动子的选择取决于表达所采用的表达系统。通常，优选组成型启动子(constitutive promoter)，但是也可以采用诱导型启动子(inducible promoter)。用这样的方法产生的构造包括：至少一个部分载体，特别是调控元件；选自λ-衍生物、腺病毒、杆状病毒、牛痘苗病毒、猿猴肾病毒40(SV40-viruses)和逆转录病毒的载体。优选该载体能够在所给定的宿主细胞中表达核酸。
本发明进一步提供了包含有载体并适于表达载体的宿主细胞。所选择的许多原核和真核表达系统都已知属于现有技术，例如，寄主细胞选自原核细胞中的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，选自真核细胞中的酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(P.pastoris)。虽然也可以使用更高等的真核细胞，例如昆虫细胞或者哺乳动物细胞，然而宿主细胞优选像肉毒杆菌一样，没有糖基化组织。
根据一个优选实施方式，核酸编码肉毒杆菌神经毒素的HC-片段。该核酸包含内切核酸酶界面(其侧接于编码Hc片段的核酸两侧)，其内切核酸酶位点与肉毒杆菌神经毒素的其它Hc片段位点一致，为了使得它们在编码转运蛋白的基因中容易进行模块置换，同时保持了氨基酸序列的相似性。
如果根据本发明提供一种组合物，除转运系统外，它还进一步包含至少一个间插分子，并且用羧基端半胱氨酸或者巯基基团使该间插分子、肽或蛋白质功能化，然后，以与前述相类似的方式，可以通过重组法例如使用双载体或者多种寄主细胞来生产肽和/或蛋白质。如果相同的宿主细胞同时用于表达转运蛋白和肽或者蛋白质，优选分子间二硫键原位形成。为了在相同的宿主细胞中进行更有效的生产，也可以在相同的阅读框中将编码肽或蛋白的核酸与编码转运蛋白的核酸一起翻译，结果生产出单链多肽。该情况下优选分子内二硫键是原位形成。为了对转运蛋白与肽和/或蛋白质之间同样出现的肽交联进行简单水解，将氨基酸序列插入转运蛋白氨基端，其被专一性地识别并且被蛋白酶凝血酶或被专一性的的寄主细胞内切蛋白酶分裂。
令人惊奇的是，如果插入序列CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC(SEQ ID NO：1)，其中X表示任何需要的氨基酸，Z和B分别独立地选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸，它在体内可以被细菌宿主特别是大肠杆菌的一种内源蛋白酶有效地分裂。在转运蛋白和肽或蛋白质中间插入该插入序列，可以给后一阶段的后处理带来优势，例如不再需要利用凝血酶处理。大肠杆菌菌株特别优选E.coli K12。
优选该插入序列形成具有18～20个氨基酸的环。
如果这样不可行，在对转运蛋白和蛋白分别进行分离纯化后，可以接着通过本领域技术人员熟知的氧化工艺在转运蛋白和蛋白之间形成适合的分子间二硫键。也可以通过合成或者片段缩合直接得到肽或者蛋白质，适宜的方法是本领域技术人员所熟知的方法。
随后分别对转运蛋白和肽或蛋白质进行纯化。为达到此目的，可利用本领域技术人员熟知的方法，例如离子色谱法或电泳法。
本领域的另一个实施方式涉及一种药物组合物，其包含该转运蛋白或一种组合物、以及任意药理学可接受的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。
该药物组合物适合口服、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和局部给药。本文中优选肌肉注射给药。药物组合物的一个剂量单位包含大约0.1pg至1mg的根据本发明的转运蛋白和/或组合物。
该药物组合物适合治疗神经递质机能障碍和诸如下述机能障碍：半面痉挛、痉挛性斜颈、眼睑痉挛、痉挛状态、肌张力障碍、偏头痛、疼痛、颈部和腰椎脊柱机能障碍、斜视、多涎、伤口愈合、打鼾和抑郁。颈和腰椎脊柱机能障碍、斜视、唾液分泌过多和抑郁疾病。
本发明的另一个实施方式包括一种化妆品组合物，含有转运蛋白和适合化妆品的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。该化妆品组合物适于治疗多汗和面部皱纹。
附图说明
图1：利用GST-pull-down分析法对于在神经节苷脂存在或不存在的情况下，野生型和突变型BoNT/B的HC-片段与缩短的GST-syt I和GST-syt II融合蛋白之间结合的体外研究。
图2：利用GST-pull-down分析法对于在神经节苷脂存在或不存在的情况下，野生型和突变型BoNT/G的HC-片段与缩短的GST-syt I和GST-syt II融合蛋白之间结合的体外研究。
图3：HDA中BoNT/B和G野生型的剂量-效应关系图。使用效价函数对单一突变型和相关的野生型的麻痹时间进行了对比。
图4：HDA中，与BoNT/B野生型相比单一突变体神经毒性的增加和减小。
图5：HDA中，与BoNT/G野生型相比单一突变体神经毒性的增加和减小。
图6：HDA中BoNT/B野生型和BoNT/A单一突变体的剂量-效应关系图。
具体实施方式
具体地讲，本发明含有转运蛋白(Trapo)，其通过修饰肉毒梭菌所产神经毒素的HC而形成，优选专一性地结合于神经元，通过受体介导的胞吞作用优选进行细胞内吸收，并从酸性内体小室易位进入神经元胞质液。该蛋白质被用作转运手段，以便将蛋白酶和其他结合于所述转运手段、且不能生理学地渗入细胞膜并且到达神经细胞胞质液的其它物质导入细胞内。该蛋白酶的底物是定位于细胞内的参与神经递质释放的蛋白质和多肽。在底物分离后，神经元的特定功能就会被阻断；但细胞本身并不受损。这些功能之一是造成神经递质释放的胞吐作用。如果递质释放被抑制，从细胞到细胞的信号传递就会被阻断。例如，如果在神经肌肉接触点处的乙酰胆碱释放被抑制，横纹肌就会被麻痹。如果把该转运蛋白应用于痉挛或张力障碍肌肉的神经末端，可以临床使用该效果。其它的活性物质为，例如显示出抗病毒作用的物质。与转运蛋白相配合，它们可用来治疗神经系统的病毒感染。本发明还涉及转运蛋白用于抑制神经递质释放的用途。
具有相对较低亲和性的转运蛋白可与神经细胞结合，但不会被它们吸收。这些转运蛋白因此适于作为特定的针对神经细胞表面的转运手段。
如果采用来自肉毒杆菌的原毒素A和B对患者进行治疗，尽管使用低剂量，注射这些非人源蛋白质也会导致抗体的形成，致使这种治疗失效并且因此而必须停止使用以防止过敏性休克。通过施用具有相同作用机制、又具有更高酶活性转运效率的物质，剂量可以显著降低，并且不会产生抗体。这些特性归因于此处描述的转运蛋白。
虽然给出了应用实施例，但是合适的应用模式和剂量通常是由主治医生分别确定。常规上讲应该由精通相关专业领域的医师做出这些决定。因此，例如可以基于例如所选神经毒素溶解度或者待治疗痛感强度的标准，按照本发明在此的描述而选择应用模式和神经毒素剂量。
利用来自肉毒杆菌的天然原毒素A和B进行治疗的间隔时间一般平均为3到4个月。延长该间隔将会降低抗体形成的风险，并并且使得BoNT有较长的治疗周期。在胞质液中LC的增加将随时间延迟其分解，并从而延长了作用的持续时间。此处描述的转运蛋白显示出比天然HC更高的亲和力以及吸收速率。
下述实施例仅用于阐明本发明，并不得理解为一种对本发明的限制方式。
材料和方法
重组蛋白的制备以及其质粒的构建
采用合适的引物，以编码BoNT/A(AAA23262)、BoNT/B(AAA23211)、和BoNT/G(CAA52275)的染色体DNA以及表达载体pQe3(Quiagen AG公司)作为起始载体，利用PCR方法得到所需质粒，该质粒用于在E.coli中表达BoNT/B的重组HC-片段、BoNT/G的重组HC-片段、以及带有羧基端StrepTag的全长形式BoNT/A、B和G的重组HC-片段，其中StrepTag用于亲和纯化。将鼠-突触结合蛋白I(syt I)(1-53个氨基酸；1-82个氨基酸)和鼠-突触结合蛋白II(syt II)(1-61个氨基酸；1-90个氨基酸)的缩短变种克隆入GST编码的载体pGEX-2T(Amersham Biosciences AB公司)。所有质粒的核酸序列通过DNA测序进行确认。重组的HC-片段以及全长形式BoNT的HC-片段通过在室温下对E.coli-菌株M15[pRep4](Qiagen公司)诱导10小时、并根据厂商的说明书在StrepTactin-matrix(IBA GmbH公司)上进行纯化后而制得。通过借助固定在琼脂糖凝胶微粒上的谷胱甘肽，从E.coli BL21得到的GST-融合蛋白被分离出来。合并包含了所需蛋白的片段的部分，在Tris-NaCl-triton缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0,5％Triton X-100，pH 7,2)中进行透析。
GST-pull-down
在总体积为180μl的Tris-NaCl-triton-buffer缓冲体系中，分别在加入或不加入牛脑神经节苷脂混合物(18％GM1，55％GD1a，10％GT1b，2％其它神经节苷脂，Calbiochem；每份20μg)的情况下，将固定在10μl GT-脂糖凝胶微粒上的GST融合蛋白(每份0.12nmol)在4℃下与HC-fragments(0.1nmol)一起孵育2h。离心并收集微粒，去除上清，每种分离后的微粒用400μl相同的缓冲液洗涤3次。漂洗后的沉淀小丸部分在SDS-样品缓冲液中煮沸，与上清部分一起，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行研究。
BoNT/B野生型只在神经节苷脂复合物以及带有跨膜结构域的突触结合蛋白I都存在时才会结合，而在突触结合蛋白II无论是否带有跨膜结构域、是否存在神经节苷脂复合物时都可以结合。通过特异性取代BoNT/B的蛋白受体结合位点处的氨基酸，可以显著地增强(E1191L；Y1183L)或者减弱(V1118D；K1192E)它与两种突触结合蛋白分子间的相互作用(图1)。
对于BoNT/G野生型，研究显示，其可与突触结合蛋白I和II结合，而无论这两种突触结合蛋白是否带有跨膜结构域，也无论经节苷脂复合物是否存在。通过与BoNT/B相类似地特异性取代位于BoNT/G的蛋白受体结合位点处的氨基酸，可以明显地增强(Y1262F)或者减弱(Q1200E)BoNT/G与这两种突触结合蛋白分子间的相互作用(图2)。
对重组的BoNT/B和G的HC-片段与分离的、固定化的神经节苷脂之间结合进行探测发现，通过向syt-结合袋导入突变体，可以排除对相邻的神经节苷脂结合口袋的功能造成损害，并得出了HC-片段的完整三维结构的充分结论。这些结果得到了同样展现了BoNT/B和G的突变HC-片段的三维结构的CD光谱研究和热变性实验的支持。
小鼠半隔膜分析(HDA)
BoNT/A、B和G突变体的神经毒性通过Habermann等人描述的方法进行测定(Habermannet al.，Naunyn Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.311(1980)，33-40)。
在HDA中确定的全长形式BoNT/A、B和G野生型的效价通过剂量-效应关系图(图3和6)表示了出来。不同的全长形式BoNT/A、B和G单一突变体的效价随后也通过HAD进行了测定(图6)，并且使用效价函数通过绘图对全长形式BoNT/A、B和G野生型进行了对比(图4和5)。将BoNT/B中第1118位缬氨酸取代为天冬氨酸或者将第1192位赖氨酸取代为谷氨酸，会使其效价显著减小为＜2％。与此相反，将第1183位酪氨酸分别突变为亮氨酸或精氨酸会导致BoNT/B效价显著的增加(图4)。将第1256位的酪氨酸修饰为苯丙氨酸同样使BoNT/G的效价增加；而将第1200位的谷氨酸突变为谷胺酰胺、赖氨酸或酪氨酸会导致BoNT/G的效价发生明显减弱(图5)。对于BoNT/A，将第1207位的丝氨酸修饰为精氨酸或酪氨酸会使其效价增加，而将第1260位的赖氨酸突变为谷氨酸会导致BoNT/A效价的强烈减弱(图6)。
序列表
<110>托克索基因有限公司
     麦氏制药公司
<120>用于靶向神经细胞的载体
<130>PDEBP07001869
<140>PCT/EP2006/003896
<141>2006-04-26
<150>10 2005 019 302.1
<151>2005-04-26
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>切割位点
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(4)
<223>X可以是任何天然氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X可以选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>X可以选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(19)
<223>X可以是任何天然氨基酸
<400>1
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Thr Lys Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys
1           5                       10                  15
Xaa Xaa Xaa Cys
            20

Claims (45)

1.一种转运蛋白，其通过修饰肉毒杆菌所产神经毒素的重链而得到，其中，
(i)所述蛋白质以与天然神经毒素相比更高或更低的亲和力与神经细胞结合；
(ii)所述蛋白质具有与天然神经毒素相比增强或减弱的神经毒性，所述神经毒性适宜通过半隔膜分析法测定；并且/或者，
(iii)与天然神经毒素相比，所述蛋白质显示出更低的与中和抗体亲和力。
2.根据权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，所述中和抗体抑制天然神经毒素与蛋白质受体或与神经节苷脂受体的结合，并且/或者抑制神经毒素在神经细胞中的吸收。
3.根据权利要求1或2所述的转运蛋白，其特征在于，所述转运蛋白通过胞吞作用被细胞吸收。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白质特异性地结合于与细胞质膜相关的分子、跨膜蛋白、突触泡囊蛋白、突触结合蛋白家族的蛋白质、或突触泡囊糖蛋白2(SV2)、和/或突触结合蛋白I和/或突触结合蛋白II(胆碱能运动神经元)和/或SV2A、SV2B或SV2C，，优选人突触结合蛋白I和/或人突触结合蛋白II和/或人SV2A、SV2B或SV2C。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白显示出比天然神经毒素至少高15％或至少低15％的亲和力，优选至少50％，特别优选至少80％，并且特别优选至少90％。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述转运蛋白的HC-片段包含至少一种取代和/或删除、和/或插入、和/或添加、和/或对天然或非天然氨基酸的翻译后修饰，使得亲和力较天然神经毒素增强或者减弱。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述的神经毒素为肉毒杆菌神经毒素血清型A至G。
8.根据权利要求7所述的转运蛋白，其特征在于，位于下述蛋白质中氨基酸位的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：
肉毒杆菌神经毒素血清型A的第867至1296位，
肉毒杆菌神经毒素血清型B的第866至1291位，
肉毒杆菌神经毒素血清型C1的第864至1291，或者1280位，
肉毒杆菌神经毒素血清型D的第860至1276，或者1285位，
肉毒杆菌或者丁酸梭菌神经毒素血清型E的第843至1251，或者1252位，
肉毒杆菌或者巴拉蒂梭菌神经毒素血清型F的第861至1274、第862至1280或1278位和第854至1268位，
肉毒杆菌神经毒素血清型G的第861～1297位。
9.根据前面任一项权利要求所述的转运蛋白，其特征在于，所述天然神经毒素为神经毒素血清型A，所述转运蛋白优选与突触泡囊糖蛋白2(SV2)结合，特别优选与SV2A、SV2B或SV2C结合。
10.根据权利要求9所述的转运蛋白，其特征在于，位于所述肉毒杆菌神经毒素血清型A蛋白质序列中的下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1195位的苏氨酸、1196位的精氨酸、1199位的谷氨酸、1204位的赖氨酸、1205位的异亮氨酸、1206位的亮氨酸、1207位的丝氨酸、1209位的亮氨酸、1213位的天冬氨酸、1217位的亮氨酸、1255位的苯丙氨酸、1256位的精氨酸、1258位的异亮氨酸和/或1260位的赖氨酸。
11.根据权利要求10所述的转运蛋白，其特征在于，位于下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1196位的精氨酸、1199位的谷氨酸、1207位的丝氨酸、1255位的苯丙氨酸、1258位的异亮氨酸和/或1260位的赖氨酸。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述第1207位丝氨酸被精氨酸或者酪氨酸取代。
13.根据权利要求10或11中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述第1260位赖氨酸被谷氨酸取代。
14.根据权利要求1～8中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述神经毒素为肉毒杆菌神经毒素血清型B，所述转运蛋白优选结合于突触结合蛋白I或II。
15.根据权利要求14所述的转运蛋白，其特征在于，位于所述肉毒杆菌神经毒素血清型B蛋白质序列中的下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1113位的赖氨酸、1114位的天冬氨酸、1116位的丝氨酸、1117位的脯氨酸、1118位的缬氨酸、1182位的苏氨酸、1183位的酪氨酸、1186位的苯丙氨酸、1188位的赖氨酸、1191位的谷氨酸、1192位的赖氨酸、1193位的亮氨酸、1194位的苯丙氨酸、1204位的苯丙氨酸、1243位的苯丙氨酸、1245位的谷氨酸、1254位的赖氨酸、1255位的天冬氨酸和1256位的色氨酸。
16.根据权利要求15所述的转运蛋白，其特征在于，位于所述肉毒杆菌神经毒素血清型B蛋白质序列中下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1118位的缬氨酸、1183位的酪氨酸、1191位的谷氨酸、1192位的赖氨酸、1245位的谷氨酸和1256位的色氨酸。
17.根据权利要求16所述的转运蛋白，其特征在于，所述第1183位的酪氨酸被亮氨酸取代。
18.根据权利要求16所述的转运蛋白，其特征在于，所述第1191位的谷氨酸被亮氨酸取代。
19.根据权利要求1～8中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述的神经毒素为肉毒杆菌神经毒素血清型G。
20.根据权利要求19所述的转运蛋白，其特征在于，位于所述肉毒杆菌神经毒素血清型G蛋白质序列中的下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1121位的苯丙氨酸、1123位的赖氨酸、1124位的丙氨酸、1125位的丝氨酸、1126位的甲硫氨酸、1190位的缬氨酸、1191位的亮氨酸、1194位的丝氨酸、1196位的谷氨酸、1199位的苏氨酸、1200位的谷氨酸、1201位的亮氨酸、1202位的苯丙氨酸、1212位的苯丙氨酸、1248位的苯丙氨酸、1250位的赖氨酸、1251位的天冬氨酸和1262位的酪氨酸。
21.根据权利要求20所述的转运蛋白，其特征在于，位于所述肉毒杆菌神经毒素血清型G蛋白质序列中的下述氨基酸位置处的至少一个氨基酸被翻译后修饰、和/或添加、和/或删除、和/或插入、和/或被天然或非天然氨基酸取代：第1126位的甲硫氨酸、1191位的亮氨酸、1199位的苏氨酸、1200位的谷氨酸、1250位的赖氨酸和1262位的酪氨酸。
22.根据权利要求21所述的转运蛋白，其特征在于，第1262位的酪氨酸被苯丙氨酸取代。
23.一种组合物，包含权利要求1～22中任一项所述的转运蛋白和至少一种间插分子。
24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述间插分子通过肽键、酯键、醚键、硫键、二硫键、或碳-碳键与所述转运蛋白共价结合。
25.根据权利要求23或24所述的组合物，其特征在于，所述间插分子是小的有机分子、肽、或蛋白质。
26.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述小的有机分子为病毒抑制剂、细胞静止剂、抗生素、或免疫球蛋白。
27.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质为蛋白酶。
28.根据权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶包括一种或多种肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G的轻链(LCs)。
29.根据权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶包含有源于肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G的轻链(LC)的蛋白水解活性片段，该片段特征是具有至少0.01％、优选至少50％的天然蛋白酶的蛋白水解活性。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶特异性地分裂胆碱能运动神经元内的特定底物。
31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述底物选自于神经细胞中神经递质释放所涉及的蛋白质和能在神经细胞内进行催化反应的蛋白质。
32.根据权利要求28或29所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶和所述转运蛋白通过一段氨基酸序列而共价结合，所述氨基酸序列能被肽链内切酶特异性地识别和分裂的。
33.根据权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸序列包括序列CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC，其中X为任意所需要的氨基酸，Z和B分别独立选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸。
34.根据权利要求32所述的组合物，其特征在于，被肽链内切酶特异性分裂后，二硫桥连接起所述蛋白酶和所述转运蛋白，之后便形成活性全毒素。
35.一种药物组合物，包含根据权利要求1～22中任一项所述的转运蛋白或者根据权利要求23～34中任一项所述的组合物，还任选地包含药理学可接受的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物的用途，用于治疗本来用肉毒杆菌神经毒素医治的机能障碍和疾病。
37.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述机能障碍或疾病为下列之一：半面痉挛、痉挛性斜颈、眼睑痉挛、痉挛状态、肌张力障碍、偏头痛、疼痛、颈部和腰椎脊柱机能障碍、斜视、多涎、伤口愈合、打鼾和抑郁障碍。
38.一种化妆品组合物，包含根据权利要求1～22中任一项所述的转运蛋白或者根据权利要求23～34中任一项所述的组合物，还任选地包含化妆品用的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。
39.根据权利要求38所述的化妆品组合物的用途，用于处理美容目的的多汗和面部皱纹。
40.一种工艺，用于根据已知方法通过重组来制备根据权利要求1～22中任一项所述的转运蛋白或根据权利要求23～34中任一项所述的组合物。
41.根据权利要求40所述的制备转运蛋白的工艺，其特征在于，所述HC-片段的基因侧接有两个含有核酸的限制性内切核酸酶界面，所述内切核酸酶界面与肉毒杆菌神经毒素的其它HC-片段的内切核酸酶界面一致，从而使它们在保持氨基酸序列的相似性同时容易进行模块置换。
42.根据权利要求40所述的制备组合物的工艺，其特征在于，所述蛋白酶的基因侧接有两个含有核酸的限制性内切核酸酶界面，所述内切核酸酶界面与肉毒杆菌神经毒素的其它HC-片段的内切核酸酶界面一致，从而使它们在保持氨基酸序列的相似性的同时容易进行模块置换。
43.包含有重组表达载体的宿主细胞，其中所述表达载体编码根据权利要求1～22中任一项所述的转运蛋白，或者编码根据权利要求23～34中任一项所述的组合物。
44.根据权利要求43所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞可以是大肠杆菌细胞特别是E.coli K12、酿酒酵母、毕赤酵母或者枯草杆菌(Bacillus megaterium)。
45.表达载体，包含编码根据权利要求1～22中任一项所述转运蛋白或根据权利要求23～34中任一项所述组合物的核酸。
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