VEHÍCULO PARA TARGETING DE CÉLULAS NERVIOSAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con una proteína de transporte que se liga a neuronas con mayor o menor afinidad que la neurotoxina generada por Clostridi um botulinum . La proteína de transporte es absorbida preferentemente por endocitosis mediada por receptores. Esta proteína se usa como vehículo que trasloca otras sustancias químicas (por ejemplo proteasas) del compartimiento ácido endosomal al citosol de neuronas que no pueden penetrar fisiológicamente por la membrana de plasma al citosol de células neuronales. La presente invención se relaciona en particular con el uso de una proteína de transporte para introducir inhibidores de la emisión de neurotransmisores. Las células neuronales liberan sustancias transmisoras mediante la exocitosis. Como exocitosis se designa la fusión de las membranas de vesículas intracelulares con la membrana del plasma. En este proceso se derrama simultáneamente el contenido vesicular a la hendidura sináptica. La fusión de ambas membranas es regulada mediante calcio que reacciona con la proteína sinaptotagmina . Junto con los demás cofactores, SNAP-25, sinaptobrevina 2 y sintaxina ÍA. Mientras la sintaxina Al y la sinaptobrevina 2 están integradas en la membrana del plasma y de la vesícula, el SNAP-25 está ligado sólo débilmente con la membrana del plasma. Al incrementarse la concentración de calcio intracelular, las tres proteínas ligan entre sí aproximándose las dos membranas y a continuación de fusionan. En las neuronas colinérgicas se libera acetilcolina, que causa las contracciones musculares, la secreción de sudor y otras reacciones mediadas de modo colinérgico. Las tres proteínas de fusión precedentemente mencionadas son las moléculas meta (sustratos) de la cadena ligera (LC) de las neurotoxinas clostridianas, que son formadas por las bacterias C. botulinum , C. butiri cum , C. bara tii y C. tetani . La bacteria anaeróbica, gram positiva C. botulinum produce siete diferentes serotipos de la neurotoxina clostridiana . Éstos se designan como las neurotoxinas Botulinus (BoNT/A a BoNT/G) . De estos son sobre todo BoNT/A y BoNT/B las que causan enfermedades neuroparalíticas en el hombre y el animal, que son designadas como botulismo. Las esporas de C. botul inum están presentes en la tierra, pero pueden desarrollarse también en conservas alimenticias no correctamente esterilizadas y cerradas de producción casera, que son la procedencia de muchos casos de botulismo.
BoNT/A es la más activa de todas las sustancias biológicas conocidas. Tan solo 5-6 pg de BoNT/A purificado representan una MLD (Median letal Dosis; dosis letal promedia, por sus siglas en inglés). Una unidad (inglés, unit, U) de BoNT/A es definida como MLD que mata después de inyección intraperitonea la mitad de ratones Swiss Webster femeninos con un peso de 18-20 g cada uno. Se caracterizaron siete BoNT inmunológicamente diferentes. Ellos llevan las designaciones Bo/NTA, B, Cl, D, E, F y G y pueden diferenciarse mediante neutralización con anticuerpos específicos de serotipo. Los diferentes serotipos de BoNT se diferencian en las especies de animales afectados en cuanto a la gravedad y la duración de la parálisis causada. Así, BoNT/A es 500 veces más activa, por ejemplo, en la rata en cuanto a la parálisis que BoNT/B. A esto se agrega que BoNT/B en primates, en una dosificación de 480 U/kg peso corporal resultó ser no tóxico. La misma cantidad de BoNT/A corresponde a 12 veces la dosis letal de esta sustancia en los primates. Por otro lado, en los ratones, la duración de la parálisis después de inyección de BoNT/A es 10 veces más larga que después de inyección de BoNT/E. Los BoNT son usados para el tratamiento de disfunciones neuromusculares que se caracterizan por una hiperactividad en músculos del esqueleto, causada por nervios patológicamente hiperactivos . BoNT/A es admitido por la U.S. Food and Drug Administration para el tratamiento de blefarospasmo, estrabismo, hiperhidrosis, arrugas y espasmos hemifaciales . Comparado con BoNT/A, los demás serotipos de BoNT poseen obviamente una actividad menor y una duración de actividad más corta. Los efectos clínicos de BoNT/A administrado intramuscular periférico se presentan usualmente dentro de una semana. La duración de la supresión de síntomas por una sola inyección intramuscular de BoNT/A asciende normalmente a aproximadamente tres a seis meses. Las neurotoxinas clostridianas hidrolizan específicamente diferentes proteínas del aparato de fusión. BoNT/A, Cl y E dividen SNAP-25, mientras que BoNT/B, D, F, G, así como la neurotoxina tétanos (TeNT) atacan la proteína de membrana, asociada con la vesícula (VAMP)2 -llamada también sinaptobrevina 2-. BoNT/Cl divide además la sintaxina ÍA. Las bacterias clostridias liberan las neurotoxinas como polipéptidos de una cadena con, respectivamente, 1251 a 1315 aminoácidos. A continuación, unas proteasas endógenas separan cada una de estas proteínas en un sitio determinado en 2 cadenas en cada caso ( 'muesca iento' ) , permaneciendo ambas cadenas, sin embargo, unidas entre sí mediante un puente disulfúrico. Estas proteínas de cadena doble son designadas como holotoxinas
(véase Shone et al . (1985) , Eur. J. , Biochem. 151, 75-82).
Las dos cadenas tienen diferentes funciones. Mientras la parte menor representa la cadena ligera (en inglés: light chain = LC) , una endoproteasa dependiente de Zn2+, la unidad mayor (inglés: heavy chain = HC) es el transportador de la cadena ligera. Mediante tratamiento de la HC con endopeptidasas se produjeron dos fragmentos de 50 kDa
(véase Giménez et al . (1993), J. Protein Chem. 12, 351-363) . La mitad que termina en un amino (fragmento HN) se integra a un valor pH bajo en membranas y trasloca la LC en el citosol de la célula neuronal . La mitad que termina en carboxilo (fragmento Hc) liga en polisialogangliósidos complejos que sólo existen en las membranas de células neuronales, y en receptores de proteínas identificados hasta la fecha sólo de manera parcial (Halpern et al . (1993), Curr Top Microbiol Immuno. 195, 221-241). Esto explica la gran neuroselectividad de las neurotoxinas clostridianas. Las estructuras cristalinas confirman que BoNT/A posee tres dominios que pueden explicar las tres etapas del mecanismo activo (véase Lacy et al . (1998), Nat. Struct. Biol. 5, 898-902). Estos datos permiten además llegar a la conclusión de que dentro del fragmento Hc existen dos subunidades autónomas (subdominios) de 25 kDa en cada caso. La primera prueba de la existencia de los dos subdominios funcionales fueron proporcionadas con la mitad terminal amino (HCN) y mitad terminal carboxilo (HCc) del fragmento Hc del TeNT, que fueron expresadas de manera recombinante y que permitieron descubrir que el dominio HCc, pero no el dominio HCN liga en neuronas (véase Herreros et al . (2000), Biochem. J. 347, 199-204). En un momento posterior es localizó un solo sitio de liga de gangliósido dentro del dominio HCc de BoNT/A y B y se caracterizó (véase Rummel et a l . (2004), Mol. Microbiol. 51, 631-643). El sitio para la liga de la sinaptotagmina I y II identificada como receptor de proteína para BoNT/B y G pudo limitarse también a la región de los dominios Hcc de BoNT/B y G (véase Rummel et al . (2004), Mol. Microbiol. 279, 30865-70). El documento no manifiesta, sin embargo, los aminoácidos relevantes para la bolsa de liga de BoNT/B y G. En condiciones fisiológicas, la HC liga con el fragmento Hc en el gangliósido neuronal, se absorbe en el interior de la célula mediante endocitosis mediada por receptor y llega a través del compartimiento endosomal al ciclo vesicular natural. En el ambiente ácido de los endosomas inmaduros, el fragmento HN penetra en la membrana vesicular y forma un poro. Toda sustancia (X) que está unida con la HC a través de un puente disulfuro será separada del HC por sistemas redox intracelulares que obtienen acceso al puente disulfuro y lo reducirán.
Finalmente, X aparecerá en el citosol. En el caso de las neurotoxinas clostridianas, la HC es el portador de una LC que separa en la etapa final su sustrato específico en el citosol. El ciclo de la formación y disociación de complejos de las proteínas de fusión es interrumpido y con ello se inhibe la emisión de acetilcolina. En consecuencia se paralizan los músculos estriados y las glándulas sudoríparas paran su secreción. La duración de la actividad de los respectivos serotipos BoNT es diferente y depende de la presencia de LC inctactas en el citosol. Como todas las neuronas poseen receptores para neurotoxinas clostridianas, no es solo la emisión de acetilcolina la que puede ser afectada, sino potencialmente también la emisión de la sustancia P, de noradrenalina, GABA, glicina, endorfina y de otros transmisores y hormonas . En un estudio de ligandos se intercambiaron determinados radicales de aminoácidos dentro del dominio HCc de BoNT/B y G para identificar y caracterizar la bolsa de liga del receptor de proteína, para modificar así la afinidad al receptor de proteína. La afinidad de los fragmentos Hc mutados de BoNT/B y G fue determinado en ensayos de descenso de glutadion-S-transferasa (GST) con sinaptotagmina . A continuación se acopló la HC con las mismas mutaciones a LC-B respectivamente LC-G. La potencia de actividad de estos constructos fue analizada con la ayuda del preparado de nervio-músculo del ratón (ensayo de hemidiafragma, Hemi-Diafragma-Assay = HDA, por sus siglas en inglés). En este preparado se encuentra el nervus phreni cus que consiste de neuronas motores colinérgicas y que representa el blanco fisiológico más importante de la neurotoxina clostridiana . A continuación se intercambiaron en el dominio HCc de BoNT/A en una depresión que se encuentra en un sitio análogo a las bolsas de liga del receptor de proteína en BoNT/B y G, aminoácidos singulares. Los mutantes singulares de longitud completa de BoNT/A se analizaron a continuación también en el HDA en cuanto a una potencia modificada, lo que da indicaciones sobre interacciones de ligando-receptor de proteína modificadas. El complejo BoNT/A, denominado también toxina progenitora A, fue empleado en el pasado reciente para el tratamiento de distonías motores, así como para tranquilizar actividad simpática excesiva (véase Benecke et al . (1995), Akt. Neurol. 22, 209ss) y para aliviar dolor y migraña (véase Sycha et al . (2004), J. Neurol. 251, 19-30). Este complejo consiste de la neurotoxina, diferentes hemaglutininas y una proteína no tóxica, no hemaglutinina. En ambiente de pH fisiológico, el complejo se disocia en pocos minutos. La neurotoxina que surge a raíz de ello es el único componente del complejo que es terapéuticamente relevante y que causa un alivio de los síntomas. Debido a que no se cura el padecimiento neurológico fundamental, es necesario volver a inyectar el complejo en intervalos de tres a cuatro meses. Dependiendo de la cantidad de la proteína extraña inyectada, algunos pacientes forman anticuerpos BoNT/A específicos. Estos pacientes se vuelven resistentes a la neurotoxina. Una vez que células sensibles al antígeno detectan la neurotoxina y se han formado anticuerpos, las células memoria respectivas se preservarán por años. Por esto es importante tratar a los pacientes con preparaciones de actividad máxima en una dosificación tan baja como posible. Las preparaciones no deberían contener, además, otras proteínas de origen bacteriana, ya que estas pudieran actuar como adyuvantes inmunológicos. Estas sustancias atraen a los macrófagos que reconocen tanto los adyuvantes inmunológicos como también las neurotoxinas y los presentan a los linfocitos, que contestan en seguida con la formación de inmunoglobulinas. En consecuencia, se debieran usar en la terapia sólo productos de pureza máxima, que no contienen proteínas extrañas. La resistencia de los pacientes frente a la neurotoxina está basada, visto en el plano molecular, principalmente en la presencia de anticuerpos neutralizantes. Mediante la presente invención se presenta ahora una proteína de transporte (Trapo) que puede superar los problemas descritos en lo precedente de los métodos conocidos hasta ahora. Esta tarea se resolvió con una nueva proteína de transporte que se obtiene mediante la modificación de la cadena pesada de la neurotoxina formada por Clostridi um botulinum, en que (i) la proteína liga a células neuronales con afinidad mayor o menor que la neurotoxina nativa; (ii) la proteína posee, en comparación con la neurotoxina nativa, una neurotoxicidad incrementada o reducida; preferentemente se determina la neurotoxicidad con en ensayo de hemidiafragma; y/o (iii) la proteína posee en comparación con la neurotoxina nativa una afinidad menor frente a anticuerpos neutralizantes. Según una modalidad preferida de la presente invención, se prepara una proteína de transporte que liga con una afinidad mayor o menor a las células nerviosas que la neurotoxina nativa formada por C. botulinum . Según otra modalidad preferida de la presente invención, se ofrece una proteína de transporte que es obtenida mediante modificación de la HC de la neurotoxina formada por C. botul inum, ligando en esto la proteína con mayor o menor afinidad que la neurotoxina nativa específicamente a las células nerviosas. La proteína de transporte es absorbida preferentemente por estas células mediante endocitosis. Según otra modalidad preferida se ofrece también una proteína de transporte que se obtiene mediante modificación de la HC de la neurotoxina formada por C. botulinum, siendo que la proteína ya no es accesible a la liga de anticuerpos neutralizantes debido a intercambios de aminoácidos expuestos en la superficie en particular en las bolsas de receptor de gangliósidos y proteínas. A continuación se definen los conceptos según deben ser entendidos en el contexto de la presente solicitud. "Liga a células nerviosas con afinidad mayor o menor que la neurotoxina nativa". La neurotoxina nativa es en esto la neurotoxina de C. botulinum . Preferentemente, la neurotoxina nativa es en esto la neurotoxina botulinus A y/o neurotoxina botulinus B y/o neurotoxina botulinus G de C. botulinum . La neurotoxina botulinus producida de manera recombinante de E . coli , que contiene, entre otros, la secuencia de aminoácidos idéntica a la neurotoxina botulinus nativa, se comporta farmacológicamente idéntica a la neurotoxina botulinus nativa y se denomina neurotoxina botulinus recombinante tipo silvestre. Las células nerviosas mencionadas en este contexto son neuronas motores colinérgicas. Preferentemente, la proteína de transporte liga específicamente a las moléculas asociadas a la membrana de plasma, proteína de transmembrana, proteínas de vesícula sináptica, una proteína de la familia de la sinaptotagmina o de la vesícula sináptica glicoproteína 2 (SV2), preferentemente sinaptotagmina I y/o sinaptotagmina II y/o SV2A, SV2B o SV2C, con particular preferencia sinaptotagmina I humana y/o sinaptotagmina II humana y/o SV2A, SV2B o SV2C humanas. La liga se determina preferentemente in Vi tro . Con particular preferencia, la determinación se realiza mediante el uso de un ensayo de descenso GST, que se explica en detalle en los ejemplos. "La proteína posee, en comparación con la neurotoxina nativa, una neurotoxicidad incrementada o reducida". La neurotoxina nativa en esto es la neurotoxina nativa de C. botulinum . Preferentemente, la neurotoxina nativa es en esto la neurotoxina botulinus A y/o neurotoxina botulinus B y/o neurotoxina botulinus G de C. botulinum . La neurotoxina botulinus producida de manera recombinante de E . coli , que contiene, entre otros, la secuencia de aminoácidos idéntica a la neurotoxina botulinus nativa, se comporta farmacológicamente idéntica a la neurotoxina botulinus nativa y se denomina neurotoxina botulinus recombinante tipo silvestre. Las células nerviosas mencionadas en este contexto son neuronas motores colinérgicas. La neurotoxicidad se determina preferentemente con la ayuda del ensayo de hemidiafragama
(HDA) conocido en el estado de la técni ca . La neurotoxicidad de las mutemas puede determinarse preferentemente según describe Habermann et al., Naunyn Schmiederg's Arch. Pharmacol. 311 (1980), 33-40. "Anticuerpos neutralizantes". Se conocen anticuerpos neutralizantes orientados contra la neurotoxina botulmus (Goschel H, Wohlfarth K, Frevert J, Dengler R, Bigalke H. Botulinum A toxm therapy: neutralizmg and nonneutralizing antibodies-therapeutic consequences, Exp. Neurol. 1997 Sep; 147 ( 1 ): 96-102 ) . Se ha descubierto que los anticuerpos que neutralizan la neurotoxina interactúan en particular con los centros activos como, por ejemplo, las bolsas de liga de receptor de gangliósido y proteína dentro del dominio Hcc de la neurotoxina. Si se modifican en la neurotoxma las superficies adyacentes a las bolsas de liga mediante intercambio de aminoácidos sin menoscabo de su funcionalidad, entonces los anticuerpos neutralizantes pierden sus sitios de liga y la neurotoxina mutada ya no es neutralizada. La expresión "modificación de la cadena pesada de la neurotoxina formada por C. botul mum" . La secuencia de aminoácidos y/o de acido nucleico de la cadena pesada (HC) de la neurotoxina formada por C. botul mum pueden obtenerse en los bancos de datos de acceso publico para cada uno de los serotipos conocidos A a G (véase también la tabla 1) . La modificación en esto comprende que al menos un aminoácido es suprimido, adicionado, insertado en la secuencia de aminoácidos, o al menos un aminoácido de la neurotoxina nativa es sustituido por otro aminoácido presente en forma natural o no natural y/o un aminoácido en la secuencia de aminoácidos dada es modificado de modo postraslacional . Las modificaciones postraslacionales comprenden en esto la glicolización, acetilación, acilación, desaminación, fosforilización, isoprenilización, glicosilfosfatidilinositolización, y otras modificaciones que el experto conoce. La HC de la neurotoxina formada por C. botulinum comprende tres subdominios, a saber, el dominio HN de translocación amino-terminal con tamaño de 50 kDa, el dominio HCN adyacente con tamaño de 25 kDa y el dominio HCc en el extremo de carboxilo de 25 kDa. Juntos, los dominios HCN y HCc se denominan fragmento Hc. Las secciones de aminoácidos correspondientes de los respectivos subdominios pueden desprenderse de la tabla 1 para cada uno de los serotipos y sus variantes. "Receptor de gangliósido" La HC de la neurotoxina botulinus poseen una afinidad alta a las células nerviosas periféricas que es medida principalmente por la interacción con unos gangliósidos complejos -éstos son los glicolípidos que consisten de más de un ácido sialínico- (Halpern et al. (1995), Curr. Top. Microbiol. Immunol . 195, 221-41; WO 2006/02707). En consecuencia, las LC ligadas a ellos llegan sólo a este tipo de células y se vuelven activas sólo en estas células. BoNT/A y B ligan sólo una molécula de gangliósido GTlb. En el caso de BoNT/B y BoNT/G, los receptores de proteína son sinaptotagmina I y sinaptotagmina II. En el caso de BoNT/A, los receptores de proteína son la glicoproteína 2 de vesícula sináptica (SV2), preferentemente SV2A, SV2B y SV2C. Corrientemente se conocen 13 isoformas de la familia de la sinaptotagmina. Todas ellas se caracterizan por dos dominios C2 en el extremo carboxilo que ligan Ca2+, un dominio de transmembrana mediano (TMD) que ancla la sinaptotagmina en la membrana de la vesícula sináptica, y por un extremo amino de diferente longitud. Después del influjo de Ca2+ se inicia la fusión de la vesícula sináptica con la membrana del plasma, en consecuencia de lo cual el extremo amino intraluminal de la sinaptotagmina se vuelve presente extracelular y está disponible como ancla de receptor para BoNT/B y G. Análogamente a esto, el cuarto dominio luminal de las isoformas SV2 están disponibles en forma extracelular para la interacción con BoNT/A después de la exocitosis. Mediante la mutagenesis deliberada se modificó el carácter de aminoácidos singulares de la bolsa de liga de manera tal que se dificulta o impide una liga a un receptor de proteína. De esta manera se expresaron y aislaron los fragmentos Hc de BoNT/B y BoNT/G recombinantes como tipo silvestre o con intercambios individuales de aminoácidos (mutaciones/sustituciones) en la bolsa de liga postulada en E . coli . Para un ensayo descendente GST para el análisis de la interacción in Vi tro entre BoNT/B y BoNT/G, así como la sinaptotagmina I y la sinaptotagmina II, se incubó la respectiva proteína de fusión de la sinaptotagmina GST con diferentes cantidades del respectivo fragmento de Hc de BoNT/B respectivamente BoNT/G y se realizó una separación de fases. Fragmento de Hc libre permaneció en el sobrenadante, mientras que fragmento de Hc de BoNT ligado pudo detectarse en la fase sólida junto con la proteína de fusión de sinaptotagmina GST. La sustitución de los respectivos fragmentos de Hc por la longitud completa de BoNT/B y G en el ensayo descendente GST dio el mismo resultado . En esto se detectó que el tipo silvestre de BoNT/B liga al dominio de la transmembrana sólo en presencia de gangliósidos complejos y sinaptotagmina I, mientras que la sinaptotagmina II es ligada tanto con como sin el dominio de transmembrana como también en presencia o ausencia de gangliosidos complejos. Mediante la sustitución deliberada de aminoácidos en el interior del sitio de liga de receptor de proteina de BoNT/B pudo incrementarse, respectivamente, debilitare claramente la interacción con ambas moléculas de la smaptotagmina (figura 1) . Ademas se mostró para el tipo silvestre de BoNT/G que tanto en presencia como también en ausencia de gangliosidos complejos se realiza la liga a la sinaptotagmina I y sinaptotagmina II, en cada caso con o sin dominio de transmembrana. Mediante la sustitución deliberada de aminoácidos homólogos a BoNT/B en el interior del sitio de liga del receptor de proteina de BoNT/G pudo incrementarse respectivamente debilitarse claramente la interacción de ambas moléculas de la s naptotagmina (figura 2) . La potencia de la forma de longitud completa de tipos silvestres de BoNT/A, B y G fueron determinados en el HDA mediante una curva de dosis-efecto (figura 3 y 6) . A continuación se determino la potencia de las diferentes formas de longitud completa de mutantes singulares de BoNT/A, B y G en el HDA (figura 6) y se puso en proporción mediante una función de potencia comparada frente a la potencia de los tipos silvestres de BoNT/B y G (figuras 4 y 5) . A guisa de ejemplo, el intercambio de los aminoácidos valina 1118 contra aspartato, o lisina 1192 contra glutamato en BoNT/B produjo una reducción drástica de la potencia a < 2%. En contraste, la mutación de la tirosina 1183 en leucina respectivamente arginina produjo un claro incremento de la potencia de BoNT/B (figura 4). La modificación de tirosina 1256 a fenilalanina en BoNT/G resulta también en un incremento de potencia, mientras que la mutación de glutamina 1200 en glutamato, lisina o tirosina causan una fuerte reducción de la potencia de BoNT/G (figura 5) . En el caso de BoNT/A, la modificación de serina 1207 a arginina o tirosina produce un incremento de potencia, mientras que la mutación lisina 1260 en glutamato causa una reducción drástica de potencia del BoNT/A (figura 6) . Según una modalidad preferida, la proteína de transporte posee una afinidad que es al menos 15% más alta o al menos 15% más baja que la de la neurotoxina nativa. Preferentemente, la proteína de transporte posee una afinidad que es al menos 50% más alta o más baja, particularmente 80% más alta o más baja, y particular 90% más alta o más baja que la de la neurotoxina nativa. Según una modalidad preferida, la modificación de la HC se realiza en la región del fragmento de Hc de la neurotoxina dada. Siempre que la modificación comprenda una sustitución, supresión, inserción o adición, esta puede ser realizada, por ejemplo, mediante una mutagenesis deliberada, métodos para ello son conocidos para el experto. Los aminoácidos presentes en la neurotoxina nativa son modificados en esto mediante aminoácidos que existen naturalmente o que no existen naturalmente. En principio, los aminoácidos son clasificados en diferentes grupos físico-químicas. Aspartato y glutamato pertenecen a los aminoácidos de carga negativa. Entre los aminoácidos de carga positiva cuentan histidina, arginina y lisina. Entre los aminoácidos polares permanecen asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteina y tirosina. A los aminoácidos no polares pertenecen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina y triptofano. Grupos laterales aromáticos existen en los aminoácidos histidina, fenilalanina, tirosina y triptofano. Se prefiere en general que se intercambie un aminoácido por otro aminoácido que pertenece a otro grupo físico-químico. Según una modalidad preferida de la invención, la proteína de transporte es una neurotoxina botulinus del serotipo A a G. Para sello pueden obtenerse las secuencias de aminoácidos de las neurotoxinas nativas como sigue de los bancos de dato de acceso público:
Tabla 1: números de banco de datos de las secuencias de aminoácidos y distribución de los subdominios de las siete neurotoxinas botuhnus En cuanto al fragmento Hc de estas neurotoxinas botulinus se prefieren los aminoácidos en las posiciones de aminoácidos de 867 a 1296 de la neurotoxina C. botulinum serotipo A, 866 a 1291 de la neurotoxina C. botulinum serotipo B, 864 a 1291 respectivamente 1280 de la neurotoxina C. botulinum serotipo Cl, 860 a 1276 respectivamente 1285 de la neurotoxina C. botulinum serotipo D, 843 a 1251 respectivamente 1252 de la C. botulinum respectivamente C. butyricum neurotoxina serotipo E, 861 a 1274, 862 a 1280 respectivamente 1278 y 854 a 1268 de la C. botulinum respectivamente C. bara tii neurotoxina serotipo F, 861 a 1297 de la neurotoxina C. botulin um serotipo G. Se prefiere, sin embargo, que al menos un aminoácido en las posiciones precedentemente mencionadas sea modificado de manera postraslacional, y/o adicionado, y/o suprimido, y/o insertado, y/o sustituido por un aminoácido, que es de origen natural o no es de origen natural . Según una modalidad preferida, la neurotoxina botulinus es la neurotoxina serotipo A. Preferentemente al menos un aminoácido en las posiciones treonina 1195, asparagina 1196, glutamina 1199, Lisina 1204, isoleucina 1205, leucina 1206, serina 1207, leucina 1209, aspartato 1213, leucina 1217, fenilalanina 1255, asparagina 1256, isoleucina 1258 y/o Lisina 1260 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina botulinus serotipo A es modificada de manera postraslacional, y/o adicionada, y/o suprimida, y/o insertada y/o sustituida por un aminoácido, que es de origen natural o no es de origen natural. Particularmente preferidas son las posiciones asparagina 1196, glutamina 1199, serina 1207, fenilalanina 1255, isoleucina 1258 y/o lisina 1260. Según una modalidad preferida, la neurotoxina botulinus es la neurotoxina serotipo B. Preferente al menos un aminoácido es modificado postraslacional en las posiciones lisina 1113, aspartato 1114, serina 1116, prolina 1117, valina 1118, treonina 1182, tirosina 1183, fenilalanina 1186, lisina 1188, glutamato 1191, lisina 1192, leucina 1193, fenilalanina 1194, fenilalanina 1204, fenilalanina 1243, glutamato 1245, lisina 1254, aspartato 1255 y tirosina 1256 de las secuencias de proteínas de la neur?t?xirid b?lulinus ser?Lip? B, es modificada de modo postraslacional y/o adicionada, y/o suprimida, y/o insertada y/o sustituida por un aminoácido, que es de origen natural o no es de origen natural. Particularmente preferidas son las posiciones valina 1118, tirosina 1183, glutamato 1191, lisina 1192, glutamato 1245 y tirosina 1256 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina botulinus serotipo B. En particular se prefieren las posiciones tirosina 1183 y glutamato 1191 que son sustituidas por leucina. Según una modalidad preferida, la neurotoxina botulinus es la neurotoxina serotipo G. Preferente al menos un aminoácido es modificado postraslacional en las posiciones fenilalanina 1121, lisina 1123, alanina 1124, serina 1125, metionina 1126, valina 1190, leucina 1191, serina 1194, glutamato 1196, treonina 1199, glutamina 1200, leucina 1201, fenilalanina 1202, fenilalanina 1212, fenilalanina 1248, lisina 1250, aspartato 1251 y tirosina 1262 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina botulinus serotipo G, modificada de modo postraslacional y/o adicionada, y/o suprimida, y/o insertada y/o sustituida por un aminoácido, que es de origen natural o no es de origen natural. Particularmente preferidas son las posiciones metionina 1126, leucina 1191, treonina 1199, glutamina 1200, lisina 1250 y tirosina 1262 de las secuencias de proteínas de la neurotoxina botulinus serotipo G. En particular se prefieren las posiciones. En particular se prefiere la posición tirosina 1262 que es sustituida por fenilalanina. La proteína de transporte ofrecida en la presente invención posee una afinidad específica incrementada o disminuida de su dominio que liga proteínas, en particular a moléculas de la familia de las sinaptotagminas o de la glicoproteína 2 de la vesícula sináptica. Otra modalidad de la invención presente se relaciona con una composición que contiene una proteína de transporte inventiva y al menos una molécula (X) interventora. La molécula interventora puede ser una molécula orgánica pequeña, un péptido o una proteína; preferentemente enlazada con la proteína de transporte en forma covalente por un enlace de péptido, enlace de éster, enlace de éter, enlace de sulfuro, enlace de disulfuro o enlace carbono-carbono. La molécula interventora comprende además todas las sustancias conocidas terapéuticamente activas. Se prefiere en esto los citostáticos, antibióticos, virustáticos, pero también las inmunoglobulinas. En una modalidad preferida, la proteína es una proteasa que divide una o varias proteínas del aparato de liberación de neurotransmisores, siendo la proteasa seleccionada del grupo de las neurotoxinas que consiste de las LC de las neurotoxinas C. botulinum, en particular del serotipo A, B, Cl, D, E, F y G o de un fragmento activo proteolítico de la LC de una neurotoxina C. botulinum, en particular de una neurotoxina del serotipo A, B, Cl, D, E, F y G, poseyendo el fragmento al menos 0.01% de la actividad proteolítica de la proteasa nativa, preferentemente al menos 5%, particularmente preferido al menos 50%, en particular al menos 90%. Preferentemente, la proteína de transporte y la proteasa son derivadas del mismo serotipo de neurotoxina C. botulinum, prefiriéndose en particular el dominio HN de la proteína de transporte y la proteasa derivados de la neurotoxina C. botilinum serotipo A. Las secuencias de las proteasas son generalmente accesibles de los bancos de datos y los números de los bancos de dato pueden desprenderse de la tabla 1. La actividad proteolítica de las proteasas es determinada mediante una cinética de separación de sustrato (véase Binz et a l . (2002), Biochemistry 41(6), 1717-23). Según otra modalidad de la presente invención se ofrece un método para la producción de la proteina de transporte. En una primera etapa se prepara para ello un ácido nucleico que codifica la proteína de transporte. El ácido nucleido puede ser, en esto, ARN, ADN o mezclas de ellos. El ácido nucleico puede estar, además, modificado en cuanto a su resistencia a la nucleasa, como por ejemplo mediante inserción de enlaces de fosfortioato . El ácido nucleico puede producirse de un ácido nucleico como materia prima, donde el ácido nucleico de materia prima es obtenible, por ejemplo, mediante clonación de los bancos de genoma o cADN. El ácido nucleico puede producirse también directamente mediante síntesis de fases sólidas. Los métodos apropiados son del conocimiento del experto. Siempre que se parta de un ácido nucleico como materia prima puede realizarse una modificación deliberada que produce al menos una adición, inserción, supresión y/o sustitución. El ácido nucleico es unido entonces de manera operativa con un promotor apropiado. Promotores apropiados para la expresión en sistemas de expresión conocidos son del conocimiento del experto. La selección del promotor depende del sistema de expresión usado. De manera general se prefieren promotores constitutivos, pero es posible también usar promotores inducibles. El constructo así producido comprende al menos una parte de un vector, en particular elementos reguladores, siendo seleccionado el vector, por ejemplo, de los derivados ?, adenovirus, vaccinavirus, SV40 virus y retrovirus. El vector es capaz, preferentemente de expresar el ácido nucleico en una célula huésped determinada. La invención ofrece además células huésped que contienen el vector y que son apropiadas para expresar el vector. Se conocen en el estado de la técnica varios sistemas de expresión procariontes y eucariontes, seleccionándose las células huésped, por ejemplo, de células procariontes como E . coli o B . subtilis, de células eucariontes como S. cerevisiae y P. pastoris . Ciertamente es posible también usar células eucariontes superiores como células de insectos o células de mamíferos, pero se prefieren células huésped que no poseen un aparato de glicólisis igual como C. botul inum . Según una modalidad preferida, el ácido nucleico codifica el fragmento Hc de la neurotoxina C. botulinum . Este ácido nucleico contiene interfaces de endonucleasa que flanquean el ácido nucleico que codifica el fragmento de Hc, siendo las interfaces de endonucleasis compatibles con aquellas de otros fragmentos de Hc de las neurotoxinas de C. botulinum, para permitir su intercambio modular fácil en el gen que codifica la proteína de transporte, mientras se preserva la similitud de la secuencia de aminoácidos. Siempre que se prepare una composición inventiva que contiene, además de la proteína de transporte, también al menos una molécula interventora, y esta molécula interventora es un péptido o una proteína, funcionalizados con una cisteina del extremo carboxilo o un grupo mercapto, entonces es posible producir el péptido, respectivamente la proteína, de manera recombinante de manera análoga a la descrita en lo precedente, por ejemplo, usando vectores binarios o mediante células huésped diferentes. Siempre que se use la misma célula huésped para la expresión tanto de la proteína de transporte como también del péptido o de la proteína, se forma, preferentemente, in Si tu una liga disulfuro intermolecular. Para la producción más eficiente en la misma célula huésped, el ácido nucleico que codifica el péptido o la proteína puede trasladarse también con aquel de la proteína de transporte en el mismo marco de lectura, de manera que se produzca un polipéptido de una cadena. Para ello se forma entonces, preferentemente, una liga disulfuro intermolecular in Si tu . Para la hidrólisis sencilla del enlace peptídico también presente entre la proteína de transporte y el péptido, respectivamente, la proteína, se inserta en el extremo amino de la proteína de transporte una secuencia de aminoácidos que es reconocida y separada específicamente por la proteasa trombina o una endoproteasa específica de la célula huésped. Sorprendentemente se ha detectado que la secuencia de inserto CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC (SEQ ID NO: 1), en que X significa un aminoácido arbitrario y Z y B están seleccionados independientemente entre sí de alanina, valina, serina, treonina y glicina, es escindida eficientemente in Vivo por una proteasa endógena de un huésped bacteriano, preferentemente E . coli . La inserción de la secuencia de inserto entre la secuencia de aminoácido de la proteína de transporte y de otro péptido o proteína tiene, por lo tanto, la ventaja de que no se requiere un reprocesamiento posterior como, por ejemplo, mediante trombina. Se prefiere en particular la cepa de E . coli , E. coli K 12. La secuencia de inserto es preferentemente parte de un lazo con 18, 20, preferentemente aminoácidos. En caso de ser esto imposible, es posible provocar un enlace disulfuro correspondiente después de purificación separada de la proteína de transporte y de la proteína posteriormente mediante métodos de oxidación que son del conocimiento del experto. El péptido respectivamente la proteína puede obtenerse también directamente mediante síntesis o condensación de fragmentos. Los métodos correspondientes son del conocimiento del experto. La proteína del transporte y el péptido, respectivamente, la proteína es purificada a continuación. Para esto se usan los métodos que son del conocimiento del experto, como, por ejemplo, métodos de cromatografía o electrofóresis. Otra modalidad de la presenta invención se relaciona con una composición farmacéutica y opcionalmente un excipiente aceptable farmacéuticamente, un diluyente y/o un aditivo. La composición farmacéutica es apropiada para la administración oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular y tópica. Se prefiere en esto la administración intramuscular. Una unidad de dosis de la composición farmacéutica contiene aproximadamente 0.1 pg hasta 1 mg de la proteina de transporte y/o la composición inventiva. La composición farmacéutica es apropiada para el tratamiento de disfunciones de la liberación de neurotransmisores y enfermedades como, por ejemplo, espasmos hemifaciales, tortícolis espasmódica, blefaroespasmos, espasticidades, distonias, migraña, dolores, enfermedades de la columna cervical y lumbar, estrabismo, hipersalivación, curación de heridas, ronquera y depresiones. Otra modalidad de la presente invención incluye composiciones cosméticas que contienen una proteína de transporte y un excipiente cosméticamente aceptable, diluyente y/o aditivo. La .composición cosmética es apropiada para el tratamiento de hiperhidrosis y arrugas faciales . Figura 1: análisis de la liga in Vi tro del tipo silvestre y de fragmentos Hc de BoNT/B en proteínas de fusión acortadas GST-Syt I y GST-Syt II en presencia o ausencia de gangliósidos complejos mediante ensayo descendente GST. Figura 2: análisis de la liga in Vi tro del tipo silvestre y de fragmentos Hc de BoNT/G mutados en proteínas de fusión acortadas GST-Syt I y GST-Syt II en presencia o ausencia de gangliósidos complejos mediante ensayo descendente GST. Figura 3: Curva de dosis-actividad de los tipos silvestres BoNT/B y G en el HDA. Las funciones de potencia graficadas permiten una comparación relativa de los tiempos de parálisis de los mutantes individuales con los tipos silvestres asociados. Figura 4 : Decremento e incremento de la neurotoxicidad de los mutantes individuales de BoNT/B en comparación con el tipo silvestre en el HDA. Figura 5: Decremento e incremento de la neurotoxicidad de los mutantes individuales de BoNT/G en comparación con el tipo silvestre en el HDA. Figura 6: Curva de dosis-actividad de los tipos silvestres BoNT/A y del mutante individual BoNT/A en el HDA. En detalle, la presente invención contiene una proteína de transporte (Trapo) que surge mediante la modificación de la HC de la neurotoxina producida por C. botulinum, que liga preferentemente específicamente en neuronas y que es absorbida intracelular preferentemente por la endocitosis mediada por receptores y que es traslocada del compartimiento endosomal ácido al citosol de neuronas. Esta proteína es usada como vehículo para introducir las proteasas y otras sustancias ligadas a ella que no pueden penetrar fisiológicamente la membrana del plasma y llegar al citosol de las células nerviosas, en las células. Los sustratos de las proteasas son proteínas y péptidos de localización intracelular que participan en la liberación de transmisores. Después de la escisión de los sustratos, las funciones específicas de la neurona son bloqueadas, sin que la célula misma sea dañada. Una de estas funciones es la exocitosis que lleva a cabo la liberación de neurotransmisores. Si la liberación de transmisores queda inhibida, entonces la transmisión de señales de célula a célula queda bloqueada. Por ejemplo, los músculos estriados son paralizados, cuando la liberación de acetilcolina está inhibida en el sitio de contacto neuromuscular . Este efecto puede aprovecharse terapéuticamente, cuando la proteína de transporte es aplicada en terminaciones nerviosas de músculos espásticos o distónicos. Otras sustancias activas son, por ejemplo, sustancias activas con actividad antiviral. Si se conjugan con la proteína de transporte, entonces son de utilidad para el tratamiento de infecciones virales del sistema nervioso. La presente invención se relaciona también al uso de una proteína de transporte para la inhibición de la liberación de neurotransmisores. Proteínas de transporte con una afinidad baja ligan a las células nerviosas, pero no son absorbidas por éstas. Estas proteínas de transporte, por lo tanto, son apropiadas como transporte específico a la superficie de la célula nerviosa. Cuando los pacientes son tratados con las toxinas progenitoras A y B de C. botulinum, entonces la inyección de estas proteínas no humanas causa, no obstante la dosis baja, la formación de anticuerpos, de manera que la terapia queda sin efecto y debe ser, por lo tanto, interrumpida, para evitar últimamente un choque anafiláctico. Pero al aplicar una sustancia con el mismo mecanismo activo teniendo una eficiencia de transporte mayor de la actividad enzimática, entonces es posible reducir la dosis drásticamente y no se presentará la formación de anticuerpos. Esta característica corresponde a la proteína de transporte aquí descrita. Aún cuando se indican ejemplos para la aplicación, el modo de aplicación apropiado y la dosificación son, no obstante, determinados generalmente por el médico responsable del tratamiento en forma individual. Decisiones de esta naturaleza son tomadas a manera de rutina por todo médico familiarizado con la materia. Así es posible, por ejemplo, seleccionar el modo de aplicación y la dosificación de la neurotoxina según la invención aquí presentada basado en criterios de disolubilidad de la neurotoxina seleccionada o de la intensidad del dolor que debe ser tratado. Actualmente, el intervalo de tratamiento para las toxinas progenitoras A y B nativas de C. botulinum asciende a tres a cuatro meses en promedio. Una extensión de este intervalo reduciría el riesgo de la formación de anticuerpos y permitir una duración mayor del tratamiento con BoNT. El aumento de LC en el citosol extendería temporalmente su desintegración y con esto extender la duración de la actividad. La proteína de transporte descrita en la presente posee una afinidad y una tasa de absorción mayores que la HC nativa. El siguiente ejemplo sirve tan sólo para fines de aclaración y no debiera entenderse como limitante. Material y métodos Construcción de plásmidos y producción de proteínas recombinantes Plásmidos para la expresión de E . coli de fragmentos Hc recombinantes de BoNT/B y BoNT/G, así como la forma de longitud completa de BoNT/A, B y G con StrapTag en el extremo carboxilo para la purificación de la afinidad fueron producidos mediante métodos PCR con cebadores apropiados, ADN de cromosoma que codifica BoNT/A (AAA23262) BoNT/B (AAA23211) y BoNT/G (CAA52275) y el vector de expresión pQe3 (Qiagen AG) como vector inicial. Variantes recortadas de sinaptotagmina I de rata (Syt I) (aminoácidos 1-53; aminoácidos 1-82) y sinaptotagmina II de rata (Syt II) (aminoácidos 1-61; aminoácidos 1-90) fueron insertadas por clonación en el vector pGEX-2T codificante GCT (Amersham Biosciences AB) . Las secuencias se ácido nucleico de todos los plásmidos fueron confirmadas mediante secuenciación de ADN. Los fragmentos Hc recombinantes y la forma de longitud completa fueron producidos en la cepa E . , coli M15 [pRep4] (Qiagen) durante una inducción de diez horas a temperatura ambiente y purificada en una matriz StrepTactin (IBA GmbH) según recomendaciones del productor. La proteínas de fusión GST obtenidas fueron aisladas con al ayuda de glutation inmovilizada en esferitas de serafose. Las fracciones que contenían las proteínas deseadas fueron combinadas y dializadas contra un tampón de Tris-NaCl-Tritón (20 raM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % Tritón X-100, pH 7,2) . Ensayo descendente GST Las proteínas de fusión GST (en cada caso 0.12 nmol) que estaban inmovilizadas en esferitas de GT-serafose de 10 µl, se incubaron con fragmentos Hc (01. nmol) en ausencia o presencia de una mezcla de gangliósidos de cerebro de res (18% GMl, 55% GDla, 10% GTlb, 2% otros gangliósidos; Calbiochem; 20 µg en cada caso) en un volumen total de 180 µl de tampón de tris-NaCl-triton durante 2h. Las esferitas fueron combinadas mediante centrifugación, el sobrenadante se separó y las esferitas separadas fueron lavadas en cada caso tres veces con 400 µl del mismo tampón. Las fracciones de pellets fueron hervidas en tampón de muestras de SDS y se analizaron juntas con la fracción de sobrenadante mediante SDS-PAGE y tintado azul Coomassie. El tipo silvestre BoNT/B liga sólo en presencia de gangliósidos complejos y sinaptotagmina I con el dominio de la transmembrana, mientras que la sinaptotagmina II es ligada tanto con y sin el dominio de la transmembrana, como también en presencia o ausencia de gangliósidos complejos.
Mediante la sustitución deliberada de aminoácidos dentro del sitio de liga de receptor de proteínas de BoNT/B pudo incrementarse (E1191L; Y1183L) respectivamente reducirse
(V1118D; K1192E) claramente la interacción con ambas moléculas de sinaptotagmina (figura 1). Para el tipo silvestre de BoNT/G fue mostrado que se realiza tanto en presencia como también en ausencia de gangliósidos complejos la liga en sinaptotagmina I y sinaptotagmina II, en cada caso con o sin dominio de transmembrana. Mediante la sustitución deliberada de aminoácidos homólogos con BoNT/B dentro del sitio de liga del receptor de proteína de BoNT/G pude incrementarse (Y1262F) respectivamente reducirse (Q1200E) claramente la interacción con ambas moléculas de sinaptotagmina (figura 2) . Mediante comprobación de la liga de los fragmentos Hc recombinantes de BoNT/B y G en gangliósidos aislados, inmovilizados pude excluirse el daño de la función de la bolsa de liga de gangliósido contigua que permiten excluir las mutaciones introducidas en la bolsa de liga Syt y sacar conclusiones suficientes sobre una estructura terciaria intacta del fragmento Hc. Estos resultados son apoyados por los análisis mediante espectroscopia CD, así como experimentos de desnaturalización térmica, que también señalan unas estructuras terciarias intactas de los fragmentos Hc mutados de BoNT/B y G. Ensayo de hemidiafragma, ratón (HDA) La neurotoxicidad de las muteínas BoNT/A, B y G fue determinada según se describe en Habermann et al., Naunyn Schmiedeberg' s Arch. Pharmacol. 311 (1980), 33-40. La potencia de la forma de longitud completa de BoNT/A, B y G, tipos silvestres, fue determinada en el HDA mediante una curva de dosis-actividad (figura 3 y 6) . A continuación se determinó la potencia de las formas de longitud completa de BoNT/A, B y G de mutantes individuales en el HDA (figura 6) y se puso en proporción, mediante una función de potencia graficada con la potencia de los tipos silvestres de BoNT/B y G (figura 4 y 5) . Así el intercambio de los aminoácidos valina 1118 contra aspartato, o lisina 1192 contra glutamato en BoNT/B produce una reducción drástica de la potencia a < 2%. En contraste, la mutación de la tirosina 1183 en leucina respectivamente arginina produjo un claro incremento de la potencia de BoNT/B (figura 4). La modificación de tirosina 1256 a fenilalanina en BoNT/G resulta también en un incremento de potencia, mientras que la mutación de glutamina 1200 en glutamato, lisina o tirosina causan una fuerte reducción de la potencia de BoNT/G (figura 5) . En el caso de BoNT/A, la modificación de serina 1207 a arginina o tirosina produce un incremento de potencia, mientras que la mutación lisina 1260 en glutamato causa una reducción drástica de potencia del BoNT/A (figura 6) .