EA012578B1

EA012578B1 - Носитель для доставки в нервные клетки

Info

Publication number: EA012578B1
Application number: EA200702323A
Authority: EA
Inventors: Андреас Руммель; Таня Вайль; Александрс Гуйткайтс
Original assignee: Токсоген Гмбх; Мерц Фарма Гмбх Энд Ко. Кгаа
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2009-10-30
Also published as: US9650622B2; US20130315888A1; KR20080014754A; EP3181578B1; ZA200709166B; EP3511338A2; BRPI0610252A2; EA200702323A1; US10266816B2; AU2006239506A1; EP3511338A3; HUE044200T2; MX2007013284A; US9115350B2; IL186508A0; US8481040B2; TR201905924T4; PL3181578T3; WO2006114308A3; WO2006114308A8

Abstract

Настоящее изобретение относится к транспортному белку, который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи нейротоксинов, синтезируемых Clostridium botulinum, причем (1) белок специфически связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем нативный нейротоксин; (2) белок обнаруживает повышенную или пониженную нейротоксичность по сравнению с нативным нейротоксином; при этом предпочтительно нейротоксичность определяют в анализе на препарате гемидиафрагмы; и/или (3) белок по сравнению с нативным нейротоксином обладает меньшим сродством к нейтрализующим антителам. Кроме того, приведены способы его получения и применения в косметических и фармацевтических композициях.

Description

Настоящее изобретение относится к транспортному белку, который связывается с нейронами с большим или меньшим сродством, чем нейротоксин, продуцируемый С1о81пбшт Ьо1и1тит. Транспортный белок предпочтительно захватывается посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Этот белок находит применение в качестве транспортера, который транслоцирует из кислого эндосомального компартмента в цитозоль нейронов другие химические вещества (например, протеазы), которые физиологически не могут проникнуть через плазматическую мембрану в цитозоль нервных клеток. Настоящее изобретение относится, в частности, к применению транспортного белка для введения ингибиторов высвобождения медиаторов.

Нервные клетки высвобождают вещества-медиаторы посредством экзоцитоза. Под экзоцитозом понимают слияние мембраны внутриклеточной везикулы с плазматической мембраной. Одновременно при этом процессе в синаптическую щель выбрасывается содержимое везикулы. Слияние двух мембран регулируется ионом кальция, который реагирует с белком синаптотагмином. Совместно с другими кофакторами синаптотагмин контролирует состояние трех так называемых белков слияния - 8ΝΆΡ-25, синаптобревина-2 и синтаксина-1А. В то время как синтаксин-1А и синаптобревин-2 встроены в плазматическую мембрану и(или) мембрану везикул, 8ΝΑΡ-25 лишь слабо связан с плазматической мембраной. При повышении внутриклеточной концентрации кальция эти три белка связываются друг с другом, при этом обе мембраны сближаются и, в конечном счете, сливаются. В случае холинергических нейронов высвобождается ацетилхолин, который вызывает сокращения мышц, выделение пота и другие холинергически-опосредованные реакции.

Вышеуказанные белки слияния являются целевыми молекулами (субстратами) для легких цепей (ЪС) клостридиальных нейротоксинов бактерий С. Ьо1и1тит, С. ЬШупеит. С. Ьага1и и С. 1е1аш.

Анаэробная грамположительная бактерия С. Ьо1и1тит продуцирует семь различных серотипов клостридиальных нейротоксинов. Их называют ботулиновыми нейротоксинами (от ΒоNΤ/Α до ВоКТ/О). Из них, в частности, ВоКТ/А и ВоКТ/В вызывают у людей и животных нейропаралитическое заболевание, которое называется ботулизмом. Споры С. Ьо1и1тит обнаруживаются в земле, но они могут также развиваться в неправильно простерилизованных и закупоренных консервированных продуктах питания домашнего приготовления, которыми объясняют многие случаи ботулизма.

ВоКТ/А - это самое активное из всех известных биологических веществ. Всего 5-6 пг очищенного ВоКТ/А составляют МЛД (медианную летальную дозу). МЛД называют единицу (англ.: υηίΐ, и) ВоNТ/Α, которая после внутрибрюшинного введения убивает половину самок мышей линии §ет188 \7сЬ81ет весом 18-20 г. Было охарактеризовано семь иммунологически различных ВоКТ. Они обозначены как ВоКТ/А, В, С₁, Ό, Е, Е и О, и их можно различить по нейтрализации серотип-специфическими антителами. Различные серотипы ВоКТ отличаются по тяжести и длительности вызываемого ими паралича у поражаемых видов животных. Так, например, у крысы ВоКТ/А действует в 500 раз сильнее в отношении паралича, чем ВоКТ/В. К этому надо добавить, что доказано, что ВоКТ/В у приматов в дозировке, равной 480 Ед/кг веса тела, является нетоксичным. Такое же количество ВоКТ/А соответствует 12 летальным дозам этого вещества для приматов. Кроме того, у мышей длительность паралича после инъекции ВоКТ/А в 10 раз больше, чем после инъекции ВоКТ/Е.

ВоКТ используются в клинике для лечения нервно-мышечных нарушений, которые характеризуются гиперактивностью скелетных мышц, обусловленной патологически гиперактивными периферическими нервами. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (РИА) США разрешило использовать ВоКТ/А для лечения блефароспазма, страбизма, гипергидроза, морщин и гемифациальных спазмов. По сравнению с ВоКТ/А остальные серотипы ВоКТ обладают заметно меньшей эффективностью и меньшей длительностью эффекта. Клинические эффекты периферического внутримышечного введения ВоКТ/А обычно возникают в течение недели. Длительность подавления симптомов после единственной внутримышечной инъекции ВоКТ/А, как правило, составляет примерно от 3 до 6 месяцев.

Клостридиальные нейротоксины специфически гидролизуют различные белки аппарата слияния. ВоКТ/А, С1 и Е расщепляют 8КАР-25, тогда как ВоКТ/В, Ό, Е, О и столбнячный тейротоксин (ТеКТ) разрушают мембранный белок-2, ассоциированный с везикулами (УАМР-2), который также называют синаптобревином-2. Кроме того, ВоКТ/С'/ расщепляет синтаксин-1А.

Клостридиальные бактерии выделяют нейротоксины в виде одноцепочечных полипептидов, состоящих из 1251-1315 аминокислот. Затем эндогенные протеазы расщепляют эти протеины в определенном месте на 2 цепи («никинг»), хотя после этого обе цепи еще остаются связанными дисульфидным мостиком. Эти двухцепочечные протеины называют голотоксинами (см. 8йопе е1 а1. (1985), Еиг. 1. ВюсНет. 151, 75-82). Эти две цепи имеют различные функции. Если меньшая часть (легкая цепь=11дй1 ейат=ЕС)) представляет собой Ζη+зависимую эндопротеазу, то большая часть (тяжелая цепь=йеауу ейат=НС) является транспортером легкой цепи. При обработке тяжелой цепи эндопептидазами образуются два фрагмента по 50 кДа (см. Сппетех е1 а1. (1993), 1. Рто1еш СНет. 12, 351-363). При низком значении рН аминотерминальная часть (Н_К-фрагмент) встраивается в мембраны и транслоцирует легкую цепь в цитозоль нервной клетки. Карбокситерминальная часть (Н_С-фрагмент) связывается со сложными полисиалоганглиозидами, присутствующими только в мембранах нервных клеток, и до сих пор с лишь частично идентифицированными белковыми рецепторами (На1регп е1 а1. (1993), Сигг Тор М1етоЬю1 1ттипо1

- 1 012578

195, 221-241). Это объясняет высокую нейроселективность клостридиальных нейротоксинов. Кристаллические структуры подтверждают, что ΒοΝΤ/Α содержит три домена, которые можно привести в соответствие с тремя этапами механизма действия (см. Ьаеу с1 а1. (1998), Ναι 8!гис! ΒίοΙ 5, 898-902). Далее эти данные позволяют сделать вывод о том, что внутри Н_с-фрагмента существуют две автономные субъединицы (субдомены) размером по 25 кДа. Первое доказательство существования обоих функциональных субдоменов было получено с использованием аминотерминальной (Н, ·_Ν) и карбокситерминальной (Н_сс) частей Н_с-фрагмента ΤοΝΤ. которые были рекомбинантно экспримированы, и это позволило узнать, что с нейроном связывается Н_сс-, но не Н—домен (см. Негггегок с1 а1. (2000), Вюебет 1 347, 199-204). Позже был локализован и охарактеризован единственный участок связывания с ганглиозидами в Н_сс-доменах ΒοΝΤ/Α и В (см. К.итте1 е1 а1. (2004), Мо1. Мюгобюк 51, 631-643). Сайт связывания синаптотагминов I и II, идентифицированных в качестве белковых рецепторов ΒοΝΤ/Β и С, также удалось отнести к области Н_сс-доменов ΒοΝΤ/Β и С (см. К.итте1 е! а1. (2004), 1 Βίο1 сбет 279, 30865-70). Однако в этой статье не были описаны аминокислоты, относящиеся к карману связывания ΒοΝΤ/Β и С.

В физиологических условиях тяжелая цепь (НС) связывается с Н_с-фрагментом нейронального ганглиозида, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза поступает внутрь клетки и через эндосомальный компартмент поступает в естественный круговорот везикул. В кислой среде ранних эндосом Н\-фрагмент проникает в мембрану везикул и образует пору. Любое вещество (X), которое связано с НС дисульфидным мостиком, будет отделяться от НС при помощи внутриклеточных окислительновосстановительных систем, которые получают доступ к дисульфидному мостику и восстанавливают его. В конечном итоге, X появляется в цитозоле.

В случае клостридиальных нейротоксинов НС является переносчиком Ьс, которая на конечной стадии расщепляет свой специфический субстрат в цитозоле. Цикл образования и диссоциации комплексов белков слияния прерывается, и за счет этого подавляется выделение ацетилхолина. Вследствие этого поперечно-полосатые мышцы расслабляются, а потовые железы прекращают секрецию. Длительность эффекта отдельных серотипов ΒοΝΤ различна и зависит от присутствия интактных Ьс в цитозоле. Так как все нейроны имеют рецепторы клостридиальных нейротоксинов, влияние может быть оказано не только на выделение ацетилхолина, но потенциально также и на выделение субстанции Р, норадреналина, ГАМК, глицина, эндорфинов и других медиаторов и гормонов.

То, что преимущественно блокируется холинергическая передача, может объясняться тем, что НС проникает в периферическую часть нейрона. Центральные синапсы защищены гематоэнцефалическим барьером, который не могут преодолеть белки.

В исследовании взаимодействия «лиганд-рецептор» была произведена замена определенных аминокислотных остатков в Нсс-доменах ΒοΝΤ/Β и С с целью идентификации и определения характеристик кармана связывания белка-рецептора с тем, чтобы попытаться изменить сродство к белку-рецептору. Сродство мутированных Н_с-фрагментов ΒοΝΤ/Β и С было определено в экспериментах с обработкой синаптотагмина глутатион-8-трансферазой (Ό8Τ-ριι11<1ο\νη). Затем НС с этими мутациями соединяли с Ьс-Β или Ьс-С. Эффективность этих конструкций анализировали с помощью изолированного нервномышечного препарата мыши (анализ на гемидиафрагме = НО А). В этом препарате содержится №гуи§ рбтешсик, который состоит из холинергических мотонейронов и представляет собой важнейшую физиологическую мишень клостридиальных нейротоксинов. Затем в Нсс-доменах ΒοΝΤ/Α в углублении, которое находится в том же месте, что и карманы связывания с белком-рецептором в ΒοΝΤ/Β и С, были заменены отдельные аминокислоты. После этого отдельные мутанты ΒοΝΤ/Α полной длины анализировали с помощью НОА-анализа на предмет изменения их эффективности, что свидетельствует об изменении взаимодействий типа «лиганд-рецептор».

ΒοΝΤ/Α-комплекс, который также называют предшественником токсина А, в недавнем прошлом использовали для лечения моторных дистоний, а также для подавления избыточной симпатической активности (см. Βеηеске е! а1. (1995), Ак!. №иго1. 22, 209ГГ) и для облегчения болей и мигреней (см. 8усба е! а1. (2004), 1. №ига1. 251, 19-30). Этот комплекс состоит из нейротоксина, различных гемагглютининов и одного не токсичного и не гемагглютинирующего белка. При физиологических значениях рН комплекс диссоциирует за несколько минут. Выделяющийся при этом нейротоксин является единственной составной частью комплекса, которая имеет терапевтическое значение и обеспечивает облегчение симптомов. Так как лежащее в основе неврологическое заболевание не излечивается, необходимо повторно инъецировать комплекс с интервалами в три-четыре месяца. В зависимости от количества введенного чужеродного белка у некоторых пациентов образуются специфические антитела к ΒοΝΤ/Α. Эти пациенты становятся устойчивыми к нейротоксину. Если антиген-чувствительные клетки хотя бы один раз распознали нейротоксин и образовали антитела, соответствующие клетки памяти сохраняются в течение многих лет. Поэтому принято лечить пациентов препаратами с максимальной активностью в как можно меньших дозировках. Кроме того, препараты не должны содержать других белков бактериального происхождения, так как они могут действовать как иммуноадъюванты. Такие вещества привлекают макрофаги, которые распознают как иммуноадъюванты, так и нейротоксины, и представляют их лимфоцитам, которые отвечают на это образованием иммуноглобулинов. Вследствие этого для лечения следует использовать только продукты высочайшей чистоты, которые не содержат чужеродных белков. Устойчивость пациентов к

- 2 012578 нейротоксину связана, с молекулярной точки зрения, главным образом, с наличием нейтрализующих антител.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает транспортный белок (Тгаро), который дает возможность преодолеть вышеуказанные проблемы уже известных способов.

Эта задача была решена за счет нового транспортного белка, который можно получить посредством модификации тяжелой цепи нейротоксинов, синтезируемых Оойпйшш ЬоЛйпит, причем:

(1) белок связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем нативный нейротоксин;

(2) белок обнаруживает по сравнению с нативным нейротоксином повышенную или пониженную нейротоксичность; при этом нейротоксичность предпочтительно определяют в анализе на гемидиафрагме; и/или (3) белок по сравнению с нативным нейротоксином обладает меньшим сродством к нейтрализующим антителам.

Согласно предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем синтезируемый С. Ьо1и1шит нативный нейротоксин.

Согласно следующей предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который получен посредством модификации НС нейротоксина, синтезируемого С. ЬоШНпит, причем этот белок специфически связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем нативный нейротоксин. Предпочтительно транспортный белок поглощается этими клетками посредством эндоцитоза.

Согласно следующей предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который получен посредством модификации НС нейротоксина, синтезируемого С. ЬоШйпит, причем этот белок в результате замены обращенных к поверхности аминокислот, главным образом в карманах связывания с ганглиозидными и белковыми рецепторами, больше не способен к связыванию с нейтрализующими антителами.

Далее будет определено, как следует понимать некоторые термины в контексте настоящего изобретения.

«Связывание с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем у нативного нейротоксина». Нативный нейротоксин при этом предпочтительно является нативным нейротоксином С. ЬоЦШпшп. Предпочтительно при этом нативный нейротоксин является ботулиновым нейротоксином А, и/или ботулиновым нейротоксином В, и/или ботулиновым нейротоксином С из С. ЬоЦШгшш. Полученный рекомбинантным способом из Е. сой ботулиновый нейротоксин, который, в частности, имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности аминокислот нативного ботулинового нейротоксина, ведет себя с фармакологической точки зрения идентично нативному ботулиновому нейротоксину и называется рекомбинантным ботулиновым нейротоксином дикого типа. Упомянутыми выше нервными клетками являются холинергические мотонейроны. Предпочтительно транспортный белок специфически связывается с молекулами, ассоциированными с плазматической мембраной, трансмембранными белками, белками синаптических везикул, белком из семейства синаптотагминов или гликопротеином-2 синаптических везикул (8У2), предпочтительно с синаптотагмином I, и/или синаптотагмином II, и/или 8У2А, 8У2В или 8У2С; особо предпочтительно с синаптотагмином I человека, и/или с синаптотагмином II человека, и/или с 8У2А, 8У2В или 8У2С человека. Связывание предпочтительно определяется ίη νίΙΐΌ. Особо предпочтительным является определение с помощью анализа С8Т-ри11-ботеп, который подробно описан в примерах.

«Белок обнаруживает повышенную или пониженную нейротоксичность по сравнению с нативным нейротоксином». Нативным нейротоксином при этом является нативный нейротоксин С. ЬоЛБпит. Предпочтительно нативный нейротоксин является ботулиновым нейротоксином А, и/или ботулиновым нейротоксином В, и/или ботулиновым нейротоксином С из С. ЬоЛйпит. Полученный рекомбинантным способом из Е. сой ботулиновый нейротоксин, который, в частности, имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности аминокислот нативного ботулинового нейротоксина, ведет себя с фармакологической точки зрения идентично нативному ботулиновому нейротоксину и называется рекомбинантным ботулиновым нейротоксином дикого типа. Упомянутыми выше нервными клетками являются холинергические мотонейроны. Нейротоксичность предпочтительно определяют с помощью соответствующего современному уровню техники анализа на гемидиафрагме (НО А). Нейротоксичность мутеина предпочтительно можно определить, как описано в работе НаЬегтапп с1 а1., Ыаипуп 8с1ишсйсЬегд'8 Агсй. Рйагтасо1. 311 (1980), 33-40.

«Нейтрализующие антитела». Нейтрализующие антитела к ботулиновому нейротоксину хорошо известны (Со5с11с1 Н., \Уо111Гаг111 К., Егсуей 1., Оспд1сг В., В1да1кс Н. Во1и1шит А 1охт Легару: псШгаКхтд апб поппси1га1|/тд апйЬоЛск - ШегарсиИс сопксдиепсск, Ехр. Псига1. 1997 8ср; 147(1):96-102). Было обнаружено, что антитела, нейтрализующие нейротоксин, преимущественно реагируют с активными центрами нейротоксинов, например с карманами связывания ганглиозидных и белковых рецепторов в пределах НСС-доменов. Если в нейротоксине поверхности, окружающие карманы связывания, изменены посредст- 3 012578 вом замены аминокислот без негативного влияния на их функциональность, нейтрализующие антитела теряют сайты связывания, и мутированный нейротоксин больше не нейтрализуется.

Выражение «модификация тяжелой цепи нейротоксинов, образуемых С. Ьо1и1шит». Последовательность аминокислот и/или нуклеотидов тяжелой цепи (НС) нейротоксинов, образуемых С. Ьо1и1шит, обычно можно получить из общедоступных банков данных для каждого из известных серотипов А-С (см. также таблицу). Модификация при этом означает, что по меньшей мере одна аминокислота удалена, добавлена или вставлена в последовательность аминокислот, или что по меньшей мере одна аминокислота нативного нейротоксина заменена другой природной или не существующей в природе аминокислотой, и/или что одна аминокислота в данной последовательности аминокислот модифицирована после трансляции. При этом посттрансляционные модификации охватывают гликозилирование, ацетилирование, ацилирование, дезаминирование, фосфорилирование, изопренилирование, гликозилфосфатидилинозитолирование и другие модификации, известные специалисту в данной области техники.

НС нейротоксинов, образуемых С. Ьо1и1шит, содержит три субдомена, а именно аминотерминальный транслокационный домен Η_Ν размером 50 кДа, прилегающий к нему Н,-.,--домен размером 25 кДа и расположенный карбокситерминально Н_СС-домен размером 25 кДа. Нс,- и Н_сс-домены совместно называют Н_с-фрагментом. Соответствующие участки последовательностей аминокислот этих субдоменов для отдельных серотипов и их вариантов можно видеть в таблице.

«Ганглиозидный рецептор». НС ботулиновых нейротоксинов обладают высоким сродством к клеткам периферической нервной системы, которое преимущественно обусловлено взаимодействием со сложными полисиалоганглиозидами - это гликолипиды, состоящие более чем из одной сиаловой кислоты (На1регп с1 а1. (1995), сигг. Тор. М1стоЬю1. 1ттипо1. 195, 221-41; №0 2006/02707). Вследствие этого связанные с ними Ьс доходят только до клеток такого типа и эффективны только в этих клетках. ВоЫТ/А и В связываются только с одной молекулой ганглиозида СТ1Ь.

В случае ВоЫТ/В и ВоЫТ/С белковыми рецепторами являются синаптотагмин I и синаптотагмин II. В случае ВоЫТ/А белковыми рецепторами являются гликопротеины-2 синаптических везикул (8У2), предпочтительно 8У2А, 8У2В и 8У2с.

В настоящее время известны 13 изоформ, относящихся к семейству синаптотагминов. Все они отличаются двумя карбокситерминальными Са²⁺-связывающими С2-доменами, центральным трансмембранным доменом (ТМЭ), который фиксирует синаптотагмин в мембране синаптической везикулы, и одним аминотерминальным доменом различной длины. Входящий Са²⁺-ток инициирует слияние синаптической везикулы с плазматической мембраной, после чего внутрипросветная аминотерминаль синаптотагмина презентируется во внеклеточное пространство и используется в качестве рецептора, фиксирующего ВоЫТ/В и С. Аналогично четвертый внутрипросветный домен 8У2-изоформ после экзоцитоза становится доступным с внешней стороны клетки для взаимодействия с Во,Т/А.

Посредством направленного мутагенеза характер отдельных аминокислот кармана связывания был изменен так, чтобы связывание с белковым рецептором было затруднено или устранено. Для этого Н_сфрагменты Во,Т/В и Во,Т/С были рекомбинантно в виде дикого типа или с отдельными заменами аминокислот (мутациями/замещениями) в указанном кармане связывания экспримированы в Е. сой и изолированы. Для С8Т-Ри11-боетп анализа с целью исследования взаимодействия ίη νίΙΐΌ между ВоЫТ/В или ВоЫТ/С и синаптотагмином I или синаптотагмином II соответствующий слитый белок, состоящий из С8Т и синаптотагмина, инкубировали с различными количествами Н_с-фрагментов ВоЫТ/В или ВоЫТ/С и проводили фазовое разделение. Свободный Нс-фрагмент оставался в отделенном супернатанте, тогда как связанный Н_с-фрагмент ВоЫТ обнаруживался в твердой фазе совместно со слитым белком «С8Тсинаптотагмин». Замена соответствующего Н_с-фрагмента на полноразмерные ВоЫТ/В и ВоЫТ/С в С8ТРи11-боетп анализе дала такие же результаты.

При этом было обнаружено, что ВоЫТ/В дикого типа связывается с синаптотагмином I с трансмембранным доменом только в присутствии сложных ганглиозидов, тогда как с синаптотагмином II он связывается как при наличии или в отсутствие трансмембранного домена, так и в присутствии или в отсутствие сложных ганглиозидов. За счет направленной замены аминокислот внутри сайта связывания белкового рецептора Во,Т/В можно заметно усилить или ослабить взаимодействие с молекулами обоих синаптотагминов (фиг. 1).

Кроме того, для ВоЫТ/С дикого типа была показано, что как в присутствии, так и в отсутствие сложных ганглиозидов происходит его связывание с синаптотагмином I и синаптотагмином II с трансмембранными доменами или без трансмембранных доменов. За счет направленной замены аминокислот, гомологичных Во,Т/В, внутри сайта связывания белкового рецептора Во,Т/С можно было заметно усилить или ослабить взаимодействие с молекулами обоих синаптотагминов (фиг. 2).

Эффективность полномерных форм ВоЫТ/А, В и С диких типов была определена посредством НЭА при помощи кривой «доза-эффект» (фиг. 3 и 6). Затем посредством НЭА была определена эффективность различных единичных мутантов полномерных форм Во,Т/А, В и С (фиг. 6) и с помощью аппроксимированной кривой эффективности определено ее соотношение с эффективностью диких типов ВоЫТ/В и С (фиг. 4 и 5). Например, замена в ВоЫТ/В аминокислоты валина в положении 1118 на аспартат или лизина в положении 1192 на глутамат приводила к резкому снижению эффективности до <2%. В

- 4 012578 противоположность этому мутация тирозина в положении 1183 до лейцина или аргинина приводила к заметному увеличению эффективности ΒοΝΤ/Β (фиг. 4). Модификация тирозина в положении 1256 до фенилаланина в ΒοΝΤ/С также приводит к снижению эффективности, тогда как мутация глутамина в положении 1200 до глутамата, лизина или тирозина вызывает значительное увеличение эффективности ΒοΝΤ/С (фиг. 5). В случае ΒοΝΤ/Α модификация серина в положении 1207 до аргинина или тирозина приводит к повышению эффективности, тогда как мутация лизина в положении 1260 до глутамата вызывает резкое снижение эффективности ΒοΝΤ/Α (фиг. 6).

Согласно одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения транспортный белок обнаруживает по меньшей мере на 15% большее сродство или по меньшей мере на 15% меньшее сродство, чем нативный нейротоксин. Предпочтительно транспортный белок обнаруживает по меньшей мере на 50% большее или меньшее сродство, особенно предпочтительно по меньшей мере на 80% большее или меньшее сродство, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере на 90% большее или меньшее сродство, чем нативный нейротоксин.

Согласно одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения производится модификация НС в области Н_с-фрагмента соответствующего нейротоксина. Поскольку модификация охватывает замену, делецию, инсерцию или добавление аминокислот, она может быть осуществлена, например, посредством направленного мутагенеза, способы которого известны специалистам в данной области техники. При этом содержащиеся в нативном нейротоксине аминокислоты заменяют либо существующими в природе, либо не существующими в природе аминокислотами. Принципиально аминокислоты можно разделить на различные физико-химические группы. К отрицательно заряженным аминокислотам относятся аспартат и глутамат. К положительно заряженным аминокислотам относятся гистидин, аргинин и лизин. К полярным аминокислотам относятся аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин. К неполярным аминокислотам относятся глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин и триптофан. Ароматические боковые группы обнаруживаются у аминокислот гистидина, фенилаланина, тирозина и триптофана.

В целом, предпочтительно, чтобы аминокислота была заменена на аминокислоту, которая относится к другой физико-химической группе.

Согласно предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения транспортный белок представляет собой ботулиновый нейротоксин серотипов Α-С. При этом аминокислотные последовательности нативных нейротоксинов, приведенные ниже, можно получить из общедоступных банков данных.

Номера аминокислотных последовательностей в банках данных и распределение субдоменов семи ботулиновых нейротоксинов

ΒοΝΤ	Номер последовательности протеина в банке данных	Число аминокислот	НС
Η_Ν	Нс
Нем	Нсс
ΒοΝΤ/Α	ААА23262 ААМ75961 ААО06331 ВТСЬАВ	1296	449-866	867-1091	10921296
Р10845	1296	449-866	867-1091	10921296
САА36289	1296	449-866	867-1091	10921296
САА51824 Ι40645 045894	1296	449-866	867-1091	10921296
ΒοΝΤ/Β	ААЫ1499 АЛЬП 498	1291	442-855	866-1078	10791291
САА73968	1291	442-855	866-1078	10791291
ААК97132	1291	442-855	866-1078	10791291
А48940 ААА23211 Р10844	1291	442-855	866-1078	10791291
ВАС22064	1291	442-855	866-1078	10791291
САА50482 140631	1291	442-855	866-1078	10791291
ΒοΝΤ/С!	А49777 ВАА14235 ВАВ71749 САА51313 846431	1291	450-863	864-1092	10931291
Р18640	1291	450-863	864-1092	10931291
ВААО8418	1280	450-863	864-1083	1084-

- 5 012578

					1280
ΒΑΑ89713	1280	450-863	864-1083	10841280
ВоЫТО	САА38175 Ρ19231 311455	1276	446-859	860-1079	10801276
ΑΑΒ24244	1276	446-859	860-1079	10801276
ΒΑΑ07477 370582	1285	446-859	860-1088	10891285
ΒΑΑ90661	1285	446-859	860-1088	10891285
ΒοΝΤ/Ε	ΒΑΒ86845 САА44558 321178	1252	423-842	843-1066	10671252
САА43999 000496	1251	423-842	843-1066	10671251
САА43998 Л-10256 Ρ3Ο995	1251	423-842	843-1066	10671251
ΒοΝΤ/Ρ	1901210Α ΑΑΑ23263 140813 Ρ30996	1274	440-860	861-1086	1087- 1274
САА73972	1280	440-861	862-1087	10881280
ΑΑΑ23210 САА57358	1278	440-861	862-1084	10851278
САА48329 333411	1268	432-853	854-1075	10761268
ΒοΝΤ/Θ	САА52275 060393 339791	1297	447-860	861-1086	10871297

Что касается Н_с-фрагмента этих ботулиновых нейротоксинов, то для модификации предпочтительны аминокислоты в следующих положениях:

с 876 по 1296 для нейротоксина С. Ьо1и1шит серотипа А, с 866 по 1291 для нейротоксина С. Ьо1и1шит серотипа В, с 864 по 1291 или 1280 для нейротоксина С. Ьо1и1шит серотипа С1, с 860 по 1276 или 1285 для нейротоксина С. Ьо1и1шит серотипа Ό, с 843 по 1251 или 1252 для нейротоксина С. Ьо1и1шит или С. ЬШупсит серотипа Е, с 861 по 1274, с 862 по 1280 или 1278 и с 854 по 1268 для нейротоксина С. Ьо1и1шит или С. Ьага1и серотипа Р, с 861 по 1297 для нейротоксина С. Ьо1и1шит серотипа С.

Поэтому предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна аминокислота в вышеуказанных положениях была посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение.

Согласно одной из предпочтительных форм осуществления изобретения нейротоксин является ботулиновым нейротоксином серотипа А. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в положениях Треонин 1195, Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Лизин 1204, Изолейцин 1205, Лейцин 1206, Серин 1207, Лейцин 1209, Аспартат 1213, Лейцин 1217, Фенилаланин 1255, Аспарагин 1256, Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Серин 1207, Фенилаланин 1255, Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А. Наиболее предпочтительны положения Серин 1207, который заменяют на Аргинин или Тирозин, и Лизин 1260, который заменяют на Глутамат.

Согласно другой предпочтительной форме осуществления изобретения нейротоксин является ботулиновым нейротоксином серотипа В. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в положениях Лизин 1113, Аспартат 1114, Серин 1116, Пролин 1117, Валин 1118, Треонин 1182, Тирозин 1183, Фенилаланин 1186, Лизин 1188, Глутамат 1191, Лизин 1192, Лейцин 1193, Фенилаланин 1194, Фенилаланин 1204, Фенилаланин 1243, Глутамат 1245, Лизин 1254, Аспартат 1255 и Тирозин 1256 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа В посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Валин 1118, Тирозин 1183, Глутамат 1191, Лизин 1192, Глутамат 1245 и Тирозин 1256 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа В. Наиболее предпочтительны положения Тирозин 1183 и Глутамат 1191, которые заменяют на Лейцин.

Согласно следующей предпочтительной форме осуществления изобретения нейротоксин является ботулиновым нейротоксином серотипа С. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в положениях Фенилаланин 1121, Лизин 1123, Алании 1124, Серин 1125, Метионин 1126, Валин

- 6 012578

1190, Лейцин 1191, Серин 1194, Глутамат 1196, Треонин 1199, Глутамин 1200, Лейцин 1201, Фенилаланин 1202, Фенилаланин 1212, Фенилаланин 1248, Лизин 1250, Аспартат 1251 и Тирозин 1262 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа С посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Метионин 1126, Лейцин 1191, Треонин 1199, Глутамин 1200, Лизин 1250 и Тирозин 1262 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа С. Наиболее предпочтительно положение Тирозин 1262, который заменяют на Фенилаланин.

Полученный в настоящем изобретении транспортный белок обнаруживает повышенное или пониженное специфическое сродство своего протеинсвязывающего домена, в частности, к молекулам из семейства синаптотагминов или гликопротеинов-2 синаптических везикул.

Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к конструкции, которая содержит транспортный белок согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одну переносимую внутрь клетки молекулу (X). Переносимая молекула может быть мелкой органической молекулой, пептидом или протеином; предпочтительно она присоединена ковалентной связью, например пептидной, простой эфирной, сложноэфирной, сульфидной, дисульфидной или углерод-углеродной связью.

Термин «переносимая молекула» охватывает также все известные терапевтически эффективные вещества. Предпочтительными при этом являются цитостатики, антибиотики, виростатики и иммуноглобулины.

В одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения белок является протеазой, расщепляющей один или несколько белков аппарата высвобождения нейромедиаторов, причем протеаза выбрана из группы нейротоксинов, которая состоит из ЬС нейротоксинов С. Ьо1и1тит, в частности серотипов А, В, С1, Ό, Е, Г и С, или протеолитически активного фрагмента ЬС нейротоксинов С. Ьо1и1тит, в частности серотипов А, В, С_ь Ό, Е, Г и С, причем фрагмент обнаруживает не менее 0,01% протеолитической активности нативной протеазы, предпочтительно не менее 5%, особо предпочтительно не менее 50% и наиболее предпочтительно не менее 90%. Предпочтительно транспортный белок и протеаза происходят от одного серотипа нейротоксина С. Ьо1и1тит, особо предпочтительно Η_Ν-домен транспортного белка и протеза происходят от нейротоксина С. Ьо1и1тит серотипа А. Последовательно сти протеаз общеизвестны из банков данных, и их номера в банках данных приведены в таблице. Протеолитическую активность протеаз определяют на основании кинетики расщепления субстрата (см. Βίηζ с1 а1. (2002), ВюсйетШгу 41(6), 1717-23).

Согласно следующей форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения транспортного белка. На первой стадии при этом получают нуклеиновую кислоту, кодирующую транспортный белок. Кодирующая нуклеиновая кислота при этом может быть РНК, ДНК или их смесью. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы в отношении их резистентности к нуклеазам, например, посредством вставки фосфотиоатных связей. Нуклеиновая кислота может быть получена из исходной нуклеиновой кислоты, при этом исходная нуклеиновая кислота может быть получена, например, посредством клонирования нуклеиновых кислот из геномных банков или банков кДНК. Также нуклеиновая кислота может быть получена непосредственно путем твердофазного синтеза. Подходящие способы известны специалисту в данной области техники. Если исходить из исходной нуклеиновой кислоты, то можно, например посредством сайт-направленного мутагенеза, провести целенаправленное изменение, которое на уровне аминокислот приведет по меньшей мере к одной добавке, вставке, делеции и/или замене. Затем нуклеиновые кислоты оперативно соединяют с подходящим промотором. Промоторы, подходящие для экспрессии в известных системах экспрессии, известны специалисту в данной области техники. Выбор промотора зависит при этом от используемой для экспрессии системы экспрессии. В целом, предпочтительны конститутивные промоторы, однако находят применение и индуцируемые промоторы. Полученная таким образом конструкция включает в себя по меньшей мере часть вектора, в частности регуляторные элементы, причем вектор выбирают, например, из λ-производных, аденовирусов, бакуловирусов, вакциниявирусов, 8У40-вирусов и ретровирусов. Вектор предпочтительно способен к экспрессии нуклеиновых кислот в определенной клетке-хозяине.

Далее изобретение предусматривает клетки-хозяева, которые содержат вектор и которые пригодны для экспрессии вектора. На современном уровне техники известны многочисленные прокариотические и эукариотические системы экспрессии, при этом клетки-хозяева выбраны, например, из прокариотических клеток, таких как Е. со11 или В. киЬШщ, или эукариотических клеток, таких как 8. сегеуШае и Р. ра§1ог18. Хотя можно использовать и клетки эукариот, находящихся на более высоких уровнях развития, например клетки насекомых или клетки млекопитающих, все же предпочтительны такие клетки-хозяева, которые, также как и С. Ьо1и1тит, не используют аппарат гликозилирования.

Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения нуклеиновая кислота кодирует Н_Сфрагмент нейротоксина С. Ьо1и1тит. Эта нуклеиновая кислота содержит сайты рестрикции эндонуклеазой, которые фланкируют нуклеиновую кислоту, кодирующую НС-фрагмент, при этом сайты рестрикции эндонуклеазой должны быть совместимыми с сайтами рестрикции других Н_С-фрагментов из нейротоксинов С. Ьо1и1тит, чтобы была возможна легкая замена модулей в гене, кодирующем транспортный бе

- 7 012578 лок, с сохранением сходства последовательности аминокислот.

Поскольку получена конструкция согласно настоящему изобретению, которая наряду с транспортным белком содержит по меньшей мере одну переносимую молекулу, и эта переносимая молекула представляет собой пептид или протеин, функционализированный карбокситерминальным цистеином или меркаптогруппой, то аналогично тому, как описано выше, этот пептид или протеин можно получить рекомбинантным методом, например с использованием бинарных векторов или различных клеток-хозяев. Поскольку эти клетки-хозяева используются для экспрессии как транспортного белка, так и пептида или протеина, межмолекулярную дисульфидную связь предпочтительно образуют ίη кйи. Для более эффективной продукции в той же клетке-хозяине нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или протеин, может быть транслирована вместе с транспортным белком в одних и тех же рамках считывания, так что образуется одноцепочечный полипептид. При этом предпочтительно образуется внутримолекулярная дисульфидная связь ίη кйи. Для простого гидролиза существующей пептидной связи между транспортным белком и пептидом или протеином к аминотерминали транспортного белка присоединяют последовательность аминокислот, которая специфически распознается и расщепляется либо протеазой тромбином, либо специфической эндопротеазой клетки-хозяина.

Неожиданно было обнаружено, что последовательность-вставка СХХХ2КТК8ЬУРК.68КВХХС (8ЕО ΙΌ N0:1), в которой Х обозначает любую аминокислоту, а Ζ и В независимо выбраны из аланина, валина, серина, треонина и глицина, эффективно расщепляется ίη νίνο эндогенной протеазой бактериихозяина, предпочтительно Е. со11. Поэтому внедрение этой последовательности-вставки между аминокислотной последовательностью транспортного белка и другим пептидом или протеином дает преимущество, состоящее в том, что не требуется дальнейшей обработки на следующей стадии, например тромбином. Особенно предпочтительной является Е. сой штамма К12.

Последовательность-вставка предпочтительно является частью петли, предпочтительно состоящей из 18-20 аминокислот.

Если это невозможно, то после раздельной очистки транспортного белка и протеина можно получить соответствующую межмолекулярную дисульфидную связь с использованием известного специалисту в данной области техники окислительного способа. Пептид или протеин также можно получить прямо посредством синтеза или конденсации фрагментов. Соответствующие способы известны специалисту в данной области техники.

Затем транспортный белок и пептид или протеин очищают. При этом можно использовать известные специалисту в данной области техники способы, например хроматографический способ или электрофорез.

Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит транспортный белок или конструкцию и, возможно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.

Фармацевтическая композиция пригодна для орального, внутривенного, подкожного, внутримышечного и местного применения. При этом предпочтительным является внутримышечное введение. Единица дозировки фармацевтической композиции содержит приблизительно от 0,1 пг до 1 мг транспортного белка и/или конструкции согласно настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция пригодна для лечения нарушений высвобождения медиаторов и таких заболеваний, как, например, гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, блефароспазм, спастики, дистонии, мигрени, боли, заболевания шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация, заживление ран, храп и депрессии.

Следующая форма осуществления настоящего изобретения представляет собой косметическую композицию, которая содержит транспортный белок и косметически приемлемый носитель, разбавитель и/или аддитив. Косметическая композиция пригодна для лечения гипергидроза и морщин на лице.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - исследование посредством О8Т-Ри11-Еотеп анализа связывания ίη νίίτο Н_С-фрагментов ΒοΝΤ/Β дикого типа и мутированных с укороченными слитыми белками О8Т-8у1 I и О8Т-8у1 II в присутствии и в отсутствие сложных ганглиозидов.

Фиг. 2 - исследование посредством Οδ^Ρου-Εο^η анализа связывания ίη νίίτο Н_С-фрагментов ΒοΝΠΟ дикого типа и мутированных с укороченными слитыми белками О8Т-8у1 I и О8Т-8у1 II в присутствии и в отсутствие сложных ганглиозидов.

Фиг. 3 - кривая «доза-эффект» для ΒοΝΠΒ и О, полученная посредством ΗΌΆ. Аппроксимированные функции эффективности дают возможность относительного сравнения длительностей паралича, вызываемого отдельными мутантами и соответствующими дикими типами.

Фиг. 4 - снижение и повышение нейротоксичности отдельных мутантов ΒοΝΠΒ по сравнению с диким типом, определенные посредством ΗΌΑ.

Фиг. 5 - снижение и повышение нейротоксичности отдельных мутантов ΒοΝΠΟ по сравнению с диким типом, определенные посредством ΗΌΑ.

Фиг. 6 - кривые «доза-эффект» для диких типов ΒοΝΌΆ и отдельных мутантов ΒοΝΓΑ, полученные посредством ΗΌΑ.

- 8 012578

Более конкретно, настоящее изобретение охватывает транспортный белок (Тгаро), который получают посредством модификации НС нейротоксина, продуцируемого С. ЬоШИпит, который предпочтительно специфически связывается с нейронами и который предпочтительно попадает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза и транслоцируется из кислого эндосомального компартмента в цитозоль нейронов. Этот белок используется в качестве транспортера для переноса в клетки связанных с ним протеаз и других веществ, которые физиологически не могут проникнуть через плазматическую мембрану и попасть в цитозоль нервных клеток. Субстратами протеаз являются расположенные внутри клетки протеины и пептиды, которые участвуют в высвобождении медиаторов. После расщепления субстрата блокируются специфические функции нейронов, при этом сами клетки не повреждаются. Одной из этих функций является экзоцитоз, который обеспечивает высвобождение медиатора. Если высвобождение медиаторов подавляется, блокируется передача сигналов от клетки к клетке. Например, если подавляется высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах, расслабляются поперечно-полосатые мышцы. Этот эффект можно использовать в терапевтических целях, если наносить транспортный белок на нервные окончания спастичных или дистоничных мышц. Другими активными веществами являются, например, активные вещества с противовирусным эффектом. Их используют для лечения вирусных инфекций нервной системы в виде конъюгатов с транспортным белком. Настоящее изобретение относится также к применению транспортного белка для подавления высвобождения нейромедиаторов.

Транспортные белки с меньшим сродством связываются с нервными клетками, но не поглощаются ими. Поэтому такие транспортные белки пригодны для использования в качестве специфических транспортеров веществ к поверхности нервных клеток.

При лечении пациентов предшественниками токсинов А и В из С. ЬоШйпшп инъекция этих чужеродных для человека белков, несмотря на низкую дозировку, вызывает образование антител, так что лечение не приносит эффекта, и поэтому его приходится прекращать во избежание возникновения в конечном итоге анафилактического шока. Если же вводить вещество с тем же механизмом действия, но с более высокой эффективностью транспорта ферментативной активности, дозу можно резко снизить, и не произойдет образования антител. Эти свойства принадлежат транспортному белку, описанному в данном изобретении.

Даже в тех случаях, когда приводятся примеры применения, подходящий способ применения и дозировка обычно индивидуально определяются лечащим врачом. Такие решения приходится принимать в повседневной практике каждому врачу, занимающемуся профессиональной деятельностью. Так, например, способ применения и дозировку нейротоксина согласно настоящему изобретению можно выбрать на основании таких критериев, как растворимость выбранного нейротоксина или интенсивность болей, на которые необходимо воздействовать.

В настоящее время интервал между циклами лечения нативными ΒοΝΤ/Α и В в среднем составляет от трех до четырех месяцев. Увеличение этого интервала снизило бы риск образования антител и обеспечило бы большую длительность лечения с использованием ΒοΝΤ. Увеличение концентрации ЬС в цитозоле увеличило бы время ее распада и за счет этого увеличило бы длительность эффекта. Описанный в данной работе транспортный протеин обладает большим сродством и большей скоростью поступления в клетку, чем нативная НС.

Приведенный ниже пример служит исключительно для целей разъяснения, и его не следует рассматривать как ограничивающий изобретение.

Описание примера осуществления изобретения

Материалы и методы.

Конструирование плазмид и получение рекомбинантных белков.

Плазмиды для экспрессии в Е. сой рекомбинантных Н_С-фрагментов ΒοΝΤ/Β и ΒοΝΤ/Ο и полномерных форм ΒοΝΤ/Α, В и О с карбокситерминальным 81герТад для аффинной очистки были получены ПЦР-методами с использованием подходящих праймеров, хромосомных ДНК, кодирующих ΒοΝΤ/Α (ΑΑΑ23262), ΒοΝΤ/Β (ΑΑΑ23211) и ΒοΝΤ/Ο (САА52275), и вектора экспрессии рОе3 (О1а§еп АО) в качестве исходного вектора. Укороченные варианты синаптотагмина I (8у1 I) крысы (аминокислоты 1-53; аминокислоты 1-82) и синаптотагмина II (8у1 II) крысы (аминокислоты 1-61; аминокислоты 1-90) были клонированы в ΟδΤ-кодирующий вектор ρΟΕΧ-2Τ (Лтегейат Рюхаепсех ΑΒ). Последовательности нуклеиновых кислот всех плазмид были подтверждены посредством ДНК-секвенирования. Рекомбинантные Н_С-фрагменты и Н_С-фрагменты полномерных форм ΒοΝΤ были получены в Е. той, штамм М15 [рЯер4] (О1а§еп). в ходе десятичасовой индукции при комнатной температуре и очищены на δϋΐρΤα^ηматриксе (ΓΒΑ ОтЬН) согласно рекомендациям производителя. Полученные из Е. ^1ί, штамм ΒΕ21, ΟδΤ-содержащие слитые белки были выделены при помощи глутатиона, иммобилизированного на сефарозных гранулах. Фракции, содержавшие желаемые белки, очищали и подвергали диализу против Трис№1С’1-тритонового буфера (20 мМ Трис-НС1, 150 мМ №С1, 0,5% Тритон Х-100, рН 7,2).

ΟδΤ-Ρι.ι11-άο\νπ анализ.

ΟδΤ-содержащие слитые белки (в каждом случае по 0,12 нмоль), иммобилизированные на 10 мкл глутатион-сефарозных микрогранул, инкубировали с Н_С-фрагментами (0,1 нмоль) в отсутствие или в

- 9 012578 присутствии смеси ганглиозидов из мозга коров (18% СМ1. 55% СЭ1а. 2% прочих ганглиозидов; Са1ЫосИет; в каждом случае по 20 мкг) в ТрНС-ЫаС1-тритоновом буфере с общим объемом 180 мкл в течение 2 ч при 4°С. Гранулы отделяли посредством центрифугирования, надосадочную жидкость удаляли, а отделенные гранулы три раза промывали 400 мкл такого же буфера. Промытые фракции гранул кипятили в буфере для разведения проб с додецилсульфатом натрия и исследовали совместно с фракциями надосадочной жидкости посредством 8Ό8-ΡΑΟΕ электрофореза с окрашиванием кумасси синим.

ΒοΝΤ/Β дикого типа связывается только в присутствии сложных ганглиозидов и синаптотагмина I с трансмембранным доменом. тогда как синаптотагмин II связывается как при наличии. так и в отсутствие трансмембранного домена. а также в присутствии или в отсутствие сложных ганглиозидов. Посредством направленной замены аминокислот внутри сайта связывания белкового рецептора ΒοΝΤ/Β взаимодействие с обеими молекулами синаптотагмина можно заметно усилить (Е1191Ь; У1183Ь) или ослабить (У1118Э; К1192Е) (фиг. 1).

Для ΒοΝΤ/С дикого типа было показано. что как в присутствии. так и в отсутствие сложных ганглиозидов происходит связывание с синаптотагмином I и синаптотагмином II. причем как при наличии. так и в отсутствие трансмембранного домена. Посредством направленной замены аминокислот внутри сайта связывания белкового рецептора ΒοΝΤ/С взаимодействие с обеими молекулами синаптотагмина можно заметно усилить (Υ1262Ρ) или ослабить (О1200Е) (фиг. 2).

Благодаря полученным доказательствам связывания рекомбинантных Н_С-фрагментов ΒοΝΤ/Β и С с изолированными. иммобилизированными ганглиозидами. удалось исключить нарушение функции соседнего кармана связывания ганглиозидов за счет мутаций. внедренных в 8ук-карман связывания. и сделать убедительные выводы об интактности третичной структуры Н_С-фрагментов. Эти результаты подтверждаются КД-спектроскопическими исследованиями и экспериментами с термической денатурацией. которые также продемонстрировали интактные третичные структуры мутированных Н_С-фрагментов ΒοΝΤ/Β и С.

Анализ на гемидиафрагме мыши (НЭА).

Нейротоксичность мутеинов ΒοΝΤ/Α. В и С была определена. как описано в работе НаЬегтаии ек а1.. №шпуп §сйт1ебеЬегд'8 Агсй. РИатта^! 311 (1980). 33-40.

Эффективность полномерных форм ΒοΝΤ/Α. В и С дикого типа была определена в НЭА с помощью кривых «доза-эффект» (фиг. 3 и 6). Затем посредством НЭЛ была определена эффективность различных единичных мутантов полномерных форм ΒοΝΤ/Α. В и С (фиг. 6) и с помощью аппроксимированной функции эффективности было определено ее соотношение с эффективностью ΒοΝΤ/Β и С дикого типа (фиг. 4 и 5). Так. замена аминокислоты валина в положении 1118 на аспартат или лизина в положении 1192 на глутамат в ΒοΝΤ/Β приводит к резкому снижению эффективности до <2%. В противоположность этому мутация тирозина в положении 1183 на лейцин или аргинин приводит к явному повышению эффективности ΒοΝΤ/Β (фиг. 4). Модификация тирозина в положении 1256 на фенилаланин в ΒοΝΤ/С также приводит к повышению эффективности. тогда как мутация глутамина в положении 1200 на глутамат. лизин или тирозин приводит к значительному снижению эффективности ΒοΝΤ/С (фиг. 5). В случае ΒοΝΤ/Α модификация серина в положении 1207 на аргинин или тирозин вызывает повышение эффективности. тогда как мутация лизина в положении 1260 на глутамат приводит к резкому снижению эффективности ΒοΝΤ/Α (фиг. 6).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Транспортный белок. который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи нейротоксинов. образуемых СЬзкпбшт Ьοки1^ηит серотипа А. где по меньшей мере одна аминокислота в положениях с 876 по 1296 посттрансляционно модифицирована. и/или добавлена. и/или удалена. и/или вставлена. и/или заменена аминокислотой. существующей в природе. либо не имеющей естественного происхождения. причем (1) белок связывается с белковыми рецепторами нервных клеток с большим или меньшим сродством. чем нативный нейротоксин; и/или (2) белок обнаруживает повышенную или пониженную нейротоксичность по сравнению с нативным нейротоксином; при этом нейротоксичность предпочтительно определяют в анализе на препарате гемидиафрагмы.
2. Транспортный белок по п.1. где этот белок специфически связывается с 8У2С человека.
3. Транспортный белок по п.1 или 2. где этот белок обнаруживает сродство по меньшей мере на 15% большее или по меньшей мере на 15% меньшее. чем у нативного нейротоксина. предпочтительно по меньшей мере на 50% большее или меньшее. особо предпочтительно по меньшей мере на 80% большее или меньшее. наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% большее или меньшее.
4. Транспортный белок по п.1. где по меньшей мере одна аминокислота в положениях Треонин 1195. Аспарагин 1196. Глутамин 1199. Лизин 1204. Изолейцин 1205. Лейцин 1206. Серин 1207. Лейцин 1209. Аспартат 1213. Лейцин 1217. Фенилаланин 1255. Аспарагин 1256. Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А посттрансляционно модифи

- 10 012578 цирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, существующей в природе, либо не имеющей естественного происхождения.
5. Транспортный белок по п.4, где по меньшей мере одна аминокислота в положениях Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Серин 1207, Фенилаланин 1255, Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, существующей в природе, либо не имеющей естественного происхождения.
6. Транспортный белок по п.4 или 5, где аминокислота серин в положении 1207 заменена на аргинин или тирозин.
7. Транспортный белок по п.4 или 5, где аминокислота лизин в положении 1260 заменена на глутамат.
8. Композиция, содержащая транспортный белок по любому из пп.1-7 и по меньшей мере одну переносимую молекулу.
9. Композиция по п.8, где переносимая молекула ковалентно связана с транспортным белком пептидной, простой эфирной, сложноэфирной, сульфидной, дисульфидной или углерод-углеродной связью.
10. Композиция по п.8 или 9, где переносимая молекула является органической молекулой с низкой молекулярной массой, пептидом или белком.
11. Композиция по п.10, где органическая молекула с низкой молекулярной массой является виростатиком, цитостатиком, антибиотиком или иммуноглобулином.
12. Композиция по п.10, где белок является протеазой.
13. Композиция по п.12, где протеза содержит одну или несколько легких цепей (ЬС) нейротоксинов ОоЛпбшт Ьо!и1тит серотипов А, В, С1, Ό, Ε, Е и/или С.
14. Композиция по п.12, где протеаза содержит протеолитически активный фрагмент, который ведет свое происхождение от легкой цепи (ЬС) нейротоксинов ОоЛпбшт Ьо!и1тит серотипов А, В, С1, Ό, Ε, Е и/или С и характеризуется тем, что он обнаруживает по меньшей мере 0,01% протеолитической активности нативной протеазы, предпочтительно по меньшей мере 50% протеолитической активности нативной протеазы.
15. Композиция по п.13 или 14, где протеза специфически расщепляет определенные субстраты внутри холинергических мотонейронов.
16. Композиция по п.15, где субстраты выбраны из белков, которые участвуют в высвобождении нейромедиаторов в нервных клетках, и белков, которые способны к каталитическим реакциям в нервной клетке.
17. Композиция по п.13 или 14, где протеаза и транспортный белок ковалентно связаны через последовательность аминокислот, которая специфически распознается и расщепляется эндопептидазой.
18. Композиция по п.17, где последовательность аминокислот включает в себя последовательность СХХХ2КТК8ЕУРВС8КВХХС, где X является любой аминокислотой, а Ζ и В независимо друг от друга выбраны из аланина, валина, серина, треонина и глицина.
19. Композиция по п.17, где после расщепления эндопептидазой протеза и транспортный белок остаются связанными дисульфидным мостиком, что снова приводит к возникновению активного голотоксина.
20. Фармацевтическая композиция, которая содержит транспортный белок по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19, а также, возможно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
21. Применение фармацевтической композиции по п.20 для лечения расстройств и заболеваний, при которых показано лечение ботулиновым нейротоксином.
22. Применение по п.21, где расстройство или заболевание является одним из следующих: гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, блефароспазм, спастики, дистонии, мигрени, боли, заболевания шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация, храп, заживление ран и депрессивные заболевания.
23. Косметическая композиция, которая содержит транспортный белок по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19, а также, возможно, косметически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
24. Применение косметической композиции по п.23 для лечения косметических показаний, гипергидроза и морщин на лице.
25. Способ получения транспортного белка по любому из пп.1-7 или композиции по любому из пп.8-19 посредством рекомбинации согласно известным способам.
26. Способ получения транспортного белка по п.25, где ген Н_С-фрагмента фланкирован двумя нуклеиновыми кислотами, содержащими сайты рестрикции эндонуклеазами, причем сайты рестрикции эндонуклеазами совместимы с сайтами рестрикции других Н_С-фрагментов из нейротоксинов СШйпбшт Ьо!и1тит, чтобы обеспечить легкий обмен модулями с сохранением сходства последовательности аминокислот.
27. Способ получения композиции по п.25, где ген протеазы фланкирован двумя нуклеиновыми кислотами, содержащими сайты рестрикции эндонуклеазами, причем сайты рестрикции эндонуклеазами

- 11 012578 совместимы с сайтами рестрикции других протеазных доменов из нейротоксинов ОоЧпбшт Ьо1и1тит, чтобы обеспечить легкий обмен модулями с сохранением сходства последовательности аминокислот.
28. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор экспрессии, причем вектор экспрессии кодирует транспортный белок по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19.
29. Клетка-хозяин по п.28, где клетка-хозяин может быть клеткой ЕксйепсЫа со11, в частности Е. сой штамма К12, Зассйатотусек сегегыае. РюЫа раЧогЬ или ВасШик тед-Иегшт.
30. Вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую транспортный белок по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19.