DE69511860T2

DE69511860T2 - Modifizierung von clostridium-toxinen und ihre anwendung als transport proteine

Info

Publication number: DE69511860T2
Application number: DE69511860T
Authority: DE
Inventors: Kei Roger Aoki; James Oliver Dolly; Michael Elwood Garst; Larry Allen Wheeler
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2000-02-10
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: JPH10500988A; ES2138740T3; DE69511860D1; EP0760681A1; AU2622295A; WO1995032738A1; US6203794B1; CA2191754A1; AU695623B2; EP0760681B1; JP3523879B2; CA2191754C; DK0760681T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet biochemischer Beförderungssysteme, die auf Rezeptoren abgezielt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung modifizierter Polypeptid-Toxine als Vehikel zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Zellen, die Toxinrezeptoren tragen.

Hintergrund der Erfindung

Tetanustoxin (TeTx) und Botulinumtoxin (ToNT) sind hochwirksame Neurotoxine, die durch Mechanismen, welche die Hemmung der Neurotransmitter-Freisetzung umfassen, Paralyse induzieren. Diese Clostridium-Neurotoxine werden anfänglich als einkettige Proteine mit etwa 150 kDa produziert. Proteolytische Spaltung erzeugt dann ein aktives zweikettiges Molekül mit einer schweren Kette (H) von etwa 100 kDa und einer leichten Kette (L) von etwa 50 kDa, die durch eine einzige Zwischenketten-Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Die H-Kette enthält Domänen, die zur Bindung des Toxins an die neuronalen Zelloberflächenrezeptoren beitragen und die Translozierung der L- Kette in Zellen erleichtern. Die L-Kette ist für die Blockierung der Neurotransmitter-Freisetzung verantwortlich.
Die Mechanismen der Toxinwirkung wurden in letzter Zeit untersucht. Die TeTx-L-Kette ist eine zinkabhängige Protease, die für das vesikelassoziierte Protein namens Synaptobrevin oder das vesikelassoziierte Membranprotein (VAMP) spezifisch ist. Die Spaltung von VAMP durch die TeTx-L-Kette hemmt die Neurotransmitter-Freisetzung durch Verhinderung des Andockens/Fusionierens von transmitterhältigen Vesikeln und der präsynaptischen Membran.
Während eine einzige Iso-Form von TeTx von Clostridium tetani produziert wird, werden sieben serologisch unterschiedliche Iso-Formen von BoNT von Clostridia botulinum produziert. Diese sieben Botulinumspezies werden als BoNT/A-G bezeichnet. Wie Teta nustoxin ist das Botulinum Typ B-Neurotoxin eine zinkabhängig Protease. In EMBO J. 12, 4821 (1993), schlugen Blasi et al. vor, daß Botulinum-Neurotoxinserotypen unterschiedliche Substratspezifitäten entwickelten, jedoch eine gemeinsame Protease-Aktivität bewahrten. Die Botulinum-Neurotoxine B, D, F und G spalten auch VAMP oder eine eng zugehörige Iso-Form. Im Gegensatz dazu spalten BoNT/A und BoNT/E ein synaptosom-assoziiertes Protein mit einem Molekulargewicht von 25 kDa (SNAP-25). Schließlich wurde gezeigt, daß BoNT/C Syntaxin spaltet. Außer diesen Zielproteinen wurde berichtet, daß TeTx und BoNT/B auch Cellubrevin spalten. Somit nehmen die intraneuronalen Ziele der Clostridium-Toxine universell am Prozeß der Neurotransmitter-Freisetzung teil.
Alle Clostridium-Neurotoxine binden offenbar unterschiedliche Oberflächenrezeptoren und proteolysieren zelluläre Komponenten, die für die Neurotransmitter-Freisetzung erforderlich sind. TeTx übt seinen Einfluß im Rückenmark und im unteren Hirnstamm aus, indem die Aktivität hemmender Neuronen reduziert wird. Die sieben Iso-Formen von BoNT führen alle zu schlaffer Paralyse. Mechanistisch hemmen die Botulinumtoxine periphere cholinergische Nervenenden, die man vor allem an neuromuskulären Verbindungen vorfindet, in selektiver Weise.
Bestimmte zinkabhängige Endoproteasen enthalten die konservierte Aminosäuresequenz HExxH. In Thermolysin wird die Zinkbindung durch His¹&sup4;² und His¹&sup4;&sup6; innerhalb dieses Motifs gemeinsam mit Glu¹&sup6;&sup6; erreicht; der vierte Ligand ist Wasser. Der Vergleich der Tetanus L-Kette mit Thermolysin und anderen Zink-Endoproteasen zeigte die Gegenwart des gleichen Konsensmotifs. Es ist daher vorstellbar, daß Glu²³&sup4; der TeTx-L-Kette mit dem entscheidenden Glu¹&sup4;&sup5;-Rest in Thermolysin übereinstimmt.
Die Rolle von Glu²³&sup4; innerhalb dieses Motivs in der L-Kette von TeTx wurde unter Anwendung stellengerichteter Mutagenese und in einem in vitro-Assay für die Proteolyse von Cellubrevin untersucht. In Nature 364, 346 (1993), zeigten McMahon et al., daß Cellubrevin nicht gespalten wurde, wenn COS-Zellen mit mutierter L-Kette (Glu234 substituiert durch Gln) und Cellubrevin-DNA-Konstrukten cotransfiziert wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein chemisches Konjugat zur Behandlung einer mit Nervenzellen in Zusammenhang stehenden Störung. Dieses Konjugat umfaßt ein aktives oder inaktives Botulinum- oder Tetanustoxin mit Spezifität für eine Ziel-Nervenzelle. Das Toxin ist an ein Arzneimittel oder anderes bioaktives Molekül gebunden, ohne die Fähigkeit des Toxins einzuschränken, in die Ziel-Nervenzelle einzudringen. Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung ein chemisches Konjugat zur Behandlung einer mit Nervenzellen in Zusammenhang stehenden Störung. Das chemische Konjugat enthält ein inaktives Clostridium-Neurotoxin mit Spezifität für eine Ziel-Nervenzelle und ein Arzneimittel oder anderes bioaktives Molekül, das an das Neurotoxin gebunden ist. Das Neurotoxin behält seine Fähigkeit bei, in die Ziel-Nervenzelle einzudringen. Das Clostridium-Neurotoxin kann ein beliebiges einer Vielzahl von Toxinen sein; Beispiele sind Tetanustoxin, Botulinumtoxin A, Botulinumtoxin β, Botulinumtoxin C, Botulinumtoxin D, Botulinumtoxin E, Botulinumtoxin F und Botulinumtoxin G. Die Inaktivierung des Clostridium-Neurotoxins kann durch eine Aminosäureänderung in dessen leichter Kette erreicht werden. Somit kann das inaktivierte Clostridium-Neurotoxin Tetanustoxin mit einer Modifikation an Glu²³&sup4; ein Botulinumtoxin A mit einer Modifikation an His²²&sup7; und/oder Glu²²&sup4; oder ein anderes Botulinumtoxin als Botulinumtoxin A mit einer Modifikation an einer Stelle sein, die His²²&sup7; und/oder Glu²²&sup4; von Botulinumtoxin A entspricht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft das oben besprochene chemische Konjugat zur Behandlung einer neuromuskulären Dysfunktion bei einem Säugetier, z. B. einer Dysfunktion in Zusammenhang mit unkontrollierbaren Muskelkrämpfen.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des oben beschriebenen chemischen Konjugats bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neuromuskulären Dysfunktion, z. B. einer Dysfunktion in Zusammenhang mit unkontrollierbaren Muskelkrämpfen, bei einem Säugetier.
In einem bestimmten Aspekt der Erfindung ist das Arzneimittel im chemischen Konjugat ein Wirkstoff zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus. Dieser Aspekt der Erfindung kann zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus bei einem Säugetier sowie zur Herstellung eines Medikaments für eine solche Behandlung herangezogen werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von inaktivem Clostridium- Neurotoxin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tobulinumtoxin-Vergiftung. In diesem Aspekt kann das inaktive Clostridium-Neurotoxin alleine ohne Bindung an ein anderes Arzneimittel verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines chemischen Konjugats, das ein aktives Clostridium-Neurotoxin und ein Arzneimittel enthält. Ein solches Konjugat wird bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung fokaler Dystonien, spastischer Zustände aufgrund von Schlaganfall oder traumatischer Gehirn- oder Rückenmarksverletzung, Blepharospasmus, Strabismus, Zerebrallähmung oder Rückenschmerzen aufgrund von Muskelkrämpfen verwendet.
In einem zusätzlichen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer neuromuskulären Dysfunktion bei einem Säugetier. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte der Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Lösung, die ein Clostridium-Neurotoxin enthält, das mit einem Arzneimittel verbunden ist, und der Verabreichung einer wirksamen Menge der pharmazeutisch aktiven Lösung an ein Säugetier. Das Neurotoin kann jedes beliebige einer Vielzahl derartiger Toxine sein; Beispiele sind Tetanustoxin, Botulinumtoxin A, Botulinumtoxin B, Botulinumtoxin C, Botulinumtoxin D, Botulinumtoxin E, Botulinumtoxin F und Botulinumtoxin G. Das Neurotoxin kann durch eine Aminosäu reänderung in seiner leichten Kette inaktiviert sein. In einer Ausführungsform hemmt das Arzneimittel die Neurotransmitter-Freisetzung und in einer weiteren die Aktivität von Synaptobrevin. In einer bevorzugten Anwendung des Verfahrens dient das Verfahren dazu, eine neuromuskuläre Dysfunktion in Zusammenhang mit unkontrollierbaren Muskelkrämpfen zu behandeln.
Weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung aus der Lektüre der folgenden ausführlichen Beschreibung.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des TeTx und des DNA-Konstrukts (pMAL-LC) zur Expression der MBP-L-Kettenfusionsproteine. Der Einbuchstaben-Code im ersten Teil der Abbildung stellt die Aminosäuresequenz der ersten paar Reste der gereinigten rekombinierten L-Kette und Ala²³&sup4;-L-Kette dar (bestimmt durch N-terminale Mikrosequenzierung). Der zweite Teil der Abbildung zeigt, daß die H-Kette über Disulfidbindung mit der L-Kette verbunden ist. Die Position der Zink-Bindedomäne ist auch schematisch dargestellt.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung des Prozentsatzes an durch native, rekombinierte oder mutierte L-Ketten gespaltenem HV62-Peptid (einem synthetischen Fragment von menschlichem VAMP) als Funktion der Zeit. Die unterschiedlichen Symbole bedeuten 33 (o), 100 ( ) und 250 nM ( ) von nativer L-Kette; oder 250 nM rekombinierte L-Kette (Δ); oder 2,5 uM Ala²³&sup4;-L-Kette ( ). Das Insert zeigt die Fähigkeit der Ala²³&sup4; L-Kette, die offensichtliche Hydrolyse von HV62-Substrat durch die native L-Kette zu reduzieren. Der leere Balken stellt den Prozentsatz an durch die native L-Kette in Gegenwart der Ala²³&sup4;-L-Kette hydrolysiertem Substrat dar, während der schraffierte Balken den Prozentsatz an in Abwesenheit der Ala²³&sup4;-L-Kette hydrolysiertem Substrat darstellt.
Fig. 3 zeigt eine grafische Darstellung der Muskelspannung (als Prozentsatz des anfänglichen Werts) als Funktion der Zeit als einen Assay von neuromuskulärer Übertragung darstellt. Die unterschiedlichen Symbole bedeuten 10 nM TeTx (o), 10 nM rekonstituierte native H-Kette und L-Kette ( ), 10 nM rekombinierte L-Kette, zusammengesetzt mit nativer H-Kette (Δ), 100 nM Ala²³&sup4;-L-Kette, umgefaltet mit H-Kette ( ). Die Werte sind die aus 3 Versuchen erhaltenen Mittelwerte (± Standardabweichung). Das Insert zeigt die Ergebnisse, die mit 20 nM rekonstituierter H-Kette und L-Kette ( ) und 40 nM rekonstituierter nativer H-Kette und rekombinierter L-Kette (Δ) erzielt wurden. Man beachte, daß die angegebenen Konzentrationen rekonstituierter Proben die geringe Menge nichtkovalent gebundener Ketten nicht berücksichtigen.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung des chemisch-synthetischen Schemas zur Verbindung des Transporterproteins und eines Arzneimittelmoleküls.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des rekombinierten BoNT/A-Leichtketten-Expressionskonstrukts pCAL. Dieses entstand durch Insertion des L-Kettengens zwischen die BamHI- und die SalI-Stelle am Polylinker des Vektors pMAL-c2. Der Vektor enthält den induzierbaren Ptac-Promotor, der so positioniert ist, daß die malE-LacZα-Genfusion transkribiert wird. Das lac1 q-Gen kodiert für den lac-Repressor, der Transkription von Ptac bis zur Induktion durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) unterdrückt. Der rrnB- Terminator verhindert, daß die Transkription die Plasmidreplikation stört. Ampr kodiert für β-Lactamase zur Ampicillin-Resistenz. M13-ori und pBR322ori geben die Ursprünge der DNA-Replikation an. Die Faktor Xa-Spaltstelle und der L-Kettenbeginn sind durch Pfeile angegeben.
Fig. 6 zeigt das rekombinierte SNAP-25-Substrat für BoNT/A und veranschaulicht grafisch Ergebnisse aus einem durch Western Blotting entwickelten Spaltungsassay. (A) Schematische Darstellung des C-terminaien Fragments von SNAP-25, umfassend die BoNT/A-Spaltstelle, gegen die ein polyklonaler Antikörper gebildet wurde. (B) Grafische Darstellung der numerischen Werte, die aus dem Densitometer-Scanning von Eastern Blots erhalten wurden. Reduziertes natives BoNT/A ( ) und rekombinierte L-Kette der Wildform (o) konnten SNAP-25 wirksam spalten, während die Tyr²²&sup7;-Mutante keine proteolytische Aktivität besaß ( ).
Die Fig. 7A und 7B sind Liniengraphen, die veranschaulichen, daß rekombinierte L-Kette oder deren Fusionsprotein die Catecholamin-Freisetzung von permeabilisierten Chromaffin-Zellen hemmt. Fig. 7A ist vor der Faktor Xa-Spaltung, Fig. 7B nach der Faktor Xa-Spaltung. Zellen wurden durch Inkubation 15 Minuten lang mit 20 uM Digitonin in KGEP-Puffer (139 mM K&spplus;-Glutamat, 5 mM Ethylenglykol-bis-[β-aminoethylether]- N,N,N',N'-tetraessisäure [EGTA], 2 mM ATP, 2 mM MgCl&sub2;, 20 mM Piperazin-N,N'-bis- [2-ethansulfonsäure] [PIPES], pH 6,5), umfassend die angegebene Konzentration von nativem BoNT/A (o; Δ) oder rekombiniertes L-Ketten-Fusionsprotein, vor ( ) oder nach ( ) der Spaltung mit Faktor Xa permeabilisiert. Nach kurzem Spülen mit KGEP wurden die Zellen 15 Minuten lang mit KGEP mit oder ohne 20 uM freies Ca²&spplus; inkubiert. Eine Aliquote wurde dann aus jedem Napf entnommen und durch ein fluorometrisches Verfahren hinsichtlich Catecholamin-Gehalt untersucht. In den Zellen verbliebenes Catecholamin wurde nach Tx-100-Solubilisierung berechnet und die Sekretion als Prozentsatz des gesamten Zellgehalts (= verblieben + freigesetzt) berechnet. Catecholamin im Ca²&spplus;-freien Puffer wurde von jenem subtrahiert, das in 20 uM Ca²&spplus; enthaltenden Puffer sekretiert wurde, um die hervorgerufene Freisetzung zu berechnen.
Fig. 8 ist ein Liniengraph, der die Auswirkung von gereinigter und rekombinierter L-Kette der Wildform oder L-Kettenmutante auf nerveninduzierte neuromuskuläre Übertragung auf motorischen Endplättchen nach Rekonstitution mit der nativen H-Kette von BoNT/A darstellt. Bei Anwendung auf Mäuse-Phrenikus-Hemidiaphragmen blockierte die BoNT/A H-Kette, rekonstituiert mit rekombinierter L-Kette (1,6 nM; o), die neuromuskuläre Übertagung mit etwa der gleichen Wirksamkeit wie die nativen rekonstituierten L- und H-Ketten (2,0 nM; ); Im Gegensatz dazu konnte selbst eine größere Menge der Doppelkette, welche die Tyr²²&sup7;-Mutantenform der L-Kette enthielt (10 nM; ) kein nerveninduziertes Muskelzucken hervorrufen. Die Konzentrationen des rekonsti tuierten Materials wurden nach der Quantifizierung der Menge des vorhandenen 150 kDa-Doppelkettenmaterials durch SDS-PAGE und Densitometer-Scanning berechnet. Die Gewebe wurden in ein Krebs-Ringer-Mediumbad eingelegt und mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; (auf 24ºC gehalten) belüftet. Alle gezeigten Punkte sind der Mittelwert von zumindest 3 getrennten Versuchen ± Standardabweichung.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Konstrukte zur Herstellung einer MBP- BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutante ("1") und einer gekürzten MBP-TeTx-L-Ketten-BoNT/A- L-Ketten-Doppelmutante ("2").

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung modifizierter Clostridium-Neurotoxine in ihren Doppelketten-Formen als Transporter zur Beförderung gebundener pharmakologischer Verbindungen. Unter den Verbindungen, die mit den Toxin-Transportern verbunden werden können, befinden sich visualisierbare Mittel, die Fluorochrome tragen, und Arzneimittel von therapeutischem Nutzen. Während die enzymatischen Eigenschaften der nativen Toxine insolchen Anwendungen ein Nachteil sein könnten, entdeckten die Anmelder eine Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden. Die vorgeschlagenen Zellpopulationen, auf welche die Toxin-Transporter abzielen, sind u. a. jene, die zugehörige Toxinrezeptoren exprimieren.
Die Anmelder entdeckten, daß ein wirksames Arzneimittel-Beförderungsmittel durch Mutieren einer oder mehrerer Aminosäurepositionen in der L-Kette eines Clostridium- Neurotoxins zwecks Inaktivierung seiner Protease-Aktivität und anschließende Bindung eines Arzneimittels an dieses inaktivierte Neurotoxin hergestellt werden kann. Trotz dieser Eliminierung enzymatischer Aktivität behielt das mutagenisierte Toxin günstigerweise die Fähigkeit bei, sich an seinen zugehörigen Zelloberflächenrezeptor zu binden. Außerdem entdeckten die Anmelder andere unerwartete Eigenschaften der nicht entschärften Clostridium-Toxine.
Vor allem stellten die Anmelder fest, daß sowohl die schwere als auch die leichte Kette der Clostridium-Neurotoxine für optimale Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung notwendig ist. Im Lichte dieser Erkenntnis zogen die Anmelder den Schluß, daß ein Toxin-Transporter günstigerweise beide Ketten des Doppelkettenmoleküls umfaßt. Da die toxischen Eigenschaften, die man mit dem L-Kettenmolekül assoziiert, die therapeutische Wirkung eines Arzneimittels beeinträchtigen könnten, das kovalent mit dem Transporter verbunden ist, wurde ein entschärftes L-Kettenmolekül geschaffen, das mit nativer H-Kette rekonstituiert war; die Fähigkeit des resultierenden Doppelkettenmoleküls, sich an den zugehörigen Rezeptor zu binden und internalisiert zu werden, wurde beibehalten. Die Anmelder entdeckten, daß dies mit offenkundig minimaler Störung der gefalteten Struktur des L-Kettenproteins durch Mutation einer oder mehrerer Aminosäurepositiorien durchgeführt werden kann.
Dementsprechend wurde die Verwendung des inaktivierten Clostridium-Toxins als Vehikel untersucht, das kovalent mit einem Arzneimittel verbunden sein kann. Rekonstituiertes Toxin mit einer inaktivierten L-Kette, die über Disulfidbindung mit einer nativen H-Kette verbunden ist, behielt die Fähigkeit bei, spezifisch mit Zielrezeptoren wechselzuwirken und gemeinsam mit dem gebundenen Molekül zum Cytosol transportiert zu werden. Somit kann der inaktivierte und chemisch modifizierte Toxinkomplex als System zur Beförderung gebundener chemischer Verbindungen zum Cytosol neuronaler Zellen verwendet werden, die Zelloberflächenrezeptoren für die Toxine exprimieren.
Bei der Forschungsarbeit für die Erfindung wurde das für die TeTx-L-Kette kodierende Gen am 5'-Ende durch Hinzufügung einer DNA-Sequenz modifiziert, die für eine Maltose-Bindedomäne kodiert. Die Domäne wurde daher dem N-terminalen Abschnitt des TeTx-L-Kettenproteins hinzugefügt. Nach der Expression in E. coli wurde das rekombinierte Fusionsprotein (MBP-L-Kette genannt) durch Affinitätschromatographie gereinigt. Proteolyse durch Faktor Xa ermöglicht die Trennung der L-Kette und MBP-Domänen des Fusionsproteins. Die gereinigte L-Kette wurde dann mit gereinigter H-Kette kombiniert, die aus C. tetani-TeTx isoliert worden war, um eine Doppelkette zu bilden. Dieses rekonstituierte TeTx-Molekül wies Aktivitäten auf, die für das native Toxin charakteristisch sind. Parallele Untersuchungen fanden auch unter Verwendung des rekombinierten BoNT/A-L-Kettenproteins nach erneuter Assoziierung mit nativem BoNT/A-H-Kettenprotein statt.
In anderen Versuchen eliminierte die Modifikation von Glu²³&sup4; in Ala in der TeTx-L-Kette seine Fähigkeit, VAMP oder ein synthetisches Substrat zu spalten, das die Spaltungs- Erkennungsstelle für die TeTx-L-Kette enthielt. Günstigerweise wurde die Neurotoxizität des Komplexes, der aus L-Kettenmutante und einer H-Kette der Wildform bestand, auch eliminiert, obwohl das modifizierte Toxin die Fähigkeit bewahrte, sich an seinen Rezeptor zu binden. In einem ähnlichen Experiment wurden getrennte BoNT/A-L-Kettenmoleküle entweder an Hi²²&sup7; oder Glu²²&sup4; oder an beiden Resten modifiziert. Diese Modifikationen in der BoNT/A-L-Kette bewirkten den Verlust proteolytischer Aktivität gegen zelluläre Zielsubstrate.
Da viele Menschen gegen Tetanustoxin immunisiert sind, gilt es als vorteilhaft, das TeTx-Molekül weiter zu modifizieren, sodaß es durch Antikörper im Kreislauf minimal neutralisiert wird. Modifikationen am TeTx-Molekül, die seine zelluläre Bindung und Internalisierungsfähigkeit aufrechterhalten, jedoch seine Detektion durch das Immunsystem einschränken, werden bevorzugt.
Durch die hierin beschriebenen Verfahren können Clostridium-Toxinmutanten synthetisiert werden; außerdem behalten sie ihre Fähigkeit bei, wirksam internalisiert und zum Cytosol transportiert zu werden. Diese Toxine behalten die Fähigkeit der Neuronenbindung selbst in Abwesenheit von assoziierter Protease-Aktivität bei. Diese entschärften Toxine eignen sich zur Produktion neuartiger Systeme zur spezifischen Beförderung von Chemikalien zu Zielneuronen.
Die hierin beschriebenen mutagenisierten und enzymatisch inaktiven Doppelketten- Clostridium-Toxine können günstigerweise als neuropharmakologische Mittel für den Transport chemischer Verbindungen zu neuronalen Zellen dienen, die Zelloberflächenrezeptoren für die Toxine exprimieren. Die Bindung von Chemikalien an das Transporterprotein ist für die Praxis der Erfindung erforderlich. Solche Chemikalien sind pharmakologische Mittel, chemotherapeutische Mittel oder visualisierbare Mittel, die durch Licht oder eine andere Form elektromagnetischer Strahlung nachweisbar sind.
Trotz einiger Ähnlichkeiten ist es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß Tetanus- und Botulinumtoxine in zumindest einem wichtigen Aspekt funktionell unterschiedlich sind. Tetanustoxin wird von motorischen Neuronen aufgenommen und dann zum Rückenmark transportiert, wo es einen spastischen Zustand hervorruft. Somit kann TeTx Zielzellen im Rückenmark über einen Weg erreichen, der in den Muskeln beginnt und bis zum Rückenmark zurückführt. Die verschiedenen BoNT-Serotypen üben hingegen allesamt lokalisierte Neurotoxizität in cholinergischen Nervenenden aus (im wesentlichen auf die Injektionsstelle beschränkt).
Der Unterschied zwischen der Fähigkeit von TeTx, zum Rückenmark vorzudringen und toxische Aktivität und lokalisierte Aktivität von BoNT zu entfalten, kann in therapeutischen Behandlungen unter Verwendung modifizierter Toxin-Transporter ausgenützt werden. Insbesondere kann man erwarten, daß modifizierte Toxine auf der Basis von TeTx gebundene Arzneimittel entlang eines neuralen Wegs, der das Rückenmark mit dem injizierten Muskel verbindet, zum Rückenmark befördern. Modifizierte Toxine auf der Basis eines der Botulinum-Serotypen bleiben vermutlich an der Injektionsstelle lokalisiert. Ein Kliniker kann daher unter Verwendung von Therapeutika auf der Basis modifizierter Toxin-Transporter der Erfindung Arzneimittel selektiv zur Rückenmarksregion befördern, indem ein Therapeutikum auf TeTx-Basis in einen geeigneten Muskel injiziiert wird. Alternativ dazu kann man erwarten, daß die Verabreichung eines Therapeutikums auf BoNT-Basis in einen Muskel eine auf die motorischen Neuronen an der Injektionsstelle beschränkte Aktivität entfaltet.
Der inaktive Tetanustoxin-Transporter kann vor allem zur Beförderung von Arzneimitteln zum Zielgewebe verwendet werden, um den spastischen Zustand und übermäßige Bewegungen in allgemeinen Bereichen, wie z. B. im Arm, Bein oder einem anderen Körperteil, zu steuern. Das Arzneimittel und der Transporter können intramuskulär an eine oder mehrere Muskelgruppen verabreicht werden, die aus dem Rückenmarksziel entspringen. Im allgemeinen sind Krankheiten, die Muskeln unterhalb des Halses betreffen, ideale Ziele.
Krankheiten, die vermutlich von solchen Therapien profitieren, sind u. a. spasmodische Tortikollis, durch Schlaganfall oder traumatische Gehirnverletzung induzierte spastische Zustände und Dystonien großer Muskelgruppen.
Der inaktive Botulinumtoxin-Transporter kann vor allem zur Beförderung von Arzneimitteln verwendet werden, die auf das periphere motorische Nervenende abzielen. Daher können Krankheiten, die eingeschränkte Muskelgruppen betreffen, am geeignetsten unter Verwendung des BoNT/A-basierten Transporters behandelt werden. Man geht davon aus, daß Transporter auf der Grundlage anderer Botulinumtoxin-Serotypen für diesen Zweck auch geeignet sind.
Krankheiten, die vermutlich von solchen Therapien profitieren, sind u. a. tardive Dyskinesie, spastische Kolitis, essentieller Tremor, glatte Magenmuskulatur, Achalasie (abnormale Kontraktionen des Ösophagus), lokalisierte Spastizität, schmerzvolle Muskelkrämpfe, die auf Rücken- oder andere Muskelgruppen beschränkt sind, temporal-mandibulare Störungen, spasmodische Tortikollis, Spastizität nach Schlaganfall oder traumatischer Gehirnverletzung, Dystonien großer Muskelgruppen, glatte kardiovaskuläre Muskeln (d. g. Arteriole) und glatte Sphinktermuskulatur in verschiedenen Organen (Gallenblase, Harnblase, Rektum usw.).
Tabelle 1 zeigt potentielle Therapeutika in Zusammenhang mit der Erfindung. Die Einträge in dieser Tabelle beschreiben spezifische Medikamentenklassen, die mit den Tetanustoxin- oder Botulinumtoxin-Molekülen verbunden sein können. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, kann modifiziertes Tetanustoxin therapeutische Verbindungen zum Rückenmark und zu anderen Nervenzellstellen befördern. Modifizierte Botulinumtoxine sind als Vehikel zur lokalen Beförderung chemischer Mittel geeignet.
Obwohl die hierin beschriebenen Transporter vor allem inaktive Doppelketten-Tetanus- und Botulinumtoxin-Typ A-Proteine sind, könnten die Toxine aller anderen Botulinum- Serotypen (B-G) ebenso verwendet werden. Die unterschiedlichen Serotypen von Botulinumtoxin nutzen verschiedene präsynaptische Rezeptoren. Die Anmelder sehen also den Einsatz unterschiedlicher Toxinserotypen als Transporter voraus, die dazu verwendet werden können, für Spezifität der Arzneimittelbeförderung zu sorgen. Dies wäre besonders dann sinnvoll, wenn einige Gewebe einen Rezeptor selektiv stärker als ändere exprimierten. Alternativ dazu könnten zwei Transporter dazu dienen, unterschiedliche Therapeutika zum gleichen Zielgebiet des Körpers zu transportieren. Dieser Ansatz würde die Kompetition zwischen unterschiedlichen Toxinliganden an der Rezeptorstelle günstigerweise einschränken.
Außerdem soll die Verwendung nativer und rekombinierter Clostridium-Neurotoxinproteine der Wildform für gebundene chemische Verbindungen in den Schutzbereich der Erfindung fallen. In solchen Anwendungen bietet die enzymatische Aktivität des L-Kettenabschnitts des Arzneimittel-Transporters einen zusätzlichen therapeutischen Vorteil infolge seiner neurotoxischen Eigenschaften. Ein Arzneimittel, das Nervenfunktion blockiert, könnte z. B. mit einem Botulinumtoxin-Molekül der Wildform verbunden werden, um eine Verbindung mit Doppelwirkung bereitzustellen. Das Botulinumtoxin würde seinen neuronalen inhibitorischen Effekt zeigen, während das Arzneimittel an seiner Zielstelle in der Zelle wirkt.
Beispiele für neuromuskuläre Krankheiten, die therapeutische Ziele unter Verwendung aktiver Neurotoxine sind, die an Arzneimittelmoleküle gebunden sind: fokale Dystonien, spastische Zustände infolge von Schlaganfall oder traumatischer Gehirn- oder Rückenmarksverletzung, Blepharospasma, Strabismus, Zerebrallähmung und Rückenschmerzen aufgrund von Muskelkrämpfen.
Wie weiter untend dargelegt, wirken einige der Arzneimittel, die für die Verwendung in der Erfindung in Betracht gezogen werden, intrazellulär, während andere extrazellulär wirken. Wie hierin geoffenbart, können die intrazellulär wirkenden Arzneimittel an einen Clostridium-Toxinträger gebunden und wirksam internalisiert werden. Extrazellulär wirkende Arzneimittel kommen jedoch auch für die Erfindung in Frage. Die Anmelder stellten fest, daß sich reduzierte, alkylierte Botulinumtoxin-Moleküle and das Äußere der Zelle binden können, aber nicht internalisiert werden (de Paiva et al., J. Biol. Chem. 268, 20838 (1993)). Somit können diese reduzierten, alkylierten Moleküle an extrazellulär wirkende Arzneimittel gebunden und zur Oberfläche der Zielzelle befördert werden. Sobald sie an die Zelloberfläche gebunden sind, können Enzyme wie etwa Esterasen das Arzneimittel vom Toxinträger abspalten, um das Arzneimittel in unmittelbarer Nähe der Zielzelle freizusetzen.
Eine kurze Beschreibung verschiedener Anwendungen der mit repräsentativen Arzneimittelklassen verbundenen Transporterformen ist nachstehend zusammengefaßt. Tabelle 1 Therapeutische Verwendungen von Clostridium-Toxin-Transportern
Die Verfahren zur kovalenten Bindung der inaktivierten Clostridium-Toxine und der Chemikalien beruhen auf herkömmlichen Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Sie erfolgen jedoch unter der Voraussetzung, daß die Domäne der Verbindung, die mit dem inaktivierten Toxin übereinstimmt, die Fähigkeit beibehält, spezifisch mit zugehörigen Colstridium-Toxinrezeptoren auf Zielzellen wechselzuwirken.
Gereinigtes Botulinumtoxin vom Typ A wurde klinisch als neurotoxisches Mittel verwendet. Diese Verbindung, die unter dem Markennamen BOTOX® vertrieben wird, wird von Allergan, Inc. (Irvine, CA, USA) hergestellt. Dieses Mittel wird therapeutisch eingesetzt, um lokalisierte Muskelparalyse mit chemischer Denervierung hervorzurufen. Im Falle dieser chemischen Denervierung atrophiert der betroffene Muskel und kann extrajunkturale Acetylcholin-Rezeptoren entwickeln. Man geht davon aus, daß die betroffenen Nervenzellen Muskelgewebe wachsen lassen und reinnervieren können, wodurch die paralytische Aktivität von BOTOX® reversibel ist.
Modifizierte, gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellte Clostridium-Toxine werden in lyophilisierter Form unter Vakuum in Behältern gelagert. Vor der Lyophilisierung weren die modifizierten Toxine mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten kombiniert, z. B. mit Albuminen und anderen geeigneten Mitteln, wie sie Fachleüte auf dem Gebiet kennen. Weitere Informationen betreffend solche pharmazeutischen Präparate finden sich in "Physicians Desk Reference", einem Werk, das jährlich von Medical Economics Data or Oradell, New Jersey, USA, veröffentlicht wird. Das lyophilisierte Material wird vor intramuskulärer Injektion mit steriler, nicht-konservierter Salzlösung rekonstituiert. Das gelöste Material eignet sich dann zur Behandlung einer Vielzahl neuromuskulärer Störungen (siehe oben).

Verfahren zur Bindung chemischer Verbindungen an Leichtketten-Proteine

Obwohl die Anmelder der Auffassung sind, daß viele unterschiedliche chemische Verbindungen günstigerweise an Toxin-Transportermoleküle gebunden werden, besteht eine Untergruppe dieser Verbindungen aus neuropharmakologischen Mitteln oder Medikamenten. Die folgende Beschreibung betont daher Verfahren zum Verbinden von Transporterproteinen und Arzneimitteln. Fachleuten auf dem Gebiet ist aber bewußt, daß der allgemeinere Ausdruck "chemische Verbindung" ohne weiteres an die Stelle des Terminus "Arzneimittel" oder "Medikament" treten kann.
Viele Vorgangsweisen sind bekannt, um chemische Verbindungen mit den Aminosäureketten von Proteinen zu verknüpfen. Die Anmelder verwenden ein Linkermolekül, um das Arzneimittel vom L-Kettenpeptid zu trennen. Wie oben besprochen, entdeckten die Anmelder, daß 11 Aminosäuren an den N-Terminus der TeTx-L-Kette gebunden werden können, ohne ihre Funktionellität nennenswert zu beeinflussen. Aus diesem Grund wird der N-terminale Abschnitt der Botulinumtoxin- oder Tetanustoxin-L-Kette als Verbindungs-Bindungspunkt verwendet.
Es ist bekannt, daß die meisten Arzneimittel Positionen besitzen, die sterischer Hinderung gegenüber unempfindlich sind. Ferner sollte das Verbindungsverfahren keine Chiralität in das Arzneimittelmolekül einführen. Außerdem sollten der Linker und das Arzneimittel durch eine kovalente Bindung aneinander gebunden sein. Die Entfernung zwischen der L-Kette und dem Arzneimittel kann durch Einfügen von Spacergruppen eingestellt werden. Bevorzugte Spacer besitzen funktionelle Gruppen, die sich an den Linker, das Arzneimittel und die L-Kette binden und diese miteinander verbinden können.
Bevorzugte Spacer:
1) HOOC-(CH&sub2;)n-COOH, mit n = 1-12, geeignet zur Insertion am aminoterminalen Ende eines Peptids, um es mit einem Linker auf einem Arzneimittelmolekül zu verbinden.
2) HO-(CH&sub2;)n-COOH, mit n > 10, geeignet zur Bindung am Aminoterminus eines Peptids, um die L-Kette mit einem Linker auf einem Arzneimittelmolekül zu verbinden.
3) (C&sub6;H&sub6;)n, mit n > 2, geeignet zur Bindung, um die L-Kette an einen Linker auf dem Arzneimittelmolekül zu knüpfen. Die Benzolringe bieten einen starren Spacer zwischen dem Arzneimittel und der L-Kette. Natürlich sind geeignete funktionelle Gruppen, wie sie z. B. durch nachstehendes X definiert sind, auf den Benzol ringen vorhanden, um das Arzneimittel und die L-Kette miteinander zu verbinden.
Zwei unterschiedliche Linkertypen werden in Betracht gezogen. Beim ersten Typ bleibt das Arzneimittel-Linker-L-Ketten-Molekül nach Einführung in Zellen intakt. Im zweiten Typ wird das Arzneimittel-Linker-L-Ketten-Molekül metabolisiert, um das Arzneimittel nach Einführung in Zellen freizusetzen.

Linker, die nach Einführung intakt bleiben

In einem Verfahren wird ein Cysteinrest durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren an das Ende des L-Kettenmoleküls gebunden. Beispielsweise kann das Genkonstrukt, das das L-Kettenmolekül trägt, mutiert werden, um im N-terminalen Abschnitt des Proteins einen Cysteinrest zu enthalten. Ein Maleimidlinker wird dann durch bekannte Mittel an den Cysteinrest gebunden.
In einem zweiten Verfahren wird der Linker direkt an das Arzneimittel gebunden. Eine Arzneimittel-X-Gruppe kann die folgenden Gruppen aufweisen, worin X = OH, SH, NH&sub2;, CONH, CONH&sub2; ist. Natürlich befindet sich die richtige Gruppe nicht an einer aktiven Stelle und ist nicht sterisch gehindert. Die folgende Reaktion verbindet Arzneimittel-X mit dem Linkermolekül.
Sobald das Arzneimittel einen gebundenen Linker aufweist, kann die folgende Reaktion dazu dienen, das Arzneimittel mit dem Toxin zu verbinden. In dieser Reaktion besitzt das Toxin eine zugängliche Lysingruppe, die als Bindungspunkt für das Arzneimittel verwendet wird. Wie oben besprochen, kann eine zusätzliche Aminosäure, z. B. Lysin, problemlos dem N-terminalen Abschnitt des L-Kettengens hinzugefügt und als Bindungspunkt für ein Arzneimittel verwendet werden. In der folgenden Reaktion wird Natriumcyanoborhydrid dazu verwendet, den Linker an die Lysingruppe auf dem L-Kettenmolekül zu binden.
Arzneimittel, die sich zur Verwendung in der Erfindung eignen, sind jene, die eine freie -XH-Gruppe aufweisen und als Neuroinhibitoren dienen können. Diese Neuroinhibitoren können die Überproduktion von Neurotransmittern bei einigen medizinischen Indikationen insofern beeinflussen, als Nervenentzündung verhindert wird. Zweckmäßige Arzneimittel mit -XH-Gruppen sind Aconitin, Adenosin-Agonisten/Antagonisten, Adrenergika, Anatoxin A, Antiepileptika, Baclofen, Batiachotoxin, Brefeldin A, Brevetoxin, Captopril, Kurare, Dantrolen, Doxorubin, Diazepam, Grayanotoxin, Lidorain, Methocarbamol, Methyllycaconitin, Neosaxitoxin, Physostigmin, Psychosin, THA, Tetrodotoxin, Vesamicol und Vigabatum.

Linker, die nach der Einführung abgespalten werden

Je nach der Wirkungsweise des Arzneimittels kann es wichtig sein, daß das Arzneimittel nach der Einführung von der L-Kette freigesetzt wird. In diesem Verfahren besitzt das Arzneimittel eine freie -XH-Gruppe, welche die aktive Stelle für die Synthese mit einem Linker ist. Die -XH-Gruppe könnte ein Alkohol, Phenol, Amin, eine Carbonsäure oder Thiolgruppe sein.
Die allgemeine Formel zur Bindung eines Arzneimittels an ein Toxin, sodaß es nach der Einführung metabolisiert wird, ist:
worin X = O, N/NH, CO&sub2;, S, CONH sein kann und worin der Linker A) oder B) sein kann, wie nachstehend dargestellt:
Die jeweiligen Reaktionen mit Linkem A oder B sind nachstehend dargestellt.
Die Strategie der Anmelder zur Bindung von Ribozymen an die Toxin-Transporter sieht die Verwendung der freien funktionellen Aminogruppen auf Adenosin- und Guanosin- Basen für die Linkerbeindung vor. Insbesondere verwenden die Anmelder modifizierte Adenosin- oder Guanosinreste, die an ihren freien Aminopositionen mit einem Linker modifiziert sind, der seinerseits an die Stickstoffposition von Succinimid gebunden ist. Die Strukturen dieser modifizierten Nukleoside können wie folgt schematisch dargestellt werden:

Zucker-Base-N H-Linker-Succinimid

Ribozyme werden üblicherweise hergestellt, indem Nukleoside nacheinander in einer definierten Reihenfolge verbunden werden. Die Verbindungsreaktion erfolgt zwischen den Zuckergruppen der einzelnen chemischen Einheiten. Die Einarbeitung eines modifizierten Nukleosids (s. o.) entweder am 3'- oder 5-Ende des Ribozyms bietet ein Mittel zur kovalenten Bindung des Toxin-Transporters gemäß dem oben beschriebenen Mechanismus.
Obwohl auch andere Materialien und Verfahren, die den hierin beschriebenen ähneln, in der Praxis oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, folgt nun eine Beschreibung der bevorzugten Verfahren und Materialien. Allgemeine Informationen über die Durchführung der verschiedenen PCR- und Klonierungsverfahren finden sich in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al. [Hrsg.]), Cold Spring Harbor Lab. Publ. 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. [Hrsg.], Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1987).
Der erste Schritt bei der Bildung einer inaktivierten TeTx-Zusammensetzung umfaßte das Subklonieren der Wildform- und mutierten L-Ketten-Strukturgene in Plasmid-Expressionsvektoren. Der für diesen Zweck eingesetzte Vektor war konstruiert, ein Fusionsprotein zu exprimieren, das eine Maltose-Bindeproteindomäne am N-Terminus mit L- Kettensequenzen am C-Terminus verbindet. Eine vektorkodierte proteolytische Faktor Xa-Spaltstelle befindet sich zwischen MBP und L-Ketten-Insertsequenzen. Stellengerichtete Mutagenese der L-Ketten-DNA diente zur Änderung von Glu²³&sup4; zu Ala (Fig. 1B). Beispiel 1 beschreibt die Verfahren zur Bildung rekombinierter Plasmide, die für Maltosebindungs-Fusionsproteine von Wildform- und mutierten Tetanustoxin-L-Kette kodierten.

Beispiel 1

Herstellung von Maltose-Bindeprotein-TeTx-L-Ketten-Konstrukten

E. coli K12-Stamm TG1 diente als Wirt zur Vermehrung aller nachstehend beschriebenen Plasmidkonstrukte. Plasmid pMAL-LC (L-Kettengen der Wildform) wurde durch PCR-Amplifizierung eines 1417 bp-Fragments konstruiert, das für die L-Kette von Plasmid pTet87 kodiert, das von Fairweather et al., FEBS Lett. 323, 218 (1993), beschrieben wurde. Die zwei Polynukleotidprimer, a und d genannt, die in dieser PCR-Amplifizierung verwendet wurden, besaßen die Sequenzen 5'-GAGATGGTCGACATGCCAATA ACCATAAATAAT-3' (Seq.-ID Nr. 1) bzw. 5'-ACGCGAAGCTTTTATCATGCAGTTCTA TTATA-3' (Seq.-ID Nr. 2). Das Amplifizierungsprodukt dieser Reaktion wurde mit SalI und Hindill (Promega) gespalten und dann mit Vektor pMAL-c2 (New England BioLabs) ligiert (Fig. 1A), der mit den gleichen Enzymen gespalten wurde, um das Plasmid pMAL- LC zu bilden, das TeTx-Sequenzen der Wildform aufwies. Für die stellengerichtete Mutagenese wurden zwei zusätzliche Primer, b und c, verwendet, welche die Sequenzen 5'-TAGTACATGTATAAGTGCGTGCATTAATAG-3' (Seq.-ID Nr. 3) bzw. 5-TTATAC ATGTACTACATGGT-3' (Seq.-ID Nr. 4) aufwiesen. Jeder dieser Primer besaß AfIIII-Spaltstellen, die zur Mutation eines Glu-Codons zu einem Ala-Codon an Aminosäureposition 234 der TeTx-L-Kettte dienten. PCR-Amplifizierung von pTet87 erfolgte mit den Primerpaaren a/b bzw. c/d. Das Amplifizierungsprodukt von Paar a/b wurde mit SalI und AfIIII gespalten, und jenes von Paar c/d wude mit AfIIII und HindIII gespalten. Nach der Reinigung mit dem MAGIC DNA CLEAN-UP SYSTEM (Promega) wurden die Proben an pMAL-c2 ligiert, das mit SalI und HindIII gespalten worden war, um das Plasmid pMAL- LC-Ala²³&sup4; zu bilden, das die mutierte TeTx-Sequenz aufwies.
Nach dem Subklonieren wurde Plasmid-DNA aus Kulturen ampicillin-resistenter Transformanten gereinigt und die Strukturen der Konstrukte mittels Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung des Inserts bestätigt. SalI- und HindIII-Spaltung lieferte ein Fragment mit der erwarteten Länge von 1417 bp (bestimmt durch Agarosegel-Elektrophorese). DNA-Sequenzierung bestätigte, daß sich die Nukleotidsequenz an der Verbindungsstelle des 5'-Endes des L-Kettengens, die multiple Klonierungsstelle (MCS), die Faktor Xa-Spaltstelle, die L-Kette und die MBP-Kodiersequenzen alle im korrekten Leserahmen befanden (Fig. 1A).
Die Verfügbarkeit der oben beschriebenen Plasmidkonstrukte ermöglichte die Produktion rekombinierter L-Ketten-Fusionsproteine der Wild- und Mutantenform. Konkret wurden Kulturen bakterieller Klone, die Plasmide pMAL-LC oder pMAL-LC-Ala²³&sup4; aufwiesen, mit Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induziert, um eine hochwertige Synthese der rekombinierten Fusionsproteine zu stimulieren. Die Reinigung der zwei Fusionsproteine in großem Umfang wurde durch Affinitätschromatographie bakterieller Extrakte auf Amylose-Affinitätsharz erreicht.
Beispiel 2 beschreibt die Verfahren zur Produktion und Reinigung rekombinierter L-Ketten-Fusionsproteine, für die die im obigen Beispiel erläuterten Plasmidkonstrukte kodieren.

Beispiel 2

Expression von TeTx-Fusionsproteinen und Reinigung von Wildform- und Ala²³&sup4;-L- Ketten-Mutanten-Proteinen

E. coli-Klone, welche die Plasmide pMAL-LC oder pMAL-LC-Ala²³&sup4; enthielten, wurden bis zu Dichten von etwa 2 · 10&sup8; Zellen/ml (A600nm ~ 0,5) bei 37ºC in L-Brühe gezüchtet, die 100 ug/ml Ampicillin und 2 mg/ml Glucose enthielt. Induktion wurde durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mM eingeleitet. Zellen wurden 2 Stunden später durch 30-minütige Zentrifugation bei 6000 · g geerntet. Die resultieren den Pellets wurden dann in Säulenpuffer resuspendiert [10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 1 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,4], umfassend 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Nach der Zentrifugation wurden Rohextrakte auf eine Amylose-Affinitätssäule (2,5 · 10 cm, 40 ml Harz) aufgebracht. Nach der Entfernung ungebundener Proteine durch Waschen mit Puffer wurden die gebundenen MBP- LC-Fusionsproteine mit 10 mM Maltose enthaltendem Säulenpuffer eluiert; dies erfolgte gemäß dem Verfahren von Maina et al., Gene 74, 365 (1988). Die isolierten Fusionsproteine wurden auf 0,5-1 mg/ml unter Verwendung von Amicon CENTRICON aufkonzentriert. Proteinproben wurden dann durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blotting unter Verwendung von polyklonalen Anti- MBP- und monoklonalen Anti-L-Ketten-Antikörpern analysiert. SDS-PAGE beider Zellextrakte zeigte die Gegenwart einer induzierten Proteinbande (Mr ~ 90.000), die im Coomassie-Färbungsmuster der nicht-induzierten Kulturen fehlte. Das Molekulargewicht der Proteinbande stimmte mit jenem überein, das von einer Fusion von MBP und L-Kette zu erwarten war (Mr ~ 40.000 bzw. 50.000). Die optimalen Bedingungen zur Expression rekombinierter L-Kette und Ala²³&sup4;-Mutante mittels des pMAL-c2-Vektorsystems waren 2-stündige Induktion mit IPTG bei 37ºC. Weder eine lange Induktionszeit noch das Vorsehen von Proteaseinhibitoren steigerte die Produktausbeute. Beide Fusionsproteine waren in wäßrigem Puffer (bis zu 0,5 mg/ml löslich) und bis zu 8 Monate lang bei Lagerung bei -20ºC stabil.
Nach diesem ersten Reinigungsschritt wurden beide MBP-L-Ketten-Präparate bei 23ºC 24 Stunden lang mit Faktor Xa bei einem Enzym-Protein-Verhältnis von 0,5-1 : 100 (w/w) gespalten. Diese Spaltung sorgte für eine vollständige Umwandlung der Fusionsproteine in die L-Kette der Wildform und Ala²³&sup4;-L Kette mit der Freisetzung von MBP, wie durch SDS-PAGE bestätigt wurde. Nach umfangreicher Dialyse gegen den Säulenpuffer zur Entfernung von Maltose wurde die L-Kette oder Ala²³&sup4;-L-Kette durch Reabsorption auf einer neue Affinitätssäule weitergereinigt. Das gewünschte Produkt aus diesem Reinigungsschritt fand sich in der Säulen-Waschlösungsfraktion. Fraktionen der Säulenwasch lösung wurden auf A280nm untersucht und mittels SDS-PAGE und Western Blotting überprüft.
Für das Aminosäure-Sequenzieren wurden L-Ketten der Wild- und der Mutantenform auf SDS-PAGE laufen gelassen und auf eine Poly(vinylidendifluorid)-Membran übertragen, wie von Tous et al., Anal. Biochem. 179, 50 (1989), beschrieben, wobei automatisierter Edman-Abbau auf einem Protein-Sequenzierer Modell 4000 (Chelsea Instruments, London) durchgeführt wurde. Die Mikrosequenzierung der beiden Produkte zeigte 4 Reste, die mit jenen des N-Terminus nativer L-Kette identisch waren und denen jene 11 Aminosäuren vorangingen, für welche die multiple Klonierstelle des Vektors kodiert (siehe Fig. 1A). Angesichts des Erfolgs bei der Herstellung rekombinierter L-Ketten-Proteine mit den gewünschten Strukturen wurden als nächstes die enzymatischen Aktivitäten dieser Zusammensetzungen untersucht.
Die Messung der zinkabhängigen Protease-Aktivität nativer L-Kette wurde als Assay auf Aktivität der rekombinierten L-Ketten-Proteine verwendet. Zwei unterschiedliche Proteinsubstrate wurden in diesem Assay verwendet. Im ersten Fall wurden kleine synaptische Rindervesikel (SSVs) verwendet. Der Assay für die proteolytische Spaltung des Substrats basierte auf Coomassie-Färbung und Western Blotting von Proteingelen.
Beispiel 3 beschreibt die Verfahren zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität von rekombinierten L-Ketten-Proteinen der Wild- und Mutantenform mittels SSVs als Substrat.

Beispiel 3

Messung von TeTx-L-Ketten-abhängiger Proteolyse von in vitro-Substraten

Native, rekombinierte Wildform- oder Ala²³&sup4;-L-Ketten wurden mit SSVs (0,5 mg/ml) 90 min lang bei 37ºC in 50 mM HEPES, 400 mM NACl, 5 mM DDT, 2 uM ZnSO&sub4; (pH 7,4), inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer ab gebrochen, gefolgt von 3-5-minütigem Aufkochen. Proben wurden dann SDS-PAGE unterzogen und mittels affinitätsgereinigtem Anti-HV62-Antikörper gegen ein 62 Aminosäuren umfassendes synthetisches Polypeptid, das den Resten 33-94 von menschlichem VAMP 2 entsprach (wie von Shone et al., Eur. J. Biochem. 217, 965 (1993) definiert), mittels Western Blotting detektiert. Das Verfahren zur Herstellung des Anti-HV62-Antikörpers war im wesentlichen das gleiche wie das von de Paiva et al., J. Neurochem. 61, 2338 (1993), beschriebene Verfahren. Inkubation der rekombinierten (100 nM) oder authentischen (50 nM) L-Ketten-Proteine mit Rinder-SSVs führte zur proteolytischen Spaltung von VAMP, wie dies semi-quantitativ durch Western Blotting mittels der Anti- VAMP-Antikörpersonde oder Protfärbung der Spaltlösungen nach SDS-PAGE ermittelt wurde. Die Ala²³&sup4;-L-Kette erwies sich als Protease inaktiv, selbst in einer Konzentration von 2,3 uM. Dieses Ergebnis bestätigte, daß Glu²³&sup4; für die enzymatische Aktivität der TeTx-L-Kette wesentlich ist.
Um die relativen Aktivitäten der nativen und rekombinierten L-Ketten präziser zu quantifizieren, wurde RP-HPLC dazu verwendet, die Spaltung eines synthetischen, 62 Reste umfassenden Polypeptids, HV62, das den Resten 33-94 von menschlichem VAMP-2 entsprach, zu messen.
Beispiel 4 beschreibt das Verfahren zur Quantifizierung der in vitro-Aktivitäten nativer und rekombinierter L-Ketten unter Verwendung des HV62-Peptidsubstrats.

Beispiel 4

Quantifizierung der proteolytischen Aktivitäten nativer und rekombinierter TeTx-L- Ketten-Proteine

Eine Stammlösung von HV62-Peptid (40 uM Endkonzentration, 60 ul Endvolumen) in 20 mM HEPES und 200 mM NaCl (pH 7,4) mit 5 mM DTT wurde bei 37ºC mit L-Ketten-Präparaten (100 nM Endkonzentration) inkubiert. In zeitlich abgestimmten Intervallen wurden die Reaktionen durch Zugabe von 60 ul 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) (pH 2) abgebrochen, gefolgt von Zentrifugation. Die Proben wurden bis zur Analyse bei -20ºC gelagert. Das Ausmaß an HV62- Hydrolyse wurde durch RP-HPLC auf einer Micropax C&sub1;&sub8;-Säule (äquilibriert in 0,05% TFA mittels eines 0-60% Acetonitril-Gradienten) gemessen, während bei A220nm kontrolliert wurde. N-terminale Sequenzierung des Spaltprodukts bestätigte eine einzelne proteolytische Stelle zwischen Gln&sup7;&sup6; und Phe&sup7;&sup7;, was mit den Beobachtungen von Schiavo et al., EMBO J. 11, 3577 (1992), übereinstimmte. Der Prozentsatz an HV62-Hydrolyse wurde anhand der Peakhöhe des Abbauprodukts berechnet, das den Resten 77-94 entsprach. Eine lineare Standardkurve, die Peakhöhe mit bekannten Produktmengen in Beziehung setzte, wurde zur Quantifizierung verwendet.
Die Quantifizierung des getrennten Spaltprodukts (Reste 77-94) sowie die Zeit- und konzentrationsabhängige Hydrolyse des Polypeptids durch native L-Kette ist in Fig. 2 dargestellt. Die Spaltung des HV62-Substrats (40 uM) durch die rekombinierte L-Kette (250 nM) bestätigte deren proteolytische Aktivität. Eine 2,5-fach höhere Konzentration der rekombinierten L-Kette war jedoch erforderlich, um das gleiche Hydrolyseausmaß (n = 4) hervorzurufen wie für das authentische L-Ketten-Protein. Unter den angegebenen Bedingungen waren die Anfangsraten (n = 4) der Substratspaltung bei 37ºC mit 100 nM nativer und rekombinierter L-Kette 45,6 ± 3,6 bzw. 21,6 ± 2,4. Die Proteolyse des Polypeptids (40 uM) war vor allem nicht nachweisbar, wenn die Ala²³&sup4;-L-Kette 3 Stunden lang bei 2,5 uM inkubiert wurde. Diese Erkenntnis bestätigte, daß Glu²³&sup4; für die katalytische Aktivität der TeTx-L-Kette entscheidend war.
Das Fehlen von proteolytischer Aktvität, das die Ala²³&sup4;-L-Kettenmutante charakterisierte, könnte entweder einer Unfähigkeit der L-Kette, das Substrat zu binden, oder ihrer Unfähigkeit, die Peptidbindung (Gln Phe) zu spalten, zuzuschreiben sein. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Ala²³&sup4;-L-Kette hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, die Spaltung des HV62-Substrats durch native L-Kette abzuschwächen. Dies wurde einfach durch Vorinkubieren von HV62 mit Ala²³&sup4;-L-Kette vor der Zugabe von nativer L-Kette getestet. Um diesen Versuch durchzuführen, wurden 9 um HV62 mit 4,5 uM Ala²³&sup4;-L-Kette im Reaktionspuffer 1 Stunde vor der Zugabe von 150 nM nativer L-Kette bei 37ºC vorinkubiert. Am Ende der Reaktionszeit wurde die Probe auf Substratspaltung analysiert (s. o.). Die Ergebnisse dieser Vorgangsweise deuteten darauf hin, daß die Gegenwart des Ala²³&sup4;-L-Ketten-Mutantenproteins die Aktivität der nativen L-Kette um mehr als 50% reduzierte (Fig. 2, Insert). Dieses Ergebnis zeigte, daß die L-Kettenmutante die Fähigkeit der Peptidbindung beibehielt, wodurch die proteolytische Aktivität der nativen L-Kette gehemmt wurde.
Da die Anmelder zeigten, daß die Ala²³&sup4;-L-Kette keine nachweisbare proteolytische Aktivität besaß, untersuchten sie danach die Eigenschaften von Doppelkettenmolekülen, die aus nativen H-Ketten- und inaktiven L-Ketten-Komponenten bestanden. Da der H- Kettenabschnitt des Toxins in hohem Maß zur Bindung von Zelloberflächenrezeptoren beiträgt, folgerten die Anmelder, daß ein Doppelkettentoxin, das die Fähigkeit zur Proteolyse von Substraten eingebüßt hatte, vermutlich die Fähigkeit beibehält, sich an die Zelloberfläche zu binden und internalisiert zu werden. Eine solche Doppelkettenspezies könnte an die Verwendung als Vehikel zur Beförderung verschiedener chemischer Spezies zu neuronalen Zellen angepaßt werden.
Beispiel 5 beschreibt das Verfahren zur Herstellung von TeTx-Doppelketten, die entweder native L-Kette, rekombinierte L-Kette der Wildform oder Ala²³&sup4;-L-Kette enthalten.

Beispiel 5

Reassoziation von TeTx von nativer H-Kette und rekombinierter L-Kette

Native H-Kette, nach dem Verfahren von Weiler et al., Eur. J. Biochem. 182, 649 (1989), aus TeTx gereinigt, wurde mit einer äquimolekularen Menge an nativer L-Kette, rekombinierter L-Kette der Wildform oder Ala²³&sup4;-L-Kette kombiniert. Die Gemische wurden gegen 2M Harnstoff, 20 mM DTT,1 M NaCl und 50 mM Tris-HCl (pH 8,4), unter 18-stündigem Rühren dialysiert und dann ohne Rühren gegen 50 mM Tris-HCl und 600 mM Glycin (pH 8,4) 72 Stunden lang weiter dialysiert. Eine Aliquote (300 ug) wurde auf eine HPLC DEAE-Säule in 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,4) geladen und mit einem NaCl- Gradienten (0-1 M) im gleichen Puffer eluiert. Das Ausmaß an kovalenter Rekonstitution wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und Silberfärbung überprüft.
Die Reassoziation von Doppelkettenspezies wurde aufgrund der Gegenwart von gefärbten Proteinbanden mit hohem Mr bestätigt, die mit nativem teTx co-migrierten. Hinsichtlich der rekombinierten L-Ketten der Wild- und Mutantenform betrugen die relativen Mengen der Doppelkettenspezies 55,1% bzw. 56,8% (bestimmt durch Densitometer- Scanning des silbergefärbten Gels). Native H-Kette und L-Kette lieferte ähnliche Rekonstitutionswerte. Letztere umfaßte Zwischenketten-Disulfidbildung, da das Toxin bei Reduktion durch DTT wieder in die freie H-Kette und L-Kette umgewandelt wurde.
Aufgrund der Verfügbarkeit reassoziierter Doppelketten-Toxinmoleküle untersuchten die Anmelder die biolgoischen Aktivitäten von Doppelketten, die rekombinierte L-Ketten umfaßten. Obwohl die Ergebnisse der von den Anmeldern durchgeführten SDS-PAGE- Analyse zeigten, daß Doppelkettenspezies reassoziiert hatten, war dies alleine kein Beweis dafür, daß die rekonstituierten Proteine richtig gefaltet waren oder daß sich die geeigneten Disulfidbindungen innerhalb und zwischen den Ketten gebildet hatten, um aktive Toxine zu produzieren. Somit war es notwendig, einen funktionellen Assay auf Toxinaktivität durchzuführen.
Beispiel 6 beschreibt die Verfahren zur Ermittlung der biologischen Aktivität der reassoziierten Doppelkettentoxine.

Beispiel 6

Bioassay reassoziierter TeTx-Doppelkettentoxine

Mäuse (20 g) erhielten in die Nackenregion subkutane Injektionen mit Doppelkettentoxin oder anderen Proben (200 ul/Maus), wie von Fairweather et al., Infect. Immunol. 58, 1323 (1990), beschrieben. LD&sub5;&sub0;-Werte wurden nach dem Verfahren von Maisey et al., Eur. J. Biochem. 177, 683 (1988), ermittelt. Die Ergebnisse dieser Vorgangsweise sind in Tabelle 2 veranschaulicht. Tabelle 2 Mäuse-Letalität bei TeTx und rekonstituierten Proben aus nativer HC und rekombinierter LC oder der Ala²³&sup4;-Mutante
a Gemessen im Verlauf von 4 Tagen wie in den Versuchsverfahren beschrieben, Mittelwerte für Dreifachversuche angegeben
b Von TeTx gereinigte HC wurde mit äquimolekularen Mengen nativer LC, rekombinierter LC oder Ala²³&sup4;- LC rekonstituiert, um Doppelketten zu bilden. Der Anteil an Gesamtprotein, das als kovalentes Dimer vorliegt, wurde durch SDS-PAGE und Densitometer-Scanning von Silberfärbungsgelen bestimmt.
Die Ergebnisse von Tabelle 2 zeigen deutlich, daß die aus der Ala²³&sup4;-L-Kette und nativen H-Kette rekonstituierte Doppelkettenspezies keine toxische Aktivität außer jener der H-Kette alleine aufwies. Dieses Fehlen von Aktivität war nicht auf den Reassoziierungsprozeß zurückzuführen, da die aus nativer H-Kette und rekombinierter L-Kette rekonstituierte Doppelkette Toxizität aufwies.
Die dokumentierte lokale Wirkung von TeTx bei der Blockierung neuromuskulärer Übertragung, die von Habermann et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 311, 33 (1980), beschrieben wurde, wurde auch ausgenützt, um die Aktivität rekonstituierter Proben im Verhältnis zu jener des intakten Toxins zu bestimmen.
Beispiel 7 beschreibt die Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit rekonstituierter Doppelkettentoxine, neuromuskuläre Übertragung zu bewirken.

Beispiel 7

Effekte von rekonstituierter H-Kette und rekombinierter TeTx-L-Kette oder Ala²³&sup4;-L-Kette auf die neuromuskuläre Übertragung

Die Hemmung der Acetylcholin-Freisetzung durch die rekonstituierte Doppelkette aus linken Mäusephrenikus-Hemidiaphragma-Präparaten wurde als Reduktion der nerveninduzierten Muskelspannung gemessen (beschrieben durch de Paiva et al., FEBS Lett. 277, 171 (1990)). Die Zeit bis zur Paralyse wurde als Dauer von der Zugabe von Toxin bis zu jenem Punkt, als die Muskelspannung auf 10% des ursprünglichen Werts sank, aufgezeichnet. Das hier verwendete Verfahren wurde allgemein von de Paiva et al., J. Neurochem. 61, 2338 (1993), beschrieben. Die Ergebnisse dieser Vorgangsweise sind in Fig. 3 dargestellt.
Bei 10 nM eliminierte TeTx nerveninduzierte Muskelspannung innerhalb von 150 Minuten, während aus nativer, H-Kette und L-Kette erzeugtes Toxin 240 Minuten benötigte; um Paralyse zu erzielen. Dieses Ergebnis stimmte mit den bereits besprochenen geringeren neuromuskulären Blockierungsaktivitäten rekonstituierter Ketten aus TeTx und BoNT/A überein (im Verhältnis zu jenen ihrer nativen Txoine, siehe Weiler et al., Eur. J. Biochem. 182, 649 (1989), und Maisey et al., Eur. J. Biochem. 177, 683 (1988)). Wenn die rekombinierte TeTx-L-Kette mit nativer H-Kette zusammensetzt wurde, zeigte die resultierende Doppelkette etwa die Hälfte der erwarteten Wirksamkeit; die rekombinierte Doppelkette bei 40 nM benötigte die gleiche Paralysezeit wie die nativen rekonstituierten Doppelketten bei 20 nM (Fig. 3, Insert), was mit der oben erwähnten reduzierten enzymatischen Aktivität exprimierter L-Kette übereinstimmt. Im Mäuse-Bioassay erwies sich TeTx als 15-fach toxischer als umgefaltete native Ketten (Tabelle 2). Wenn rekombinierte L-Kette der Wildform in der Rekonstitution verwendet wurde, konnte man einen weiteren Abfall der Letalität beobachten (Tabelle 2), die sich den von Fairweather et al., FEBS Lett. 323, 218, berichteten Werten näherte.
Vor allem erwies sich das Doppelkettentoxin, das mittels Ala²³&sup4;-L-Kette und nativer H- Kette rekonstituiert wurde, bei neuromuskulärer Übertragung über 6 Stunden bei 100 nM als inaktiv. Diese Erkenntnisse bestätigten die wesentliche Rolle der enzymatischen Aktivität in der Wirkung des Toxins.
Beispiel 8 beschreibt, wie die nativen oder rekombinierten Clostridium-Toxin-L-Ketten- Proteine kovalent an eine chemische Verbindung gebunden werden können. In diesem Beispiel wird ein Arzneimittel, das die Aufnahme von Acetylcholin aus dem Cytoplasma in synaptische Vesikel blockiert, unter Verwendung freier SH-Gruppen mit dem Transporterprotein verbunden. Der in diesem Verfahren gewählte Syntheseweg ist in Fig. 4 veranschaulicht.

Beispiel 8

Chemische Bindung von Transporterprotein und Vesamicol

Vesamicol wird zuerst an einen Linker von 1-Chlorpropyl-12-chlordodecanat unter Verwendung äquimolekularer Konzentrationen in einer Basen-Katalysator-Lösung (z. B. Pyridin, 2,6-Dimethylpyridin, Triethylamin oder Tetramethylguanidin) in Lösungsmitteln wie etwa THF, DMSO, DMF oder Acetonitril gebunden (Fig. 4). Die Reaktion erfolgt bei Temperaturen zwischen 0ºC und 100ºC über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden. Das resultierende Vesamicol-Linker-Produkt wird dann mit äquimolekularen Mengen des Kaliumsalzes von Maleimid in den gleichen Lösungsmitteln wie oben und in Gegenwart von Natriumiodid (als Katalysator) unter Einhaltung der gleichen Zeiten und Temperaturen wie oben umgesetzt.
Die rekombinierte inaktive L-Kette und native H-Kette werden renaturiert, um ein Doppelkettenmolekül von etwa 150 kDa Mr zu produzieren. Die Renaturierung wird durch Vermischen äquimolekularer Mengen von L-Ketten- und H-Kettenproteinen in Gegenwart von Harnstoff und DTT erzielt. Das Gemisch wird bei 4ºC gegen einen Puffer dialysiert, der die gleiche Zusammensetzung besitzt wie der in Beispiel 5 verwendete Dialysepuffer. Der Puffer wird vorzugsweise während des Renaturierungsverfahrens mit Sauerstoff angereichert und im Zeitraum von 24 Stunden fünfmal gewechselt. Die Entfernung von Harnstoff und DTT führt zur Disulfidverbindung von L-Kette und H-Kette. Jede Doppelkette besitzt mehrere freie Sulfhydrylgruppen, die zur Arzneimittelbindung zur Verfügung stehen.
Der Vesamicol-Linker wird an die freien Sulfhydrylgruppen auf dem intakterr Transporter-Molekül gebunden, indem ein fünffacher Molüberschuß des Vesamicol-Linkers mit dem Transporter in Tris-NaCl wie oben beschrieben bei 4ºC im Dunkeln 1 bis 24 Stunden lang vermischt wird. Das Transporter-Vesamicol-Präparat wird dann gegen Tris- NaCl über Nacht dialysiert, um überschüssiges Vesamicol-Linker-Maleimid aus dem Vesamicol-Transporter zu entfernen.
Das Arzneimittel-Transporter-Material steht dann zur Verabreichung als sterile Injektion in einer therapeutisch wirksamen Dosis zur Verfügung.
Der oben beschriebene modifizierte und inaktivierte TeTx-Neurotoxin-Transporter kann verschiedenen klinischen Anwendungen zugeführt werden. Beispielsweise ist zu erwarten, daß diese modifizierten Toxine für die Behandlung neuromuskulärer Störungen, die den spastischen Zustand in allgemeinen Körperbereichen beeinflussen, in Frage kommen. Zu diesen Störungen zählen spasmodische Tortikollis und spastische Zustände infolge von Schlaganfall oder traumatischer Gehirnverletzung.
Beispiel 9 beschreibt, wie der oben beschriebene chemisch modifizierte inaktive TeTx- Transporter als Therapeutikum zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen, die Toxinrezeptoren exprimieren, verwendet werden kann.

Beispiel 9

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: splasmodische Tortikollis (Zervixdystonie)

Eine 45 Jahre alte Frau, die an spasmodischer Tortikollis leidet, die sich in spasmodischen oder tonischen Kontraktionen der Halsmuskulatur manifestiert, wodurch sterotype abnormale Abweichungen des Kopfes, des Kinns (zu einer Seite gerollt) und der Schulter (gehoben zur Seite, auf die der Kopf gedreht wird) entstehen, wird direkt in den betroffenen Muskeln mit therapeutisch wirksamen Dosen eines geeigneten Arzneimittels behandelt (wie es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig ist), das an einen inaktiven Tetanustoxin-Transporter gebunden ist. Nach 3-7 Tagen sind die Symptome deutlich gelindert, d. h. die Patientin kann ihren Kopf und ihre Schulter in einer normalen Position halten, oder es tritt eine erhebliche Schmerzlinderung und Steigerung des Wohlbefindens ein.
Beispiel 10 schildert, wie der oben beschriebene chemisch modifizierte inaktive TeTx- Transporter als Therapeutikum zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen, die Toxinrezeptoren exprimieren, verwendet werden kann.

Beispiel 10

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: durch Schlaganfall oder traumatische Gehirnverletzung induzierte Spastizität

Eine junger, 24 Jahre alter Mann, der an traumatischer Gehirnverletzung leidet, entwickelte in den oberen und unteren Gliedmaßen einen spastischen Zustand, der die Bewegung einschränkt sowie die Rehabilitation und die Körperhygiene beeinträchtigt. Zu den Symptomen zählen schwerer Verschluß der Hand, Einrollen des Handgelenks und Schließen der Beine, sodaß der Patient und der ihn unterstützende Betreuer Schwierigkeiten bei der Körperhygiene haben. Außerdem verhindert die Spastik der Gliedmaßen die physische Rehabilitation und bewirkt Muskelkontraktionen und möglicherweise Gelenksimmobilisierung. Sterile Injektionen therapeutisch wirksamer Dosen eines geeigneten Arzneimittels (von Fachleuten auf dem Gebiet bestimmbar), das an einen inaktiven Tetanustoxin gebunden ist, werden direkt in die betroffenen Muskeln injiziert. Linderung der Symptome trat innerhalb von 7-21 Tagen ein, sodaß die unteren Gliedmaßen ausreichend entspannt waren, damit der Patient und sein Betreuer normale Hygiene durchführen konnten.
Eine 70 Jahre alte Frau, die an zerebralem vaskulärem Schlaganfall leidet, entwickelte Spastizität der unteren Gliedmaßen, aufgrund derer ihre Körperhygiene mit großen Anstrengungen verbunden war. Die Patientin erhielt in beide Gliedmaßen Injektionen therapeutisch wirksamer Dosen eines geeigneten Arzneimittels (von Fachleuten auf dem Gebiet bestimmbar), das an einen inaktiven Tetanustoxin-Transporter gebunden war. Die Injektionen erfolgten direkt in die betroffenen Muskeln. Linderung der Symptome trat innerhalb von 7-21 Tagen ein, sodaß die unteren Gliedmaßen ausreichend entspannt waren, damit die Patientin und ihr Betreuer normale Hygiene durchführen konnten.
Während die obigen Beschreibungen, Resultate und Schlußfolgerungen vor allem die Produktion, Charakterisierung und Verwendung des modifizierten TeTx-Transporters betrafen, wurden parallele Entdeckungen in bezug auf einen modifizierten BoNT/A-Transporter gemacht. Die Arbeiten der Anmelder mit BoNT/A begannen mit dem Subklonieren der L-Kettenprotein-Kodiersequenz.
Ein für die BoNT/A-L-Kette kodierendes DNA-Fragment wurde mittels sense- und antisense-Primern PCR-amplifiziert und an die 5- und 3'-Enden des BoNT/A-L-Kettengens gebunden. Das Amplifizierungsprodukt wurde in den pBluescript II SK&spplus;-Vektor ligiert, um das Plasmid pSAL zu bilden. Wie im folgenden Beispiel geschildert, bestätigte doppelstrangige Plasmidsequenzierung, daß die Nukleotidsequenz des klonierten L-Kettengens mit jener des authentischen BoNT/A-L-Kettengens identisch war.
Beispiel 11 beschreibt die Verfahren zum Klonieren der Polynukleotidsequenz, die für die BoNT/A-L-Kette kloniert.

Beispiel 11

Subklonieren des BoNT/A-L-Kettengens

Die für die BoNT/A-L-Kette kodierende DNA-Sequenz wurde durch ein PCR-Verfahren amplifiziert, in dem synthetische Oligonukleotide mit den Sequenzen 5'-AAAGGCCTT TTGTTAATAAACAA-3' (Seq.-ID Nr. 5) und 5'-GGAATTCTTACTTATTGTATCCTTTA-3' (Seq.-ID Nr. 6) zum Einsatz kamen. Die Verwendung dieser Primer ermöglichte die Einführung von StuI- und EcoRI-Restriktionsstellen in das 5'- bzw. 3-Ende des BoNT/A-L- Ketten-Genfragments. Diese Restriktionsstellen wurden anschließend dazu verwendet, das unidirektionale Subklonieren der Amplifizierungsprodukte zu erleichtern. Zusätzlich führten diese Primer ein Stopcodon am C-Terminus der L-Ketten-Kodiersequenz ein. Chromosomale DNA aus C. botulinum (Stamm 63 A) diente als Templat in der Amplifizierungsreaktion.
Die PCR-Amplifizierung erfolgte in einem 100 ul-Volumen, umfassend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats (dNTP), 50 pMol jedes Primers, 200 ng genomische DNA und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Promega). Das Reaktionsgemisch wurde 35 Zyklen Denaturierung (1 min bei 94ºC), Annelierung (2 min bei 37ºC) und Polymerisation (2 min bei 72ºC) unterzogen. Schließlich wurde die Reaktion weitere 5 min lang bei 72ºC fortgesetzt.
Das PCR-Amplifizierungsprodukt wurde mit StuI und EcoRI gespalten, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und in mit SmaI und EcoRI gespaltenen pBluescript II SK&spplus; ligiert, um das Plasmid pSAL zu ergeben. Dieses Plasmid aufweisende bakterielle Transformanten wurden durch Standardverfahren isoliert. Die Identität des klonierten L-Ketten-Polynukleotids wurde durch doppelstrangige Plasmidsequenzierung mittels SEQUE- NASE (United States Biochemicals) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestätigt. Synthetische Oligonukleotid-Sequenzierprimer wurden bedarfsgemäß hergestellt, um überlappende Sequenzierläufe durchzuführen. Die klonierte Sequenz stellte sich als identisch zur Sequenz von Binz et al., J. Biol. Chem. 265 9153 (1990), und Thompson et al., Eur. J. Biochem. 189, 73 (1990), heraus.
Es wurden auch stellengerichtete Mutanten zur Beeinträchtigung der enzymatischen Aktivität der BoNT/A-L-Kette gebildet.
Beispiel 12 beschreibt das Verfahren zum Konstruieren von Polynukleotiden, die für BoNT/A-L-Kettenmutanten kodieren.

Beispiel 12

Mutagenese des BoNT/A-L-Ketten-Polynukleotids

PCR-vermittelte Mutagenese von BoNT/A Glu²²&sup4; zu Gln oder His²²&sup7; zu Tyr wurde unter Verwendung des klonierten L-Ketten-Polynukleotids als Templat gemäß einer Modifizierung des Verfahrens von Higuchi, PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky und White (Hrsg.), Academic Press, Inc. (1990), durchgeführt. Die sense- und antisense-Oligonukleotidprimer zur Bildung der Gln²²&sup4;-Mutante besaßen die Sequenzen 5'-GCACAT CAACTTATACAT-3' (Seq.-ID Nr. 7) und 5'-ATGTATAAGTTGATGTGC-3' (Seq.-ID Nr. 8). Die sense- und antisense-Oligonukleotidprimer zur Bildung der Tyr²²&sup7;-Mutante wiesen die Sequenzen 5'-AACTTATATATGCTGGAC-3' (Seq.-ID Nr. 9) und 5'-GTCCAG CATATATAAGTT-3' (Seq.-ID Nr. 10). Sekundäre PCR unter Verwendung von Primern mit den Sequenzen Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6 amplifizierten die vollständigen Genmutanten. Das die Gln²²&sup4;-Mutation umfassende amplifizierte Polynukleotid wurde mit StuI und EcoRI gespalten und in den pBluescript II SK&spplus;-Vektor ligiert, der mit SmaI und EcoRI doppelgespalten worden war, um das Plasmid pSAL-Gln²²&sup4; zu ergeben. Das die Tyr²²&sup7;-Mutation umfassende amplifizierte Polynukleotid wurde mit StuI und EcoRI gespalten und in den pBluescript II SK&spplus;-Vektor ligiert, der mit SmaI und EcoRI doppelgespalten worden war, um das Plasmid pSAL-Tyr²²&sup7; zu ergeben.
Polynukleotide, die für rekombinierte L-Ketten kodieren, wurden von ihren jeweiligen Plasmiden abgespalten und in prokaryotische Expressionsvektoren ligiert, um die Produktion von Fusionsproteinen in Bakterien zu erleichtern. Der pMAL-c2-Vektor diente dazu, Expressionsplasmide zu konstruieren, welche die hochwertige Expression von Maltose-Bindefusionsproteinen lenken konnten. Wie aus Beispiel 21 (siehe weiter unten) ersichtlich, wurde der pGEX-2T-Vektor (Pharmacia) in ähnlicher Weise für die Produktion von Glutathion-S-Transferase-(GST-)Fusionsproteinen mit ebenfalls guten Ergebnissen verwendet. Obwohl die Anmelder die GST-Fusionsproteine erzeugten und untersuchten, stellten sie fest, daß Fusionsproteine mit Maltose-Bindedomänen günstigerweise mit besonderer Leichtigkeit gereinigt werden können. Die L-Kettenprotein-Kodiersequenzen in allen hierin beschriebenen Expressionskonstrukten standen unter der Transkriptionskontrolle von vektorgetragenen IPTG-induzierbaren Ptac-Promotoren.
Beispiel 13 beschreibt die Verfahren zur Konstruktion von Plasmiden, welche die Expression der BoNT/A-L-Ketten der Wild- und Mutantenform als Maltose-Bindefusionsproteine in bakteriellen Wirtzellen lenkten.

Beispiel 13

Konstruktion von Plasmiden zur Expression einer rekombinierten BoNT/A-L-Kette

Die BoNT/A-L-Ketten-Polynukleotide der Wild- und Mutantenform, getragen von den pSAL-, pSAL-Gln²²&sup4;- und pSAL-Tyr²²&sup7;-Plasmiden, wurden durch Spaltung mit BamHI und SalI herausgespalten und dann zwischen die BamHI- und der SalI-Stelle des pMAL-c2- Expressionsvektors (New England BioLabs) ligiert, um die Plasmide pCAL, pCAL-Gln²²&sup4; und pCAL-Tyr²²&sup7; zu produzieren. Das pCAL-Plasmid ist schematisch in Fig. 5 dargestellt. Die pCAL-, pCAL-Gln²²&sup4;- und pCAL-Tyr²²&sup7;-Plasmide sind mit Ausname der Mutation einzelner Codons (siehe oben) identisch. Der pMAL-c2-Vektor umfaßt das MalE-Gen, das unter Transkriptionskontrolle des IPTG-induzierbaren Ptac-Promotors für das Maltose- Bindeprotein (MBP) kodiert. Eine multiple Klonierungsstelle (MCS) innerhalb dieses Plasmids ermöglichte das Subklonieren der L-Ketten-Kodiersequenzen am 3-Ende der MaIE-Kodiersequenzen. Vor allem war eine Faktor Xa-Protease-Spaltungssequenz zwischen den MaIE- und L-Kettensequenzen der Fusionsproteine vorhanden. Transformierte E. coli TG1 mit den Expressionsplasmiden wurden durch Standardverfahren isoliert.
Die Struktur der pCAL-, pCAL-Gln²²&sup4; und pCAL-Tyr²²&sup7;-Plasmide wurden durch Restriktionsenzym-Spaltung und Agarosegel-Elektrophorese verifiziert. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß die in diesen Plasmiden vorhandenen Inserts in bezug auf den Translations-Leserahmen des authentischen L-Kettengens korrekt ausgerichtet waren. Die Sequenzanalyse bestätigte ferner, daß die 5'-Enden der L-Kettengene mit den MCS- und Faktor Xa-Spaltstellen über kurze Sequenzen fusioniert waren, die für 7 Aminosäuren kodierten, was den Erwartungen entsprach. Außerdem zeigten die DNA-Sequenzierungsergebnisse, daß die L-Kettensequenzen und die verbundenen MaIE-Sequenzen im gleichen Translations-Leserahmen angeordnet waren.
Aufgrund der Verfügbarkeit bakterieller Klone, die für die rekombinierten L-Ketten kodierende Expressionsplasmide aufwiesen, wurde es möglich, brauchbare Mengen an BoNT/A-L-Kettenproteinen der Wild- und Mutantenform zu erzeugen. Ähnliche Vorgangsweisen wurden für die Produktion und Reinigung von L-Ketten-Fusionsproteinen der Wild- und Mutantenform angewendet. Während das folgende Beispiel die Vorgangsweisen unter Verwendung der Try²²&sup7;-Fusionsproteine der Wild- und Mutantenform darstellt, waren auch identische Verfahren zur Produktion von die Gln²²&sup4;-Mutation aufweisenden Fusionsproteinen möglich.
Beispiel 14 beschreibt die Verfahren zur Verifizierung der Expression der L-Ketten der Wild- und Mutantenform in Bakterien, welche die pCAL- und pCAL-Tyr²²&sup7;-Plasmide umfassen.

Beispiel 14

Expression der BoNT/A-L-Ketten-Fusionsproteine

Gut isolierte Bakterienkolonien, die entweder pCAL oder pCAL-Tyr²²&sup7; umfaßten, dienten zum Impfen von L-Brühe, die 100 ug/ml Ampicillin und 2% (w/v) Glucose enthielt, und wurden über Nacht unter Rühren bei 30ºC vermehrt. Die über Nacht gezüchteten Kulturen wurden 1 : 10 in frische L-Brühe verdünnt, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt, und 2 Stunden lang inkubiert. Die Expression von Fusionsprotein wurde durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert. Nach weiterer vierstündiger Inkubation bei 30ºC wurden Bakterien 10 min lang durch Zentrifugation bei 6.000 · g gesammelt.
Eine in kleinem Maßstab durchgeführte SDS-PAGE-Analyse bestätigte die Gegenwart einer 90 kDa-Proteinbande in Proben von IPTG-induzierten Bakterien. Dieses Mr stimmte mit der vorhergesagten Größe eines Fusionsproteins mit Komponenten von MBP- (~ 40 kDa) und BoNT/A-L-Ketten- (~ 50 kDa) überein. Außerdem enthielten bei einem Vergleich mit aus Vergleichskulturen isolierten Proben die IPTG-induzierten Klone beträchtlich größere Mengen des Fusionsproteins.
Die Gegenwart der gewünschten Fusionsproteine in IPTG-induzierten Bakterien-Extrakten wurde auch durch Western Blotting mittels der polyklonalen Anti-L-Kettensonde bestätigt (siehe Cenci di Bello et al., Eur. J. Biochem. 219, 161 (1993)). Reaktive Banden auf PVDF-Membranen (Pharmacia; Milton Keynes, UK) wurden mit an Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad; Hemel Hempstead, UK) gebundenem Anti-Hasen-lmmunglobulin und dem ECL-Detektionssystem (Amersham, UK) visualisiert. Western Blotting-Ergebnisse bestätigten die Gegenwart des dominanten Fusionsproteins gemeinsam mit mehreren schwachen Banden, die Proteinen mit niedrigerem Mr entsprachen als das Fusionsprotein voller Größe. Diese Beobachtung deutete, an, daß ein begrenzter Abbau des Fusionsproteins in den Bakterien oder während des Isolationsvorgangs erfolgte. Weder die Verwendung von 1 mM noch von 10 mM Benzamidin (Sigma; Poole, UK) während des Isolationsverfahrens eliminierte diesen proteolytischen Abbau.
Die Ausbeute an intaktem Fusionsprotein, das durch das obige Verfahren isoliert wurde, blieb für alle hierin beschriebenen Vorgangsweisen absolut adäquat. Auf der Grundlage von Schätzungen anhand gefärbter SDS-PAGE-Gele lieferten die bakteriellen, IPTG-induzierten Klone insgesamt 5-10 mg an MBP-Wildform- oder -Mutantenform-L-Ketten-Fusionsprotein pro Liter Kultur. Somit war das hierin geoffenbarte Verfahren zur Erzeugung von BoNT/A-L-Ketten-Fusionsproteinen trotz auftretender beschränkter Proteolyse sehr effizient.
Die MBP-L-Ketten-Fusionsproteine, für die die pCAL- und pCAL-Tyr²²&sup7;-Expressionsplasmide kodieren, wurden durch Amylose-Affinitätschromatographie aus Bakterien gereinigt. Rekombinierte L-Ketten der Wildform oder L-Kettenmutanten wuden dann von den Zuckerbindungsdomänen der Fusionsproteine durch stellenspezifische Spaltung mit Faktor Xa getrennt. Dieses Spaltungsverfahren lieferte freies MBP, freie L-Ketten und eine geringe Menge an ungespaltenem Fusionsprotein. Während die in solchen Gemischen vorhandenen L-Ketten erwiesenermaßen die gewünschten Aktivitäten aufwiesen, sahen die Anmelder auch einen zusätzlichen Reinigungsschritt vor. Demzufolge wurde das Gemisch von Spaltprodukten auf eine zweite Amylose-Affinitätssäule aufgebracht, die sowohl das MBP als auch ungespaltenes Fusionsprotein band. Freie L-Ketten wurden auf der Affinitätssäule nicht gehalten und wurden zur Verwendung in den unten beschriebenen Verfahren isoliert.
Beispiel 15 beschreibt das Verfahren zur Produktion und Reinigung von Wildform- und rekombinierten mutierten Tyr²²&sup7;-BoNT/A-Leichtketten aus bakteriellen Klonen.

Beispiel 15

Reinigung von Fusionsproteinen und Isolierung rekombinierter BoNT/A-L-Ketten

Pellets aus 1 I-Kulturen von Bakterien, die entweder BoNT/A-L-Kettenproteine der Wildform oder Mutanten davon exprimierten, wurden in Säulenpuffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EGTA und 1 mM DTT], umfassend 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Benzamidin, resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Die Lysate wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 15.000 · g und 4ºC geklärt. Überstände wurden auf eine Amylose-Affinitätssäule [2 · 10 cm, 30 ml Harz] (New England BioLabs; Hitchin, UK) aufgebracht. Ungebundene Proteine wurden mit Säulenpuffer aus dem Harz gewaschen, bis das Eluat proteinfrei war (bestimmt durch stabile Absorptionsablesung bei 280 nm). Das gebundene MBP-L-Ketten-Fusionsprotein wurde anschließend mit 10 mM Maltose enthaltenden Säulenpuffer eluiert. Das Fusionsprotein enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), ergänzt mit 150 mM NaCl, 2 mM CaCl&sub2; und 1 mM DTT, 72 Stunden lang bei 4ºC dialysiert.
Fusionsproteine wurden mit Faktor Xa (Promega; Southampton, UK) in einem Enzym- Substrat-Verhältnis von 1 : 100 gespalten, während die Dialyse gegen einen Puffer von 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), ergänzt mit 150 mM NaCl, 2 mM Cacl&sub2; und 1 mM DTT, erfolgte, Die Dialyse wurde bei 4ºC 24 h lang fortgesetzt. Das Gemisch von MBP und L-Kette der Wildform oder L-Kettenmutante, das sich aus dem Spaltschritt ergab, wurde auf eine 10 ml-Amylosesäule aufgebracht, die mit Säulenpuffer äquilibriert war. Aliquote der Durchflußfraktionen wurden für die SDS-PAGE-Analyse gebildet, um Proben zu identifizieren, welche die L-Ketten enthielten. Die übrigen Teile der Durchflußfraktionen wurden bei -20ºC gelagert. E. coli-Vollextrakt oder die gereinigten Proteine wurden in SDS- Probenpuffer solubilisiert und gemäß Standardverfahren PAGE unterzogen. Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, daß das rekombinierte Toxinfragment etwa 90% des Proteingehalts der Probe ausmachte.
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß das Verfahren zur Konstruktion der hierin beschriebenen MBP-L-Ketten-Fusionsproteine zur effizienten Produktion rekombinierter BoNT/A- L-Ketten der Wild- und Mutantenform herangezogen werden könnte. Außerdem bewiesen die Ergebnisse der Anmelder, daß rekombinierte L-Ketten von den Maltose-Bindedomänen der Fusionsproteine getrennt und danach gereinigt werden könnten. Während diese Ergebnisse direkt bestimmte Struktureigenschaften der rekombinierten L-Ketten betrafen, blieben die funktionellen Eigenschaften dieser Proteine unbestimmt. Somit untersuchten die Anmelder die enzymatischen Eigenschaften rekombinierter L-Kettenmutanten und rekombinierter L-Ketten der Wildform.
Ein sensitiver Assay auf Antikörperbasis wurde entwickelt, um die enzymatischen Aktivitäten rekombinierter L-Kettenprodukte mit ihrem nativen Gegenstück zu vergleichen. Der Assay verwendete einen Antikörper mit Spezifität für den intakten C-terminalen Bereich von SNAP-25 (entsprach der BoNT/A-Spaltstelle). Western Blotting der Reaktionsprodukte von BoNT/A-Spaltung von SNAP-25 zeigte eine Unfähigkeit des Antikörpers, SNAP-25-Subfragmente zu binden. Somit detektierte das im folgenden Beispiel verwendete Antikörperreagens nur intaktes SNAP-25. Der Verlust an Antikörperbindung diente als Indikator von SNAP-25-Proteolyse, die durch zugegebene BoNT/A-Leichtkette oder rekombinierte Derivate davon vermittelt wird.
Beispiel 16 beschreibt das Verfahren, das aufzeigen soll, daß native und rekombinierte BoNT/A-L-Ketten, jedoch nicht die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutanten, ein SNAP-25-Substrat proteolysieren können. Obwohl die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante in diesem Beispiel verwendet wurde, lieferte die Gln²²&sup4;-L-Kettenmutante im SNAP-25-Spaltungsassay identische Ergebnisse.

Beispiel 16

Evaluierung der proteolytischen Aktivität rekombinierter L-Ketten gegenüber einem SNAP-25-Substrat

Ein quantitativer Assay diente dazu, die Fähigkeiten der BoNT/A-L-Ketten der Wildform und ihrer Mutanten sowie ihrer rekombinierten Analoge, ein SNAP-25-Substrat zu spalten, zu vergleichen. Das für diesen Assay verwendete Substrat wurde durch Herstellung eines Glutathion-S-Transferase-(GST-)SNAP-25-Fusionsproteins, das eine Spaltstelle für Thrombin aufweist, erhalten, unter Verwendung des pGES-2T-Vektors exprimiert und durch Affinitätschromatographie auf Glutathion-Agarose gereinigt. Das SNAP-25 wurde dann unter Verwendung von Thrombin in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), umfassend 150 mM NaCl und 2,5 mM CaCl&sub2; (Smith et al., Gene 67, 31 (1988)), bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1 : 100 aus dem Fusionsprotein gespalten. Ungespaltenes Fusionsprotein und die gespaltene Glutathion-Bindedomäne banden sich an das Gel. Das rekombinierte SNAP-25-Protein wurde mit dem letzteren Puffer eluiert und 24 h lang bei 4ºC gegen 100 mM HEPES (pH 7,5) dialysiert. Die Protein-Gesamtkonzentration wurde durch Routineverfahren bestimmt.
Polyklonale Hasen-Antikörper, die für den C-terminalen Bereich von SNAP-25 spezifisch sind, wurden gegen ein synthetisches Peptid gebildet, das die Aminosäuresequenz CANQRATKMLGSG (Seq.-ID Nr. 11) aufwies. Dieses Peptid entsprach den Resten 195 bis 206 des synaptischen Plasma-Membranproteins und einem N-terminalen Cysteinrest, der in nativem SNAP-25 nicht vorkommt. Das synthetische Peptid wurde an Rinder-Serumalbumin (BSA) (Sigma; Poole, UK) mittels Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) als Vernetzer (Sigma; Poole, UK) gebunden, um die Antigenität zu verbessern (Liu et al., Biochemistry 18, 690 (1979)). Affinitätsreinigung der Antipeptid-Antikörper erfolgte unter Verwendung einer Säule, deren antigenes Peptid über seinen N-terminalen Cysteinrest an ein Aminoalkylagarose-Harz (Bio-Rad; Hemel Hempstead, UK) gebunden war, aktiviert mit Iodessigsäure mittels des Vernetzers Ethyl-(3-dimethylpropyl)carbodiimid. Nach nacheinander erfolgenden Waschungen der Säule mit einem Puf fer, der 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 150 mM NaCl enthielt, wurden die peptidspezifischen Antikörper unter Verwendung einer Lösung von 100 mM Glycin (pH 2,5) und 200 mM NaCl eluiert und in Röhren gesammelt, die 0,2 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) Neutralisierungspuffer enthielten.
Alle rekombinierten Präparate, die L-Kettenmutante oder L-Kette der Wildform enthielten, wurden über Nacht bei 4ºC in 100 mM HEPES (pH 7,5), umfassend 0,02% Lubrol und 10 uM Zinkacetat, dialysiert, bevor ihre enzymatischen Aktivitäten ermittelt wurden. BoNT/A, zuvor mit 20 mM DTT 30 min lang bei 37ºC reduziert, sowie diese dialysierten Proben wurden dann auf verschiedene Konzentrationen im obigen HEPES-Puffer, ergänzt mit 1 mM DTT, verdünnt.
Die Reaktionsgemische enthielten 5 ul rekombiniertes SNAP-25-Substrat (8,5 uM Endkonzentration) und entweder 20 ul reduzierte BoNT/A, rekombinierte L-Kette der Wildform oder Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante. Alle Proben wurden 1 h lang bei 37ºC inkubiert, bevor die Reaktionen mit 25 ul wäßriger 2% Trifluoressigsäure (TFA) und 5 mM EDTA gequencht wurden (Foran et al., Biochemistry 33, 15365 (1994)). Aliquote jeder Probe wurden für SDS-PAGE und Western Blotting mit dem polyklonalen SNAP-25-Antikörper durch Zugabe von SDS-PAGE-Probepuffer und Aufkochen gebildet.
Die in Fig. 6 grafisch dargestellten Western Blotting-Ergebnisse zeigten klare Unterschiede zwischen den proteolytischen Aktivitäten der gereinigten L-Kettenmutante und entweder nativer oder rekombinierter BoNT/A-L-Kette der Wildform. Konkret spaltete die rekombinierte L-Kette der Wildform das SNAP-25-Substrat, obwohl dies etwas weniger wirksam erfolgte als mit der reduzierten nativen BoNT/A-L-Kette, die im Verfahren als positiver Vergleich diente. Im Gegensatz dazu wies die Tyr²²&sup7;-Mutante im wesentlichen keine proteolytische Aktvität im Assay auf. Eine enzymatisch aktive Form der BoNT/A-L- Kette wurde mittels Rekombination produziert und nachfolgend isoliert. Außerdem beeinträchtigte die Substitution einer einzelnen Aminosäure im L-Kettenprotein die Fähigkeit des rekombinierten Proteins, das synaptische terminale Protein abzubauen. Wie weiter unten geoffenbart, entdeckten die Anmelder, daß der gleiche Effekt durch Mutieren mehr als einer Aminosäureposition innerhalb des Clostridium-Toxins erzielt werden kann.
Als Vorversuch der biologischen Aktivität der rekombinierten BoNT/A-L-Kette der Wildform wurde die Fähigkeit des MBP-L-Ketten-Fusionsproteins untersucht, die durch Ca²&spplus; hervorgerufene Catecholamin-Freisetzung aus mit Digotinin permeabilisierten Rinder- Adrenochromaffin-Zellen zu verringern. Dementsprechend induzierte rekombiniertes L- Ketten-Fusionsprotein der Wildform (entweder intakt oder mit Faktor Xa gespalten, um ein Gemisch zu erzeugen, das freies MBP und rekombinierte L-Kette enthielt) eine dosisabhängige Hemmung von Ca²&spplus;-stimulierter Freisetzung, die der Hemmung durch natives NoNT/A entsprach.
Beispiel 17 beschreibt die Verfahren zur Beurteilung der Fähigkeit des BoNT/A-Fusionsproteins, die Catecholamin-Freisetzung aus Chromaffin-Zellen zu hemmen.

Beispiel 17

Bestimmung der Fähigkeit von rekombiniertem L-Ketten-Fusionsprotein, die Catecholamin-Freisetzung aus permeabilisierten Chromaffin-Zellen zu hemmen

Chromaffin-Zellen wurden aus Rinder-Nebennierendrüsen durch Protease-Perfusion unter Anwendung des Verfahrens von Livett, Physiol. Rev. 64, 1103 (1984), hergestellt: Die Zellen wurden mit 1 · 10&sup6; Zellen/Napf in 24-Napf-Platten in modifiziertem Dulbecco's Eagle's-Medium, ergänzt mit 10% Kalbsfötenserum, 8 uM Fluorodoxyurin, 50 ug/ml Gentamicin, 10 uM Cytosinarabinofuranosid, 2,5 ug/ml Gungizon, 25 IU/ml Penicillin, 25 ug/ml Streptomcycin und 2 mM Glutamin, aufplattiert. Die Experimente erfolgten 3-8 Tage nach dem Plattieren. Durch Ca²&spplus; hervorgerufene Catecholamin-Freisetzung wurde fluorimetrisch gemessen.
Die in Fig. 7 veranschaulichten Ergebnisse des Vorversuchs zeigten, daß sowohl das rekombinierte BoNT/A-L-Ketten-Fusionsprotein der Wildform und ein Gemisch, das die Faktor Xa-Spaltprodukte der rekombinierten L-Kette der Wildform enthielt, günstigerweise biologische Eigenschaften aufwies, die jenen des nativen BoNT/A-Toxins ähnelten. Es war dann von Interesse, die Frage zu untersuchen, ob L-Kettenmutanten wie gewünscht diese Eigenschaften nicht aufwiesen.
Angesichts der Tatsache, daß eine Einzelpunktmutation die proteolytische Aktivität rekombinierter L-Ketten eliminieren konnte, rekonstituierten die Anmelder Doppelkettenmoleküle mit L-Kettenmutanten als Mittel zur Schaffung inaktiver BoNT/A-Neurotoxine. Gereinigte rekombinierte Wildform- und Mutantenform-Tyr²²&sup7;-L-Ketten wurden in Abwesenheit der Zuckerbindungsdomänen der Stamm-Fusionsproteine mit nativer, aus BoNT/A isolierer H-Kette rekonstituiert. Die Bildung des mit Disulfid verbundenen Doppelkettentoxins mit 150 kDa wurde durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestätigt. Die quantitative Analyse zeigte, daß die rekombinierten L-Ketten mit der nativen H-Kette weniger wirksam reassoziierten, um Doppelketten zu bilden, als das native L-Kettenprotein. Diese Differenz kann eine Divergenz zwischen den gefalteten Strukturen der rekombinierten und nativen Proteine widerspiegeln.
Beispiel 18 beschreibt das Verfahren zur Reassoziierung von Doppelkettentoxinen mit H- und L-Ketten. Doppelketten, die entweder native L-Ketten, rekombinierte L-Ketten der Wildform- oder BoNT/A-L-Kettenmutanten enthielten, wurden durch dieses Verfahren reassoziiert. Es wird zwar in diesem Beispiel die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante verwendet, doch ist es für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß andere L-Kettenmutanten nach dem gleichen Verfahren mit nativen H-Ketten assoziiert werden können.

Beispiel 18

Rekonstitution nativer L-Kette, rekombinierter L-Kette der Wildform oder Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante mit gereinigter H-Kette

Native H- und L-Ketten wurden von BoNT/A (List Biologicals Inc.; Campbell, USA) mit 2 M Harnstoff dissoziiert, mit 100 mM DTT reduziert und dann gemäß bekannten chromatographischen Verfahren gereinigt (Kozaki et al., Japan J. Med. Sci. Biol. 34, 61 (1981); Maisey et al., Eur. J. Biochem. 177, 683 (1988)). Gereinigte H-Kette wurde mit einer äquimolekularen Menge von nativer L-Kette, rekombinierter L-Kette der Wildform oder der Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante kombiniert. Rekonstitution erfolgte durch Dialyse der Proben gegen einen Puffer, der aus 25 mM Tris (pH 8,0), 50 pM Zinkacetat und 150 mM NaCl bestand, über einen Zeitraum von 4 Tagen bei 4ºC. Nach der Dialyse wurde die Assoziation der rekombinierten L-Kette und nativen H-Kette zur Bildung von über Disulfid verbundenen 150 kDa-Doppelketten durch SDS-PAGE überwacht und durch Densitometer-Scanning quantifiziert. Der Anteil an Doppelkettenmolekülen, die mit den rekombinierten L-Ketten gebildet wurden, war niedriger als jener, der bei Verwendung nativer L-Kette erhalten wurde. Nur etwa 30% der rekombinierten L-Kette der Wildform oder der L-Kettenmutante waren rekonstituiert, während > 90% der nativen L-Kette mit der H-Kette reassoziierten. Trotz dieser geringeren Wirksamkeit der Rekonstitution wurde ohne Probleme ausreichend Material, das die rekombinierten L-Ketten enthielt, zur späteren Verwendung in funktionellen Studien produziert.
Doppelkettenmoleküle mit L-Kettenmutanten besaßen - wie in physiologischen in vitro- Assays festgestellt - neuartige Eigenschaften im Vergleich zu rekonstituierten Doppelketten mit nativen L-Ketten oder rekombinierten L-Ketten der Wildform. Nach der Dialyse wurde das im vorhergehenden Beispiel beschriebene rekonstituierte Material auf die in Medium eingelegten, exzidierten Mäuse-Phrenikus-Hemidiaphragmen verwendet. Wie nachstehend geoffenbart, konnten Doppelketten, die entweder mit nativer L-Kette oder rekombinierter L-Kette der Wildform rekonstituiert waren, neuromuskuläre Übertragung im Assay wirksam blockieren. Im Gegensatz dazu waren die mit der L-Kettenmutante rekonstituierten Doppelkettenmoleküle vollkommen inaktiv.
Beispiel 19 beschreibt das Verfahren, das dazu dient, modifizierte funktionelle Eigenschaften rekonstituierter Doppelkettentoxine aufzuzeigen, die rekombinierte L-Ketten umfassen.

Beispiel 19

Bestimmung der Wirkung rekonstituierter Toxine auf die neuromuskuläre Übertragung

Mäuse-Phrenikus-Hemidiaphragmen wurden aus Balb/C-Mäusen (20-25 g) exzidiert und in einem Superfusionssystem mit geschlossenem Kreislauf gebadet, das 10 ml belüftete Krebs-Ringer-Lösung enthielt und aus folgendem bestand (mM): NaCl, 118,0; KCl, 4,7; MgSO&sub4;, 1,2; CaCl&sub2;, 2,5; NaHCO&sub3;, 23,8; KH&sub2;PO&sub4;, 1,2; Glucose, 11,7, pH 7,4 (de Paiva et al., J. Biol. Chem. 268, 20838 (1993)). Muskelzucken wurden durch supramaximale Stimulation des Phrenikus hervorgerufen und mittels eines Kraftverlagerungs-Meßwandlers gemessen (Simpson, J. Pharmacol. Exp. Ther. 212, 16 (1980)).
Die in Fig. 8 gezeigten Ergebnisse deuten an, daß ein unter Verwendung der rekombinierten L-Kette der Wildform rekonstituiertes Doppelkettentoxin neuromuskuläre Übertragung fast so wirksam blockierte wie eine Doppelkette, die unter Verwendung nativer L-Ketten rekonstituiert worden war. Die Blockade der Übertragung durch diese rekonstituierten Proteine kehrte sich bei Einsatz von 0,3 mM 4-Aminopyridin um; dies ist ein Blocker von spannungsgesteuerten K&spplus;-Kanälen, der die nerveninduzierte Muskelspannung an mit BoNT/A vergifteten Synapsen vorübergehend wiederherstellt (Simpson, J. Pharmacol. Exp. Ther. 245, 867 (1988)). Diese Feststellung bewies, daß die Hemmung durch die Probe mit rekombinierter L-Kette das Ergebnis einer präsynaptischen Blockade der Transmitter-Freisetzung war. Somit konnte das Doppelkettentoxin mit der rekombinierten L-Kette der Wildform in diesem Assay die Aktivität von BoNT/A imitieren. Im Gegensatz dazu übte das die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante enthaltende Doppelkettenmaterial keinen Einfluß auf nerveninduziertes Muskelzucken aus, selbst wenn der Test bei hohen Konzentrationen erfolgte. Dieses Fehlen an Aktivität, das ein Doppelkettenmolekül charakterisierte, das eine L-Kettenmutante enthielt, stimmte vollkommen mit den Ergebnissen des oben präsentierten SNAP-25-Spaltungsassays überein. Vor allem erweitern die im Nerven-Hemidiaphragma-Assay erhaltenen Ergebnisse den Verlust von Aktivität auf ein klinisch relevantes Modell an der Wirkungsstelle des Toxins.
Um die Eigenschaften von Doppelkettenmolekülen, die rekombinierte L-Ketten umfassen, weiter zu veranschaulichen, wurde ein Experiment durchgeführt, um die Fähigkeit dieser Mittel, Botulismus-Symptome bei Mäusen hervorzurufen, zu testen.
Beispiel 20 beschreibt die Verfahren, die beweisen sollen, daß rekonstituierte Doppelketten mit nativen oder rekombinierten L-Ketten der Wildform, jedoch ohne L-Kettenmutanten in vivo neurotoxische Aktivität aufweisen.

Beispiel 20

Beurteilung der Mäuse-Letalität rekonstituierter Toxine und ihre Wirkung auf die neuromuskuläre Übertragung

Die Fähigkeit der rekonstituierten Doppelketten, Botulismus hervorzurufen, wurde nach intraperitonealer Injektion von Labormäusen untersucht. Die Ergebnisse wurden als Anzahl Dosen, die innerhalb von 4 Tagen letal wirkten, pro mg Protein ausgedrückt (LD&sub5;&sub0;/mg) (Maisey et al., Eur. J. Biochem. 177, 683 (1988)).
Die Toxizität des Doppelkettenmaterials, das die rekombinierte L-Kette der Wildform enthielt (LD&sub5;&sub0;/mg 6 · 10&sup7;) war mit jener der Doppelkette vergleichbar, die unter Verwendung nativer L-Ketten rekonstituiert worden war (LD&sub5;&sub0;/mg 7 · 10&sup7;). Mäuse, denen jene Doppelkette injiziert wurde, die mittels der Tyr²²&sup7;-Mutante rekonstituiert worden war, zeigten innerhalb von 4 Tagen keine Anzeichen von Botulismus. Daher ist in allen hierin geoffenbarten in vitro- und in vivo-Assays die in E. coli exprimierte rekombinierte L-Kette der Wildform mit der Wirksamkeit ihres nativen Gegenstücks vergleichbar, während die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante keine Aktivität zeigte.
Um die allgemeine Nützlichkeit rekombinierter BoNT/A-L-Ketten aufzuzeigen, die gemäß den hierin geoffenbarten Verfahren erzeugt werden, produzierten die Anmelder eine zweite Gruppe von Fusionsprotein-Mutanten, die keine proteoiytische Aktivität besaßen. Genauer gesagt veranschaulichten die Anmelder, daß die Mutagenese von Glu²²&sup4; zu Gln enzymatische Aktivität, die mit der BoNT/A-L-Kette der Wildform assoziiert ist, eliminieren konnte. Durch Verwendung eines GST-Fusionsproteins in dieser Demonstration bestätigten die Anmelder überdies den allgemeinen Nutzen dieser Vorgangsweise bei der Herstellung rekombinierter BoNT/A-L-Ketten.
Beispiel 21 beschreibt die Verfahren zum Konstruieren eines Polynukleotids, das für eine mutierte Gln²²&sup4;-BoNT/A-L-Kettenfusion mit dem GST-Protein kodiert.

Beispiel 21

Herstellung und Expression von BoNT/A-L-Kettenfusionen mit GST

Polynukleotide, die für die BoNT/A-Kette der Wildform, die Gln²²&sup4;-Kettenmutante und die Tyr²²&sup7;-L-Kettenmutante kodieren, wurden genauso wie in Beispiel 11 und Beispiel 12 hergestellt. Die Amplifizierungsprodukte wurden mit StuI und EcoRI gespalten, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und zwischen der SmaI- und der EcoRI-Stelle des pGEX-2T-Expressionsvektors (Pharmacia) ligiert, um die Plasmide pTAL-Wildform (GST), pTAL-Gln²²&sup4; (GST) und pTAL-Tyr²²&sup7; (GST) zu produzieren. E. coli XL-1-Blue-Transformanten, welche die Plasmide umfaßten, wurden durch herkömmliche Verfahren isoliert.
Kulturen von E. coli, welche die Expressionskonstrukte enthielten, wurden dazu gebracht, die kodierten Fusionsproteine genauso wie in Beispiel 14 zu exprimieren. Nach der Lyse der Zellen wurden die GST-Fusionsproteine durch Glutathion-Affinitätschroma tographie gemäß auf dem Gebiet herkömmlicher Verfahren gereinigt. Die GST-Fusionsproteine wurden anschließend in einem in vitro-Assay auf proteolytische Aktivität getestet.
Beispiel 22 beschreibt die Verfahren zur Bewertung der proteolytischen Aktivität der mutierten BoNT/A-L-Ketten-GST-Fusionsproteine.

Beispiel 22

Charakterisierung der BoNT/A-L-Ketten-GST-Fusionen

Es wurde die proteolytische Aktivität des isolierten mutierten GST-L-Ketten-Fusionsproteins gegenüber einem SNAP-25-Substrat untersucht. Nach der Inkubation der gereinigten mutierten L-Ketten-Fusionsproteine und eines rekombinierten GST-SNAP-25-Substrats in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 2 Stunden lang oder bei 22ºC über Nacht wurden die Produkte durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse der Analyse zeigten, daß die Mutante keine nachweisbare proteolytische Aktivität gegenüber dem SNAP-25-Analog aufwies. Im Gegensatz dazu proteolysierte das rekombinierte L-Ketten-Fusionsprotein der Wildform das Substrat. Somit war das mutierte GST-BoNT/A-L-Ketten-Fusionsprotein wie das mutierte MBP-Fusionsprotein enzymatisch inaktiv. Ferner war das GST-Fusionsprotein mit BoNT/A-L-Kettensequenzen der Wildform gegenüber dem SNAP-25-Substrat enzymatisch aktiv.
Diese Ergebnisse bestätigten die Bedeutung der Aminosäuren, aus denen das konservierte HexxH-Motiv der BoNT/A-L-Kette besteht, und zeigten, daß andere Fusionsproteine als MBP-Fusionsproteine dazu dienen können, rekombinierte Proteine zu produzieren, die sich für die Praxis der Erfindung eignen. Ob als GST-Fusionsprotein oder als MBP- Fusionsprotein ausgebildet- rekombinierte BoNT/A-L-Kettenmutanten besaßen keine der Aktivitäten, die das native Toxin charakterisieren oder rekonstituierte Doppelketten, die rekombinierte L-Ketten der Wildform umfassen.
Die obigen Beispiele zeigten, wie Clostridium L-Ketten zur Expression in rekombinierter Form als aktive oder entschärfte Moleküle konstruiert werden können. Diese L-Ketten wurden mit nativen H-Ketten rekonstituiert, um Doppelkettenmoleküle zu bilden, die biologische Aktvität auf der Ebene neuromuskulärer Übertragung besitzen oder nicht besitzen. Das folgende Beispiel liefert schlüssige Beweise, daß Doppelketten-Transportermoleküle als Vehikel zur intrazellulären Beförderung gebundener Moleküle verwendet werden können.
Ein "Dreifachketten"-Hybridmolekül wurde zum Zweck dieser exemplarischen Demonstration hergestellt. Genauer gesagt wurde eine BoNT/A-L-Kette, die mittels einer Gln²²&sup4;/ Tyr²²&sup7;-Doppelmutation inaktiviert wurde, mit einem aktiven Abschnitt der TeTx-L-Kette fusioniert. Das resultierende rekombinierte Protein wurde mit der nativen BoNT/A-H- Kette rekonstituiert, um eine "Dreifachkette" zu produzieren. Dieser Drei kettenkomplex konnte sich an Zielneuronen binden und in diese eindringen. Da die BoNT/A-L-Ketten- Doppelmutante keine enzymatische Aktivität besaß, war die mit der Dreifachkette assoziierte Neurotoxizität notwendigerweise auf die Gegenwart einer aktiven TeTx-Komponente zurückzuführen. Die im folgenden Beispiel präsentierten Ergebnisse bestätigten, daß der Transporter von Zielzellen internalisiert werden und ein gebundenes Molekül in das Cytosol befördern konnte und daß das transportierte Protein intrazellulär aktiv war. Wie nachstehend geoffenbart, schloß ein biochemischer Test jede neurotoxische Aktivität in Zusammenhang mit der BoNT/A-L-Kette aus.
Beispiel 23 beschreibt ein Verfahren, das beweisen soll, daß Transporter mit inaktiven Clostridium L-Ketten in peripheren cholinergischen Nervenenden internalisiert werden können. Ferner zeigten die nachstehend dargelegten Ergebnisse, daß solche Transporter in einem Zustand, der biologische Aktivität intrazellulär beibehält, ein gebundenes Molekül in das Cytosol von Zielneuronen befördern können.

Beispiel 23

Clostridium-Toxintransporter als Vehikel für biochemische Beförderung

Die L-Kettenkomponente der Dreifachkette wurde gemäß dem in aus Fig. 9 ersichtlichen Schema produziert. Eine Doppelmutation (Glu²²&sup4; zu Gln²²&sup4; und His²²&sup7; zu Tyr²²&sup7;) wurde durch PCR-Mutagenese in die BoNT/A-L-Kette eingeführt. Die Primer und Verfahren zur Erzeugung der Doppelmutante waren die gleichen wie bei der Bildung der Tyr²²&sup7;-Mutante, außer daß die Gln²²&sup4;-Mutante als Templat verwendet wurde. Die L-Ketten-Doppelmutante (dm) wurde zuerst in pBluescript SK&spplus; II kloniert, um pSALdm zu bilden, und danach in pMAL-c2 kloniert, um pCALdm zu ergeben. Das pCALdm-Konstrukt diente dazu, das Fusionsprotein mit einer Maltose-Bindedomäne und einer BoNT/A-L- Kettendomäne, die eine Doppelmutation (MBP-BoNT/A dm) trägt, zu exprimieren. Das pCALdm-Konstrukt ist in Fig. 9 als "1" bezeichnet. Die TeTx-L-Kette wurde gemäß einer PCR-Arbeitsvorschrift unter Verwendung eines Polynukleotids mit der klonierten Gensequenz der Wildform als Templat gemeinsam mit Primern mit den Sequenzen 5'-ATT TCACCAATAACCATAAATAATTTTAG-3' (Seq.-ID Nr. 12) und 5'-CGGGATCCTTCTGTA TCATTGTAAAT-3' (Seq.-ID Nr. 13) verkürzt. Das Amplifizierungsprodukt kodierte für zwei zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus und war an Gly³&sup9;&sup9; verkürzt. Die letzten 58 Reste einschließlich von Cys&sup4;³&sup9;, das normalerweise für Disulfidbindung an die H- Kette in nativem TeTx verantwortlich ist, wurden deletiert. Nach der Spaltung mit BamHI wurde das resultierende DNA-Fragment in mit XmnI und BamHI gespaltenes pMAL-c2 kloniert, um pCTL399 zu erzeugen. Die MBP-verkürzte TeTx-L-Ketten-BoNT/Al-L-Ketten-dm-Genfusion pCTLALdm wurde durch Ligieren des herausgespaltenen BoNT/A-L-Ketten-dm-Gens an das mit BamHI und SalI gespaltene pCTL399 hergestellt. Das in Fig. 9 als "2" bezeichnete pCTLALdm-Konstrukt diente zum Exprimieren des MBP-verkürzte TeTx-L-Ketten-BoNT/A-L-Ketten-dm-Fusionsproteins in E. coli.
Gereinigtes MBP-BoNT/A dm von L-Ketten-Fusionsprotein, für das das pCALdm-Konstrukt kodierte, konnte kein rekombiniertes SNAP-25-Substrat in einem Assay spalten, der gemäß dem Verfahren von Beispiel 16 durchgeführt wurde. Somit besaß das BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutanten-Fusionsprotein wie erwartet keine enzymatische Aktivität. Nach der Spaltung des Fusionsproteins mit Faktor Xa wurden gereinigte BoNT/A- L-Ketten-Doppelmutanten mit nativen BoNT/A-H-Ketten rekonstituiert, um Doppelkettenmoleküle zu bilden. Diese Doppelketten konnten neuromuskuläre Übertragung an Mäuse-Hemidiaphragma nicht blockieren (untersucht nach dem Verfahren aus Beispiel 19). Somit besaß die Doppelkette, welche die BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutante umfaßte, in diesem in vitro-Assay ebenfalls erwartungsgemäß keine biologische Aktivität. Schließlich war die rekonstituierte Doppelkette, welche die BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutante umfaßte, nicht-toxisch, wenn sie gemäß dem Verfahren von Beispiel 20 in Mäuse injiziert wurde. Dies galt selbst dann, wenn die Doppelkette, welche die BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutante aufwies, in einer Menge injiziert wurde, die um das 200-fache größer war als die LD&sub5;&sub0;-Dosis von nativem BoNT/A.
Diese Ergebnisse zeigten, daß die Gln²²&sup4;/Tyr²²&sup7;-Doppelmutation alle toxischen Eigenschaften eliminiert, die mit dem nativen BoNT/A-Molekül verbunden sind. Jegliche toxische Aktivität in Zusammenhang mit einem Transporter, der die L-Ketten-Doppelmutante umfaßt, muß demzufolge auf ein Molekül zurückzuführen sein, das mit der inaktiven BoNT/A-L-Kette verbunden ist, da der Transporter selbst keine toxische Aktivität besaß. Daher stellte die rekonstituierte Doppelkette, welche die BoNT/A-L-Ketten-Doppelmutante umfaßte, einen idealen cholinergischen Transporter dar.
Das gereinigte TeTx-verkürzte L-Ketten-BoNT/A-L-Ketten-dm-Fusionsprotein, für das pCTLALdm kodiert, wies Aktivitäten auf, die für TeTx, jedoch nicht für BoNT/A charakteristisch sind. Genauer gesagt wies das von pCTLALdm kodierte Fusionsprotein die Fähigkeit auf, Synaptobrevin von neuronalen Membranen in einer konzentrationsabhängigen Weise abzuspalten. Diese Aktivität wurde durch die BoNT/A-L-Ketten-Komponente des Komplexes nicht beeinflußt und unterstrich die Bewahrung der Endoprotease-Aktivität durch die verkürzte TeTx-L-Kettenkomponente der Fusion. Wie erwartet, mangelte es dem von pCTLALdm kodierten Fusionsprotein an der Fähigkeit, ein rekombiniertes SNAP-25-Substrat zu spalten. Dies bestätigte die erfolgreiche Eliminierung enzymati scher Aktivität, die mit der BoNT/A-L-Kettenkomponente der Fusion assoziiert ist. Nach der Spaltung des von pCTLALdm kodierten Fusionsproteins mit Faktor Xa wurde das freigesetzte Toxinhybrid mit nativer BoNT/A-H-Kette rekonstituiert, um die Dreifachkette zu ergeben.
Interessanterweise führt die Herstellung der Dreifachkette sowohl in vitro als auch in vivo zu Symptomen, die für Botulismus charakteristisch sind. Die Dreifachkette blockierte in einer Konzentration von 2 nM durch Nerven hervorgerufenes Muskelzucken von Mäuse-Hemidiaphragmen in 161 min bei 24ºC und lieferte eine Mäuse-Toxizität von > 10&sup7; LD&sub5;&sub0;/mg. Man beachte, daß es jedoch nicht möglich war, exakte quantitative Daten über die Wirksamkeit dieses Proteins zu liefern; Grund dafür war die Gegenwart von freiem MBP, ungespaltenem Fusionsprotein und etwas nativer H-Kette in den rekonstituierten Proben, die eine präzise Messung der Menge der vorhandenen Dreifachkette ausschließen. Die mit der Dreifachkette im Hemidiaphragma-Assay beobachtete Blockade wurde durch 4-Aminopyridin, einen spannungsgesteuerten K&spplus; -Kanalblocker, der BoNT/A, jedoch nicht die durch TeTx hervorgerufene Hemmung neuromuskulärer Übertragung umkehrt. Außerdem wurde ein Einfluß der H-Kette (oder von kontaminierendem nativem BoNT/A) auf die beobachtete Toxizität durch die beobachtete Abwesenheit neuromuskulärer paralytischer Aktivität bei größeren Mengen der H-Kette ausgeschlossen, die in der Rekonstitution verwendet und in identischer Weise wie das Dreifachkettenmaterial behandelt wurde.
Diese Ergebnisse bewiesen, daß der Transporter auf motorische Nervenenden abzielt, internalisiert wird und als Vehikel zum Transport des verbundenen Segments der TeTx- L-Kette zum Cytosol dienen kann. Ferner behielt das verbundene Segment der TeTx-L- Kette seine biologische Aktivität nach der Beförderung in cholinergische Nerven bei. Der Nutzen dieses neuartigen Transporters als Arzneimittel-Beförderungssystem für acetylcholin-hältige Neuronen wurde klar gezeigt.
Neben der im vorhergehenden Beispiel beschriebenen L-Ketten-Modifikationsstrategie können native oder rekombinierte Botulinumtoxin-L-Kettenproteine gemäß dem Verfahren aus Beispiel 8 kovalent an eine chemische Verbindung gebunden werden. Der resultierende Transporter steht dann zur Verabreichung als sterile Injektion in einer therapeutisch wirksamen Dosis zur Verfügung.
Die oben beschriebenen modifizierten BoNT/A-Toxintransporter eignen sich für verschiedene klinische Anwendungen. Beispielsweise können die auf BoNT/A basierenden Transporter zur Beförderung therapeutisch nützlicher Arzneimittel an das periphere motorische Ende verwendet werden. Die auf diese Weise beförderten Arzneimittel eignen sich demzufolge zur Steuerung einer begrenzten Anzahl an Muskelgruppen. Unter den Krankheiten, die als therapeutische Ziele in Frage kommen, befinden sich tardive Dyskinesie, spastische Kolitis, essentieller Tremor, Abnormalitäten glatter Muskeln, lokalisierte Spastizität, schmerzhafte Muskelkrämpfe, die auf Rücken- oder andere Muskelgruppen lokalisiert sind, temporal-mandibulare Störungen, spasmodische Dysphonie und Spannungskopfschmerzen.
Beispiel 24 beschreibt, wie der obige, chemisch modifizierte, inaktive BoNT/A-Toxintransporter als Therapeutikum zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen verwendet werden kann, die Toxinrezeptoren exprimieren.

Beispiel 24

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: tardive Dyskinesie

Ein 45 Jahre alter männlicher Patient, der infolge der Behandlung mit einem Antipsychotikum wie Thorazin oder Haldo an tardiver Dyskinesie leidet, wird mit therapeutisch wirksamen Dosen eines geeigneten Arzneimittels (von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zu bestimmen), das an einen inaktiven Botulinum-Toxintransporter gebunden ist, direkt in die Gesichtsmuskulatur behandelt. Nach 1-3 Tagen sind die Symptome tar diver Dyskinesie, d. h. Dyskinesie des Munds und Gesichts, Athetose, Dystonie, Chorea, Muskelzucken und Gesichtsgrimassen usw., deutlich gelindert.
Beispiel 25 veranschaulicht, wie die oben beschriebenen chemisch modifizierten und inaktiven Toxine als Therapeutika zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen, die Toxinrezeptoren exprimieren, verwendet werden können.

Beispiel 25

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: essentieller Tremor

Ein 45 Jahre alter männlicher Patient, der an essentiellem Tremor leidet, der sich in rhythmischem Schwingen der Kopf- und Handmuskeln manifestiert und durch gleichbleibende Körperhaltung oder Bewegung hervorgerufen wird, wird mit therapeutisch wirksamen Dosen eines Arzneimittels (siehe Liste in obiger Tabelle), das an einen inaktiven Botulinum-Toxintransporter gebunden ist, direkt in die betroffenen Muskeln behandelt. Die Muskeln können mit Hilfe von Elektromyographie (EMG) identifiziert werden. Nach 1-2 Wochen sind die Symptome deutlich gelindert, d. h. der Kopf oder die Hand des Patienten hat zu schwingen aufgehört.
Beispiel 26 zeigt, wie der oben beschriebene chemisch modifizierte und inaktive BoNT/A-Toxintransporter als Therapeutikum zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen, die Toxinrezeptoren exprimieren, verwendet werden kann.

Beispiel 26

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: Abnormalität glatter Muskeln

Eine 30 Jahre alte Frau mit einer Konstriktion des unteren Ösophagus (diese Krankheit wird als Achalasie bezeichnet) zeigt Symptome, welche die Nahrungsaufnahme verhindern. Aufgrund der Kontraktion des unteren Ösophagus sammeln sich Nahrung und Flüssigkeit und werden schließlich regurgitiert, wodurch die Nährstoffzufuhr der Patien tin schwer beeinträchtigt ist. Therapeutisch wirksame Dosen eines Arzneimittels (siehe Liste in obiger Tabelle), das an einen inaktiven Botulinum-Toxintransporter gebunden ist, werden direkt in die betroffenen Sphinktermusken verabreicht. Üblicherweise werden die Injektionen in 2-4 Quadranten mit einer beliebigen endoskopischen Vorrichtung oder während eines chirurgischen Eingriffs verabreicht. In etwa 1-7 Tagen wird der normale Durchgang von fester und flüssiger Nahrung in den Magen erreicht, wodurch das Regurgitieren eliminiert oder reduziert wird.
Beispiel 27 veranschaulicht, wie der obige chemisch modifizierte und inaktive BoNT/A- Toxintransporter als Therapeutikum zur Beförderung chemischer Verbindungen zu Neuronen verwendet werden kann, die Toxinrezeptoren exprimieren.

Beispiel 27

Therapeutische Verabreichung modifizierter Toxine: spasmodische Dystonie (überaktive Stimmbänder)

Ein 45 Jahre alter Mann, der infolge von Krämpfen der Stimmbänder nicht deutlich sprechen kann, wird durch Injizieren therapeutisch wirksamer Dosen eines geeigneten Arzneimittels (von Fachleuten auf dem Gebiet zu bestimmen; an einen inaktiven Botulinum-Toxintransporter gebunden) in die Stimmbänder behandelt. Nach 1-7 Tagen kann der Patient wieder deutlich sprechen.
Somit veranschaulicht Beispiel 27 eine weitere Anwendungsmöglichkeit der inaktiven Clostridium-Toxine der Erfindung. In einem anderen Fall können die inaktiven Toxine zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus verwendet werden. Bei einer derartigen Behandlung wird das inaktive Clostridium-Toxin an einen Wirkstoff zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus wie etwa Captopril oder einen anderen Zinkprotease-Hemmer gebunden. Ein an Botulismus oder Tetanus leidender Patient kann durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des Konjugats, z. B. durch intramuskuläre Injektion, behandelt werden. Die richtige therapeutisch wirksame Dosis für jedes Transpor ter/Arzneimittel-Konjugat kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren von Fachleuten empirisch bestimmt werden.
Das inaktive Toxin alleine kann als Sofort-Gegengift für Individuen verwendet werden, die Botulinumtoxin ausgesetzt waren. Zu diesem Zweck sollte die Verabreichung vorzugsweise in Form einer Injektion von zumindest 1 mg inaktivem Toxin erfolgen. Höhere Dosen sind möglicherweise bei Personen erforderlich, die höheren Toxinmengen ausgesetzt waren. Zu diesem Zweck kann das inaktive Toxin alleine - ohne Bindung an ein anderes Arzneimittel - verwendet werden. Man geht davon aus, daß die Verwendung dieses Transporters bei der Behandlung von Botulinumtoxin-Vergiftung wirksamer ist als frühere Verfahren, z. B. die Verabreichung von Botulinumtoxin-Antiseren.
Zusammenfassend konnten die Anmelder die Wirkungsweise der TeTx- und BoNT/A-Toxine durch Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken näher beleuchten, um L- Kettenprotein in brauchbaren Mengen zu produzieren. Unter Anwendung einer Arbeitsvorschrift auf der Grundlage von PCR wurden die für die L-Ketten kodierenden Gene amplifiziert, anschließend in Expressionsvektoren kloniert und in großen Mengen in E. coli exprimiert. Nach der Reinigung von der Cytosol-Fraktion mittels Amylose-Affinitätschromatographie stellte sich heraus, daß Fusionsproteine, die Sequenzen der Wildform darstellen, eine rekombinierte Form des Substrats für BoNT/A, das synaptosomal assoziierte Protein mit einem Mr von 25 kDa (SNAP-25), proteolytisch spalten. Die rekombinierten L-Kettenproteine - sobald sie vom Maltose-Bindeprotein abgespalten waren - zeigten Eigenschaften wie die nativen Proteine. Die exprimierten L-Ketten wurden mit gereinigten nativen H-Ketten rekonstituiert, um disulfid-gebundene Doppelkettenproteine zu bilden, die nerveninduzierte neuromuskuläre Übertragung in vitro hemmen und die Symptome von Botulismus bei Mäusen hervorrufen.
Vor allem entdeckten die Anmelder, daß einzelne Aminosäure-Substitutionen in der Sequenz der L-Kettenproteine die proteolytische Aktivität, die üblicherweise mit den Proteinen der Wildform assoziiert ist, vollständig eliminiert. Dies ermöglicht nun die Bil dung von Doppelkettentoxinen, die entschärft sind, da sie eine proteolytisch inaktive L- Kette umfassen.
Die Anmelder erwarten auch, daß einzelne Gene, die geeignete stellengerichtete Mutationen aufweisen, für jedes der Neurotoxine produziert werden können, sodaß entschärfte Toxine in Bakterien erzeugt werden können. Diese Vorgangsweise macht es günstigerweise überflüssig, Doppelkettenmoleküle aus Komponenten zu rekonstituieren. Das resultierende entschärfte Toxin kann vorteilhafterweise als Transporter zur Beförderung kovalent verbundener chemischer Verbindungen zu neuronalen Zellen dienen, die Toxinrezeptoren exprimieren.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: Allergan, Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Modifizierung von Clostridium-Toxinen zur Verwendung als Transportproteine
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 13
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Knobbe, Martens, Olson & Bear
(B) STRASSE: 620 Newport Center Drive 16th Floor
(C) STADT: Newport Beach
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 92660
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: DOS
(D) SOFTWARE: FastSEQ, Version 1.5
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: GB 9410870.1
(B) ANMELDUNGSDATUM: 31. Mai 1994
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Altman, Daniel E.
(B) REGISTRATIONSNUMMER: 34.115
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: ALRGN.054QPC
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 714-760-0404
(B) TELEFAX: 714-760-9502
(C) TELEX:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 1:
GAGATGGTCG ACATGCCAAT AACCATAAAT AAT
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 2:
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 2:
ACGCGAAGCT TTTATCATGC AGTTCTATTA TA
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 3:
TAGTACATGT ATAAGTGCGT GCATTAATAG
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 4:
TTATACATGT ACTACATGGT
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. S.
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 5:
AAAGGCCTTT TGTTAATAAA CAA
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 6:
GGAATTCTTA CTTATTGTAT CCTTTA
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 7:
GCACATCAAC TTATACAT
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 8:
ATGTATAAGT TGATGTGC
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 9:
(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGlE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 9:
AACTTATATA TGCTGGAC
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 10:
GTCCAGCATA TATAAGTT
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 11
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP: C-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 11:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 12:
ATTTCACCAA TAACCATAAA TAATTTTAG
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(v) FRAGMENTTYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 13:
CGGGATCCTT CTGTATCATT GTAAAT

Claims

1. Chemisches Konjugat zur Behandlung einer mit Nervenzellen in Zusammenhang stehenden Störung, umfassend:

ein inaktives Clostridium-Neurotoxin mit Spezifität für eine Ziel-Nervenzelle; und

ein Arzneimittel oder ein anderes bioaktives Molekül zur Behandlung der mit Nervenzellen in Zusammenhang stehenden Störung, das an das Neurotoxin gebunden ist, wobei das Neurotoxin seine Fähigkeit beibehält, in die Ziel-Nervenzelle einzudringen.

2. Chemisches Konjugat nach Anspruch 1, worin das Clostridium-Neurotoxin aus der aus Tetanus-Toxin, Botulinum-Toxin A, Botulinum-Toxin B, Botulinum-Toxin C, Botulinum-Toxin D, Botulinum-Toxin E, Botulinum-Toxin F und Botulinum-Toxin G bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Chemisches Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin das Clostridium-Neurotoxin durch eine Aminosäureänderung in seiner leichten Kette inaktiviert worden ist.

4. Chemisches Konjugat nach Anspruch 3, worin das inaktivierte Clostridium-Neurotoxin Tetanus-Toxin mit einer Glu²³&sup4;-Modifikation, ein Botulinum-Toxin A mit einer His²²&sup7;- und/oder Glu²²&sup4;-Modifikation oder ein anderes Botulinum-Toxin als Botulinum- Toxin A mit einer Modifikation an einer Stelle ist, die dem His²²&sup7; und/oder Glu²²&sup4; von Botulinum-Toxin A entspricht.

5. Chemisches Konjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Arzneimittel ein Wirkstoff zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein chemisches Konjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche.

7. Chemisches Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur therapeutischen Verwendung.

8. Verwendung des chemischen Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neuromuskularen Dysfunktion bei einem Säugetier.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin die neuromuskulare Dysfunktion mit unkontrollierbaren Muskelkrämpfen verbunden ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Arzneimittel Neurotransmitter- Freisetzung hemmt.

11. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Arzneimittel die Aktivität von Synaptobrevin hemmt.

12. Verwendung des chemischen Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Botulismus oder Tetanus bei einem Säugetier.

13. Verwendung eines inaktiven Clostridium-Neurotoxins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von akuter Botulismus-Toxin-Vergiftung.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin das Clostridium-Neurotoxin ohne Konjugation an ein anderes Arzneimittel verwendet wird.

15. Verwendung von chemischem Konjugat, das ein aktives Clostridium-Neurotoxin und ein geeignetes Arzneimittel umfaßt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung fokaler Dystonie, spastischer Zustände aufgrund von Schlaganfall oder trauma tischer Gehirn- oder Rückenmarksverletzungen, Blepharospasmus, Strabismus, Zerebrallähmung oder Rückenschmerzen aufgrund von Muskelkrämpfen.

16. Chemisches Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin

das inaktive Clostridium-Neurotoxin Domänen der schweren Kette umfaßt, die zur Bindung des Toxins an Oberflächenrezeptoren der Ziel-Nervenzelle beitragen; und

das Arzneimittel oder andere bioaktive Molekül eine aus der aus (a) GABA-Agonisten, (b) neuronalen Kalziumkanal-Agonisten, (c) Adenosin-Agonisten, (d) Glutamat- Antagonisten, (d) Proteinsynthesetoxinen, (e) zinkabhängigen Proteaseinhibitoren, (f) neuronalen Wachstumsfaktoren oder einem Wachstumsfakrorgen, (g) einem antiviralen Medikament oder einem Gentherapiemittel, (h) nikotinischen Antagonisten, (i) neuronalen Kalziumkanalblockern, (j) Acetylcholinesterase-Inhibitoren, (k) K&spplus;-Kanal-Aktivatoren, (l) Vesamicol oder einem Analog, sowie (m) Ribozymen oder Oligonukleotiden, die die Synthese entscheidender Komponenten für Neurotransmitter-Lexozytose und/oder Nervenkeimung und -nachwachsen verhindern, bestehenden Gruppe ausgewählte Gruppierung umfaßt.

17. Chemisches Konjugat nach Anspruch 16, worin das Clostridium-Neurotoxin weiters eine Clostridium-Leichtkette umfaßt, die durch eine Aminosäureänderung inaktiviert worden ist.

18. Chemisches Konjugat nach Anspruch 16, worin das bioaktive Molekül Ricin umfaßt.

19. Chemisches Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 bis 18, worin das Arzneimittel oder bioaktive Molekül über einen Linker mit dem Neurotoxin verbunden ist.

20. Chemisches Konjugat nach Anspruch 19, worin der Linker eine Spacergruppe umfaßt, die die Formel HOOC-(CH&sub2;)n-COOH aufweist, worin n = 1-12 ist.

21. Chemisches Konjugat nach Anspruch 19, worin der Linker eine Spacergruppe umfaßt, die die Formel HO-(CH&sub2;)n-COOH aufweist, worin n > 10 ist.

22. Chemisches Konjugat nach Anspruch 19, worin der Linker eine Spacergruppe der Formel (C&sub6;H&sub6;)n umfaßt, worin n > 2 ist.

23. Chemisches Konjugat nach einem der Ansprüche 19 bis 23, worin der Linker nach dem Einbringen in die Zielzellen im Stoffwechsel umgesetzt werden kann, um das Arzneimittel oder bioaktive Molekül freizusetzen.