JPH10500988A

JPH10500988A - 輸送タンパク質用クロストリジウム属細菌毒素の修飾

Info

Publication number: JPH10500988A
Application number: JP8500524A
Authority: JP
Inventors: ドーリィ，ジェームズ，オリバー; アオキ，ケイ，ロジャー; ウィラー，ラリー，アレン; ガースト，マイケル，エルウッド
Original assignee: アレルガンインコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 1998-01-27
Anticipated expiration: 2019-04-26
Also published as: EP0760681A1; DE69511860T2; CA2191754C; DK0760681T3; CA2191754A1; EP0760681B1; ES2138740T3; AU695623B2; JP3523879B2; AU2622295A; DE69511860D1; US6203794B1; WO1995032738A1

Abstract

(57)【要約】神経細胞に関する障害を治療するための化学物質結合体を提供する。この結合体は、標的神経細胞に対して特異性のある活性もしくは不活性のクロストリジウム属細菌毒素を含む。この毒素はその毒素の標的細胞へ侵入する能力に影響を与えることなく、医薬または他の生物活性分子と結合される。

Description

【発明の詳細な説明】輸送タンパク質用クロストリジウム属細菌毒素の修飾発明の分野本発明は、標的レセプターに生化学物質を運ぶシステムに広く関連する。さらに詳しくは、本発明は、毒素レセプターをもつ細胞へ化学物質を運ぶ伝達体として修飾されたポリペプチド毒素を用いることに関する。発明の背景テタヌストキシン（ＴｅＴｘ、破傷風毒素）とボツリヌス毒素は影響力のある神経毒素であり、神経伝達物質の放出の阻害を含む機構により麻痺を引き起こす。これらのクロストリジウム属細菌神経毒素（Clostridial neurotoxin）は、最初は約１５０ｋＤａの単鎖タンパク質として生産される。それから、タンパク質分解による分裂により約１００ｋＤａの重（Ｈ）鎖と約５０ｋＤａの軽（Ｌ）鎖とが生じ、これらは鎖間が１つのジスルフィド結合で連結される。Ｈ鎖はドメインを有しており、（このドメインは）神経細胞の表面のレセプターに毒素を結合させる働きをし、Ｌ鎖を細胞に輸送するのを促進する。Ｌ鎖は神経伝達物質放出を妨げる働きをする。毒素活動の機構が最近明らかにされた。ＴｅＴｘ-Ｌ鎖は、シナプトブレビン（synaptobrevin）または小胞会合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）と呼ばれる小胞会合タンパク質に対して特異性を有する亜鉛依存プロテアーゼである。ＴｅＴｘ- Ｌ鎖によるＶＡＭＰの開裂は、伝達物質を含む小胞と前シナプス膜のドッキング／融合を妨げることにより神経伝達物質の放出を阻害する。ＴｅＴｘのただ１つのイソ型はクロストリジウムテタニ（Clostridium teta ni）により生産される一方、ＢｏＴＮは７つの血清学的に別個なイソ型がクロストリディアボツリニウムによって生産される。これら７種のボツリヌス毒素はＢｏＮＴ／Ａ-Ｇとして示される。ボツリヌスＢ型神経毒素は、テタヌストキシンのように亜鉛依存プロテアーゼである。ＥＮＢＯＪ．１２：４８２１（１９９３）の中で、Ｂｌａｓｉらは、ボツリヌス神経毒素の血清型は一般的なプロテアーゼの活動を保っている一方で全く異なる基質特異性を発達させたことを提示している。ボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧもまたＶＡＭＰを開裂させるか、あるいはイソ型と密接な関連がある。対照的に、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、分子量２５ｋＤａのタンパク質が会合されたシナプトソームを開裂する。最終的にはＢｏＮＴ／Ｃはシンタキシン（syntaxin）を開裂することが明らかにされた。これらの標的タンパク質に加えて、ＴｅＴｘおよびＢｏＮＴ／Ｂはセルブレビン（Cellubrevin）を開裂することが報告されている。このように、クロストリジウム属細菌毒素の神経内標的は一般に神経伝達物質の放出に関連している。クロストリジウム属細菌神経毒素は全て、明らかに異なる細胞表面レセプターに結合し、神経伝達物質の放出に必要な細胞構成成分をタンパク質分解する。ＴｅＴｘは抑制神経細胞（inhibitory neurons）の活動を低減させることにより脊髄や脳幹下部においてその効果を発揮する。ＢｏＮＴの７つのイソ型は全て弛緩性麻痺を生じさせる。機構的には、ボツリヌス毒素は主に神経筋細胞の連結部に見られる末梢コリン性神経末端を選択的に抑制する。ある亜鉛依存性エンドプロテアーゼはアミノ酸の保存配列ＨＥｘｘＨを含んでいる。サーモリシンでは、亜鉛結合がＧｌｕ¹⁶⁶とこのモチーフ内のＨｉｓ¹⁴²とＨｉｓ¹⁴⁶によって成されている。なお、４番目のリガンドは水である。テタヌスＬ鎖をサーモリシンや他の亜鉛エンドプロテアーゼと比べると、同じ共通モチーフの存在が明らかとなった。考えられるところでは、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖のＧｌｕ² ³⁴ は、サーモリシン中の臨界Ｇｌｕ¹⁴⁵残基に対応するものであると思われる。ＴｅＴｘのＬ鎖内のこのモチーフに含まれているＧｌｕ²³⁴の役割は、セルブレビン（cellubrevin）のタンパク質分解に対する特定部位の変異誘発やインビトロアッセイを使って研究されてきた。Ｎａｔｕｒｅ３６４：３４６（１９９３）の中でＭｃＭａｈｏｎらは、変異Ｌ鎖（Ｇｌｕ²³⁴がＧｌｎに置換）およびセルブレビンＤＮＡ構成物を伴ってＣＯＳ細胞がコトランスフェクションされた時にはセルブレビン（cellubrevin）は開裂しないことを証明している。発明の概要本発明の１つの態様は、神経細胞に関する障害を治療するための化学物質結合体に関する。この結合体は、標的神経細胞に対して特異性のある活性もしくは不活性のボツリヌス毒素またはテタヌストキシンを含む。この毒素は、その毒素の標的神経細胞へ侵入する能力に影響を与えることなく、医薬または他の生物活性分子と結合される。このように、本発明の１つの態様は、神経細胞に関連する障害を治療するための化学物質結合体に関するものである。化学物質結合体は、標的神経細胞に対して特異性のある不活性なクロストリジウム属細菌神経毒素と、該神経細胞に結合した医薬若しくは生物活性分子とを含む。神経毒素は、標的神経細胞に侵入するその能力を維持している。クロストリジウム属細菌神経毒素であればいずれの種類の毒素であっても用いることができ、テタヌストキシン、ボツリヌス毒素Ａ、ボツリヌス毒素Ｂ、ボツリヌス毒素Ｃ、ボツリヌス毒素Ｄ、ボツリヌス毒素Ｅ、ボツリヌス毒素Ｆ、ボツリヌス毒素Ｇが含まれる。クロストリジウム属細菌毒素の不活性化はその軽鎖中のアミノ酸を変更させることにより達せられる。このように、例えば不活性化したクロストリジウム属細菌神経毒素としては、Ｇｌｕ²³⁴の修飾を有するテタヌストキシン、Ｈｉｓ²²⁷および／またはＧｌｕ²²⁴に修飾を有するボツリヌス毒素Ａまたはボツリヌス毒素ＡのＨｉｓ²²⁷ および／またはＧｌｕ²²⁴に対応する部位に修飾を有するボツリヌス毒素Ａ以外のボツリヌス毒素が挙げられる。本発明の他の態様としては、制御不能な筋痙攣のような哺乳動物の神経筋機能障害の治療に使用される上記の化学物質結合体に関する。本発明は、上記化学物質結合体を制御不能な筋痙攣のような哺乳動物の神経筋機能障害の治療用薬剤の調製に使用することを含む。本発明の具体的な態様では、化学物質結合体中の医薬がボツリヌス中毒または破傷風の治療に対する有効成分である。本発明のこの態様は、哺乳類のボツリヌス中毒または破傷風の治療に使用することができ、またこのような治療のための薬剤の調製に使用することができる。本発明の他の態様としては、ボツリヌス毒素中毒の治療用薬剤の調製に不活性クロストリジウム属細菌神経毒素を使用することに関する。この態様では、不活性クロストリジウム属細菌神経毒素は他の医薬を複合させることなく単独で用いることができる。さらに本発明の態様としては、活性クロストリジウム属細菌神経毒素と医薬とを含む化学物質結合体の使用に関する。このような結合体は、限局性ジストニー（focal dystonias）、ストローク（stroke）若しくは外傷性脳損傷若しくは脊椎損傷による痙直（spasticities due to stroke or traumatic brain or spina l cord injury）、眼瞼痙攣（blepharospasm）、斜視（strabismus）、脳性小児麻痺（cerebral palsy）、筋痙攣による背痛（back due to muscle spasms）の治療用薬剤の調製に用いられる。さらに本発明の他の態様では、哺乳類の神経筋機能障害の治療方法に関する。この方法は、医薬に連結させたクロストリジウム属細菌神経毒素を含む医薬的に活性のある溶液を調製する段階と、効果を生じる量の医薬的に活性のある溶液を哺乳類に導入する段階とを含む。神経毒素はこのようないずれの種類の毒素であっても用いることができ、テタヌストキシン、ボツリヌス毒素Ａ、ボツリヌス毒素Ｂ、ボツリヌス毒素Ｃ、ボツリヌス毒素Ｄ、ボツリヌス毒素Ｅ、ボツリヌス毒素Ｆおよびボツリヌス毒素Ｇが含まれる。神経毒素はその軽鎖中のアミノ酸を変えることにより不活性化することができる。１つの実施態様では、医薬が神経伝達物質の放出を抑制し、他の実施態様では医薬がシナプトブレビン（synaptobre vin）の活性を抑制する。好ましくは、本方法は、制御不能な筋痙攣に関連する神経筋機能障害を治療するのに使われる。以下に続く詳細な説明を参照することにより当業者はさらに本発明の実施態様を見いだすであろう。図面の簡単な説明図１は、ＴｅＴｘおよびＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質を発現するのに使われるＤＮＡ構築物（ｐＭＡＬ-ＬＣ）の図式表示である。最初の図中の一文字コードは、精製された組換え体Ｌ鎖およびＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖の、Ｎ末端マイクロシーケンシングにより決定された最初の数残基のアミノ酸配列を表している。図の次の部分は、Ｈ鎖がＬ鎖とジスルフィド結合していることを示している。亜鉛結合ドメインの位置もまた図示している。図２は、天然、組換え又は変異Ｌ鎖により開裂したＨＶ６２ペプチド（ヒトＶＡＭＰの合成断片）の割合を経時的に示したグラフである。種々の記号は、３３（○）、１００（□）、２５０ｎＭ（▲）の天然Ｌ鎖；または２５０ｎＭ組換えＬ鎖（△）；または２．５μＭＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖（■）を表す。挿入図は、天然Ｌ鎖によるＨＶ６２基質の見かけ上の加水分解を低減するＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖の能力を示している。中白の棒はＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖の存在下で天然Ｌ鎖により加水分解された基質の割合を示し、一方、斜線の入った棒はＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖が存在しない条件下で加水分解された基質の割合を示す。図３は、経時的な神経筋伝達の検定として筋緊張（初期値の％として）を示すグラフである。種々の記号は、１０ｎＭＴｅＴｘ（○）、１０ｎＭ再構成天然Ｈ鎖およびＬ鎖（□）、１０ｎＭ天然Ｈ鎖と会合させた組換え再構成Ｌ鎖（△ ）、１００ｎＭＨ鎖と共に再生したＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖（■）を示す。数値は３検体から得られた平均値（±ＳＤ）である。挿入図は、２０ｎＭ再構成天然Ｈ鎖およびＬ鎖（□）並びに４０ｎＭ再構成天然Ｈ鎖および組換えＬ鎖（△）で得られた結果を表す。ただし、再構成サンプルの定められた濃度には微量の非共有結合した鎖は含んでいない。図４は、輸送タンパク質と医薬分子を結合するのに使われる化学合成機構の図解を示す。図５は、組換えＢｏＮＴ／Ａ軽鎖発現構築物ｐＣＡＬの図解を示す。これはｐＭＡＬ-ｃ２ベクターのポリリンカーにおけるＢａｍＨＩとＳａｌＩ制限部位との間にＬ鎖遺伝子を挿入して作製される。ベクターは、ｍａｌＥ-ＬａｃＺａ遺伝子融合体を転写させる位置にある誘導性（inducible）Ｐ_tacプロモーターを含む。ｌａｃ１^q遺伝子は、イソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導まで、Ｐ_tacからの転写を抑制するｌａｃリプレッサーをコードする。ｒｒｎＢターミネーターは、転写がプラスミドの複製に干渉するのを妨げる。Ａｍｐ^rは、アンピシリン耐性のためのβ-ラクタマーゼをコードする。Ｍ１３-ｏｒｉおよびｐＢＲ３２２ｏｒｉはＤＮＡ複製の開始点を示す。ファクタ−Ｘ^a開裂部位およびＬ鎖起点は矢印で指し示している。図６は、ＢｏＮＴ／Ａに対する組換えＳＮＡＰ-２５基質およびウエスタンブロットによる開裂検定の結果を示す図である。図解（Ａ）は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位を含むＳＮＡＰ-２５のＣ-末端断片であって、これに対するポリクローナル抗体を生じさせた。グラフ（Ｂ）は、ウエスタンブロットのデンシトメトリックスキャン（densitometric scanning）により得られた数値である。還元型天然ＢｏＮＴ／Ａ（●）および組換え野生型Ｌ鎖（○）は、効果的にＳＮＡＰ-２５を開裂する一方、Ｔｙｒ²²⁷変異体はタンパク質分解活性に欠けた（▽）。図７Ａおよび７Ｂは、組換えＬ鎖またはその融合タンパク質が、透過性クロマフィン細胞からのカテコールアミン放出を阻害することを表す線グラフである。図７ＡはファクターＸ_a開裂前であり、図７ＢはファクターＸ_a開裂後である。細胞は、２０μＭジギトニンを含むＫＧＥＰバッファー（１３９ｍＭＫ⁺グルタミン酸、５ｍＭエチレングリコールビス［β-アミノエチルエーテル］Ｎ，Ｎ，Ｎ ’，Ｎ’-テトラアセチックアシッド［ＥＧＴＡ］、２ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭピペラジン-Ｎ，Ｎ’-ビス［２-エタンサルフォニックアシッド］［ＰＩＰＥＳ］ｐＨ６．５）に、表示された濃度の天然ＢｏＮＴ／Ａ（○； △）または組換えＬ鎖融合タンパク質をファクターＸ_aに伴う開裂の前（●）若しくは後（▲）に配合したもので、１５分間インキュベートすることにより透過性を有するようになった。続いてＫＧＥＰで軽くすすぎ、２０μＭ遊離Ｃａ²⁺を含むかまたは除いたＫＧＥＰで１５分間インキュベートした。それから、それぞれのウエルからアリコート（aliquot）を取り出し、カテコールアミンの含有量を蛍光法（fluorometric method）によって検定した。細胞内に残存しているカテコールアミンはＴｘ-１００可溶化した後に算出し、分泌物は全細胞含有量（＝残存＋放出）の割合として算出した。Ｃａ²⁺を含まない緩衝液中のカテコールアミンを、２０μＭＣａ²⁺を含む緩衝液で分泌されたカテコールアミンから除いて、誘発放出を算出した。図８は、ＢｏＮＴの天然Ｈ鎖で再構成した後の、運動終板で神経誘発性神経筋伝達における、精製された天然、組換え野生型および変異Ｌ鎖の効果を示す線グラフである。マウスの半横隔膜の横隔神経（phrenic nerve-hemidiaphrams）に投与すると、組換えＬ鎖と再構成したＢｏＮＴ／ＡＨ鎖（１．６ｎＭ；○）は、天然Ｌ鎖とＨ鎖を再構成したもの（２．０ｎＭ；▽）とほぼ同じ程度に神経筋伝達をブロックした。対照的に、Ｌ鎖のＴｙｒ²²⁷変異体を含む２本鎖では量を多くしても神経誘発性単収縮に対して効果はなかった。再構成物質の濃度は、ＳＤＳ -ＰＡＧＥおよびデンシトメトリックスキャニングにより１５０ｋＤａ２本鎖物質を定量した後に計算して求めた。組織をクレブス-リンガー培地に浸し、９５％Ｏ₂および５％ＣＯ₂でエアレーションしながら２４℃に保った。示されたすべてのポイントは、少なくとも３つの別検体の平均±ＳＤである。図９は、ＭＢＰ-ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖２重変異体（”１”）およびＭＢＰ-ＴｅＴｘ切断（truncated）Ｌ鎖-ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖２重変異体（”２”）を生成するための構築物を図解したものである。発明の詳細な説明本発明は、連結された薬学的化合物を運ぶための輸送体として、２本鎖形態の、修飾されたクロストリジウム属細菌神経毒素を利用することに関する。毒素輸送体に結合させることができる化合物の中には、蛍光物質を保持する視覚化試薬および治療価値のある医薬がある。天然毒素の酵素的な特性はこのような適用には不利であったが、本発明者らは、この限界を克服する手段を見いだした。毒素輸送体による標的と予定される細胞集団には同種の毒素レセプターを有する（ex press）ものも含まれる。本発明者らは、有効な医薬の輸送薬（delivery agent）は、クロストリジウム属細菌神経毒素のＬ鎖中のアミノ酸の１つまたはそれ以上を変異させ、そのプロテアーゼ活性を不活性化し、さらに医薬をその不活性化された神経毒素に結合させることにより調製することができることを見いだした。この酵素活性の失活にもかかわらず、変異した毒素は、都合の良いことに、その同種の細胞表面レセプターに結合する能力は維持している。さらに、本発明者らは、弱毒化したクロストリジウム属細菌神経毒素について他の予期しがたい特性を見いだした。意義深いことに本発明者らは、クロストリジウム属細菌神経毒素の重鎖およびＬ鎖の両方が最適なレセプター-リガンド相互作用のために要求されることを見いだした。この知見から毒素輸送体は、２本の鎖分子を両方とも含んでいることが有利であると考えられる。Ｌ鎖分子に関連している毒素の特性は、輸送体に共有結合した医薬の医療効果を妨げるため、本発明者らは、天然Ｈ鎖と再構成した弱毒化したＬ鎖分子を作製したところ、得られた２本鎖分子は、同種のレセプターに結合し、インターナリゼイション（internalization）される能力を維持していた。これは、１つまたはそれ以上のアミノ酸位置の変異により、Ｌ鎖タンパク質の折り畳み構造に対して最小限の損傷で達成することができることを見いだした。したがって、医薬に共有結合し得る、媒介手段として不活性化したクロストリジウム属細菌神経毒素を用いることを探究した。再構成された毒素、すなわち不活性化されたＬ鎖が天然のＨ鎖にジスルフィド結合された毒素は、標的レセプターに特異的に相互作用し、かつ、結合された分子を伴い細胞質ゾルに輸送される能力を維持していた。したがって、不活性化され、かつ化学的に修飾された毒素結合体（modified toxin complex）は、結合された化学物質を、毒素に対する細胞表面レセプターを有している神経細胞の細胞質ゾルに輸送するシステムとして用いることができる。本発明では、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖をコードしている遺伝子に、マルトースバインディングドメイン（maltose-binding domain）をコードするＤＮＡ配列を５’末端に加えることにより修飾した。それゆえ、このドメインはＴｅＴｘ-Ｌ鎖タンパク質のＮ-末端部位につけ加えられた。Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現のあと、組換え体融合タンパク質（「ＭＢＰ-Ｌ鎖」という）は、アフィニティークロトマトグラフィーにより精製された。ファクターＸ_aによるタンパク質分解によれば、融合タンパク質のＬ鎖とＭＢＰドメインを分離することができた。次に、精製したＬ鎖は、２本鎖を生成するためにＣ．ｔｅｔａｎｉ-由来ＴｅＴｘから分離、精製したＨ鎖と結合させた。この再構成ＴｅＴｘ分子は天然毒素の活性特性を示す。また、天然ＢｏＮＴ／Ａ-Ｈ鎖タンパク質と再会合させた組換えＢｏＮＴ／Ａ- Ｌ鎖タンパク質を用いても同様の知見が得られた。他の実験では、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖中のＧｌｕ²³⁴をＡｌａにする修飾により、ＶＡＭＰまたはＴｅＴｘ-Ｌ鎖が認識する開裂部位を含む合成基質を開裂するその能力は失われた。優れたことには、修飾された毒素はそのレセプターに結合する能力を維持していたが、変異Ｌ鎖と野生型Ｈ鎖とで形成された複合体の神経毒性もまた失われた。似たような実験として、分離ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖分子のＨｉｓ²²⁷若しくはＧｌｕ²²⁴のいずれかを、またはその両方を修飾した。ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖中でのこのような修飾は、細胞の標的基質に対するタンパク質分解活性を消失させた。テタヌストキシンに対しては多くのヒトが免疫されているので、循環抗体による中和が最低限になるように、ＴｅＴｘ分子を更に修飾するほうが有利であると考えられる。ＴｅＴｘ分子への修飾は、その細胞結合およびインターナリゼーション能力を維持し、しかし免疫システムによる探知は制限することが好ましい。ここに説明する方法によれば、変異クロストリジウム属細菌神経毒素を合成することができ、それは効果的に細胞質ゾルにインターナリゼーションされ、輸送される能力を有している。これらの毒素は、関連するタンパク質分解活性はなくとも、神経に結合する能力を維持していて有利である。このような弱毒化された毒素は化学薬を標的神経に特異的に輸送するための新規なシステムをつくるのに有用である。ここで述べられる、変異を誘発し酵素的に不活性な２本鎖クロストリジウム属細菌神経毒素は、毒素に対する細胞表面レセプターを有する神経細胞に化学物質を輸送するための神経薬理学的な薬として優れたものを提供している。輸送体タンパク質に化学薬を結合することは、本発明を実施するために必須である。このような化学薬としては薬理学的な薬、化学療法的な薬または電磁気放射の光若しくは他の形態の電磁気放射線により検知可能な視覚化試薬を用いることができる。似たようなものはたくさんあるが、当業者は、少なくとも１つ重要な点において、テタヌストキシンおよびボツリヌス毒素が機能的に区別されることを認識するであろう。テタヌストキシンは運動ニューロンによって取り込まれ、脊髄へと運ばれて痙攣による痙直を引き起こす。このようにして、筋肉を起点として脊髄へさかのぼる道筋を通って、ＴｅＴｘは脊髄中の標的細胞へと到達することができる。逆に、種々の血清型ＢｏＮＴ（BoNT serotypes）では全て、神経毒性は、コリン作動性神経末端、実質的には注射部位に局部的に限定して作用する。ＴｅＴｘが脊髄へ移動して毒素活性を示す能力とＢｏＮＴの局部限定的な毒素活性の能力とのこのような違いは、修飾された毒素輸送体を用いる治療プロトコールにおいて活用することができる。特に、ＴｅＴｘに基づく修飾された毒素は、脊髄と注射された筋肉とをつなぐ神経の道筋に沿って、結合された医薬を脊髄に運ぶと考えられる。逆に、血清型ボツリヌス毒素のうちのひとつを基礎にして修飾された毒素は、注射した部位に局部的に限定されると考えられる。ゆえに、以下に続く本発明の修飾された毒素輸送体に基づく治療薬を使う臨床家は、ＴｅＴｘに基づく治療薬（therapeutic agent）を適当な筋肉に注射することによって、選択的に脊髄の領域へ医薬を運ぶことができる。その一方、ＢｏＮＴに基づく治療薬の筋肉への投与は、作用活性が注射部位の運動ニューロンに限られる。不活性なテタヌストキシン輸送体は、主に、腕、脚若しくは体の一部分のように全般的な範囲で痙直や過剰運動を制御するために、標的となる組織に医薬を運ぶのに用いられる。医薬および輸送体は、脊髄標的に起源のあるひとつまたはそれ以上の筋群内に筋内投与することができる。治療による効果があると考えられる病気としては、痙性斜頸（spasmodic tort icollis）、ポストストローク（post stroke）若しくは外傷性脳損傷（traumati c brain injury）により誘発される痙直（spsticity）、および大きな筋群（lar ge muscle groups,）のジストニー（dystonia）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。不活性なボツリヌス毒素輸送体は、主に、末梢運動神経末端を標的として医薬を運ぶのに用いられる。それゆえ、限定された筋群に影響のある病気には、ＢｏＮＴ／Ａに基づく輸送体を使って治療するのが最適である。他の血清型ボツリヌス毒素に基づいた輸送体もまたこのような目的に有効であると考えられる。治療による効果があると考えられる病気としては、晩発性運動障害（tardive dyskinesia）、痙性結腸炎（spastic colitis）、本態性振せん（essential tre mor）、胃平滑筋（gastric smooth muscle）、アカラシア（食道の異常収縮）、局所性痙直（localized spasticity）、背中若しくはその他の筋群に限定された筋痙攣痛（painful muscle spasms）、一時的下顎障害（temporal mandibular d isorder）、痙性発声困難（声帯過剰反応 overactive vocal chords）、嚥下障害（swallowing disorder）、緊張性頭痛（tension headaches）、痙性斜頸（sp asmodic torticollis）、ポストストローク（post stroke）若しくは外傷性脳損傷（traumatic brain injury）により誘発される痙直（spasticity）、大きな筋群（large muscle groups）、心血管平滑筋（cardiovascular smooth muscle）（例えば、細動脈）、および様々な器官（胆嚢、膀胱、直腸など）に見られる括約平滑筋（sphincter smooth muscle）のジストニーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。表１には、本発明に関連し得る治療の概要を示す。この表には、テタヌストキシンまたはボツリヌス毒素の分子に連結させることができる具体的な医薬の種類が記載されている。表１に示すように、修飾されたテタヌストキシンは治療薬を脊椎および他の神経細胞部位に運ぶことができる。修飾されたボツリヌス毒素は、化学薬を局所に運ぶための媒介手段として用いることができる。ここにいう輸送体は主に、不活性な２本鎖テタヌストキシンおよびボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であるが、他の全ての血清型のボツリヌス毒素（Ｂ−Ｇ）も同様に用いることができる。異なる血清型のボツリヌス毒素は、異なる前シナプスのレセプターに対して用いることができる。すなわち、異なる血清型の毒素は、医薬輸送を特異的に行うことに好ましく用いることができる輸送体として使用されよう。このことは、仮にある組織がひとつのレセプターを他のレセプターよりも選択的に有している場合には、特に有効である。あるいは、２つの輸送体を用いて異なる治療薬を体内の同じ標的域に運ぶことに用いることもできる。この後者のアプローチは、レセプター部位の、異なる毒素リガンド間での競合を減らすのに有効である。さらに、クロストリジウム属細菌神経毒素タンパク質の天然のものと組換え野生型の双方に化学物質を結合させて輸送体として用いることは、本発明の範囲に含まれる。このような態様では、医薬輸送体のＬ鎖部分の有する酵素活性により、その神経毒素特性の効能による治療上の利点を得られる。例えば、神経機能を阻害する医薬を野生型ボツリヌス毒素分子に結合させて２つの作用を有する結合体とすることができる。医薬はその標的部位で作用する一方、ボツリヌス毒素はその神経阻害効果を及ぼす。医薬分子に結合される活性毒素を用いた治療対象となる神経筋疾患の例としては、限局性ジストニー、ストローク若しくは外傷性脳損傷若しくは脊椎損傷による痙直、眼瞼痙攣、斜視、脳性小児麻痺、筋痙攣による背痛が含まれる。以下に示すように、本発明で用いられることが予期されるいくつかの医薬は、他の医薬が細胞外部で作用するのに対し、細胞内部で作用する。ここで明らかにするように、細胞内部作用医薬は、クロストリジウム属細菌神経毒素輸送体に結合させることができ、効果的にインターナリゼーションされる。しかし、細胞外部作用性医薬もまた、本発明で用いることができる。還元されたアルキル化ボツリヌス毒素は細胞の外部に結合するが、インターナリゼーションはされない（de Pavia et al.，J．Biol．Chem．268:20838(1993)）。このようにして、還元されたアルキル化分子は、細胞外部作用医薬と結合されて、標的細胞の表面へと運ばれる。いったん細胞の表面に結合すると、エステラーゼのような酵素が毒素輸送体から医薬を引き離すので、標的細胞にきわめて接近して医薬を放つことになる。以下に、代表的な医薬の種類とこれに結合される輸送体の形態の種々の実施態様の概要を示す。不活性クロストリジウム属細菌神経毒素と化学薬とを共有結合する方法は、当業者に知られている通常の方法による。ただし、不活性な毒素に対応する複合薬のドメインは、標的細胞上の同種のクロストリジウム属細菌神経毒素レセプターと特異的に相互作用する能力を維持していることが条件である。精製されたボツリヌス毒素Ａ型は、神経毒素薬として医療的に用いられてきた。この化合物は、アレルガン社（アーバイン、カリフォルニア）により製造されており、ＢＯＴＯＸ（登録商標）という商品名で販売されている。この薬は、治療上、局所的、化学的な除神経筋肉麻痺を生じさせるために用いられる。この様にして化学的除神経を施すと、影響を受けた筋肉は萎縮し、ジャンクション外（ extrajunctional）アセチルコリンレセプターを発達させ得る。影響を受けた神経細胞は、発芽新生を生じ、筋組織を再び神経支配できるので、ＢＯＴＯＸの麻痺活性は可逆的であると考えられる。上記の方法に従って製造される修飾されたクロストリジウム属細菌神経毒素は、減圧化で凍結乾燥した状態で容器に入れ保存できる。凍結乾燥に先立って、修飾された毒素は、当業者に知られているアルブミンや他の適当な薬品のような、製薬的に許容される賦形剤と混合できる。製薬的な調製については、ニュージャージーの Medical Economics Data of Oradell により毎年出版される「Physici ans Desk Reference」にさらに記載がある。凍結乾燥剤は、筋内注射の前に、無菌の非保存性生理食塩水を使って再調製する。この溶液は、上述の種々の神経筋障害の治療に使いかってがよい。軽鎖タンパク質に化学物質を結合させる方法多種多様な化学物質を毒素輸送体分子に結合させて用いることができると考えられるが、これらの代表的物質は神経薬学的薬または医薬であろう。したがって、以下の説明では、輸送体タンパク質と医薬との結合方法を詳説する。しかしながら、当業者であれば、より一般的な用語「化学物質（chemical compound）」を「医薬（drug）」という用語に置き換えたにすぎないことは認識できるであろう。タンパク質のアミノ酸鎖に化学物質を結合する方法は数多く知られている。本発明者らは、Ｌ鎖ペプチドから医薬を離すためにリンカー分子を用いる。上記のように、本発明者らは、その本質的な機能に影響を及ぼすことなく、ＴｅＴｘのＮ末端に１１アミノ酸を結合することができることを見いだした。このため、化合物の結合部分として、ボツリヌス毒素またはテタヌストキシンのＬ鎖のＮ末端部位を用いることができる。ほとんどの医薬で立体障害に対して敏感ではない位置があることは知られている。また、連結工程により医薬分子にキラリティが生じるわけではない。さらに、リンカーと医薬とは共有結合により結合される。Ｌ鎖と医薬との距離はスペーサー分子を挿入して調節する事ができる。スペーサーとしては、リンカー、医薬及びＬ鎖に結合し、またそれらを結びつけることができる官能基を有するものを用いることができる。好ましいスペーサーとしては、：１）ＨＯＯＣ-（ＣＨ₂）_n-ＣＯＯＨ、ｎ＝１−１２、ペプチドのアミノ末端に挿入して、そのアミノ末端を医薬上のリンカーに連結するのに好適である。２）ＨＯ-（ＣＨ₂）_n-ＣＯＯＨ、ｎ＞１０、ペプチドのアミノ末端に結合させ、Ｌ鎖を医薬分子上のリンカーをＬ鎖に結合するのに適している。３）（Ｃ₆Ｈ₆）_n、ｎ＞２、医薬分子上のリンカーとＬ鎖を結合するアタッチメントとして好適である。ベンゼン環は医薬とＬ鎖との間の剛性のあるスペーサーとなる。もちろん、適当な官能基、例えば下記にＸ基として特定されるようなものが、医薬とＬ鎖を連結するベンゼン環についていることもある。二つの異なる結合タイプが見られる。最初のタイプは、医薬-リンカー-Ｌ鎖分子が細胞中に導入された後にもインタクト（無傷）のまま維持される。二つめのタイプは、医薬-リンカー-Ｌ鎖分子が細胞に導入された後に代謝されて医薬を分離する。導入後もインタクトのまま維持されるリンカーひとつの方法としては、システイン残基がＬ鎖分子の末端に従来の技術を用いて結合される。例えば、Ｌ鎖分子をコードする遺伝子構築物を、タンパク質のＮ -末端部位にシステイン残基が含まれるように変異させることができる。マレイミドリンカーは既知の手法によりシステイン残基に結合される。二つめの方法としては、リンカーを直接医薬に結合する。医薬-Ｘ成分は、ＸがＯＨ、ＳＨ、ＮＨ₂、ＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ₂であるものであってもよい。もちろん、好ましい基は、活性部位にはなく、また立体的に障害とならない。以下の反応により、医薬-Ｘをリンカー分子に連結する。一旦医薬がリンカーに結合されると、医薬を毒素に連結するために以下の反応を行うことができる。この反応においては、毒素は医薬に対する結合部分となる接触可能なリシン基を有する。上記の通り、リシンなどの追加アミノ酸は、Ｌ鎖遺伝子のＮ-末端部位に容易に結合でき、医薬に対する結合部位として用いられる。以下の反応では、水素化シアノホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride ）が、Ｌ鎖分子上のリシン基にリンカーを結合するために用いられる。本発明に用いられるものとして挙げられている医薬は、フリー-ＸＨ基を有し、神経抑制剤（neuroinhibitor）として作用し得る医薬である。これらの神経抑制剤は、神経がファイアリング（firing）するのを阻害されているような医学的徴候において神経伝達物質の過剰生産を妨げることができる。好ましい-ＸＨ基を有する医薬としては、アコニチン（Aconitine）、アデノシンアゴニスト／アンタゴニスト（adenosine agonists/antagonists）、アドレナリン作用薬（adrene rgics）、アナトキシンＡ（anatoxin A）、抗てんかん薬（antiepileptics）、バクロフェン（baclofen）、バチアコトキシン（bactiachotoxin）、ブレフェルヂンＡ（brefeldin A）、ブレベトキシン（brevetoxin）、カプトプリル（capt or il）、クラーレ（curare）、ダントロレン（dantrolene）、ドキソルビン（doxo rubin）、ジアゼパン（diazepan）、グライアノトキシン（grayanotoxin)、リドレイン（lidoraine）、メトカルバモール（methocarbamol）、メチルリカコニチン（methyllycaconitine）、ネオサキシトキシン（neosaxitoxin）、フィソスツチジミン（physostigmine）、プシコシン（psychosine）、ＴＨＡ、テトロドトキシン（tetrodotoxin）、ベサミコル（vesamicol）およびバイガバタム（vigab atum）導入後開裂するリンカー医薬の作用の様式によっては、導入後にＬ鎖から医薬が分離されることが重要となることがある。この方法では、医薬はリンカーとともに合成のための活性部位となるフリー-ＸＨ基を有する。-ＸＨ基はアルコール、フェノール、アミン、カルボン酸またはチオールでもよい。導入後代謝されるように医薬を毒素に連結する際の一般式は以下の通りである。Ｘとしては、Ｏ、Ｎ／ＮＨ、ＣＯ₂、Ｓ、ＣＯＮＨが挙げられる。リンカーとしては以下に示すＡ）またはＢ）が挙げられる。リンカーＡ又はＢとの具体的反応を以下に示す。リボザイムを毒素輸送体に連結する手法では、リンカーの結合のためにアデノシンおよびグアノシン塩基上のフリーアミノ官能基を用いる。とりわけ、我々のアプローチでは、フリーアミノ部位が修飾された修飾アデノシンまたはグアノシン残基を、スクシニミド（succinimide）の窒素部位に結合されるリンカーと結合させる。これらの修飾ヌクレオシドの構造は次のように図式化できる：糖-塩基-ＮＨ-リンカー-スクシニミドリボザイムは通常の方法に従って、定められた順序でヌクレオシドを逐次連結して調製される。連結反応は、個々の化学ユニットの糖部分の間に生じる。上記したように、リボザイムの３’または５’末端のいずれかでの修飾ヌクレオシドの結合は、前述の機構によって毒素輸送体に共有結合で連結するための手段を提供するであろう。ここに述べた物質や方法の他のものも本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および物質は今述べた通りである。ここに述べられている種々のＰＣＲおよびクローニング手順を行うために用いることができる方法についての一般的参考文献として、Molecular Cloning: A Laborator y Mannual(Sambrook et al．eds．Cold Spring Harbor Lab Publ．1989)および Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al．eds.，Greene Publi shing Associates and Wiley-Interscience 1987)がある。不活性ＴｅＴｘ構成物を作成する最初の段階は、野生型および変異型Ｌ鎖構造遺伝子をプラスミド発現ベクターにサブクローニングすることを含む。この目的のために用いられるベクターは、マルトースバインディングタンパク質ドメイン（maltose binding protein domain）のＮ末端を、Ｌ鎖のＣ末端に連結する融合タンパク質を発現するように設計される。ベクターにコードされたファクターＸ_a の共有結合開裂部位は、ＭＢＰとＬ鎖挿入配列との間に挿入される。Ｌ鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発を用いてＧｌｕ²³⁴をＡｌａに代える。実施例１では、野生型および変異型テタヌストキシンＬ鎖のマルトースバインディング融合タンパク質をコードした組換えプラスミドを作成する方法を説明する。実施例１マルトース-バインディング-タンパク質-ＴｅＴｘ-Ｌ鎖構築物Ｅ．ＣｏｌｉＫ-１２ＴＧ１菌株を、以下に説明する全てのプラスミド構築物の増殖用のホストとして用いた。ｐＭＡＬ-ＬＣプラスミド（野生型Ｌ鎖遺伝子）は、ＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒらがＦＥＢＳＬｅｔｔ．３２３：２１８（１９９３）で示したｐＴｅｔ８７プラスミドからのＬ鎖をコードする１４１７-ｂｐ断片のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）増幅により構築した。このＰＣＲ増幅で用いられるａおよびｄという２つのポリヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列５’-ＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴ-３’（配列番号１）、５’-ＡＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡ-３’（配列番号２）を有していた。この反応の増幅産物をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Promega）で消化し、それから野生型ＴｅＴｘ配列を保有するｐＭＡＬ-ＬＣプラスミドを作製するために同じ酵素で消化したｐＭＡＬ-ｃ２ベクター（New England BioLabs）（図１Ａ）に連結した。部位特異的変異誘発用には、配列５’-ＴＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＧＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧ-３’（配列番号３）および５’-ＴＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴ-３’（配列番号４）をそれぞれ有するｂとｃというさらに２つのプライマーを用いた。それぞれのプライマーは、ＴｅＴｘ- Ｌ鎖の２３４アミノ酸位置のＧｌｕコドンをＡｌａコドンに変異させる際に利用するＡｆｌＩＩＩ開裂部位を有する。ｐＴｅｔ８７のＰＣＲ増幅は、プライマーａ／ｂおよびｃ／ｄの組合せを別々に用いて行った。ａ／ｂの組合せから得られた増幅産物は、ＳａｌＩおよびＡｆｌＩＩＩで消化し、ｃ／ｄの組合せから得られたものはＡｆｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。マジックＤＮＡクリーンアップシステム（Promega）で精製した後、変異ＴｅＴｘ配列を保有するｐＭＡＬ-ＬＣ-Ａｌａ²³⁴プラスミドを作製するために試料をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂したｐＭＡＬ-ｃ２に連結した。サブクローニングの後、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換体の培養物から精製して、構築物の構造を制限酵素マッピングおよび挿入したＤＮＡの配列決定により確認した。ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化により、アガロースゲル電気泳動により推定される長さが１４１７ｂｐである断片を収集した。ＤＮＡ配列決定により、Ｌ鎖遺伝子の５’-末端の接続部のヌクレオチド配列、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、ファクターＸ_a開裂部位、Ｌ鎖およびＭＢＰコドン配列がすべて正しいリーディングフレームになっていることを確認した（図１Ａ）。上記プラスミド構築物の利用により、組換え野生型および変異Ｌ鎖融合タンパク質の作製が可能となった。特に、ｐＭＡＬ-ＬＣまたはｐＭＡＬ-ＬＣ-Ａｌａ² ³⁴ プラスミドを保有するバクテリアクローンの培養は、組換え体融合タンパク質の高レベル合成を刺激するイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘導される。アミロースアフィニティー樹脂によるバクテリア抽出物のアフィニティークロマトグラフィーによって、２つの融合タンパク質のラージスケール精製を行った。実施例２では、上記の実施例で説明したプラスミド構築物によってコードされた組換えＬ鎖融合タンパク質の生成と精製の手法を説明する。実施例２ＴｅＴｘ融合タンパク質の発現並びに野生型およびＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖変異タンパク質の精製ｐＭＡＬ-ＬＣまたはｐＭＡＬ-ＬＣ-Ａｌａ²³⁴プラスミドを保有するＥ．Ｃｏｌｉクローンを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌおよびグルコースを２ｍｇ／ｍｌにしたＬ-ブロース（broth）中に３７℃の条件で、およそ２×１０⁸ｃｅｌｌ／ｍｌ（Ａ⁶⁰⁰〜０．５）の密度になるまで増殖させた。最終濃度０．３ｍＭまでＩＰＴＧを添加して誘導を開始した。２時間後に６０００×ｇ、３０分間遠心分離を行い、細胞を収集した。得られたペレットを、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含むカラム緩衝液［１０ｍＭトリス-ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭエチレングリコールビス（β-アミノエチルエーテル）-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラ酢酸、および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ７．４）］に再懸濁し、超音波処理により溶菌させた。遠心分離の後、粗抽出物をアミロースアフィニティーカラム（２．５×１０ｃｍ、４０ｍｌの樹脂）にアプライした。結合しなかったタンパク質を緩衝液で洗って除去し、続いて、ＭａｉｎａらがＧｅｎｅ７４：３６５（１９８８）に記載した手順にしたがって、結合したＭＢＰ-ＬＣ融合タンパク質を１０ｍＭマルトースを含む緩衝液で溶離した。分離された融合タンパク質は、アミコンセントリコン（Amicon CENTRICON ）を用いた０．５−１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。それからタンパク質試料を、ソジウムドデシルサルフェイトポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）および抗-ＭＢＰポリクローナル抗体と抗-Ｌ鎖モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。双方の細胞抽出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥは、非誘導培養のクーマシー染色パターンにはない、誘導タンパク質バンド（Ｍ_r 〜９０，０００）の存在を示した。タンパク質バンドの分子量は、ＭＢＰとＬ鎖の融合から予測されるもの（それぞれＭ_r〜４０，０００および５０，０００）に一致した。ｐＭＡＬ-ｃ２ベクターシステムを使って組換えＬ鎖およびＡｌａ²³⁴変異体を発現させるための定められた最適条件は、ＩＰＴＧで３７℃、２時間の誘導であった。それ以上の時間誘導してもプロテアーゼ阻害剤を混合させても生成物の収量は増えなかった。どちらの融合タンパク質も緩衝水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌまで）に溶解し、また−２０℃で保存して８カ月安定していた。この最初の精製段階の後、双方のＭＢＰ-Ｌ鎖調製物を、ファクターＸ_aによって、酵素：タンパク質の割合を０．５−１：１００（ｗ／ｗ）として、２３℃、２４時間で開裂した。この開裂により、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより確認された通り、ＭＢＰが遊離して野生型-Ｌ鎖およびＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖それぞれへの融合タンパク質の転換が達成された。カラム緩衝液に対し十分に透析してマルトースを除いた後、Ｌ鎖またはＡｌ²³⁴-Ｌ鎖を新たなアフィニティーカラムに再吸着させてさらに精製した。この精製段階の所望の生成物はカラム洗浄画分中に見いだされる。カラム洗浄の画分は、Ａ_280nmでモニターし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより再確認した。アミノ酸配列決定のために、野生型または変異型Ｌ鎖をＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、ＴｏｕｓらがＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：５０（１９８９）で記載したようにポリ（ビニリデンジフルオライド）膜に移し、モデル４０００タンパク質シンケンサー（Chelsea Instruments，London）を用いて、自動エドマン分解を行った。２つの生成物をマイクロシーケンシングしたところ、図１Ａに示されるように、ベクターの多重クローニング部位によりコードされる１１アミノ酸の後に位置する４つの残基が、天然Ｌ鎖のＮ-末端のそれと全く同じであることが明かとなった。所望の構造を有する組換えＬ鎖タンパク質を精製することに成功したので、我々は次にこれらの化合物の酵素活性を試験した。天然Ｌ鎖タンパク質の亜鉛依存プロテアーゼ活性の試験を、組換えＬ鎖タンパク質の活性についての検定として行った。この検定では、２つの異なるタンパク質基質を用いた。最初に、ウシ小シナプス小胞（ＳＳＶｓ）を用いた。クーマシー染色およびタンパク質ゲルのウエスタンブロッティングに基づいて基質のタンパク質分解開裂を検定した。実施例３では、ＳＳＶｓを基質として用いて野生型および変異型組換えＬ鎖タンパク質のタンパク質分解活性を検定する方法について説明する。実施例３インビトロ基質のＴｅＴｘ-Ｌ鎖依存タンパク質分解測定天然、組換え野生型またはＡｌａ²³⁴Ｌ鎖を、ウシ小シナプス小胞（０．５ｍｇ／ｍｌ）とともに、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、４００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＤＴ、２μＭＺｎＳＯ₄（ｐＨ７．４）中、３７℃で、９０分間インキュベートした。反応は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し３−５分間煮沸して停止させた。それから試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、ＳｈｏｎｅらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：９６５（１９９３）に示したヒトＶＡＭＰ２の３３−９４残基に対応する６２-アミノ酸合成ポリペプチドに対して産生させたアフィニティー精製抗-ＨＶ６２抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。抗-ＨＶ６２抗体の調製方法は、実質的にＰａｉｖａらがＪ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：２３３８（１９９３）の中で示している方法と同じである。ＳＤＳ −ＰＡＧＥ後の消化物の抗-ＶＡＭＰ抗体プローブによるウエスタンブロッティングまたはタンパク質染色による半定量検定をしたところ、ウシＳＳＶｓとともに組換え（１００ｎＭ）または基準（５０ｎＭ）Ｌ鎖タンパク質をインキュベートすることによってＶＡＭＰのタンパク質分解開裂が生じた。Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖は、濃度２．３μＭであってもプロテアーゼとして不活性であることが判明した。この結果はＧｌｕ²³⁴ がＴｅＴｘ-Ｌ鎖の酵素活性にとって必須であることを裏付けた。天然および組換えＬ鎖の相対活性をより正確に定量するために、ヒトＶＡＭＰ -２の３３-９４残基に対応する合成６２-残基ポリペプチド、ＨＶ６２、の開裂の測定にＲＰ-ＨＰＬＣを用いた。実施例４では、ＨＶ６２ペプチド基質を用いて天然および組換えＬ鎖のインビトロ活性を定量するための手順を説明する。実施例４天然および組換えＴｅＴｘ-Ｌ鎖タンパク質のタンパク質分解活性の定量５ｍＭＤＤＴを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、２００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）のＨＶ６２ペプチドのストック溶液（最終濃度４０μＭ、最終容量６０μｌ）を調製Ｌ鎖（最終濃度１００ｎＭ）とともに３７℃でインキュベートした。所定時間間隔で、５ｍＭエチレンジアミン-四酢酸（ＥＤＴＡ）６０μｌおよび１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２）を添加して反応を停止し、続いて遠心分離を行った。試料は分析にかけるまで−２０℃で保存した。ＨＶ６２加水分解の進行度を、０−６０％アセトニトリル勾配を用い、０．０５％ＴＦＡ中で平衡化したマイクロパックス（Micropax）Ｃ₁₈カラム上で逆相高圧液体クロマトグラフィーによりＡ_220nmをモニターしながら測定した。ＳｃｈｉａｖｏらがＥＭＢＯＪ．１１：３５７７（１９９２）に発表した知見と同じく、Ｇｌｕ⁷⁶およびＰｈｅ⁷⁷の間のただ１つのタンパク質分解部位が開裂生成物のＮ末端配列決定によって確認された。ＨＶ６２加水分解の割合を７７−９４残基に対応した分解生成物のピーク高さから算出した。生成物の既知量をピーク高さに関連付けた直線標準曲線を、定量のために用いた。分離した開裂生成物（７７−９４残基）の定量、すなわち天然Ｌ鎖によるポリペプチドの時間および濃度依存加水分解、は図２に示す通りである。組換えＬ鎖（２５０ｎＭ）によるＨＶ６２基質（４０μＭ）の開裂はそのタンパク質分解活性により確認した。しかしながら、基準Ｌ鎖タンパク質で観察されるのと同じレベルの加水分解（ｎ＝４）を生じさせるには、２．５倍高濃度の組換えＬ鎖が必要となる。この特定の条件下では、１００ｎＭ天然および組換えＬ鎖の３７℃での基質開裂の初速度は、それぞれ４５．６±３．６および２１．６±２．４ｐｍｏｌ／ｍｉｎであった。さらに重要なことには、Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖を２．５μＭで３時間インキュベートしたときには、ポリペプチド（４０μＭ）のタンパク質分解は検知されなかった。この後者の発見は、Ｇｌｕ²³⁴がＴｅＴｘ-Ｌ鎖の酵素活性に必須であることを裏付けた。Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖変異体を特徴づけるタンパク質分解活性の欠落は、Ｌ鎖が基質に結合できないか、あるいはペプチド結合（Ｇｌｕ、Ｐｈｅ）を開裂することができないかのいずれかに起因する。２つの可能性を区別するために、Ａｌａ²³⁴ Ｌ鎖の、天然Ｌ鎖によるＨＶ６２基質の開裂を減じる能力について調べた。これは、天然Ｌ鎖を添加する前に、前もってＨＶ６２とＡｌａ²³⁴Ｌ鎖をインキュベートするという単純な試験により行った。この試験を行うために、反応緩衝液中で９μＭＨＶ６２を、４．５μＭＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖とともに、１５０ｎＭ天然Ｌ鎖を添加する前に前もって３７℃で１時間インキュベートした。反応を止めたところで、上記したように試料中の基質開裂を分析した。この試験の結果から、Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖変異タンパク質が存在すると、天然Ｌ鎖の活性が５０％以上も減少することが判明した（図２、挿入部）。この結果から、変異Ｌ鎖はペプチドに結合する能力は維持しており、それゆえ天然Ｌ鎖のタンパク質分解活性を阻害していることが判明した。Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖が検知し得るタンパク質活性を有していないことが証明されたので、我々は、天然Ｈ鎖および不活性Ｌ鎖成分を会合した２本鎖分子の特性を調べた。毒素タンパク質Ｈ鎖は細胞表面レセプターに結合するのに大きく貢献するので、基質をタンパク質分解する能力を喪失した２本鎖毒素はおそらく細胞表面に結合する能力を維持しており、またインターナリゼションされると我々は推論した。このような２本鎖種は、神経細胞にさまざまな化合物類（chemical speci es）を運ぶ輸送体として用いることに容易に応用し得る。実施例５では、天然Ｌ鎖、組換え野生型Ｌ鎖またはＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖のいずれかを合体させた２本鎖ＴｅＴｘを調製する方法について説明する。実施例５天然Ｈ鎖と組換えＬ鎖からのＴｅＴｘの再会合ＷｅｌｌｅｒらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１８２：６４９（１９８９）で詳述したようにＴｅＴｘより精製した天然Ｈ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖、組換え野生型Ｌ鎖またはＡｌａ²³⁴Ｌ鎖のいずれかに結合させた。２Ｍ尿素、２０ｍＭＤＤＴ、１ＭＮａＣｌおよびトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．４）に対して攪拌しながら１８時間その混合物を透析し、さらに５０ｍＭトリス-ＨＣｌおよび６００ｍＭグリシン（ｐＨ８．４）に対して攪拌せずに７２時間透析した。１アリコート（３００μｇ）を２５ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）の入ったＨＰＬＣＤＥＡＥカラムにかけ、ＮａＣｌ勾配（０−１Ｍ）を有する同じ緩衝液で溶離した。共有結合再構成（covalent reconstitution）の程度は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび銀染色法により確認した。２本鎖種（dichain species）の再会合は、天然ＴｅＴｘと同様に泳動した高Ｍ_rタンパク質染色バンドの存在により確認した。組換え野生および変異Ｌ鎖について、銀染色ゲルのデンシトメトリックスキャンにより確認したところ、２本鎖種（dichain species）の相対量は５５．１および５６．８％であった。天然Ｈ鎖およびＬ鎖は同等レベルの再構成を示した。後者は、ＤＴＴによる還元で毒素がフリーＨ鎖およびＬ鎖にもどったので鎖間ジスルフィド結合を有していた。２本鎖毒素分子の再会合ができたので、組換えＬ鎖を含有した２本鎖の生物活性を調べた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析によれば、２本鎖種は再会合していたが、これのみでは、再構成タンパク質は適切に折りたたまれ、あるいは適切に鎖間または鎖内ジスルフィド結合が形成されて活性毒素を生成しているとはいいきれない。そこで、毒素活性について作用検定を行う必要があった。実施例６では、再会合した２本鎖毒素の生物活性を検定する方法を説明する。実施例６再会合ＴｅＴｘ２本鎖毒素のバイオアッセイＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒらがＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ５８：１３２３（１９９０）で示したようにして、２本鎖毒素または他の試料をマウス（２０ｇ）の首の背側部分に皮下注射（２００μ／匹）し、ＭａｉｓｅｙらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７：６８３（１９８８）に示したようにして、ＬＤ₅₀値を決めた。この実験の結果を表２に示す。表２から明らかなように、Ａｌａ²³⁴-Ｌ鎖および天然Ｈ鎖から再構成された２本鎖種は、Ｈ鎖のみよりも毒素活性がなかった。天然Ｈ鎖と組換えＬ鎖による再構成２本鎖は毒性を示すことから、この活性の欠如は再会合のプロセスに起因するものではない。ＨａｂｅｒｍａｎｎらがＮａｕｎｙｎ-Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓＡｒｃｈ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３１１：３３（１９８０）に示している神経筋の伝達物質をブロックするＴｅＴｘの局所的な作用を、インタクトな毒素に対する再構成試料の活性の評価に使用した。実施例７は、再構成２本鎖の神経筋伝達に対する影響を評価する方法について説明する。実施例７再構成されたＨ鎖および組換えＴｅＴｘ-Ｌ鎖またはＡｌａ²³⁴-Ｌ鎖の神経筋伝達に対する影響マウスの左横隔膜神経半横隔膜調製物からの再構成２本鎖によるアセチルコリン放出の抑制を、ｄｅＰａｉｖａらがＦＥＢＳＬｅｔｔ．２７７：１７１（１９９０）に示したようにして、神経誘発性筋緊張（muscle tension）として測定した。完全麻痺に至るまでの時間として、毒素を加えてから、筋緊張が元の最大反応の１０％まで低下したときのポイントまでを記録した。試験手順は、ＰａｉｖａらがＪ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：２３３８（１９９３）に概略を示しているような方法を採った。この試験の結果を図３に示す。天然Ｈ鎖とＬ鎖から生じる毒素では完全麻痺に至るまでに２４０秒要するところ、ＴｅＴｘは１５０秒以内に神経誘発性筋緊張を失わせた。この結果は、ＴｅＴｘおよびＢｏＮＴ／Ａの天然毒素に関して、ＷｅｌｌｅｒらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：６４９（１９８９）で明らかにした、ＴｅＴｘとＢｏＮＴ／Ａから再構成した鎖の下部神経筋ブロッキング活性についての報告と一致するものである。組換えＴｅＴｘＬ鎖を天然Ｈ鎖と再構成すると、得られた２本鎖は、予想されたよりも１．５倍の効能を示した。４０ｎＭの組換え２本鎖は、完全麻痺に至らせるまでに、２０ｎＭ再構成天然２本鎖（図３、挿入部）と同じだけの時間を要しており、上記した発現Ｌ鎖（expressed L chain）の減少した酵素活性と一致する。マウスバイオアッセイにより、ＴｅＴｘもまた、再構成天然鎖（図２）よりもより毒性がある（１５倍）であることが判明した。さらに、再構成に組換え野生型Ｌ鎖を用いると、ＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒらがＦＥＢＳＬｅｔｔ．３２３：２１８に報告したレベルの近くまでさらに致死量（lethality）が低下した。最も意義深いのは、Ａｌａ²⁴³-Ｌ鎖と天然Ｈ鎖を使って再構成した２本鎖は、１００ｎＭで、６時間以上神経筋伝達に対し不活性であることが判明したことである。実施例８では、クロストリジウム属細菌神経毒素Ｌ鎖タンパク質に化学物質を共有結合により連結させる方法について説明する。この実施例では、細胞質からシナプス小胞へのアセチルコリンの取込みをブロックする医薬を、フリーＳＨ基を用いて輸送体に連結する。この工程での合成工程の概要を図４に示す。実施例８輸送体タンパク質とベサミコール（Vesamicol）との化学結合最初に、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはアセトニトリルなどの溶媒中の、それぞれ等モル濃度の塩基性触媒溶液（ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、トリエチルグアニジンなど）を用いて、ベサミコール（vesamicol）をリンカーである１-クロロプロピル１２-クロロ-ドデカン酸（dodecanoate）に結合する。反応は、０から１００℃の間の温度で、１〜４８時間行う。次に、上記したのと同じ溶媒中にヨウ化ナトリウム（触媒として用いた）の存在下、上記と同様の時間と温度で、得られたベサミコール-リンカー生成物を等モル量のマレイミドのカリウム塩と反応させる。組換え不活性Ｌ鎖と天然Ｈ鎖とを、およそ１５０ｋＤａ_rの２本鎖分子に復元する。復元は、等モル量のＬ鎖とＨ鎖タンパク質を尿素とＤＴＴの存在下で混合して行う。混合液は、実施例５で用いた透析緩衝液と同じ組成の緩衝液を用いて４℃で透析する。復元プロセス中は好ましくは緩衝液を酸素化するとよい。緩衝液は２４時間で５回取り替える。尿素とＤＴＴを除去するとＬ鎖とＨ鎖のジスルフィド結合が生じる。二本鎖のそれぞれは、医薬を結合することができるいくつかのフリーのスルフィドリル基を有する。輸送体を含む上記のトリス-ＮａＣｌに５倍モル以上のベサミコールリンカーを混合し、暗所に４℃で１〜２４時間の条件で、ベサミコールリンカーを、インタクト輸送体分子に存在するフリースルフィドリル基に結合させる。次に輸送体- ベサミコール試料はトリス-ＮａＣｌに対して一晩透析し、ベサミコール輸送体から余分なベサミコール-リンカー-マレイミドを除去する。医薬-輸送体物質は、治療上有効量を無菌注射として投与するのに利用できる。上記の修飾され、不活性化されたＴｅＴｘ神経毒素輸送体は多数の臨床用の適用があるであろう。例えば、これらの修飾された毒素は、人体の全身領域（gene ral area）での痙直に影響を及ぼす神経筋障害の治療に有用であろうと考えられる。この機能障害には、痙性斜頸、ポストストロークまたは外傷性脳損傷により誘発される痙直が含まれるが、これらに限定はされない。実施例９では、上記の化学的に修飾され、不活性化されたＴｅＴｘ輸送体を、毒素レセプターをもつ神経単位に化学物質を運ぶための治療用医薬として用いる方法について説明する。実施例９修飾された毒素の治療適用：痙性斜頸（頸部のジストニー）首筋系の痙性または緊張性収縮で、頭、顎のステレオタイプ異常偏向（deviat ions）を生じて、片方に回旋し、また肩が回旋した頭の脇まで持ち上がっているような症状が現れている痙性斜頸を患う４５歳の女性に、当業者が知っている適切な医薬を、不活性なテタヌストキシン輸送体に結合させて、症状のでている筋肉へ治療有効量を直接処置する。３−７日後には症状はかなり緩和し、例えば、患者は自分の頭と肩を正常な位置に保つことができ、あるいは痛みや不快感が著しく軽減される。実施例１０では、上記不活性なＴｅＴｘ輸送体を、毒素レセプターをもつ神経単位に化学物質を運ぶための治療用医薬として用いる方法についてさらに説明する。実施例１０修飾された毒素の治療適用：ポストストロークまたは外傷性脳損傷により誘発される痙直外傷性脳損傷を患う２４歳の青年男性は、動きを制限し、またリハビリテーションや衛生（hygiene）の妨げとなるほど上肢および下肢痙直が進行している。症状には、患者や付添人が衛生の困難をもつほどの重度の手のクロージング（cl osing）、腰のカーリング（curling）および脚のクロージング（closing）も含まれる。さらに、肢の痙性は理学的リハビリテーションの妨げとなり、また筋肉の痙攣や関節の不動化を引き起こす。当業者が知っている適切な医薬を不活性なテタヌストキシン輸送体に結合させ、治療上有効な量の無菌注射液を、症状のでている筋肉へ直接投与する。これらの症状の軽減が７−２１日中に現れ、下肢はリラックスして患者や付添人が通常の衛生を保てるようになる。脳血管卒中（cerebral vascular event(stroke)）を患う７０歳の女性は下肢痙直が進行して、衛生を保つために多大な努力を要する。患者の両肢に、当業者が知っている適切な医薬を、不活性なテタヌストキシン輸送体に結合させて、患者の両肢に治療上有効な量を直接注射する。注射は、症状のでている筋肉へ直接行う。これらの症状の軽減が７−２１日中に現れ、下肢はリラックスして患者や付添人が通常の衛生を保てるようになる。以上の説明での結果および結論は、主に修飾されたＴｅＴｘ輸送体の生成、性質決定、使用に関連しているが、修飾されたＢｏＮＴ／Ａ輸送体に関しても同様な結果が得られている。我々がＢｏＮＴ／Ａについてまず行ったのは、Ｌ鎖タンパク質をコードしている配列のサブクローニングであった。ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードしているＤＮＡ断片を、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子の５’および３’末端にアニールされるセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。増幅生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ⁺ ベクターに結合してプラスミド、ｐＳＡＬを作製した。以下の実施例に説明するように、２本鎖プラスミドの配列決定によって、クローン化されたＬ鎖遺伝子のヌクレオチド配列は基準となるＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖のものと同一であることが確かめられた。実施例１１では、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化するための方法について説明する。実施例１１ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子のサブクローニングＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードしているＤＮＡ配列を、５’-ＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡ-３’（配列番号５）および５’-ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＡ-３’（配列番号６）という配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲプロトコールによって増幅した。これらのプライマーを使えば、ＳｔｕＩとＥｃｏＲＩ制限部位を、ＢｏＮＴ／Ａ -Ｌ鎖遺伝子断片の５’末端と３末端にそれぞれ導入することができる。これらの制限部位は、後で増幅生成物の単一方向（unidirectional）サブクローニングに用いる。さらに、これらのプライマーは、Ｌ鎖をコードしている配列のＣ-末端に停止コドンを導入する。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（６３Ａ菌株）からの染色体ＤＮＡは増幅反応でのテンプレートとして用いられる。ＰＣＲ増幅は、１０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、デオキシヌクレオチドトリリン酸（ｄＮＰＴ）をそれぞれ０．２ｍＭ、プライマーをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、ゲノムＤＮＡを２００ｎｇおよびＴａｑ-ポリメラーゼ（Promega）を含む１００μｌ容量中で行った。反応溶液は、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３７℃、２分）、重合（７２℃ 、２分）を３５回繰り返す条件にかけた。最後にさらに７２℃で５分間、反応を延長した。ＰＣＲ増幅生成物は、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロース電気泳動で精製し、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ⁺に結合させてプラスミド、ｐＳＡＬを得た。このプラスミドを保有するバクテリアの形質転換体は、通常の方法によって分離する。クローン化されたＬ鎖ポリヌクレオチドの同定は、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（United States Bioche micals）を用い、製造業社の取扱説明書にしたがって２本鎖プラスミドの配列決定を行うことにより確認した。合成オリゴヌクレオチドの配列決定プライマーは、オーバーラップ配列決定を実行するのに十分なように用意した。クローン化された配列は、ＢｉｎｚらがＪ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６５：９１５３（１９９０）で、またＴｈｏｍｐｓｏｎらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：７３（１９９０）で明らかにした配列と一致することがわかった。ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性が落ちるように設定された部位特異的変異体もまた作成した。実施例１２では、変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードしているポリヌクレオチドを構築するために用いられる方法について説明する。実施例１２ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ポリヌクレオチドの変異誘発ＨｉｇｕｃｈｉらがＰＣＲプロトコール、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ、ＳｎｉｎｓｋｙおよびＷｈｉｔｅ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に示した方法の変法に従って鋳型としてクローン化されたＬ鎖ポリヌクレオチドを用い、ＰＣＲを介して、ＢｏＮＴ／ＡＧｌｕ²²⁴をＧｌｎに、またはＨｉｓ²²⁷をＴｙｒに変異誘発させた。Ｇｌｎ²²⁴変異体を作成するためのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列５’-ＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＡＴＡＣＡＴ-３ ’（配列番号７）および５’-ＡＴＧＴＡＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＣ-３’（配列番号８）を有するものを用いた。Ｔｙｒ²²⁷変異体を作製するためのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列５’-ＡＡＣＴＴＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＣ-３’（配列番号９）および５’-ＧＴＣＣＡＧＣＡＴＡＴＡＴＡＡＧＴＴ-３’（配列番号１０）を有するものを用いた。２回目のＰＣＲでは、プライマーとして配列番号５および配列番号６の配列を用いて、完全な変異遺伝子を増幅した。Ｇｌｎ²²⁴変異を有する増幅したポリヌクレオチドは、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ⁺ベクターに結合して、プラスミド、ｐＳＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴を作成した。Ｔｙｒ²²⁷変異変異を有する増幅したポリヌクレオチドは、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＳａｍＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ⁺ベクターに結合して、プラスミド、ｐＳＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷を作成した。組換えＬ鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれのプラスミドから開裂し、バクテリア中での融合タンパク質生成を促進するために、原核生物発現ベクターに結合した。マルトースバインディング融合タンパク質の発現を高レベルにする能力のある発現ベクターを作成するために、ｐＭＡＬ-ｃ２ベクターを用いた。実施例２１（後記参照）に開示したとおり、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の生成に、ｐＧＥＸ-２Ｔベクター（Phmacia）を同様に用い、同じく良好な結果を得た。我々は、ＧＳＴ融合タンパク質を生成し試験したが、都合のよいことに、マルトースバインディングドメインを結合した融合タンパク質は、極めて容易に精製することができることを見いだした。ここで説明した発現構築物のすべてのＬ鎖タンパク質コーディング配列は、ベクターが有するＩＰＴＧ-誘導Ｐ_taqプロモーターの転写調節下にあった。実施例１３では、バクテリアのホスト細胞中で、ＢｏＮＴ／Ａ野生型および変異Ｌ鎖を発現するプラスミドを構築するために用いる方法を説明する。実施例１３組換えＢｏＴＮ／Ａ-Ｌ鎖発現プラスミドの構築ｐＳＡＬ、ｐＳＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴およびｐＳＡＬ−Ｔｙｒ²²⁷プラスミドによって担持される、ＢｏＮＴ／Ａ野生型および変異型Ｌ鎖ポリヌクレオチドは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して切除し、プラスミドｐＣＡＬ、ｐＣＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴およびｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷を生成するために、ｐＭＡＬ-ｃ２発現ベクター（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）のＢａｍＩおよびＳａｌＩ部位の間に結合した。ｐＣＡＬプラスミドを図５に示す。ｐＣＡＬ、ｐＣＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴およびｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷プラスミドは、上記で明らかなように、１コドンの変異を除いては同一である。ｐＭＡＬ-ｃ２ベクターは、ＩＰＴＧ-誘導Ｐ_ta _c プロモーターの転写調節下でマルトースバインディングタンパク質（ＭＢＰ）をコードするＭａｌＥ遺伝子を保有する。このプラスミド内の多重クローニング部位（ＭＣＳ）によって、ＭａｌＥをコードしている配列の３’末端で、Ｌ鎖をコードしている配列のサブクローニングをすることができる。重要なのは、ファクターＸ_aプロテアーゼ開裂配列が融合タンパク質のＭａｌＥとＬ鎖配列との間に存在することである。発現プラスミドを保有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１は通常の方法により分離した。ｐＣＡＬ、ｐＣＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴およびｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷ラスミドの構造は、制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動により確かめた。ＤＮＡ配列分析により、これらのプラスミド中に存在する挿入片（inserts）は、基準（authentic ）Ｌ鎖遺伝子の翻訳リーディングフレイムについて正しい方向にあることが確認された。また配列分析により、予想どおり、Ｌ鎖遺伝子の５’末端は、ＭＣＳとファクターＸ_aの開裂部位に７つのアミノ酸をコードする短い配列を介して融合されたことが確認された。さらに、ＤＮＡ配列決定の結果は、Ｌ鎖配列と連結されたＭａｌＥ配列は同じ翻訳リーディングフレームにあることを示した。組換えＬ鎖をコードしている発現プラスミドを保有するバクテリアのクローンを利用することで、野生型および変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖タンパク質双方の有用量を生成することが可能となった。野生型および変異Ｌ鎖融合タンパク質の生成および精製には同様の手法が採られた。以下に続く実施例では野生型およびＴｒｙ²²⁷変異融合タンパク質を用いる手法を説明するが、同一の方法をＧｌｎ²²⁴変異を有する融合タンパク質の生成にも適用することができた。実施例１４では、ｐＣＡＬおよびｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷プラスミドを保有するバクテリア内での野生型および変異Ｌ鎖の発現を確かめるために用いる方法について説明する。実施例１４ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合プロテインの発現ｐＣＡＬまたはｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷のいずれかを保有するバクテリアのコロニーを充分に分離して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと２％（ｗ／ｖ）グルコースとを含むＬ-ブロースに接種し、３０℃で１晩振盪培養した。１晩培養した培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なＬ-ブロースで１：１０に希釈し、２時間インキュベートした。最終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することにより、融合タンパク質発現を誘導した。さらに３０℃で４時間インキュベートした後、６０００×ｇで１０分間遠心分離を行うことによりバクテリアを収集した。スモールスケールＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により、ＩＰＴＧ-誘導バクテリア由来の試料中に９０ｋＤａのタンパク質が存在することが確認された。このＭ_rは、ＭＢＰ（〜４０ｋＤａ）およびＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖（〜５０ｋＤａ）という成分を有する融合タンパク質の予期されたサイズに一致した。さらに、コントロール培養物と比較したところ、ＩＰＴＧ-誘導クローンは融合タンパク質をより多量に含んでいた。またＩＰＴＧ-誘導バクテリアの抽出物中に所望の融合タンパク質が存在することは、また、ＣｅｎｃｉｄｉＢｅｌｌｏらがＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：１６１（１９９３）に示したポリクローナル抗-Ｌ鎖プローブを用いるウエスタンブロッティングにより確認した。ＰＶＤＦ膜（Pharmacia; Milton Ke ynes,UK）上の反応バンドは、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗-ウサギ免疫グロブリン（Bio-Rad;Hemel Hempstead,UK）とＥＣＬ検知システム（Amersham,UK）を用いて視覚化した。ウエスタンブロッティングの結果、フルサイズの融合タンパク質よりもＭ_rの低いタンパク質に対応するいくつかのかすかなバンドと共に優勢融合タンパク質の存在が確認された。この観察により、バクテリア中でまたは分離過程中に融合タンパク質の限定分解が生じたことを示唆された。分離過程中に１ｍＭまたは１０ｍＭのベンズアミジン（Sigma;Poole, UK）を用いても、このタンパク質分解は避けられなかった。上記過程により分離したインタクト融合タンパク質の収率は、ここで説明したすべての過程で適切に保たれた。染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルによる見積もりでは、ＩＰＴＧを用いて誘導したバクテリアクローンから、培養物のリッターあたり５−１０ｍｇのＭＢＰ-野生型または変異Ｌ鎖融合タンパク質が得られた。ここに示したＢｏＴＮ／Ａ-Ｌ鎖融合タンパク質の生成方法は、限定タンパク質分解が生じるとはいえ極めて効果的である。ｐＣＡＬおよびｐＣＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷発現プラスミドによりコードされたＭＢＴ-Ｌ鎖融合タンパク質は、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによりバクテリアから精製された。組換え野生型または変異Ｌ鎖は、ファクターＸ_aを用いた部位特異開裂により融合タンパク質の糖バインディングドメインから分離した。この開裂過程により、フリーＭＢＰ、フリーＬ鎖および少量の開裂してない融合タンパク質が得られる。このような混合物中に得られたＬ鎖が所望の作用を有することが明らかとなったが、我々はさらに精製を行った。すなわち、開裂した生成物の混合物をＭＢＴと開裂してない融合タンパク質の両方を結合する２回目のアミロースアフィニティーカラムを行った。フリーＬ鎖は、アフィニティーカラムにはとどまらず、以下に説明する実験に用いるために分離された。実施例１５では、バクテリアのクローンから、野生型およびＴｙｒ²²⁷変異組換えＢｏＮＴ軽鎖を生成および精製するために用いられる方法を説明する。実施例１５融合タンパク質の精製および組換えＢｏＮＴ／Ａ−Ｌ鎖の単離野生型または変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖タンパク質のいずれかを発現しているバクテリアの培養物１リッターからのペレットを、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むカラム緩衝液［１０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ］に再懸濁し、超音波処理により溶菌させた。溶菌液は、１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して清澄化した。上澄みをアミロースアフィニティーカラム［２×１０ｃｍ、３０ｍｌ樹脂］（New England BioLabs;Hitchin、UK）にかけた。結合しなかったタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度の安定により判断して、タンパク質が溶出しなくなるまでカラム緩衝液で樹脂を洗浄した。その後、結合したＭＢＰ -Ｌ鎖融合タンパク質を１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液で溶離した。融合タンパク質を含む画分をプールし、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂ および１ｍＭＤＴＴを配合した２０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して、４℃で７２時間透析した。融合プロテインを、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂および１ｍＭＤＴＴを配合した２０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に対して透析すると同時に、ファクターＸa（Promega;Southampton、UK）を用い、酵素：基質割合を１：１００として切断した。透析は、４℃で２４時間行った。切断により得られたＭＢＰと、野生型または変異Ｌ鎖のいずれかとの混合物をカラム緩衝液で平衡化した１０ｍｌアミロースカラムにかけた。Ｌ鎖が含まれている試料を特定するため、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析用に素通り画分のアリコートを調製した。素通り画分の残りは−２０℃で保存した。Ｅ．ｃｏｌｉの総抽出物または精製タンパク質をＳＤＳ中で可溶化し、通常の方法に従ってＰＡＧＥにかけた。この結果、組換え毒素断片が試料のタンパク質含量のおよそ９０％をしめることが示された。上記結果は、ここで説明したＭＢＰ-Ｌ鎖融合プロテインを作成するアプローチは、野生型および変異組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を生成するのに効果的なものとなり得ることを示した。さらに、これらの結果は、組換えＬ鎖は、マルトースバインディングドメインから分離しその後精製することができることを証明した。これらの結果は組換えＬ鎖のある構造的特性を直接的に扱ったものであるが、これらのタンパク質の機能的特性について定めることが残った。したがって、我々は、野生型および変異組換えＬ鎖の酵素活性を調べることを行った。組換えＬ鎖生成物とそれに対応する天然のものの酵素活性を比較するために、感受性抗体ベースアッセイ（sensitive antibody-based assay）を開発した。アッセイでは、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位に対応するインタクトなＳＮＡＰ-２５のＣ-末端部に特異性を有する抗体を用いた。ＳＮＡＰ-２５のＢｏＮＴ／Ａ開裂の反応生成物のウエスタンブロッティングにより、抗体がＳＮＡＰ-２５サブフラグメントに結合することができないことが明らかとなった。このように、以下の実施例で用いた抗体試薬は、インタクトＳＮＡＰ-２５のみを探知した。加えたＢｏＮＴ／Ａ軽鎖またはその組換え体によるＳＮＡＰ-２５タンパク質分解のインディケーターとして抗体結合の喪失は役立った。実施例１６では、天然および組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖がともにＳＮＡＰ-２５基質をタンパク質分解するが、Ｔｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖はしないことを明らかにするために用いる方法について説明する。なお、この実施例ではＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖を用いたが、Ｇｌｕ²²⁴変異Ｌ鎖もＳＮＡＰ-２５開裂アッセイにおいて同じ結果を与えた。実施例１６ＳＮＡＰ-２５基質に対する組換えＬ鎖タンパク質分解の評価野生型および変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖、ならびにそれらの組換え類似体の能力を比較するために、ＳＮＡＰ-２５基質を開裂させる定量アッセイを行った。このアッセイのために用いられた基質は、ｐＧＥＸ-２Ｔベクターを用いて発現させ、グルタチオンアガロースのアフィニティークロマトグラフィーで精製して、トロンビンで開裂する部位を含むグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ） -ＳＮＡＰ-２５融合タンパク質を調製して得た。トロンビンを用い、１５０ｍＭＮａＣｌおよび２．５ｍＭＣａＣｌ₂を含む５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６７：３１（１９８８））中で、酵素：基質割合を１：１００として、ＳＮＡＰ-２５を融合タンパク質から切断した。切断されなかった融合タンパク質と開裂したグルタチオン-インディングドメインは、ゲルに結合させた。組換えＳＮＡＰタンパク質は同緩衝液を用いて溶離し、１００ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）に対して、４℃で２４時間透析した。総タンパク質濃度は一般的な方法で測定した。ＳＮＡＰ-２５のＣ-末端部に対して特異性のあるウサギポリクローナル抗体を、アミノ酸配列、ＣＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ（配列番号１１）を有する合成ペプチドに対して生じさせた。このペプチドは、シナプス原形質膜タンパク質の１９５から２０６残基および天然ＳＮＡＰ-２５には見られないＮ-末端システイン残基に対応するものである。抗原性を改良するために、マレイミドベンゾイル- Ｎ-ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）をクロス-リンクキング試薬（Si gma;Poole、UK）として、合成ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma; Poole、UK）結合させた（Liu et al.,Biochemistry18:690(1979)）。クロス-リンカーとしてエチル-３-（３-ジメチルプロピル）カルボジイミドを用いてヨード酢酸で活性化されたアミノアルキルアガロース樹脂にＮ-末端システイン残基を介して結合された抗原ペプチドを有するカラム（Bio-Rad;Hemel Hempstead、UK）を用いて抗-ペプチド抗体のアフィニティー精製を行った。２５ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液でカラムを連続洗浄した後、ペプチド-特異性抗体を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）および２００ｍＭＮａＣｌの溶液を用いて溶離し、０．２ｍｌの１Ｍトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中和緩衝液の入ったチューブに収集した。すべての野生型または変異型Ｌ鎖を含む組換え調製物を、酵素活性を測定する前に、０．０２％ルブロールと１０μＭ酢酸亜鉛を含む１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４℃で１晩透析した。前もって、これらの透析された試料だけではなく、２０ｍＭＤＴＴを用いて３７℃、３０分間還元したＢｏＮＴ／Ａを、１ｍＭのＤＴＴを加えた同ヘペス緩衝液で異なる濃度に希釈した。５μｌの組換えＳＮＡＰ-２５基質（最終濃度８．５μＭ）を含む反応混合物には、および２０μｌ還元ＢｏＮＴ、組換え野生型Ｌ鎖またはＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖のいずれかが含まれた。すべての試料を、２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と５ｍＭＥＤＴＡの水溶液２５μｌで反応を停止させる（Foran et al.,Biochemi stry33:15365(1994)）前に、３７℃で１時間インキュベートした。それぞれのサンプルのアリコートを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液を加えて煮沸することにより、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびポリクローナルＳＮＡＰ-２５抗体を用いたウエスタンブロッティング用に調製した。抗ＳＮＡＰ-２５抗体の反応性は、ＥＣＬ検出システムでモニターし、デンシトメトリックスキャンニングによって定量した。図６に示されるように、ウエスタンブロッティングの結果、精製した変異Ｌ鎖と、天然または組換え野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖のいずれかとではタンパク質分解活性に明かな違いが示された。組換え野生型Ｌ鎖は、反応中正の対照として供される還元ＢｏＮＴ／Ａ天然Ｌ鎖より効果がやや低いが、明らかにＳＮＡＰ-基質を開裂した。対照的に、Ｔｙｒ²²⁷変異体は検定において実質的にタンパク質分解活性を示さなかった。このようにして、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性形態は組換え手段により生成、分離された。さらに、Ｌ鎖タンパク質中のアミノ酸のひとつを置換すると、シナプス末端タンパク質を分解する組換えタンパク質の能力が失われた。後に示すが、我々はクロストリジウム属細菌神経毒素内のアミノ酸の位置を１つ以上変異させて、同じ効果を得られることも発見した。野生型組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の生物活性の予備的な試験として、ジギトニン-透過性ウシアドレノクロマフィン（adrenochromaffin）細胞からのＣａ²⁺-励起（evoked ）カテコールアミン放出を低減するＭＢＬ-Ｌ鎖融合タンパク質の能力を試験した。インタクトまたはフリーＭＢＰおよび組換えＬ鎖を含む混合物を生成するためにファクターＸ_aで開裂した野生型組換えＬ鎖融合タンパク質は、天然ＢｏＮＴ／Ａによる抑制と同等のＣａ²⁺-刺激放出の用量依存性抑制を誘発し、矛盾はなかった。実施例１７では、クロマフィン細胞（chromaffin cell）からのカテコールアミン放出を抑制するＢｏＮＴ／Ａ融合タンパク質の能力を検定するために用いる方法を説明する。実施例１７透過性クロマフィン細胞からのカテコールアミン放出を抑制する組換えＬ鎖融合タンパク質の能力の検定クロマフィン細胞を、ＬｉｖｅｔｔがＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４：１１０３（１９８４）で示した方法を用いてプロテアーゼ灌流（protease perfusion）によりウシの副腎から調製した。細胞を、１０％ウシ胎児血清、８μＭフルオロドキシウリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μＭシトシンアラビノフラノシド、２．５μｇ／ｍｌファンジゾーン（fungizone）、２５国際単位／ｍｌペニシリン、２５μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを加えたダルベッコ修正イーグル培地の入った２４-ウエルプレートに、１×１０⁶細胞／ウエルとなるようにプレートした。試験は、プレート後３−８日間行った。Ｃａ²⁺励起カテコールアミン放出を蛍光光度法により測定した。図７に示すようにこの予備試験の結果は、組換え野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合タンパク質と野生型組換えＬ鎖のファクターＸ_a開裂生成物を含む混合物の双方が、都合のよいことにこれらの天然ＢｏＮＴ／Ａ毒素に似た生物学的特性を示した。そこで、組換えＬ鎖に上記のようなこれらの特性が欠けているかどうかを調べることに関心が生じた。一点の変異が組換えＬ鎖のタンパク質分解活性を喪失させることから、我々は、不活性なＢｏＮＴ／Ａ天然毒素を作成する手段として、変異Ｌ鎖を合体した二本鎖分子の再構成をさらに進めた。親融合タンパク質の糖バインディングドメインが欠落している、精製組換え野生型およびＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖を、ＢｏＮＴ／Ａから分離した天然Ｈ鎖と再構成した。約１５０ｋＤａのジスルフィド-連結２本鎖の形成は、非還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより確認された。定量分析により、組換えＬ鎖は天然Ｈ鎖タンパク質と再会合し、天然Ｌ鎖タンパク質よりは低い効率で２本鎖毒素を形成したことが明かとなった。この違いは、組換えタンパク質と天然タンパク質の折り畳み構造の違いを表していると考えられる。実施例１８では、ＨおよびＬ鎖を有する２本鎖毒素を再会合するために用いられる方法を示す。天然、組換え野生型または変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖のいずれかを合体させた２本鎖は、この方法手順で再会合される。実施例ではＴｙｒ²²⁷を用いているが、当業者であれば同じ手順で他の変異Ｌ鎖を天然Ｈ鎖に会合することができるであろう。実施例１８天然Ｌ鎖、組換え野生型またはＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖と、精製Ｈ鎖との再構成ＢｏＮＴ／Ａ（List Biological Inc.;Campbell,USA）から天然Ｈ鎖とＬ鎖とを、２Ｍ尿素を用いて分離し、１００ｍＭＤＴＴで還元し確立したクロマトグラフの手法（Kozaki et al.,Japan J.Med.Sci.Biol.34:61(1981); Maisey et al .,Eur.J.Biochem.177:683(1988)）に従って精製した。精製したＨ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖、組換え野生型Ｌ鎖またはＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖のうちのいずれかと結合した。再構成は、試料を２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５０μＭ酢酸亜鉛および１５０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液に対して、４℃で４日間透析して行った。透析に続き、ジスルフィド結合した１５０ｋＤａ２本鎖を形成した組換えＬ鎖と天然Ｈ鎖の結合をＳＤＳ-ＰＡＧＥで検出し、デンシトメトリックスキャンにより定量した。組換えＬ鎖を用いて形成された２本鎖の割合は、天然Ｌ鎖をを用いて得られた場合よりも低かった。実際のところ、組換え野生型または変異Ｌ鎖は約３０％が再構成されたのに対して、９０％以上の天然Ｌ鎖がＨ鎖と再会合した。このように再構成の効率は低いが、組換えＬ鎖を合体させた物質は、以下の機能的な研究用に容易に生成された。変異Ｌ鎖を保有する二本鎖分子は、インビトロで生理学的に検定すると、天然または野生型組換えＬ鎖のいずれかを有する再会合２本鎖と比べて新規な特性を有していた。透析に続いて、本実施例で示した再構成物質を、マウスの半横隔膜の横隔神経（phrenic nerve-hemidiaphragms）を浸した培地に投与した。いかに示すとおり、天然または野生型組換えＬ鎖のいずれかを用いて再構成した２本鎖は、この検定において効果的に神経筋伝達をブロックした。対照的に、変異Ｌ鎖を用いて再構成された２本鎖分子は、全く不活性であった。実施例１９では、組換えＬ鎖を合体させた再構成２本鎖毒素の変更された機能的特性を明らかにするために用いる方法について説明する。実施例１９再構成毒素の神経筋伝達における効果の評価マウスの半横隔膜の横隔神経（phrenic nerve-hemidiaphragms）をＢａｌｂ／Ｃマウス（２０−２５ｇ）から切除し、ＮａＣｌ、１１８．０；ＫＣｌ，４．７；ＭｇＳＯ₄、１．２；ＣａＣｌ₂、２．５；ＮａＨＣＯ₃、２３．８；ＫＨ₂ＰＯ₄ 、１．２；グルコース、１１．７、ｐＨ７．４（de Pavia et al，Biol.Chem.2 68:20838(1993)）（ｍＭ）からなる１０ｍｌのエアレーションしたクレブス-リンガー溶液の入った閉鎖型循環式スーパーフュージョンシステム（superfusion system）中に浸した。横隔神経の最大上刺激（supramaximal simulation）によって単収縮が誘発され、フォース-ディスプレイスメント変換器（force-displac ement transducer）（Simpson J.Pharmacol.Exp.Ther.212:16(1980)）を用いて測定した。図８に示した結果は、野生型組換えＬ鎖を用いて再構成した２本鎖毒素は、天然Ｌ鎖を用いて再構成した２本鎖とほぼ同様に神経筋伝達をブロックすることを示した。これらの再構成タンパク質による伝達の遮断は、ＢｏＮＴ／Ａの毒に侵されたシナプスの神経誘発筋緊張を一時的に回復させる電圧ゲートＫ⁺ チャンネルの遮断物である４-アミノピリジン（Simpson J.Pharmacol.Exp.Ther. 245:867(1988)）０．３ｍＭを投与すると消える。この知見は、組換えＬ鎖を含むサンプルによる阻害が、伝達物質放出のシナプス前の遮断によって生じることを明らかにした。すなわち、このアッセイでは、野生型組換えＬ鎖を含む２本鎖毒素はＢｏＮＴ／Ａの活性を擬態した。これに対してＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖を合体させた２本鎖物質は、たとえ高濃度で試験しても、神経誘発性単収縮（nerve-evoked muscle twitch）に何ら影響を及ぼさなかった。変異Ｌ鎖を含む２本鎖分子を特徴づける、この活性の欠落は、上記ＳＮＡＰ-２５開裂アッセイの結果と全く一致するものであった。重要なのは、半横隔膜-神経アッセイで得られた結果は、毒素の活性部位での、臨床的な関連モデルについての活性の喪失に拡大解釈できることである。組換えＬ鎖を合体させた２本鎖分子の特性についてさらに明らかにするために、これらの薬がマウスにボツリヌス中毒症状を引き起こす能力を試す実験を行った。実施例２０では、変異Ｌ鎖ではなく、天然または野生型組換えＬ鎖が合体した組換え２本鎖が、インビトロで神経毒素活性を有することを証明するための方法について説明する。実施例２０再構成毒素のマウス致死量検定およびその神経伝達に対する効果再構成２本鎖がボツリヌス中毒を引き起こす能力を以下のように実験用マウスの腹腔に注射して評価した。結果は、４日以内での致死量をｍｇタンパク質（ＬＤ₅₀／ｍｇ）で表した（Maisey et al.，Eur.J.Biochem.177:683(1988)）。野生型組換えＬ鎖を含む２本鎖物質の毒性（６×１０⁷ ＬＤ₅₀／ｍｇ）は、天然Ｌ鎖を用いて再構成した２本鎖の毒性（７×１０⁷ ＬＤ₅₀／ｍｇ）と同等であった。Ｔｙｒ²²⁷変異体を用いて再構成した２本鎖を注射したマウスには、４日以内ではボツリヌス中毒の症状が表れなかった。すなわち、ここに明らかにしたすべてのインビトロおよびインビボの検定では、Ｔｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖が活性を失っているのに対して、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた組換え野生型Ｌ鎖は、対応する天然物の能力と同等であることになる。ここに明らかにした方法に従って調製された組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の一般的な利用性を説明するため、我々はタンパク質分解活性を欠落した変異融合タンパク質の２つ目のセットを作成した。より具体的には、我々は、Ｇｌｕ²²⁴をＧｌｎにする変異誘発が野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖に伴う酵素活性を取り除くことを実証した。さらに、この実証においてＧＳＴ融合タンパク質を用いることによって、我々は、組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を生成する我々のアプローチの普遍性を確認した。実施例２１では、ＧＳＴタンパク質とのＧｌｎ²²⁴変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合体をコードするポリヌクレオチドを構築するために用いる方法について説明する。実施例２１ＧＳＴとのＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合体の調製と発現ＢｏＮＴ／Ａ野生型、Ｇｌｎ²²⁴変異およびＴｙｒ²²⁷変異Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドを実施例１１および実施例１２で説明したそのとおりに調製した。増幅生成物はＳｔｕＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミドｐＴＡＬ-野生型（ＧＳＴ）、ｐＴＡＬ-Ｇｌｎ²²⁴（ＧＳＴ）およびｐＴＡＬ-Ｔｙｒ²²⁷（ＧＳＴ）を生成するためにｐＧＥＸ-２Ｔ発現ベクター（Pharmacia）のＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に結合した。プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉＸＬ-Ｂｌｕｅ形質転換体を一般的な方法によって分離した。発現構築物を含むＥ．ｃｏｌｉの培養物は、実施例１４で説明したそのとおりにしてコードされた融合タンパク質を発現するように誘導した。細胞を溶菌した後、当業者がよく用いる方法にしたがって、ＧＳT融合タンパク質をグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。その後、インビトロアッセイでＧＳＴ融合タンパク質のタンパク質分解活性を試験した。実施例２２では、変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ＧＳＴ融合タンパク質のタンパク質分解活性を検定するのに用いる方法について説明する。実施例２２ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ＧＳＴ融合タンパク質の特徴分離したＧＳＴ変異Ｌ鎖融合タンパク質のＳＮＡＰ-２５基質に対するタンパク質分解活性を検定した。精製したＬ鎖融合タンパク質および組換えＧＳＴ-ＳＮＡＰ-２５基質を５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中２時間または１晩２２℃でインキュベートし、生成物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。分析結果によれば、変異体はＳＮＡＰ-２５類似体に対して検知できるタンパク質分解活性を発揮しないことが示された。対照的に、野生型組換えＬ鎖融合タンパク質は基質をタンパク質分解した。すなわち、ＧＳＴ変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合タンパク質は、ＭＢＰ変異体融合タンパク質のように酵素的に不活性であった。さらに、野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖配列を有するＧＳＴ融合タンパク質は、ＳＮＡＰ-２５基質に対して酵素的に活性であった。これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の保存されたＨＥｘｘＨモチーフを形成しているアミノ酸の重要性を確認するものであり、またＭＢＰ融合タンパク質以外の融合タンパク質を、本発明を実施するのに用いられる組換えタンパク質を生成するために用いることができることを実証するものであった。ＧＳＴ融合タンパク質として形成されようがＭＢＰ融合タンパク質として形成されようが、組換え変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖は、天然毒素あるいは組換え野生型Ｌ鎖と合体した再構成２本鎖を特徴づける活性が欠けていた。前記実施例では、いかにしてクロストリジウム属細菌神経毒素Ｌ鎖が組換え体において活性化または弱毒化された分子として発現するように設定され得るかを説明した。これらのＬ鎖は天然Ｈ鎖と再構成され、神経筋伝達のレベルで生物活性を有した、あるいは喪失した２本鎖分子が生成される。以下の実施例では、連結分子を生体内で運搬するための媒介手段として、２本鎖輸送体分子を用いることができる確かな証拠を提供する。ハイブリッド”３重鎖”分子はこの例示をするために用いられた。より具体的には、Ｇｌｎ²²⁴／Ｔｙｒ²²⁷の二重変異により不活性化されたＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖の活性部分に融合した。得られた組換えタンパク質は天然ＢｏＮＴ／Ａ-Ｈ鎖と再構成して、”３重鎖”が生成された。３重鎖複合体は標的神経に結合し、侵入する。２重変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖は酵素活性に欠けるので、３重鎖に関連する神経毒性は、必然的に活性ＴｅＴｘ成分の存在に帰することとなる。以下の実施例で提供される結果から、輸送体が標的細胞にインターナリゼーションされ、連結された分子を細胞質ゾルに運ぶことができ、また輸送されたタンパク質は細胞内で活性があったことを確認した。以下に示す生化学的な試験では、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖に関連するいかなる神経毒素活性も排した。実施例２３では、不活性なクロストリジウム属細菌神経毒素Ｌ鎖を含む輸送体が、末梢コリン作動性神経末端にインターナリゼーションされ得ることを証明するために用いる方法について説明する。さらに、以下に示された結果は、このような輸送体が、細胞内で生物活性を維持したまま、連結された分子を標的神経細胞の細胞質ゾルに運ぶ能力を有していることを示した。実施例２３生化学物質運搬用の媒介手段としてのクロストリジウム属細菌神経毒素輸送体３重鎖のＬ鎖成分は図９に示される機構にしたがって生成した。２重変異（Ｇｌｕ²²⁴をＧｌｎ²²⁴およびＨｉｓ²²⁷をＴｙｒ²²⁷）をＰＣＲ変異誘発によってＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖に導入した。プライマーおよび２重変異を生じさせるために用いた方法は、Ｇｌｎ²²⁴変異体を鋳型として用いた以外は、Ｔｙｒ²²⁷変異を生成するための方法と同じである。２重変異（ｄｍ）Ｌ鎖は、ｐＳＡＬｄｍを形成するために、まずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺ＩＩにクローン化し、その後ｐＣＡＬｄｍを得るためにｐＭＡＬ-ｃ２にクローン化した。マルトースバインディングドメインおよび２重変異を持つＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ドメインを有する融合タンパク質（ＭＢＰ-ＢｏＮＴ／Ａｄｍ）を発現させるためにｐＣＡＬｄｍ構築物を用いた。ｐＣＡＬｄｍ構築物は図９中では”１”として標識してある。ＴｅＴｘ-Ｌ鎖は、配列、５’-ＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＡＧ-３’（配列番号１２）を有するプライマーおよび５’-ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＴＧＴＡＡＡＴ-３’（配列番号１３）を有するプライマーと共に、クローン化した野生型遺伝子配列を保有するポリヌクレオチドを鋳型として用いて、ＰＣＲプロトコールにより端を切断した。増幅生成物は、Ｎ -末端に加えられた２つのアミノ酸をコードし、Ｇｌｙ³⁹⁹で切断された。通常、天然ＴｅＴｘではＨ鎖にジスルフィド結合するところに対応するＣｙｓ⁴³⁹を含む、最後の５８残基が切除された。ＢａｍＨＩで開裂した後、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＴＬ３９９を生成するためにＸｍｎＩとＢａｍＨＩで消化したｐＭＡＬ-ｃ２にクローン化した。ＭＢＡ-切断ＴｅＴｘ-Ｌ鎖-ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ｄｍ遺伝子融合体、ｐＣＴＬＡＬｄｍ、は、切り出したＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ｄｍ遺伝子を、ＢａｍＨＩ- とＳａｌＩ-とで消化したｐＣＴＬ３９９に結合させて作成した。図９で”２”として標識したｐＣＴＬＡＬｄｍ構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＭＢＰ-ＴｅＴｘ切断Ｌ鎖-ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖ｄｍ融合タンパク質を発現させるために用いた。ｐＣＡＬｄｍ構築物にコードされた、精製したＭＢＰ-ＢｏＮＴ／ＡｄｍのＬ鎖融合タンパク質は、実施例１６の方法にしたがって検定を行ったところ、組換えＳＮＡＰ-２５基質を開裂できなかった。すなわち、予想通り、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖２重変異融合タンパク質は酵素活性が欠落していた。ファクターＸ_aで融合タンパク質を開裂した後、２本鎖分子を形成するために、精製ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖２重変異体を天然ＢｏＮＴ／Ａ-Ｈ鎖と再構成した。実施例１９の方法により試験したところ、これらの２本鎖は、マウス半横隔膜で神経筋伝達をブロックすることができなかった。すなわち、これも予想通り、２重変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖が合体した２本鎖は、このインビトロアッセイにおいて生物活性を欠いていた。結局、実施例２０の方法にしたがってマウスに注射しても、２重変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖が合体した再構成２本鎖は、毒性はなかった。２重変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖が合体した２本鎖を、天然ＢｏＮＴ／ＡのＬＤ₅₀投与量の２００倍以上の量で注射しても毒性はなかった。これらの結果は、Ｇｌｎ²²⁴／Ｔｙｒ²²⁷２重変異により、天然ＢｏＮＴ／Ａ分子に関連するあらゆる毒性が除去されることを明らかにした。したがって、Ｌ鎖二重変異体が合体した輸送体に関連するいかなる毒素活性も、輸送体そのものには毒素活性がないのであるから、不活性なＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖に連結した分子に起因するはずである。したがって、２重変異ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖が合体した組換え２本鎖が、理想的なコリン作用性の輸送体として提供される。ｐＣＴＬＡＬｄｍにコードされ、精製されたＴｅＴｘ切断Ｌ鎖-ＢｏＮＴ／Ａ- Ｌ鎖ｄｍ融合タンパク質は、ＢｏＮＴ／ＡではなくＴｅＴｘの特性を有していた。より具体的には、ｐＣＴＬＡＬｄｍにコードされた融合タンパク質は、濃度に依存して、神経膜からシナプトブレビンを開裂する能力を示した。この活性はＢｏＮＴ／ＡＬ鎖成分によるものではなく、融合体の切断ＴｅＴｘ-Ｌ鎖成分によるエンドプロテアーゼ活性が保持されていることが強調される。想像どおり、ｐＣＴＬＡＬｄｍにコードされた融合タンパク質は組換えＳＮＡＰ-２５基質を開裂する能力が欠如していた。このことは、融合体のＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖成分に関連する酵素活性がうまく除去されていることを確認するものである。ｐＣＴＬＡＬｄｍにコードされた融合タンパク質をファクターＸ_aで開裂した後、分離したハイブリッド毒素を天然ＢｏＮＴ／Ａ-Ｈ鎖と再構成して、３重鎖を得た。最も重要なのは、作成された３重鎖が、インビトロおよびインビボ双方でのボツリヌス中毒の特徴的症状を示すことである。３重鎖は２ｎＭ濃度で、２４℃、１６１分間、マウス半横隔膜の神経誘発単収縮をブロックし、また１０⁷ ＬＤ₅₀ ／ｍｇ以上のマウスにおける毒性を与えた。しかしながら、”３重鎖”の存在量を正確に測定するのを妨げる再構成試料中のフリーＭＢＰ、開裂しなかった融合タンパク質およびいくらかの天然Ｈ鎖の存在により、このタンパク質の効能についての正確な量的データを提供することはできなかったことは注意すべきである。重要なことは、半横隔膜試験で３重鎖で観察されたブロックが、ＢｏＮＴ／Ａが誘発する神経筋伝達の抑制を消滅させるがＴｅＴｘによるものは消失させない電位ゲートＫ⁺チャンネルブロッカーである４−アミノピリジンにより消失しないということである。さらに、観察された毒性についてのＨ鎖（あるいは天然ＢｏＮＴ／Ａにいくらか混ざっているＨ鎖）の寄与は、神経筋麻痺活性の欠如がより多量のＨ鎖を再構成に使用し、３重鎖物質についてと同一に扱っても観察されなかったことから排除される。これらの結果は、輸送体が運動神経末端を標的とし、インターナリゼーションされて、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖に連結したものを細胞質ゾルに輸送する媒介手段として作用することができることを明らかにした。さらに、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖に連結したものは、コリン作用性神経への運送の後もその生物活性を維持した。このアセチルコリンを含む神経単位に医薬を運ぶシステムとして新規な輸送体の利用は明確に確立された。上記で説明したＬ鎖を修飾する手法に加え、実施例８に詳説した方法にしたがって、天然または組換えボツリヌス毒素Ｌ鎖タンパク質を化学物質に共有結合させることができる。得られた輸送体は、治療有効量の無菌注射剤として投与し得る。修飾されたＢｏＮＴ／Ａ毒素輸送体は、神経臨床的に適用されるであろう。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ-ベース輸送体は、治療的に有用な医薬を末梢運動神経に運ぶために用いることができる。したがって、この様式でこれらの医薬は限られた筋群を制御するために有用であろう。治療標的として研究されるであろう疾病としては、晩発性運動障害（tardive dyskinesia）、痙性結腸炎（spastic coliti s）、本態性振せん（essential tremor）、平滑筋異常（smooth muscle abnorma litie s）、局所性痙直（localized spasticity）、背中または他の筋群に限られた筋痙攣痛（painful muscle spasms）、一時的下顎障害（temporal madibular diso rder）、痙性発生困難（spasmodic dysphonia）、緊張性頭痛（tension headach es）が挙げられる。実施例２４では、いかにして上記化学的に修飾された不活性ＢｏＮＴ／Ａ毒素輸送体を、毒素レセプターを発現する神経に化学物質を運ぶ治療薬として用いることができるかについて説明する。実施例２４修飾された毒素の治療適用：晩発性運動障害トラジン（Thorazine）またはハルド（Haldo）などの抗精神病薬による治療で晩発性運動障害を患う４５歳の男性患者に、当業者が知っている適当な医薬を、不活性なボツリヌス毒素輸送体に結合させて、治療有効量を顔面筋に直接処置する。１−３日後、晩発性運動障害すなわち、口顔運動障害（orofacial dyskines ia）、アテトーシス（athetosis）、ジストニー、ヒョレア（chorea）、習性攣縮（tics）、しかめ面（facial grimacing）などが顕著に低減する。実施例２５ではさらに、いかにして上記化学的に修飾された不活性な毒素を、毒素レセプターを有する神経単位に化学物質を運ぶ治療用医薬として用いることができるかについて説明する。実施例２５修飾された毒素の治療適用：本態性振せん頭部や手の筋肉のリズミカル振動（rhythmical oscillation）および姿勢や動きの持続刺激という症状の現れている本態性振せんを患う４５歳の男性に、有効な医薬（出願書類中の前記表を参照）を不活性なボツリヌス毒素輸送体に結合させて、治療有効量を症状のでている筋肉に直接注射する。筋肉は筋電図検査（ＥＭＧ）も使って見極めればよい。１、２週間後には、症状、すなわち患者の頭部や手の振動は、かなり軽減される。実施例２６ではさらに、いかにして上記化学的に修飾された不活性ＢｏＮＴ／Ａ毒素輸送体を、毒素レセプターを有する神経に化学物質を運ぶ治療薬として用いることができるかについて説明する。実施例２６修飾された毒素の治療適用：平滑筋異常食道下部狭窄（病名アカラシア Achalasia）を患う３０歳の女性には、食物の経口摂取を妨げる症状が現れている。食道下部狭窄により食物や流動物が蓄積し、ついには逆流してしまって、患者は適切に栄養を採ることが妨げられる。医薬（出願書類中の前記表を参照）を不活性なボツリヌス毒素輸送体に結合し、治療有効量を症状のでている括約筋に直接投与する。普通、内視鏡を用いて、または手術中に、２から４四分円（quardrants）に注射する。約１−７日中には、逆流をなくすか抑制して普通に固形物や液体を胃に送り込むことができるようになる。実施例２７では、さらに、いかにして上記化学的に修飾された不活性ＢｏＮＴ／Ａ毒素輸送体を、毒素レセプターを有する神経単位に化学物質を運ぶ治療薬として用いることができるかについて説明する。実施例２７修飾された毒素治療適用：痙性ジストニー（声帯過剰反応）声帯の痙直によりはっきりとしゃべることができない４５歳の男性に、当業者が知っている適当な医薬を、不活性なボツリヌス毒素輸送体に結合させて、治療有効量の注射を声帯に施す。１から７日後には、患者ははっきりと話すことができる。実施例２７では、本発明の不活性なクロストリジウム属細菌神経毒素のもう一つの使用法を示す。さらにもう一つの使用法では、不活性な毒素をボツリヌス中毒または破傷風の治療に用いることができる。このような治療のために、不活性なクロストリジウム属細菌神経毒素を、カプトプリルや他の亜鉛プロテアーゼ阻害剤のようなボツリヌス中毒または破傷風に対する治療活性成分に結合する。ボツリヌス中毒または破傷風にかかった患者は、筋肉内注射のように治療有効量を投与して治療することができる。個々の輸送体／医薬結合体の適切な治療有効量は、当業者が容易に知り得る技術を用い経験的に決定することができる。また、不活性な毒素のみでも、ボツリヌス中毒毒素の症状を示す者に即効性解毒剤として用いることができる。この目的のために好ましくは、投与は少なくとも１ｍｇの不活性毒素を注射して行うとよい。高レベルの毒素に侵されている者には、より多く投与する必要があるかもしれない。この目的のためには、他の医薬を結合させることなく、不活性毒素だけで用いることもできる。この輸送体を用いれば、ボツリヌス毒素抗血清の投与のような従来技術よりもボツリヌス毒素の被毒に対してより効果的であると考えられる。すなわち、我々は、有用な量のＬ鎖タンパク質を生成するため組換えＤＮＡ技術を用い、ＴｅＴｘおよびＢｏＮＴ／Ａ毒素の作用についてさらなる識見を得た。ＰＣＲベースプロトコールを利用して、Ｌ鎖をコードする遺伝子を増幅し、その後発現ベクターににクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ内で高レベルに発現させた。細胞質ゾル画分からアミロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した後、野生型配列を発現した融合タンパク質が、ＢｏＮＴ／Ａに対する基質の組換え体で、シナプトソームに関するＭ_r ２５ｋＤａのタンパク質（ＳＮＡＰ− ２５）をタンパク質分解することが見いだされた。さらに、マルトースバインディングタンパク質から一旦酵素的に開裂されると、組換えＬ鎖タンパク質は、天然タンパク質の特性と同じような特性を示すことが明かとなった。また、発現されたＬ鎖を精製天然Ｈ鎖と再構成して、神経誘発神経筋伝達をインビトロで阻害しマウスにボツリヌス中毒症状を生じさせる、ジスルフィド結合２本鎖タンパク質を形成した。最も重要なのは、我々は、Ｌ鎖タンパク質の配列中のひとつのアミノ酸を置換することで、野生型タンパク質に通常伴うタンパク質分解活性が阻害されることを見いだしたことである。これにより、タンパク質分解が不活性なＬ鎖を合体させて２本鎖毒素を弱毒化した形態とすることが可能となる。また我々は、弱毒化した毒素をバクテリア内で生成できるようにするために、適当な部位特異的変異を導入したひとつの遺伝子を、それぞれの神経毒素用に生成することができることを予期している。このアプローチは、構成成分から２本鎖を再構成する必要をなくすのに有効であろう。得られた弱毒化された毒素は、共有結合された化学物質を毒素レセプターを有する神経細胞に運ぶための有利な輸送体として提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウィラー，ラリー，アレンアメリカ合衆国，92715 カリフォルニア, アーバイン，バリービュー 18番地 (72)発明者ガースト，マイケル，エルウッドアメリカ合衆国，92622 カリフォルニア, ニューポートビーチ，ビスタホーガー 2433番地

Claims

【特許請求の範囲】１．神経細胞に関連する障害を治療するための化学物質結合体であって、標的神経細胞に対して特異性を有する不活性なクロストリジウム属細菌神経毒素と前記神経毒素に結合した医薬または他の生物活性分子とを含み、前記神経毒素が前記標的神経細胞に侵入する能力を維持している化学物質結合体。２．前記クロストリジウム属細菌神経毒素がテタヌストキシン、ボツリヌス毒素Ａ、ボツリヌス毒素Ｂ、ボツリヌス毒素Ｃ、ボツリヌス毒素Ｄ、ボツリヌス毒素Ｅ、ボツリヌス毒素Ｆおよびボツリヌス毒素Ｇからなる群より選ばれる請求項１に記載の化学物質結合体。３．前記クロストリジウム属細菌神経毒素が、その軽鎖中のアミノ酸の変更により不活性化されている請求項１に記載の化学物質結合体。４．前記不活性化されたクロストリジウム属細菌神経毒素が、Ｇｌｕ²³⁴の修飾を有するテタヌストキシン、Ｈｉｓ²²⁷および／またはＧｌｕ²²⁴に修飾を有するボツリヌス毒素Ａ、またはボツリヌス毒素ＡのＨｉｓ²²⁷および／またはＧｌｕ² ²⁴ に対応する部位に修飾を有するボツリヌス毒素Ａ以外のボツリヌス毒素である請求項３に記載の化学物質結合体。５．哺乳類の神経筋機能障害の治療に用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の化学物質結合体。６．制御不能な筋痙攣に関連する神経筋障害の治療に用いられる請求項５に記載の化学物質結合体。７．哺乳類での神経筋機能障害の治療用の薬剤の調製における請求項１〜４のいずれかに記載の化学物質結合体の使用。８．前記神経筋機能障害が、制御不能な筋痙攣に関連する請求項７に記載の使用。９．前記医薬が、ボツリヌス中毒または破傷風の治療用の有効成分である請求項１〜４のいずれかに記載の化学物質結合体。１０．ボツリヌス中毒または破傷風の治療に用いられる請求項９の化学物質結合体。１１．哺乳類でのボツリヌス中毒または破傷風の治療用の薬剤の調製における請求項９に記載の化学物質結合体の使用。１２．急性のボツリヌス毒素中毒の治療用の薬剤の調製における不活性クロストリジウム属細菌神経毒素の使用。１３．前記クロストリジウム属細菌神経毒素が、他の医薬と複合せずに用いられる請求項１２に記載の使用。１４．限局性ジストニー、ストローク若しくは外傷性脳損傷若しくは脊椎の損傷による痙直、眼瞼痙攣、斜視、脳性小児麻痺または筋痙攣による背痛の治療用薬剤の調製における、活性クロストリジウム属細菌神経毒素と医薬とを含む化学物質結合体の使用。１５．哺乳類の神経筋機能障害の治療方法であって、医薬が結合されたクロストリジウム属細菌神経毒素を含む医薬的に活性のある溶液を調製し、有効量の前記薬学的に活性のある溶液を哺乳類に導入することを特徴とする方法。１６．前記クロストリジウム属細菌神経毒素が、テタヌストキシン、ボツリヌス毒素Ａ、ボツリヌス毒素Ｂ、ボツリヌス毒素Ｃ、ボツリヌス毒素Ｄ、ボツリヌス毒素Ｅ、ボツリヌス毒素Ｆおよびボツリヌス毒素Ｇからなる群より選ばれる請求項１５に記載の方法。１７．前記クロストリジウム属細菌神経毒素が、その軽鎖中のアミノ酸の変更により不活性化されている請求項１５に記載の方法。１８．前記医薬が、神経伝達物質の放出を抑制する請求項１５に記載の方法。１９．前記医薬が、シナプトブレビン（synaptobrevin）の活性を抑制する請求項１８に記載の方法。２０．前記神経筋機能障害が、制御不能な筋痙攣に関連する請求項１５に記載の方法。