DE60032367T2

DE60032367T2 - Aktivierbare rekombinante neurotoxine

Info

Publication number: DE60032367T2
Application number: DE60032367T
Authority: DE
Inventors: Oliver J. DOLLY; Yan Li; Chion Kuo CHAN
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2020-08-26
Also published as: KR20020034178A; EP2267010B1; EP2267010A2; US7749514B2; US20090004224A1; US7985411B2; CA2380457A1; US7422877B2; US20070259401A1; EP1206554B1; US7132259B1; DE60032367T3; EP2267009B1; US20090030182A1; WO2001014570A1; EP2264052A3; US20080161226A1; HK1046020A1; US20080311622A1; EP2267009A3

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die auf den Gebieten der Neurologie, Molekularbiologie und Medizin nützlich sind, sowie Verfahren zur Herstellung potentieller toxischer therapeutischer Agentien und deren Derivaten. Die Erfindung betrifft außerdem rekombinante Clostridien-Neurotoxine (insbesondere Botulinum-Neurotoxine), deren modifizierte Versionen und Verfahren zur Herstellung solcher Moleküle zur Verwendung als therapeutische Agentien, Transportermoleküle, Zusatzstoffe und dergleichen.
Hintergrund der Erfindung
Neurotoxine, wie solche, die aus Clostridium botulinum und Clostridium tetani erhalten werden, sind sehr wirksam und spezifische Gifte von Neuronenzellen und anderen Zellen, wenn sie zu therapeutischen Zwecken in solche Zellen befördert werden. Diese grampositiven Bakterien drücken zwei verwandte, aber unterschiedliche Toxintypen aus, jede davon umfasst zwei Disulfid-gebundene Aminosäureketten: eine leichte Kette (L) von ungefähr 50 KDa und eine schwere Kette (H) von ungefähr 100 KDa, die ausschließlich für die Symptome dieser Erkrankungen verantwortlich sind. Das Holotoxin wird in vivo als Einzelkette synthetisiert, anschließend in einer posttranslationalen Modifizierung abgeschnitten, um das aktive Neurotoxin zu bilden, das die getrennten L- und H-Ketten umfasst. Die Tetanus- und Botulinumtoxine sind die der Menschheit bekannten letalsten Substanzen mit einer letalen Dosis beim Menschen von zwischen 0,1 ng und 1 ng pro Kilogramm Körpergewicht. Tonello et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 389: 251-260 (1996). Beide Toxine wirken durch Inhibieren der Neurotransmitterfreigabe in befallenen Neuronen. Das Tetanus-Neurotoxin (TeNT) wirkt hauptsächlich im zentralen Nervensystem, wohingegen Botulinum-Neurotoxin (BoNT) an den neuromuskulären Verbindungsstellen und anderen cholinergischen Synapsen im peripheren Nervensystem wirkt; beide wirken durch Inhibieren der Neurotransmitterfreigabe aus dem Axon des befallenen Neurons in die Synapse, was zur Paralyse führt.
Das Tetanus-Neurotoxin (TeNT) ist dafür bekannt, in einer immunologisch distinkten Art zu existieren; die Botulinum-Neurotoxine (BoNT) sind bekannt, in sieben verschiedenen Immunogenentypen aufzutreten, die BoNT/A bis BoNT/G bezeichnet werden. Während all diese Typen durch C-Botulinum-Isolate hergestellt werden, stellen zwei andere Arten C. baratii und C. butyricum jeweils Toxine ähnlich zu /F und /E her. Siehe z. B. Coffield et al., The Site and Mechanism of Action of Botulinum Neurotxin in Therapy with Botulinum Toxin 3-13 (Jankovic J. & Hallett M. eds. 1994), dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Unabhängig des Typs, scheint der molekulare Mechanismus der Intoxifizierung ähnlich zu sein. Im ersten Verfahrensschritt bindet das Toxin durch eine spezifische Wechselwirkung zwischen der schweren (H)-Kette und einem Zelloberflächenrezeptor an die präsynaptische Membran des Zielneurons; von dem Rezeptor wird angenommen, dass er sich bei jedem Botulinumtoxentyp und bei TeNT unterscheidet. Dolly et al., Seminars in Neuroscience 6: 149-158 (1994). Das Carboxylende der schweren Kette scheint für das Targeting des Toxins an die Zelloberfläche wichtig zu sein. Id.
Im zweiten Schritt durchtritt das Toxin die Plasmamembran der vergifteten Zelle. Das Toxin wird als Erstes durch die Zelle über die Rezeptor-vermittelte Endozytose eingeschlossen und ein das Toxin enthaltendes Endosom wird gebildet. Das Toxin verlässt anschließend das Endosom in das Zytoplasma der Zelle. Von diesem letzten Schritt wird angenommen, dass er durch das Aminoende der H-Kette vermittelt wird, der eine Konformationsänderung des Toxins als Antwort auf einen pH von ungefähr 5,5 oder niedriger auslöst. Von Endosomen ist bekannt, dass sie eine Protonenpumpe besitzen, die den intraendosomalen pH verringert. Die Konformationsänderung setzt hydrophobe Reste in dem Toxin frei, wodurch es dem Toxin erlaubt wird, selbst in die endosomale Membran eingebettet zu werden. Das Toxin ändert anschließend seinen Aufenthaltsort von der endosomalen Membran in das Zytosol.
Der letzte Schritt des Mechanismus der Botulinumtoxinaktivität scheint eine Reduktion der Disulfidbindung, die die H- und die leichte (L)-Kette verbindet, zu beinhalten. Die gesamte toxische Aktivität des Botulinum- und Tetanustoxins ist in der L-Kette des Holotoxins enthalten; die L-Kette ist eine Zink (Zn⁺⁺)-Endopeptidase, die selektiv Proteine spaltet, die für das Erkennen und das Andocken der Neurotransmitter enthaltenden Vesikel mit der zytoplasmischen Oberfläche der Plasmamembran und der Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran wesentlich sind. TxNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F und BoNT/G bewirken den Abbau von Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt), ein synaptosomales Membranprotein. Der größte Teil der Zytosoldomäne von VAMP, der von der Oberfläche des synaptischen Vesikels reicht, wird als Ergebnis einer dieser Spaltvorkommnisse entfernt. Jedes Toxin (außer TeNT und BoNT/B) spaltet speziell eine unterschiedliche Bindung.
BoNT/A und /E spalten selektiv das Plasmamembran-assoziierte Protein SNAP-25; dieses Protein, das auch durch BoNT/C1 gespalten wird (Foran et al., Biochem. 35: 2630-2636 (1996)) bindet hauptsächlich und ist auf der zytoslischen Oberfläche der Plasmamembran vorhanden. BoNT/C spaltet Syntaxin, ein integrales Protein, wobei der größte Teil seiner Masse dem Zytosol ausgesetzt ist. Syntaxin wechselwirkt mit den Calciumkanälen an präsynaptischen aktiven Endzonen. Siehe Tonello et al., Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Intracellular Protein Catabolism 251-260 (Suzuki K. & Bond J. eds. 1996), die Offenbarung ist durch Bezugnahme als Teil dieser Beschreibung eingeschlossen.
Sowohl TeNT als auch BoNT werden von der neuromuskulären Verbindungsstelle aufgenommen. BoNT verbleibt innerhalb der peripheren Neuronen und blockiert die Freigabe des Neurotransmitters Acetylcholin aus diesen Zellen. Durch seinen Rezeptor wird TeNT in die Vesikel aufgenommen, die sich auf eine rückschrittliche Art und Weise entlang des Axons bis zum Soma bewegen und wird in den intersynaptischen Zwischenraum zwischen Motorneuronen und den inhibierenden Neuronen des Rückenmarks abgegeben. Zu diesem Zeitpunkt bindet TeNT Rezeptoren der inhibierenden Neuronen, wird wieder aufgenommen und die leichte Kette tritt in das Zytosol ein, um die Freigabe der inhibierenden Neurotransmitter 4-Aminoburyrinsäure (GABA) und Glycin aus diesen Zellen zu blockieren.
Wegen seiner speziellen ortsbezogenen Wirkungen sind minutiöse BoNT-Dosen seit 1981 als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Patienten verwendet worden, die unter Dystonie, einschließlich Strabismus (Schielen), Bepharospasmus (unfreiwilliger Augenlidverschluss) und hemifazialem Spasmus leiden (siehe z. B. Borodic et al., Pharmacology and Histology of the Therapeutic Application of Botulinum Toxin in Therapy with Botulinum Toxin 119-157 (Jankovic J. & Hallett eds. 1994). Von den sieben Toxinarten ist BoNT/A das am meisten wirksame der BoNTs und das am besten charakterisierte. Intramuskuläre Injektion in spastisches Gewebe mit kleinen BoNT/A-Mengen ist außerdem wirksam verwendet worden, um Spastizität wegen einer Gehirnverletzung, Rückenmarksverletzung, eines Schlaganfalls, Multipler Sklerose und zerebraler Lähmung zu behandeln. Das Paralyseausmaß hängt sowohl von der Dosis als von dem Volumen, das der Zielstelle zugeführt wird, ab.
Obgleich die L-Kette der Teil ist, der für die neurale Toxifizierung verantwortlich ist, muss er dem neuralen Zytoplasma zugeführt werden, um toxisch zu sein. Ähnlich entfalten die Proformen der einzelnen Kette des Holotoxins verhältnismäßig niedrige Toxizität, bis sie an einer oder mehreren Peptidbindungen in einem exponierten Schleifenbereich zwischen ihren H- und L-Ketten gespalten werden, um die voll aktiven reifen Neurotoxine zu erzeugen. Wie in dem oben bereitgestellten Mechanismus angezeigt, ist die H-Kette jedes Neurotoxins für die Zellrezeptorbindung und Endozytose wesentlich, wohingegen sowohl die L-, als auch die H-Ketten (und eine intakte Disulfidbindung) zur Translokation des Toxins in das Zytoplasma erforderlich sind. Wie oben angezeigt, ist die L-Kette allein verantwortlich für die Toxizität, die durch die Inhibierung der Acetylcholinabsonderung verursacht wird.
Trotz der deutlichen therapeutischen Wirksamkeit von clostridialen Neurotoxinpräparaten, ist die industrielle Herstellung des Toxins schwierig. Die Herstellung von Neurotoxin aus anaeroben Clostridium-Kulturen ist ein mühsames zeitaufwändiges Verfahren, einschließlich eines mehrschrittigen Reinigungsprotokolls, das verschiedene Proteinausfällungsschritte und entweder eine verlängerte oder wiederholte Kristallisierung des Toxins oder verschiedene Stadien der Säulenchromatographie beinhaltet. Bedeutend ist, dass es die hohe Toxizität des Produktes erfordert, dass das Verfahren unter strikten Bedingungen (BL-3) durchgeführt wird. Während des Reinigungsverfahrens sind die gefalteten einkettigen Neurotoxine durch endogene clostridiale Proteasen durch ein Verfahren, das „nicking" genannt wird, aktiviert. Dies beinhaltet die Entfernung der ungefähr zehn Aminosäurereste von der Einzelkette, um die zweikettige Form zu bilden, bei der die zwei Ketten kovalent über die Disulfidbindung in der Kette verbunden sind.
Das geschnittene Neurotoxin ist viel aktiver als die ungeschnittene Form. Die Größe und präzise Stelle des Schneidens variiert mit den Serotypen der Bakterien, die das Toxin herstellt. Die Unterschiede bei der einkettigen Neurotoxinaktivierung und folglich die Ausbeute des geschnittenen Toxins sind auf Variationen im Typ und den Mengen der protolytischen Aktivität, die durch den gegebenen Stamm hergestellt werden, zurückzuführen. Z. B. wird mehr als 99 % des einzelkettigen Neurotoxins vom C. botulinum Typ A durch den Hall A C. Botulinum-Stamm aktiviert, wohingegen Typ B und Typ E-Stämme Toxine mit niedrigeren Aktivierungsmengen (0 bis 75 % in Abhängigkeit der Gärungszeit) herstellen. Folglich spielt die hohe Toxizität des reifen Neurotoxins eine wichtige Rolle bei der kommerziellen Herstellung von Neurotoxinen als therapeutische Agentien.
Der Aktivierungsgrad von erzeugten clostridialen Toxinen ist daher bei der Herstellung dieser Materialien zu berücksichtigen. Es würde ein wichtiger Vorteil sein, wenn Neurotoxine, wie BoNT und TeTx in hoher Ausbeute in schnell wachsenden Bakterien (wie heterologen E. coli-Zellen) als verhältnismäßig nicht toxische Einzelketten (oder Einzelketten mit reduzierter toxischer Aktivität), die sicherer, leichter herzustellen und einfacher in die voll aktive Form umzuwandeln sind, exprimiert werden könnten.
Angesichts der Sicherheit als primäre Angelegenheit, hat sich die vorherige Arbeit auf die Expression in E. coli und die Reinigung von individuellen H- und L-Ketten von TeTx und BoNT konzentriert; diese isolierten Ketten sind selbst nicht toxisch, siehe Li et al., Biochemistry 33: 7014-7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34: 15175-15181 (1995). Nach der getrennten Herstellung dieser Peptidketten unter strikt kontrollierten Bedingungen können die H- und L-Untereinheiten durch oxidative Disulfidbindung kombiniert werden, um die neuroparalytischen Di-Ketten zu bilden. Unglücklicherweise hat diese Strategie verschiedene Nachteile.
Erstens ist es nicht praktisch, große Menge der individuellen Ketten zu exprimieren und zu isolieren; insbesondere in der Abwesenheit der L-Kette ist die isolierte H-Kette in wässriger Lösung ziemlich unlöslich und ist dem protolytischen Abbau sehr zugänglich. Zweitens ist die invitro Oxidation der individuell exprimierten und gereinigten H- und L-Ketten, um die aktive Di-Kette herzustellen, sehr ineffizient und führt zu niedriger Ausbeute von aktivem Toxin und der Herstellung vieler inaktiver, nicht richtig gefalteter oder oxidierter Formen. Die Reinigung des korrekt gefalteten und oxidierten H- und L-Ketten enthaltenden Toxins ist schwierig, so ist seine Herstellung aus diesen inaktiven Formen und der nicht umgesetzten getrennten H- und L-Ketten.
Es würde daher nützlich und von Vorteil sein, clostridiale Neurotoxine als inaktive (oder weniger aktive) einkettige Formen zu exprimieren, um die Notwendigkeit der zeitaufwändigen und ineffizienten Wiederherstellung der einzelnen Ketten abzuschaffen, die Löslichkeit der Proteinketten beizubehalten, die Proteinfalschfaltung zu verringern und die daraus resultierende Empfänglichkeit für Proteaseanfall zu verringern, die Toxinausbeute zu verbessern und/oder ein einfaches Verfahren zur Reinigung des Toxins bereitzustellen.
Zusätzlich würde es nützlich sein, diese Toxine biotechnologisch zu erzeugen, um einkettige, modifizierte Neurotoxinmoleküle bereitzustellen, die neue therapeutische Eigenschaften und/oder eine längere Wirkungsdauer oder toxische oder nicht-toxische Formen aufweisen, um als Transportmoleküle verwendet zu werden, die eine therapeutische Komponente zu Nerven oder anderen Zelltypen bringen können. Durch Exprimieren solcher Proteine als Einzelkette, würde die Ausbeute und Reinigung der biotechnologisch erzeugten Proteine deutlich verbessert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante und isolierte clostridiale Neurotoxinpolipeptide gerichtet, die eine funktionale Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine therapeutische Domäne umfassen, wobei die Polypeptide eine Aminosäuresequenz beinhalten, die für die spezifische Spaltung in vitro empfänglich ist, gefolgt von der Expression als einzelne Kette. Die Polypeptide können clostridiale Neurotoxine und deren Derivate umfassen, wie solche Proteine, die im U.S. Patent 5,989,545 und in der Internationalen Patentanmeldung WO 95/32738 offenbart sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Protein die funktionalen Domänen einer clostridialen Neurotoxin-H-Kette und einige oder alle Funktionen einer clostridialen Neurotoxin-L-Kette in einer einzelnen Polypeptidkette und weist eine eingeführte proteolytische Spaltstelle auf, die keine Trypsin-, Chymotrypsin- oder Pepsinspaltstelle ist, und die sich zwischen der H-Domäne und der L-Domäne befindet, wodurch das einzelkettige Protein gespalten werden kann, um die einzelnen Ketten herzustellen, die bevorzugt kovalent durch eine Disulfidbindung verbunden sind. Die Erfindung umfasst außerdem Verfahren zur Herstellung solcher Proteine und Exprimieren derselben in einer Zelle, sowie Nucleinsäurevektoren zum Übertragen und zur Expression der Nucleotidsequenzbereiche, die solche Proteine codieren, und Zellen, die solche Vektoren enthalten. Die proteolytischen Spaltstellen umfassen Aminosäuresequenzen, die selektiv erkannt und durch ein spezifisches Enzym gespalten werden.
Die exprimierten einkettigen Proteine umfassen die biologisch aktiven Domänen der H-Kette und L-Kette eines clostridialen Neurotoxins. Das Schneiden an der inneren proteolytischen Spaltstelle, das die Kettendomänen trennt, führt folglich zur Aktivierung eines Neurotoxins mit voller Aktivität.
Erfindungsgemäße Proteine werden so zugeschnitten, dass sie eine zusätzliche Aminosäuresequenz enthalten, die eine Bindungsmarkierung umfasst, die eine Zielverbindung mit ausreichend hoher Wirksamkeit bindet, um die schnelle Isolierung des Toxinproteins zu erleichtern. Proteine, enthaltend solche Bindungsstellen, kommen häufig vor und sind dem Fachmann gut bekannt und können ohne Einschränkung monoklonale Antikörper, Maltosebindungsprotein, Glutathionin-S-Transferase, Protein A, a His₆-Markierung und dergleichen umfassen.
Da solche Proteine für eine bestimmte Verbindung oder einen Verbindungstyp Bindungsselektivität entfaltet, kann die Zielverbindung an einen festen Träger immobilisiert werden, der ohne Einschränkung ein Chromatographieharz, eine Microtiter-Vertiefung umfasst, und zur Affinität-Reinigung des modifizierten Toxins verwendet wird. Das clostridiale Neurotoxin kann anschließend durch Standardverfahren eluiert werden, wie durch die Verwendung einer hohen Salzlösung oder eines spezifischen Antagonisten.
Um das Sicherheitsrisiko, das mit der Handhabung von clostridialem Neurotoxin verbunden ist, zu minimieren, werden die erfindungsgemäßen clostridialen Neurotoxine als ihre einkettigen Proformen mit niedriger Aktivität (oder die inaktiv sind) exprimiert, anschließend werden sie durch eine vorsichtig gesteuerte proteolytische Reaktion in vitro aktiviert, bevorzugt auf dem gleichen Wirkgrad wie das natürliche Neurotoxin, aus dem sie abstammen. Zur Verbesserung der Effizienz und der proteolytischen Spaltrate können die biotechnologisch erzeugten protolytischen Spaltzellen derart entworfen werden, dass sie an einer speziell entworfenen Stelle zwischen dem H- und L-Teil der einzelnen Aminosäurenkette auftreten, die die Zugangsfähigkeit der Protease zu dem Holotoxinsubstrat fördert. Um das Risiko der nicht beabsichtigten Aktivierung von clostridialem Neurotoxin durch den Menschen oder durch herkömmlich vorkommende Proteasen zu verringern, werden die Aminosäuresequenzen der Spaltstelle bevorzugt so entworfen, dass sie einen hohen Spezifitätsgrad für proteolytische Enzyme aufweisen, die normalerweise im Menschen nicht auftreten (entweder als humane Proteasen oder als Teil der vorhersehbaren humanen Fauna und Flora auftreten). Eine nicht ausschließlich Liste von Beispielen solcher Proteasen umfasst Rinderenterokinase, die die Aminosäuresequenz DDDDK spaltet, Tobacco-Etch-Virus (TEV)-Protease, die die Sequenz EXXYXQS/G spaltet, die GENENASE^® von Bacillus amyliquifaciens, die die Sequenz HY oder YH spaltet, und PRESCISSION^®-Protease vom humanen Rhinovirus 3C, die die Aminosäuresequenz LEVLFQGP spaltet. Wie oben verwendet, bedeutet der Buchstabe X jede Aminosäure. Alle Aminosäuresequenzen, die in der vorliegenden Beschreibung gezeigt sind, sind in der Richtung vom Aminoterminus bis zum Carboxylterminus und alle Nucleotidsequenzen von 5' zu 3' (von links nach rechts) angegeben, wenn nicht anders angegeben.
In einem erfindungsgemäßen Aspekt ist das einkettige Polypeptid ein isoliertes Polypeptid. Mit „isoliert" ist gemeint, dass es aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Z. B. bei einem Protein, das innerhalb der Zelle exprimiert wird, umfasst die Isolierung die Herstellung eines Zelllysats sowie darauf folgende Reinigungsschritte. Ein Protein, das extrazellulär exprimiert wird, kann z. B. isoliert werden durch Trennung des Überstandes von den Zellen sowie jedem darauf folgenden Reinigungsverfahren.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird der Schleifenbereich in der Kette des C. botulinum Subtyps E Neurotoxins, der normalerweise resistent gegen proteolytisches Abspalten in Bakterien und in Säugern ist, modifiziert, um die eingeführte proteolytische Spaltstelle zu enthalten und dieser Schleifenbereich wird als Schleifenbereich der Kette in dem einkettigen Toxin oder den modifizierten Toxinmolekülen der Erfindung verwendet. Es wird angenommen, dass die Verwendung der Schleife aus dem C. botulinum Subtyp E das nicht abgespaltene Toxinmolekül in vivo stabilisiert, wodurch es resistent gegen ungewünschte Spaltung ist, bis es durch die Verwendung der selektierten Protease aktiviert wird.
In wiederum einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt sind Zusammensetzungen angesprochen, die rekombinante Formen von BoNT/E umfassen, die ein einkettiges Polypeptid exprimieren.
In wieder einem Aspekt sind rekombinante chimäre oder modifizierte clostridiale Neurotoxinderivate angesprochen, die als einkettiges Polypeptid exprimiert werden. Ein solches Polypeptid kann ein molekularer Transporter sein, wie ohne Einschränkung solche, die in die von Dolly et al. in der Europäischen Patentbeschreibung EP 0 760 681 B1 offenbart sind.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst clostridiale Neurotoxinderivate, umfassend mindestens einen Teil einer leichten Kette aus einem clostridialen Neurotoxin oder Subtyp davon und mindestens einen Teil einer schweren Kette aus einem anderen Neurotoxin oder Neurotoxinsubtyp sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. In einer Ausführungsform kann das Hybrid-Neurotoxin die gesamte leichte Kette einer leichten Kette aus einem Neurotoxinsubtyp und die schwere Kette aus einem anderen Neurotoxinsubtyp enthalten. In einer weiteren Ausführungsform kann ein chimäres Neurotoxinderivat einen Teil (z. B. die Bindungsdomäne) der schweren Kette eines Neurotoxinsubtyps mit einem anderen Teil der schweren Kette, die aus einem anderen Neurotoxinsubtyp abstammt, enthalten. In ähnlicher Weise oder alternativ kann das therapeutische Element Teile der leichten Kette aus unterschiedlichen Neurotoxinen umfassen.
Solche Hybrid- oder chimäre Neurotoxinderivate sind z. B. als Mittel nützlich, um die therapeutischen Vorteile solcher Neurotoxine Patienten zukommen zulassen, die immunologisch resistent gegenüber einem gegebenen Neurotoxinsubtyp sind, Patienten zukommen zu lassen, die eine niedrigere als durchschnittliche Konzentration von Rezeptoren gegenüber einer gegebenen Bindungskomponente der schweren Kette des Neurotoxins aufweisen oder Patienten zukommen zu lassen, die eine Protease-resistente Variante des Membran- oder Vesikeltoxinsubtrats aufweisen (z. B. SNAP-25, VAMP und Syntaxin). Die Erzeugung von rekombinanten chimären oder Hybrid-Neurotoxinderivaten mit einer leichten Kette mit unterschiedlichem Substrat würde solchen Patienten ermöglichen, dass sie auf eine Neurotoxintherapie ansprechen.
Angesichts der immunologischen Resistenz ist bekannt, dass die meisten Neurotoxinepitope auf dem Toxinteil der schweren Kette auftreten. Folglich, wenn ein Patient neutralisierende Antikörper gegen z. B. BoNT/A, einem chimären Neurotoxin, enthaltend die schwere Kette aus BoNT/E und die leichte Kette aus BoNT/A (das eine längere Verweildauer der therapeutischen Aktivität als andere leichte Ketten vom Neurotoxin hat) entwickelt, würde diese Resistenz bewältigt werden. Wenn ein Patient wenige Oberflächenrezeptoren für BoNT/A aufweist, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass der gleiche Patient in ähnlicher Weise adäquate Rezeptoren für einen anderen BoNT-Subtyp hat. Durch Erzeugen eines Hybrid- oder chimären Neurotoxins (wie solche, die mindestens einen Teil einer schweren Kette, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HC_A, HC_B, HC_C1, HC_D, HC_E, HC_F und HC_G und mindestens einen Teil einer leichten Kette, ausgewählt aus einem unterschiedlichen clostridialen Neurotoxinsubtyp, wobei die leichte Kette ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus LC_A, LC_B, LC_C1, LC_D, LC_E, LC_F und LC_G aufweist), indem die schwere Kette dieses Subtyps mit der therapeutisch am geeignetsten leichten Kette (z. B. der BoNT/A-leichten Kette) kombiniert wird, könnte der Patient besser auf eine Neurotoxintherapie ansprechen.
Ein weiterer Vorteil der oben beschriebenen Hybrid- oder chimären Neurotoxinderivate bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte leichte Ketten (z. B. LC_A) eine lange Wirkungsdauer aufweisen, andere eine kurze Wirkungsdauer aufweisen (z. B. LC_E und LC_F), währenddessen wiederum andere eine dazwischenliegende Aktivitätsdauer haben (z. B. LC_B). Folglich stellen Hybrid- und chimäre Neurotoxine Neurotoxinmedikamente der zweiten und dritten Generation dar, wobei die Neurotoxinaktivität auf eine spezifische therapeutische Notwendigkeit oder Bedingung zugeschnitten werden kann, wobei unterschiedliche Medikamente unterschiedliche Aktivitäten, Substratspezifitäten oder Aktivitätsdauern aufweisen.
Solche Hybrid- oder chimären Neurotoxine würden außerdem bei der Behandlung eines Patienten (wie eines Soldaten oder eines Laborarbeiters) nützlich sein, der mit dem pentavalenten BoNT-Impfstoff geimpft ist. Solche Impfstoffe enthalten kein BoNT/F, folglich würde das Kombinieren einer geeigneten leichten Kette mit der BoNT/F schweren Kette ein therapeutisches Agens erzeugen, das in einem solchen Patienten wirksam ist, bei dem herkömmliche therapeutische Neurotoxine es nicht sein können.
Die gleiche Strategie kann bei der Verwendung von Derivaten der clostridialen Neurotoxine mit einer therapeutischen Komponente, außer einer aktiven Neurotoxin leichten Kette, nützlich sein. Da die schwere Kette eines solchen Agens von einem Neurotoxin abstammen würde, könnte es von Vorteil sein, eine weniger bekannte oder seltenere schwere Kette zu verwenden, um Resistenzmechanismen, die die Wirksamkeit des therapeutischen Neurotoxinderivats neutralisieren, zu vermeiden.
Auf die gleiche Weise kann die Bindungskomponente eine andere sein, als eine Bindungskomponente, die von einer schweren Kette eines clostridialen Neurotoxins abstammt, wodurch eine Zielwirkung bei Zelltypen, außer Motorneuronen, bereitgestellt wird.
Hier eingeschlossen sind ebenfalls Verfahren zur Herstellung, Expression und Reinigung solcher Moleküle in hoher Ausbeute als biologisch aktive Komponenten.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1A ist eine Diagrammansicht des einkettigen TeTx-Konstruktes im Plasmid pTrcHisA und die Nucleotidsequenz des Verbindungsbereichs.
1B zeigt die Aminosäuresequenz, die den Carboxylterminus der leichten Kette und den Aminoterminus der schweren Kette verbindet und einen biotechnologisch hergestellten Schleifenbereich, der eine Enterokinase-Spaltstelle enthält.
2A ist eine Darstellung eines Westernblots eines SDS-PAGE-Gels der Zellextrakte von E. coli JM 109 Transformanten, die 2 unterschiedliche rekombinante einkettige Toxine enthalten, entweder vor oder nach der Induktion der Plasmidproteinexpression mit IPTG. Der zum Nachweis verwendete Antikörper ist ein anti-His₆ monoklonaler Antikörper.
2B ist ein Westernblot, der IPTG-induzierten Zellextrakte auf Zellen, die mit dem E234A-Konstrukt transformiert sind.
3A zeigt die Ergebnisse eines Experiments, in dem ein Affinitäts-gereinigtes rekombinantes einkettiges (SC) TeTx mit Enterokinase gespalten wird, anschließend unter Verwendung von SDS-PAGE getrennt wird und unter Verwendung von Commassie-Brilliant-Blau unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen sichtbar gemacht wird.
3B zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem Affinitäts-gereinigtes rekombinantes einkettiges (SC) TeTx mit Enterokinase abgespalten wird, anschließend unter Verwendung von SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen getrennt und einem Westernblot unter Verwendung von Anti-TeT%X schwere Kette Antikörper unterworfen wird.
4 ist eine Aufzeichnung des Paralysegrades, der in einem Nerven-/Muskelpräparat in vitro induziert wird, unter Verwendung von nativem TeTx und rekombinantem einkettigem Neurotoxin vor und nach dem Abschneiden als Funktion der Zeit.
5 ist eine Darstellung der erzeugten Peptidfragmente nach der Inkubierung von rekombinantem einkettigem TeTx mit Trypsin und Arg C-Protease und die Ableitung der Aminosäuresequenz von den N-terminalen Sequenzen einer der resultierenden Fragmente, die von diesen Agentien erkannt wird.
6 zeigt den Verdau von ungeschnittenem SC WT TeTx und SC R496G TeTx mit verschiedenen Trypsinkonzentrationen.
7 zeigt die inhibierende Wirkung durch TeTx-stimulierte Inhibierung der Ca⁺⁺-abhängigen Neurotransmitterfreigabe der vorinkubierten cerebellaren Zellen mit dem E234A mutanten TeTx.
8 zeigt die Wirkung durch Ca⁺⁺-abhängige Neurotransmitterfreigabe von cerebellaren Neuronen, indem sie der nativen rekombinanten einkettigen Mutante E234A und der rekombinanten einkettigen TeTx-Mutante R496G ausgesetzt wurden.
9 zeigt die inhibierende Wirkung durch TeTx-stimulierte paralytische Aktivität der vorinkubierten Hemidiaphragmen der Maus mit der TeTx-Mutante E234A.
10 zeigt das Schema zur Herstellung eines Plasmids, das einkettiges BoNT/E codiert und ein Agarosegelelektrophoretogramm des PCR-Fragments, das während der Herstellung des Plasmids erhalten wird.
11 zeigt das Schema zur Herstellung eines Plasmids, das die proteolytische inaktive einkettige BoNT/E-Mutante E212Q codiert und ein Agarosegelelektrophoretogramm des umgekehrten PCR-Fragments, das während der Herstellung des Plasmids erhalten wird.
12 zeigt das Expressions- und Reinigungsschema von rekombinantem einkettigem BoNT/E und ein SDS-PAGE-Elektrophoretogramm und die Westernblots der Reinigungsfraktionen.
13 zeigt SDS-PAGE-Elektrophoretogramme unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen von nativem rekombinantem ungeschnittenem und rekombinantem geschnittenem BoNT/E und Westernblots, die gegen die schweren und leichten Ketten des Toxins gerichtet sind.
14 zeigt die Ergebnisse des Inkubierens von nativem BoNT/E, rekombinantem geschnittenem und ungeschnittenem BoNT/E und der Mutante E212Q mit einem GST-SNAP-25[140-205]-Proteasesubstrat.
15 zeigt die Wirkung der Ca⁺⁺-abhängigen Glutamatfreigabe von cerebellaren Zellen, die mit nativem BoNT/E nicht gespaltenem rekombinantem einkettigem BoNT/E und gespaltenem rekombinantem einkettigem BoNT/E inkubiert wurden.
16A zeigt die Wirkungen auf die Muskelspannung, wenn Hemidiaphragmata des Phrenikus der Maus mit 0,2 nM rekombinantem geschnittenem BoNT/E (❍) oder mit 0,2 nM nativem BoNT/E (☐) inkubiert werden.
16B zeigt die Wirkungen der Muskelspannung, wenn Hemidiaphragmata des Phrenikus der Maus mit 1 nM rekombinantem ungeschnittenem (❍), mit 1 nM rekombinantem geschnittenem
oder mit 0,05 nM rekombinantem geschnittenem (∇) BoNT/E inkubiert wurden.
17 zeigt die Attenuierung der paralytischen Aktivität auf Hemidiaphragmata des Phrenikus der Maus, die mit der inaktiven E212Q-Mutante vorinkubiert wurden, bevor sie nativem, geschnittenem BoNT/E-Toxin ausgesetzt wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren umfassen modifizierte clostridiale Neurotoxine, ihre Synthese und Verwendung. Zwei-Ketten-Neurotoxine, die normal durch Schneiden eines einkettigen Polypeptids mittels einheimischer Proteasen aktiviert werden, können auf Nucleinsäureebene durch Änderungen oder Entfernung der Nucleotidsequenz modifiziert werden, die die einheimische Protease-Spaltstelle codiert und durch Einfügen einer Nucleotidsequenz, die eine davon unterschiedliche proteolytische Spaltstelle, die resistent gegen Spaltung durch die Wirtszelle oder humane Proteasen ist, codiert. Die eingeführte Aminosäuresequenz wird so entworfen, das sie in vitro durch die Verwendung eines Spaltmittels gespalten wird, das vor der Expression ausgewählt wird und das sowohl im Menschen als auch im Wirtszellgewebe nicht vorkommt.
Die eingeführte Aminosäuresequenz kann ausgewählt werden, um Empfänglichkeit gegen ein chemisches Agens zu übertragen, das Peptidbindungen spalten kann, wie Cyanogenbromid. Wesentlich bevorzugt ist es jedoch, dass die codierte Aminsäuresequenz eine proteolytische Spaltstelle umfassen kann, die für eine ausgewählte Protease sehr spezifisch ist. Die ausgewählte Protease ist eine, die normalerweise nicht in der Zelle, die in das einkettige Toxinmolekül (z. B. E. coli oder das native clostridiale Bakterium), exprimiert, vorkommt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist an rekombinante einkettige modifizierte clostridale Neurotoxine gerichtet, die auf Wunsch durch eine Protease gespalten werden können, um ein aktives zweikettiges Molekül bereitzustellen. Solche modifizierten Neurotoxine müssen nicht toxisch sein; bei bestimmten dieser Proteine kann die enzymatische Aktivität der Toxin-L-Kette abgeschafft sein und das Toxin an ein Medikament oder anderes bioaktives Agens mit therapeutischer Aktivität gebunden sein. Alternativ ist in bestimmten anderen modifizierten Neurotoxinen die L-Kette enzymatisch aktiv, aber Teile der H-Kette sind modifiziert, um Spezifität gegenüber Zielzellen außer dem natürlichen Ziel des Neurotoxins zu verschaffen, wohingegen die Translokation und die Endozytose-stimulierenden Aktivitäten des nativen Toxins beibehalten werden.
Modifizierte Neurotoxine, wie solche, die in diesem erfindungsgemäßen Aspekt beschrieben sind, sind z. B. offenbart in den Internationalen Patentveröffentlichungen WO 95/32738, WO 99/55359, WO 96/33273, WO 98/07864 und WO 99/17806. Die Erfindung stellt einkettige, spaltbare Versionen dieser Moleküle bereit und verbesserte Verfahren zur Herstellung solcher Moleküle.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein modifiziertes clostridiales Neurotoxin, abstammend vom Tetanustoxin (TeNT), oder einem oder mehreren der Botulinumtoxin (BoNT)-Subtypen, bei denen der in der Natur vorkommende Schleifenbereich in der Kette mit einem modifizierten Schleifenbereich ersetzt worden ist, der eine unterschiedliche Aminosäuresequenz umfasst, die 1) Resistenz gegen Spaltung durch Wirtsproteasen oder autolytische Aktionen und/oder 2) Labilität gegen ausgewählte Proteasen überträgt. Bevorzugt ist die Spaltstelle hochspezifisch für die ausgewählte Protease.
Der Schleifenbereich in der Kette von bestimmten clostridialen Neurotoxinen, z. B. BoNT/E, ist in der Natur resistent gegen proteolytische Spaltung in vivo. Diese Proteaseresistenz kann eine Sekundär- oder Tertiärstruktur reflektieren, die die Schleife resistenter gegen einheimische Proteasen, außer clostridialen Neurotoxinen, macht. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Schleifenbereich in der Kette von BoNT/E mit dem natürlichen Schleifenbereich, der in einem anderen BoNT vorkommt, mit höherer therapeutischer Aktivität oder Aktionsdauer, z. B. BoNT/A oder /B substituiert. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Schleifenbereich von BoNT/E modifiziert, um eine proteolytische Spaltstelle zu enthalten, die hochspezifisch gegenüber einer ausgewählten Protease vor dem Subklonieren ist. Der andererseits hoch konservierte BoNT/E-Schleifenbereich würde resistent gegen einheimische Proteasen sein oder solche, die beim Menschen auftreten, würden aber die Fähigkeit beibehalten, durch Verdau mit der ausgewählten Protease aktiviert zu werden.
Die ausgewählte Protease wirkt daher im Wesentlich als „Aktivator" der Neurotoxintoxizität (oder modifizierten Toxinaktivität), das auf Wunsch der rekombinanten Expression folgend zugeführt werden kann.
Die ausgewählte Protease kann jede sein, die eine spezifische Aminosäuresequenz erkennt und eine Peptidbindung in der Nähe oder an dem Ort spaltet, aber die ausgewählte Protease ist sehr bevorzugt nicht eine humane Protease, wie humanes Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin oder eine Wirtszellprotease. Die ausgewählte Protease erkennt darüber hinaus nicht die gleiche Aminosäuresequenz, wie die einheimischen Proteasen. Letztlich sollte die ausgewählte Protease nicht eine sein, die durch die Wirtszelle exprimiert wird, die das Plasmid enthält, das das rekombinante Neurotoxin codiert.
Eine nicht-humane Protease, die eine verhältnismäßig seltene Aminosäure erkennt, kann verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Aminosäureerkennungssequenz auch bekannt ist. Beispiele der als Aktivatoren ausgewählten Proteasen können ohne Einschränkung jede der folgenden umfassen: Rinderenterokinase, Pflanzenprotease, wie Papain (aus Carica papaya) und Legumain, Insektenpapain-homolog (aus der Seidenraupe Sitophilus zeamatus) und Krustentierpapainhomolog („decapod"), Tobacco etch virus (TEV) Protease, die die Sequenz EXXYXQS/G spaltet, GENENASE^® aus Bacillus amyliquifaciens, die die Sequenz HY oder YH spaltet; PRESCISSION^®-Protease aus dem humanen Rhinovirus 3C, die die Aminosäuresequenz LEVLFQGP spaltet. Wie oben verwendet, zeigt der Buchstabe X jede Aminosäure an.
Wenn nicht anders angegeben, haben die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen in dieser Beschreibung:
Mit „Bindungselement" ist ein Aminosäuresequenzbereich gemeint, der bevorzugt unter physiologischen Bedingungen an einen Zelloberflächenmarker bindet, der für die Zielzelle charakteristisch ist. Der Zelloberflächenmarker kann ein Polypeptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glycoprotein, ein Lipoprotein umfassen oder kann strukturelle Charakteristiken von einem oder mehreren dieser zeigen. Mit „bevorzugt wechselwirkt" ist gemeint, dass die Dissoziationskonstante (K_d) des Bindungselements für den Zelloberflächenmarker mindestens ein Größengrad geringer ist als die des Bindungselements für jeden anderen Zelloberflächenmarker. Bevorzugt ist die Disassoziationskonstante mindestens 2 Größengrade geringer, sogar bevorzugter ist die Disassoziationskonstante mindestens 3 Größengrade geringer als die des Bindungselements für jeden anderen Zelloberflächenmarker, dem das Neurotoxin oder modifizierte Neurotoxin ausgesetzt wird.
Das „Translokationselement" umfasst einen Teil einer clostridialen Neurotoxin-H-Kette mit einer Translokationsaktivität. Mit „Translokation" ist die Fähigkeit gemeint, den Transport eines Polypeptids über die vesikuläre Membran zu erleichtern, wodurch einige oder alle der Polypeptide dem Zytoplasma ausgesetzt werden.
In verschiedenen Botulinum-Neurotoxinen wird angenommen, dass die Translokation eine allosterische Konformationsänderung der schweren Kette umfasst, die durch eine pH-Verringerung in dem Endosom bewirkt wird.
Die Konformationsänderung scheint die N-terminale Hälfte der schweren Kette zu beinhalten und führt zu Porenbildung in der vesikulären Membran; diese Änderung ermöglicht die Bewegung der protolytischen leichten Kette aus dem endosomalen Vesikel in das Zytoplasma. Siehe z. B. Lacy et al., Nature Struct. Biol. 5: 898-902 (Oktober 1998).
Die Aminosäuresequenz des Translokations-vermittelten Teils der Botulinum-Neurotoxin schweren Kette ist dem Fachmann bekannt; zusätzlich sind solche Aminosäurereste innerhalb dieses Teils, von denen bekannt ist, dass sie wesentlich zum Übertragen der Translokationsaktivität sind, ebenso bekannt.
Es wird daher innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns liegen, z. B. die in der Natur vorkommende N-terminale Peptidhälfte der schweren Kette jedes dieser verschiedenen Clostridium tetanus oder Clostridium botulinum Neurotoxinsubtypen als Translokationselement einzusetzen oder ein analoges Translokationselement zu entwerfen, in dem die Primärsequenzen der N-terminalen Hälften der verschiedenen schweren Ketten angeordnet werden und eine Konsensus-primäre Translokationssequenz auf Basis konservierter Aminosäuren, Polarität, sterischen und hydrophoben Charakteristiken unter den Sequenzen ausgewählt wird.
Das erfindungsgemäß „therapeutische Element" ist ein Polypeptid, umfassend eine clostridiale Neurotoxin leichte Kette oder einen Teil davon, der die SNARE-Proteinsequenz in spezifische Endopeptidaseaktivität einer clostridialen Neurotoxin leichten Kette beibehält. Die Aminosäuresequenzen der leichten Kette der Botulinum-Neurotoxin (BoNT)-Subtypen A-G wurden bestimmt sowie die Aminosäuresequenz der leichten Kette des Tetanus-Neurotoxin (TeNT). Jede Kette enthält das Zn⁺⁺-Bindungsmotiv His-Glu-x-x-His (N-terminale Richtung am linken Ende), das bei Zn⁺⁺-abhängigen Endopeptidasen charakteristisch ist (HELIH in TeNT, BoNT/A/B und /E; HELNH in BoNT/C; und HELTH in BoNT/D).
Vor kurzem durchgeführte Untersuchungen mit der BoNT/A leichten Kette haben bestimmte Merkmale aufgedeckt, die für die Aktivität und Spezifität des Toxins gegen sein Zielsubstrat SNAP-25 wichtig sind. Studien von Zhou et al. Biochemistry 34: 15175-15181 (1995) haben somit angezeigt, dass wenn der Aminosäurerest His₂₂₇ der leichten Kette mit Tyrosin substituiert wird, das resultierende Polypeptid nicht fähig ist, SNAP-25 zu spalten; Kurazono et al., J. Biol. Chem. 14721-14729 (1992) führten Studien in präsynaptischen cholinergenen Neuronen der Bukkalganglia von Aplysia californiaca unter Verwendung einer rekombinanten BoNT/A leichten Kette durch, wodurch gezeigt wurde, dass die Entfernung der 8 N-terminalen oder 32 C-terminalen Reste die Toxizität nicht beseitigt, aber die Entfernung von 10 N-terminalen oder 57 C-terminalen Resten, die Toxizität in diesem System beseitigt. Erst vor kurzem wurde die Kristallstruktur des gesamten BoNT/A Holotoxins aufgeklärt: die aktive Seite beinhaltet die Teilnahme von His₂₂₂, Glu₂₂₃, His₂₂₆, Glu₂₆₁ und Tyr₃₆₅ zu beinhalten. Lacy et al., siehe oben. (Diese Reste entsprechen His₂₂₃, Glu₂₂₄, His₂₂₇, Glu₂₆₂ und Tyr₃₆₆ der BoNT/A L-Kette von Kurazono et al., siehe oben.) Interessant ist, dass eine Anordnung von BoNT/A bis E und TeNT leichten Ketten ergab, dass jede dieser Ketten unverändert diese Reste in Positionen aufweist, die mit BoNT/A analog sind. Kurazono et al., siehe oben.
Die katalytische Domäne von BoNT/A ist für den C-Terminus von SNAP-25 sehr spezifisch und scheint ein Minimum von 17 SNAP-25 Aminosäuren zu erfordern, damit die Spaltung auftritt. Die katalytische Stelle ähnelt einer Tasche; wenn die leichte Kette über die Disulfidbindung zwischen Cys₄₂₉ und Cys₄₅₃ gebunden wird, scheint es, dass die Translokationsdomäne der schweren Kette den Zugang zu der katalytischen Tasche blockiert, bis der leichten Kette Eintritt in das Cytosol gewährt wird. Wenn die Disulfidbindung anschließend reduziert wird, ist die katalytische Tasche „geöffnet" und die leichte Kette ist voll aktiv.
Wie oben beschrieben, werden VAMP und Syntaxin durch BoNT/B, D, F, G und TeNT und BoNT/C₁ jeweils gespalten, wohingegen SNAP-25 durch BoNT/A E und C1 gespalten wird.
Die Substratspezifitäten der unterschiedlichen clostridialen Neurotoxin leichten Ketten, außer BoNT/A, sind bekannt. Daher könnte der Fachmann leicht die Toxinreste bestimmen, die in diesen Subtypen für die Spaltung und die Substraterkennung wesentlich sind (z. B. durch ortsspezifische Mutagenese oder Deletion verschiedener Bereiche des Toxinsmoleküls, gefolgt von der Untersuchung auf proteolytische Aktivität und Substratspezifität) und könnte daher leicht Varianten der nativen Neurotoxin leichten Kette entwerfen, bei denen die gleiche oder ähnliche Aktivität beibehalten wird oder fehlt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das einkettige Neurotoxin oder Neurotoxinderivat der Erfindung, das wie oben angezeigt geändert ist, weiter modifiziert, um andere gelegentlich vorkommende endogene proteolytische Stellen, wie solche, die durch Trypsin, Arg-C-Protease, Chymotrypsin oder Wirtszellproteasen gespalten werden, zu entfernen. Wie unten angezeigt, kann die Modifizierung der primären Aminosäuresequenzen in diesen Bereichen, um Proteaseresistenz zu übertragen, die Ausbeute des Neurotoxins erhöhen und die Toxizität des einkettigen Neurotoxins vor der Spaltung und Aktivierung verringern.
Die Aminosäuresequenzen, die von vielen Proteasen erkannt werden, und ihre Spaltspezifität sind dem Fachmann gut bekannt. Folglich, ist sowohl das Design einer spezifischen proteolytischen Spaltstelle in dem Schleifenbereich zwischen dem L- und H-Kettenteil des einkettigen Toxins als auch die Modifizierung von einheimischen Proteasestellen in dem Polypeptid, um Protease-resistent zu sein, eine Routine-Vorgehensweise, um die Spezifität und Erkennungssequenzen verschiedener Proteine zu vergleichen. Im ersten Fall muss die Spezifität einer möglichen proteolytischen Stelle nicht völlig exklusiv sein, sondern muss lediglich Spaltstellen vom Menschen und/oder Wirtszellproteasen ausschließen, die während der Handhabung, Aufbereitung und Reinigung des einkettigen Neurotoxins vorhanden sein können. Natürlich ist es bevorzugt, dass die Proteasestelle so spezifisch wie möglich ist. Im letzteren Fall braucht die Modifizierung der proteolytischen Spaltzelle nur ausreichend zu sein, um diese Stelle gegen die Aktivatorprotease und gegen humane und Wirtszellproteasen resistent zu machen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante modifizierte einkettige Neurotoxin weiter modifiziert, indem die Kette mit einem Bindungsmarkierung, umfassend ein Mitglied eines spezifischen Bindungskomplexes gebunden ist. Mit „spezifischem Bindungskomplex" sind zwei oder mehrere chemische oder biochemische Einheiten gemeint, die miteinander unter definierten Umgebungsbedingungen binden werden und die nicht bedeutend andere chemische oder biochemische Einheiten binden, die in der Umgebung unter den gleichen Bedingungen vorhanden sind. Beispiele der Mitglieder eines spezifischen Bindungskomplexes umfassen ohne Einschränkung einen Antikörper und sein Antigen, ein Lectin und sein Target-Carbohydrat, einen Nucleinsäurestrang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang, einen Zelloberflächenrezeptor und sein Ligand, ein Metall und eine Verbindung, die eine Koordination oder Chelatkomplex mit diesem Metall bilden kann, und dergleichen.
Bei dieser Ausführungsform kann das Bindungsmarkierung an das einkettige Toxin über einen Linker, bevorzugt einen spaltbaren Linker, gebunden werden. Beispiele möglicher Linker umfassen, obgleich nicht ausschließlich, 1) aliphatische Dicarbonsäuren der Formel HOOC-(CH₂)_n-COOH, wobei n=1-12 (kann an eine freie Aminogruppe gebunden werden); 2) HO-(CH₂)_n-COOH, wobei n>10 (geeignet zur Bindung an den Aminoterminus des Polypeptids); 3) substituierte Polybenzolstrukturen und 4) eine N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esterbindung. Die Verwendung eines Linkers, enthaltend ein Ester, ermöglicht die Spaltung der Esterbindung, gefolgt von der Verwendung bei der Reinigung des einkettigen Neurotoxins unter verhältnismäßig milden sauren Bedingungen.
Alternativ und am meisten bevorzugt kann das Bindungsmarkierung einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz eines adäquaten Polypeptids umfassen, das mit dem einkettigen Toxin als Fusionsprotein coexprimiert wird, solche Polypeptide können ohne Einschränkung umfassen, die Maltosebindungsdomäne des Maltosebindungsproteins (MBP), ein His₆-Markierung (eine Reihe von 6 Histidinresten); die Calmodilinbindungsdomäne des Calmodulinbindungsprotein und die Glutathionbindungsdomäne von Glutathion-S-Transferase.
Andere Polypeptidbindungsmarkierungen sind dem Fachmann ebenso bekannt und können leicht adoptiert werden, um erfindungsgemäß eingesetzt zu werden.
Zusätzlich kann die Bindungsmarkierung so konstruiert werden, dass es einer Proteasespaltstelle zwischen ihm selbst und entweder dem Aminoterminus oder dem Carboxylterminus des einkettigen Toxins aufweist, so dass es bei der Reinigung des Peptids entfernbar ist. Die proteolytische Spaltstelle kann so entworfen werden, dass sie durch die gleiche Aktivatorprotease gespalten wird, die ausgewählt wird, um das einkettige Toxin zwischen den H- und L-Ketten abzuspalten.
Es ist daher eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein rekombinantes aktivierbares einkettiges Neurotoxinmolekül bereitzustellen, das im Vergleich zu dem nativen Neurotoxin eine verringerte Toxizität aufweist, bis es durch Reaktion mit einer nicht-clostridialen Protease aktiviert wird.
Das einkettige Neurotoxin ist leichter zu reinigen, weniger gefährlich in der Handhabung beim Reinigungsverfahren und kann optional modifiziert sein, um dem Toxin wünschenswertere Eigenschaften zu geben.
Es ist ebenfalls eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen zum Herstellen eines rekombinanten aktivierbaren einkettigen Neurotoxins durch Modifizieren der Nucleotidsequenz, die das Neurotoxin codiert, um die native proteolytische Aminosäurenspaltsequenz, die die H- und L-Kette trennt, mit einer Aminosäuresequenz auszutauschen, die gegenüber einheimischen clostridialen oder Wirtszellproteasen stabil ist, die aber empfänglich für eine Spaltung durch eine ausgewählte Protease in vivo ist.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, stabilere Neurotoxinpolypeptide bereitzustellen durch Modifizierung der Nucleotidsequenz des codierenden Bereichs der H- und L-Ketten davon, Entfernen auftretender proteolytischer Spaltstellen, indem bewirkt wird, dass die labilen Aminosäuren mit anderen Aminosäureresten, die Toxinresistenz gegen ungewünschten proteolytischen Abbau überträgt, ausgetauscht werden.
Zusätzlich ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe, Verfahren bereitzustellen zum Reinigen von rekombinanten Neurotoxinen als einzelne Kette, indem das exprimierte einkettige Neurotoxin mit einer Bindungskomponente verbunden wird, die einen Partner eines spezifischen Bindungskomplexes umfasst, der bei der Affinitätsreinigung mit dem Bindungspartner, umfassend die andere Hälfte des Bindungskomplexes, verwendet werden kann. Die Reinigung kann chargenweise oder in einer Chromatographiesäule durchgeführt werden. Die Bindungskomponente kann dem Affinitätsschritt folgend anschließend entfernt und aus dem Neurotoxin getrennt werden.
Es ist außerdem eine erfindungsgemäße Aufgabe, einkettige rekombinante modifizierte Neurotoxinmoleküle bereitzustellen, die als therapeutische Agentien verwendet werden können. Die modifizierten Neurotoxinmoleküle können eine geänderte Zielspezifizität oder eine geänderte Aktivität im Vergleich zum nativen Neurotoxin, aus dem sie abstammen, oder beides aufweisen.
Es ist außerdem eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein einkettiges aktivierbares rekombinantes Neurotoxin bereitzustellen, das leichter gereinigt werden kann als das Wildtyp-Neurotoxin. Ein solches Neurotoxin ermöglicht die Großherstellung von schlecht gereinigtem hoch-reinem Toxin zur klinischen Verwendung.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen darzustellen, und beschränken den Erfindungsumfang, der in den Ansprüchen definiert ist, in keiner Weise.
Beispiel 1
Herstellung eines Expressionsvektors, enthaltend einen einkettigen TeTx-codierenden Bereich
Die vorliegende Erfindung kann beispielhaft dargestellt werden durch die Beschreibung der Herstellung eines Plasmids, das TeTx in E. coli als einzelnes Protein exprimieren wird, das leicht, d. h. durch Affinitätschromatographie, gereinigt ist. TeTx kann als Pilotsystem ausgewählt werden, da (i) die Verfügbarkeit eins aufgezeichneten Impfstoffes das Risiko seiner Handhabung deutlich verringert und (ii) es das am umfangreichsten studierte Toxin in Bezug auf das Exprimieren von HC- und LC-Domänen ist. Der Fachmann wird jedoch verstehen, dass die gleiche oder ähnliche Strategien eingesetzt werden können unter Verwendung jedes zweikettigen oder dreikettigen Toxins oder anderer bioaktiver Moleküle, die als einzelne Polypeptide exprimiert werden und durch proteolytische Spaltung aktiviert werden. Einkettige Moleküle wurden hergestellt, enthaltend die Wildtyp-TeTx L-Kette und eine mutierte Version der TeTx leichten Kette, wobei jeweils ein Glutaminsäurerest an Position 234 mit einem Alanin ausgetauscht ist (genannt „E234A", Ala²³⁴ oder „die E234A-Mutante leichte Kette"). Die spätere Mutation resultiert in eine inaktive TeTx leichte Kette und ein Plasmid, das die E234A-Mutante leichte Kette (pMAL-E234A) codiert, wurde, wie von Li et al. in Biochemistry 33: 7014-7020 (1994) beschrieben hergestellt (hierbei durch Bezugnahme aufgenommen). Das folgende Protokoll wurde zur Herstellung jedes einkettigen Toxins verwendet.
Der Vektor pTrcHisA, von Invitrogen erworben, wurde unter Verwendung eines Stratagene QuickChange^® ortsspezifischen Mutagenesekits modifiziert (für ortsspezifische Mutageneseverfahren, siehe z. B. Smith et al., J. Biol. Chem. 253: 6651-6560 (1979), die hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist), um zwei zusätzliche Restriktionsstellen (SalI und HindIII) stromaufwärts der Nucleotide zu erzeugen, die eine vorkommende Enterokinase (EK)-Spaltstelle codieren. Das Plasmid enthält unmittelbar stromaufwärts der Enterokinasespaltstelle außerdem ein Translations-Startcodon (ATG) gefolgt von einer Reihe von Codonen, die 6 Histidinreste codieren. Eine Mehrfachklonierungsstelle, enthaltend BamHI-, XhoI-, BglII-, PstI-, KpnI-, EcoRI-, BstBI- und HindIII-Spaltstellen, befindet sich unmittelbar stromabwärts der EK-Stelle; die HindIII-Stelle wurde durch ortsspezifische Mutagenese entfernt. Die folgenden Trimere wurden eingesetzt, um Restriktionsspaltstellen (unterstrichen) einzuführen, die stromaufwärts der EK-Spaltstelle liegen:
SEQ ID Nr. 1
SEQ ID Nr. 2
Das resultierende Plasmid enthält sowohl SalI- als auch HindIII-Stellen, die sich an der 5'-Seite der Nucleotidsequenz befinden, die die Enterokinase (EK)-Spaltstelle vom Rind codieren.
Die Nucleotidsequenz, die die Wildtyp TeTx L-Kette codiert, wird aus dem Plasmid pMAL-LC erhalten, das von Li et al. in Biochemistry 33, 7014-7020 (1994), beschrieben ist, hier durch Bezugnahme aufgenommen. Das Plasmid codiert die TeTx leichte Kette als Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungsprotein (MBP), das sich unmittelbar stromaufwärts der für die L-Kette codierenden Sequenz befindet. Die Teile MBP und die L-Kette des Fusionsproteins sind so entworfen, dass sie die Spaltstelle für den humanen Blutcoagulierungsfaktor Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) enthalten, um, nachdem die Affinitätsreinigung durchgeführt worden ist, die Entfernung des MBP zu erleichtern.
Das DNA-Fragment, enthaltend die codierende Sequenz der L-Kette, wurde aus dem Plasmid pMAL-LC durch Verdau des Plasmids mit SalI und HindIII ausgeschnitten, das resultierende DNA-Fragment, enthaltend die L-Kette, wird Gel-gereinigt und dieses Fragment in das Plasmid pTrcHisA, an den neu kreierten SalI- und HindIII-Stellen, stromaufwärts der EK-Stelle ligiert. Dieses Fragment führt zum Ausschneiden der Maltose-Bindungsproetinsequenzen vom N-Terminus der L-Kette.
Ein identisches Verfahren wurde verwendet, um das DNA-Fragment subzuklonieren, enthaltend eine mutante L-Kette aus dem Plasmid pMAL-LC-Ala²³⁴, bei dem eine einzelne Aminosäureänderung an der Aminosäure 234 der L-Kette vorgenommen wurde, wobei die native Glutaminsäure mit Alanin ersetzt wurde. Diese Änderung reicht aus, um die Zink-Endopeptidase-Aktivität der L-Kette abzuschaffen und ein nicht-toxisches, rekonstituiertes Tetanustoxin, enthaltend die native H-Kette und die Ala²³⁴-L-Kette zu ergeben.
Das DNA-Fragment, enthaltend die H-Kette, wurde aus dem Plasmid pMAL-HC erhalten; die Herstellung dieses Vektors ist von Li et al. in J. Biochem. 125: 1200-1208 (1999) beschrieben, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Kurz gesagt wird das Gen, das die H-Kette codiert, durch Zusammenfügen von drei DNA-Fragmenten, enthaltend unterschiedliche Teile der Sequenz, die die H-Kette codiert, die in getrennte Plasmide kloniert worden ist. Die Fragmente, umfassend die Amino-terminale Hälfte von H, wurden zunächst unter Verwendung von Standardpolymerase-Kettenreaktionsverfahren amplifiziert (siehe z. B. Mullis, U.S. Patent Nr. 4,683,202 und Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,800,159, die beide in ihrer Gesamtheit hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind) und die folgenden Primer: PCR-Primer a (enthaltend eine XbaI-Spaltstelle) und b (enthalend eine BglII-Spaltstelle) (jeweils SEQ ID Nr. 3 und 4) wurden verwendet, um das H-Ketten-Fragment zu amplifizieren, das in einem Plasmid enthalten ist, das pTet8 genannt wird; PCR-Primer c (enthaltend eine BglII-Spaltstelle) und d (enthaltend sowohl eine HindIII- als auch eine SalI-Spaltstelle) (jeweils SEQ ID Nr. 5 und 6) wurden verwendet, um das H-Ketten-Fragment zu amplifizieren, das in einem Plasmid enthalten ist, das pTet14 genannt wird. Die Nucleotidsequenzen dieser Primer wurden nachfolgend bereitgestellt, wobei die Restriktionsstellen unterstrichen sind.
SEQ ID Nr. 3

AATAGATCTAGATCATTAACAGATTTAGGA (a)

SEQ ID Nr. 4

TTCTAAAGATCTATACATTTGATAACT (b)

SEQ ID Nr. 5

ATGTATAGATCTTTAGAATATCAAGTA (c)

SEQ ID Nr. 6

ATCGATAAGCTTTTATCAGTCGACCCAACAATCCAGATTTTTAGA (d)

Der PCR-Amplifizierung und der Gelreinigung der amplifizierten H-Ketten-Fragmente folgend, wurde jedes Fragment mit BglII verdaut und ligiert, um die vollständige N-terminale Hälfte des codierenden Bereichs der H-Kette zu ergeben. Dieses Legierungsprodukt wurde anschließend mit XbaI und HindIII verdaut und in die Mehrfachklonierungsstelle von pMAL-c2-T subkloniert (das Plasmid wird auch mit XbaI und HindIII geschnitten), die sich stromabwärts des codierenden Bereichs für MBP und der Faktor Xa-Stelle befindet. pMAL-c2 ist ein im Handel erhältlicher Vektor, der dem Fachmann bekannt ist. Das resultierende Plasmid heißt pMAL-H_N.
Der gesamte codierende Bereich der H-Kette wurde wie folgt zusammengeführt. Das pMAL-H_N-Plasmid wurde mit SacI und SalI verdaut, um das DNA-Fragment zu ergeben, das den N-Terminus der H-Kette codiert. Das Plasmid pTet215 wurde mit SalI und BamHI verdaut, um das DNA-Fragment zu ergeben, das den Carboxylterminus der H-Kette codiert. Der Vektor pMAL-c2-t wurde mit SacI und BamHI verdaut und an die verdauten H-Ketten-Fragmente ligiert, die wegen der Verwendung von bestimmten Endonucleasen in der richtigen Richtung zusammengeführt werden. Das resultierende Plasmid ist pMAL-HC.
Die DNA-Fragmente, die die H- und L-Ketten codieren (einschließlich Ala²³⁴ L-Kette) wurden geschnitten und direkt aus pMAL-LC oder pMALE234A und pMAL-HC-Konstrukten gereinigt und in den modifizierten pTrcHisA-Vektor, der oben beschrieben ist, subkloniert. Die H-Kette wurde zunächst in dem modifizierten Vektor an die BamHI-Stelle, unmittelbar stromabwärts der EK-Stelle, ligiert und das resultierende Plasmid wurde Gel-gereinigt. Dem Verdau dieses Plasmids mit HindIII und SalI folgend wurde die L-Kette an der Position, unmittelbar stromaufwärts der EK-Spaltstelle ligiert.
Das resultierende Plasmidkonstrukt enthält die Nucleotidsequenz, die das einkettige Toxinprotein codiert, umfassend (vom Amino- bis Carboxylterminus): sechs Histidinreste (die His-Markierung), gefolgt von der L-Kette, einer Enterokinase-Spaltstelle, und der H-Kette. Die translatierte Verbindung zwischen den L- und H-Ketten, enthaltend die EK-Spaltstelle (DDDDK), ist unten gezeigt (in der Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus) und in 1.
SEQ ID Nr. 7
Um die Expression der beiden Ketten als eine Einheit zu ermöglichen, wurde eine Nucleotidsequenz, umfassend ein Stop-Codon, das an dem 3'-Ende der L-Ketten codierenden Sequenz in pMAL-LC vorkommt, durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von zwei Primern (SEQ ID Nr. 8 und 9) entfernt, wodurch ein einzelner Leserahmen, enthaltend sowohl die H- als auch die L-Kette, erhalten wurde.
SEQ ID Nr. 8
SEQ ID Nr. 9
Das resultierende Konstrukt auf pTrcHisA-Basis wurde in den E. coli-Stamm JM109 durch Hitzeschock unter Verwendung des Verfahrens von Hanahan transformiert und die transformierten Kolonien wurden auf Luria Agarplatten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, isoliert. Die Plasmide wurden aus diesen Transformanten gereinigt und die Insertionen wurden durch analytischen Restriktions-Endonuclease-Verdau und Agarosegel-Elektrophorese bestätigt.
Beispiel 2
Expression und physikalische Charakterisierung von einkettigem TeTx
Die Expression des einkettigen TeTx-Konstruktes auf pTrcHisA-Basis (unter Kontrolle eines Hybrid trp/lac Promotors) wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG (Isopropylthio-galactopyranosid) zu einer konfluenten Kultur eines beispielhaften transformanten Klons in 200 ml Luriabrühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, induziert und weiter bei 37°C 16 Stunden vor der Zellernte durch Zentrifugierung inkubiert.
Die Zellpellets wurden wieder in 30 ml Puffer A (20 mM Na₂PO₄, 500 mM NaCl (pH 7,8)) suspendiert, durch Ultrabeschallung bei 4°C anschließend unter Verwendung von 10-Sekunden-Bursts bei einer mittleren Einstellung lysiert. Unlösliche Trümmer wurden durch Zentrifugierung bei 9.000 × U 30 min. bei 4°C entfernt und der Überstand durch Zentrifugierung zurückgewonnen.
Der Überstand, enthaltend jedes einkettige Konstrukt, wurde 20 min. bei 22°C mit 2 ml Nickel-Eisenharz (Invitrogen Corp.) mittels Affinitätsreinigung durch Chelatbildung zwischen den Histidinresten am Aminoterminus des einkettigen Toxinmoleküls und dem Nickel inkubiert. Die Harze wurden anschließend auf Minisäulen geladen und mit 200 ml Waschpuffer (20 mM Na₂PO₄, 500 mM NaCl (pH 6,0)) gewaschen, um nicht spezifisch gebundenes Material zu entfernen; die rekombinanten einkettigen Proteine wurden in 0,5 ml Fraktionen mit 8-15 ml 100 mM Imidazol in Puffer A eluiert. Die Konzentration der eluierten Einzelketten wurde durch die Bradford's Protein-Untersuchung (Bio-Rad Laboratories) gemessen; ungefähr 1 Milligramm des Fusionsproteins wurde gewonnen.
Beispiel 3
SDS-PAGE und Westernblot-Untersuchung der rekombinanten Einzelkette TeTx
Die einkettigen TeTx-Konstrukte wurden in Luriabrühe, enthaltend Ampicillin, bei 37°C wachsen gelassen und Aliquote sowohl vor als auch nach der Induktion der Proteinexpression mit IPTG entnommen. Rohe Zellextrakte wurden für die SDS-PAGE durch Verdünnen in Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen in der Gegenwart von β-Mercaptoethanol (BME) hergestellt. Der SDS-PAGE-Elektrophorese folgend, wurden die getrennten Proteine wie folgt Western-geblottet: Die Proteine wurden elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran unter Verwendung von Standardverfahren übertragen (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), das hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist); die Membran behandelt, um Hintergrund-Ig-Bindung zu verringern und anschließend unter Verwendung eines Anti-His₆-Antikörpers sondiert, unter Verwendung eines alkalischen Phosphase-konjugierten sekundären Antikörpers danach nachgewiesen und mit einem 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat/nitroblautetrazolsubstrat entwickelt.
Wie in den Bahnen 1 und 2 der 2A gezeigt, ergab der Westernblot keine nachweisbare TeTx-Expression vor der Induktion der Proteinsynthese, im Gegensatz dazu offenbarte sich eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 150 kDa in den Aliquoten, die nach der Proteininduktion entnommen wurden (siehe Bahnen 3 und 4). In 2A sind die Bahnen 1 und 3 das WT-Konstrukt der leichten Kette und die Bahnen 2 und 4 enthalten das mutante E234A-Konstrukt.
2B ist ein Westernblot der IPTG-induzierten Zellextrakte aus Zellen, die mit dem E234A-Konstrukt transformiert sind. Bedeutsam ist, dass keine sichtbaren proteolytischen Spaltprodukte der leichten Kette mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet wurden, ein Beweis für die relative Stabilität des einkettigen Toxins nach der Expression und Reinigung.
3 zeigt die Ergebnisse eines zweiten Experimentes, bei dem Affinitäts-gereinigtes rekombinantes einkettiges (SC) TeTx mit Enterokinase wie folgt geschnitten wird. 30 μg gereinigtes einkettiges Toxin wurden mit 1 Einheit Enterokinase in einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-Hcl (pH 8,0), 1 mM CaCl₂ und 0,1 % Tween-20 (v/v) inkubiert. Als Kontrolle wurde das rekombinante Protein in der gleichen Reaktionsmischung, enthaltend kein EK, inkubiert. Diese Proben plus eine Aliquote von nativem (nicht-rekombinantem) TeTx wurden der SDS-PAGE in einem 8 % Polyacrylamidgel unter entweder reduzierenden (+BME) oder nicht reduzierenden (-BME) Bedingungen unterworfen. Das resultierende Gel wurde sowohl als Westernblot als auch bei dem nachfolgenden Nachweis unter Verwendung von Anti-H-Ketten-Antikörpern (3B) und durch direkte Färbung mit Coomassie-Blau (3A) verwendet.
Wie in 3 angezeigt, migrieren unter nicht reduzierenden Bedingungen alle drei Proben (Natives TeTx (Bahn 1), rekombinantes geschnittenes Toxin (Bahn 2) und durch Enterokinase geschnittenes rekombinantes Toxin (Bahn 3)) als Dublette (anscheinend unterschiedliche Konformationsisomere, die sich in einer einzelnen Bande durch Induktion auflösen) mit im Wesentlichen nicht unterscheidbaren anscheinenden Molekulargewichten von ungefähr 150 kDa. Das nicht-reduzierende Gel bestätigt, dass 1) hohe Expressionsmengen erhalten werden, 2) die Disulfidbindungen, die die leichten und schweren Ketten verbinden, vollständig formiert werden und 3) das rekombinante einkettige Toxin nicht bemerkbarem proteolytischem Abbau unterliegen.
Im Gegensatz dazu ergeben unter reduzierenden Bedingungen Wildtyp- und geschnittenes rekombinantes Toxin eine H-Kette mit einem Molekulargewicht von ungefähr 100 kDa durch sowohl Westernblot als auch Coomassie-Färbung. Zusätzlich zeigen beide dieser Proben in dem Coomassie-gefärbten Gel eine niedrigere Molekulargewichtsart von ungefähr 50 kDa, die der L-Kette entspricht. Die Wildtyp-L-Kette migriert mit einem niedrigeren anscheinenden Molekulargewicht als die rekombinante L-Kette, die 22 zusätzlich Aminosäurereste wegen der Gegenwart der His₆-Komponente und einen modifizierten EK-Spaltstelle enthaltenden Verbindungsbereich der Zwischenkette aufweist. Das ungeschnittene rekombinante Toxin (Bahn 3) migriert als einzelne Bande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr 150 kDa. Zu bemerken ist, dass kein ungeschnittenes Toxin in Bahn 3 zu beobachten ist, was auf die Wirksamkeit der Enterokinasebehandlung hinweist.
Beispiel 4
In vitro Toxin-induzierte Paralyse durch rekombinantes einkettiges TeTx
Die biologische Aktivität von rekombinantem TeTx wurde außerdem untersucht und mit dem Wildtyp-Toxin unter Verwendung von phrenischen Nerven-Hemidiaphragma verglichen, da natives Toxin dafür bekannt ist, neuromuskuläre Paralyse zu verursachen, obgleich bei höheren Konzentrationen als die die im CNS wirken. Für dieses Experiment wurden linke phrenische Nervendiaphragma der Maus aus der Maus (T/O-Stamm, 4 Wochen alt und ~20 g Gewicht) seziert und sofort in ein geschlossenes Zirkulations-Superfusionssystem, enthaltend 10 ml Krebs-Ringer-Lösung (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 2,5 mM CaCl₂, 23,8 mM NaHCO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 11,7 mM Glucose (pH 7,4)), aufbebrodelt mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ und ergänzt mit 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin, um nichtspezifische Adsorption der Toxine zu verringern (Li et al., Biochemistry 33: 7014-7020 (1994)). Die Hemidiaphragmata wurden in einem Bad, das 10 ml Krebs-Ringer-Puffer enthält bei 37°C 10 Minuten gehalten, bevor sie 4 oder 10 nM nativen TeTx (
und ∇, jeweils) oder 10 nM geschnittenem rekombinantem TeTx
oder 10 nM ungeschnittenem rekombinantem TeTx (❍), jeweils ausgesetzt wurden (siehe 4).
Muskelspannung wurde durch supra-maximale Stimulierung der phrenischen Nerven mit bipolaren Elektroden ausgelöst und über ein Kraftaustauscher-Transducer (Lectromed, UK), der an einen Amplizierer und ein Computersystem (MacLab, AD Instruments, UK) verbunden ist, aufgezeichnet. Parameter der Nervenstimulierung waren 0,2 Hz Rechteckwellen von 0,1 msek. Dauer mit 1,5-2,5 V Amplitude. Toxin-induzierte Paralyse der neuromuskulären Transmission wurde als Zeit, die für die Nerven ausgelöste Muskelkontraktion erforderlich ist, um auf 10 % (90 % Reduktion) des Ursprungswertes abzusinken, quantifiziert.
Wie in 4 gezeigt, wurde festgestellt, dass bei dem Blockieren von Nerven-induzierter Muskelspannung 10 nM rekombinantes geschnittenes TeTx so wirksam ist wie 10 nM natives Toxin, wobei die Präparate eine 90 % Reduktion der Muskelspannung in ungefähr 170 Minuten ergaben. Dieses neue TeTx-Präparat, das in E. coli in großen Mengen als einkettiges aktivierbares Polypeptid exprimiert und durch einen einfachen Affinitäts-Chromatographieschritt gereinigt wird, erwies sich hinsichtlich aller untersuchten Kriterien folglich als vollständig aktiv.
Im Gegensatz dazu erforderten 10 nM des ungeschnittenen TeTx-Präparats ungefähr zweimal solange, um die Muskelspannung zu verringern und war ungefähr so aktiv wie 4 nM Wildtyp-TeTx. Als Kontrolle wurde festgestellt, dass Hemidiaphragmata, die mit KR-Puffer inkubiert wurden, wobei eine kleine Menge Enterokinase in den experimentellen Proben vorhanden war, eine negierbare Verringerung der Muskelspannung über 5 Stunden zeigten.
Folglich weist dieses Experiment darauf hin, dass das ungeschnittene TeTx beträchtlich weniger toxisch ist als entweder das Wildtyp- oder rekombinante geschnittene Protein in vitro.
Beispiel 5
Weitere Modifizierung des einkettigen TeTx, um proteolytische Spaltstellen zu entfernen, wobei die Toxizität von ungeschnittenem rekombinantem Toxin verringert wird.
Obgleich die ungeschnittene rekombinante einkettige TeTx-Form verringerte Toxizität entfaltet im Vergleich zu der geschnittenen Form, entsteht die Rest-Toxinaktivität durch Aktivierung des Toxins mittels zusätzlicher Proteasen in vivo. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Stellen in dem einkettigen Toxinmolekül, das für proteolytische Spaltung durch Trypsin und Arg C-Protease empfänglich ist, durch Inkubation von einkettigem TeTx mit diesen Enzymen wie folgt identifiziert. 50 μg rekombinantes einkettiges TeTx wurden mit 4 μg Arg-C bei 37°C 4 h, 0,1 μg Trypsin bei 37°C 0,5 h oder Puffer ohne Protease als Kontrolle inkubiert. Diese Reaktionen wurden durch Addition von SDS-PAGE Probenpuffer, enthaltend 0,1 % SDS, beendet, gefolgt von 5 minütigem Kochen, anschließend wurden die Proben SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von einer elektrophoretischen Westernübertragung auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran. Die Membran wurde mit IgG, der für das His₆-Markierung spezifisch ist, geblottet und unter Verwendung eines Meerrettich-Peroxidase-Färbungssystems nachgewiesen.
Wie in 5 gezeigt, ergab der Westernblot, dass Trypsin und Arg C-Protease ein L-Ketten (und folglich ein H-Ketten)-Fragment der gleichen Größe ergaben. Die Übertragung eines Duplikatgels wurde auf Protein mit Ponceau-Rot gefärbt und die H-Ketten-Bande von ungefähr einem Molekulargewicht von 100 kDa aus jeder Bahn herausgeschnitten und durch N-terminales Sequenzieren untersucht.
In dem rekombinanten einkettigen TeTx sind die LC und HC durch 17 Aminosäuren (GEKLYDDDDKDRWGSSR) verbunden, gefolgt von dem Anfang der H-Ketten-Sequenz (SLTDLGGEL...). N-terminales Aminosäure-Sequenzieren des größeren von sowohl Trypsin als auch Arg C-Protease erzeugten Fragmentes ergab, dass die ersten 5 Aminosäuren des 100 kDa Trypsin und Arg C-Protease-Spaltproduktproteins SLTDL sind; folglich scheint es, dass diese Proteasen das einkettige Toxin zwischen der R-S-Bindung spalten (siehe 1), um die H-Kette und die L-Kette, enthaltend den EK-Linker an seinem C-Terminus, freizusetzen, wobei diese Variante ein zweikettiges Toxin ergab, das im Wesentlichen identisch mit dem geschnittenen Toxin ist.
Das Arginin am Carboxy-Terminus der EK-Linkersequenz wurde durch ortsspezifische Mutagenese zu einem Glycin (R496G) mutiert, und das resultierende einkettige Toxin-Polypeptid wurde wie oben exprimiert und gereinigt.
Die Titrierung von 6 μg des mutierten einkettigen (WT LC) R496G Toxins und von SC TeTx, dem eine solche Mutation fehlt, gegen 0, 0,01, 0,1, 1, 10 μg/ml Trypsin, gefolgt von SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau ergab das in 6 gezeigte Spaltmuster. Wie daraus zu ersehen ist, sind beide einkettigen Moleküle empfänglich für Trypsinspaltung, die R496G-Mutante ergab jedoch weniger Fragmente als das SC-Toxin, das nicht eine Mutation im Schleifenbereich zwischen den Ketten enthält. Obwohl drei Trypsinpeptidbanden deutlich in der Nähe der Bande der leichten Kette durch Trypsinspaltung von SC WT-Toxin zu beobachten sind, werden z. B. nur zwei solche Banden in den Aufschlussprodukten erkannt.
Die Tatsache, dass verbleibende Trypsinstellen in dem R496G-Mutanten SC-Toxin existieren, begründet wahrscheinlich die Tatsache, dass diese Mutante das Herabsetzen der Toxizität im Vergleich zu dem ungeschnittenen SC-Toxin auslöst; beide Präparate ergeben ähnliche Werte bei der Maussterblichkeit und den oben beschriebenen neuromuskulären Paralyseuntersuchungen.
Ein unterschiedliches Assay-System wurde verwendet, um Neurotoxinaktivität gegen CNS-Neurone, Zellen, die naturgemäß durch TeTx beeinflusst sind, zu messen. Die verwendeten Zellen waren Kleinhirnneuronen, wobei diese Zellen aus dem Kleinhirn von 7 Tage alten Ratten dissoziiert wurden. Neuronen wurden auf 1-2 × 10⁶/ml in Medium, bestehend aus 3 Teilen Basal-Eagle-Medium und 1 Teil eines Puffers, bestehend aus 40 mM HEPES-NaOH (pH 7,3), 78,4 mM KCl, 37,6 mM D-Glucose, 2,8 mM CaCl₂, 1,6 mM MgSO₄ und 1,0 mM NaH₂PO₄, sowie 1 × N2-Zusatz, 1,0 mM L-Glutamin, 60 Einheiten/ml Penicillin, 60 μg/ml Streptomycin und 5 % (V/V) dialysiertes Pferdeserum suspendiert. Ein Milliliter dieser Zellsuspension wurde zu Poly-D-Lysin-beschichteten Vertiefungen mit einem Durchmesser von 22 mm gegeben. Cytosin β-D-Arabinofuranosid (Ara-C, 40 μM) wurde nach 20-24 Stunden in 5 % (V/V) Co₂-Kultur gegeben und die Neuronen wurden durch wöchentliches Austauschen des oben aufgeführten Mediums, enthaltend 40 μM Ara-C beibehalten.
Bei jeder Untersuchung wurden Neuronen mindestens 10 Tage in vitro kultiviert, viermal mit O₂-vergastem Krebs-Ringer HEPES-Puffer (KRH, mM: 20 HEPES.NaOH pH 7,4, 128 NaCl, 5 KCl 1 NaH₂PO₄, 1,4 CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 10 D-Glucose und 0,05 mg/ml BSA) gewaschen und 0,5 ml des letzteren Puffers, enthaltend 0,25 μCi/ml [14C]-Glutamin (d. h. der Glutamatvorläufer) wurden zugegeben.
Alle Schritte wurden bei 37°C durchgeführt. Nach einer 45-minütigen Markierungsdauer wurde das Medium entfernt und die Neuronen viermal wie zuvor gewaschen. Kontrollneurone und Toxin-behandelte Neurone wurden 5 Minuten bei 37°C in KRH-Puffer, enthaltend entweder 1,4 mM Ca²⁺ oder 0,5 mM EGTA (d. h. um die CA²⁺-unabhängige Freigabe zu beurteilen), inkubiert; Aliquote wurden anschließend entfernt und zur Untersuchung des [¹⁴C]-Glutamatgehaltes durch Scintillationszählen aufbewahrt. Sofort nach dem Entfernen des obigen Basismediums wurden ein modifizierter KRH-Puffer, enthaltend 50 mM KCL (enthaltend einen niedrigeren NaCl-Gehalt von 83 mM, um ein normales osmotisches Potenzial beizubehalten) und entweder 1,4 Ca²⁺ oder 0,5 mM EGTA für eine 5-minütige Stimulierungsdauer zugegeben. Letztlich wurden die Neuronen mit 20 mM EGTA.NaOH pH 7,5, enthaltend 1 % (g/v) SDS, aufgelöst und mit Aliquoten-Scintillationszählung durchgeführt, um deren verbleibende radioaktive Mengen zu berechnen. Die Mengen von ¹⁴C-Glutamat in Basis- und stimulierten Proben wurden als Prozentwerte im Verhältnis zu der berechneten Gesamtzellmenge ausgedrückt. Die prozentualen [¹⁴C]-Glutamatmengen in EGTA-enthaltendem Puffer wurden von den Werten abgezogen, die bei Ca²⁺-enthaltenden Proben erfasst wurden, um die maßgebliche Ca²⁺-abhängige Komponente der Freigabe zu berechnen und wiederum die späteren Basisablesungen wurden von den Werten subtrahiert, die für 50 mM KCl-Proben erhalten wurden, um die K⁺-hervorgerufene Ca²⁺-abhängige Komponente der Glutamatfreigabe zu ergeben.
8 stellt die Fähigkeit von rekombinantem Toxin dar, die Neurotransmitterfreigabe zu inhibieren. Kleinhirnneuronen, die in vitro 10 Tage aufbewahrt wurden, wurden zweimal mit eiskaltem KRH-Puffer, enthaltend 5 mM Mg²⁺ und 0,5 mM Ca²⁺ gewaschen, anschließend in diesem Puffer-spezifischen Konzentrationen ausgesetzt von
und ausgefüllt nativem TeTx (❍) EK-geschnittenem TeTx R496G,
einkettigem, geschnittenen TeTx oder (∇) EK-geschnittenem TeTx E234A 60 min. bei 4°C (siehe 8). Natives TeTx (0,2 nM) wurde anschließend zu den spezifizierten Vertiefungen gegeben und nach weiteren 30 Minuten wurden die Neuronen dreimal mit eiskaltem KRH-Puffer gewaschen und anschließend 30 min. bei 37°C inkubiert. Die darauf folende Untersuchung der K⁺-ausgelösten Ca²⁺-abhängigen Neurotransmitterfreigabe wurde, wie oben detailliert ausgeführt, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in 8 gezeigt.
Wenn Kleinhirnneuronen geschnittenem TeTx ausgesetzt wurden, wurde eine Dosis-abhängige Inhibierung der Ca²⁺-abhängigen Transmitterfreigabe mit einer Potenz, die ähnlich zu der von nativem Toxin ist, festgestellt. Geschnittenes SC TeTx, sowohl WT als auch R496G, ergaben in diesem Assay ähnliche Werte. Obwohl die Toxinaktivität in dem ungeschnittenen einkettigen Molekül durch die Entfernung einer einzelnen Trypsin-Spaltstelle nicht aufgehoben ist, ist folglich die Entfernung zusätzlicher solcher Spaltstellen in Bereichen des einkettigen Toxins realisierbar, um eine aktivierbare einkettige Proform des Toxins zu erlangen, das noch geringere Toxizität entfaltet, außer wenn es in vitro aktiviert wird, wenn seine vollständige Aktivität erreicht werden kann.
Beispiel 7
Protease-defiziente TeTx-Mutante antagonisiert die Wirkungen von TeTx auf peripheren und Zentralneuronen
Tabelle 1 zeigt die tabellarisierten Ergebnisse der angezeigten TeTx-Konstrukte, die in drei Untersuchungen der Toxinaktivität getestet wurden: Fähigkeit, das HV62-Peptid zu spalten (das nur die proteolytische Aktivität bemisst): neuromuskuläre Paralyse (eine Angabe der Fähigkeit der Toxinmoleküle, in die Zelle einzutreten und infolgedessen die Neurotransmitterfreigabe zu inhibieren), und Maussterblichkeit durch intraperitoneale Injektion der verschiedenen Toxinkonstrukte. Die ersten beiden dieser Untersuchungen wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Die Untersuchung der Maussterblichkeit wurde im Wesentlichen wie folgt durchgeführt: Proben von rekombinant gereinigtem einkettigem TeTx, der R496G-Mutante von TeTx und der E234A-Mutante von TeTx wurden jeweils in zwei Aliquote unterteilt und jede Aliquote mit Enterokinase behandelt, um das Toxin zu schneiden. Alle Proben wurden serienmäßig in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 150 mM NaCl und 0,25 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt, und die Toxinpräparate wurden intraperitoneal in Mäuse injiziert.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die nativen und geschnittenen TeTx-Präparate in der Untersuchung der Maussterblichkeit vergleichbar aktiv, mit einem LD₅₀ von ungefähr 1 × 10⁸/mg. Das ungeschnittene rekombinante Toxin und die ungeschnittene R496G-Mutante waren beide ungefähr halb so aktiv. Letztlich erwies sich das geschnittene E234A proteolytisch inaktive Toxin weniger als 5 × 10⁷-fach weniger aktiv.

^a Anfangsgeschwindigkeiten der Paralyse wurden gemessen unter Verwendung des Verfahrens auf RP-HPLC-Basis, das von Foran et al. (1994) detailliert beschrieben wurde. Inkubationen mit 15 μM eines synthetischen Peptids, entsprechend den Resten 33 bis 94 von humanem VAMP-2 (HV62) wurden bei 37°C in 50 mM HEPES.NaOH, pH 7,5, enthaltend 2 mM DTT 0,2 mg.ml^-1 BSA und 50 μM ZnCl₂ unter Verwendung von geeigneten Konzentrationen jedes reduzierten Toxinpräparats, die erforderlich ist, um 10-15 % des Substrats während einer Dauer von 30 min. zu proteolysieren, durchgeführt. Die Daten sind Mittelwerte (± Standardabweichung: n=4).
^b LD₅₀ ist die Toxinmenge, die 50 % der injizierten Mäuse innerhalb von 4 Tagen tötet.
^c Toxinpräparate wurden mit EK (1 Einheit/30 μg) bei 22°C 1 h geschnitten.
^d Dieser v⁰-Wert stellt die Nachweisgrenzen des RP-HPC-Tests dar; keine HV62-Proteolyse wurde bei anhaltenden Inkubationen beobachtet.

Gereinigtes SC E234A TeTx, bei dem das katalytische E an Position 234 durch ein A ausgetauscht wurde, zeigte keine nachweisbare Proteolyse eines Peptids, enthaltend die Reste 33 bis 94 von humanem VAMP-2 (genannt HV62), entweder vor oder nach dem Schneiden mit EK. Folglich zeigte sich das geschnittene TeTx E234A frei von Toxizität in Mäusen und ohne Fähigkeit, die Transmitterfreigabe an der neuromuskulären Verbindungsstelle oder aus Kleinhirnneuronen zu inhibieren.
Bedeutend ist jedoch, dass diesem mutanten Toxin die Fähigkeit bleibt, an die Oberflächenrezeptoren auf peripheren und Zentralneuronen zu binden. Die Vor-Inkubation von Kleinhirnneuronen mit geschnittenem (10-60 nM) oder ungeschnittenem (7-40 nM) TeTx E234A bei 4°C, gefolgt von der Zugabe von 0,2 nM nativem Toxin antagonisierte die native Toxininhibierung der Transmitterfreigabe bei 37°C in ähnlichem Ausmaß (7).
Wie in 9 dargestellt, verlängerte sich die Zeit, die gebraucht wird, um neuromuskuläre Paralyse zu bewirken, wenn Mäusediaphragma 100 nM TeTx E234A bei 4°C 60 min. vor der Zugabe von 1 nM nativem Toxin ausgesetzt werden.
Hemidiaphragma des Phrenikus der Maus wurde in KR bei 37°C mit 20 nM rekombinantem TeTx E234A (∇) inkubiert, während der Stimulierung der Nerven (0,2 Hz, 1,5-2,5 V) und Aufzeichnen der Muskelspannung. Zur Überprüfung der Competition wurden Hemidiaphragmata 60 min. bei 4°C mit MKR, enthaltend 0,1 % BAS allein (☐) oder das Letztere 100 nM geschnittenem TeTx E234A (❍) vor der Zugabe von 1 nM nativem TeTx inkubiert. Nach 30-minütiger Aussetzung des Letzteren wurden die Gewebe dreimal mit MKR und zweimal mit KR gewaschen. Die Temperatur wurde auf 37°C angehoben und die Nerven stimuliert, wobei die ausgelöste Muskelzuckung, wie oben ausgeführt, aufgezeichnet wurde. Die sichtbare Competition der Toxinbindung durch die Mutante, die bei beiden Geweben beobachtet wurde, verdeutlicht, dass das rekombinante zweikettige TeTx wesentlich höhere Affinität für die Zelloberflächenrezeptoren entfaltet als die schwere Kette oder H_c von TeTx allein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konformation des rekombinanten zweikettigen TeTx hohe Affinität an den Zelloberflächenrezeptor aufweist.
Darüber hinaus und sehr bezeichnend zeigen diese Daten, dass rekombinante Moleküle gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren der vorliegenden Meldung erzeugt werden können, die spezifische Bindung für den gleichen zellulären Rezeptor wie TeTx aufweisen. Solche Moleküle können, wie die E234A-Mutante, als Toxinmoleküle jedoch inaktiv sein, behalten aber die Fähigkeit bei, von der Zielzelle aufgenommen zu werden, folglich dienen sie als potentielle Transportermoleküle.
Beispiel 8
Expression von einkettigem BoNT/A
Unter Verwendung von Verfahren, die ähnlich zu den oben beschriebenen sind, wurden DNA-Fragmente, enthaltend Neurotoxin H- und L-Ketten des BoNT Subtyps A, zusammen ligiert, wobei sie durch die EK-Spaltstelle voneinander getrennt sind. Diese einkettige Toxin kodierende Sequenz wurde in eine Vielzahl von Expressionsvektoren, enthaltend unterschiedliche N-terminale Sequenzen und Promotoren eingeführt, wie unten in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Die „Fusionsmarkierungen" umfassen jeweils ein Mitglied eines spezifischen Bindungskomplexes als Reinigungshilfe und um die Löslichkeit und Stabilität des exprimierten Proteins zu verbessern. Diese Plasmide wurden in die E. coli-Stämme, die in Tabelle 2 angezeigt sind, transformiert, und die Expression des einkettigen Toxins wurde aufgezeichnet.
In einem weiteren Experiment wurde das einkettige BoNT/A-Konstrukt in das Plasmid pMAL-c2 zwischen den BamHI und HindIII-Restriktionsstellen eingeführt, was zu einer codierenden Sequenz für ein Fusionsprotein führt, das das Maltose-Bindungsprotein am N-Terminus enthält, gefolgt von einer Faktor Xa-Spaltstelle. Transformante JM 109 Kolonien wurden in Luriabrühe, enthaltend Ampicillin, ausgewählt, die Expression wurde durch IPTG auf eine Endkonzentration von 0,3 mM induziert. Wie im Fall des TeTx-Konstruktes, wurden Aliquote der Zellkultur vor und nach der Induktion gesammelt, die Zellen durch Beschallung in jeder Probe lysiert, und der Überstand unter sowohl reduzierenden als auch nicht reduzierenden Bedingungen für die SDS-PAGE aufbereitet. Nach der Elektrophorese zum Trennen der Proteine gemäß deren anscheinendem Molekulargewicht wurde das Gel einem Westernblot unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen die H-Kette von BoNT/A gerichtet ist, unterworfen. Der Westernblot ergab das Auftreten einer immunologisch reaktiven einkettigen Toxinbande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr 200 kDa. Weitere Modifizierungen des einkettigen BoNT-Molekü1s, um zufällige Protease-Spaltstellen zu beseitigen (ähnlich zu solchen Modifizierungen, die an der TeTx-Stelle, die gegen Trypsin und Arg C-Protease unbeständig ist, wie oben beschrieben) führt zu einer noch höheren Stabilität des einkettigen BoNT/A-Moleküls.
Beispiel 9
Herstellung eines Plasmid-Vektors, der BoNT/E exprimiert
Ein Plasmid, das eine einkettige rekombinante Version des Neurotoxins vom Clostridium botulinum Subtyp E (Stamm Beluga) (BoNT/E) exprimiert, wurde wie folgt hergestellt. PCR-Primer wurden auf Basis der cDNA-Sequenz des BoNT/E-Neurtoxins der EMBL-Datenbank (GenBank Hinterlegungs-Nr. X62089) entworfen. Diese Nucleotidsequenz ist hier als Sequenz ID Nr. 10 dargestellt.
Der Vorwärts-Primer hatte die folgende Nucleotidbasensequenz:
wobei die BamHI-Endonuclease-Stelle unterstrichen ist und die Sequenz der leichten Kette, minus dem Start-Codon, fett ist. Der Umkehr-Primer hatte die Sequenz:
wobei die PstI-Endonuclease-Stelle unterstrichen ist, das Ende des kodierenden Bereichs der schweren Kette fett ist, und das Stop-Codon in Kleinbuchstaben ist. Diese Primer wurden unter Verwendung von Standard-DNA-Synthesemethodik hergestellt.
Die zwei Primer wurden in einer PCR-Reaktion, enthaltend unterschiedliche Mengen der chromosomalen DNA vom Clostridium botulinum Typ E (Stamm Beluga) verwendet. Die PCR-Reaktion setzte eine Polymerase mit Korrekturlesungsaktivität (Pfx-DNA-Polymerase, von Life Technology erhalten) ein, um Sequenzfehler in dem amplifizierten Gen zu vermeiden. Die Amplifikationsreaktionsbedingungen waren wie folgt: 30 Zyklen von: einer 45-sekundigen Denaturierung bei 95°C, gefolgt von einem 45-sekundigen Annealing-Schritt bei 56°C, gefolgt von einer Primer-Verlängerungsreaktion von 3 Minuten und 48 Sekunden bei 68°C.
Das PCR-Produkt wurde mit BamHI und HindIII verdaut, und der Verdau der Agarosegelelktrophorese unterworfen. Die Färbung des Agarosegels mit Ethidiumbromid ergab ein DNA-Hauptfragment von ungefähr 3,5 Kilobasen (siehe 10). Die Bande, enthaltend dieses Fragment, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA aus der Agarose gereinigt und an BamHI- und HindIII-geschnittenen Vektor pQE30 (QIAGEN) ligiert. Das resultierende ligierte Plasmid wurde verwendet, um den E. coli-Stamm JM 109, wie oben beschrieben, zu transformieren, und die Transformanten auf selektive LB-Agar-Platten plattiert. Verschiedene Klone wurden gewonnen und die Gegenwart des korrekten BoNT/E-DNA-Einsatzes durch Restriktionsverdau kontrolliert. Das resultierende Konstrukt enthält das BoNT/E-Gen (minus dem ersten Methionin), das an die His₆-Markierung des Vektors pQE30 fusioniert ist und enthält 2 extra Aminosäurereste (Glycin, Serin), die durch die biotechnologisch erzeugte BamHI-Stelle beigesteuert wurden.
Beispiel 11
Herstellung einer proteolytisch inaktiven Mutante von BoNT/E durch ortsspezifische Mutagenese
Durch Mutieren der Glutaminsäure an Position 212 (innerhalb der aktiven Stelle) des BoNT/E-Polypeptid-Konstruktes zu Glutamin, wurde ein proteolytisch inaktives und nicht-toxisches einkettiges BoNT/E-Polypeptid erhalten.
Der Glutaminaustausch wurde in den Vorwärtsprimer unter Verwendung von Routine-ortsspezifischen Mutageneseverfahren eingeführt. Der mutagene DNA-Primer hatte die Sequenz
wobei das Codon, das Glutamin an Position 212 codiert, in Kleinbuchstaben angezeigt ist.
Eine Umkehr-PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des obigen Primers durchgeführt, zusammen mit dem Umkehr-Primer
und Pfx DNA-Polymerase (Life Technology) wie oben. Die PCR-Matrix war das Wildtyp-einkettige BoNT/E-Konstrukt (pQEESCwt genannt). Die Zyclusparameter (30 Zyklen) waren wie folgt: 1) ein 45-sekundiger Denaturierungsschritt bei 95°C, 2) ein 45-sekundiger Annealschritt bei 56°C, und 3) ein 7-minütiger und 10-sekundiger Verlängerungsschritt bei 68°C.
Am Ende der Amplifikationsreaktion wurde die DNA-Matrize durch das Restriktionsenzym DpnI verdaut, um nur die Selektion von Mutanten-Klonen zu erlauben. Nachdem das PCR-Produkt einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen wurde, wurde eine Bande von ungefähr 7 Kilobasen entfernt und die DNA gereinigt und für die Selbstligierung in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (Promega) und Polynucleotidkinase (Promega) verwendet, um Phosphorylierung des PCR-Produktes zu ermöglichen. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um den E. coli-Stamm DH10B zu transformieren und die Transformanten auf selektive Agar-Platten plattiert. Die Gegenwart des korrekten Plasmidkonstruktes wurde in verschiedenen beispielhaften Transformanten durch Restriktionsverdau verifiziert und die Mutation wurde auch durch DNA-Sequenzieren bestätigt. 11 zeigt das Protokoll zur Herstellung des Mutanten BoNT/E-Plasmids und ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel der PCR-Reaktionsmischung (Bahnen 2 und 3) gegenüber Molekulargewichtsmarkern (Bahn 1).
Beispiel 12
Reinigung von einkettigem rekombinantem BoNT/E
Die Gegenwart der Hisitidin-Markierung am N-Terminus des exprimierten Proteins ermöglicht eine Ein-Schritt-Reinigung des rekombinanten Neurotoxins durch Metallaffinitätschromatographie.
Der E. coli-Stamm M15 (QIAGEN) wurde zum Exprimieren des BoNT/E einkettigen Konstruktes verwendet. Dieser Stamm trägt ein endogenes Plasmid (pREP4, Kanamycin-resisten), enthaltend einen Bereich, der das lac I^q-Repressorgen codiert, um die Transkription des Neurotoxingens vor der Induktion mit IPTG zu verhindern. Der Vektor pQE30 enthält einen T5-Bacteriophagen RNA-Polymerase-Promotor, der auch von der E. coli-RNA-Polymerase erkannt wird.
Eine Kolonie von M15-Zellen, enthaltend pQEESCwt, wurde bei 37°C über Nacht in 5 ml 2TY Medium, enthaltend 0,1 mg/ml Ampicillin, 0,025 mg/ml Kanamycin und 0,2 % Glucose (G/V) wachsen gelassen, und die resultierende Kultur verwendet, um 500 ml des gleichen Mediums zu impfen. Wenn diese zweite Kultur eine optische Dichte von 0,5-0,8 bei 600 nm erreichte, wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 0,3 mM zugegeben und die Kultur bei 25°C über Nacht inkubiert, um die Expression des Neurotoxins zu ermöglichen.
Darauf folgende Zentrifugierung der Kultur ergab ~2,3 g nasses Zellpellet, das in 10 ml Extraktionspuffer (20 mM HEPES pH 7,0, 300 mM NaCl, 5 mM Benzamidin, 2 μM Pepstatin und 2 μM E-64) wieder suspendiert. Lysozym wurde auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml zugegeben, und die Zellsuspension auf Eis 60 Minuten inkubiert. Ungefähr 0,5 ml Glaskügelchen (0,1 mm Durchmesser von Biospec) wurde zu der Zellsuspension gegeben, gefolgt von 2-minütigem Vortexen, um die Zellen aufzubrechen. Zell-freie Extrakte wurden durch 30-minütige Zentrifugierung bei 10.000xU und 4°C erhalten. Der Überstand wurde mit 0,5 ml Talon^® Cobalt-Metall-Affinitätsharz (Clontech), das mit Extraktionspuffer vorgewaschen war, in einer schaukelnden Plattform 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Das Harz wurde anschließend auf eine wegwerfbare Chromatographiesäule geladen und mit 10 Bettvolumen des Waschpuffers zweimal gewaschen (20 mM HEPES pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM Imidazol), bevor gebundenes Neurotoxin in 6 Bettvolumen des Elutionspuffers (20 mM HEPES pH 7,0, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazol) eluiert wurde.
Das Eluat wurde über Nacht bei 4°C gegen 10 mM HEPES (pH 7,0), enthaltend 150 mM NaCl,dialysiert und durch zentrifugale Filtrierung (MW Rückhaltung bei 10 kDa) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml Protein konzentriert.
Wie in 12 gezeigt, wurde die Reinheit des Affinitätsgereinigten Toxins durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt von Coomassie-Färbung und Westernblotting, wobei der N-Terminus mit einem monoklonalen Anti-His-Antikörper der Maus von Quiagen (2.000-fach verdünnt) nachgewiesen wurde, dargelegt. Erhöhte Chemiluminescenz-Lösungen (Santa Cruz) und Sekundär-Meerrettich-Peroxidase der Maus (von Sigma, Affinitäts gereinigt) wurden zum Nachweis von gebundenem Antikörper verwendet. Ungefähr 2 μg Proteinproben wurden in jede Vertiefung geladen.
Beispiel 13
Trypsin-Aktivierung von gereingtem rekombinantem BoNT/E einkettigem Polypeptid
Gereinigte BoNT/E einkettige Neurotoxin-Polypeptidproben wurden durch Schneiden der einzelnen Kette mit Trypsin (1,5 μg/ml Endkonzentration) 60 Minuten bei einer Konzentration von 1 mg Toxin/ml in 10 mM HEPES (pH 7,0), 150 mM NaCl aktiviert. Der Reaktion folgend wurde das Trypsin unter Verwendung von 0,5 mM PMSF und 10 μg Trypsin-Inhibitor/ml inaktiviert. Die Qualität der Trypsinisierung wurde untersucht und durch SDS-PAGE unter sowohl reduzierenden als auch nicht reduzierenden Bedingungen verifiziert, wobei anschließend mit Coomassie-Färbung gefärbt und Westernblotting des Polyacrylamidgels unter Verwendung eines monoklonalen Anti-His-Antikörpers der Maus (Quiagen, 2.000-fach verdünnt) und eines monoklonalen Anti-H_cIgG der Maus (26-fach verdünnt) durchgeführt wurde. Wie in 13 gezeigt, führt das Coomassie-gefärbte geschnittene Protein zu zwei Banden unter reduzierenden Bedingungen, wohingegen die schwere und leichte Kette unter nicht reduzierenden Bedingungen Disulfid-verbunden bleiben, ähnlich wie das native Toxin. Die Antikörper-nachgewiesene rekombinante schwere Kette ist ungefähr identisch in Größe wie sein Wildtyp-Clostridium-Gegenstück, wohingegen die rekombinante leichte Kette bei einem etwas höheren Molekulargewicht im Vergleich zum nativen Protein migriert. Das spätere Kennzeichen ist auf die Extrareste, die durch His₆-Markierung am N-Terminus bereitgestellt werden, zurückzuführen.
Beispiel 14
Rekombinantes BoNT/E ist proteolytisch aktiv
Stammlösungen (1 μM) des nativen geschnittenen BoNT/E-Toxins, ungeschnittenem einkettigem rekombinanten Toxin, geschnittenem zweikettigen rekombinanten Toxin und geschnittener Mutante (E212Q) BoNT/E wurden in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 10 μg/ml BSA) hergestellt. Diese Proben wurden 30 Minuten bei 37°C in der Abwesenheit oder Gegenwart von 20 mM DTT inkubiert und anschließend serienmäßig in 0,02 ml HBS auf die Endkonzentrationen, die in 14 gezeigt sind, verdünnt.
Ein rekombinantes Peptid, enthaltend Aminosäuren 140-205 von SNAP-25, an Glutathion-S-Transferase fusioniert (GST-SNAP-25 [140-205]), wurde als Proteasesubstrat verwendet, um die proteolytische Aktivität der rekombinanten BoNT/E-Polypeptide zu testen. 10 μg dieses Proteasesubstrats wurden mit den Toxinproben inkubiert. Die Verdaureaktion wurde 30 Minuten bei 37°C in der Abwesenheit oder Gegenwart von 2 mM DTT fortgesetzt und durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer beendigt, gefolgt von 5-minütigem Kochen.
Die resultierenden Proben wurden durch SDS-PAGE (3 μg GST-SNAP-25 [140-205] pro Bahn) und Silberfärbung untersucht. Wie 14 darlegt, behält sogar ungeschnittenes rekombinantes einkettiges Toxin die proteolytische Aktivität. Wie erwartet, hatte das mutante E212Q BoNT/E-Konstrukt keine nachweisbare proteolytische Aktivität. 14 zeigt nur die GST-SNAP-25 [140-205] Banden.
Beispiel 15
Durch Schneiden wird rekombinantes BoNT/E vollständig funktional
Kleinhirnneurone, die 10 Tage in Kultur (2×10⁶/22 mm Durchmesser Vertiefung) gehalten wurden, wurden mit Krebs-Ringer-HEPES (KRH)-Puffer gewaschen, anschließend den spezifischen Konzentrationen ausgesetzt von BoNT/E nativ
Trypsin-geschnittenem rekombinantem (❍), oder ungeschnittenem einkettigen
BoNT/E ausgesetzt (siehe 15). Nach 60 Minuten bei 37°C wurde der Toxin-enthaltende Puffer entfernt, und die Zellen wurden zweimal gewaschen, anschließend mit KHR-Puffer, enthaltend 0,25 μCi/ml [¹⁴C]-markiertem Glutamin (d. h. dem Glutamat-Vorläufer) inkubiert. Nach 45 Minuten wurde das letztere Medium entfernt und die Neuronen wurden viermal bei 37°C gewaschen vor der Untersuchung der Transmitter-Glutamat-Freigabe. Kontrollneurone und Toxin-behandelte Neurone wurden 5 Minuten bei 37°C in KRH-Puffer, enthaltend entweder 1,4 mM Ca²⁺ oder oder 0,5 mM EGTA, inkubiert, um Ca²⁺-unabhängige Freigabe zu untersuchen; Aliquote wurden anschließend zur Bestimmung ihrer [¹⁴C]-Glutamatmenge entfernt (siehe unten).
Sofort nach der Entfernung des Basismediums, wurde KHR-Puffer, enthaltend 50 mM KCl, und entweder 1,4 mM Ca²⁺ oder 0,5 mM IGTA zugegeben; wie zuvor wurden Aliquote für die [¹⁴C]-Glutamatuntersuchung nach einer 5-minütigen Stimulierungsdauer entfernt. Letztlich wurden die Neuronen mit 20 mM EGTA.NaOH pH 7,5, enthaltend 1 % (G/V) SDS aufgelöst und die Aliquote wurden entfernt, um die Radioaktivitätsmengen zu bestimmen, die in den Zellen zurückbleiben. Die [¹⁴C]-Glutamatmenge in jeder der Proben wurde durch Scintillations-Zählen untersucht und die unter Basis- und stimulierten Bedingungen freigesetzten Gehalten wurden als Prozentwerte im Verhältnis zu dem berechneten gesamten Zellgehalt ausgedrückt.
Der prozentuale [¹⁴C]-Glutamatgehalt in dem EGTA-enthaltenden Puffer für jede Probe wurde von den Werten abgezogen, die bei Ca²⁺-enthaltenden KRH-Proben aufgezeichnet wurden, um die Ca²⁺-abhängige Freigabekomponente zu erhalten und die späteren Basisablesungen wurden von den Werten subtrahiert, die für 50 mM KCl-Proben erhalten wurden, um K⁺-ausgelöste Ca²⁺-abhängige Freigabe zu ergeben. Die Werte, die vom Toxin behandelte Neuronen erhalten wurden, wurden folglich im Verhältnis zu Toxin-freien Kontrollen ausgedrückt.
15 zeigt, dass trotz der verbleibenden proteolytischen Aktivität, das ungeschnittene rekombinante BoNT/E deutlich weniger Aktivität als entweder das native BoNT/E oder die geschnittene rekombinante Version aufweist. Diese Erkenntnis könnte die Unfähigkeit des ungeschnittenen Toxins reflektieren, adäquat in die Zielzelle einzutreten. Zusätzlich scheint die geschnittene rekombinante Version effektiver bei dem Inhibieren der Glutamatfreigabe als das native Toxin.
Bespiel 16
Rekombinantes BoNT/E hat eine neuromuskuläre paralytische Aktivität, die äquivalent zu dem nativen Toxin an neuromuskulären Endplatten der Maus ist, wobei Schneiden die Wirksamkeit erhöht
Hemidiaphragmata des Phrenikus der Maus wurden in KR, das mit 0,1 % BSA ergänzt worden war, gebadet und mit 95 % O₂/5 % CO₂ gesättigt. Phrenikusnerven wurden stimuliert (0,2 Hz, 1,5-2,5 mV) und Nerven-ausgelöste Muskelspannung wurde vor und nach der Zugabe von (16A) 0,2 nM rekombinantem geschnittenem BoNT/E (❍) oder 0,2 nM nativem BoNT/E (☐) und (16B) 1 nM rekombinantem ungeschnittenem (❍), 1 nM rekombinantem geschnittenem
oder 0,05 nM rekombinantem geschnittenem (∇) BoNT/E aufgezeichnet. Wie in 16A und 16B gezeigt, ist das rekombinante geschnittene BoNT/E ein wirksames paralytisches Agens, das eine größere Aktivität in dieser Untersuchung als das native Toxin aufzeigt. Das ungeschnittene Toxin zeigt eine deutlich geringere Aktivität als das geschnittene Toxin in dieser Untersuchung auf.
Die neuromuskuläre paralytische Aktivität von rekombinantem geschnittenem BoNT/E wurde ebenso in Mäusen durch intramuskuläre Injektion in die hinteren Muskelglieder dargetan. Dies führte zur Paralyse, die durch die Zehen gespreizte Refelxuntersuchung untersucht wurde, mit einem Muster von Symptomen, die bei Botulismus typisch sind.
Die in vivo Neurotoxizität von geschnittenem, rekombinantem Neurotoxin wurde ermittelt durch Injizieren des Toxins in Mäuse, um eine spezifische Neurotoxizität von weniger als 10⁷ Maus LD₅₀-Einheiten pro mg zu ergeben.
Beispiel 17
Die BoNT/E E212Q-Protease inaktive Mutante antagonisiert BoNT/E-induzierte Neuroparalyse
Ein Hemidiaphragma des Phrenikus der Maus wurde 10 nM BoNT/E E212Q in KR-Medium ausgesetzt, der Nerv wurde stimuliert und die ausgelöste Muskelspannung wurde aufgezeichnet. Wie durch 17 angezeigt, inhibiert die BoNT/E E212Q-Mutante die Neurotransmission nicht, wobei dies durch dessen Ausbleiben bestimmt ist, Nerven ausgelöste Muskelspannung zu inhibieren (❍). Zur Untersuchung der Fähigkeit dieser nicht-toxischen Mutante, die Aktivität des nativen Toxins zu antagonisieren, wurden Hemidiaphragmata des Phrenikus der Maus 60 Minuten bei 4°C in MKR, das mit 0,1 % BSA ergänzt worden war, gebadet und mit 95 % O₂/5 % CO₂ gesättigt, ohne (☐) oder mit (Δ) des Einschlusses von 5 nM BoNT/E E212Q. Natives gespaltenes BoNT/E wurde zu jedem Bad (0,05 nM End) gegeben und die Gewebe wurden weitere 30 Minuten inkubiert. Die Nervenmuskeln wurden anschließend dreimal jeweils mit MKR gefolgt von KR gewaschen, bevor die Temperatur auf 37°C angehoben wurde, und die Nerven-stimulierte und ausgelöste Muskelspannung aufgezeichnet wurde.
Wie in 17 gezeigt, war der Anfang der nativen BoNT/E-Aktivität in dieser Untersuchung verspätet und antagonisiert, wenn Hemidiaphragmata des Phrenikus mit der E212Q-Protease inaktiven Mutante vor-inkubiert worden waren, was darauf hindeutet, dass die rekombinante Mutante immer noch an den gleichen Zelloberflächenrezeptor bindet wie es das native Toxin tut. Die Verfahren dieser vorliegenden Patentanmeldung können folglich verwendet werden, um rekombinante und modifizierte Toxine herzustellen, die voll funktionale Rezeptorbindungsdomänen aufweisen und BoNT-verwandte Transportermoleküle zur intrazellulären Zuführung von therapeutischen Agentien.
Für den Fachmann ist verständlich, dass die hier bereitgestellten Proben bevorzugte Zusammensetzungen und Verfahren beschreiben, und dass eine Vielzahl von unterschiedlichen Klonierungsstrategien, Proteasespaltstellen und spezifischen Bindungskomplex-Mitgliedern in der Praxis eingesetzt werden und erfindungsgemäß verwendet werden können, und dies im Erfindungsumfang bleibt. Zusätzlich können untscheidliche zweikettige oder binäre Toxinmoleküle und modifizierte Versionen davon (z. B. BoNT/B-E und modifizierte Varianten davon) als Basis der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Einkettiges Clostridien-Neurotoxin-Polypeptid, umfassend: a) einen ersten Aminosäuresequenzbereich, umfassend i) eine erste Domäne umfassend ein Bindungselement umfassend mindestens ein Teil einer schweren Kette eines Clostridien-Neurotoxins, das speziell einen Oberflächenmarker der Zielzelle unter physiologischen Bedingungen binden kann, und ii) eine zweite Domäne umfassend ein Translokationselement umfassend mindestens ein Teil einer schweren Kette eines Clostridien-Neurotoxins, das die Übertragung eines Polypeptids über eine Vesikulärmembran erleichtern kann; und b) einen zweiten Aminosäuresequenzbereich, umfassend ein therapeutisches Element umfassend mindestens ein Teil einer leichten Kette eines Clostridien-Neurotoxins mit biologischer Aktivität, wenn es in das Zytoplasma der Zielzelle abgegeben wird, c) einen dritten Aminosäuresequenzbereich, umfassend eine Protease-Spaltstelle, die keine Trypsin-, Chymotrypsin- oder Pepsin-Spaltstelle ist, zwischen dem ersten und dem zweiten Aminosäuresequenzbereich.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Translokationselement des ersten Aminosäuresequenzbereichs mindestens ein Teil einer H-Kette eines Clostridien-Neurotoxins umfasst, das zum Übertragen der Translokationsaktivität wesentlich ist.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Teil der H-Kette des Clostridien-Neurotoxins von der schweren Kette von C. botulinum Subtyp A abstammt.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das therapeutische Element des zweiten Aminosäuresequenzbereichs eine L-Kette des Clostridien-Neurotoxins oder einen Teil davon, der die SNARE-Proteinsequenz-spezifische Endopeptidaseaktivität einer leichten Kette des Clostridien-Neurotoxins beibehält, umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 4, wobei der Teil der L-Kette des Clostridien-Neurotoxins von dem abstammt, der von C. botulinum Subtyp A, B oder E erhalten wird.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Teil der H-Kette des Clostridien-Neurotoxins von dem von C. tetani erhaltenem abstammt.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Teil der H-Kette des Clostridien-Neurotoxins abstammt von der Neurotoxin schweren Kette eines Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C. botulinum Subtyp B, C. botulinum Subtyp C, C. botulinum Subtyp D, C. botulinum Subtyp E, C. botulinum Subtyp F, C. botulinum Subtyp G, C. baratii und C. butyricum.
Polypeptid nach Anspruch 7, wobei das therapeutische Element der zweiten Domäne eine L-Kette des Clostridien-Neurotoxins umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Protease-Spaltstelle durch eine Protease gespalten wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) nicht-humaner Enterokinase, b) Tobacco etch Virus-Protease, c) einer Protease abstammend von Bacillus subtilus, d) einer Protease abstammend von Bacillus amyliquifaciens, e) einer Protease abstammend von einem Rhinovirus, f) Papain, g) einem Insekten-Papain-Homolog und h) einem Schalentier-Papain-Homolog.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Protease-Spaltstelle eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) DDDDK, b) EXXYXQS/G, c) HY, d) YH und e) LEVLFQGP, wobei X = jede Aminosäure.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 9, außerdem eine Bindungsmarkierung umfassend.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei die Bindungsmarkierung einen zielbindenden Teil eines Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His6, monoklonalen Antikörpern, Maltose-Bindungsprotein, Glutathionin-S-Transferase, Protein A und Calmodulin-Bindungsprotein, umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Translokationselement des ersten Aminosäuresequenzbereichs mindestens ein Teil einer schweren Kette umfasst abstammend aus einem ersten Clostridien-Neurotoxin Subtyp, der zum Übertragen der Translokationsaktivität wesentlich ist, und das therapeutische Element des zweiten Aminosäuresequenzbereichs eine L-Kette des Clostridien-Neurotoxins oder einen Teil umfasst, der die SNARE-Proteinsequenz-spezifische Endopeptidaseaktivität der Clostridien-Neurotoxin leichten Kette beibehält, abstammend von einem zweiten Clostridien-Neurotoxin Subtyp, wobei der erste und zweite Clostridien-Neurotoxin Subtyp nicht der gleiche ist.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei der Teil der schweren Kette von einer schweren Kette ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HCA, HCB, HCCl, HCD, HCE, HCF und HCG, und der Teil der leichten Kette von einer leichten Kette ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LCA, LCB, LCCl, LCD, LCE, LCF, LCG, und wobei die Teile der leichten und schweren Kette von unterschiedlichen Clostridien-Neurotoxin Subtypen sind.
Polypeptid nach Anspruch 14, wobei mindestens einer der schweren und leichten Kettenteile jeweils weniger als die gesamte schwere oder leichte Kette des Clostridien-Neurotoxin Subtyps umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 14, wobei mindestens einer der schweren und leichten Kettenteile jeweils die gesamte schwere oder leichte Kette des Clostridien-Neurotoxin Subtyps umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 13, wobei der erste oder zweite Aminosäuresequenzbereich modifiziert ist, um mindestens eine Aminosäuresequenz, die spezifisch durch eine Protease gespalten wird, zu eliminieren.
Plasmid mit einem Nukleinsäuresequenzbereich, umfassend einen offenen Leserahmen, der ein spaltbares Clostridien-Neurotoxin-Polypeptid mit einer einzelnen Kette codiert, wobei der offene Leserahmen umfasst: a) einen ersten Nukleotidsequenzbereich, umfassend i) einen ersten Teil, der einen ersten Aminosäuresequenzbereich codiert, umfassend ein Bindungselement umfassend mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin schweren Kette, die spezifisch einen Oberflächenmarker einer Zielzelle unter physiologischen Bedingungen binden kann, ii) einen zweiten Teil, der einen zweiten Aminosäuresequenzbereich codiert, umfassend ein Translokationselement umfassend mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin schweren Kette, die die Übertragung eines Polypeptids durch eine Vesikulärmembran erleichtert; und b) einen zweiten Nukleotidsequenzbereich, der einen dritten Aminosäuresequenzbereich codiert, umfassend ein therapeutisches Element umfassend mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin leichten Kette mit biologischer Aktivität, wenn er in das Zytoplasma der Zielzelle abgegeben wird, c) einen dritten Nukleotidsequenzbereich, der einen vierten Aminosäuresequenzbereich codiert, umfassend eine Protease-Spaltstelle, die keine Trypsin-, Chymotrypsin- oder Pepsin-Spaltstelle ist, zwischen dem ersten und zweiten Nukleotidsequenzbereich, und wobei das einkettige Clostridien-Neurotoxin-Polypeptid durch dieses Plasmid mit einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.
Plasmid nach Anspruch 18, wobei der erste oder zweite Nukleotidsequenzbereich außerdem einen Aminosäuresequenzbereich codiert, der einen Bindungsmarkierung umfasst.
Plasmid nach Anspruch 19, wobei der Bindungsmarkierung einen zielbindenden Teil eines Polypeptids umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His6, monoklonalen Antikörpern, Maltose-Bindungsprotein, Glutathionin-S-Transferase, Protein A und Calmodulin-Bindungsprotein.
Plasmid nach Anspruch 18, wobei das Translokationselement des ersten Nukleotidsequenzbereichs mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin schweren Kette codiert, der zum Übertragen der Translokationsaktivität wesentlich ist.
Plasmid nach Anspruch 21, wobei der erste Nukleotidsequenzbereich mindestens eine schwere Kette vom Clostridium-Botulinum-Neurotoxin codiert.
Plasmid nach Anspruch 21, wobei der erste Nukleotidsequenzbereich mindestens einen Teil einer schweren Kette vom Clostridium-Tetanin-Neurotoxin codiert.
Plasmid nach einem der Ansprüche 18 oder 21, wobei das therapeutische Element des zweiten Nukleotidsequenzbereichs eine L-Kette des Clostridien-Neurotoxins oder einen Teil davon codiert, bei dem die SNARE-Proteinsequenz-spezifische Endopeptidaseaktivität einer Clostridien-Neurotoxin leichten Kette beibehalten ist.
Plasmid nach Anspruch 24, wobei der zweite Nukleotidsequenzbereich mindestens einen Teil einer leichten Kette vom Clostridium-Botulinum-Neurotoxin codiert.
Plasmid nach Anspruch 24, wobei der zweite Nukleotidsequenzbereich mindestens einen Teil einer leichten Kette vom Clostridium-Tetani-Neurotoxin codiert.
Verfahren zur Herstellung eines einkettigen Polypeptids abstammend von einem Clostridien-Neurotoxin, umfassend: a) Einführen des Plasmids nach einem der Ansprüche 18 bis 27 in eine geeignete Wirtzelle, b) Wachsen der Wirtszelle in Kultur und c) Ermöglichen oder Induzieren der Wirtszelle, das einkettige Polypeptid, das durch das Plasmid codiert wird, zu exprimieren.
Verfahren zum Reinigen des rekombinanten einkettigen Polypeptids nach Anspruch 11, umfassend die Schritte: Lysieren einer Zelle, die das einkettige Polypeptid exprimiert, um ein Zellysat herzustellen, und Inkontaktbringen des Zellysats mit einer Zielverbindung, um einen spezifischen Bindungskomplex zu bilden, der immobilisiert werden kann, umfassend diesen Bindungsmarkierung und diese Zielverbindung.
Einkettiges Clostridien-Neurotoxin-Polypeptid, umfassend: a) einen ersten Aminosäuresequenzbereich, umfassend i) eine erste Domäne umfassend ein Bindungselement umfassend mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin schweren Kette, der einen Oberflächenmarker einer Zielzelle unter physiologischen Bedingungen spezifisch binden kann, und ii) eine zweite Domäne umfassend ein Translokationselement umfassend mindestens ein Teil einer Clostridien-Neurotoxin schweren Kette, der die Übertragung eines Polypeptids durch eine Vesikulärmembran erleichtern kann; und b) einen zweiten Aminosäuresequenzbereich, umfassend ein therapeutisches Element umfassend mindestens eine Clostridien-Neurotoxin leichte Kette mit biologischer Aktivität, der in das Zytoplasma einer Zielzelle abgegeben wird, c) einen dritten Aminosäuresequenzbereich, umfassend den Schleifenbereich zwischen zwei Ketten eines Botulinum-Neurotoxins Typ E (BoNT/E) zwischen dem ersten und zweiten Aminosäuresequenzbereich.