ES2614990T3 - Proteínas de fusión para uso en el tratamiento de acromegalia - Google Patents

Proteínas de fusión para uso en el tratamiento de acromegalia Download PDF

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Abstract

Un polipéptido para uso en la supresión de la secreción desde una célula tumoral neuroendocrina para tratar la acromegalia, comprendiendo dicho polipéptido: a. una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de romper una proteína del aparato de fusión exocítico en una célula tumoral pituitaria, en donde dicha proteasa no citotóxica es una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA; b. un Resto dirigido a diana (TM) que se une a un sitio de unión en una célula tumoral pituitaria, sitio de unión que es capaz de someterse a endocitosis para incorporarse a un endosoma dentro de la célula tumoral pituitaria, en donde el TM comprende un péptido de hormona de liberación de hormona del crecimiento (GHRH); y c. un dominio de traslocalización bacteriano o vírico que traslocaliza la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y al citosol de dicha célula tumoral pituitaria; en donde el polipéptido carece de un dominio Hc funcional de una neurotoxina clostridial.

Description

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DESCRIPCION
Protemas de fusion para uso en el tratamiento de acromegalia
La presente invencion describe agentes terapeuticos y las correspondientes terapias para el tratamiento de enfermedades y afecciones neuroendocrinas.
El sistema neuroendocrino esta formado por celulas derivadas de la cresta neural embrionaria, el neuroectodermo y el endodermo. Se puede dividir en tipos celulares que forman glandulas y otros que estan distribuidos de forma difusa, es decir el sistema neuroendocrino diseminado o difuso. El primer grupo incluye las celulas que forman la pituitaria, las glandulas paratiroides y la medula adrenal. El segundo grupo incluye celulas de la piel, pulmon, timo, tiroides, pancreas y los tractos de intestino grueso, biliar y urogenital. Los tumores neuroendocrinos puede surgir en todas estas localizaciones y pueden provocar patofisiologfas tanto por tamano ffsico, que produzca una presion o constriccion localizada en los organos circundantes, como por secreciones anormales de una variedad de hormonas y otras moleculas bioactivas. Dichas moleculas normalmente son secretadas por celulas no tumorales en cantidades fisiologicamente apropiadas y bajo control fisiologico estricto. Sin embargo, cuando dichas celulas forman tumores, las secreciones pueden ser excesivas, dando lugar a enfermedades.
Las terapias actuales para estas enfermedades de hipersecrecion pueden incluir la eliminacion quirurgica del tumor(es), quimioterapia anti-tumoral generica, terapia de interferon, radioterapia y tratamientos mas espedficos, por ejemplo, con analogos de somatostatina. La preferencia para el modo de tratamiento inicial vana segun el medico y, aunque cada una de dichas estrategias puede tener exito, no siempre son apropiadas. Dependiendo del tamano y la localizacion del tumor, la intervencion quirurgica puede ser considerada demasiado arriesgada y puede que el tumor no se eliminado completamente. La terapia anti-tumoral, la terapia de interferon y la radioterapia a veces son mal toleradas por el paciente, o pueden estar contraindicadas por otras razones.
Adicionalmente, las terapias que resultan en la muerte de las celulas tumorales tambien introducen la posibilidad de que se produzca el smdrome de lisis tumoral (TLS, del ingles “Tumour Lysis Syndrome”). El TLS es una complicacion muy grave de la terapia tumoral, suponiendo a veces una amenaza para la vida. Se puede definir como una constelacion de anormalidades metabolicas que son el resultado de necrosis tumoral o apoptosis fulminante espontaneas o relacionadas con el tratamiento. Las anormalidades metabolicas observadas en pacientes de TLS incluyen: hiperkalemia, hiperuricemia e hiperfosfatemia con hipercalcemia secundaria. El TLS tambien puede conducir a fallo renal agudo (ARF, del ingles “Acute Renal Failure”).
En la mayona de los pacientes con carcionides metastasicos y tumores endocrinos pancreaticos, el tratamiento con medicamentos actuales, tal como octreotide, puede incluir una mejona rapida de los smtomas clmicos, tales como diarrea, deshidratacion, ataques de enrojecimiento, hiperkalemia, ulceracion peptica, ataques hipoglucemicos y lesiones cutaneas necroticas (Kvols et al. 1986, 1987, Ruszniewski et al.1996, Caplin et al. 1998, Kulke & Mayer 1999, Wymenga et al. 1999). Sin embargo, la mayona de los pacientes muestran perdida de sensibilidad a la inhibicion de la secrecion hormonal por octreotide y lanreotide en cuestion de semanas a meses. Estas limitaciones de las terapias actuales representan un problema importante.
Los tumores neuroendocrinos, que incluyen tumores endocrinos gastroenteropancreaticos y adenomas pituitarios son enfermedades raras y heterogeneas (Tabla 1). Como consecuencia, su prognosis y la supervivencia a largo plazo no se conocen bien. Independientemente de las perspectivas de supervivencia, las secreciones excesivas de dichos tumores pueden afectar profundamente a la calidad de vida de los individuos afectados, y por lo tanto un tratamiento efectivo de esta funcion aberrante es requisito para mantener la calidad de vida de los pacientes.
Tabla 1. Incidencia/prevalencia de tumores neuroendocrinos principales (EE.UU. a menos que se indique lo contrario)
Tipo de tumor
Incidencia
Tumores carcinoides
Se diagnostican aproximadamente 5.000 tumores carcinoides al ano. Segun el “National Cancer Institute” (NCI), aproximadamente el 74% de dichos tumores se originan en el tracto del intestino grueso (GI) y el 25% se producen en el tracto respiratorio.
Los carcinoides son raros en ninos, siendo mas comunes en pacientes con edades superiores a los 50 anos. Son el doble de comunes en hombres. Los tumores carcinoides del apendice habitualmente son benignos y a menudo se dan en edades comprendidas entre los 20 y los 40 anos.
Insulinomas
La incidencia es de aproximadamente 4 casos por millon y ano, y la prevalencia es de aproximadamente 4 por millon de poblacion y ano.
Tipo de tumor
Incidencia
Gastrinomas
La incidencia de gastrinomas que se producen esporadicamente o asociados a neoplasia endocrina multiple de tipo 1 (MEN-1) es de 0,1-3 por millon. La prevalencia de MEN-1 es de 0,2-2 por 100.000. La MEN-1 se diagnostica en el 30-38% de los pacientes con gastrinomas, mientras que se observa que el 20-61% de los pacientes diagnosticados con MEN-1 presentan gastrinomas asociados a ZES (Smdrome de Zollinger-Ellison).
VlPomas
Prevalencia = 1,12 por millon de poblacion
Glucagonomas
El glucagonoma esta clasificado como “enfermedad rara” por la “Office of Rare Diseases” (ORD) del “National Institute of Health” (NIH). Prevalencia = aprox. 1 en 2.720.000 personas de EE.UU.
Prolactinoma
Incidencia: 6-10 por millon y ano. Prevalencia: 60-100 por millon
Somatotrofinoma
Prevalencia de acromegalia: 40-60 por millon de personas afectadas en cualquier momento; Incidencia (anual) de Acromegalia: 3 por millon de casos anuales.
Corticotrofinoma
Incidencia: 2-3 por millon y ano. Prevalencia: 20-30 por millon
Feocromocitoma
En los pafses occidentales la prevalencia del feocromocitoma puede estimarse en el rango de 1:6.500 a 1:2.500 con una incidencia anual en los Estados Unidos de 500 a 1.100 casos anuales.
Tirotrofinoma
Muy raro
De forma general, los smtomas de estos tumores vanan dependiendo del tipo de tumor, ya que cada uno secreta hormonas diferentes que producen smtomas diferentes (Tabla 2).
Tabla 2. Smtomas o enfermedades producidas por hipersecrecion de tumores neuroendocrinos.
Tipo de tumor
Patofisiologia y smtomas (producidos por la hipersecrecion mas que por la masa tumoral)
Tumores carcinoides
Una combinacion de smtomas que son resultado de la secrecion de hormonas o de sustancias de tipo hormonal (p.ej., serotonina, gastrina, ACTH, histamina) producidas por algunos tumores carcinoides. Dichos smtomas incluyen enrojecimiento, diarrea, dolor abdominal de tipo calambre, hinchamiento de la piel o la cara y el cuello, respiracion dificultada, ganancia de peso, aumento del bello corporal y facial, diabetes, dolor de cabeza, edema, lagrimacion, debilidad, hipertension pulmonar, smtomas de fallo cardiaco que incluyen falta de aliento.
Insulinomas
Vision borrosa, diplopfa, debilidad, palpitaciones, confusion y comportamiento extrano. Tiende a producirse hipoglucemia 5 horas o asf despues de una comida y los smtomas asociados pueden verse afectados por la dieta, la ingesta de etanol y el ejercicio.
Gastrinomas
Diarrea, gastritis, ulceras gastricas recurrentes
VlPomas
Diarrea lfquida (3-20 litros al dfa), hipokalemia, hipomagnesemia, hipercalcemia, acidosis, enrojecimiento, vejiga distendida flacida, fleo/subfleo distendido flacido. La diabetes o la intolerancia a la glucosa tambien son comunes.
Glucagonomas
Sarpullido eritematoso necrolttico (a menudo en la cara, las extremidades y areas intertriginosas), anemia, perdida de peso, tolerancia a la glucosa afectada, trombosis y diarrea.
Corticotrofinoma
Enfermedad de Cushing como consecuencia de que ACTH induce un exceso de cortisol en circulacion
Somatotrofinoma
Acromegalia
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Tipo de tumor
Patofisiologia y smtomas (producidos por la hipersecrecion mas que por la masa tumoral)
Prolactinoma
Oligomenorrea/amenorrea, galactorrea, sequedad vaginal, perdida de libido en mujeres; disfuncion sexual (impotencia), galactorrea y ginecomastia en hombres
Feocromocitoma
Un amplio rango de smtomas resultado de acciones metabolicas y hemodinamicas de catecolaminas en circulacion. La hipertension sostenida o paroxismal es el signo clinico mas comun en mas del 90% de los pacientes; con frecuencia decreciente: dolor de cabeza, palpitaciones, palidez, nauseas, enrojecimiento, perdida de peso, cansancio, ansiedad/panico, hipotension ortostatica, hiperglucemia
Tirotrofinoma
Tirotoxicosis (sobre-actividad de la glandula tiroidea), cuyos smtomas incluyen perdida de peso a pesar de un aumento del apetito, ritmo cardiaco acelerado, temblores ligeros, nerviosismo e inestabilidad emocional incrementados, intolerancia al calor, y episodio catatonico de excesiva sudoracion, ojos hinchados, agrandamiento de la glandula tiroidea; aproximadamente en un tercio de los casos, el tumor tambien produce un exceso de hormona de crecimiento, dando como resultado una ligera acromegalia
Las terapias actuales son altamente individualizadas, ya que los smtomas experimentados por cada paciente a menudo son diferentes y tambien pueden ir cambiando con el tiempo. Los tres objetivos potenciales del tratamiento de un paciente son (1) eliminar el tumor, (2) frenar o detener el crecimiento del tumor, o (3) aliviar los smtomas provocados por la hipersecrecion procedente del tumor - pueden buscarse los tres de forma combinada. A continuacion se describen las terapias actuales mas comunes.
Tumores carcinoides/smdrome carcinoide
A menudo se usa una estrategia doble en el tratamiento del smdrome carcinoide, comenzando con cirugfa para eliminar el tumor o para reducir su tamano, seguida de tratamiento con quimioterapia o interferones. Se puede usar un procedimiento conocido como embolizacion hepatica para controlar el cancer que se ha extendido desde un tumor carcinoide al Mgado; ayuda a reducir los smtomas disminuyendo el aporte sangumeo al Imgado y privando de alimento a las celulas tumorales.
Insulinomas
Los smtomas de los insulinomas a veces pueden tratarse mediante regulacion de dieta (p.ej., mediante ingesta frecuente de carbohidratos complejos de liberacion lenta; goma guar). Con el insulinoma maligno, se puede producir metastasis a los nodos linfaticos circundantes y al hngado. Si el tumor no puede localizarse antes o durante una cirugfa (intra-operativamente), puede ser eliminado a traves de pancreatectomfa distal.
Gastrinomas
En pacientes con gastrinomas, se usa medicacion antisecretora, tal como un inhibidor de bomba de protones, para controlar la hipersecrecion de acido gastrico. Si un paciente no puede tomar esta medicacion, se recomienda una gastrectoirna total. Se ha demostrado que la cirugfa proporciona una tasa de curacion a 5 anos del 30%, y se recomienda en pacientes sin metastasis al hngado, MEN 1, o condiciones medicas de complicacion que puedan limitar la esperanza de vida. (El noventa y cinco por ciento de los pacientes con gastrinomas presentan tumores). Los pacientes con enfermedad metastasica pueden beneficiarse de quimioterapia u octreotide, si la quimioterapia falla.
VIPomas
La terapia de primera lmea para los VIPomas esta dirigida a corregir la profunda hipokalemia, la deshidratacion y la acidosis metabolica mediante el recambio de fluidos y electrolitos. Normalmente se administra a los pacientes hasta 5 L de fluido y 350 mEq de potasio al dfa. El tratamiento optimo para los VIPomas es la eliminacion quirurgica del tumor principal.
Glucagonomas
Se emplea cirugfa para aliviar los efectos de los glucagonomas o para reducir el tamano de los tumores, si bien dos tercios de los pacientes no son curados por la cirugfa incluso tras una localizacion tumoral exitosa y una determinacion de la enfermedad metastasica. Actualmente, no existen farmacos activos usados para tratar el glucagonoma.
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Prolactinomas
El tratamiento medico habitualmente es con los agonistas de dopamina, bromocriptina o cabergolina. Estos farmacos reducen el tamano del tumor y devuelven los niveles de prolactina a lo normal en aproximadamente el 80 por ciento de los pacientes. Sin embargo, el uso de dichos agonistas esta asociado a efectos secundarios tales como nauseas y mareos. La cirugfa es una opcion cuando la terapia medica no puede ser tolerada o si falla en la reduccion de los niveles de prolactina, en restaurar la reproduccion y la funcion pituitaria normal, y en reducir el tamano tumoral. Sin embargo, los resultados de la cirugfa dependen enormemente del tamano del tumor y del nivel de prolactina, asf como de la habilidad y la experiencia del neurocirujano. Dependiendo del tamano del tumor y de cuanto se elimine, los estudios muestran que del 20 al 50 por ciento reaparecen, normalmente en los primeros cinco anos.
Somatotrofinomas (p.ej., que producen acromegalia)
El tratamiento actual para pacientes con acromegalia incluye cirugfa, radiacion y terapias medicas. El tratamiento depende del tamano y de la extension del tumor y de la necesidad de un rapido cese de la funcion hormonal que de como resultado secuelas clmicas serias. Los tratamientos estandar incluyen cirugfa (normalmente una estrategia transesfenoidal) con o sin terapia de radiacion post-operativa, tratamiento con bromocriptina, tratamiento con octreotide y, mas recientemente, tratamiento con pegvisomant. Las terapias descritas anteriormente tienen una tasa de exito variable.
Corticotrofinomas
Para pacientes con adenomas corticotropos, la microcirugfa transesfenoidal es el tratamiento elegido. Sin embargo, las tasas de remision publicadas en la mayona de las series son de aproximadamente el 70% al 90%. La terapia con farmacos se considera un adjunto a la microcirugfa transesfenoidal en los casos con un tumor residual y en los casos en los que se esta esperando a los efectos de la terapia de radiacion. Se usan inhibidores de esteroidogenesis, que incluyen mitotano, metirapone, cetoconazol y aminoglutetimide. El cetoconazol es el mejor tolerado de estos agentes, aunque solo en aproximadamente el 70% de los pacientes. Se ha usado terapia de radicacion en pacientes considerados malos candidatos a cirugfa, y tambien se ha usado como terapia adjunta en pacientes con tumor activo residual o recurrente.
Feocromocitoma
El procedimiento preferido es la eliminacion laparoscopica del tumor. Sin embargo, es necesario mantener al mmimo las complicaciones durante la cirugfa mediante un tratamiento medico preoperatorio adecuado para prevenir complicaciones inducidas por catecolamina, graves y potencialmente amenazantes para la vida, durante la cirugfa, que incluyen crisis hipertensivas, arritmias cardiacas, edema pulmonar e isquemia cardiaca. Los regfmenes tradicionales incluyen bloqueantes de a-adrenoceptor, bloqueantes combinados de a/p-adrenoceptor, bloqueantes del canal de calcio, todos los cuales pueden presentar efectos no deseados tanto antes como despues de la cirugfa.
Tirotrofinomas
La cirugfa transesfenoidal es el tratamiento elegido para pacientes con adenomas tirotroficos. Se puede emplear terapia de radiacion adyuvante cuando se sabe que la cirugfa no va a ser curativa incluso si el paciente todavfa esta eutiroide debido a que la recafda es inevitable, y el efecto completo de la terapia de radiacion requiere meses o anos. Puede requerirse terapia medica para pacientes que todavfa presentan smtomas hipertiroideos a pesar de la cirugfa y la radiacion externa.
Ademas de representar afecciones humanas raras, pero amenazantes para la vida, los tumores neuroendocrinos siguen suponiendo un problema para el cuidado animal a escala global. Por consiguiente, existe una necesidad en la tecnica de agentes terapeuticos y terapias alternativas y/o mejoradas que aborden uno o mas de los problemas anteriores.
En todos los casos, la cirugfa puede tener un exito limitado, ademas de comportar riesgos inherentes para el paciente. Adicionalmente, los tratamientos con farmacos actuales tampoco son una garantfa de exito para aliviar los smtomas en todos los pacientes.
El documento WO2006/025976 describe metodos para tratar diversos canceres mediante administracion local de una neurotoxina de botulinum o en las proximidades del cancer.
La presente invencion resuelve uno o mas de los anteriores problemas o riesgos asociados a la cirugfa o a las terapias medicas existentes, proporcionando una nueva categona de agente no citotoxico disenado para suprimir secreciones tumorales pituitarias no deseadas (p.ej. anormalmente elevadas) y de esta manera minimizar o revertir la enfermedad resultante, que es la acromegalia.
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En mas detalle, un primer aspecto de la presente invencion proporciona un polipeptido para uso en la supresion de la secrecion de una celula tumoral neuroendocrina para el tratamiento de la acromegalia, tal como se define en las reivindicaciones.
Al ser usado, un polipeptido como el descrito en la presente memoria, se une a una celula tumoral neuroendocrina. Despues de eso, el componente de traslocalizacion efectua el transporte del componente de proteasa al citosol de la celula tumoral. Finalmente, una vez dentro, la proteasa inhibe el proceso de fusion exocftica de la celula tumoral neuroendocrina. Por tanto, desactivando el aparato de fusion exocftica de la celula tumoral neuroendocrina, el polipeptido de la invencion inhibe la secrecion desde la misma. Consecuentemente, el polipeptido descrito en la presente memoria suprime/ trata uno o mas de las diversas afecciones o smtomas patofisiologicos enumerados anteriormente en la Tabla 2.
Las celulas diana principales descritas en la presente memoria son celulas tumorales de origen neuroendocrino que secretan una o mas hormonas (u otras moleculas bioactivas) que conducen al desarrollo de una afeccion patofisiologica.
Los polipeptidos descritos en la presente memoria son capaces (y se usan para ello) de suprimir la secrecion de hormonas y/u otras moleculas bioactivas desde los tumores neuroendocrinos.
Sin pretender establecer teona alguna, los inventores de la presente creen que la secrecion no deseada (p.ej., de niveles elevados) de moleculas fisiologicamente activas desde tumores neuroendocrinos produce y mantiene afecciones patologicas en un paciente. Por lo tanto, inhibiendo dichas secreciones, se puede detener la progresion del estado de enfermedad y se pueden revertir los smtomas.
Los polipeptidos descritos en la presente memoria son particularmente adecuados para el tratamiento de una serie de tumores neuroendocrinos, incluyendo sus metastasis de secrecion hormonal, afecciones precancerosas y los smtomas de los mismos. En este respecto, “tratamiento” incluye reducir o eliminar las secreciones excesivas desde dichas celulas. A modo de ejemplo, las celulas tumorales neuroendocrinas diana importantes descritas en la presente memoria incluyen: adenomas pituitarios y/ o tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos (GEP- NETs). Los GEP-NETs se localizan principalmente en el estomago, el intestino o el pancreas y secretan cantidades excesivas de hormonas y otras moleculas bioactivas que normalmente son secretadas en niveles inferiores bajo una regulacion fisiologica. Estas secreciones contribuyen a los smtomas experimentados por los pacientes. Los GEP- NETs pueden dividirse en los subtipos carcinoide y no carcinoide.
Los GEP-NETs carcinoides (55% del total de GEP-NETs) tienden a clasificarse segun su localizacion tisular e incluyen, en orden de prevalencia, los que surgen en celulas del apendice (39%), el fteo (23%), el recto (13%) y los bronquios (11,5%). Los GEP-NETs no carcinoides incluyen insulinomas de las isletas pancreaticas que secretan un exceso de insulina (17%), tumores de tipo desconocido (15%), gastrinomas del pancreas o del duodeno que secretan un exceso de gastrina (9%), VIPomas del pancreas, del pulmon o ganglioneuromas, que secretan un exceso de polipeptido intestinal vasoactivo, y glucagonomas, tumores de las isletas pancreaticas que secretan un exceso de glucagon.
Los tumores pituitarios, que tienden a clasificarse segun su tipo de secrecion o su identidad celular, incluyen prolactinomas que secretan prolactina (el mas comun), somatotrofinomas (hormona del crecimiento, corticotrofinomas (hormona adrenocorticotrofica), tirotrofinomas (hormona estimulante de tiroides), gonadotrofinomas (FSH, LH), y adenomas pituitarios no funcionales.
Otros tumores secretores incluyen tumores medulares tiroideos, tumores pulmonares de celula pequena y no pequena, tumores de celula de Merkel, y feocromocitomas. Este ultimo puede ser mortal si el exceso de adrenalina secretada conduce a una hipertension grave. Dicha hipertension puede hacer que el individuo no sea adecuado para cirugfa de eliminacion de la masa tumoral y por tanto puede surgir un ciclo pernicioso de refuerzo y es deseable el tratamiento del tumor para minimizar la secrecion.
Un subconjunto particular de celulas tumorales neuroendocrinas es: insulinomas, gastrinomas, VIPomas, glucagonomas, prolactinomas, somatotrofinomas, corticotrofinomas, tirotrofinomas y feocromocitomas.
Suprimiendo las funciones secretoras de las celulas tumorales neuroendocrinas (tales como el anterior subconjunto de celulas tumorales), la presente solicitud describe una terapia para el tratamiento de, entre otras, afecciones tales como la enfermedad de Cushing, acromegalia, smdrome carcinoide, smdrome hipoglucemico, eritema migratorio necrolftico, smdrome de Zollinger-Ellison y smdrome de Verner-Morrison. Tambien se proporcionan terapias para el tratamiento de los smtomas que suceden a secreciones tumorales neuroendocrinas no deseadas (ver la Tabla 2).
El componente “bioactivo” de los polipeptidos de la presente invencion es proporcionado por una proteasa no citotoxica como se define en las reivindicaciones. Dicho grupo distintivo de proteasas actua rompiendo proteolfticamente las protemas de transporte intracelular conocidas como protemas SNARE (p.ej., SNAP-25, VAMP o Sintaxina) - ver Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4a edicion) John Wiley & Sons, Inc. El acronimo SNARE deriva del termino en ingles “Soluble NSF Attachment Receptor” (Receptor de union de NSF soluble), en donde NSF significa “N-ethylmaleimide-Sensitive Factor” (factor sensible a N-etilmaleimida). Las protemas SNARE
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son integrales a la formacion de vesmula intracelular, y por tanto a la secrecion de moleculas a traves del transporte vesicular desde una celula. Por consiguiente, una vez administradas a una celula diana deseada, la proteasa no citotoxica es capaz de inhibir la secrecion celular desde la celula diana.
Las proteasas no citotoxicas son una clase discreta de moleculas que no matan celulas; en su lugar, actuan inhibiendo procesos celulares diferentes a la smtesis de protemas. Las proteasas no citotoxicas son producidas como parte de una molecula toxina mas grande por una variedad de plantas, y por una variedad de microorganismos tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.
Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo principal de moleculas toxina no citotoxicas, y comprenden dos cadenas de polipeptido unidas por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena-H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena-L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Es la cadena-L la que posee una funcion de proteasa y exhibe una elevada especificidad de sustrato para protemas de vesmula y/o asociadas a membrana plasmatica (SNARE) implicadas en el proceso exocftico (p.ej., sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25). Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
Neisseria sp., de forma mas destacada de la especie N. gonorrhoeae, y Streptococcus sp., de forma mas destacada de la especie S. pneumoniae, producen moleculas toxina no citotoxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de dichas proteasas no citotoxicas es la IgA proteasa (ver WO99/58571). Por tanto, la proteasa no citotoxica de la presente invencion es una proteasa neurotoxina clostridial o una IgA proteasa.
Pasando ahora al componente de resto dirigido a diana (TM, del ingles “Targeting Moiety”) de la presente invencion, es el componente que une los polipeptidos descritos en la presente memoria a una celula tumoral neuroendocrina.
De esta manera, un TM descrito en la presente memoria se une a un receptor en una celula tumoral neuroendocrina. A modo de ejemplo, un TM descrito en la presente memoria puede unirse a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor de somatostatina (sst), que incluye variantes de division del mismo (p.ej., ssti, sst2, sst3, sst4 y sst5); un receptor de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH) - tambien conocido como receptor de GRF; un receptor de grelina, un receptor de bombesina (p.ej., BRS-1, BRS-2, o BRS-3); un receptor de urotensina (p.ej., un receptor de urotensina II); un receptor de hormona de concentracion de melanina 1; un receptor de hormona de liberacion de prolactina; un receptor de hormona de liberacion de gonadotropina (GnRHR) tal como un GnRHR de Tipo 1 y/o un receptor de GnRHR de Tipo 2; y/o un receptor de KiSS-1.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a un receptor de somatostatina (SST). Los ejemplos de TMs de peptido de SST adecuados incluyen sSt de longitud completa y cortistaina (CST), asf como truncamientos y analogos de peptido de los mismos, tales como: sAnSnPaMAPRErKaGCKNFFWKTFTSC (SST-28); AGCKNFFWKTFTSC (SST-14); QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-29);
QERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); QERPPPQQPPHLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-17); PCRNFFWKTFSSCK (CST-14); y PCKNFFWKTFSSCK (CST-14); D-Phe-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052), D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056) o c[Cys- Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (BIM23268); peptidos de octreotide, peptidos de lanreotide, BIM23027, CYN154806, BIM23027, peptidos de vapreotide, peptidos de seglitide y SOM230. Estos TMs se unen a receptores sst, tales como los receptores ssti, sst2, sst3, sst4 y sst5, que estan presentes en celulas tumorales neuroendocrinas relevantes para la presente invencion - ver la Tabla 3. SST y CST presentan homologfa estructural, y se unen a todos los receptores sst conocidos.
Tabla 3
Expresion de subtipos de receptor de somatostaina en tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos (%)
sst1 sst2 sst3 sst4 sst5
Todos los tumores
68 86 46 93 57
Insulinoma
33 100 33 100 67
Gastrinoma
33 50 17 83 50
Glucagonoma
67 100 67 67 67
VIPoma
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Expresion de subtipos de receptor de somatostaina en tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos (%)
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No funcional
80 100 40 100 60
NETs de vientre medio
80 95 65 35 75
Un TM de la presente invencion se une a un receptor de hormona de liberacion de hormona de crecimiento (GHRH). La GHRH tambien es conocida como factor de liberacion de hormona de crecimiento (GRF o GHRF) o somatocrinina. Los peptidos de GHRH adecuados incluyen el peptido GHRH completo (1-44), y truncamientos del mismo tales como GhRh(1-27, 1-28, 1-29), GHRH(1-37), y GhRh(1-40, 1-43)-OH, as^ como peptidos analogos tales como BIM 28011 o NC-9-96; [MeTyr1,Ala15,22,Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2; MeTyr1,Ala8,9,15,22,28,Nle27]-
hGHRH(1-29)-NH2; ciclo(25-29)[MeTyr1,Ala15,DAsp25,Nle27,Orn29+ ++]-hGHRH(1-29)-NH2; (D-Tyr1)-GHRH (1- 29)-NH2; (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala4)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Thr7)-GHRH (1- 29)-NH2; (D-Asn8)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ser9)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Tyr10)-GHRH (1-29)-NH2; (Phe4)-GHRH (1- 29)-NH2; (pCl-Phe6)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyr1)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N- Ac-D-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-D-Tyr1, D-Ala 2, D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (His1, D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-His1, D-Ala2, N-Leu27)-GHRH (1-29)-NH2; (His1, D- Ala 2, D-Ala 4, Nleu27)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; [His1, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2; [NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2; H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe- Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu- Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys- Val-Arg-Leu-NH2; His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-
Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg; His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a un receptor de grelina. Los ejemplos de TMs adecuados en este aspecto incluyen: peptidos de grelina tales como grelina de longitud completa (p.ej., grelina-^) y truncamientos y peptidos analogos de la misma, tales como grelina24-117, grelina52-117, [Trp3, Arg5]-grelina (1-5), des- Gln-Grelina, cortistatina-8, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, peptido de liberacion de hormona del crecimiento (p.ej., GHRP-6) o hexarelina.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a un receptor de bombesina (p.ej., BRS-1, BRS-2 o BRS-3). Los ejemplos de peptidos de bombesina incluyen bombesina de longitud completa - un peptido de 14 aminoacidos aislado originalmente de la piel de una rana (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2); y los dos homologos conocidos en mairnferos, a saber, neuromedina B, y peptido de liberacion de gastrina (GRP) tal como: GRP porcino - Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, y GRP humano - Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg- Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2. La referencia a peptidos de bombesina abarca sus homologos tales como neuromedina B y GRP, e incluye truncamientos y peptidos analogos de los mismos.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a receptor de urotensina. Los TMs adecuados en este aspecto incluyen peptidos de urotensina tales como Urotensina-II (U-II), que es un neuropeptido dclico. La region ciclica C-terminal de U-II esta fuertemente conservada a lo largo de diferentes especies, e incluye los seis residuos de aminoacido (-Cys Ple-Trp-Lys-Tyr-Cys-), que es estructuralmente similar a la region central de la somatostatina- 14 (-Phe-Trp-Lys-Thr-). Los peptidos de urotensina de la presente invencion incluyen los peptidos precursores de U- II, tales como prepro-urotensina-II (que incluye las dos isoformas humanas de la misma, 134 y 139) asf como otros truncamientos tales como la forma de peptido maduro de once residuos y peptidos analogos del mismo.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a receptor de hormona de concentracion de melanina 1. Los ejemplos de TMs en este aspecto incluyen: peptidos de hormona de concentracion de melanina (MCH) tales como MCH de longitud completa, truncamientos y analogos de la misma.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a un receptor de hormona de liberacion de prolactina. Un ejemplo de un TM adecuado en este aspecto incluye el peptido de liberacion de prolactina, truncamientos y analogos del mismo.
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En la presente memoria se describen TMs que se unen a receptor de hormona de liberacion de gonadotropina (GnRH). El GnRH tambien es conocido como hormona de liberacion de hormona luteinizante (LHRH). Los ejemplos de TMs de receptor de GnRH incluyen: peptidos de GnRHI, peptidos de GnRHIl y peptidos de GnRHIII, por ejemplo el polipeptido precursor de GnRH de longitud completa, 92 aminoacidos, y truncamientos del mismo tales como el decapeptido piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly CONH2.
En la presente memoria se describen TMs que se unen a un receptor KiSS-1. Los ejemplos de TMs adecuados en este aspecto incluyen los peptidos Kisspeptina-10, Kisspeptina-54, truncamientos y analogos de los mismos.
Segun un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion de materia, esto es, un polipeptido tal como se define en las reivindicaciones.
Todas las caractensticas del primer aspecto de la presente invencion se aplican igualmente al mencionado segundo aspecto.
En una realizacion preferida del primer y/ o del segundo aspectos de la presente invencion, el TM presenta una secuencia de aminoacidos de peptido humano. Por tanto, un TM altamente preferido es un peptido de GHRH humano.
Preparacion del polipeptido
Los polipeptidos de la presente invencion comprenden 3 componentes principales: un compuesto “bioactivo” (es decir, una proteasa no citotoxica); un TM; y un dominio de traslocalizacion. La tecnologfa general asociada a la preparacion de dichas protemas de fusion a menudo se denomina tecnologfa de toxina re-atacada. A modo de ejemplo, nos referimos a: WO94/21300; WO96/33273; WO98/07864; WO00/10598; WO01/21213; WO06/059093; WO00/62814; WO00/04926; WO93/15766; WO00/61192 y WO99/58571.
Mas detalladamente, el componente TM de la presente invencion puede fusionarse tanto al componente de proteasa como al componente de traslocalizacion de la presente invencion. Dicha fusion preferiblemente es a traves de un enlace covalente, por ejemplo, tanto un enlace covalente directo como a traves de una molecula espaciadora/ ligando. El componente de proteasa y el componente de traslocalizacion estan unidos preferiblemente mediante un enlace covalente, por ejemplo un enlace covalente directo o una molecula espaciadora/ ligando. Las moleculas espaciadoras/ ligando adecuadas son bien conocidas en la tecnica, y tfpicamente comprenden una secuencia basada en aminoacidos de entre 5 y 40, preferiblemente entre 10 y 30 residuos de aminoacido de longitud.
En el uso, los polipeptidos presentan una conformacion di-cadena, en donde el componente de proteasa y el componente de traslocalizacion estan unidos, preferiblemente a traves de un enlace disulfuro.
Los polipeptidos de la presente invencion pueden prepararse mediante tecnicas de conjugacion qrnmica convencionales, que son bien conocidas por los especialistas en la tecnica. A modo de ejemplo, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, cRc Press, Nagy et al., PNAS 95 p1794-99 (1998). Otras metodologfas detalladas para la union de TMs sinteticos a un polipeptido de la presente invencion se proporcionan, por ejemplo, en EP0257742.
De forma alternativa, los polipeptidos pueden prepararse mediante preparacion recombinante de una protema de fusion de polipeptido individual (vease, por ejemplo, WO98/07864). Esta tecnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo mediante el cual se prepara la neurotoxina clostridial nativa (es decir, holotoxina), y da como resultado una protema de fusion que presenta la siguiente disposicion estructural “simplificada”:
NH2 - [componente proteasa] - [componente traslocalizacion] - [TM] - COOH
Segun el documento WO98/07864, el TM se coloca hacia el extremo C-terminal de la protema de fusion. La protema de fusion es activada a continuacion mediante tratamiento con una proteasa, que ejerce la ruptura en un sitio entre el componente de proteasa y el componente de traslocalizacion. De este modo se produce una protema di-cadena, que comprende el componente de proteasa como cadena de polipeptido individual unida covalentemente (a traves de un puente disulfuro) a otra cadena de polipeptido individual que contiene el componente de traslocalizacion mas TM.
Alternativamente, segun el documento WO06/059093, el componente TM de la protema de fusion esta localizado hacia la mitad de la secuencia de la protema de fusion lineal, entre el sitio de ruptura de proteasa y el componente de traslocalizacion. Esto asegura que el TM se una al dominio de traslocalizacion (es decir, como ocurre con la holotoxina clostridial nativa), aunque en este caso los dos componentes estan en orden inverso con respecto a la holotoxina nativa. La posterior ruptura en el sitio de ruptura de proteasa expone la porcion N-terminal del TM, y proporciona la protema de fusion de polipeptido di-cadena.
La(s) secuencia(s) de ruptura de proteasa mencionadas anteriormente pueden introducirse (y/ o eliminar cualquier secuencia de ruptura inherente) a nivel de ADN empleando medios convencionales, tales como mutagenesis sito-
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dirigida. Se puede llevar a cabo un escrutinio para confirmar la presencia de secuencias de ruptura manualmente o con la ayuda de un software de ordenador (p.ej., el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.). Aunque se puede emplear cualquier sitio de ruptura de proteasa (esto es, clostridial o no clostridial), los preferidos son los siguientes:
Enteroquinasa
(DDDDKi)
Factor Xa
(IEGR4 / IDGRi)
TEV (Virus del grabado del tabaco)
(ENLYFQ^G)
Trombina
(LVPR^GS)
PreScission
(LEVLFQ^GP).
Otros sitios de ruptura de proteasa adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que son divididas por una proteasa no citotoxica, por ejemplo, por una neurotoxina clostridial. Estas incluyen las secuencias de reconocimiento de protema SNARE (p.ej., SNAP-25, sintaxina, VAMP) que son divididas por proteasas no citotoxicas tales como las neurotoxinas clostridiales. En el documento US2007/0166332 se proporcionan ejemplos concretos.
El termino sitio de ruptura de proteasa tambien abarca una interna, que es una secuencia auto-divisora. La reaccion de auto-division es controlable, por ejemplo variando la concentracion de agente reductor presente. Tambien se puede emplear la “activacion” de sitios de ruptura mencionada anteriormente como un sitio de ruptura “destructivo” (discutido mas adelante), en caso de que se incorpore uno a un polipeptido de la presente invencion.
En una realizacion preferida, la protema de fusion de la presente invencion puede comprender una o mas etiquetas de purificacion localizadas N-terminal y/ o C-terminal. Aunque se puede emplear cualquier etiqueta de purificacion, se prefieren las siguientes:
etiqueta-His (p.ej., 6 * histidina), preferiblemente como una etiqueta C-terminal y/ o N-terminal
etiqueta-MBP (protema de union a maltosa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal
etiqueta-GST (glutationa-S-transferasa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal
etiqueta-His-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
etiqueta-GST-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
etiqueta-Tiorredoxina, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
etiqueta-CBD (Dominio de Union a Quitina), preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Se pueden incluir uno o mas peptidos espaciadores/ moleculas ligando en la protema de fusion. Por ejemplo, se puede emplear un peptido espaciador entre una etiqueta de purificacion y el resto de la molecula de protema de fusion.
Por tanto, un tercer aspecto de la presente invencion proporciona una secuencia de acido nucleico (p.ej., ADN) que codifica un polipeptido como se ha descrito anteriormente (es decir, el segundo aspecto de la presente invencion).
Dicho acido nucleico puede incluirse en la forma de un vector, tal como un plasmido, que opcionalmente puede incluir uno o mas de un origen de replicacion, un sitio de integracion de acido nucleico, un promotor, un terminador y un sitio de union a ribosoma.
La presente invencion tambien incluye un metodo para expresar la secuencia de acido nucleico descrita anteriormente (es decir, el tercer aspecto de la presente invencion) en una celula hospedante, en particular E. coli o a traves de un sistema de expresion de baculovirus.
La presente invencion tambien incluye un metodo para activar un polipeptido de la presente invencion, comprendiendo dicho metodo la puesta en contacto del polipeptido con una proteasa que divide el polipeptido en un sitio de reconocimiento (sitio de ruptura) localizado entre el componente de proteasa no citotoxica y el componente de traslocalizacion, convirtiendo de este modo el polipeptido en un polipeptido di-cadena en donde los componentes de proteasa no citotoxica y de traslocalizacion estan unidos a traves de un enlace disulfuro. En una realizacion preferida, el sitio de reconocimiento no es nativo para una neurotoxina clostridial natural y/ o para una IgA proteasa natural.
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Los polipeptidos de la presente invencion pueden modificarse adicionalmente para reducir o para prevenir efectos secundarios no deseados asociados a la dispersion a areas que no son un objetivo. Segun esta realizacion, el polipeptido comprende un sitio de ruptura destructiva. El sitio de ruptura destructiva es diferente del sitio de “activacion” (es decir, formacion de di-cadenas), y puede ser dividido por un segunda proteasa y no por la proteasa no citotoxica. Ademas, cuando es dividido de este modo en el sitio de ruptura destructiva por la segunda proteasa, el polipeptido presenta una potencia reducida (p.ej., una capacidad de union reducida a la celula diana objetivo, una actividad de traslocalizacion reducida y/ o una actividad de proteasa no citotoxica reducida). Por completar, cualesquier sitios de ruptura “destructivos” de la presente invencion pueden emplearse por separado como un sitio de “activacion” en un polipeptido de la presente invencion.
Por tanto, segun esta realizacion, la presente invencion proporciona un polipeptido que puede desactivarse y/ o destruirse de forma controlable en una localizacion apartada.
En una realizacion preferida, el sitio de ruptura destructiva es reconocido y atacado por una segunda proteasa (es decir, una proteasa destructiva) seleccionada entre una proteasa en circulacion (p.ej., una proteasa extracelular, tal como una proteasa en suero o una proteasa de la cascada de coagulacion sangumea), una proteasa asociada a tejido (p.ej., una metaloproteasa de matriz (MMP), tal como una MMP de musculo), y una proteasa intracelular (preferiblemente una proteasa que este ausente de la celula diana).
Por tanto, durante el uso, en caso de que un polipeptido de la presente invencion sea dispersado lejos de su celula diana objetivo y/ o sea procesado por una celula no diana, el polipeptido se desactivara por ruptura del sitio de ruptura destructiva (por la segunda proteasa).
En una realizacion, el sitio de ruptura destructiva es reconocido y atacado por una segunda proteasa que esta presente dentro de un tipo celular apartado del sitio. En esta realizacion, la celula apartada y la celula diana son preferiblemente de tipos celulares diferentes. Alternativamente (o adicionalmente), el sitio de ruptura destructiva es reconocido y atacado por una segunda proteasa que esta presente en una localizacion apartada (p.ej., distal con respecto a la celula diana). Por consiguiente, cuando se produce la ruptura destructiva extracelularmente, la celula diana y la celula apartada pueden ser del mismo tipo celular o de diferente tipo celular. En este aspecto, la celula diana y la celula apartada pueden poseer cada una un receptor al cual se une el mismo polipeptido de la invencion.
El sitio de ruptura destructiva de la presente invencion proporciona la desactivacion/ destruccion del polipeptido cuando el polipeptido esta en una localizacion apartada. En este aspecto, la ruptura del sitio de ruptura destructiva minimiza la potencia del polipeptido (en comparacion con un polipeptido identico que carece del mismo sitio de ruptura destructiva, o que posee el mismo sitio de ruptura destructiva pero en forma no dividida). A modo de ejemplo, una potencia reducida incluye: una union reducida (a un receptor de celula de mairnfero) y/ o una traslocalizacion reducida (a lo largo de la membrana endosomal de una celula de mamffero en la direccion del citosol), y/ o una ruptura de protema SNARE reducida.
Cuando se selecciona(n) sitio(s) de ruptura destructiva en el contexto de la presente invencion, es preferible que el sitio(s) de ruptura destructiva no sea(n) sustrato(s) para ninguna proteasa que pueda usarse separadamente para una modificacion post-traduccional del polipeptido de la presente invencion como parte de su proceso de fabricacion. A este respecto, las proteasas no citotoxicas de la presente invencion emplean tfpicamente un evento de activacion de proteasa (a traves de un sitio de ruptura de proteasa de “activacion” separado, que es estructuralmente distinto del sitio de ruptura destructiva de la presente invencion). El proposito del sitio de ruptura de activacion es romper un enlace peptfdico entre la proteasa no citotoxica y los componentes de traslocalizacion o de union del polipeptido de la presente invencion, proporcionando de este modo un polipeptido di-cadena “activado” en donde los dos componentes estan unidos a traves de un enlace disulfuro.
Por tanto, para ayudar a asegurar que el(los) sitio(s) de ruptura destructiva de los polipeptidos de la presente invencion no afectan negativamente al sitio de ruptura de “activacion” y a la posterior formacion de enlace disulfuro, los primeros son introducidos preferiblemente al polipeptido de la presente invencion en una posicion alejada en al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, y mas preferiblemente al menos 60, al menos 70, al menos 80 residuos de aminoacido (contiguos) del sitio de ruptura de “activacion”.
El(los) sitio(s) de ruptura destructiva y el sitio de ruptura de activacion son preferiblemente exogenos (es decir, modificados/ artificiales) con respecto a los componentes nativos del polipeptido. En otras palabras, dichos sitios de ruptura preferiblemente no son inherentes a los correspondientes componentes nativos del polipeptido. A modo de ejemplo, se puede disenar una proteasa o componente de traslocalizacion basado en cadena-L o cadena-H de BoNT/A (respectivamente) segun la presente invencion para incluir un sitio de ruptura. Dicho sitio de ruptura, sin embargo, no estana presente en la correspondiente cadena-H o cadena-H de BoNT nativa. De forma similar, cuando el componente de Resto dirigido a diana (TM) del polipeptido se modifica para incluir un sitio de ruptura de proteasa, dicho sitio de ruptura no estana presente en la correspondiente secuencia nativa del correspondiente Resto dirigido a diana.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva y el sitio de ruptura de “activacion” no son atacados por la misma proteasa. En una realizacion, los dos sitios de ruptura difieren uno del otro
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en que al menos uno, mas preferiblemente al menos dos, de forma particularmente preferible al menos tres, y lo mas preferiblemente al menos cuatro de los aminoacidos tolerados dentro de las respectivas secuencias de reconocimiento sea(n) diferente(s).
A modo de ejemplo, en el caso de una polipeptido quimerico que contiene un sitio de “activacion” de Factor Xa entre los componentes de cadena-L y Hn, es preferible emplear un sitio de ruptura destructiva que sea un sitio diferente a un sitio de Factor Xa, que puede insertarse en otro sitio de el(los) componente(s) de cadena-L y/ o Hn y/ o TM. En este escenario, el polipeptido puede ser modificado para acomodar un sitio de “activacion” alternativo entre los componentes de cadena-L y Hn (por ejemplo, un sitio de ruptura de enteroquinasa), en cuyo caso se puede incorporar un sitio de ruptura de Factor Xa separado en otro sitio del polipeptido como sitio de ruptura destructiva. Alternativamente, el sitio de “activacion” de Factor Xa existente entre los componentes de cadena-L y HN puede ser retenido, y se puede incorporar un sitio de ruptura alternativo como sitio de ruptura destructiva, tal como un sitio de ruptura de trombina.
Cuando se identifican sitios adecuados dentro de la secuencia primaria de cualquiera de los componentes de la presente invencion para la inclusion de sitio(s) de ruptura, es preferible seleccionar una secuencia primaria que coincida estrechamente con el sitio de ruptura propuesto que va a ser insertado. De este modo, se introducen cambios estructurales mmimos en el polipeptido. A modo de ejemplo, los sitios de ruptura tfpicamente comprenden al menos 3 residuos de aminoacido contiguos. Por tanto, en una realizacion preferida, se selecciona un sitio de ruptura que ya posee (en la(s) posicion(es) correcta(s) al menos uno, preferiblemente al menos dos de los residuos de aminoacido requeridos para introducir el nuevo sitio de ruptura. A modo de ejemplo, en una realizacion, se puede introducir el sitio de ruptura de Caspasa 3 (DMQD). A este respecto, se identifica una posicion de insercion preferida que ya incluye una secuencia primaria seleccionada, por ejemplo, entre Dxxx, xMxx, xxQx, xxxD, DMxx, DxQx, DxxD, xMQx, xMxD, xxQD, DmQx, xMQD, DxQD y DMxD.
De forma similar, es preferible introducir los sitios de ruptura en regiones expuestas superficialmente. Dentro de las regiones expuestas superficialmente, se prefieren las regiones de lazo existentes.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se introduce(n) en una o mas de las siguientes posiciones, que estan basadas en la secuencia de aminoacidos primaria de BoNT/A. Aunque las posiciones de insercion se identifican (por conveniencia) en referencia a BoNT/A, las secuencias de aminoacido primarias de dominios de proteasa alternativos y/ o de dominios de traslocalizacion pueden ser alineadas facilmente con dichas posiciones BoNT/A.
Para el componente de proteasa, se prefieren una o mas de las siguientes posiciones: 27-31, 56-63, 73-75, 78-81, 99-105, 120-124, 137-144, 161-165, 169-173, 187-194, 202-214, 237-241, 243-250, 300-304, 323-335, 375-382, 391-400 y 413-423. La numeracion anterior comienza preferiblemente desde el extremo N del componente de proteasa de la presente invencion.
En una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 8 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 10 residuos de aminoacido, mas preferiblemente a mas de 25 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo N del componente de proteasa. De forma similar, en una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 20 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 30 residuos de aminoacido, mas preferiblemente a mas de 40 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo C del componente de proteasa.
Para el componente de traslocalizacion, se prefiere una o mas de las siguientes posiciones: 474-479, 483-495, 507543, 557-567, 576-580, 618-631, 643-650, 669-677, 751-767, 823-834, 845-859. La numeracion anterior preferiblemente reconoce una posicion de inicio de 449 para el extremo N del componente de dominio de traslocalizacion de la presente invencion, y una posicion de finalizacion de 871 para el extremo C del componente de dominio de traslocalizacion.
En una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 10 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 25 residuos de aminoacido, mas preferiblemente a mas de 40 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo N del componente de traslocalizacion. De forma similar, en una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 10 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 25 residuos de aminoacido, mas preferiblemente a mas de 40 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo C del componente de traslocalizacion.
En una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 10 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 25 residuos de aminoacido, mas preferiblemente a mas de 40 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo N del componente TM. De forma similar, en una realizacion preferida, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se localiza(n) en una posicion situada a mas de 10 residuos de aminoacido, preferiblemente a mas de 25 residuos de aminoacido,
mas preferiblemente a mas de 40 residuos de aminoacido, de forma particular preferiblemente a mas de 50 residuos de aminoacido, del extremo C del componente TM.
El polipeptido de la presente invencion puede incluir uno o mas sitios (p.ej., dos, tres, cuatro, cinco o mas) de ruptura destructiva de proteasa. Cuando se incluye mas de un sitio de ruptura destructiva, los sitios de ruptura pueden ser 5 iguales o diferentes. A este respecto, el uso de mas de un sitio de ruptura destructiva proporciona una desactivacion apartada mejorada. De forma similar, el uso de dos o mas sitios de ruptura destructiva proporciona una flexibilidad de diseno adicional.
El(los) sitio(s) de ruptura destructiva puede(n) disenarse en cualquiera de los siguientes componentes del polipeptido: el componente de proteasa no citotoxica, el componente de traslocalizacion, el resto dirigido a diana, o 10 el peptido espaciador (si esta presente). A este respecto, el(los) sitio(s) de ruptura destructiva se elige(n) para asegurar un efecto adverso mmimo sobre la potencia del polipeptido (por ejemplo, presentando un efecto mmimo sobre las regiones dirigidas a diana/ de union y/ o el dominio de traslocalizacion, y/ o sobre el dominio de proteasa no citotoxica) a la vez que se asegura que el polipeptido es labil lejos de su sitio diana/ celula diana.
Los sitios de ruptura destructiva preferidos (mas las correspondientes proteasas) se presentan en la Tabla mostrada 15 inmediatamente debajo. Los sitios de ruptura enumerados son puramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos de la presente invencion.
Segunda proteasa
Secuencia de reconocimiento de sitio de ruptura destructiva Varianza de secuencia de reconocimiento tolerada P4-P3-P2-P1-^-P1'- P2'-P3'
P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3'
Trombina
LVPR^GS A,F,G,I, L,T,V o M A,F,G ,I,L,T, V,W o A P R No D o E No D o E
Trombina
GR^G G R G
Factor Xa
IEGR^ A,F,G,I, L,T,V o M D o E G R
ADAM17
PLAQA^VRSSS
Proteasa de tipo tripsina de vfas respiratorias humana (HAT)
SKGR^SLIGRV
ACE (peptidil- dipeptidasa A)
--- --- --- --- No P No D o E N /A
Elastasa (leucocito)
MEA^VTY M, R E A, H V, T V, T, H Y -- -
Furina
RXR/KR ▼ R X R o K R
Granzima
IEPD^ I E P D --- --- ---
Caspasa 1
F,W,Y, L --- H, A,T D No P,E,D, Q,K o R --- -- -
Caspasa 2
DVAD^ D V A D No P,E,D, Q,K o R --- -- -
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Segunda proteasa
Secuencia de reconocimiento de sitio de ruptura destructiva Varianza de secuencia de reconocimiento tolerada P4-P3-P2-P1-^-P1'- P2'-P3'
P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3'
Caspasa 3
DMQD^ D M Q D No P,E,D, Q,K o R --- -- -
Caspasa 4
LEVD^ L E V D No P,E,D, Q,K o R --- -- -
Caspasa 5
L o W E H D --- --- --
Caspasa 6
V E H o I D No P,E.D. Q.K o R --- -- -
Caspasa 7
DEVD^ D E V D No P,E.D. Q.K o R --- -- -
Caspasa 8
I o L E T D No P,E.D. Q.K o R --- -- -
Caspasa 9
LEHD^ L E H D --- --- ---
Caspasa 10
lEHD^ I E H D --- --- ---
Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son un grupo preferido de proteasas destructivas en el contexto de la presente invencion. Dentro de este grupo, se prefiere ADAM17 (EC 3.4.24.86, tambien conocida como TACE) y actua rompiendo una variedad de protemas de superficie celular ancladas a membrana para “mudar” los dominios extracelulares. Otras MMPs adicionales preferidas incluyen adamalisinas, serralisinas y astacinas.
Otro grupo de proteasas destructivas preferidas es una proteasa sangumea de mairnfero, tal como la Trombina, el Factor de Coagulacion Vila, el Factor de Coagulacion iXa, el Factor de Coagulacion Xa, el Factor de Coagulacion Xla, el Factor de Coagulacion Xlla, Calicrema, Protema C y serina proteasa asociada a MBP.
En una realizacion de la presente invencion, dicho sitio de ruptura destructiva comprende una secuencia de reconocimiento que tiene al menos 3 o 4, preferiblemente 5 o 6, mas preferiblemente 6 o 7, y de forma particularmente preferible al menos 8 residuos de aminoacido contiguos. En este aspecto, cuanto mas larga es la secuencia de reconocimiento (en terminos de residuos de aminoacido contiguos), menos probable es que se produzca una ruptura no espedfica del sitio destructivo por una segunda proteasa no pretendida.
Es preferible que el sitio de ruptura destructiva de la presente invencion se introduzca en el componente de proteasa y/ o el Resto dirigido a diana y/ o el componente de traslocalizacion y/o el peptido espaciador. De estos cuatro componentes, se prefiere el componente de proteasa. Por consiguiente, el polipeptido puede desactivarse rapidamente por una destruccion directa de la proteasa no citotoxica y/o por union y/ o componentes de traslocalizacion.
Administracion de polipeptidos
Para su uso, la presente invencion emplea una composicion farmaceutica, que comprende un polipeptido, junto con al menos un componente seleccionado de un vehfculo, excipiente, adyuvante, propelente y/ o sal farmaceuticamente aceptable.
Los polipeptidos de la presente invencion pueden formularse para aplicacion oral, parenteral, por infusion continua, por implante, por inhalacion o topica. Las composiciones adecuadas para inyeccion pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones o emulsiones, o de polvos seco que se disuelve o suspende en un vehfculo adecuado antes del uso.
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Los medios de administracion local pueden incluir un aerosol, u otro pulverizador (p.ej., un nebulizador). En este aspecto, una formulacion de aerosol de un polipeptido permite la administracion a los pulmones y/o a otras vfas bronquiales o respiratorias.
La ruta de administracion preferida se selecciona entre: sistemica (p.ej., iv), laparoscopica y/ o inyeccion localizada (por ejemplo, inyeccion transfenoidal directamente en el tumor).
En el caso de formulaciones para inyeccion, es opcional incluir una sustancia farmaceuticamente activa para ayudar en la retencion o para reducir la eliminacion del polipeptido del sitio de administracion. Un ejemplo de dicha sustancia farmaceuticamente activa es un vasoconstrictor tal como la adrenalina. Una formulacion asf confiere la ventaja de aumentar el tiempo de residencia del polipeptido despues de la administracion y, por tanto, de esta manera aumentar y/o potenciar su efecto.
Los rangos de dosis para la administracion de polipeptidos de la presente invencion son aquellos que produzcan el efecto terapeutico deseado. Cabe destacar que el rango de dosis requerido depende de la naturaleza precisa del polipeptido o de la composicion, de la ruta de administracion, de la naturaleza de la formulacion, de la edad del paciente, de la naturaleza, extension o gravedad de la afeccion del paciente, de contraindicaciones, si las hay, y del criterio del medico responsable. Las variaciones de dichos niveles de dosis se pueden ajustar usando rutinas empmcas estandares para la optimizacion.
Las dosis diarias adecuadas (por kg de peso del paciente) se encuentran en el rango de 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente de 0,0001-0,5 mg/kg, mas preferiblemente de 0,002-0,5 mg/kg y de forma particularmente preferible de 0,004-0,5 mg/kg. La dosis unitaria puede variar desde menos de 1 microgramo hasta 30 mg, pero habitualmente estara en la region de 0,01 a 1 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o preferiblemente de forma menos frecuente, tal como semanalmente o seis veces al mes.
Un regimen de dosificacion particularmente preferido se basa en 2,5 ng de polipeptido como dosis 1X. En este aspecto, las dosis preferidas se encuentran en el rango de 1X-100X (es decir, 2,5-250 ng).
Las formas de dosis fluidas se preparan tfpicamente utilizando el polipeptido y un veldculo esteril libre de pirogenos. El polipeptido, dependiendo del veldculo y de las concentraciones usadas, puede disolverse o suspenderse en el vehfculo. Al preparar las disoluciones, el polipeptido se puede disolver en el veldculo, haciendo la disolucion isotonica si es necesario mediante la adicion de cloruro sodico y esterilizando mediante filtracion a traves de un filtro esteril usando tecnicas asepticas antes de ser llevadas a viales o ampollas esteriles adecuadas y de sellar. Alternativamente, si la estabilidad de la disolucion es adecuada, la disolucion en sus recipientes sellados puede ser esterilizada mediante autoclavado. De forma ventajosa se pueden disolver en el vedculo aditivos tales como agentes tamponantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes o bactericidas, agentes de suspension o emulsionantes y/ o agentes anestesicos locales.
El polvo seco, que se disuelve o se suspende en un veldculo adecuado antes de su uso, puede prepararse rellenando los ingredientes esterilizados previamente en un recipiente esteril usando tecnicas asepticas en un area esterilizada. Alternativamente, los ingredientes se pueden disolver en recipientes adecuados usando tecnicas asepticas en un area esterilizada. A continuacion es producto es secado por congelacion y los recipientes se sellan asepticamente.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyeccion intramuscular, subcutanea o intradermica, se preparan sustancialmente de la misma manera, exceptuando que los componentes esteriles son suspendidos en el veldculo esteril, en lugar de estar disueltos, y la esterilizacion no se puede llevar a cabo por filtracion. Los componentes pueden aislarse en estado esteril o, alternativamente, pueden esterilizarse tras el aislamiento, p.ej., mediante irradiacion gamma.
De forma ventajosa, se incluye un agente de suspension, por ejemplo polivinilpirrolidona, en la(s) composicion(es) para facilitar una distribucion uniforme de los componentes.
Seccion de definiciones
El resto dirigido a diana (TM, del ingles “Targeting Moiety”) segun se define en las reivindicaciones significa cualquier estructura qrnmica que interacciones funcionalmente con un sitio de union para producir una asociacion ffsica entre el polipeptido de la invencion y la superficie de la celula diana (dpicamente una celula de marnffero, especialmente una celula humana). El termino TM abarca cualquier molecula (es decir, una molecula natural o una variante modificada qmmicamente/ffsicamente de la misma) que sea capaz de unirse a un sitio de union sobre la celula diana, sitio de union que es capaz de internalizacion (p.ej., formacion de endosoma) - tambien denominada endocitosis mediada por receptor. El TM puede poseer una funcion de traslocalizacion de membrana endosomal, en cuyo caso no es necesario que esten presentes los componentes TM y de dominio de traslocalizacion separados en un agente de la presente invencion. A lo largo de la descripcion precedente, se han descrito TMs espedficos. La referencia a dichos TMs es meramente ilustrativa, y abarca todas las variantes y derivados de los mismos, que posean una capacidad de union basica (es decir, de ataque a diana) a un sitio de union localizado en la celula tumoral neuroendocrina, en donde el sitio de union es capaz de internalizacion.
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El TM de la presente invencion se une (preferiblemente se une espedficamente) a la celula diana en cuestion. El termino “se une espedficamente” preferiblemente significa que un TM dado se une a la celula diana con una afinidad
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de union (Ka) de 10 M- o superior, preferiblemente de 10 M- o superior, o de 10 M- o superior, o de 10 M- o superior. Los TMs de la presente invencion (cuando se encuentran en forma libre, es decir cuando estan separados de cualquier componente de proteasa y/ o de traslocalizacion), preferiblemente presentan una afinidad de union (IC50) por el receptor diana en cuestion en el rango de 0,05-18 nM.
El TM de la presente invencion preferiblemente no es aglutinina de germen de trigo (WGA).
La referencia a TM en la presente especificacion abarca los fragmentos y variantes del mismo que retienen la capacidad de unirse a la celula diana en cuestion. A modo de ejemplo, una variante puede tener una homologfa de secuencia de aminoacidos de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, mas preferiblemente de al menos el 95% y lo mas preferiblemente de al menos el 97 o al menos el 99% con respecto al TM de referencia - este ultimo es cualquier secuencia de TM mencionada en la presente solicitud. Por tanto, una variante puede incluir uno o mas analogos de un aminoacido (p.ej., un aminoacido no natural), o un enlace sustituido. Asimismo, a modo de ejemplo, el termino fragmento, cuando se usa en relacion a un TM, significa un peptido que tiene al menos cinco, preferiblemente al menos diez, mas preferiblemente al menos veinte, y lo mas preferiblemente al menos veinticinco residuos de aminoacido del TM de referencia. El termino fragmento tambien se refiere a las variantes mencionadas anteriormente. De esta manera, a modo de ejemplo, un fragmento de la presente invencion puede comprender una secuencia de peptido que tiene al menos 7, 10, 14, 17, 20, 25, 28, 29 o 30 aminoacidos, en donde la secuencia de peptido tiene una homologfa de secuencia de al menos el 80% con respecto a la correspondiente secuencia de peptido de aminoacidos (contiguos) del peptido de referencia.
La somatostatina (SST) y la cortistatina (CST) tienen una elevada homologfa estructural, y se unen a todos los receptores de SST conocidos. La SST de longitud completa presenta la secuencia de aminoacidos:
MLSCRLQCALAALSIVLALGCVTGAPSDPRLRQFLQKSLAAAAGKQELAKYF
LAELLSEPNQTENDALEPEDLSQAAEQDEMRLELQRSANSNPAMAPRERKA
GCKNFFWKTFTSC
La CST de longitud completa presenta la secuencia de aminoacidos:
MYRHKNSWRLGLKYPPSSKEETQVPKTLISGLPGRKSSSRVGEKLQSAHKM
PLSPGLLLLLLSGATATAALPLEGGPTGRDSEHMGEAAGIRKSSLLTFLAWW
FEWTSQASAGPLIGEEAREVARRQEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSS
CK
La referencia a estos TMs incluye los siguientes fragmentos de los mismos (y las correspondientes variantes): NFFWKTF;
(R o K)NFFWKTF;
C(R o K)NFFWKTF;
(P o G)C(R o K)NFFWKTF;
NFFWKTF(S o T);
NFFWKTF(S o T)S;
NFFWKTF(S o T)SC;
(R o K)NFFWKTF(S o T);
(R o K)NFFWKTF(S o T)S;
(R o K)NFFWKTF(S o T)SC;
C(R o K)NFFWKTF(S o T);
C(R o K)NFFWKTF(S o T)S;
C(R o K)NFFWKTF(S o T)SC;
(P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T);
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(P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T)S; o (P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T)C.
En relacion a las anteriores secuencias, cuando se proporciona una alternativa (P o G), es preferible P en el caso de un TM de CST, mientras que se prefiere G en el caso de un TM de SST. Cuando se proporciona una alternativa (R o K), es preferible R para el caso de un TM de CST, mientras que para el caso de un TM de SST se prefiere K. Cuando se proporciona una alternativa (S o T), es preferible S para el caso de un TM de CST, mientras que para el caso de un TM de SST se prefiere T.
Los fragmentos preferidos comprenden al menos 7 o al menos 10 residuos de aminoacido, preferiblemente al menos 14 o al menos 17 residuos de aminoacido, y mas preferiblemente al menos 28 o 29 residuos de aminoacido. A modo de ejemplo, las secuencias preferidas incluyen: SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC (SST-28); AGCKNFFWKTFTSC (SST-14); QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-29);
QERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); QERPPPQQPPHLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-17); PCRNFFWKTFSSCK (CST-14) y PCKNFFWKTFSSCK (CST-14).
El TM puede comprender una secuencia de aminoacidos mas larga, por ejemplo, de al menos 30 o 35 residuos de aminoacido, o de al menos 40 o 45 residuos de aminoacido, siempre que el TM sea capaz de unirse a una celula tumoral neuroendocrina, preferiblemente a un receptor de SST o de cSt de una celula tumoral neuroendocrina. A este respecto, el TM preferiblemente es un fragmento de SST o CST de longitud completa, aunque incluyendo al menos la secuencia de nucleo “NFFWKTF” o una de las secuencias de aminoacido primarias definidas anteriormente.
Los peptidos GHRH de la presente invencion incluyen:
YADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDILSR;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIM;
ADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQDILSR;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMS;
YADA1FTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA;
YADAIFTNAYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAI FTASYKKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAI FTASYNKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYKKVLGQLSAKKLLQDIMSR; YADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFEASYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYR KELGQ LSAR KLLQDIMSR; YADAI FTESYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIMSR; YADAI FTAAYRKVLAQLSARKALGDIASR;
YADAI FTNSYRKVLGQLSARKALQDIMSR YADAIFTASYKRVLGQLSARKLLQDIMSR YADAI FTASYRKVLGQLSAKKLLQDIMSR YADAI FTASYRKVLGQLSANKLLQDIMSR YADAIFTASYRKVLGQLSARNLLQDIMSR YADAI FTASERKVLGQLSARKLLQDIMSR YADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDIMSR YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIM YADAIFTASYRKVLAQLSARKLLQDIMSR YADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQDIMSR
HVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA;
HVDAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILSRQQG; HVDAIFTSSYRKVLAQLSARKLLQDILSR; HVDAIFTTSYRKVLAQLSARKLLQDILSR; YADAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILNR;
YADAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILSR.
La confirmacion de que un TM se une a la celula diana seleccionada es rutinaria. Por ejemplo, se puede emplear un experimento sencillo de desplazamiento radioactivo en el que el tejido o las celulas representativas de una celula tumoral neuroendocrina son expuestos a TM marcado (p.ej., tritiado) en presencia de un exceso de TM no marcado. En dicho experimento, se pueden determinar las proporciones relativas de union no espedfica y union espedfica, permitiendo de este modo la confirmacion de si el TM se une a la celula diana. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o mas antagonistas de union, y el ensayo puede comprender ademas la observacion de una perdida de union de TM. Los ejemplos de este tipo de experimento se pueden encontrar en Hulme, E.C. (1990), “Receptorbinding studies, a brief outline”, pag. 303-311, en “Receptor biochemistry, A Practical Approach”, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
En el contexto de la presente invencion, la referencia a un peptido TM (p.ej., un peptido GHRH) abarca los peptidos analogos del mismo, siempre que el TM analogo se una al mismo receptor que el TM de “referencia” correspondiente. Dichos analogos pueden incluir residuos sinteticos tales como: I3-Nal = 13-naftilalanina; 13-Pal = U -
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piridilalanina; hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina; hArg(Et)2 = N, N'-guanidino-(dimetil)-homoarginina; hArg(CH2CF3)2 = N, N-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetil)-homoarginina; hArg(CH3, hexil) = N, N-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina; Lys(Me) = Ne-metillisina; Lys(iPr) = Ne-isopropillisina; AmPhe = aminometilfenilalanina; AChxAla = aminociclohexilalanina; Abu = acido a-aminobutmco; Tpo = 4-tiaprolina; MeLeu = N-metilleucina; Orn = ornitina; Nle - norleucina; Nva = norvalina; Trp(Br) = 5-bromo-triptofano; Trp(F) = 5-fluoro-triptofano; Trp(NO2) = 5-nitro- triptofano; Gaba = acido Y-aminobutmco; Bmp = J-mercaptopropionilo; Ac = acetilo; y Pen = pencillamina.
El aspecto del peptido analogo anterior se describe con mas detalle en referencia a peptidos TMs espedficos, tal como los peptidos de SST, los peptidos de GHRH, los peptidos de bombesina, los peptidos de grelina, GnRH (tambien conocidos como peptidos LHRH), y los peptidos de urotensina.
Los analogos de somatostatina incluyen los descritos en las siguientes publicaciones: Van Binst, G. et al. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. et al. Abstract, "Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity"
22nd European peptide Symposium, 13-19 de septiembre,1992, Interlaken, Suiza; US5.506.339; EP0363589
US4.904.642
US4.369.179
US4.211.693
US5.552.520
WO91/18016
US4.871.717
US4.360.516
US4.190.648
EP0389180;
US4.725.577
US4.328.214
US4.146.612
EP0505680;
US4.684.620
US4.316.890
US4.133.782
US4.603.120;
US4.650.787
US4.310.518
US5.506.339
EP0030920;
US4.585.755
US4.291.022
US4.261.885
US4.853.371;
US4.725.577
US4.238.481
US4.282.143
WO90/12811;
US4.522.813
US4.235.886
US4.190.575
WO97/01579
WO98/08529 y WO98/08528; WO/0075186 y WO00/06185; WO99/56769; y FR 2.522.655.
Los analogos preferidos incluyen: ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe) o H-D-I3-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys- Thr-NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe-THr-NH2; H-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-NH2, H-D-Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D-13-Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2, H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D- Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-I3-Nal-NH2; H-D-I3-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Phe-D- Trp-Lys-Thr-Cys-I3-Nal-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-I3-Nal-NH2; H-D-I3-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; H-Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-OH; H-Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH; H-Phe-Pen-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; H-D-Phe- Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH2; H-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; Ac-D-Phe-Lys*-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Asp*-Thr-NH2 (un puente de amida formado entre Lys* y Asp*); Ac-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Bu)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-L-hArg (Et) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe- D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt; Ac-L-hArg (CH2-CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys- Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (Me)-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys- Phe-D-Trp-Lys (Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt; Ac-hArg (CH3, hexil)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-hArg (hexil2)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt; Ac- D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2; Propionil-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (iPr)-Thr- Cys-Thr-NH2; Ac-D-13-Nal-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg (Et) 2-NH2; Ac-D-Lys (iPr)-Gly-Cys-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys- Thr-NH2; Ac- D-hArg (CH2CF3) 2-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys- Phe-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; c-Cys-Lys-Asn-4-CI-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p- Cl-Phe-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2; H-D-I3-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H-pentafluoro-D-Phe- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; Ac-D-l3-Nal-Cys-pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-i-Nal-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-I3-Nal-NH2; H-D-, SNal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Abu-Cys-Thr-NH2; H-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; Ac-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys- Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-p-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2; ciclo (Pro- Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-N-Me-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-L-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp (F)-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-Trp (F)-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro- Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-p-Cl-Phe); ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-Trp-D- Phe); ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Phe); ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-Lys-D-Trp-D-Phe); ciclo (D- Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr); ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-t-4- AchxAla-Thr-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe); ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-4-Amphe-Thr-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-4-Amphe- Thr-Phe); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba-Gaba); ciclo (Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-NH (CH2) 4cO); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-
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Lys-Thr-Phe->Ala); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH; ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly); ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Gly); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp (F)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp (NO2)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-Trp (Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe (I)-Gaba); ciclo (Asn-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Tyr (But)-Gaba); ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH; ciclo (Bmp- Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro-Cys)-OH; ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Tpo- Cys)-OH; ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys)-OH; ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Phe-Gaba); ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Phe-Gaba); ciclo (Phe-Phe-D-Trp (5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys (Ac)-Thr-Phe-NH- (CH2) 3-cO); ciclo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Orn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H- Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2.
Los metodos para sintetizar analogos estan bien documentados, tal como se ilustra, por ejemplo, en las patentes citadas anteriormente. Por ejemplo, la smtesis de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 se puede lograr siguiendo el protocolo establecido en el Ejemplo 1 de la patente EP0395417A1. De forma similar, la smtesis de analogos con un extremo N sustituido se puede lograr, por ejemplo, siguiendo el protocolo establecido en las patentes WO88/02756, EP0329295 y US5.240.561.
Los ejemplos preferidos de analogos lineales incluyen: H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D- Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-*Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe- Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; y H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-beta-Nal-NH2.
Uno o mas restos qmmicos, p.ej., un derivado de azucar, grupos mono o poli-hidroxilalquilo (C2-12), mono o poli- hidroxiacilo (C2-12), o un derivado de piperacina, pueden unirse a un analogo de SST, p.ej., al aminoacido del extremo N - veanse las patentes WO88/02756, EP0329295 y US5.240.561.
Ejemplos adicionales de analogos de SST incluyen los siguientes: D-Cpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo[Cys-p-NH2-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; N-Me- D-Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Pal-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; Ac-D-Nal- ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-OH; ED-Phe-ciclo[Cys-Nal-D-Trp-Lys-Val- Cys]-Thr-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Nal-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-D-Cys]-Nal- NH2; D-Trp-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Nal-NH2; Nal- ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Nal-NH2; (AcO-CH2)3-C-NH-CO-(CH2)2-CO-D-Nal-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys]Thr-NH2; [3-O-(2,5,6-triacetil ascorbico)acetil-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Nal-ciclo[Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2; Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2; 3-O-(ascorbico)-butiril-D-Nal- ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; 3-O-(acido ascorbico)Ac-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr- NH2; D-Bpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Bpa-NH2; Tris-Suc- D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Dpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal- ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Dpa-NH2; Ac-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; ciclo-[Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; NmeCpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(NMeDcys-3-Pal- DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe; Cpa-ciclo (DCys-NMe3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal- NMeDTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3- Pal-DTrp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys- 3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Nme2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Dip-NHMe; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Tfm- ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; Nal- ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; 3-Pal-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; NmeCpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal- NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2- Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; Nal-ciclo (DCys-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)- DTrp-NH2; o 3-Pal-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; NmeCpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr- Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-NMeDTrp- NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; o Cpa-ciclo(DCys-3-Pal- DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-Tyr- DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; acido metilpropionico-Tyr-D-Trp- ys-Val-Cys-Thr-NH2; acido metilpropionico -Tyr- D-Trp- ys-Val-Cys-Phe-NH2; acido metilpropionico -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH2; acido metilpropionico -Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2; D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-val-Phe-Thir- NH2; D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; o D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-p-D-Nal-NH2; H2- c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Trp- D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, o H2-c[Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]- NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys- Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp- Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-
5
10
15
20
25
30
35
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45
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65
Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, o H2-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]- NH2, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-C [D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-C [Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2- c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[ Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D- Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys- Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ]-NH2, H2-c [Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c [D-Cys-Asn- Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c [Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c [D-Cys-Asn- Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c [Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c [D-Cys-Asn- Phe-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2; Ac-D-Phe-Tyr-ciclo (D- Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D- Cys)-Abu-Nal-NH2; D-Dip-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)- Abu-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal- NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; ciclo(D-Phe-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr); Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A3c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Cpa- Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A6c-Nal-NH2; (G(z))aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Pal-ciclo(D- Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-l3-Ala-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-Sar-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)-Pro-Nal-NH2; Pro-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nle-Phe-NH2; Pro-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)- Thr-Nle-NH2; Pro-Phe-c (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr-Phe-NH2; Cpa-Phe-c (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-NH2 ; Cpa-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Tyr-NH2; Pip-Phe-c (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-NH2; Pip-Phe-c (Cys-D- Trp-Lys-Cys)-Gaba-NH2; o Pro-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr-NH2; Phe-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2; Phe-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-NH2; Ac-D-Phe-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-NH2; Nal- Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo(D- Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo (D-Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2, Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys- D-Cys)-A3c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)- A6c-Nal-NH2; (G(z))aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; D-Cpa-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal- NH2; Pal-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Cpa-Pal- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-G-Ala-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Sar-Nal-NH2; Cpa-Pal- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Aic-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D- Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Pro-Nal-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-(A)aeg-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)-A4c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal- NH2; Pro-Phe-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-NH2; Pro-Phe-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Val-NH2; Pip-4-NO2-Phe- ciclo(D-cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nle-NH2; (G)aeg-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-(C)aeg-NH2; or (C)aeg- Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr (Bzl)-(G)aeg-NH2; Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Nal- ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2, D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-4-NO2-Phe-Pal-ciclo(D- Cys-Phe (4-O-Bzl)-D-Trp-Lys-Cys)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-NH2; D-4- NO2-Phe-ciclo (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(Bzl)-Tyr-NH2; 4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Pro-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(Bzl)-Nal-NH2; Ser(Bzl)-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)- Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (G)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-(T)aeg-D- Trp-Lys-Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal- D-Trp-Lys-Cys)-Phe(4-O-Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-A5c-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Tyr-NH2; D-Cpa-ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (c)aeg-ciclo(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-Cpa-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(Pen-Pal- D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Trp-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Phe-D- Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Orn-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D- Trp-hLys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-lamp-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D- Trp-Cha(4-am)-D-Cys) Thr (Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-D-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys) Thr (Bzl)-Trp-NH2; (T) aeg-c (D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Pen)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Ina-c(D-Cys- Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Mnf-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Inp-c(D-Cys-Phe-D- Trp-Lys-D-Cys)-thr(Bzl)-Tyr-NH2; Nua-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Tyr(Bzl)-Thr-NH2; (C)aeg-Phe-c(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys) Thr(Bzl)-Tyr-NH2; or (T)aeg-D-Trp-c(D-Cys-Pal-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Leu-NH2; Hca-ciclo(D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-D-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)- Nal-NH2; Ac-D-Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Nal- ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-4-NO2-Phe-Pal-ciclo(D-Cys-Phe(4-O-Bzl)-D-Trp-Lys-Cys)-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-
5
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65
ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; 4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-
Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; Pro-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Nal-NH2; Ser(Bzl)-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (c)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Aic-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C(z))aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (A(z))aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D- Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (G)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys- (T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Phe(4-O-Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-A5c-Tyr-NH2; (T)aeg- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Tyr-NH2; D-Cpa-ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-p-Me-Phe-NH2; Ac-(T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)- Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; D-Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr- NH2; (C)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; D-Cpa-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr- NH2; (T)aeg-c(Pen-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Trp-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Orn-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-hLys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2, (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-lamp-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Cha(4-am)-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr- NH2; (T)aeg-c (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr (Bzl)-D-Tyr-NH2; (T)aeg-c (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)- Trp-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Pen)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)- Tyr-NH2; Ina-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Mnf-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr- NH2; Inp-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Nua-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Tyr(Bzl)-Thr-NH2; (C)aeg-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; o (T)aeg-D-Trp-c(D-Cys-Pal-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Leu-NH2; ciclo(Trp-D-Trp-Lys-Phe(4-O-Bzl)-Phe-(T)aeg); ciclo(Trp-D-Trp-Lys-Pal-Phe-(T)aeg); ciclo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- (T)aeg); o H-I3-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (tambien conocido como lanreotide) ciclo(Pro-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe), ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Phe); D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; D-Phe-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cysbeta-Nal-NH2; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-acido aminobutmco-Cys-Thr-NH2; pentafluoro-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; N-Ac-D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;D-beta-Nal~Cys- pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; D-/3-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; D-Phe-Cys-/3-Nal- D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-acido aminobutmco-Cys-Thr-NH2; D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-a- acido aminobutmco-Cys-Thr-NH2; acetil-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a- acido aminobutmco-Cys-Thr- NH2; ciclo(Pro-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe); ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe); D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH2; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2; D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol); D-p-Cl- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2- hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizineethanesulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizineethanesulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta- Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-0-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Lys-Thr-NH2; H2- Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanosulfonil)-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-N H2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)- Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-NH2; H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)- beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietN)-1-pipenzinaetanosulfoml)-beta- Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxiethil)-1-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys- beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Abu-Cys- beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys- Thr-NH2; H2-Phe-D-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Pen-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Pen-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2; H2- Dip-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Dip-NH2; H2-F5-Phe-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-F5-Phe-NH2; H2-Dip-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-m-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-m-F-Phe-NH2 H2-o-F-Phe-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-o-F-Phe-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-F-Phe-NH2; H2-F5-Phe-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-F5-Phe-NH2; H2-F5-Phe-D-Cys-2-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-F5-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys- His-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Dip-NH2; H2-Dip-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Dip-D-Cys-His-D-Trp- Lys-Val-Cys-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Trp-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-D-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-D-p-F-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Nle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Ile-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Gly-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Ala-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Leu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Bip-D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Ile-Cys-Bip-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-His-D-Trp Lys-Val-Cys-p-F-Phe-NH2; H2-Npa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val- Cys-Tyr-NH2; H2-m-F-Phe-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-m-F-Phe-NH2; H2-o-F-Phe-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys- o-F-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Dip-NH2; H2-Cpa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Cpa-NH2; H2-Igl-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-lgl-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D- Cys-3-I-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-CN-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-CN-Phe-NH2; H2-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Bta-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F- Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Bpa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Bpa-NH2; H2-lph-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-lph-NH2; H2-Trp-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Tle-Cys-p-Cl-Phe-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cha-Cys-p-Cl-Phe-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys- Tr(l)-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH2; H2-p-Cl-Phe-D-Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-Cl-Phe-D- Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Tyr(lI-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F- Phe-D-Cys-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-N02-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-N02-Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D- Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-N02-Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)- Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-N02-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Tyr-NH2; H2-p- NO2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-N02-Phe-D-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys-P-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Tyr(Bzl)-NH2; H2-D-Phe-D-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; H2-D-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr- NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-beta-Nal-NH2; H2-D-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-D- p-F-Phe-NH2; H2-D-Bip-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-Dip-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta- Nal-NH2; H2-D-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-p-Cl-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys- p-Cl-Phe-NH2; p-N02-D-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Tyr(Bzl)-NH2; p-N02-D-Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp- Lys-Val-Cys-Tyr(Bzl)-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-NO2-P-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys- Tyr(Bzl)-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-N02-P-Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Val-Cys-Tyr(Bzl)-NH2; (H) (5-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-N H2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3- fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta- Nal-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH,2; (H)(3-[2- naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr- NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-
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Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[p-hidroxifenil])-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-naftil]propioml)-D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; (H)(3- fenililpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; o (H)(3-fenililpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys- Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(cH3CO)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-
hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidroxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida;
(H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-
hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosuifonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidroxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida;
(H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-
hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosuifonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidroxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida;
(H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-
hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosuifonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidroxi)propilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida;
(H)(CH3cO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R, 3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)- 1-piperizinaetanosulfonil) Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; H2-Phe-D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilairiida; H(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val- Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazimlacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil) Phe-D-Cys-Pal- D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilairiida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R, 3R-(2-hidroximetil)-3-
hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazimlacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroxiirietil)- 3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-pipenzinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-
hidroxi)propilamida; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidroxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-pipenzinaetanosuifonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-
hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-ys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3cO)- beta-Nal-D-Cys-Tyr-P-Trp-Lys-Vai-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil) -1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfoml)-D-Nal-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida;
(H)(CH,CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazimlacetil)- beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-pipenzinaetanosulfoml)-beta-Nal- D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-
naftil)etilamida; (H)(CH,CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4- (2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanosuifonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2- hidroxietil) -1-piperazinilacetil)Phe-P-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val- Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)Phe-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilaiTiida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1I-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr- Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)- 1-piperazinilacetil)Phe-P-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr- Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)Phe-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)Phe-P-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Abu-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; o H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Ab u-Cys-2R, 3R-(2-hidroximetil)-3-hidroxi)propilamida; H2-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H2-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-Phe-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe- Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil) - beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-
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D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D- Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)- beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosuifonil) -beta-Nal-D-Cpa-Pal- D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D- Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Phe-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanosulfonil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta- Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2-; o H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe- Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cpa-Phe-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr- NH2; H2-D-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; o H2-D-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2.
Los peptidos analogos de GHRH data de la decada de 1990, e incluyen el “antagonista estandar” (Ac-Tyr', D- Arg2jhGH-RH (1-29) Nha. La Patente de EE.UU. n° 4.659.693 describe analogos antagonistas que contienen determinados residuos de N,N'-dialquil-omega-guanidino alfa-amino acilo en posicion 2 de la secuencia GH-RH (129). Cabe destacar las siguientes publicaciones, WO91/16923 describe modificaciones de hGH-RH que incluyen: reemplazar Tyr1, Ala2, Asp3 o Asn8 por sus isomeros D; reemplazar Asn8 por L- o D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln o D- Lys; reemplazar Ser9 por Ala para potenciar la anfifilicidad de la region; y reemplazar Goy'S por Ala o Aib. La patente uS5.084.555 describe un analogo [Se-psi [CH2-NH]-Tyrl°IhGH-RH (1-29) que incluye un enlace pseudo- peptfdico (es decir, un enlace peptfdico reducido a un enlace [CH2-NH]) entre los residuos R9 y R10. Las patentes US 5.550.212, US5.942.489 y US6.057.422 describen analogos de hGH-RH (1-29) NH2 producidos mediante reemplazamiento de varios aminoacidos y acilacion con acidos aromaticos o no polares en el extremo N de GH-RH (1-29) NH2. Se han demostrado las propiedades inhibidoras de tumor de los antagonistas presentados en la Patente de EE.UU. n° 5.942.489 y en la Patente de EE.UU. n° 6.057.422 usando ratones nude que portan xenoinjertos de modelos de cancer humano experimentales. Los ejemplos espedficos incluyen: [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Amp9, Tyr (Me010, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Amp9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, His9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Amp9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [HOOC (CH2) 8CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Amp9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 2CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCi) 6, Amp9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Amp9, Tyr (Me)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1- 29) NH2; [1-nac-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH- RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu15, Nle27, D-Arg28 Har'] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Cit8, Amp9, Tyr (Et)'°, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, His9, Tyr (Et010, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Alpe, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, i Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 8CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, His9, Tyr(Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, His9, Tyr(Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Ala8, Amp9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2)1 2CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har2lhGH-RH' (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO-Tyr1, D- Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, Amp9, Tyr(Et)10, His11, Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [1-Nac- Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, His9, Tyr (Et)'°, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH- RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6C0-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Ala8, His9, Cit15, Nle27, D-Arg28, har29]hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, His9, tyr(Et)10, His11, His15, His20, Nle27, D-Arg28 Har29]hGH-RH (129) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6C0-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Alas, His9, Tyr (Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Ala8, His9, Tyr (Et)", His", Abu", Nie 2', D-Arg2, Har29]hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 8CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 10CO -Tyr1, D-Arg2 Phe (pCl) 6 Ala8, His9, Tyr(Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28 Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [Hca -Tyr1, D- Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, His9, Tyr(Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NHEt; [CH3 (CH2) 6C0-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NHMe; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe(pCl)6,Alas, His9, Tyr (Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27 D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe Cl)6, Ala8, Amp9, Tyr(Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21 Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Phe (pNO2)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-
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RH(1-29)NH2; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, His9, Tyr(Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC 9CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Alas, Amp9, Tyr (Et)10, His", Orn, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 2CO -Tyr1, D- Arg2 Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Dip'°, His", Orn12, Abu'5, His, Orn21, Nie D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Phe (pNO2)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Alas, His9, Tyr (Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, d-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, Amp9, Phe(pNO2)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D- Arg28, har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Ala8, Amp9, Tyr(Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nie27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Aia8, His9, Phe (pN02)'°, His", Orn'2, Abu'5, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Ala8, Amp9, Dip10, His", Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nie27 D-Arg Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Phe (pN02) 10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala', Amp9 Dip'°, His", Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Phe (pNO2)10, His11, orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2) 12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, his20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2)1 2CO -Tyr1, D- Arg2, Phe (pCl) 6, Alas, Amp9, Phe (pNO2)10, His", Orn12, Abu15, His20 Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 4CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2) 4CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3(CH2)8CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)8CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2)1 OCO-Tyr1, D-Arg2 Phe Cl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg26, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2) 0CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nie27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH- RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) i2CO-Tyr\ D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 4CO-Tyr1 D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 4CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) CO- Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, Har28, D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu'5, Nle27, Har28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 4CO-PheO, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 14CO-D-PheO, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Arg°, D-Arg2, Phe (pCi) 6, Arg9, Abu'5, NLe27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-D-Arg°, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyrl, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cite, Arg9 Abut5 Nie27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cite, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Arg9, Abu'5, Nle27, Har28, D-Arg29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Cit8, Cit9, Abu15, Nle27, Har28, D-Arg29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) i2CO-Tyr\ D-Arg2, Phe (pCl)6, Cit8, Cit9, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, D-Ala8, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyrl, D-Arg2, Phe (pCl) r3, Abu3, Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Cit9, Abu15, Nle27, Har28, D-Arg29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Amp'°, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Amp10 Abu5, Nle27, D-Arg28, Har29 hGH-RH (1-29) NH2; PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6 Arg9, His'o, Abu'5, Nle 27, D-Arg28, Ha) hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Cha10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Tpi10, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29]hGH-RH (129) NH2; PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, 2-Nal10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc- Tyrl, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Dip10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Phe (pNH2)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2 Phe (pCl) zu Har9, Trpt°, Abu15 Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Phe(pNO2)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, 3-Pal10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Et)'°, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-His', D-Arg2, Tyr6, Har9, Bpa10, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Har12, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [Hca-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NHEt; [PhAc- Tyr'D-Arg2, Phe (pCl) 6 Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29[hGH-RH(1-29) NHEt; PhAc-Tyr1, D-Arg2 Phe Cl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29 NHEt; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Aib15, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Orn12, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1- 29) NHEt; [Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Agm29]hGH-RH (1-29); [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)'°, Abu15, Nle27, D-Arg28, Agm29]hGH- RH(1-29); [Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30]hGH-RH(1- 30) NH2; [Dat-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30]hGH-RH (1-30) NH2; [Ipa-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30]hGH-RH(1-30)NH2; [Hca-
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Tyr', D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30] hGH-RH (1-30) NHEt; [Hca-Tyr', D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me10), Abu15, Nle27, D-Arg28, D-Arg29, Har30]hGH-RH(1- 30) NH2; [Hca-Tyr', D- Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, D-Arg30]hGH-RH(1- 30) NH2; [Hca-Tyr', D- Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Agm30] hGH-RH (1-30); [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Agm30] hGH-RH (1-30); [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr(Me)10, Har11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NH2 [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr (Me)10, Amp11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Tyr (Me)10, Cit", Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Tyr (Me)'°, Abu15, His20, Nle, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe(pCl)6, Har9, Tyr (Me)10, His", Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH- RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Cit15, Nie27, D- Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [IndAc0, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe pCl) r, Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH- RH (1-29) NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH- RH (1-29) NH2; [PhAc°, His', D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [Nac°, His', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe (pCl) 6 Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [lndAc°, D-Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc°, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2 ; [PhAc°, His', D- Arg2, Phe (pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [Nac°, His', D-Arg2, Phe(pCl)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (129) NH2; [PhAc0, D-Arg2, Phe(pCl)fi, Ala15, Nle27, Asp28]hGH-RH(1-28)Agm; [Ibu°,D-Arg2, Phe(pCl)8 10, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm; [PhAc°,D-Arg2, Phe(pCl)6, Abu15, Nie 7]hGH-RH(1-28)Agm; [PhAc°,D-Arg2, Phe(pCl)6,
Ala15, Nle27]hGH-RH(1-29)-NH2; [PhAc°, D-Arg2Phe(pCl)6,Abu8,Ala85,Nle2/]hGH-R~H(1-29)NH2; [PhAc0, D-Arg2
Ala15 Mlo27lh^W_PWM_OQ'\_MI-U- ,~i,~l,A,12rDhA^° n-Ai-n2 Pho/nrO6 HUiil3 a i_15 mi_27-,u^l
Nle27]hGH-RH(1-29)-NH2; ciclo8
Phe(pCl)6, Abu8,28.
NH2; ciclo17,21 [PhAc°,D-Arg2,Phe(pCl)6,Ser8,Alal5,Glu
Arg2,Phe(pCl)0Glu8,25 ,Abu15,Nle27]hGH-RH(1-28)Agm;
[PhAc°,D-Arg2,Phe(pCl)6,Glu,Ala,Nle]hGH-RH(1-29) Nle27]hGH-RH(1-29)-NH2;
ciclo8,12;21;25[PhAc°,D- ciclo8,12;21,25[PhAc°,D-Arg2,D-Asp3,Phe(pCl)8,Gl8.25,D-
Lys12,Ala16,Nle2']hGH-RH(1-29)-NH2; ciclo812;21,25[[PhAc°,D-Arg2, Phe(pCl)6, Glu8,25, D-Lys12, Ala15, Nle2'] hGH- RH(1-29)-NH2. En los documentos de patente WO96/032126, WO96/022782, WO96/016707, WO94/011397 y WO94/011396 se proporcionan ejemplos adicionales de analogos de GHRH.
Los ejemplos de analogos de bombesina incluyen TMs que comprenden: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- NH2 (nombre codigo BIM-26218), D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2 (nombre codigo BIM-26187); D-Cpa- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-cp [CH2NH]-Phe-NH2 (nombre codigo BIM-26159), y D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-cp [CH2NH]-Cpa-NH2 (nombre codigo BIM-26189); D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-N-metil-D-Ala-His-Leu-metilester, y D-Fg-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-metilester.
Los analogos de bombesina incluyen peptidos derivados de peptidos naturales estructuralmente relacionados, a saber, bombesina, neuromedina B, neuromedina C, litorina y gRp. Las secuencias de aminoacido relevantes de dichos peptidos naturales son: Bombesina (ultimos 10 aminoacidos): Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2; Neuromedina B: Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2; Neuromedina C: Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-Met-NH2; Litorina: pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2; GRP humana (ultimos 10 aminoacidos): Gly-Asn- His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.
Los analogos incluyen los descritos en la patente de EE.UU. con numero de serie 502.438, presentada el 30 de marzo de 1990, la patente de EE.UU. con numero de serie 397.169, presentada el 21 de agosto de 1989, la patente de EE.UU. con numero de serie 376.555, presentada el 7 de julio de 1989, la patente de EE.UU. con numero de serie 394.727, presentada el 16 de agosto de 1989, la patente de EE.UU. con numero de serie 317.941, presentada el 2 de marzo de 1989, la patente de EE.UU. con numero de serie 282.328, presentada el 9 de diciembre de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 257.998, presentada el 14 de octubre de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 248.771, presentada el 23 de septiembre de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 207.759, presentada el 16 de junio de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 204.171, presentada el 8 de junio de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 173.311, presentada el 25 de marzo de 1988, la patente de EE.UU. con numero de serie 100.571, presentada el 24 de septiembre de 1987; y la patente de EE.UU. con numero de serie 520.225, presentada el 9 de mayo de 1990, la patente de EE.UU. con numero de serie 440.039, presentada el 21 de noviembre de 1989. Tambien se describen analogos de bombesina en Zachary et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 82: 7616 (1985); Heimbrook et al., "Synthetic Peptides: Approaches to Biological Problems", UCLA Symposium on Mol. and Cell. Biol. New Series, Vol. 86, ed. Tarn y Kaiser; Heinz-Erian et al. , Am. J. Physiol. G439 (1986); Martinez et al., J. Med. Chem. 28: 1874 (1985); Gargosky et al., Biochem. J. 247: 427 (1987); Dubreuil et al., Drug Design and Delivery, Vol 2: 49, Harwood Academic Publishers, GB (1987); Heikkila et al., J. Biol. Chem. 262: 16456 (1987); Caranikas et al., J. Med. Chem. 25: 1313 (1982); Saeed et al., Peptides 10: 597 (1989); Rosell et al., Trends in Pharmacological Sciences 3: 211 (1982); Lundberg et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 80: 1120, (1983); Engberg et al., Nature 293: 222 (1984); Mizrahi et al., Euro. J. Pharma. 82: 101 (1982); Leander et al., Nature 294: 467 (1981); Woll et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155: 359 (1988); Rivier et al., Biochem. 17: 1766 (1978); Cuttitta et al., Cancer Surveys 4: 707 (1985); Aumelas et al., Int. J. Peptide Res. 30: 596 (1987).
5
10
15
20
25
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35
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60
Los analogos se pueden preparar mediante tecnicas convencionales, tales como las descritas en las patentes WO92/20363 y EP0737691.
Otros analogos de bombesina adicionales comprenden: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jjsi-Tac-NH2; D-Tpi-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-£si-Tac-NH2; D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-£si-DMTac-NH2; Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-jpsi-Tac-NH2; D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2; D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe- NH2; D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2; D-Trp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2; D- Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-psi-Leu-NH2; D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-psi-Phe-NH2; D-Tpi-Gln-Trp-Ala- Val-Gly- His-Leu-psi-Trp-NH2; D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- psi-Tpi-NH2; D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; NH2CO- Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 y ACY-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 en donde ACY es acetilo, octanoilo o 3-hidroxi-2-naftoilo; D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly His-Leu-psi-Tpi-NH2; D-Trp-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val Gly-His- Leu-psi-Tpi-NH2; Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly His-Leu-psi-Tpi-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H2-D- Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Nal-Cys-Thr-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Nal-Cys-Nal-NH2; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Nal-NH2; H2-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Nal- NH2; H2-D-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-D-Cys-Nal-NH2; H2-D-Trp- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Phe-Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Nal-Lys- Val-Cys-Nal-NH2; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Nal-Cys-Thr-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Val-Cys-Nal-NH2; H2- D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH2; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Nal-NH2; H2-D-Phe-Cys-Tyr- D-Trp-Lys(diEt)-Thr-Cys-Nal-NH2 H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Ser-Cys-Thr-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH2; or H2-D-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Dab-Val-Cys-Nal-NH2, H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Val-Cys-Nal-NH2, H2-D-Nal-Cys-Tyr-D- Trp-Arg-Val-Cys-Nal-NH2; pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Met- NH2, D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Met-NH2, pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-Phe-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Phe-Met-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His- Phe-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Nle-NH2, D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Nle-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Phe-Nle-NH2, D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leuc[CH2NH]Phe-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-propilamida, Ac-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu- Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-CHx-Ala-Leu-NH2, ciclo-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu, D-Cys- Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Cys-NH2, ciclo-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met, Cys-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Cys- NH2, ciclo-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met, ciclo-D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met, ciclo-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-Met.
Otros analogos adicionales de bombesina se describen, por ejemplo, en las patentes WO89/02897, WO91/17181, WO90/03980 y WO91/02746.
Los ejemplos de analogos de grelina comprenden: Tyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, Tyr-DTrp-Lys-Trp-DPhe-NH2, His- DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Phe-DTrp-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe- Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, DeaminoTyr-DTrp-Ser- Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DTrp-Phe-Met-NH2, Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Phe- NH2, Gly^[CH2NH]-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, Gly^[CH2NH]-DbetaNal-DLyS-TrP-DPhe-Lys-NH2, DAla-
DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, His-DbetaNal-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ala-His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Alacp[CH2NH]-DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Phe-
DPhe-Nle-NH2, DciclohexilAla-Ala-Phe-DTrp-Lys-NH2, DAla-DbetaAla-Thr-DThr-Lys-NH2, DciclohexilAla-Ala-Trp- DPhe-NH2, DAla-DbetaNal-Ala-Ala-DAla-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Leu-NH2, His-DTrp-Phe-Trp-DPhe-Lys- NH2, DAla-DbetaNal-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, pAla-Trp-DAIa-DTrp-Phe-NH2, His-Trp-DAIa-DTrp-Phe-LysNH2, DLys-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, Tyr-DAla-Phe-Aib-NH2, Tyr-DAla-Sar- NMePhe-NH2, aYAbu-DTrp-DTrp-Ser-NH2, aYAbu-DTrp-DTrp-Lys-NH2, aYAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, aAbu-DTrp- DTrp-Orn-NH2, DThr-DaNal-DTrp-DPro-Arg-NH2, DAla-Ala-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ala^[CH2NH]His-DTrp-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2, Lys-DHis-DTrp-Phe-NH2, YAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, inip-Trp-Trp-Phe-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Leu- NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Lys-NH2, Ac-DTrp-DTrp-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ac-DbetaNal-Leu- Pro-NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DVal-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DLeu-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2,
CiclohexilAla-DaNal-DTrp- Phe-Arg-NH2, DTp-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DAla-DpNal-DPro-Phe-Arg-NH2, Ac-DaNal- DTrp-Phe-Arg-NH2, DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, His-DTrp-DTrp-Lys-NH2, Ac-DpNal-DTrp-NH2, aAib-DTrp-
DciclohexilAla-NH2, aAib-DTrp-DAla-ciclohexilAla-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2, DPhe-Ala- Phe-DPal-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Ac-DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Arg-DTrp-Leu-Tyr-Trp-Pro(cyclic Arg-Pro), Ac-DpNal-PicLys-ILys-DPhe-NH2, DPal-Phe-DTrp-Phe-Met-NH2, DPhe- Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, DPal-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, pAla-Pal-DTrp-DTrp-Orn-NH2, aYAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn- NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-Lys-NH2, yAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, Ava-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DLys-Tyr-DTrp- Ala-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, <Glu-His-Trp-DSer-DArg-NH2, DPhe-DPhe-DTrp-Met-DLys-NH2, 0-(2-metilalil) benzofonona oxima, (R)-2-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-1-ona, N-((R)-1-((R)-1- ((S)-3-(IH-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-ilamino)-6-amino-1-oxohexan-2-ilamino)-3-hidroxi-1- oxopropan-2-il)benzamida, (S)-N-((S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4- fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-6-acetamido-2-((S)-
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2-amino-3-(benziloxi)propanamido)hexanamida, (S)-N-((R)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4- fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)- 2-((S)-2-acetamido-3-(benziloxi)propanamido)-6-aminohexanamida, (R)-N-(3-(1 H-indol-3-il)-1-(4-(2-
metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-4-aminobutanamida, (R)-N-(3-(1 H-indol-3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin- 1-il)-1-oxopropan-2-il)-2-amino-2-metilpropanamida, metil 3-(p-tolilcarbamoil)-2-naftoato, etil 3-(4-(2- metoxifenil)piperidina-1-carbonil)-2-naftoato, 3-(2-metoxifenilcarbamoil)-2-naftoato, (S)-2,4-diamino-N-((R)-3- (naftalen-2-ilmetoxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)butanamida, naftaleno-2,3-diilbis((4-(2-
metoxifenil)piperazin-1-il)metanona), (R)-2-amino-N-(3-(benziloxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperazin-1-il)propan-2-il)-2-
metilpropanamida, o (R)-2-amino-3-(benziloxi)-1-(4-fenilpiperazin-1-il)propan-1-ona.
Los ejemplos de analogos de GnRH incluyen los conocidos de, por ejemplo, las patentes EP171477, WO96/033729, WO92/022322, WO92/013883 y WO91/05563. Ejemplos espedficos comprenden:
(NAcDQal1, DPtf2, DPAl3, cjsPzACAla5, DPicLys6, DAla10)LHRH;
NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, cjsPzACAla5, DNicLys6, ILys8, DAla10)LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, Thr4, PicLys5, DPicLys6, ILys8, DAla10)LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, PicLys5, DPicLys6, Thr7, ILys8, DAla10) LHRH;
(NapDThr1, DpClPhe2, DPal3, PicLys5, DPicLys6, ILys8, DAla10)LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, NicLys5, DNicLys6, Thr7, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, Thr4NicLys5, DNicLys6, Thr7, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, PicLys5, D(PicSar)Lys6, ILys8, DAla10) LHRH'
(NAcDNal1, DpCIPhe2, DPal3, D(PicSar)Lys6, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, PicLys5, D(6ANic)Lys6, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DpClPhe2, DPal3, PicLys5, D(6ANic)0rn6, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDQal1, DCpa2, DPal3, cisPzACAla5, DPicLys6, NLeu7, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DCpa2, DPal3 DPicLys5, DAPhe(PicSar)p, ILys8, DAla10) LHRH;
NAcDQal1, DCpa2, DPal3, PicLys5, DPal6, ILys8, DAla10) LHRH;
(NAcDNal1, DCpa2, DPal3, PicLys5, DOrn(ACyp)6, ILys8, DAla10) LHRH; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D- Lys(ciclo-pentil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-0-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclopentil)-Phe-
Lys(ciclopentil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-(isopropil)D-Lys-Pro-D-Ala- NH2; N-acety1-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe- D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(Cl-bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)- Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(t-butilmetil)-Pro-D-Ala-NH2; N- acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(4-metil-bencil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe- D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(bencil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-p-NH2-Phe- Phe-(isopropil)Lys-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Lys-(heptil)-Pro-D- Ala-NH2; N-acetil-D-3-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(1-butilpentil)-Phe-Lys(1-butilpentil)-Arg-Pro-D-Ala-NH2.
Los ejemplos de analogos de urotensina comprenden: Cpa-c [D-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys]-Val-NH2; y Asp-c[Cys- Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH.
Los polipeptidos de la presente invencion carecen de un dominio Hc funcional de una neurotoxina clostridial. Por consiguiente, dichos polipeptidos no son capaces de unirse a membranas sinaptosomales (a traves de un componente He clostridial) en ensayos de union, como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 7582. En una realizacion preferida, los polipeptidos preferiblemente carecen de los ultimos 50 aminoacidos C- terminales de una holotoxina neurotoxina clostridial. En otra realizacion, los polipeptidos preferiblemente carecen de los ultimos 100, preferiblemente de los ultimos 150, mas preferiblemente de los ultimos 200, de forma particularmente preferida de los ultimos 250, y lo mas preferiblemente de los ultimos 300 residuos de aminoacido C- terminales de una holotoxina neurotoxina clostridial. Alternativamente, la actividad de union a He se puede negar/ reducir mediante mutagenesis - a modo de ejemplo, en referencia a BoNT/ A por convenciencia, la modificacion de una o dos mutaciones de residuos de aminoacido (W1266 a L e Y1267 a F) en el bolsillo de union de gangliosido hace que la region He pierda su funcion de union a receptor. Se pueden realizar mutaciones analogas a componentes peptidicos clostridiales no de serotipo A, p.ej., una construccion basada en botulmica B con mutaciones (W1262 a L e Y1263 a F) o botulmica E (W1224 a L e Y1225 a F). Otras mutaciones en el sitio activo logran la misma ablacion de la actividad de union a receptor de He, p.ej., Y1267S en la toxina botulmica de tipo A y
el correspondiente residuo altamente conservado en las otras neurotoxinas clostridiales. Los detalles de esta y otras mutaciones se describen en Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634).
En otra realizacion, los polipeptidos de la presente invencion carecen de un dominio He funcional de una neurotoxina clostridial y tambien carecen de cualquier TM funcionalmente equivalente. Por consiguiente, dichos polipeptidos 5 carecen de la funcion de union natural de una neurotoxina clostridial y no son capaces de unirse a membranas sinaptosomales de rata (a traves de un componente He clostridial, o a traves de cualquier TM funcionalmente equivalente) en ensayos de union como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82.
El peptido He de una neurotoxina clostridial nativa comprende aproximadamente 400-440 residuos de aminoacido, y consta de dos dominios funcionalmente distintos de aproximadamente 25 kDa cada uno, a saber, la region N- 10 terminal (comunmente denominada peptido o dominio Hcn) y la region C-terminal (comunmente denominada peptido o dominio Hcc). Este hecho es confirmado en las siguientes publicaciones: Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pag. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759; y Rummel 15 A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643. Ademas, ha sido bien documentado que la region C-terminal (Hcc), que constituye los 160-200 residuos de aminoacido C-terminales, es responsable de la union de una neurotoxina clostridial a sus receptores celulares naturales, a saber, las terminales nerviosas de la union neuromuscular - este hecho tambien es confirmado en las publicaciones anteriores. De esta manera, cuando se hace referencia a lo largo de la presente especificacion a una cadena-pesada clostridial que carece de un peptido (o dominio) HC de cadena 20 pesada funcional, de tal modo que la cadena pesada es incapaz de unirse a los receptores de superficie celular a los que una neurotoxina clostridial nativa se une, significa que la cadena pesada clostridial simplemente carece de un peptido HCC funcional. En otras palabras, la region de peptido Hcc ha sido eliminada parcial o totalmente, o ha sido modificada (mediante tratamiento qmmico o proteolttico convencional) para desactivar su capacidad nativa de union a terminales nerviosas en la union neuromuscular.
25 De esta manera, en una realizacion, un peptido Hn clostridial de la presente invencion carece de una porcion de peptido C-terminal (Hcc) de una neurotoxina clostridial y por tanto carece de la funcion de union a He de la neurotoxina clostridial nativa. A modo de ejemplo, en una realizacion, el peptido Hn clostridial extendido C- terminalmente carece de los 40 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 60 residuos de aminoacido C- terminales, o de los 80 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 100 residuos de aminoacido C-terminales, o 30 de los 120 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 140 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 150 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 160 residuos de aminoacido C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. En otra realizacion, el peptido Hn clostridial de la presente invencion carece de la porcion
completa de peptido C-terminal (Hcc) de una neurotoxina clostridial y por tanto carece de la funcion de union a He de
la neurotoxina clostridial nativa. A modo de ejemplo, en una realizacion, el peptido Hn clostridial carece de los 165 35 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 170 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 175 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 180 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 185 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 190 residuos de aminoacido C-terminales, o de los 195 residuos de aminoacido C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. A modo de ejemplo adicional, el peptido Hn clostridial de la presente invencion carece de una secuencia de referencia Hcc seleccionada del grupo que consiste en:
40 Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (Y1111-L1296)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (Y1098-E1291)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (Y1112-E1291)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (Y1099-E1276)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (Y1086-K1252)
45 Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (Y1106-E1274)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (Y1106-E1297)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (Y1128-D1315).
Las secuencias de referencia identificadas antes debenan considerarse una grna, ya que se pueden producir pequenas variaciones segun los sub-serotipos.
50 La proteasa de la presente invencion es capaz de romper una o mas protemas del aparato de fusion exodtica en celulas eucarioticas.
La proteasa de la presente invencion es tal y como se define en las reivindicaciones. De forma mas preferible, la proteasa bacteriana se selecciona del genero Clostridium o Neisserial Streptococcus (p.ej., una cadena-L clostridial, o una proteasa de IgA neisserial, preferiblemente de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).
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La presente invencion tambien abarca proteasas no citotoxicas variantes (es dedr, variantes de moleculas de proteasa naturales), siempre que las proteasas variantes sigan presentando la actividad de proteasa requerida. A modo de ejemplo, una variante puede presentar al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, mas preferiblemente al menos un 90%, y lo mas preferiblemente al menos un 95% o al menos un 98% de homologfa de secuencia de aminoacidos con respecto a una secuencia de proteasa de referencia. Por tanto, el termino variante incluye proteasas no citoticas que presentan una actividad de endopeptidasa incrementada (o reducida) - se hace particular mencion aqu al aumento de Kcat/Km de los mutantes de BoNT/A Q161A, E54A y K165L, vease Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8. El termino fragmento, cuando se usa en relacion a una proteasa, tfpicamente significa un peptido que tiene al menos 150, preferiblemente al menos 200, mas preferiblemente al menos 250, y lo mas preferiblemente al menos 300 residuos de aminoacido de la proteasa de referencia. Como con el componente de “fragmento” TM (discutido anteriormente), los “fragmentos” de proteasa de la presente invencion abarcan fragmentos de proteasas variantes basadas en una secuencia de referencia.
La proteasa de la presente invencion preferiblemente presenta una actividad de serina o metaloproteasa (p.ej., actividad de endopeptidasa). La proteasa preferiblemente es espedfica para una protema SNARE (p.ej., SNAP-25, sinaptobrevina/VAMp, o sintaxina).
Se hace mencion particular a los dominios de proteasa de las neurotoxinas, por ejemplo los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. De esta manera, la presente invencion abarca el uso de dominios de neurotoxina, que existen en la naturaleza, asf como de versiones preparadas recombinantemente de dichas neurotoxinas naturales.
Los ejemplos de neurotoxinas son producidas por bacterias clostridia, y el termino neurotoxina clostridial abarca neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT), y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, asf como por las neurotoxinas de tipo BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas mencionadas anteriormente se usan a lo largo de la presente especificacion. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A denota la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). A otros serotipos de BoNT se aplica la correspondiente nomenclatura.
Las BoNTs son las toxinas mas potentes conocidas, con unos valores de dosis letal de mediana (LD50) para ratones que oscilan entre 0,5 y 5 ng/kg, dependiendo del serotipo. Las BoNTs son adsorbidas en el tracto gastrointestinal, y, despues de entrar en la circulacion general, se unen a la membrana presinaptica de las terminaciones nerviosas colinergicas y evitan la liberacion de su neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G rompen la protema de membrana asociada a vesmula (VAMP)/sinaptobrevina; BoNT/C, BoNT/A y BoNT/E rompen la protema asociada sinaptosomatica de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/C rompe la sintaxina.
Las BoNTs comparten una estructura comun, siendo protemas di-cadena de ~150 kDa, que constan de una cadena pesada (cadena-H) de ~100 kDa unida covalentemente mediante un unico enlace disulfuro a una cadena ligera (cadena-L) de ~50 kDa. La cadena-H consta de dos dominios, cada uno de ~50 kDa. El dominio C-terminal (He) es requerido para la union neuronal de alta afinidad, mientras que se propone que el dominio N-terminal (Hn) esta implicado en la traslocalizacion de membrana. La cadena-L es una metaloproteasa dependiente de cinc responsable de la ruptura de la protema SNARE sustrato.
El termino fragmento de cadena-L significa un componente de la cadena-L de una neurotoxina, fragmento que presenta actividad de metaloproteasa y que es capaz de romper proteoltticamente una protema de vesmula y/o asociada a membrana plasmatica implicada en la exocitosis celular.
Los ejemplos de secuencias de proteasa adecuadas (de referencia) incluyen:
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (1-448)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (1-440)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (1-441)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (1-445)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (1-422)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (1-439)
Neurotoxina botulfnica de tipo G - residuos de aminoacido (1-441)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (1-457)
Proteasa de IgA - residuos de aminoacido (1-959)*
* Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pag. 458-462.
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Las secuencias de referencia identificadas anteriormente debenan considerarse una gma, ya que se pueden dar pequenas variaciones segun los sub-serotipos. A modo de ejemplo, la patente US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes.
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (M1-K448)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (M1-K441)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (M1-K449)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (M1-R445)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (M1-R422)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (M1-K439)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (M1-K446)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (M1-A457)
Una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprende la cadena ligera pueden ser utiles en aspectos de la presente invencion, con la condicion de que dichos fragmentos de cadena ligera puedan atacar espedficamente los componentes de nucleo del aparato de liberacion de neurotransmisores y, de esta manera, participen en la ejecucion del mecanismo celular general mediante el cual una toxina clostridial rompe proteolfticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de las toxinas clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 420-460 aminoacidos y comprenden un dominio enzimatico. Investigaciones han demostrado que no es necesaria la longitud completa de una cadena ligera de toxina clostridial para la actividad enzimatica del dominio enzimatico. Como ejemplo no limitativo, los primeros ocho aminoacidos de la cadena ligera de BoNT/A no son requeridos para la actividad catalftica. Como ejemplo no limitativo adicional, los primeros ocho aminoacidos de la cadena ligera TeNT no son requeridos para la actividad enzimatica. Igualmente, el extremo carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como ejemplo no limitativo, los ultimos 32 aminoacidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448) no son requeridos para la actividad enzimatica. Como ejemplo no limitativo adicional, los ultimos 31 aminoacidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457) no son requeridos para la actividad enzimatica. De esta manera, los aspectos de esta realizacion pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimatico que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoacidos, al menos 375 aminoacidos, al menos 400 aminoacidos, al menos 425 aminoacidos y al menos 450 aminoacidos. Otros aspectos de esta realizacion pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimatico que tiene una longitud de, por ejemplo, como mucho 350 aminoacidos, como mucho 375 aminoacidos, como mucho 400 aminoacidos, como mucho 425 aminoacidos y como mucho 450 aminoacidos.
El componente de proteasa no citotoxico de la presente invencion comprende preferiblemente una cadena-L de serotipo BoNT/A, BoNT/B o BoNT/D (o un fragmento o variante de la misma).
Los polipeptidos de la presente invencion, especialmente su componente de proteasa, puede estar PEGilado - esto puede ayudar a incrementar la estabilidad, por ejemplo la duracion de la accion del componente de proteasa. La PEGilacion es particularmente preferida cuando la proteasa comprende una proteasa BoNT/A, B o Ci. La PEGilacion preferiblemente incluye la adicion de PEG al extremo N del componente de proteasa. A modo de ejemplo, el extremo N puede extenderse con uno o mas residuos de aminoacido (p.ej., cistema), que pueden ser iguales o diferentes. Uno o mas de dichos residuos de aminoacido pueden tener su propia molecula de PEG unida (p.ej., unida covalentemente). En la patente WO2007/104567 se describe un ejemplo de esta tecnologfa.
Un Dominio de Traslocalizacion es una molecula que permite la traslocalizacion de una proteasa en una celula diana de tal modo que se produzca una expresion funcional de la actividad de proteasa dentro del citosol de la celula diana. El hecho de que una molecula dada (p.ej., una protema o peptido) posea la funcion de traslocalizacion requerida de la presente invencion puede confirmarse mediante uno cualquiera de una serie de ensayos convencionales. Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que son expuestos a una molecula de ensayo. La presencia de la funcion de traslocalizacion requerida es confirmada por la liberacion desde los liposomas de K+ y/ o de NAD marcado, que pueden ser monitorizados facilmente [vease Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pag. 175-180].
Un ejemplo adicional es el proporcionado por Blaustein R. (1987), que describe un ensayo in vitro sencillo que emplea membranas bicapa de fosfolfpidos planos. Las membranas son expuestas a una molecula de ensayo y la funcion de traslocalizacion requerida es confirmada por un incremento de la conductancia a traves de dichas membranas [vease Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pag. 115-120].
Otras metodologfas adicionales que permiten la determinacion de la fusion de membrana, y por tanto la identificacion de Dominios de Traslocalizacion adecuados para su uso en la presente invencion, son las
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proporcionadas en “Methods in Enzymology” vol. 220 y 221, “Membrane Fusion Techniques”, Partes A y B, Academic Press 1993.
La presente invencion tambien abarca dominios de traslocalizacion variantes, siempre que los dominios variantes sigan presentando la actividad de traslocalizacion requerida. A modo de ejemplo, una variante puede tener una homolog^a de secuencia de aminoacidos de al menos un 70%, preferiblemente de al menos un 80%, mas preferiblemente de al menos un 90%, y lo mas preferiblemente de al menos un 95% o al menos un 98% con respecto a un dominio de traslocalizacion de referencia. El termino fragmento, cuando se emplea en relacion a un dominio de traslocalizacion, significa un peptido que tiene al menos 20, preferiblemente al menos 40, mas preferiblemente al menos 80, y lo mas preferiblemente al menos 100 residuos de aminoacido del dominio de traslocalizacion de referencia. En el caso de un dominio de traslocalizacion clostridial, el fragmento preferiblemente presente la menos 100, preferiblemente al menos 150, mas preferiblemente al menos 200, y lo mas preferiblemente al menos 250 residuos de aminoacido del dominio de traslocalizacion de referencia (p.ej., dominio Hn). Como con el componente de “fragmento” de TM (discutido anteriormente), los “fragmentos” de traslocalizacion de la presente invencion abarcan fragmentos de dominios de traslocalizacion variantes basados en secuencias de referencia.
El Dominio de Traslocalizacion preferiblemente es capaz de formar poros permeables a iones en membranas lipfdicas en condiciones de bajo pH. Se ha observado que es preferible usar solo las porciones de la molecula de protema capaces de formar poros en la membrana endosomal.
El Dominio de Traslocalizacion puede obtenerse a partir de una fuente de protemas microbiana, en particular de una fuente de protemas bacteriana o vmca. Por lo tanto, en una realizacion, el Dominio de Traslocalizacion es un domino traslocalizador de una enzima, tal como una toxina bacteriana o una protema vmca.
Esta bien documentado que determinados dominios de moleculas de toxinas bacterianas son capaces de formar poros de ese tipo. Tambien es sabido que determinados dominios de traslocalizacion de protemas de fusion de membrana expresadas vmcamente son capaces de formar poros de ese tipo. Dichos dominios pueden emplearse en la presente invencion.
El Dominio de Traslocalizacion puede ser de origen clostridial, tal como el dominio Hn (o un componente funcional del mismo). Hn significa una porcion o fragmento de la cadena-H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena-H, o el dominio correspondiente a dicho fragmento en la cadena- H intacta. La cadena-H carece de la funcion de union natural del componente He de la cadena-H. En este aspecto, la funcion He puede eliminarse mediante la eliminacion de la secuencia de aminoacidos He (tanto a nivel de smtesis de ADN, como a nivel post-smtesis mediante tratamiento con nucleasa o proteasa). Alternativamente, la funcion He puede desactivarse mediante tratamiento qmmico o biologico. De esta manera, la cadena-H es incapaz de unirse al Sitio de Union de una celula diana al cual se une una neurotoxina clostridial nativa (es decir, una holotoxina).
Los ejemplos de Dominios de Traslocalizacion adecuados (de referencia) incluyen:
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (449-871)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (441-858)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (442-866)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (446-862)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (423-845)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (440-864)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (442-863)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (458-879)
Las secuencias de referencia identificadas anteriormente debenan considerarse una grna, ya que se pueden dar pequenas variaciones segun los sub-serotipos. A modo de ejemplo, la patente US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes.
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (A449-K871)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (A442-S858)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (T450-N866)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (D446-N862)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (K423-K845)
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Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (A440-K864)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (S447-S863)
Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (S458-V879)
En el contexto de la presente invencion, pueden ser utiles una serie de regiones HN de toxina clostridial que comprenden un dominio de traslocalizacion en aspectos de la presente invencion, siempre que dichos fragmentos activos puedan facilitar la liberacion de una proteasa no citotoxica (p.ej., una cadena-L clostridial) a partir de vesmulas intracelulares en el citoplasma de la celula diana y de esta manera participan en la ejecucion del mecanismo celular general mediante el cual una toxina clostridial rompe proteolfflcamente un sustrato. Las regiones Hn de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 410-430 aminoacidos y comprenden un dominio de traslocalizacion. Las investigaciones han demostrado que no es necesaria la longitud completa de una region Hn de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de traslocalizacion del dominio de traslocalizacion. Por tanto, los aspectos de esta realizacion pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de traslocalizacion que tiene una longitud, por ejemplo, de al menos 350 aminoacidos, al menos 350 aminoacidos, al menos 375 aminoacidos, al menos 400 aminoacidos y al menos 425 aminoacidos. Otros aspectos de esta realizacion pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de traslocalizacion que tiene una longitud, por ejemplo, de como mucho 350 aminoacidos, como mucho 375 aminoacidos, como mucho 400 aminoacidos y como mucho 425 aminoacidos.
Para mas detalles a nivel genetico de la produccion de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, hacemos referencia a Henderson et al (1997) en “The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis”, Academic press.
El termino Hn abarca porciones Hn de neurotoxina naturales, y porciones Hn modificadas que presentan secuencias de aminoacidos que no se dan en la naturaleza y/o residuos de aminoacidos sinteticos, siempre que las porciones Hn modificadas sigan presentando la funcion de traslocalizacion mencionada anteriormente.
Alternativamente, el Dominio de Traslocalizacion puede tener un origen no clostridial. Los ejemplos de ongenes de Dominio de Traslocalizacion no clostridial (de referencia) incluyen, aunque sin limitacion, el dominio de traslocalizacion de la toxina de la difteria [O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pag. 25-51], el dominio de traslocalizacion de la exotoxina de Pseudomonas de tipo A [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 35553559], los dominios de traslocalizacion de la toxina del antrax [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], una variedad de peptidos fusogenicos o hidrofobicos de funcion traslocalizante [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; y Wagner et al (1992) PNAS, 89, pag. 7934-7938], y peptidos anfifflicos [Murata et al (1992) Biochem., 31, pag.1986-1992]. El Dominio de Traslocalizacion puede ser una imagen especular del Dominio de Traslocalizacion presente en una protema natural, o puede incluir variaciones de aminoacidos, siempre que las variaciones no destruyan la capacidad de traslocalizacion del Dominio de Traslocalizacion.
Los ejemplos particulares de Dominios de Traslocalizacion vmcos (de referencia) adecuados para su uso en la presente invencion incluyen determinados dominios de traslocalizacion de protemas de fusion de membrana expresadas vmcamente. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murata et al. (1992) describen la funcion de traslocalizacion (es decir la fusion de membrana y la vesiculacion) de una serie de peptidos fusogenicos y anfifflicos de la region N-terminal de la hemaglutinina del virus de la gripe. Otras protemas de fusion de membrana expresadas vmcamente que se sabe que poseen la actividad traslocalizadora deseada son un dominio traslocalizador de un peptido fusogenico del virus del bosque Semliki (SFV), un dominio traslocalizador de la glicoprotema G del virus de estomatitis vesicular (VSV), un dominio traslocalizador de la protema F del virus SER y un dominio traslocalizador de la glicoprotema de envoltura del virus Foamy. Las protemas Aspike codificadas vmcamente encuentran aplicacion particular en el contexto de la presente invencion, por ejemplo, la protema E1 del SFV y la protema G del VSV.
El uso de los Dominios de Traslocalizacion (de referencia) presentados en la Tabla (a continuacion) incluye el uso de sus variantes de secuencia. Una variante puede comprender una o mas sustituciones conservativas de acido nucleico y/ o eliminaciones o inserciones de acido nucleico, siempre que la variante posea la funcion de traslocalizacion requerida. Una variante tambien puede comprender una o mas sustituciones de aminoacidos y/ o eliminaciones o inserciones de aminoacidos, siempre que la variante posea la funcion de traslocalizacion requerida.
Fuente de Dominio de Traslocalizacion
Residuos de aminoacido Referencias
Toxina de la difteria
194-380 Silverman et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532
London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
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Fuente de Dominio de Traslocalizacion
Residuos de aminoacido Referencias
Dominio II de pseudomonas
405-613 Prior et al., 1992, Biochemistry 31, 35553559
Exotoxina
Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
Hemaglutinina de virus de la gripe
GLFGAIAGFIENGWE GMIDGWYG, y sus variantes Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924
Wagner et al., 1992, PNAS, 89, 79347938
Murata et al., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992
Protema fusogenica de virus del bosque Semliki
Dominio de traslocalizacion Kielian et al., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
Glicoprotema G del virus de estomatitis vesicular
118-139 Yao et al., 2003, Virology 310(2), 319332
Protema F de virus SER
Dominio de traslocalizacion Seth et al., 2003, J Virol 77(11) 65206527
Glicoprotema de envoltura de virus Foamy
Dominio de traslocalizacion Picard-Maureau et al., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
Los polipeptidos de la presente invencion pueden comprender adicionalmente un dominio que facilite la traslocalizacion. Dicho dominio facilita la administracion de la proteasa no citotoxica al citosol de la celula diana y se describe, por ejemplo, en las patentes WO 08/008803 y WO 08/008805.
A modo de ejemplo, los dominios facilitadores de traslocalizacion adecuados incluyen un dominio de peptido fusogenico de virus de envoltura, por ejemplo, los dominios de peptido fusogenico adecuados incluyen el dominio de peptido fusogenico de virus de la gripe (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus de la gripe de 23 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de alfavirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus del bosque Semliki de 26 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de vesiculovirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus de estomatitis vesicular de 21 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de respirovirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus Sendai de 25 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de morbilivirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus del moquillo canino de 25 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de avulavirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus de enfermedad de Newcastle de 25 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de henipavirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de virus Hendra de 25 aminoacidos), el dominio de peptido fusogenico de metapneumovirus (p.ej., el dominio de peptido fusogenico de metapneumovirus humano de 25 aminoacidos) o un dominio de peptido fusogenico de espumavirus, tal como el dominio de peptido fusogenico de virus foamy de simio; o fragmentos o variantes de los mismos.
A modo de ejemplo adicional, un dominio facilitador de traslocalizacion puede comprender un dominio Hcn de toxina clostridial o un fragmento o variante del mismo. Mas detalladamente, un dominio facilitador de traslocalizacion Hcn de toxina clostridial puede tener una longitud de al menos 200 aminoacidos, al menos 225 aminoacidos, al menos 250 aminoacidos, al menos 275 aminoacidos. En este aspecto, un dominio facilitador de traslocalizacion Hcn de toxina clostridial tiene una longitud de como mucho 200 aminoacidos, como mucho 225 aminoacidos, como mucho 250 aminoacidos, o como mucho 275 aminoacidos. Los ejemplos espedficos (de referencia) incluyen:
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (872-1110)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (859-1097)
Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (867-1111)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (863-1098)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (846-1085)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (865-1105)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (864-1105)
5 Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (880-1127)
Las posiciones de secuencia anteriores pueden variar ligeramente segun el serotipo/ subtipo, y ejemplos adiciones de dominios Hcn de toxina clostridial adecuados (de referencia) incluyen:
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (874-1110)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (861-1097)
10 Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (869-1111)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (865-1098)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (848-1085)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (867-1105)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (866-1105)
15 Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (882-1127)
Cualquiera de los dominios facilitadores descritos anteriormente puede combinarse con cualquiera de los peptidos de dominio de traslocalizacion descritos previamente que sean adecuados para uso en la presente invencion. De este manera, a modo de ejemplo, un dominio facilitador no clostridial puede combinarse con un peptido de dominio de traslocalizacion no clostridial o con un peptido de dominio de traslocalizacion clostridial. Alternativamente, un 20 dominio facilitador de traslocalizacion HCN de toxina clostridial puede combinarse con un peptido de dominio de traslocalizacion no clostridial. Alternativamente, un dominio facilitador HCN de toxina clostridial puede combinarse con un peptido de dominio de traslocalizacion clostridial, los ejemplos de los cuales incluyen:
Neurotoxina botulmica de tipo A - residuos de aminoacido (449-1110)
Neurotoxina botulmica de tipo B - residuos de aminoacido (442-1097)
25 Neurotoxina botulmica de tipo C - residuos de aminoacido (450-1111)
Neurotoxina botulmica de tipo D - residuos de aminoacido (446-1098)
Neurotoxina botulmica de tipo E - residuos de aminoacido (423-1085)
Neurotoxina botulmica de tipo F - residuos de aminoacido (440-1105)
Neurotoxina botulmica de tipo G - residuos de aminoacido (447-1105)
30 Neurotoxina del tetanos - residuos de aminoacido (458-1127)
Homologfa de secuencia:
Se puede usar cualquiera de una variedad de metodos de alineamiento de secuencia para determinar el porcentaje de identidad, que incluye, sin limitacion, metodos globales, metodos locales y metodos hforidos, tales como, p.ej., metodos de estrategia de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos 35 de rutina al alcance del especialista en la tecnica. Los metodos globales alinean secuencias desde el principio hasta el final de la molecula y determinan el mejor alineamiento sumando puntuaciones de pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones de hueco. Los ejemplos no limitativos incluyen, p.ej., CLUSTAL W, vease, p.ej., Julie D. Thompson et al., “CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice”, 22(22) Nucleic Acids Research 40 4673-4680 (1994); y el refinado iterativo, vease, p.ej., Osamu Gotoh, “Significant Improvement in Accuracy of
Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments”, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los metodos locales alinean secuencias identificando una o mas estructuras conservadas compartidas por todas las secuencias de entrada. Los metodos no limitativos incluyen, p.ej., el de Match-box, vease, p.ej., Eric Depiereux y Ernest Feytmans, “Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the 45 Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences”, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); el muestreo de Gibbs, vease, p.ej., C. E. Lawrence et al., “Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple
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Alignment”, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, vease, p.ej., Ivo Van Walle et al., “Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences”, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
Por tanto, el porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante metodos convencionales. Vease, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992. Resumidamente, se alinean dos secuencias de aminoacido para optimizar las puntuaciones de alineamiento usando una penalizacion de apertura de hueco de 10, una penalizacion de extension de hueco de 1, y la matriz de puntuacion “blosum 62” de Henikoff y Henikoff (ver anterior) como se indica a continuacion (los aminoacidos se indican mediante los codigos estandar de una letra).
Puntuaciones de alineacion para determinar la identidad de secuencia
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R-1 5
N-2 0 6
D-2-2 1 6
C 0-3-3-3 9
Q-1 1 0 0-3 5
E-1 0 0 2-4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0-2-3-2 1 2-1 5
F-2-3-3-3-2-3-3-3-1 0 0-3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4-3-211
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3-3-2-2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
El porcentaje de identidad se calcula entonces como:
Numero total de coincidencias identicas
x100
[longitud de la secuencia mas larga mas el numero de huecos introducidos en la secuencia mas larga con el fin de alinear la dos secuencias]
Los polipeptidos sustancialmente homologos se caracterizan por tener una o mas sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos. Estos cambios preferiblemente son de naturaleza menor, que son sustituciones de aminoacido conservativas (ver mas adelante) y otras sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad del polipeptido, pequenas eliminaciones, tipicamente de uno hasta aproximadamente 30
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aminoacidos; y pequenas extensiones amino- o carboxi-terminales, tales como un residuo de metionina amino- terminal, un peptido ligando pequeno de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad.
Sustituciones de aminoacidos conservativas
Basico:
Acido:
Polar:
Hidrofobico:
Aromatico:
Pequeno:
arginina
lisina
histidina
acido glutamico
acido aspartico
glutamina
asparagina
leucina
isoleucina
valina
fenilalanina
triptofano
tirosina
glicina
alanina
serina
treonina
metionina
Ademas de los 20 aminoacidos estandar, se pueden sustituir aminoacidos no estandar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, acido 2-aminoisobutmco, isovalina y a-metil serina) por residuos de aminoacido de los polipeptidos de la presente invencion. Un numero limitado de aminoacidos no conservativos, aminoacidos que no son codificados por el codigo genetico, y aminoacidos no naturales pueden ser sustituidos por residuos de aminoacido de polipeptido clostridial. Los polipeptidos de la presente invencion tambien pueden comprender residuos de aminoacido no naturales.
Los aminoacidos no naturales incluyen, sin limitacion, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alotreonina, metil-treonina, hidroxi-etilcistema, hidroetilhomo-cistema, nitro- glutamina, homoglutamina, acido pipecolico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4-azafenil- alanina y 4-fluorofenilalanina. En la tecnica se conocen varios metodos para incorporar residuos de aminoacido no naturales a protemas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro cuando se suprimen mutaciones sin sentido usando tARNs supresores aminoacilados qmmicamente. Los metodos para sintetizar aminoacidos y tARN aminoacilante son conocidos en la tecnica. La transcripcion y la traduccion de plasmidos que contienen mutaciones sin sentido se llevan a cabo en un sistema libre de celulas que comprende extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las protemas se purifican mediante cromatograffa. Vease, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). En un segundo metodo, la traduccion se lleva a cabo en Xenopus oocytes mediante microinyeccion de ARNm mutado y tARNs supresores aminoacilados qmmicamente (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). En un tercer metodo, se cultivan celulas de E. coli en ausencia de un aminoacido natural que va a ser reemplazado (p.ej., fenilalanina) y en presencia de el(los) aminoacido(s) no natural(es) deseado(s) (p.ej., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4- fluorofenilalanina). El aminoacido no natural se incorpora al polipeptido en lugar de su contrapartida natural. Vease, Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Los residuos de aminoacido naturales pueden convertirse en especies que existen de forma natural mediante modificacion qmmica in vitro. La modificacion qmmica se puede combinar con mutagenesis sito-dirigida para expandir aun mas el rango de sustituciones (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395403, 1993).
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Un numero limitado de aminoacidos no conservativos, aminoacidos que no son codificados por el codigo genetico, aminoacidos que no existen en la naturaleza, y aminoacidos no naturales pueden ser sustituidos por residuos de aminoacido de los polipeptidos de la presente invencion.
Los aminoacidos esenciales de los polipeptidos de la presente invencion se pueden identificar de acuerdo a procedimientos conocidos en la tecnica, tal como la mutagenesis sito-dirigida o la mutagenesis de escaneo de alanina (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Los sitios de interaccion biologica tambien se pueden determinar mediante analisis ffsico de la estructura, como se ha determinado mediante tecnicas tales como resonancia magnetica nuclear, cristalograffa, difraccion de electrones o marcado de fotoafinidad, en combinacion con mutacion de los aminoacidos del sitio de contacto putativo. Vease, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 30612, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de los aminoacidos esenciales tambien se pueden deducir a partir del analisis de las homologfas con componentes relacionados (p.ej., la traslocalizacion de componentes de proteasa) de los polipeptidos de la presente invencion.
Se pueden realizar multiples sustituciones de aminoacidos y se pueden evaluar usando metodos conocidos de mutagenesis y escrutinio, tales como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o por Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Resumidamente, estos autores describen metodos para aleatorizar simultaneamente dos o mas posiciones de un polipeptido, hacer una seleccion de polipeptido funcional, y a continuacion secuenciar los polipeptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posicion. Otros metodos que pueden usarse incluyen la presentacion de fagos (p.ej., Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE.UU. n° 5.223.409; Huse, WIPO Publicacion WO 92/06204) y la mutagenesis dirigida a region (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Se pueden realizar multiples sustituciones de aminoacidos y se pueden evaluar usando metodos conocidos de mutagenesis y escrutinio, tales como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o por Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Resumidamente, estos autores describen metodos para aleatorizar simultaneamente dos o mas posiciones de un polipeptido, hacer una seleccion de polipeptido funcional, y a continuacion secuenciar los polipeptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posicion. Otros metodos que pueden usarse incluyen la presentacion de fagos (p.ej., Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE.UU. n° 5.223.409; Huse, WIPO Publicacion WO 92/06204) y la mutagenesis dirigida a region (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Figura 1 - Purificacion de proteina de la fusion LHn/D-CT-CST28
Usando la metodologfa descrita en el Ejemplo 5, se purifico una proteina de fusion LHn/D-CT-CST28 a partir de celulas de E. coli BL21 (DE3). Resumidamente, los productos solubles obtenidos despues de una disrupcion celular fueron aplicados a una columna de captura por afinidad cargada de mquel. Las protemas retenidas fueron elrndas con imidazol 200 mM, tratadas con enteroquinasa para activar la proteina de fusion y a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada de mquel. Las muestras del procedimiento de purificacion fueron analizadas mediante SDS-PAGE. Calle 1: eluente de la primera columna de Sepharose quelante de mquel, Calle 2: eluente de la segunda columna de Sepharose quelante de mquel, Calle 3: eluente de la segunda columna de Sepharose quelante de mquel en condiciones reductoras, Calle 4: marcadores de masa molecular (kDa).
Figura 2 - Purificacion de la proteina de fusion LHNA-CT-SST14
Usando la metodologfa descrita en el Ejemplo 6, se purifico una proteina de fusion LHn/A-CT-SST14 a partir de celulas de E. coli BL21 (DE3). Resumidamente, los productos solubles obtenidos despues de una disrupcion celular fueron aplicados a una columna de captura por afinidad cargada de mquel. Las protemas retenidas fueron elrndas con imidazol 200 mM, tratadas con Factor Xa para activar la proteina de fusion y a continuacion se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada de mquel. Las muestras del procedimiento de purificacion fueron analizadas mediante SDS-PAGE. Calle 1: eluente de la primera columna de Sepharose quelante de mquel, Calle 2: Marcadores de masa molecular (kDa), Calles 3-4: eluente de la segunda columna de Sepharose quelante de mquel en condiciones no reductoras, Calles 5-6: eluente de la segunda columna de Sepharose quelante de mquel en condiciones reductoras.
Figura 3 - Actividad de SST-LHn/A en celulas endocrinas cultivadas (AtT20)
La Figura 3a muestra la inhibicion de la secrecion de ACTH por SST-LHn/A, y la Figura 3b muestra la correspondiente ruptura de SNAP-25 por SST-LHN/A.
Figura 4 - Actividad de SST-LHn/D en celulas endocrinas cultivadas (GH3)
La Figura 4 muestra el efecto de la liberacion de hormona del crecimiento desde celulas GH3. Mayores dosis de administracion de SST-LHn/D dan como resultado una mayor inhibicion de la liberacion de hormona del crecimiento.
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Figura 5 - Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
La Figura 5 muestra los efectos de la administracion i.v. de CP-GHRH-LHD (SXN101000) sobre los niveles de IGF-1 de rata 5 dfas despues del tratamiento, en comparacion con un control solo de vehmulo.
Figura 6 - Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
La Figura 6 muestra los efectos de la administracion i.v. de CP-GHRH-LHD (SXN101000) sobre los niveles de IGF-1 de rata desde el dfa 1 hasta 8 dfas despues del tratamiento en comparacion con un control solo de vehmulo. Debido al bloqueo de la canula en los dfas 9 y 10 se tuvo un numero n demasiado pequeno para ser considerado.
Figura 7 - Actividad de CP-GHRH-LHD sobre los niveles de hormona de crecimiento de rata in vivo
La Figura 7b muestra los efectos de la administracion i.v. de CP-GHRH-LHD (SXN101000) sobre los niveles de hormona de crecimiento de rata 5 dfas despues del tratamiento en comparacion con el control solo de vehmulo (Figura 7a) y con infusion de octreotide (Figura 7c).
SEQ ID NOs
1. Secuencia de ADN de LHn/A
2. Secuencia de ADN de LHn/B
3. Secuencia de ADN de LHn/C
4. Secuencia de ADN de LHn/D
5. Secuencia de ADN del ligando CP-EN-GS15-SST28 humano
6. Secuencia de ADN del ligando CT-GS20-CST28 humano
7. Secuencia de protema de la fusion CP-CST14-GS20-LHD
8. Secuencia de protema de la fusion CP-CST14-GS30-LHD
9. Secuencia de protema de la fusion CP-CST28-GS20-LHD
10. Secuencia de protema de la fusion CP-CST28-GS30-LHD
11. Secuencia de protema de la fusion CP-SST14-GS20-LHD
12. Secuencia de protema de la fusion CP-SST14-GS30-LHD
13. Secuencia de protema de la fusion CP-SST28-GS20-LHD
14. Secuencia de protema de la fusion CP-SST28-GS30-LHD
15. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS20-LHD
16. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS30-LHD
17. Secuencia de ADN de la fusion CT-CST28-GS20-LHD
18. Secuencia de protema de la fusion CT-CST28-GS20-LHD
19. Secuencia de protema de la fusion CT-CST28-GS30-LHD
20. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS15-L(#Fxa)HD
21. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS30-LHD
22. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS20-LHD
23. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS30-LHD
24. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS35-LHC
25. Secuencia de ADN de la fusion CP-GS15-SST28-LHA
26. Secuencia de protema de la fusion CP-GS15-SST28-LHA
27. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS15-LHB
5
10
15
20
25
30
35
28. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS20-LHC
29. Secuencia de protema de la fusion CT-CST17-GS25-LHC
30. Secuencia de protema de la fusion CT-CST29-GS15-LHA
31. Secuencia de protema de la fusion CT-CST29-GS30-LHB
32. Secuencia de ADN de IgA-HNtet
33. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRP-LHC
34. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRH-LHD
35. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRP-LHD
36. Secuencia de protema de la fusion CT-grelina-LHA
37. Secuencia de protema de la fusion IgA-HNtet-CT-SST14
38. Secuencia de protema de la fusion IgA-HNtet-CT-GHRP
39. Secuencia de protema de la fusion CT-grelina S3W-LHA
40. Secuencia de protema de la fusion CT-GRP-LHD
41. Secuencia de protema de la fusion CT-GRP-LHB
42. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH29-LHD
43. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHA
44. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHC
45. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD
46. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD N10-PL5
47. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD N10-HX12
48. Secuencia de protema de la fusion CP-UTS-LHA
49. Secuencia de protema de LHn/A
50. Secuencia de protema de LHn/B
51. Secuencia de protema de LHn/C
52. Secuencia de protema de LHn/D
53. Secuencia de protema de IgA-HNtet
54. Peptido Octreotide sintetizado
55. Peptido agonista GHRH sintetizado
56. Peptido antagonista GHRH sintetizado
57. Secuencia de protema de la fusion CP-MCH-LHD
58. Secuencia de protema de la fusion CT-KISS-LHD
59. Secuencia de protema de la fusion CT-PrRP-LHA
60. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-27-LHD
61. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-28-LHD
62. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-29-LHD
63. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-44-LHD
64. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-40-LHD
5
10
15
20
25
30
35
65.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ Ala9-LHD
CD CD
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ Ala22-LHD
CD
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Lys11_1-29-LHD
00 CD
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Lys11_Arg12_1-29-LHD
69.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH Ala8 Asn11_1-29-LHD
70.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Lys20_1-29-LHD
71.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Lys11_Lys20_1-29-LHD
72.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Asn20_1-29-LHD
73.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Asn12_1-29-LHD
74.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Asn21_1-29-LHD
75.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Glu_7 _1-29-LHD
CD
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Glu_10_1-29LHD
77.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Glu_13_1-29-LHD
0°
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ Ala8-LHD
79.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Glu8_1-29-LHD
00 o
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala15_1-27-LHD
81.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala15-LHD
oi 00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_Ala15_1-29-LHD
cd 00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_9_15_22_27-LHD
00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _Ala8_9_15_22-LHD
id 00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _HVQAL_1-32-LHD
CD 00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _HVSAL_1-29-LHD
00
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _HVTAL_1-29-LHD
00 CO
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ _QALN-LHD
89.
Secuencia de protema de la fusion CP-HS_ GHRH_ QAL-LHD
CD o
Secuencia de protema de la fusion CP-hGHRH29 N8A M27L-LHD
91.
Secuencia de protema de la fusion CP-hGHRH29 N8A K12N M27L-LHD
92.
Secuencia de protema de la fusion N-terminal-hGHRH29 N8A M27L-LHD
93.
Secuencia de protema de la fusion GnRH-C humana
CD 4^
Secuencia de protema de la fusion GnRH - D GS 20 humana
Sumario de ejemplos
Ejemplo 1 Preparacion de una construccion de cadena principal de LHA Ejemplo 2 Construccion de LHA-CP-SST28
Ejemplo 3 Expresion y purificacion de una protema de fusion LHA-CP-SST28 Ejemplo 4 Construccion de LHD-CT-CST28
Ejemplo 5 Expresion y purificacion de una protema de fusion LHD-CT-CST28 Ejemplo 6 Conjugacion qmmica de LHn/A aTM de SST
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 7 Actividad de SST-LHA en celulas neuroendocrinas cultivadas (AtT20)
Ejemplo 8 Actividad de SST-LHD en celulas neuroendocrinas cultivadas (GH3)
Ejemplo 9 Metodo para aliviar smtomas acromegalicos reduciendo los niveles elevados de GH e IGF-1 consecuencia de un adenoma pituitario
Ejemplo 10 Metodo para normalizar dedos hirsutos hinchados reduciendo los niveles elevados de GH e IGF-1 consecuencia de un adenoma pituitario
Ejemplo 11 Metodo para aliviar las consecuencias de un adenoma pituitario secretor de hormona de crecimiento re- emergente
Ejemplo 12 Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina
Ejemplo 13 Metodo para tratar la enfermedad de Cushing en pacientes intolerantes a analogos de somatostatina
Ejemplo 14 Metodo para revertir la impotencia sexual femenina a traves del tratamiento de prolactinoma
Ejemplo 15 Metodo para recuperar la perdida de peso a traves del tratamiento de insulinoma
Ejemplo 16 Metodo para tratar el glucagonoma
Ejemplo 17 Metodo para tratar la diarrea y el rubor producido por el VIPoma Ejemplo 18 Metodo para tratar el gastrinoma
Ejemplo 19 Metodo para tratar la tirotoxicosis producida por un tirotrofinoma
Ejemplo 20 Metodo para tratar el hinchamiento recurrente de tejidos blandos producido por la acromegalia
Ejemplo 21 Metodo para tratar el hirsutismo facial excesivo producido por la enfermedad de Cushing
Ejemplo 22 Metodo para tratar la galactorrea masculina producida por el prolactinoma
Ejemplo 23 Metodo para tratar smtomas multiples producidos por el insulinoma
Ejemplo 24 Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina
Ejemplo 25 Metodo para tratar la enfermedad de Cushing en pacientes intolerantes a analogos de somatostatina
Ejemplo 26 Metodo para revertir la impotencia sexual femenina a traves del tratamiento del prolactinoma
Ejemplo 27 Metodo para tratar la enfermedad de Cushing
Ejemplo 28 Metodo para tratar el gastrinoma
Ejemplo 29 Metodo para aliviar los smtomas acromegalicos reduciendo los niveles elevados de GH e IGF-1 resultantes de un adenoma pituitario
Ejemplo 30 Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina Ejemplo 31 Metodo para tratar la acromegalia
Ejemplo 32 Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
Ejemplo 33 Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
Ejemplo 34 Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de hormona de crecimiento de rata in vivo
SEQ IDs
1. Secuencia de ADN de LHn/A
ggatCOATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAACGGTGTTGACATTGCTTAC
ATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGCCGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTT
ATCCCGGAACGTGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAG
GTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACCGATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGT
GTTACTAAACTGTTCGAGCGTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCGC
GGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATCGATACCGAACTGAAAGTAATCGACACTAACTGCATCAAC
GTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTTCCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGAT
ATCATCCAGTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAACGGCTACGGTTCC
ACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCTTCGGTTTTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAAC
CCACTGCTGGGCGCTGGTAAATTCGCAACTGATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACTGATTCATGCA
GGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTTCAAAGTTAACACCAACGCGTATTAC
GAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAACTGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATC
GACTCTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGATATCGCATCCACCCTG
AACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACTGCTTCTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAA
TACCTGCTCAGCGAAGACACCTCCGGCAAATTCTCTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTTTACAAA
ATGCTGACTGAAATTTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTTTAAAGTTCTGAACCGCAAAACCTAT
CTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTATCTACGATGGT
TTCAACCTGCGTAACACCAACCTGGCTGCTAATTTTAACGGCCAGAACACGGAAATCAACAACATGAAC
TTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGTTTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACGGCATCATT
ACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGTGTATCAAGGTTAAC
AACTGGGATTTATTCTTCAGCCCGAGTGAAGACAACTTCACCAACGACCTGAACAAAGGTGAAGAAATC
ACCTCAGAIACTAACATCGAAGCAGCCGAAGAAAACATCTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTG
ACCTTTAATTTCGACAACGAGCCGGAAAACATTTCTATCGAAAACCTGAGCTCTGATATCATCGGCCAG
CTGGAACTGATGCCGAACATCGAACGTTTCCCAAACGGTAAAAAGTACGAGCTGGACAAATATACCATG
TTCCACTACCTGCGCGCGCAGGAATTTGAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGTTAAC
GAAGCTCTGCTCAACCCGTCCCGTGTATACACCTTCTTCTCTAGCGACTACGTGAAAAAGGTCAACAAA
GCGACTGAAGCTGCAATGTTCTTGGGTTGGGTTGAACAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCC
GAAGTATCTACTACCGACAAAATTGCGGArATCACTATCATCATCCCGTACATCGGTCCGGCTCTGAAC
ATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGACTTCGTTGGCGCACTGATCTTCTCCGGTGCGGTGATCCTGCTG
GAGTTCATCCCGGAAATCGCCATCCCGGTACTGGGCACCTTTGCTCTGGTTTCTTACATTGCAAACAAG
GTTCTGACTGTACAAACCATCGACAACGCGCTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTTTACAAA
TATATCGTGACCAACTGGCTGGCTAAGGTTAATACTCAGATCGACCrCATCCGCAAAAAAATGAAAGAA
GCACTGGAAAACCAGGCGGAAGCTACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACAACCAGTACACCGAGGAA
GAAAAAAACAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCTCTAAACTGAACGAATCCATCAACAAAGCT
ATGATCAACATCAACAAGTTCCTGAACCAGTGCTCTGTAAGCTATCTGATGAACTCCATGATCCCGTAC
GGTGTTAAACGTCTGGAGGACTTCGATGCGTCTCTGAAAGACGCCCTGCTGAAATACArTTACGACAAC
CGTGGCACTCTGATCGGTCAGGTTGATCGTCTGAAGGACAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATC
CCTTTTCAGCTCAGTAAATATGTCGATAACCAACGCCTTTTGTCCACTtaataagctt
2. Secuencia de ADN de LHn/B
GGATCCATGCCGGTTACCATCAACAACTTCAACTACAACGACCCGATCGACAACAACAACATCATTATG
ATGGAACCGCCGTTCGCACGTGGTACCGGACGTTACTACAAGGCTTTTAAGATCACCGACCGTATCTGG
ATCArCCCGGAACGTTACACCTTCGGTTACAAACCTGAGGACTTCAACAAGAGTAGCGGGATTTTCAAT
CGTGACGTCTGCGAGTACTATGATCCAGATTATCTGAATACCAACGATAAGAAGAACATATTCCTTCAG
ACTArGATTAAACTCTTCAACCGTATCAAAAGCAAACCGCTCGGTGAAAAACTCCTCGAAATGATTATC
AACGGTATCCCGTACCTCGGTGACCGTCGTGTCCCGCTTGAAGAGTTCAACACCAACATCGCAAGCGTC
ACCGTCAACAAACTCATCAGCAACCCAGGTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGTATCTTCGCAAACCTCATC
ATCTTCGGTCCGGGTCCGGTCCTCAACGAAAACGAAACCATCGACATCGGTATCCAGAACCACTTCGCA
AGCCGTGAAGGTTTCGGTGGTATCATGCAGATGAAATTCTGCCCGGAATACGTCAGTGTCTTCAACAAC
GTCCAGGAAAACAAAGGTGCAAGCATCTTCAACCGTCGTGGTTACTTCAGCGACCCGGCACTCATCCTC
ATGCATGAACTCATCCACGTCCTCCACGGTCTCTACGGTATCAAAGTTGACGACCTCCCGATCGTCCCG
AACGAGAAGAAATTCTTCATGCAGAGCACCGACGCAATCCAGGCTGAGGAACTCTACACCTTCGGTGGC
CAAGACCCAAGTATCATAACCCCGTCCACCGACAAAAGCATCTACGACAAAGTCCTCCAGAACTTCAGG
GGTATCGTGGACAGACTCAACAAAGTCCTCGTCTGCATCAGCGACCCGAACATCAATATCAACATATAC
AAGAACAAGTTCAAAGACAAGTACAAATTCGTCGAGGACAGCGAAGGCAAATACAGCATCGACGTAGAA
AGrTTCGACAAGCTCTACAAAAGCCTCATGTTCGGTTTCACCGAAACCAACATCGCCGAGAACTACAAG
ATCAAGACAAGGGCAAGTTACTTCAGCGACAGCCTCCCGCCTGTCAAAATCAAGAACCTCTTAGACAAC
GAGATTTACACAATTGAAGAGGGCTTCAACATCAGTGACAAAGACATGGAGAAGGAATACAGAGGTCAG
AACAAGGCTATCAACAAACAGGCATACGAGGAGATCAGCAAAGAACACCTCGCAGTCTACAAGATCCAG
ATGrGCGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAAC
CTGCAGTGCATCGACGTTGACAACGAAGACCTGTTCTTCATCGCTGACAAAAACAGCTTCAGTGACGAC
CTGAGCAAAAACGAACGTATCGAATACAACACCCAGAGCAACTACATCGAAAACGACTTCCCGATCAAC
GAACTGATCCTGGACACCGACCTGATAAGTAAAATCGAACTGCCGAGCGAAAACACCGAAAGTCTGACC
GACTTCAACGTTGACGTTCCGGTTTACGAAAAACAGCCGGCTATCAAGAAAATCTTCACCGACGAAAAC
ACCATCTTCCAGTACCTGTACAGCCAGACCTTCCCGCTGGACATCCGTGACATCAGTCTGACCAGCAGT
TTCGACGACGCTCTGCTGTTCAGCAACAAAGTTTACAGTTTCTTCAGCATGGACTACATCAAAACCGCT
AACAAAGTTGTTGAAGCAGGGCTGTTCGCTGGTTGGGTTAAACAGATCGTTAACGACTTCGTTATCGAA
GCTAACAAAAGCAACACTATGGACAAAATCGCTGACATCAGTCTGATCGTTCCGTACATCGGTCTGGCT
CTGAACGTTGGTAACGAAACCGCTAAAGGTAACTTTGAAAACGCTTTCGAGATCGCTGGTGCAAGCATC
CTGCTGGAGTTCATCCCGGAACTGCTGATCCCGGTTGTTGGTGCTTTCCTGCTGGAAAGTTACATCGAC
AACAAAAACAAGATCATCAAAACCATCGACAACGCTCTGACCAAACGTAACGAAAAATGGAGTGATATG
TACGGTCTGATCGTTGCTCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACCCAGTTCTACACCATCAAAGAAGGTATG
TACAAAGCTCTGAACTACCAGGCTCAGGCTCTGGAAGAGATCATCAAATACCGTTACAACATCTACAGT
GAGAAGGAAAAGAGTAACATCAACATCGACTTCAACGACATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAAC
CAGGCTATCGACAACATCAACAACTTCATCAACGGTTGCAGTGTTAGCTACCTGATGAAGAAGATGATC
ccgctggctgttgaaaaactgctggacttcgacaacaccctgaaaaagaacctgctgaactacatcgac
GAAAACAAGCTGTACCTGATCGGTAGTGCTGAATACGAAAAAAGTAAAGTGAACAAATACCTGAAGACC
ATCATGCCGTTCGACCTGAGTATCTACACCAACGACACCATCCTGATCGAAATGTTCAACAAATACAAC
TCTtaataagctt
3. Secuencia de ADN de LHn/C
ggatccATGCCGATCACCATCAACAACTTCAACTACAGCGATCCGGTGGATAACAAAAACATCCTGTAC
CTGGATACCCATCTGAATACCCTGGCGAACGAACCGGAAAAAGCGTTTCGTATCACCGGCAACATTTGG
GTTATTCCGGATCGTTTTAGCCGTAACAGCAACCCGAATCTGAATAAACCGCCGCGTGTTACCAGCCCG
AAAAGCGGTTATTACGATCCGAACTATCTGAGCACCGATAGCGATAAAGATACCTTCCTGAAAGAAATC
ATCAAACTGTTCAAACGCATCAACAGCCGTGAAATTGGCGAAGAACTGATCTATCGCCTGAGCACCGAT
ATTCCGTTTCCGGGCAACAACAACACCCCGATCAACACCTTTGATTTCGATGTGGATTTCAACAGCGTT
GATGTTAAAACCCGCCAGGGTAACAATTGGGTGAAAACCGGCAGCATTAACCCGAGCGTGATTATTACC
GGTCCGCGCGAAAACATTATTGATCCGGAAACCAGCACCTTTAAACTGACCAACAACACCTTTGCGGCG
CAGGAAGGTTTTGGCGCGCTGAGCATTATTAGCATTAGCCCGCGCTTTATGCTGACCTATAGCAACGCG
ACCAACGATGTTGGTGAAGGCCGTTTCAGCAAAAGCGAATTTTGCATGGACCCGATCCTGATCCTGATG
CATGAACTGAACCATGCGATGCATAACCTGrATGGCATCGCGATTCCGAACGATCAGACCATTAGCAGC
GTGACCAGCAACATCTTTTACAGCCAGTACAACGTGAAACTGGAATATGCGGAAATCTATGCGTTTGGC
GGTCCGACCATTGATCTGATTCCGAAAAGCGCGCGCAAATACTTCGAAGAAAAAGCGCTGGATTACTAT
CGCAGCATTGCGAAACGTCTGAACAGCATTACCACCGCGAATCCGAGCAGCTTCAACAAATATATCGGC
GAATATAAACAGAAACTGATCCGCAAATATCGCTTTGTGGTGGAAAGCAGCGGCGAAGTTACCGTTAAC
CGCAATAAATTCGTGGAACTGTACAACGAACTGACCCAGATCTTCACCGAATTTAACTATGCGAAAATC
TATAACGTGCAGAACCGTAAAATCTACCTGAGCAACGTGTATACCCCGGTGACCGCGAATATTCTGGAT
GATAACGTGTACGATATCCAGAACGGCITTAACATCCCGAAAAGCAACCTGAACGTTCTGTTTATGGGC
CAGAACCTGAGCCGTAATCCGGCGCTGCGTAAAGTGAACCCGGAAAACATGCTGTACCTGTTCACCAAA
TTTTGCGTCGACGCGATTGATGGTCGTAGCCTGTACAACAAAACCCTGCAGTGTCGTGAACTGCTGGTG
AAAAACACCGATCTGCCGTTTATTGGCGATATCAGCGATGTGAAAACCGATATCTTCCTGCGCAAAGAT
ATCAACGAAGAAACCGAAGTGATCTACTACCCGGATAACGTGAGCGTTGATCAGGTGATCCTGAGCAAA
AACACCAGCGAACATGGTCAGCTGGATCTGCTGTATCCGAGCATTGATAGCGAAAGCGAAATTCTGCCG
GGCGAAAACCAGGTGTTTTACGATAACCGTACCCAGAACGTGGATTACCTGAACAGCTATTACTACCTG
GAAAGCCAGAAACTGAGCGATAACGTGGAAGATTTTACCTTTACCCGCAGCATTGAAGAAGCGCTGGAT
AACAGCGCGAAAGTTTACACCTATTTTCCGACCCTGGCGAACAAAGTTAATGCGGGTGTTCAGGGCGGT
CTGTTTCTGATGTGGGCGAACGATGTGGTGGAAGATTTCACCACCAACATCCTGCGTAAAGATACCCTG
GATAAAATCAGCGATGTTAGCGCGATTATTCCGTATATTGGTCCGGCGCTGAACATTAGCAATAGCGTG
CGTCGTGGCAATTTTACCGAAGCGTTTGCGGTTACCGGTGTGACCATTCTGCTGGAAGCGTTTCCGGAA
TTTACCATTCCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATCTATAGCAAAGTGCAGGAACGCAACGAAATCATCAAA
ACCATCGATAACTGCCTGGAACAGCGTATTAAACGCTGGAAAGATAGCTATGAATGGATGATGGGCACC
TGGCTGAGCCGTATTATCACCCAGTTCAACAACATGAGCTACCAGATGTACGATAGCCTGAACTATCAG
GCGGGTGCGATTAAAGCGAAAATCGATCTGGAATACAAAAAATACAGCGGCAGCGATAAAGAAAACATC
AAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAAAACAGCCTGGATGTGAAAATTAGCGAAGCGATGAATAACATCAAC
AAATTCATCCGCGAATGCAGCGTGACCTACCTGTTCAAAAACATGCTGCCGAAAGTGATCGATGAACTG
AACGAATTTGATCGCAACACCAAAGCGAAACTGATCAACCTGATCGATAGCCACAACATTATTCTGGTG
GGCGAAGTGGATAAACTGAAAGCGAAAGTTAACAACAGCTTCCAGAACACCATCCCGTTTAACATCTTC
AGCTATACCAACAACAGCCTGCTGAAAGATATCATCAACGAATACTTCAATtaataagctt
4. Secuencia de ADN de LHn/D
ggatccATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAAATGACAACGATATTCTGTAC
CTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACCACACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGG
GTCATTCCAGAACGCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCGACGTCCAAA
TATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACGAACAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATC
ATTAAACTGTTTAAGCGTATTAATGAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGT
TCCCCGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTTTACCCGTCATACGACAAACATC
GCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGGAAAGTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTTT
GGTCCGCTGCCAAACATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCGAATCCGAGT
TTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCCCGGAATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTC
ACCAGCAACCAGAGCTCAGCAGTATTAGGAAAGTCAATTTTTTGCATGGACCCGGTTATTGCACTGATG
CACGAACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAGTGACAAACGTATTCGTCCC
CAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGATGGGCCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCGGA
GGCCTGGACGTAGAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCATTGGGCCATTAT
AAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAACGATTCCATCTTCGTGGATCTCGAATATTGAT
AAATATAAGAAAATTTTTAGCGAGAAATATAATTTTGATAAAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAAC
ATTGACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAAGTTGTGTATAGTTCCCAA
TACAACGTTAAGAATCGTACCCATTACTTCTCrCGTCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGAC
GATAATATTTACACTATTCGTGACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTTCAATATTGAAAATTCAGGC
CAGAACATTGAACGCAACCCGGCCTTGCAGAAACTGTCGAGTGAATCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAA
GTCTGCGTCGACAAAAGCGAAGAGAAGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTG
CAGTGTATTAAAGTGAAAAACAATCGGCTGCCTTATGTAGCAGATAAAGATAGCATTAGTCAGGAGATT
TTCGAAAATAAAATTATCACTGACGAAACCAATGTTCAGAATTATTCAGATAAATTTTCACTGGACGAA
AGCATCTTAGATGGCCAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGTGAATATG
GAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTTTATGATGACATTACGAAATATGTGGACTACCTT
AATTCTTATTACTATTTGGAAAGCCAGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGC
GTGGAAGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCTGGCGGAAAAAGTAAAT
AAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTGGGCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATT
ATGAAAAAGGATACCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCCTGCGTTA
AATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCCTTTGCTACCGCGGGCGTCGCGTTCCTC
CTGGAGGGCTTTCCTGAATTTACTATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATTTTACTCTTCCATCCAGGAG
CGTGAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAACGCTGGAAAGATTCTTAT
CAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCATCACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTAT
GATAGTCTGTCGTACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTACTCTGGT
AGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAAGAATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAA
GCrATGAATAACATTAACAAATTCATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGlTCAAGAATATGCTGCCA
AAAGTTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTATCAACCTCATCGACTCC
CACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCGTCTGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACG
ATGCCGTTTAATATTTTTTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGATATCATCAATGAATATTTCAAT
taataagctt
5. Secuencia de ADN del ligando humano CP-EN-GS15-SST28
CATATGGGATCCGGTTTAAACGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAA
AGCGCCAATTCAAATCCTGCAATGGCGCCACGCGAACGCAAAGCTGGTTGCAAAAACTTCTTCTGGAAA
ACCTTCACCTCTTGCGCGCTAGCGGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGC
GCACTAGTGCTGCAGCTAGAATAATGAAAGCTT
6. Secuencia de ADN de CT-GS20-CST28 humano
GGATCCGTCGACCTGCAGGGTCTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGT AGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGTGCAGGAAAGACCTCCATTACAACAACCTCCACATCGCGATAAG 5 AAACCATGTAAGAATTTCTTTTGGAAAACATTTAGCAGTTGCAAATGATAAAAGCTT
7. Secuencia de protema de la fusion CP-CST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFKLTNKGFNIEKSGQKI ERNPALQKLS SESVTOL FTKVCVDGIITS KTKSDDDDKPCKNFFWKTFSS CKALAGGGGSGGGGSGGGG SALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLL
PNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSL AEBCVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATA GVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHI WYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNrWKFIRECSVTYLF KNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDII NEYFN
8. Secuencia de protema de la fusion CP-CST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKHLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKPCKNFFWKTFSSCKALAGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVP INPEIVDPLLPNVNME PLNL PGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSWNVENITLTTSVEEALGYS NKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALR GNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWL SRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKF IRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFN
9. Secuencia de protema de la fusion CP-CST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKQERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCKAL AGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVP INPE I VDPLLPNVNME PLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEB ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGF PE FTIPALGVFTFYS SIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
10. Secuencia de protema de la fusion CP-CST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKQERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCKAL AGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYS DKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVE NITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRV KRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNS LDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKV 5 NESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
11. Secuencia de protema de la fusion CP-SST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD
VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMBEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSGGGGSGGGG SALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLL PNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSL AEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATA GVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNHLSRITTQFNHI NYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLF
knmlpkvidelnkfdlrtktelinlidshniilvgevdrlkakvnesfentmpfnifsytnnsllkdii
NEYFN
12. Secuencia de protema de la fusion CP-SST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGI IKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDBTNVQNYSDKFSLDESILDGQVP INPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYS NKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALR GNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSKWL SRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKF IRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFN
13. Secuencia de protema de la fusion CP-SST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGI IKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSCALA GGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVKNNRL PYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDE SILD GQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEA LGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGN SALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMV SNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNN INKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
14. Secuencia de protema de la fusion CP-SST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQPEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSCALA GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALALQCI KVKNNRL PYVADKDS ISQEI FENKI ITDETNVQNYSD KFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVEN ITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIP YIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVK RWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSL DVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVN 5 ESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
15. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNI YTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSES WDLFT KVCVDKS EE KLYDDDDKDRWGSSLQ Cl KVKNNRL PYVADKDS ISQEI FEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSV11PYIGPALNIGNSALRGN FNQAFATAGVAFLLEGFPE FTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVPCKNFF WKTFSSCK
16. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSKPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQXERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWWIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFMLTNKGFNIENSGQKFI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLE SQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAE KVNKGVQAGL FLNWAKE WEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNEALRGNFNQAFATAGVAPLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ilvgevdrlkakvnesfentmpfnifsytnnsllkdiineyfnleggggsggggsggggsggggsgggg
SALVPCKNFFWKTFSSCK
17. Secuencia de ADN de la fusion CT-CST28-GS20-LHD
GGATCCATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAAATGACAACGATATTCTGTAC
CTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACCACACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGG
GTCATTCCAGAACGCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCGACGTCCAAA
TATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACGAACAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATC
ATTAAACTGTTTAAGCGTATTAATGAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGT
TCCCCGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTTTACCCGTCATACGACAAACATC
GCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGGAAAGTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTTT
GGTCCGCTGCCAAACATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCGAATCCGAGT
TTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCCCGGAATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTC
ACCAGCAACCAGAGCTCAGCAGTATTAGGAAAGTCAATTTTTTGCATGGACCCGGrTATTGCACTGATG
CACGAACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAGTGACAAACGTATTCGTCCC
CAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGATGGGCCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCGGA
GGCCTGGACGTAGAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCATTGGGCCATTAT
AAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAACGATTCCATCTTCGTGGATCTCGAATATTGAT
AAATATAAGAAAATTTTTAGCGAGAAATATAATTTTGATAAAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAAC
ATTGACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAAGTTGTGTATAGTTCCCAA
TACAACGTTAAGAATCGTACCCATrACTrCTCTCGTCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGAC
GATAATATTTACACTATTCGTGACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTTCAATATTGAAAATTCAGGC
CAGAACATTGAACGCAACCCGGCCrTGCAGAAACTGTCGAGTGAATCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAA
GTCTGCGTCGACAAAAGCGAAGAGAAGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTG
cagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagatt
TTCGAAAATAAAATTArCACTGACGAAACCAATGTTCAGAATTATTCAGATAAATTTTCACTGGACGAA
AGCATCTTAGATGGCCAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGTGAATATG
GAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTTTATGATGACATTACGAAATATGTGGACTACCTT
AATTCTTATTACTATTTGGAAAGCCAGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGC
GTGGAAGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCTGGCGGAAAAAGTAAAT
AAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTGGGCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATT
ATGAAAAAGGATACCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCCTGCGTTA
AATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCCTTTGCTACCGCGGGCGTCGCGTTCCTC
CTGGAGGGCTTTCCTGAATTTACTATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATTTTACTCTTCCATCCAGGAG
CGTGAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAACGCTGGAAAGATTCTTAT
CAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCATCACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTAT
GATAGTCTGTCGTACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTACTCTGGT
AGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAAGAATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAA
GCTATGAATAACATTAACAAATTCATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGTTCAAGAATATGCTGCCA
AAAGTTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTATCAACCTCATCSACTCC
CACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCGTCTGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACG
ATGCCGTTrAATATTTTTTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGArATCATCAATGAATATTTCAAT
CTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGTGCAGGAAAGA
CCrCCATTACAACAACCTCCACATCGCGATAAGAAACCATGTAAGAATTTCTTTTGGAAAACATTTAGC
AGTTGCAAAtaataagctt
5 18. Secuencia de protema de la fusion CT-CST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGTIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGPFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKL SNNVENITLTTS VEEALGY SNKIYTFLPSLAE KVNKGVQAGLFLNWANEWED FTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK 11KTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVQERPPL QQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK
19. Secuencia de protema de la fusion CT-CST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTN1ITPSVLIFGPLPHILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPE FLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESOKLSNWVENITLTTS VEEALGYSNKI YTFLPSLAE KVNKGVQAGLFLNWAKEVVEDFTTNIMKK' DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SALVQERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK
20. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS15-L(#Fxa)HD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSIDGRNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYIIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYIDGRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKII TDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYL ESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSL.AEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTL DKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIK TIENCLEQRVKRWKDS YQWMVSNWLSR ITTQFNH INYQMYDSLS YQADAI KAKIDLEYKKYSGSDKENI KSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILV GEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVAGCKNFFWK 5 TFTSC
21. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SALVAGCKNFFWKTFTSC
22. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS’
YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE
KFENGSWfCVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN
QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD
VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNWINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK
FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI
ERNPALQKLS SESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGS SLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN
KIITDETNVQNYSDKFELDESILDGQVPIMPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLWSY
YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK
DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK
IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK
ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELMKFDLRTKTELINLIDSHNI
ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVSANSNP
AMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
23. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSIDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKT'IPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYT1RDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLS SE SWDLFTKVCVDKS EEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSI SQE I FEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLPLNWANEWEDFTrNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SALVSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
24. Secuencia de protema de la fusion CT-SST14-GS35-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLP FIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTS EHGQLDLLYPSIDSES EILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRS IEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ 5 VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV
DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSALVAGCKNFFWKTFTSC
25. Secuencia de ADN de la fusion CP-SST28-GS15-LHA
ggatccATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAACGGTGTTGACATTGCTTAC
ATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGCCGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTT
ATCCCGGAACGTGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAG
GTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACCGATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGT
GTTACTAAACTGTTCGAGCGTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCGC
GGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATCGATACCGAACTGAAAGTAATCGACACTAACTGCATCAAC
GTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTTCCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGAT
ATCATCCAGTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAACGGCTACGGTTCC
ACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCTTCGGTTTTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAAC
CCACTGCTGGGCGCTGGTAAATTCGCAACTGATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACTGATTCATGCA
GGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTTCAAAGTTAACACCAACGCGTATTAC
GAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAACIGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATC
GACTCTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGATATCGCATCCACCCTG
AACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACTGCTTCTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAA
TACCTGCTCAGCGAAGACACCTCCGGCAAATTCTCTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTTTACAAA
ATGCTGACTGAAATTTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTTTAAAGTTCTGAACCGCAAAACCTAT
CTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTATCTACGATGGT
TTCAACCTGCGTAACACCAACCTGGCTGCTAATTTTAACGGCCAGAACACGGAAATCAACAACATGAAC
TTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGTTTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACGGCATCATT
ACCrCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAGCGCCAATTCAAATCCTGCAATGGCGCCACGCGAA
CGCAAAGCTGGATGCAAAAACTTCTTTTGGAAGACATTTACTAGTTGTGCGCTAGCGGGCGGTGGCGGT
AGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGTGCTGCAGTGTATCAAGGTTAACAACTGG
GATTTATTCTTCAGCCCGAGTGAAGACAACTTCACCAACGACCTGAACAAAGGTGAAGAAATCACCTCA
GATACTAACATCGAAGCAGCCGAAGAAAACATCTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTGACCTTT
AATTTCGACAACGAGCCGGAAAACATTTCTATCGAAAACCTGAGCTCTGATATCATCGGCCAGCTGGAA
CTGATGCCGAACATCGAACGTTTCCCAAACGGTAAAAAGTACGAGCTGGACAAATATACCATGTTCCAC
TACCTGCGCGCGCAGGAATTTGAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGTTAACGAAGCT
CTGCTCAACCCGTCCCGTGTATACACCTTCTTCTCTAGCGACTACGTGAAAAAGGTCAACAAAGCGACT
GAAGCTGCAATGTTCTTGGGTTGGGTTGAACAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCCGAAGTA
TCTACTACCGACAAAATTGCGGATATCACTATCATCATCCCGTACATCGGTCCGGCTCTGAACATTGGC
AACATGCTGTACAAAGACGACTTCGTTGGCGCACTGATCTTCTCCGGTGCGGTGATCCTGCTGGAGTTC
ATCCCGGAAATCGCCATCCCGGTACTGGGCACCTTTGCTCTGGTTTCTTACATTGCAAACAAGGTTCTG
ACTGTACAAACCATCGACAACGCGCTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTTTACAAATATATC
GTGACCAACTGGCTGGCTAAGGTTAATACTCAGATCGACCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCACTG
GAAAACCAGGCGGAAGCTACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACAACCAGTACACCGAGGAAGAAAAA
AACAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCTCTAAACTGAACGAATCCATCAACAAAGCTATGATC
AACATCAACAAGTTCCTGAACCAGTGCTCTGTAAGCTATCTGATGAACTCCATGATCCCGTACGGTGTT
AAACGTCTGGAGGACTTCGATGCGTCTCTGAAAGACGCCCTGCTGAAATACATTTACGACAACCGTGGC
ACTCTGATCGGTCAGGTTGATCGTCTGAAGGAGAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATCCCTTTT
CAGCTCAGTAAATATGTCGATAACCAACGCCTTTTGTCCACTtaataagctt
26. Secuencia de protema de la fusion CP-SST28-GS15-LHA
E FVNKQFNYJCDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQ PVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPP PEAKQVPV SYYDSTYLSTDKEKDNYLKGVTK1FERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTWPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVWYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSGG GGSGGGGSALVLQCIKVNKWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEEWISLDLIQQYYLTFNFD NEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVTJEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNML YtCDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTN WLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININ KFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLS KYVDNQRLLST
27. Secuencia de protema de la fusion CT-SST28-GS15-LHB
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV
ceyydpdylntndkkniflqtmiklfnrikskplgekllemiingipylgdrrvpleefntniasvtvn KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSK NERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIF QYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANK SNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKN KIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKE KSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENK LYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALDSANSN PAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
28. Secuencia de protema de la fusion CT-CST14-GS20-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRPSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK. FVELYWELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTHILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNPTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVAGCKNFF WKTFTSC
29. Secuencia de protema de la fusion CT-CST17-GS25-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITG PRENI IDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALS IIS ISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQI FTEFNYAKIYNVQNRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVEAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNS FQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVDR 5 MPCRNFFWKTFSSCK
30. Secuencia de protema de la fusion CT-CST29-GS15-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALS KRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEE KN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT
LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVQEGAPPQQSARRD
RMPCRNFFWKTFSSCK
31. Secuencia de protema de la fusion CT-CST29-GS30-LHB
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPXVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSK NERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIF QYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANK SNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKN KIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNrQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKE KSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENK LYLIGSAEYEKSKVNKYLKTTMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSALDQEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK
32. Secuencia de ADN de IgA-HNtet
ggatccATGGAGTCCAATCAGCCGGAAAAAAATGGAACCGCGACTAAACCCGAGAATTCGGGGAACACT
ACGTCGGAAAACGGCCAGACGGAACCTGAGAAGAAACTGGAACTACGAAATGTGTCCGATATCGAGCTA
TACTCTCAAACCAATGGAACCTATAGGCAGCATGTTTCATTGGACGGAATCCCAGAAAATACGGATACA
TATTTCGTCAAAGTGAAGTCTAGCGCATTCAAGGATGTATATATCCCCGTTGCGAGTATTACAGAAGAG
AAGCGGAACGGTCAAAGCGTTTATAAGATTACAGCAAAGGCCGAAAAGTTACAACAGGAGTTAGAAAAC
AAATACGTTGACAATTTCACTTTTTATCTCGATAAAAAGGCTAAAGAGGAAAACACGAACTTCACGTCA
TTTAGTAATCTGGTCAAAGCCATAAATCAAAATCCATCTGGTACATACCATCTCGCGGCAAGTCTAAAC
GCGAATGAAGTAGAACTTGGCCCGGACGAGCGrTCATACATTAAGGATACCTTTACTGGCAGACTCATA
GGGGAAAAAGACGGTAAGAACTATGCTATATACAATTTGAAAAAGCCTTTATTTGAGAACCTGTCGGGC
GCCACCGTCGAGAAATTGTCCCTTAAAAACGTAGCTATAAGCGGAAAGAATGACATCGGTAGTCTTGCA
AACGAGGCTACTAACGGGACAAAGATTAAACAAGTGCACGTAGATGGGtgtgtcgacggcatcattacc
tccaaaactaaatctgacgatgacgataaaaacaaagcgctgaacctgcagtgcattaaaataaagaat
gaggatttgacattcatcgcagaaaaaaatagcttcagcgaagagccgttccaagatgagatagtaagc
tacaacaccaagaacaagccgcttaattttaattactcgttagataaaatcatagttgactacaacctt
caatcgaagatcacgttaccgaatgacagaacaactcctgtcacaaaaggaattccctatgcacctgag
tataagtcaaatgccgcgtcaacaatagagattcataatatagatgacaacaccatctatcaatatctg
tacgctcagaaaagtccaacaactcCtcagcgtataacaatgaccaatagtgtcgatgacgcattgata
aattctaccaagatatactcttatttcccgagcgtcatctccaaagttaatcaaggtgctcaaggcatt
cCatttttgcaatgggtccgagacatcatagatgacttcactaatgagtcgtctcagaaaaccacgatt
gataaaatatcagatgtttccaccatcgtcccctacatcggacctgcgcttaacattgtgaagcagggg
tatgaggggaattttatcggagcgttagaaactacgggggttgtgctattacttgaatacataccagag
ataacattgcccgttatagcggccctcagtatcgcagaatcaagtacacaaaaagaaaagataatcaaa
acaatcgacaacttcctagaaaagaggtacgaaaaatggatagaggtttataaactcgtgaaagcgaaa
tggttaggcactgttaatacgcagttccaaaagagatcctatcaaatgtatagatcactggagtaccag
gtggatgccataaagaaaattatcgactatgaatataaaatatattcaggtccagataaggagcagata
gctgatgaaataaacaatttaaaaaacaaacttgaagagaaggcgaataaggccatgatcaatatcaat
atttttatgcgagaatcttcacgatcttttttggtaaatcagatgattaacgaagccaaaaagcagctg
cttgagttcgacacacagtccaaaaacatactaatgcaatatatcaaagcaaactcaaaattcattgga
attactgagctgaagaaactggaatccaaaataaataaagtattctctaccccgatcccgttctcttac
tctaaaaaccttgactgctgggtagataacgaagaagatattgacgttctagagtaataagctt
33. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRP-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGKNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATtJD VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNL.YGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFWKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ 5 KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKWAGVQGGLFLMWANDWEDFTrNILRKDTLDKI
SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLTNLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGSSFLSPEHQRV QQRKESKKPPAKLQPR
34. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDrFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPS FEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTWKGFNIENSGGNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNWRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVYADAIF TNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA
35. Secuencia de protema de la fusion CT-GHRP-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYS SQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDG FNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWED FTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIEELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVERLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGSSFLS PEHQRVQQRKESKKP PAKLQPR
36. Secuencia de protema de la fusion CT-grelina-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDfCLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPHIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGSSPLSPEHQRVQ 5 QRKESKKPPAKLQPR
37. Secuencia de protema de la fusion IgA-HNtet-CT-SST14
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFVKV KSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNLVKA INQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATVEKLSLK NVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKIKNEDLTFIAEKNS FSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHN
IDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTN ESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGWLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQ KEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRS LEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPD KEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKF IGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVLEGGGGSGGGGSGGGGSALVAGCKNFFWKT FTSC
38. Secuencia de protema de la fusion IgA-HNtet-CT-GHRP
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFVKV KSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNLVKA INQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATVEKLSLK NVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGI ITS KTKSDDDDECNKAIiNLQC IKIKWEDLTFIAEKNS FSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHN IDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTN ESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGWLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQ KEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPD KEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKADJSKF IGITELKKLESKINKVFSTEIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGSSFLSPEHQ RVQQRKESKKPPAKLQPR
39. Secuencia de protema de la fusion CT-grelina S3W-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTMPEEGDLNPPPEAKQVPVSY YDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGS YRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFA TDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLY YYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFftEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVK FFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYK LLCVDGIITSKTKSDDDDKKKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEIT3DTNIEAAEENISLDL IQQYYLTFUFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALT NSVWEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPA LNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYK YIVTNWIAKVNTQIDLIRKKMKEALEKQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESIKKAMI NINKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQL SKYVDNQRLLSTLEIYALVGSWFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
40. Secuencia de protema de la fusion CT-GRP-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNME PLNL PGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGNHWAV 5 GHLM
41. Secuencia de protema de la fusion CT-GRP-LHB
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFMRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNER IEYNTQSNYIENDFPIKELILDTDLISKIELPSENTESLTDFKVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYL
YSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNT MDAIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKNKII KTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSN INIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYL IGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGNHWAVGH LM '
42. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRA EAAAKEAAAKALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINP EIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNS YYYLES QKLSNNVENITLTTSVEEALGY SNKI YTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNF NQAFATAGVAFLLEGFPE FT I PALGVFTFYSSIQEREKI IKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRI TTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRE CSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNN SLLKDIINEYFN
43. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQ GALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDL IQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIA LTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPY IGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEK WDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLN ESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNN TLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
44. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA LAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQ VILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSI EEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDILDKISDVSAIIPYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYE WMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEA MNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTI 5 PFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
45. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD
VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQ GERNQEQGAALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNY SDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNV ENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVI IPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQR VKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLS YQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKN SLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAK VNES FENTMP FNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
46. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD N10-PL5
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQ QGERNQEQGAPAPAPLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQV PINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGY SNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSAL RGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNW LSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINK FIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFS YTNWSLLKDIINEYFN
47. Secuencia de protema de la fusion CP-qGHRH-LHD N10-HX12
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYY DPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFEN GSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIE RSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDKFNSLYSDLTN VMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSE SVVDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTQS YRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGAEAAA KEAAAKALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPL LPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYyLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLA EKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVA FLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFMHINYQMY DSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENL.KNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKV IDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
48. Secuencia de protema de la fusion CP-UTS-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNPDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGGGGSADDDDKNDDPPISIDLTFHLLRNMIEMARIENEREQAGLNRKYLDEV ALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTKTDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLI QQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDITGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIAL TNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYI GPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKW DEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNE SINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYlYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNT 5 LSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
49. Secuencia de protema de LHn/A
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVS FEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
50. Secuencia de protema de LHn/B
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEIS KEHLAVYKIQMCVDEE KLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDL FFIADKNSFSDDLSKNER IEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYL YSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNT MDAIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDMKNKII KTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSN INIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYL IGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNS
51. Secuencia de protema de LHn/C
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSS FNKYIGEYKQKLIRKYRFWES SGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTE FNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFS YTNNSLLKDIINEYFN
52. Secuencia de protema de LHn/D
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTKSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK
iiktiencleqrvkrwkdsyqwmvsnwlsrittqfnhinyqmydslsyqadaikakidleykkysgsdk
ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTEUNLIDSHNI 5 ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
53. Secuencia de protema de IgA-HNtet
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFV KVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSN lvkainqnpsgtyhlaaslnanevelgpdersyikdtftgrligekdgknyaiynlkkplfenlsgatv eklslknvaisgkndigslaneatngtkikqvhvdgcvdgiitsktksddddknkalnlqcikiknedl TFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKS NAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFL QWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGWLLLEYIPEITL PVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDA IKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEF DTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDV
54. Peptido de Octreotide sintetizado
Cys-Dphe-Cys-Phe-Dtrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
10 55. Peptido agonista de GHRH sintetizado
HIS-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-
SER-ALA-ARG-LYS-LEO-LEU-GLN-ASP-ILE-NLE-SER-ARG-CYS
56. Peptido antagonista de GHRH sintetizado
PhAc-Tyr-D-Arg-Asp-Ala-Ile-Phe(4 Cl)-Thr-Ala-Har-Tyr(Me)-Hia-Lys-Val- Leu-Abu-Gin-Leu-Ser-Ala-His-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-Nle-D-Arg-Har-CYS
57. Secuencia de protema de CP-MCH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWIENIDKYKKIFSEKYHFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKDFDMLRCMLGRVYRPCWQVALAKRLVLQCIK VKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLN LPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVMKGVQ AGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGF PE FTIPALGVFTFYESIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLS RITTQFNHINYQMYDSLS YQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVID ELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
58. Secuencia de protema de CT-KISS-LHD
TWPVKDFNYSDPWDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDIT’KYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVYNWNSF GLRFG
5 59. Secuencia de protema de CT-PrRP-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL
QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVfCRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVTPDINPAWYASRG IRPVGRFG
60. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-27-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMALAG GGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDG QVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEAL GYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNS ALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVS NWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAIVINNI NKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
61. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-28-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSALA GGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILD GQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEA LGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGN SALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMV SNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNN INKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
62. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPS FEGFGILS.ILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSGYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGI ITSKTKSDDDDKYADAIFTNS YRKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPDLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF 5 NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
63. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-44-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKITPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQ GESNQERGARARLALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETN VQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKL SNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISD VSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENC LEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVE NLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDR LKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
64. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_1-40-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQN1WVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGGQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQ GESNQERGALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYS
DKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVE NITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRV KRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNS LDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKV NESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN 5 65. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala9-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTI PSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNAYRKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEFCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPS YLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKECLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKALQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINFEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKKSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
67. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Lys11_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQRDTFL KG1I KLFKR INERDIGKKLINYLWGS PFMGDS STPEDTFDFTRHTTNI AVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGIKIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEUPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYKKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
68. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Lys11_Arg12_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGII KLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VE11PQIERSQLRE KALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYHFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGI ITSKTKSDDDDKYADAIFTASYKKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKXSNNVENITLT'TSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSSVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF 5 NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
69. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Asn11_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPS FEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELrHSLHQLYGIMIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK
fnslysdltnvmsewyssqynvknrthyfsrhylpvfanilddniytirdgfnltnkgfntensgqni
ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYNKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFL PSLAE KVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKIS DVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGF PEFTIPALGVFTFYS SIQERE KIIKHENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
70. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Lys20_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK
fnslysdltnvmsewyssqynvknrthyfsrhylpvfanilddniytirdgfnltnkgfniensgqni
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5 71. Secuencia de protema de la fusion CP-HS-CHRH-Ala8_Lys11_Lys20_1-29-LHD
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NIFSYTNHSLLKDIINEyFW
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73. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Asn12_1-29-LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
74. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Asn21_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS 5 YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSPEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLGQLSARNLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
75. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Glu_7_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE
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76. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Glu_10_1-29LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASERKVLGQLSARKLLQDIMSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDIIKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRI.TTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
5 77. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_Glu_13_1-29-LHD
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79. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Glu8_1-29-LHD
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80. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Alal5_1-27-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTI PSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGI ITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIMALAG GGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDG QVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEAL GYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNS ALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVS NWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNI NKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI 5 FSYTNNSLLKDIINEYFN
81. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala15-LHD
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82. Secuencia de protema de la fusion CP- HS_GHRH_Ala8_Ala15_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS
yydpsylstdeqkdtflkgiiklfkrinerdigkklinylwgspfmgdsstpedtfdftrhttniave
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5 83. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_Ala8_9_15_22_27-LHD
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qssavlgksifcmdpvialmhelthslhqlyginipsdkrirpqvsegffsqdgpnvqfeelytfggld
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85. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_HVQAL_1-32-LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHS LHQLYGINIPSDKRIRPQVS EGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILSRQQ GALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDE SILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTS VEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISE AMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENT MPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
86. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_HVSAL_1-29-LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI
5 ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGI ITSKTKSDDDDKHVDAIFTSSYRKVLAQLSARKLLQDILSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPE FTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDS YQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
87. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_HVTAL_1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTKSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGI ITSKTKSDDDDKHVDAIFTTSYRKVLAQLSARKLLQDILSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQC1KVKNNRLPYVADKDSIS QEIF ENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWED FTTNIM KKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPE FTIPALGVFTFYS SIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
88. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_QALN-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPS YLSTDEQKDTFLKGI IKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILNRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPE FTIPALGVFTFYS SIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
89. Secuencia de protema de la fusion CP-HS_GHRH_QAL-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNI YTIRDGFNLTNKGFN I ENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIPTQSYRKVLAQLSARKALQDILSRAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESIL DGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWM VSNWLSRITTQFNHINYQHYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF 5 NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
90. Secuencia de protema de la fusion CP-hGHRH29 N8A M27L -LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS
YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE
KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN
QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSBGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD
VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKriPSSWISNIDKYKKIPSEKYNFDKDNTGNFWNIDK
FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI
ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSIEGRYADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDILSR
ALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDES
ILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSV
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IGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQ
WMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEA
MNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTM
PFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
91. Secuencia de protema de la fusion CP-hGHRH29 N8A K12N M27L -LHD TWPVKDPNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGIITSKTKSIEGR YADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQDILSR
ALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDES ILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSV
eealgysnkiytflpslaekvnkgvqaglflnwanewedfttnimkkdtldkisdvsviipyigpaln
IGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQ WMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEA MNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTM PFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
5 92. Secuencia de protema de la fusion N-terminal-hGHRH29 N8A M27L -LHD
HVDAI FTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRNNNNNNNNNNTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRI PQNKLIT TPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINER DIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYT ASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQL YGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNI NKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDKFNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYF SRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKL YDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPIN PEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNK IYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTrNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGN FNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSR ITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIR ECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTN NSLLKDIINEYFN
PIT[NNFNYSDPVDNKN!LYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVT
SPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDV
DFNSVDVKTRQGNNWVKTGSiNPSVIlTGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIlSISP
RFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQ
YNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQK
LIRKYRFWESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDD
NVYD1QNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQ
CRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYP
SIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYT
YFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRR
GNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWM
MGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKI
SEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVN
NSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVMKPIQKLLAGLILLT
WCVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVKEVGQLAETQRFECTTHQPRSPLRDLK
GALESLIEEETGQKKI
94. Fusion de GnRH-D SEQ ID 94
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIVWIPERFSSDTNPSLSKPPRPT
SKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKG1IKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDF
TRHTTNIAVEKFENGSWKVTNItTPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKV
APEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSlFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGfNIPSDKRIRPQVSEGFF
SQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYK
KIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDKFNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKN RTHYFSRHYLPVFA
NILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDD
DKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPI
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WKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHfNYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVE
NLKNSLDVKtSEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGE
VDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSA
LVMKPIQKLLAGLILLTWCVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVKEVGQLAETQR
FECTTHQPRSPLRDLKGALESLIEEETGQKKI
Ejemplo 1: Preparacion de una construccion de cadena principal de LHn/A
5 El siguiente procedimiento crea un clon para uso como cadena principal de expresion para la expresion multidominio de protemas. Este ejemplo se basa en la preparacion de un clon basado en serotipo A (SEQ ID 1), aunque los procedimientos y metodos son igualmente aplicables a todos los serotipos LHn tal como el serotipo B (SEQ ID 12), el serotipo C (SEQ ID 3) y el serotipo D (SEQ ID 4) y otros dominios de proteasa o de traslocalizacion tales como IgA y Hn de tetanos usando la secuencia publicada apropiada para la smtesis (SEQ ID 32).
10 Preparacion de vectores de clonacion y de expresion
Se elige el pCR4 (Invitrogen) como vector de clonacion estandar debido a la falta de secuencias de restriccion dentro del vector y a los sitios de cebador de secuenciamiento adyacentes para una facil confirmacion de construccion. El vector de expresion se basa en el vector de expresion pET (Novagen) que ha sido modificado para contener el sitio de clonacion multiple NdeI-BamHI-SalI-PstI-XbaI-HindIII para la insercion de la construccion, se ha
15 eliminado un fragmento del vector de expresion para crear un plasmido no movilizable, se ha insertado una variedad de etiquetas de fusion diferentes para aumentar las opciones de purificacion y se ha eliminado un sitio Xbal existente en la cadena principal del vector para simplificar la sub-clonacion.
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La secuencia de ADN se disena mediante traduccion inversa de la secuencia de aminoacidos LC/A (obtenida de fuentes de bases de datos disponibles libremente, tales como GenBank (numero de acceso P10485) usando una entre una variedad de herramientas de software de traduccion inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Se incorporan secuencias de reconocimiento BamH\lSal\ en los extremos 5' y 3', respectivamente, de la secuencia manteniendo el marco de lectura correcto. Se realiza un escrutinio de la secuencia de ADN (usando un software tal como el SeqBuilder, DNASTAR \nc.) para determinar las secuencias de ruptura de enzima de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de ruptura que se observe que es comun a las requeridas por el sistema de clonacion es eliminada mediante la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta, asegurando que se mantiene un uso de codon de E. coli comun. El uso de codon de E. coli se determina mediante programas de software tales como “Graphical Codon Usage Analyser” (Geneart), y se determina el % GC y la ratio de uso de codon usando como referencia tablas de uso de codon publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierto (ORF) LC/A es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR4.
Preparacion de injerto Hn/A
La secuencia de ADN se disena mediante traduccion inversa de la secuencia de aminoacidos Hn/A (obtenida de fuentes de bases de datos disponibles libremente, tales como GenBank (numero de acceso P10845) usando una entre una variedad de herramientas de software de traduccion inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Se incorpora una secuencia de restriccion Pstl en el extremo N y Xbal-codon de parada-Hind\\\ en el extremo C, asegurando que se mantiene el marco de lectura correcto. Se realiza un escrutinio de la secuencia de ADN (usando un software tal como el SeqBuilder, DNASTAR \nc.) para determinar las secuencias de ruptura de enzima de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de ruptura que se observe que es comun a las requeridas por el sistema de clonacion es eliminada mediante la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta, asegurando que se mantiene un uso de codon de E. coli comun. El uso de codon de E. coli se determina mediante programas de software tales como “Graphical Codon Usage Analyser” (Geneart), y se determina el % GC y la ratio de uso de codon usando como referencia tablas de uso de codon publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR4.
Preparacion del interdominio (ligando LC-Hn)
El ligando LC-Hn puede disenarse a partir del primer principio, usando la informacion de secuencia existente para el ligando como plantilla. Por ejemplo, el ligando de serotipo A (en este caso definido como region de polipeptido interdominio que existe entre las cistemas del puente disulfuro entre LC y Hn) tiene la secuencia VRG\\PFKTKSLDEGYNKALNDL. Esta informacion de secuencia se encuentra disponible libremente en fuentes de bases de datos tales como GenBank (numero de acceso P10845). Para la generacion de un sitio de ruptura de proteasa espedfico, se puede usar la secuencia de reconocimiento nativa para el Factor Xa en la secuencia modificada VDG\\TSKTKSL\EGR o se inserta una secuencia de reconocimiento de enteroquinasa en el bucle de activacion para generar la secuencia VDG\\TSKTKSDDDDKNKALNLQ. Usando una entre una variedad de herramientas de software de traduccion inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)) se determina la secuencia de ADN que codifica la region ligando. Se incorporan secuencias de enzima de restriccion BamH\lSal\ y Psfl/Xbal/codon de parada/Hind\\\ en cualquier extremo, en los marcos de lectura correctos. Se realiza un escrutinio de la secuencia de ADN (usando un software tal como el SeqBuilder, DNASTAR \nc.) para determinar las secuencias de ruptura de enzima de restriccion incorporadas durante la traduccion inversa. Cualquier secuencia de ruptura que se observe que es comun a las requeridas por el sistema de clonacion es eliminada mediante la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta, asegurando que se mantiene un uso de codon de E. coli comun. El uso de codon de E. coli se determina mediante programas de software tales como “Graphical Codon Usage Analyser” (Geneart), y se determina el % GC y la ratio de uso de codon usando como referencia tablas de uso de codon publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma- Genosys) y se proporciona en el vector pCR4.
Ensamblaje y confirmacion del clon de cadena principal
Debido al tamano pequeno, el ligando de activacion debe transferirse usando un proceso de dos etapas. El vector ligando pCR-4 es dividido con una combinacion de enzimas de restriccion BamH\ + Sal\ y el vector dividido a continuacion actua como receptor del ADN de LC dividido mediante enzimas de restriccion BamH\ + Sal\. Una vez que el ADN que codifica LC es insertado por encima del ADN ligando, el fragmento de ADN de ligando-LC puede aislarse a continuacion y transferirse al vector de expresion pET MCS. El ligando-LC es cortado del vector de clonacion pCR4 usando digestos de enzimas de restriccion BamHl/Psfl. El vector de expresion pET es digerido con las mismas enzimas pero tambien es tratado con fosfatasa antartica como precaucion adicional para prevenir la re- circularizacion. El ligando-LC y la cadena principal de vector pET son purificadas en gel y el inserto purificado y la
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cadena principal purificada son ligados usando ligadas de ADN T4. El producto es transformado con celulas TOP10 que son sometidas a escrutinio a continuacion para determinar ligando-LC usando digestion de restriccion BamHI/PstI. A continuacion se repite el proceso para la insercion de Hn en los sitios de restriccion PstI/HindIII de la construccion pET-ligando-LC. El escrutinio con enzimas de restriccion es suficiente para asegurar que la cadena principal final es correcta, ya que todos los componentes ya estan secuenciados y confirmados durante la smtesis. Sin embargo, durante la sub-clonacion de algunos componentes en la cadena principal, donde fragmentos de tamano similar estan siendo eliminados e insertados, se requiere el secuenciamiento de una region pequena para confirmar la insercion correcta.
Ejemplo 2: Construccion de LHn/AA-CP-GS15-SST28
El siguiente procedimiento crea un clon para uso como construccion de expresion para la expresion de fusion multidominio en la que el resto dirigido a diana (TM) es presentado centralmente entre la proteasa y el domino de traslocalizacion. Este ejemplo se basa en la preparacion de la fusion LHn/A-CP-GS15-SST28 (SEQ ID 25), aunque los procedimientos y los metodos son igualmente aplicables para la creacion de otras fusiones de proteasa, traslocalizacion y tM, en donde el TM es N-terminal respecto al dominio de traslocalizacion. En este ejemplo, se disena un espaciador glicina-serina flanqueante de 15 aminoacidos (G4S) en la secuencia interdominio para asegurar la accesibilidad del ligando a su receptor, pero tambien son aplicables otros espaciadores.
Preparacion de injerto espaciador-SST28 humano
La region ligando de polipeptido inter-dominio LC-Hn existe entre las cistemas del enlace disulfuro entre LC y Hn. Para la insercion de un sitio de ruptura de proteasa, de un espaciador y de una region de resto dirigido a diana (TM) en el bucle de activacion, se usa una de entre una variedad de herramientas de software de traduccion inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon) para determinar la secuencia de ADN que codifica la region ligando. Para la presentacion central de una secuencia de SST28 en el extremo N del dominio Hn, se disena una secuencia de ADN para las regiones de espaciador GS y de resto dirigido a diana (TM) que permite la incorporacion en el clon de cadena principal (SEQ ID 1). La secuencia de ADN se puede disponer como BamHI-Sa/I- espaciador-sitio de activacion de proteasa-SST28-espac/ador-PstI-Xbal-codon de parada-H/ndIII (SEQ ID 5). Una vez disenado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido es creado in si/ico. Es importante asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para el espaciador, SST28 y las secuencias de restriccion y que la secuencia XbaI no viene precedida por las bases TC, lo que dana como resultado la metilacion DAM. La secuencia de ADN es sometida a escrutinio para determinar la secuencia de restriccion incorporada, y cualesquier otros sitios adicionales son eliminados manualmente de la secuencia asegurando que se mantiene un uso de codon de E. co/i comun. El uso de codon de E. co/i se determina mediante programas de software tales como “Graphical Codon Usage Analyser” (Geneart), y se determina el % GC y la ratio de uso de codon usando como referencia tablas de uso de codon publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR4.
Ensamblaje y confirmacion del clon de cadena principal
A fin de crear una construccion de LC-espaciador-sitio de activacion-SST28-espaciador-HN (SEQ ID 25) usando la construccion de cadena principal (SEQ ID 1) y el recien sintetizado vector pCR 4-espaciador-sitio de activacion-TM- espaciador que codifica el TM SST28 (SEQ ID 5), se puede usar un metodo de una o dos etapas; tipicamente se usa el metodo de dos etapas cuando el ADN del TM tiene menos de 100 pares base. Usando el metodo de una etapa, la region de ligando SST28 se puede insertar directamente en la construccion de cadena principal cortando el vector pCR4-espaciador-sitio de activacion-TM-espaciador con enzimas de restriccion Sa/I y PstI e insertando el fragmento de ADN que codifica TM en una construccion de cadena principal de pET cortada de forma similar. Usando el metodo de dos etapas, el dominio LC es escindido del clon de cadena principal usando las enzimas de restriccion BamHI y Sa/I, y es ligado en un vector pCR 4-espaciador-sitio de activacion-TM-espaciador digerido de forma similar. Esto crea un ORF LC-espaciador-sitio de activacion-SST28-espaciador en pCR 4 que puede ser escindido del vector usando las enzimas de restriccion BamHI y PstI para posterior ligacion en una construccion de expresion pET cortada de forma similar. La construccion final contiene el ADN de LC-espaciador-sitio de activacion- SST28-espaciador-HN (SEQ ID 25) que dara como resultado una protema de fusion que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID 26.
Ejemplo 3: Expresion y purificacion de una protema de fusion LHn/A-CP-SST28
Este ejemplo se basa en la preparacion de una protema LHn/A que incorpora un polipeptido de TM de SST28 en la region ligando interdominio (SEQ ID 26), donde el ORF del vector de expresion pET tambien codifica una etiqueta de purificacion de histidina. Estos procedimientos y metodos son aplicables igualmente a otras protemas de fusion, tal como las mostradas en SEQ ID 7-14, 42-48, 57, 60-91. Cuando es apropiado, la enzima de activacion debena ser seleccionada para ser compatible con el sitio de activacion de proteasa de cada secuencia.
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La expresion de la protema LHn/A-CP-SST28 se logra usando el siguiente protocolo. Inocular 100 mL de TB modificado que contiene 0,2% de glucosamina y 30 pg/mL de canamicina en un matraz de 250 mL con una unica colonia de la cepa de expresion de LHA-CP-SST28. Desarrollar el cultivo a 37°C, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 L de TB modificado que contiene 0,2 % de glucosamina y 30 pg/mL de canamicina en un matraz de 2 L con 10 mL de cultivo de una noche. Desarrollar los cultivos a 37°C hasta alcanzar una DO600 nm de aproximadamente 0,5, momento en el cual se reduce la temperatura a 16°C. Despues de 1 hora, inducir los cultivos con IPTG 1 mM y cultivar a 16°C durante otras 16 horas.
Purificacion de la protema LHn/A-CP-SST28
Descongelar un tubo falcon que contiene 35 mL de HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL21 (DE3). Homogeneizar la pasta celular (1,38 bar, 20 psi) asegurando que la muestra permanece fna. Hacer girar las celulas lisadas a 18 000 rpm, 4°C durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna Quelante cargada de NisO4 0,1 M (20-30 mL de columna son suficientes) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente por etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, eliminar por lavado la protema ligada no espedfica y eluir la protema de fusion con imidazol 200 mM. La protema de fusion elrnda se dializa contra 5 L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM a 4°C durante una noche, y se mide la DO280 nm para establecer la concentracion de protema. Anadir 3,2 pL de enteroquinasa (New England Biolabs) por mg de protema de fusion e incubar en condiciones estaticas durante una noche a 25°C. Cargar en una columna Quelante cargada de NisO4 0,1 M (20-30 mL de columna son suficientes) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Lavar la columna hasta lmea base con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente por etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, eliminar por lavado la protema ligada no espedfica y eluir la protema de fusion con imidazol 200 mM. Dializar la protema de fusion elrnda contra 5L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM a 4°C durante una noche y concentrar la fusion hasta aproximadamente 2 mg/mL, tomar una almuota de muestra y congelar a -20°C. Evaluar la protema purificada usando DO280, BCA y analisis de pureza.
Ejemplo 4: Construccion de LHn/D-CT-GS20-CST28
El siguiente procedimiento crea un clon para uso como construccion de expresion para la expresion de fusion multidominio en la que el resto dirigido a diana (TM) es presentado C-terminalmente al dominio de traslocalizacion. Este ejemplo se basa en la preparacion de la fusion LHn/D-CT-GS20-CST28 (SEQ ID 17), aunque los procedimientos y los metodos son igualmente aplicables para crear otras fusiones de proteasa, traslocalizacion y TM, en donde el TM es C-terminal respecto al dominio de traslocalizacion. En este ejemplo, se disena un espaciador flanqueante de glicina-serina de 20 aminoacidos en la secuencia interdominio para asegurar la accesibilidad del ligando a su receptor, pero tambien son aplicables otros espaciadores.
Preparacion de injerto de espaciador-CST28 humano
Para la presentacion de una secuencia CST28 en el extremo C del dominio HN, se disena una secuencia de ADN para que flanquee a las regiones del espaciador y del resto dirigido a diana (TM), permitiendo la incorporacion en el clon de cadena principal (SEQ ID n4). La secuencia de ADN puede disponerse como BamHI-SalI-PstI-XbaI- espaciador-CST28-codon de parada-HindIII (SEQ ID 6). La secuencia de ADN se puede disenar usando una entre una variedad de herramientas de software de traduccion (por ejemplo, EditSeq proporciona la mejor traduccion inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una vez disenado el ADN del TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido es creado in silico. Es importante asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para el espaciador, CST28 y las secuencias de restriccion y que la secuencia XbaI no viene precedida por las bases TC, lo que dana como resultado una metilacion DAM. La secuencia de ADN es sometida a escrutinio en terminos de secuencias de restriccion incorporadas y se eliminan cualesquier secuencias adicionales manualmente de la secuencia remanente, asegurando que se mantiene un uso de codon de E. coli comun. El uso de codon de E. coli se determina en referencia a programas de software tales como “Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)”, y se determina el contenido de GC% y la ratio de uso de codon en referencia a tablas de uso de codon publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada es sintetizada a continuacion comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmacion del clon de cadena principal
A fin de crear una construccion LHn/D-GS20-CST28 (SEQ ID 17) usando la construccion de cadena principal (SEQ ID 4) y el recien sintetizado vector pCR 4-espaciador-TM que codifica el TM CST28 (SEQ ID 6), se puede usar un metodo de una o dos etapas; tipicamente se usa el metodo de dos etapas cuando el ADN del TM tiene menos de 100 pares base. Usando el metodo de una etapa, el CST28 se puede insertar directamente en la construccion de cadena principal cortando el vector pCR4-espaciador-TM con enzimas de restriccion XbaI y HindIII e insertando el fragmento de ADN que codifica tM en una construccion de cadena principal de pET cortada de forma similar. Usando el metodo de dos etapas, el dominio LHn es escindido del clon de cadena principal usando las enzimas de restriccion BamHI y XbaI, y es ligado en un vector pCR 4-espaciador-CST28 digerido de forma similar. Esto crea un
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ORF LHN-espaciador-CST28 en pCR 4 que puede ser escindido del vector usando las enzimas de restriccion BamHI y HindIII para posterior ligacion en una construccion de expresion pET cortada de forma similar. La construccion final contiene el aDn de LC-ligando-HN-espaciador-CST28 (sEq ID l7) que dara como resultado una protema de fusion que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID 18.
Ejemplo 5: Expresion y purificacion de una protema de fusion LHn/D-CT-CST28
Este ejemplo se basa en la preparacion de una protema LHn/D que incorpora un polipeptido de TM CST28 en el extremo carboxilo del dominio Hn (SEQ ID 18), donde el ORF del vector de expresion pET tambien codifica una etiqueta de purificacion de histidina. Estos procedimientos y metodos son igualmente aplicables a secuencias de protemas de fusion tales como las mostradas en las SEQ ID 15, 16, 18-24, 27-31, 33-41, 58-59 y 93-94. Cuando sea apropiado, la enzima de activacion debena seleccionarse para ser compatible con el sitio de activacion de proteasa de cada secuencia.
Expresion de LHn/D-CT-CST28
La expresion de la protema LHn/D-CT-CST28 se consigue usando el siguiente protocolo. Inocular 100 mL de TB modificado que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 pg/mL de canamicina en un matraz de 250 mL con una unica colonia de la cepa de expresion de LHn/D-CT-CST28. Desarrollar el cultivo a 37°C, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 L de TB modificado que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 pg/ml de canamicina en un matraz de 2 L con 10 mL de cultivo de una noche. Desarrollar los cultivos a 37°C hasta alcanzar una DO600 nm aproximada de 0,5, punto en el cual se reduce la temperatura hasta 16°C. Despues de 1 hora, inducir los cultivos con IPTG 1 mM y cultivar a 16°C durante otras 16 horas.
Purificacion de la protema LHnD-CT-CST28
Descongelar un tubo falcon que contiene 35 mL de HEPES 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL21 (DE3). Homogeneizar la pasta celular (1,38 bar, 20 psi) asegurando que la muestra permanece fna. Hacer girar las celulas lisadas a 18 000 rpm, 4°C durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna Quelante cargada de NisO4 0,1 M (20-30 mL de columna son suficientes) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente por etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, eliminar por lavado la protema ligada no espedfica y eluir la protema de fusion con imidazol 200 mM. La protema de fusion elrnda se dializa contra 5 L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM a 4°C durante una noche, y se mide la DO280 nm para establecer la concentracion de protema. Anadir 3,2 pL de enteroquinasa (New England Biolabs) por mg de protema de fusion e incubar en condiciones estaticas durante una noche a 25°C. Cargar en una columna Quelante cargada de NisO4 0,1 M (20-30 mL de columna son suficientes) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Lavar la columna hasta lmea base con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente por etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, eliminar por lavado la protema ligada no espedfica y eluir la protema de fusion con imidazol 200 mM. Dializar la protema de fusion elrnda contra 5L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM a 4°C durante una noche y concentrar la fusion hasta aproximadamente 2 mg/mL, tomar una almuota de muestra y congelar a -20°C. Evaluar la protema purificada usando DO280, BCA y analisis de pureza. Las Figuras 1 y 2 demuestran la purificacion de las protemas de fusion analizadas mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 6: Conjugacion quimica de LHn/A a TM de SST
El siguiente procedimiento crea una molecula conjugada qmmicamente que contiene la secuencia de aminoacidos LHn/A (SEQ ID 49), preparada a partir de la SEQ ID 1 usando el metodo de produccion descrito en el ejemplo 3, y un peptido de octreotide sSt que ha sido sintetizado qmmicamente (SEQ ID 54). Sin embargo, los procedimientos y los metodos son igualmente aplicables para la conjugacion de otros peptidos tales como SEQ ID 55 y SEQ ID 56 a las protemas de dominio de proteasa/traslocalizacion tales como las que contienen las secuencias de aminoacidos SEQ ID 50, 51, 52 y 53.
La protema LHn/A fue cambiada de disolucion tampon, de Hepes 50 mM sal 150 mM a PBSE (Na2HPO4 100 mM, 14,2 g; NaCl 100 mM, 5,85 g; EDTANa2 1 mM, pH 7,5 con HCl 1 M) usando la columna Bio-rad PD10. Esto se realizo lavando un volumen de columna de PBSE a traves de la columna PD10, a continuacion se anadio la protema a la columna hasta que no quedaran mas gotas al final de la columna PD10. Entonces se anadieron 8 mL de PBSE y se toman fracciones de 0,5 mL. Las fracciones recolectadas son medidas usando lecturas A280 y las fracciones que contienen la protema son agrupadas. Se obtuvo una concentracion de 1,55 mg/mL de LHn/A en la etapa de intercambio de disolucion tampon, y esta se uso para fijar las siguientes reacciones:
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LHn/A 1,55 mg/mL
SPDP o Sulfo-LC-SPDP 20 mM
A 200 |JL
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B 200 jL
Aumento de 400% 0,62 jL
C 200 jL
Aumento de 800% 1,24 jL
Las muestras se dejaron tumbadas a temperatura ambiente durante 3 horas antes de ser llevadas a otra columna PD10 para cambiar el tampon a PBSE y de que las fracciones que conteman la protema fueran agrupadas. A continuacion se anadio una concentracion final de DTT de 25 mM a la protema derivatizada y despues las muestras fueron dejadas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se tomaron entonces lecturas de A280 y A343 para procesar la ratio de la interaccion SPDP:LHn/A, y la reaccion que dio como resultado una relacion de derivatizacion de entre 1 y 3 se uso para la conjugacion de peptido. El reactivo SPDP se une a las aminas primarias de LHn/A a traves de un ester de N-hidroxisuccinimida (NHS), dejando la porcion de sulfhidrilo reactivo para formar un enlace disulfuro con el grupo SH libre de la cistema libre del peptido sintetizado. En este caso, la secuencia de peptido es Octreotide, que ha sido sintetizado con una cistema libre en el extremo N (SEQ ID 91). El LHn/A derivatizado con SPDP fue mezclado con un exceso 4 a 1 del ligando de Octreotide y despues se dejo la reaccion a temperatura ambiente durante 90 minutos con agitacion. El octreotide de exceso fue eliminado a continuacion usando una columna PD10 dando lugar a la molecula conjugada de LHN/A-Octreotide.
Ejemplo 7: Actividad de SST-LHn/A en celulas neuroendocrinas cultivadas (AtT20)
La lmea de celulas de tumor de pituitaria de rata AtT20 es un ejemplo de lmea celular de origen endocrino. Por tanto, representa un modelo de lmea celular para la investigacion de los efectos de inhibicion-de-liberacion de los agentes.
Las celulas AtT20 poseen receptores superficiales que permiten la union, y la internalizacion, de SST-LHn/A. Por el contrario, las celulas AtT20 carecen de receptores adecuados para neurotoxinas clostridiales y por lo tanto no son susceptibles a neurotoxinas botulmicas (BoNTs).
La Figura 3 (a) ilustra la inhibicion de la liberacion de ACTH desde celulas AtT20 despues de una incubacion previa con SST-LHn/A. Es evidente que se produce una inhibicion dependiente de la dosis, lo que indica que el SST-LHn/A puede inhibir la liberacion de ACTH desde un modelo de celula endocrina. Se demostro que la inhibicion de la liberacion de ACTH se correlaciona con la ruptura de la protema SNARE SNAP25 (Figura 3 (a) y (b)). De esta manera, la inhibicion de la liberacion del mensajero qmmico es debida a un efecto mediado por endopeptidasa clostridial de la ruptura de protema SNARE.
Materiales y metodos
Los kits de inmunoensayo de enzima ACTH se obtuvieron en Bachem Research Inc., CA, EE.UU. Los reactivos para el ensayo de transferencia Western se obtuvieron en Invitrogen y Sigma. Las celulas AtT20 fueron sembradas en placas de 12 pocillos y se cultivaron en DMEM que contema un 10% de suero bovino fetal, Glutamax 4 mM. Despues de 1 dia se aplico SST-LHn/A durante 72 horas y despues las celulas fueron lavadas para eliminar el SST- LHn/a no ligado. La secrecion de ACTH fue estimulada elevando la concentracion de potasio extracelular (KCl 60 mM) y de calcio extracelular (CaCl2 5 mM) durante 30 minutos. Se recolecto el medio de las celulas y se almaceno a -20°C hasta la determinacion del contenido de ACTH usando el kit de inmunoensayo y siguiendo las instrucciones del fabricante. Las celulas fueron solubilizadas en tampon de muestreo reductor de electroforesis 1x LDS, calentadas durante 10 minutos a 90°C y despues almacenadas a -20°C hasta ser usadas para el ensayo de transferencia Western. La secrecion estimulada se calculo restando la liberacion basal de la liberacion total en condiciones de estimulacion. Las muestras celulares solubilizadas fueron separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La proteolisis de SNAP-25, un componente crucial del proceso neurosecretor y el sustrato para la actividad de endopeptidasa dependiente de cinc de BoNT/A, fue detectada a continuacion sondeando con un anticuerpo que reconozca tanto la forma intacta como la dividida de la SNAP-25. La cuantificacion de la proteolisis se realizo mediante analisis de imagen usando el sistema de imagen Synoptics Syngene GeneGnome y el software GeneTools.
Ejemplo 8: Actividad de SST-LHn/D en celulas neuroendocrinas cultivadas (GH3)
La lmea celular de pituitaria de rata GH3 es un ejemplo de lmea celular de origen neuroendocrino. Por tanto, representa una lmea celular modelo para la investigacion de los efectos de inhibicion-de-liberacion de los agentes.
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Las celulas GH3 poseen receptores superficiales que permiten la union, y la internalizacion de SST-LHn/D. Por el contrario, las celulas GH3 carecen de receptores adecuados para neurotoxinas clostridiales y por lo tanto no son susceptibles a las neurotoxinas botulmicas (BoNTs).
La Figura 4 ilustra la inhibicion de la liberacion de hormona de crecimiento (GH) desde celulas GH3 antes de la incubacion con SST-LHn/D. Es evidente que se observa una inhibicion dependiente de la dosis, que indica que el SST-LHn/D puede inhibir la liberacion de GH desde un modelo de celula neuroendocrina.
La comparacion de los efectos de inhibicion observados con el conjugado y el LHn/D no atacado demuestran la contribucion del resto dirigido a diana (TM) en la inhibicion eficiente de la liberacion de transmisor.
Materiales y metodos
Los kits de inmunoensayo de enzima GH fueron obtenidos en Millipore, MA, EE.UU. Las celulas GH3 fueron cultivadas en placas de 24 pocillos en mezcla de nutrientes F-10 (Ham) suplementada con un 15% de suero equino, 2,5% de FBS, L-glutamina 2 mM. Las celulas fueron tratadas con SST-LHn/D o LHn/D durante 72 horas, despues fueron lavadas para eliminar el SST-LHn/D no ligado. La secrecion se estimulo exponiendo las celulas a tetradecanoil forbol acetato (TPA, PMA) 10 pM durante 30 minutos. Se recolecto el medio de las celulas y se almaceno a -20°C hasta evaluacion del contenido de GH usando el kit de inmunoensayo y siguiendo las instrucciones del fabricante. La secrecion estimulada se calculo restando la liberacion basal de la liberacion total en condiciones de estimulacion.
Ejemplo 9: Metodo para aliviar sintomas acromegalicos reduciendo los niveles elevados de GH e IGF-1 consecuencia de un adenoma pituitario
Un miembro de 35 anos de edad de un equipo masculino de badminton es sometido a un examen de rayos-X espinal por un dolor de espalda. El personal que le atiende detecta un crecimiento oseo anormal y, tras preguntar, el hombre informa de incidentes crecientes de apnea del sueno y tambien de un aumento del contenido graso de la piel.
El medico recomienda la medicion de la IGF-1 en circulacion y se observa que los niveles son elevados. Ensayos posteriores tambien muestran niveles de GH en circulacion por encima de lo normal, por lo que se realiza un escaner de IRM. Este muestra un tumor pituitario de 9 mm de diametro. El paciente es tratado con una protema de fusion de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31) mediante inyeccion i.v.
A intervalos de 1 semana se mide el nivel de IGF-1 en circulacion y se observa que es inferior a la primera medida y que se reduce constantemente hasta un 15% por encima de lo normal a lo largo de las siguientes seis semanas. Se observa que el nivel de GH en circulacion es normal en ese momento. Una dosis adicional de la medicacion con mediciones del nivel de IGF-1 quincenales demuestra que dicha hormona se ha estabilizado en el nivel superior del intervalo normal. A las seis semanas del segundo tratamiento, un escaner de IRM craneal revela una reduccion del tumor hasta los 6 mm. Se continua con la terapia en dosis reducidas en intervalos bimensuales, midiendo los niveles de IGF-1 y GH a la septima semana. Ambos resultan estables en el rango normal y la apnea del sueno y la piel aceitosa han desaparecido. Un examen de rayos-X espinal un ano despues del primer tratamiento demuestra que no hay ningun aumento de tamano oseo desde la observacion original.
Ejemplo 10: Metodo para normalizar dedos hirsutos hinchados reduciendo niveles elevados de GH e IGF-1 consecuencia de un adenoma pituitario
Una trabajadora de pastelena de 50 anos de edad presenta una dificultad creciente para quitarse su anillo de boda y finalmente visita a su medico de familia. El medico tambien detecta que los dedos de la paciente tienen mas vello de lo esperado y, tras ser preguntada, la paciente admite que ambas condiciones han aparecido gradualmente. Ensayos clmicos posteriores revelan un nivel por encima de la media de GH en circulacion que no cambia tras ingerir una bebida rica en glucosa. Se sospecha la presencia de una afeccion acromegalica y un escaner CT craneal confirma la presencia de un pequeno tumor pituitario.
La cirugfa es considerada inapropiada por lo que el paciente es tratado con una inyeccion i.v. de una protema de fusion de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Despues de cuatro semanas el ensayo de tolerancia de glucosa muestra que la respuesta en los niveles de GH y en los niveles de IGF- 1 es proxima a lo normal. El tratamiento es continuado en intervalos de seis semanas y al final de la decimoctava semana la paciente es capaz de quitarse el anillo facilmente y el hirsutismo ha desaparecido.
Ejemplo 11: Metodo para aliviar las consecuencias de un adenoma pituitario secretor de hormona de crecimiento re-emergente
Un hombre buzo de 52 anos de edad se presenta con smtomas acromegalicos cada vez mas destacados, que incluyen hinchamiento de tejidos blandos y agrandamiento de las extremidades. Unas pruebas exhaustivas confirman la presencia de un adenoma pituitario de 12 mm. El paciente tolera mal los analogos de somatostatina, por lo que el tumor es reseccionado y pruebas regulares a lo largo de 2 anos muestran que los niveles de GH y de
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IGF-1 se encuentran en el rango superior de lo normal y no se administra ninguna medicacion adicional. Dieciocho meses despues, tras presentarse con hiperhidrosis e hipertension moderada, se observa que los niveles de GH y de IGF-1 estan por encima de lo normal y un escaner CT revela un recrecimiento del adenoma pituitario. Una reseccion repetida se considera no deseada.
El hombre es tratado mediante administracion i.v. de una protema de fusion de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Tambien se administra un curso de radioterapia y despues de cuatro semanas la hiperhidrosis y la hipertension estan cerca de lo normal, al igual que los niveles de GH y de IGF-1. A lo largo de los tres anos siguientes los smtomas no muestran recurrencia y no hay recrecimiento tumoral despues de cinco anos del tratamiento.
Ejemplo 12: Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina
Despues de seis anos de control con exito de los niveles de GH y de IGF-1 en circulacion mediante analogos de somatostatina, una lectora de tarot de feria acromegalica de 60 anos de edad informa de un evidente aumento de piel aceitosa y de un olor corporal prominente como resultado de hiperhidrosis. Se observa que es intolerante a la glucosa y que presenta niveles elevados de IGF-1 en circulacion y la elevacion de la dosis de SSA no los controla.
Es tratada mediante inyeccion localizada de una protema de fusion de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). A los 14 dfas la paciente informa de una reduccion significativa de la sudoracion. A lo largo del siguiente mes su piel aceitosa vuelve a la normalidad y en ese momento sus niveles de GH y de IGF-1 se hayan ambos dentro del rango normal. Esta situacion se mantiene durante los siguientes cinco anos.
Ejemplo 13: Metodo para tratar la enfermedad de Cushing en pacientes intolerantes a analogos de somatostatina
Una estudiante de 30 anos de edad visita a su medico general para solicitar tratamiento para la ansiedad y la depresion. El medico observa que la mujer tiene una cara redondeada con un aumento de grasa en el cuello y tambien brazos y piernas mas delgados de lo normal. Tras preguntar, ella confirma un ciclo menstrual irregular. Se mide un nivel de cortisol urinario libre de 24-horas de 150 |jg, lo que sugiere un smdrome de Cushing. Un escaner de IRM abdominal no muestra tumores adrenales presentes, aunque un escaner de IRM craneal revela un pequeno tumor pituitario.
La paciente se considera inadecuada para intervencion quirurgica por lo que es tratada con una protema de fusion de Tm de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., sEq ID 7-16, 18-24, 26-31).
Ejemplo 14: Metodo para revertir la impotencia sexual femenina a traves del tratamiento de prolactinoma
Una mujer de 36 anos de edad visita a su doctor, preocupada por una reciente expresion de leche materna, a pesar de presentar un negativo en la prueba de embarazo. Un examen tambien indica sequedad vaginal y ella confirma que ha perdido la libido. Los resultados de las pruebas clmicas son normales en general con la excepcion notable de una moderada hiperprolactinemia. Un escaner de IRM craneal indica un adenoma pituitario, consistente con los niveles elevados de prolactina.
Es tratada mediante administracion oral con una preparacion de una protema de fusion de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Despues de ocho dfas ya no expresa leche materna y sus niveles de humedad vaginal han mejorado significativamente. Despues de siete semanas la sequedad comienza a reaparecer pero es revertida casi inmediatamente mediante un segundo tratamiento. Los tratamientos continuan en visitas cada seis semanas a la clmica de salud sexual, donde la mujer informa de haber vuelto a su actividad sexual normal.
Ejemplo 15: Metodo para recuperar la perdida de peso a traves del tratamiento de insulinoma
Una mujer de 64 anos de edad con un IMC de 39 ha sido diagnosticada con insulinoma inoperable. Desea conseguir una reduccion sostenida del apetito y del peso que le permitan mantener un interes activo por el ejercicio ffsico, por lo que es tratada mediante inyeccion sistemica de una protema de fusion que comprende un TM de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). En el plazo de 10 a 14 dfas despues del tratamiento su ganancia de peso se ha estabilizado y a los 30 dfas se produce una perdida de peso. La paciente mantiene una perdida de peso significativa siempre que se mantenga la medicacion con una serie de inyecciones cada 24 semanas.
Ejemplo 16: Metodo para tratar el glucagonoma
Una mujer de 63 anos de edad visita a su doctor en un estado angustiado, habiendo desarrollado sarpullidos en las nalgas, alrededor de las ingles y en la parte inferior de las piernas. Los analisis sangumeos demuestran que es anemica y diabetica. Tambien padece episodios diarreicos frecuentes. El medico sospecha la presencia de glucagonoma y un escaner CT confirma la existencia de un tumor en la cola del pancreas.
La paciente es tratada con una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Tras 4 semanas, los episodios diarreicos han remitido y los sarpullidos se han
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reducido significativamente. Su recuento sangumeo de globulos rojos tambien ha vuelto a la normalidad. El tratamiento se repite en intervalos de seis semanas y los smtomas permanecen de forma general bajo control.
Ejemplo 17: Metodo para tratar la diarrea y el rubor producido por el VIPoma
Un hombre de 49 anos de edad padece diarrea secretora asociada a rubor clmico. Las pruebas clmicas indican acidosis metabolica, y un escaner CT abdominal revela un tumor -casi con total seguridad un VIPoma- cerca del pancreas.
La cirugfa no esta disponible para el paciente por lo que es tratado con una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). En 3 semanas el rubor se ha frenado y la diarrea se ha vuelto menos frecuente. A las siete semanas despues del tratamiento todos los smtomas han desaparecido y permanecen ausentes siempre que se repita la terapia en intervalos de aproximadamente 8 semanas.
Ejemplo 18: Metodo para tratar el gastrinoma
Un hombre de 47 anos de edad padece de ulceracion peptica grave que produce un dolor abdominal debilitante. Tambien experimenta episodios diarreicos inexplicables y finalmente se le diagnostica un gastrinoma intrapancreatica a traves de analisis de sangre y un estudio de ultrasonidos abdominal.
Es tratado mediante inyeccion intra-tumoral de una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31), o una fusion que comprende un TM de peptido GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94). En una semana los smtomas gastricos dolorosos comienzan a mejorar. La hipergastrinemia ha remitido y los episodios diarreicos se han reducido en gravedad y en frecuencia. Este estatus permanece durante 7 semanas pero los niveles de gastrina en sangre comienzan a elevarse de nuevo despues de eso. Se repite la terapia en intervalos de 7 semanas y esto mantiene la gastrina en sangre en niveles normales y no reaparece ningun otro smtoma.
Ejemplo 19: Metodo para tratar la tirotoxicosis producida por un tirotrofinoma
Una mujer de 39 anos de edad miembro de tripulacion de cabina de una lmea aerea visita a su medico quejandose de una sudoracion excesiva, ligada a nerviosismo previamente desconocido, que han comenzado a afectar a su capacidad para llevar a cabo su trabajo. Durante la consulta se evidencia un ligero temblor y el doctor sospecha de una tirotoxicosis. La mujer es derivada a un endocrinologo que lleva a cabo una serie de pruebas sangumeas. Las principales anormalidades detectadas son niveles elevados de tiroxina, pero tambien hay niveles elevados de TSH (tirotrofina), indicativo de un tirotrofinoma. Un escaner de IRM de la cabeza confirma la presencia de un tumor pituitario.
La mujer es tratada con una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Tanto la sudoracion como el nerviosismo remiten a lo largo de las siguientes dos semanas. Las pruebas sangumeas quincenales de seguimiento muestran una cafda de los niveles tanto de tiroxina como de tirotrofina, y alcanzan niveles normales a las seis semanas. La paciente es capaz de recuperar completamente su actividad laboral.
Ejemplo 20: Metodo para tratar el hinchamiento recurrente de tejidos blandos producido por la acromegalia
Una mujer de 72 anos, que ya habfa sido sometida a cirugfa transesfenoidal para eliminar un macroadenoma pituitario, presenta recurrencia de smtomas acromegalicos (principalmente hinchamiento de dedos y lengua y aumento de cansancio y letargia). Un escaner de IRM craneal revela la presencia de un microadenoma pituitario putativo y los analisis sangumeos posteriores confirman niveles elevados de GH e IGF-1 en circulacion.
Se considera que la cirugfa es incompatible con las afecciones medicas pre-existentes de tal modo que es tratada con una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Despues de una semana informa de que se siente mas activa de forma general y que el hinchamiento de dedos y lengua se han reducido notablemente. A las tres semanas los smtomas recurrentes han revertido completamente y un examen endocrinologico confirma la normalizacion de los niveles de GH e IGF-1. Es monitorizada de forma mensual y se le administran tratamientos repetidos en intervalos de 10 semanas. Este regimen de dosis mantiene los niveles hormonales dentro del rango normal y evita la recurrencia de los smtomas.
Ejemplo 21: Metodo para tratar el hirsutismo facial excesivo producido por la enfermedad de Cushing
Una consultora estetica de 27 anos de edad comienza a desarrollar un crecimiento de vello facial evidente. Este no es tratado adecuadamente mediante metodos depilatorios estandar y esta generando problemas psicologicos graves (ansiedad, depresion) tanto en el ambito laboral como en su vida personal. Su medico sospecha de la existencia de un smdrome de Cushing por lo que es derivada a un endocrinologo. Las pruebas de sangre y orina revelan niveles elevados de cortisol y ACTH, y una prueba de estimulacion de CRH da positivo, confirmando la probabilidad de un
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tumor pituitario secretor de ACTH. Los escaneres CT adrenal y pituitario confirman la presencia de un tumor pituitario pero no de anormalidad adrenal.
Tras debatir con los medicos, la paciente opta por una intervencion medica y es tratada con una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-3l), o una fusion que comprende un TM de peptido de GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94). A los diez dfas la mujer comienza a sentirse mas positiva y a partir de las dos semanas pasa a usar las cremas decolorantes o depilatorias con una frecuencia mucho menor. Los smtomas comienzan a reaparecer alrededor de las diez a doce semanas por lo que se administra un segundo tratamiento. Se produce un patron similar de remision de smtomas, reaparicion gradual y tratamiento. Durante el tercer tratamiento, la paciente elige una eliminacion quirurgica del tumor pituitario. Una monitorizacion de seguimiento durante los dos siguientes anos evidencia la no recurrencia de los smtomas o del tumor.
Ejemplo 22: Metodo para tratar la galactorrea masculina producida por el prolactinoma
Un jugador de rugby de 40 anos de edad ha estado preocupado durante algun tiempo por un aumento del tamano pectoral mas alla de lo esperable por el entrenamiento. Se muestra muy preocupado cuando observa un goteo de leche en el pecho izquierdo. Su medico sospecha inmediatamente de la existencia de un prolactinoma pituitario y lo deriva a un radiologo y al endocrinologo. La analftica sangumea revela hiperprolactinemia pero una funcion tiroidea normal. Un escaner de IRM craneal muestra la presencia de un tumor pituitario.
En ausencia de cualquier efecto de masa tumoral, el hombre es tratado con una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 2631). Despues de tan solo cuatro dfas la expresion de leche ha cesado y tras seis semanas se ha producido una reduccion medible del tejido pectoral no muscular. Durante este periodo, se midio quincenalmente el nivel de prolactina en sangre y habfa retornado a la normalidad para la medida de la cuarta semana. El tratamiento se repite en intervalos de 12 semanas, tiempo durante el cual no hay recurrencia de smtomas ni indicacion de crecimiento tumoral. La cirugfa u otro tratamiento reductor del tumor son considerados innecesarios mientras se mantengan estas condiciones.
Ejemplo 23: Metodo para tratar smtomas multiples producidos por el insulinoma
Un hombre de 51 anos de edad es diagnosticado con insulinoma despues de presentarse al doctor con una variedad de afecciones de aparicion reciente que incluyen vision borrosa, palpitaciones, debilidad, amnesia y, en dos ocasiones en tres meses, desvanecimiento. El diagnostico es confirmado mediante pruebas endocrinologicas y radiograficas.
Es tratado con una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un TM de peptido de somatostatina o cortistatina (p.ej., SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31), o una fusion que comprende un TM de peptido de GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94). En una semana su vision y sus niveles de energfa han vuelto a la normalidad y continua mejorando a lo largo de la siguiente quincena. A las cuatro semanas ya no es hipoglucemico y en ese momento se lleva a cabo la enucleacion laparoscopica de un tumor de cabeza pancreatica. La posterior monitorizacion del paciente no registra reaparicion de smtomas o de masa tumoral y el paciente permanece sano despues de tres anos.
Ejemplo 24: Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina
Tras 3 anos de control con exito de los niveles de GH e IGF-1 en circulacion mediante analogos de somatostatina, una trabajadora de oficina acromegalica de 54 anos de edad informa de un incremento obvio de una condicion de piel aceitosa y tambien de un olor corporal prominente como resultado de una hiperhidrosis. Se descubre que es tolerante a la glucosa y que presenta niveles elevados de IGF-1 en circulacion, y una dosis creciente de SSA no los controla.
Es tratada mediante inyeccion intravenosa de una protema de fusion que comprende un TM de peptido de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (p.ej., SEQ ID 34, 42-47, 60-92). A los 14 dfas, la paciente informa de una reduccion significativa de la sudoracion. A lo largo del siguiente mes su piel aceitosa retorna a la normalidad y en ese momento los niveles de GH e IGF-1 estan ambos en el rango normal. Esta situacion se mantiene a lo largo de los siguientes cinco anos.
Ejemplo 25: Metodo para tratar la enfermedad de Cushing en pacientes intolerantes a analogos de somatostatina
Una recepcionista de 37 anos de edad visita a su medico de cabecera para solicitar un tratamiento para la ansiedad y la depresion. El medico observa que la mujer presenta una cara redonda con un aumento de grasa alrededor del cuello y tambien con brazos y piernas normales. Tras ser preguntada, confirma un ciclo menstrual irregular. Se mide un nivel de cortisol libre urinario de 24 horas de 150 |jg, lo que sugiere la presencia de un smdrome de Cushing. Un escaner de IRM abdominal no detecta tumores adrenales presentes, pero un escaner de IRM craneal revela un pequeno tumor pituitario.
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La paciente se considera inadecuada para intervencion quirurgica por lo que es tratada con una inyeccion intravenosa de protema de fusion que comprende un TM de peptido de urotensina (p.ej., SEQ ID 48).
Ejemplo 26: Metodo para revertir la impotencia sexual femenina a traves del tratamiento del prolactinoma
Una mujer de 28 anos de edad visita a su doctor, preocupada por una reciente expresion de leche materna, a pesar de presentar un negativo en la prueba de embarazo. Un examen tambien indica sequedad vaginal y ella confirma que ha perdido la libido. Los resultados de las pruebas clmicas son normales en general con la excepcion notable de una moderada hiperprolactinemia. Un escaner de IRM craneal indica un adenoma pituitario, consistente con los niveles elevados de prolactina.
Es tratada mediante administracion intravenosa con una protema de fusion que comprende un TM de peptido de grelina (GHRP) (p.ej., SEQ ID 33, 35, 38), o con una fusion que comprende un TM de peptido GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94). Despues de cuatro dfas ya no expresa leche materna y sus niveles de humedad vaginal han mejorado significativamente. Despues de trece semanas la sequedad comienza a reaparecer pero es revertida casi inmediatamente mediante un segundo tratamiento. Los tratamientos continuan en visitas cada doce semanas a la clmica de salud sexual, donde la mujer informa de haber vuelto a su actividad sexual normal.
Ejemplo 27: Metodo para tratar la enfermedad de Cushing
Una mecanografa de 30 anos de edad visita a su medico de cabecera para solicitar un tratamiento para la ansiedad y la depresion. El medico observa que la mujer presenta una cara redonda con un aumento de grasa alrededor del cuello y tambien con brazos y piernas mas delgados de lo normal. Tras ser preguntada, confirma un ciclo menstrual irregular. Se mide un nivel de cortisol libre urinario de 24 horas de 200 |jg, lo que sugiere la presencia de un smdrome de Cushing. Un escaner de IRM abdominal no detecta tumores adrenales presentes, pero un escaner de IRM craneal revela un pequeno tumor pituitario.
La paciente se considera inadecuada para intervencion quirurgica por lo que es tratada con una protema de fusion que comprende un TM de peptido de bombesina (GRP) (p.ej., SEQ ID 40-41), o una fusion que comprende un TM de peptido GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94).
Ejemplo 28: Metodo para tratar el gastrinoma
Un hombre de 63 anos de edad padece una ulceracion peptica grave que produce dolor abdominal debilitante. Tambien experimenta episodios diarreicos inexplicables y finalmente se le diagnostica un gastrinoma intrapancreatico por los analisis de sangre y por un estudio abdominal de ultrasonidos.
Es tratado mediante inyeccion intra-tumoral de una medicacion que consiste en una protema de fusion que comprende un analogo de TM de peptido de somatostatina o cortistatina (octreotide - sEq ID 54), que ha sido conjugado qmmicamente a la protema proteasa-traslocalizacion (p.ej., SEQ ID 49-53). En una semana los smtomas gastricos dolorosos comienzan a mejorar. La hipergastrinemia ha remitido y los episodios diarreicos se han reducido en gravedad y frecuencia. Dicho estatus se mantiene durante 8 semanas, pero despues de eso los niveles de gastrina en sangre comienzan a elevarse. Se repite la terapia en intervalos de 8 semanas y esto mantiene la gastrina en sangre en niveles normales, y ningun otro smtoma muestra recurrencia.
Ejemplo 29: Metodo para aliviar los smtomas acromegalicos reduciendo los niveles elevados de GH e IGF-1 resultantes de un adenoma pituitario
Una mujer de 50 anos de edad informa a su medico de cabecera de incidentes crecientes de apnea del sueno y tambien de un aumento de piel aceitosa, y el medico de cabecera observa un crecimiento oseo anormal. El medico de cabecera recomienda medir el nivel de IGF-1 en circulacion y se observa que es elevado. Pruebas posteriores tambien muestran niveles de GH en circulacion por encima de lo normal, por lo que se realiza un escaner de IRM craneal. Este muestra un tumor pituitario de 5 mm de diametro. La paciente es tratada con una protema de fusion de MCH (p.ej., SEQ ID 57) mediante inyeccion i.v.
A intervalos de 1 semana se determinan los niveles de IGF-1 en circulacion y se observa que son inferiores a la primera medida y que se reducen constantemente hasta un 5% por encima de lo normal a lo largo de las siguientes ocho semanas. Se observa que el nivel de GH en circulacion es normal en ese momento. Una dosis adicional de la medicacion con medidas de IGF-1 cada dos semanas muestra que dicha hormona se ha estabilizado en el extremo superior del rango normal. A las seis semanas del segundo tratamiento un escaner de IRM craneal revela una reduccion del tumor hasta los 3 mm. Se continua con la terapia con una dosis reducida en intervalos de dos meses, midiendose los niveles de IGF-1 y GH en la septima semana. Ambos son estables en el rango normal y tanto la apnea del sueno como la piel aceitosa han desaparecido.
Ejemplo 30: Metodo para tratar pacientes acromegalicos resistentes a analogos de somatostatina
Despues de 1 ano de control con exito de los niveles de GH e IGF-1 en circulacion mediante analogos de somatostatina, un operario de excavadora acromegalico de 40 anos de edad informa de un evidente aumento de piel
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aceitosa y tambien de un olor corporal prominente como resultado de una hiperhidrosis. Se descubre que es intolerante a la glucosa y que presenta niveles elevados de IGF-1 en circulacion, y una dosis creciente de SSA no los controla.
Es tratado mediante inyeccion intravenosa de una protema de fusion que comprende un TM de peptido de union a KISS1R (p.ej., SEQ ID 58), o una fusion que comprende un TM de peptido GnRH (p.ej., SEQ ID 93-94). A los 14 dfas el paciente informa de una reduccion significativa de la sudoracion. A lo largo del siguiente mes, la piel aceitosa retorna a la normalidad y en ese momento sus niveles de GH e IGF-1 se encuentran ambos dentro del rango normal. Esta situacion se mantiene a lo largo de los siguientes cinco anos.
Ejemplo 31: Metodo para tratar la acromegalia
Una paciente informa a su medico de cabecera que ya no le entran sus zapatos de talla 8, un talla que ha estado llevando los ultimos 25 anos, y que su anillo de boda tampoco le entra. Tras descartar un problema de obesidad, el medico de cabecera sospecha que podna ser el resultado de un trastorno pituitario y refiere a la paciente a pruebas que confirman unos niveles de IGF-1 y GH significativamente elevados. Un escaner de IMR craneal confirma la presencia de un adenoma pituitario.
Es tratada mediante inyeccion intravenosa de una protema de fusion que comprende un TM de peptido de union a receptor de hormona liberadora de prolactina (p.ej., SEQ ID 59). A lo largo de los siguientes meses los niveles de GH e IGF-1 vuelven a la normalidad y esto se mantiene mediante una inyeccion trimestral de la protema de fusion.
Ejemplo 32: Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
Objetivos
Determinar el impacto de la administracion i.v. de una fusion CP-GHRH-LHD sobre los niveles de IGF-1 en ratas cinco dfas despues del tratamiento en comparacion con un control tratado solo con vehmulo.
Materiales y metodos
Animales: ratas Sprague-Dawley machos adultos mantenidos en condiciones estandar de alojamiento con luz encendida a las 05:00h (14L:10D), disponibilidad ad libitum de comida y agua y habituados a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugfa.
Cirugfa: en el dfa 1 del estudio las ratas (200-250 g) seran anestesiadas con una combinacion de Hypnorm (0,32 mg/kg de citrato de fentanilo y 10 mg/kg de fluanisona, i.m.) y diazepam (2,6 mg/kg i.p.). La vena yugular derecha es expuesta y se inserta una canula de polietileno con punta silastica (d.i. 0,50 mm, d.e. 0,93 mm) (Portex, R.U.) en el vaso sangumeo hasta que se aloja proxima al atrio derecho. Las canulas seran llenadas previamente con una disolucion salina isotonica heparinizada (10 IU/mL). El extremo libre de las canulas se exteriorizara a traves de una incision de escalpelo y despues se tunelara a traves de un muelle protector anclado al craneo usando dos tornillo de acero inoxidable y acnlico dental auto-curable. Tras la recuperacion, los animales son albergados en jaulas individuales en el cuarto de muestreo sangumeo automatizado. El final del muelle protector es unido a una rotula mecanica que permite al animal una libertad de movimiento maxima. Las canulas son lavadas diariamente con disolucion salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 09:00h del dfa 2 del estudio las ratas recibiran una inyeccion i.v. de CP-GHRH-LHD o de control de vehmulo solo.
Muestreo: el sistema de muestreo sangumeo automatizado (ABS, del ingles “automated blood-sampling system”) ha sido descrito previamente (Clark et al., 1986; Windle et al., 1997). De tres a cuatro dfas despues de la cirugfa las canulas de la vena yugular de cada animal se conectaran al sistema de muestreo sangumeo automatizado. A las 07:00h del dfa 6 se iniciara el muestreo. Las muestras de sangre se recogeran en intervalos de 10 minutos usando el sistema automatizado durante un periodo de 24 horas. Se tomaran un total de 144 muestras de sangre para cada rata, que no contendran mas de 38 pL de sangre entera.
Resultados
Los niveles de IGF-1 fueron medidos usando un kit ELISA de IGF-1. La Figura 5 ilustra una reduccion estadfsticamente significativa de los niveles de IGF-1 en las ratas tratadas con la fusion en comparacion con el control solo de vehmulo con un valor-P del test-T = 0,0416 despues de tan solo cinco dfas.
Ejemplo 33: Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
Objetivos:
Este estudio esta disenado para investigar curso temporal de la actividad para la fusion CP-GHRH-LHD identificando el retraso temporal entre la administracion y el efecto inicial del compuesto en los niveles de IGF-1.
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Animales: ratas Sprague-Dawley machos adultos mantenidos en condiciones estandar de alojamiento con luz encendida a las 05:00h (14L:10D), disponibilidad ad libitum de comida y agua y habituados a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugfa.
Cio^a: en el dfa 1 del estudio las ratas (260-280 g) seran anestesiadas con una combinacion de Hypnorm y diazepam. La vena yugular derecha es expuesta y se inserta una canula de polietileno con punta silastica (d.i. 0,50 mm, d.e. 0,93 mm) (Portex, R.U.) en el vaso sangumeo hasta que se aloja proxima al atrio derecho. Las canulas seran llenadas previamente con una disolucion salina isotonica heparinizada (10 lU/mL). El extremo libre de las canulas se exteriorizara a traves de una incision de escalpelo y despues se tunelara a traves de un muelle protector anclado al craneo usando dos tornillo de acero inoxidable y acnlico dental auto-curable. Tras la recuperacion, los animales son albergados en jaulas individuales en el cuarto ABS. El final del muelle protector es unido a una rotula mecanica que permite al animal una libertad de movimiento maxima. Las canulas son lavadas diariamente con disolucion salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 10:00h del dfa 5 del estudio las ratas recibiran una inyeccion i.v. de CP-GHRH-LHD o de vehmulo (salino esterilizado).
Muestreo: tras limpiar las canulas se tomara una muestra de sangre manual individual (100 jL) de cada rata a las 09:30h. Se tomaran muestras desde el dfa 5 hasta el dfa 18 del experimento (o hasta que las canulas se bloqueen). Se almacenara el plasma de las muestras sangumeas a -20°C para un analisis posterior del contenido de IGF-1 mediante un kit ELISA.
Resultados
La Figura 6 ilustra una reduccion estadfsticamente significativa de los niveles de IGF-1 en las ratas tratadas con la fusion en comparacion con el control solo de vehmulo desde el dfa cuatro desde el tratamiento.
Ejemplo 34: Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de hormona de crecimiento de rata in vivo
Objetivos
Determinar el impacto de la administracion i.v. de la fusion CP-GHRH-LHD sobre los niveles de hormona de crecimiento en ratas cinco dfas despues de tratamiento en comparacion con controles de infusion tratados solo con vehmulo o con Octreotide.
Materiales y metodos
Animales: ratas Sprague-Dawley machos adultos mantenidos en condiciones estandar de alojamiento con luz encendida a las 05:00h (14L:10D), disponibilidad ad libitum de comida y agua y habituados a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugfa.
Cirugfa: en el dfa 1 del estudio las ratas (200-250 g) seran anestesiadas con una combinacion de Hypnorm (0,32 mg/kg de citrato de fentanilo y 10 mg/kg de fluanisona, i.m.) y diazepam (2,6 mg/kg i.p.). La vena yugular derecha es expuesta y se inserta una canula de polietileno con punta silastica (d.i. 0,50 mm, d.e. 0,93 mm) (Portex, R.U.) en el vaso sangumeo hasta que se aloja proxima al atrio derecho. Las canulas seran llenadas previamente con una disolucion salina isotonica heparinizada (10 IU/mL). El extremo libre de las canulas se exteriorizara a traves de una incision de escalpelo y despues se tunelara a traves de un muelle protector anclado al craneo usando dos tornillo de acero inoxidable y acnlico dental auto-curable. Tras la recuperacion, los animales son albergados en jaulas individuales en el cuarto de muestreo sangumeo automatizado. El final del muelle protector es unido a una rotula mecanica que permite al animal una libertad de movimiento maxima. Las canulas son lavadas diariamente con disolucion salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 09:00h del dfa 2 del estudio las ratas recibiran una inyeccion i.v. de compuesto activo Sintaxina o de vehmulo. 6 horas despues del inicio del muestreo comenzara una infusion de 12 horas de somatostatina (o un analogo) (administrada a traves de una de las lmeas de canula dual) y continuara solo durante 12 horas. [Este horario de infusion debena ser un excelente control de ensayo de GH, puesto que se debena ver la secrecion de lmea base, despues de la inhibicion completa y despues una rapida recuperacion/rebote]
Muestreo: el sistema de muestreo sangumeo automatizado (ABS) ha sido descrito previamente (Clark et al., 1986; Windle et al., 1997). De tres a cuatro dfas despues de la cirugfa las canulas de la vena yugular de cada animal se conectaran al sistema de muestreo sangumeo automatizado. A las 07:00h del dfa 6 se iniciara el muestreo. Las muestras de sangre se recogeran en intervalos de 10 minutos usando el sistema automatizado durante un periodo de 24 horas. Se tomaran un total de 144 muestras de sangre para cada rata, que no contendran mas de 38 jL de sangre entera.
Resultados
Los niveles de hormona de crecimiento fueron medidos usando un ensayo RIA. La Figura 7a ilustra los animales tratados con vehfculo que presentan un liberacion pulsada tipica de hormona de crecimiento, la Figura 7b ilustra la eliminacion completa de la liberacion pulsada de hormona de crecimiento tras el tratamiento con la quimera GHRH- 5 LHD, y la Figura 7c muestra el bloqueo de la liberacion pulsada de hormona de crecimiento y la posterior recuperacion cuando se detiene la infusion de Octreotide.

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido para uso en la supresion de la secrecion desde una celula tumoral neuroendocrina para tratar la acromegalia, comprendiendo dicho polipeptido:
    a. una proteasa no citotoxica, proteasa que es capaz de romper una protema del aparato de fusion exocftico en una celula tumoral pituitaria, en donde dicha proteasa no citotoxica es una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA;
    b. un Resto dirigido a diana (TM) que se une a un sitio de union en una celula tumoral pituitaria, sitio de union que es capaz de someterse a endocitosis para incorporarse a un endosoma dentro de la celula tumoral pituitaria, en donde el TM comprende un peptido de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH); y
    c. un dominio de traslocalizacion bacteriano o vftico que traslocaliza la proteasa desde dentro del endosoma, a traves de la membrana endosomal y al citosol de dicha celula tumoral pituitaria;
    en donde el polipeptido carece de un dominio Hc funcional de una neurotoxina clostridial.
  2. 2. Un polipeptido para uso segun la Reivindicacion 1, en donde la celula tumoral pituitaria deriva o contribuye a somatotrofinomas.
  3. 3. Un polipeptido para uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde el TM se une a un receptor de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH).
  4. 4. Un polipeptido para uso segun cualquier reivindicacion precedente, en donde la proteasa no citotoxica comprende una cadena-L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA; y/o
    en donde el dominio de traslocalizacion comprende un dominio de traslocalizacion de neurotoxina clostridial.
  5. 5. Un polipeptido que comprende:
    a. una proteasa no citotoxica, proteasa que es capaz de romper una protema del aparato de fusion exocftico en una celula tumoral pituitaria, en donde dicha proteasa no citotoxica es una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA;
    b. un Resto dirigido a diana (TM) que se une a un sitio de union en una celula tumoral pituitaria, sitio de union que es capaz de someterse a endocitosis para incorporarse a un endosoma dentro de la celula tumoral pituitaria, en donde el TM comprende un peptido de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH); y
    c. un dominio de traslocalizacion bacteriano o vftico que traslocaliza la proteasa desde dentro del endosoma, a traves de la membrana endosomal y al citosol de dicha celula tumoral pituitaria;
    en donde el polipeptido carece de un dominio Hc funcional de una neurotoxina clostridial, y en donde dicho polipeptido comprende una secuencia de aminoacido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90-92%, o al menos un 95-97%, o al menos un 98-99%, con respecto a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 34, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 o 92.
  6. 6. Un polipeptido segun la Reivindicacion 5, en donde el TM se une a un receptor de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH); en donde el TM comprende un peptido de hormona de liberacion de hormona del crecimiento (GHRH).
  7. 7. Un acido nucleico que codifica un polipeptido segun cualquiera de las Reivindicaciones 5 o 6.
  8. 8. Un metodo para activar un polipeptido segun la Reivindicacion 5 o 6, metodo que comprende poner en contacto el polipeptido con una proteasa que rompe el polipeptido en un sitio de reconocimiento (sitio de ruptura) localizado entre el componente de proteasa no citotoxica y el componente de traslocalizacion, y convertir el polipeptido en un polipeptido di-cadena en donde el componente de proteasa no citotoxica y el componente de traslocalizacion estan unidos por un enlace disulfuro.
  9. 9. Un polipeptido di-cadena que puede obtenerse mediante el metodo de la Reivindicacion 8.
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