CN113257370B - 基于临床病理基本信息和vista检测的pnet复发风险预测模型 - Google Patents

Abstract

本发明专利提供了一种基于临床分期和功能状态、免疫检查点VISTA、PD‑L1及微血管密度的模型，可以用于预测G1和G2胰腺神经内分泌瘤的复发风险。本发明根据临床分期和功能状态、通过免疫组化检测PD‑L1、VISTA和CD34，通过显微镜下判断免疫组化结果，再综合上述五个变量制作列线图，根据列线图来预测胰腺神经内分泌瘤术后1年、3年、5年复发风险。该模型可较为准确地预测G1和G2胰腺神经内分泌瘤的复发风险，从而为个体化随访方案制定提供参考。该模型是基于临床病理及肿瘤免疫微环境及微血管共同建立，具备可操作性和综合性。

Description

基于临床病理基本信息和VISTA检测的PNET复发风险预测 模型

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及基于临床病理基本信息和VISTA检测的PNET复发风险预测模型。

背景技术

胰腺神经内分泌瘤(PNET)，是具有神经内分泌分化的一组临床表现、分子改变、预后等各方面存在较大异质性的肿瘤。根据监测、流行病学和最终结果(SEER)项目的统计数据，其年发病率约为每10万人0.48，且仍在逐年增高^[1]。对于胰腺神经内分泌瘤，临床病理目前最为常用的预后评估方法是由世界卫生组织(World Health Organization，WHO)制订的胰腺神经内分泌肿瘤分级系统下面，将分别简要叙述该种方法。

由WHO制订的胰腺神经内分泌肿瘤分级系统，该系统来源于世界卫生组织制订的消化系统肿瘤分类第五版^[2]。分级主要包括下述几个步骤：

(1)病理诊断医师根据手术或生物活检取得的肿瘤标本，在经过常规固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后，对染色后的切片进行评估，根据肿瘤的分化程度，分为胰腺神经内分泌瘤或胰腺神经内分泌癌。

(2)在此基础上，计数出10mm²(相当于视野直径为0.5mm下，物镜放大倍数为40倍时，50个高倍镜视野的面积)的核分裂，并将结果表示为每10个高倍镜视野(High powerfield,HPF)(或2mm²)下核分裂的个数。

(3)利用未染色的切片，进行提示肿瘤增殖情况的Ki-67染色，正常情况下，处于分裂期的细胞核可以被染成棕褐色。对整张染好的切片进行观察，找出标记最为显著的热点区域，对其中至少500个肿瘤细胞进行评估，最后表示为Ki-67染色阳性的肿瘤细胞数占所评估的总肿瘤细胞数的百分比。

(4)在神经内分泌瘤之中，根据Ki-67和核分裂共同判定。Ki-67按＜3％、3–20％、＞20％，核分裂按＜2/10HPF、3–20/10HPF、＞20/10HPF,分为低级别(G1)、中等级别(G2)、高级别(G3)三个等级。如果上述两个指标范围一致，则最终级别判断为这两个增殖活性指标所提示的级别；若两者不一致，则以较高者所判定级别为胰腺神经内分泌瘤的级别。

近期，基于免疫检查点PD-1(Programmed cell death protein-1，程序性死亡受体1)及其配体PD-L1的免疫治疗在包括非小细胞肺癌、黑色素瘤在内的多种肿瘤中体现出较好的临床收益。随之而来，对于肿瘤的微环境，包括免疫细胞、免疫检查点、成纤维细胞及内皮细胞等的关注也日益增加。同样的，在胰腺神经内分泌瘤中，已经有研究提示肿瘤浸润中性粒细胞、肿瘤相关巨噬细胞可能参与到肿瘤的发生发展过程，也与不良的预后相关^[3,4]。然而，在胰腺神经内分泌瘤中，关于免疫检查点的研究仍较少且因纳入其他类型神经内分泌肿瘤或评判方法差异而存有争议^[5-8]，且尚未发现有明确意义的指标。PD-L1可表达于多种肿瘤，通过与PD-1结合，抑制CD8+T细胞增殖，进而抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤发生发展。而VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)则是一种近年发现的免疫检查点，正常情况下表达于造血细胞^[9]，其具有抑制CD4+和CD8+T细胞增殖及细胞因子合成^[9,10]，诱导调节性T细胞产生的作用^[11]。发明人所在课题组前期发现，新型免疫检查点VISTA在免疫细胞上高表达是乳腺癌与结直肠癌的独立预后因素，且与较好预后相关^[12,13]。但VISTA在胰腺神经内分泌瘤中的表达模式及预后意义尚不清楚，VISTA是否可以用于胰腺神经内分泌瘤的复发风险预测仍有待研究。

由世界卫生组织制订的胰腺神经内分泌肿瘤分级系统对于预后判断上存在明显不足，发现更准确的预后预测指标或方法仍为其研究的迫切需要。对于胰腺神经内分泌瘤，即便是处于相同的分级，其复发转移概率仍存在较大异质性。尤其是在中等级别的胰腺神经内分泌瘤中，最为明显。部分个体术后容易发生复发转移，而另一部分，在长时间随访后仍未见有转移复发迹象。说明现有的分级系统不能很好的根据复发风险去对人群进行区分，进而难以有针对性地考虑随访的间隔、方式等等。此外，该系统仅考虑肿瘤的分化和增殖，而忽略了肿瘤微环境和其他临床及病理特征对肿瘤复发的影响。

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发明内容

本发明提供了一种基于临床分期和功能状态、免疫检查点VISTA、PD-L1及微血管密度的模型，可以用于预测G1和G2胰腺神经内分泌瘤的复发风险，充分考虑利用了肿瘤分期和功能状态、肿瘤微环境的复发预测互补价值，较为综合全面，根据预测结果可以对病人提供更为个体化的术后随访方案。

为达到上述发明目的，本发明所采取的技术方案是提供检测VISTA、PD-L1、CD34试剂在制备PNET复发风险预测制剂的应用，所述制剂还包括检测激素分泌水平的试剂。

进一步地，本发明还提供一种PNET复发风险预测的试剂盒，其中，包含检测VISTA、PD-L1、CD34的试剂。

以上所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括检测激素分泌水平的试剂；优选地所述激素包括胰岛素、胃泌素、血管活性肠肽、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素。

以上所述试剂盒，其中，所述检测的方法包括免疫组化、病理切片和/或其他生物学检测方法。

进一步地，所述病理切片包括对胰腺神经内分泌瘤手术切除组织进行常规固定、脱水、石蜡包埋、切片以及常规HE染色。

一种PNET复发风险预测系统和/或模型，其特征在于，包括VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分。

以上所述的评价系统和/或模型，其中，所述各部分含有检测试剂，所述VEMVD的评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对表达VISTA的微血管进行计数对所得的计数值求平均数，VEMVD≥10.8/HPF，定义为VEMVD高；VEMVD＜10.8/HPF，定义为VEMVD低。

进一步地，表达VISTA的微血管应包含明确的血管腔或呈线性的血管结构，需排除肌型动脉及管径大于8个红细胞大小的静脉，同时应排除散在的胰腺小导管的干扰。

以上所述的评价系统和/或模型，其中，所述肿瘤PD-L1表达水平评估部分包括：评估肿瘤PD-L1膜/胞质阳性的强度，判断为阴性赋予0分、弱阳性赋予1分、中等强度阳性赋予2分、强阳性赋予3分，评估肿瘤中存在PD-L1膜/胞质阳性的范围占总肿瘤面积的百分比，用阳性强度赋予的分数乘以百分比得出乘积，乘积≥190时定义为高，当乘积＜190时定义为低。

以上所述的评价系统和/或模型，其中，所述MVD评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对CD34阳性的微血管进行评估，MVD≥44.5/HPF时定义为高，MVD＜44.5/HPF时定义为低。

以上所述的评价系统和/或模型，其中，所述AJCC分期评分部分包括：

(1)肿瘤T分期：肿瘤局限于胰腺内，最大径＜2cm，判定为T1期；肿瘤局限于胰腺内，最大径为2-4cm，判定为T2期；肿瘤局限于胰腺内，最大径＞4cm，或肿瘤侵及十二指肠和/或胆总管，判定为T3期；肿瘤侵犯邻近器官，如胃、脾、结肠、肾上腺或大血管壁，判定为T4期；

(2)N分期：肿瘤无区域淋巴结转移，判定为N0期；有区域淋巴结转移，数量不限，判定为N1期；

(3)M分期：肿瘤无远处转移，判定为M0期；肿瘤只存在肝转移，判定为M1a期，肿瘤只有肝外转移，转移部位包括肺、卵巢、非区域性淋巴结、腹膜和骨，判断为M1b期，肿瘤肝转移和肝外转移兼而有之，判定为M1c期；

(4)根据T、N、M共同判定神经内分泌瘤的分期(Ⅰ-Ⅳ)；Ⅰ期：T1、N0、M0；Ⅱ期：T2、N0、M0或T3、N0、M0；Ⅲ期：T4、N0、M0、任何T分期、N1、M0；Ⅳ期：任何T分期、任何N分期、M1。

以上任一所述的系统和/或模型，将VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分得分相加，得到总得分，根据总得分对应模型列线图判断复发概率。

有益效果

本发明通过分析183例G1及G2胰腺神经内分泌瘤，基于VEMVD、MVD及肿瘤PD-L1及临床病理基本信息(Clinicopathological chracteristics，AJCC分期和功能状态)等构建了一种判断胰腺神经内分泌瘤的术后复发风险预测模型(CIM)。该模型包含临床病理信息(Clinicopathological，即功能状态与AJCC分期)、免疫微环境(Immunemicroenvironment，包括肿瘤PD-L1表达和VEMVD)及微血管密度(Microvessel density)三方面信息的列线图为CIM预后模型，充分考虑利用了肿瘤分期和功能状态、肿瘤微环境的复发预测互补价值，较为综合全面。

本发明中，通过log-rank检验及单因素Cox回归分析，结果发现：VEMVD、MVD、AJCC分期、肿瘤PD-L1和功能状态与G1及G2胰腺神经内分泌瘤的术后复发相关，而在多因素Cox回归分析中，这些变量也都被纳入到最终构建的方程之中。高VEMVD、低MVD、AJCC分期Ⅲ/Ⅳ、功能状态中的其他功能性及肿瘤低PD-L1表达与患者更短的无进展生存时间相关，其生存曲线见图2。

C指数即一致性指数(concordance index)，常用来评价模型的预测能力。C指数是指所有病人对子中预测发生结局事件与实际发生结局事件一致的对子所占的比例，它估计了预测结果与实际观察到的结果相一致的概率。当C指数的值为0.5时，提示模型的预测能力不好；当其值大于0.7时，提示模型预测效果较好；当其值大于0.8时，提示模型预测效果较强；而当C指数值为1时，说明模型可以准确无误地预测结局事件。对于患者的5年无复发生存时间，本发明的CIM模型的C指数为0.9103，提示本发明的模型具有较优的预测能力。相似的，校准曲线也能直观地反映预测结局与实际结局的符合程度，其x轴表示列线图预测的无复发生存概率，而y轴则代表实际观察到的无复发生存比例。45°线提示最佳预测能力。由图3可看出，CIM模型的1年、3年及5年预测能力均较好。

附图说明

图1.本发明构建的CIM胰腺神经内分泌瘤复发风险预测模型。

图2.AJCC分期、功能状态、VEMVD、MVD及肿瘤PD-L1表达水平与G1和G2级胰腺神经内分泌瘤术后5年无复发生存时间有关。A.AJCC分期与胰腺神经内分泌瘤的5年无复发生存期有关；B.功能状态与胰腺神经内分泌瘤的5年无复发生存期有关；C.VEMVD与胰腺神经内分泌瘤的5年无复发生存期有关；D.MVD与胰腺神经内分泌瘤的5年无复发生存期有关；E.肿瘤PD-L1与胰腺神经内分泌瘤的5年无复发生存期有关。

图3列线图预测的1年、3年、5年无复发生存时间概率校准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1、研究对象

本实例的研究对象为G1、G2级胰腺神经内分泌瘤手术切除原发肿瘤组织石蜡包埋标本。纳入标准：有明确病理诊断为胰腺神经内分泌瘤；本次手术为初次胰腺神经内分泌瘤切除手术；根据WHO第五版消化系统肿瘤分类为G1或G2；病理切片及石蜡标本完整；随访时间不短于12个月；有完整临床信息。

排除标准：WHO第五版消化系统肿瘤分类为G3胰腺神经内分泌瘤或胰腺神经内分泌癌或混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤；胰腺原位复发者；缺少病理切片及石蜡标本；随访时间少于12个月；死于术后急性并发症。

2、研究方法

2.1临床信息收集

通过病案系统查阅患者住院及门诊病历，记录患者的年龄、性别、手术方式、手术日期、术前及术后治疗情况、功能状态(有无激素过度分泌引起的临床综合征)、原发胰腺肿瘤部位、肿瘤大小、远处转移情况，通过门诊病历随访信息及电话随访，记录患者术后是否复发、复发的具体时间、如何发现复发、复发部位、复发后的治疗、是否死亡、死亡时间、死亡原因。

2.2病理资料判定及收集

直接测量通过显微镜下观察HE染色切片，判读以下病理参数：Ki-67指数、核分裂、WHO分级、淋巴脉管侵犯、神经周浸润、清扫淋巴结总数及阳性淋巴结个数。

2.3VISTA、CD34及PD-L1免疫组织化学染色

(1)病理标本的筛选：根据仔细阅读HE切片，挑选含有肿瘤组织的石蜡组织标本，有条件者亦可制备石蜡包埋标本的组织芯片。

(2)切片、展片、贴片、烤片：切片厚度为4μm，然后将展开的切片用防脱粘附载玻片捞起，放于切片架晾干，在烤片机上以70℃烘烤30min。

(3)脱蜡：将至切片依次放入第一缸二甲苯、第二缸二甲苯、100％酒精、95％酒精、90％酒精、85％酒精、75％酒精、50％酒精、蒸馏水中各5min，进行脱蜡。

(4)热诱导的抗原修复：将一定量的柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)加入烧杯中，将烧杯放入高压锅中，加热至沸腾，高压沸腾2到3min，抗原修复液自然冷却至室温，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗2次。

(5)灭活过氧化物酶：滴加3％过氧化氢至组织切片，室温孵育15min，PBS冲洗3遍，以阻断内源性过氧化物酶。

(6)封闭：使用防水记号笔勾勒出组织标本部分，滴加封闭用血清，置于湿盒中室温下封闭30min,PBS冲洗3次。

(7)一抗孵育：在组织切片滴加抗VISTA(克隆号D1L2G,稀释比例1:200，厂家CellSignaling Technology)、抗CD34(克隆号QBEnd/10，稀释比例1：50，厂家AgilentTechnologies)、抗PD-L1抗体(克隆号E1L3N,稀释比例1:200，厂家Cell SignalingTechnology)的抗体置于湿盒中，4℃过夜。同型IgG作为阴性对照。

(8)二抗孵育：完成一抗孵育后，取出，在37℃复温1h,PBS洗三次,滴加二抗，室温孵育1h；然后PBS冲洗三次。

(9)二氨基联苯胺(DAB)显色：孵育完毕后，滴加新鲜配置的DAB显色液，置于显微镜下观察染色情况，控制在适当时间(不超过5min)内。根据染色的程度，流动水冲洗10min，及时终止显色。

(10)苏木素复染，返蓝：切片在苏木素染液中室温染色2min左右，流动水冲洗后放入0.1％盐酸乙醇中5到10s，自来水冲洗后，放入氨水中5到10s返蓝。

(11)脱水、透明：依次过浓度为50％酒精、70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、第一缸100％酒精、第二缸100％酒精，脱水5min；二甲苯透明：第一缸二甲苯、第一缸二甲苯中10min透明。

(12)封片：中性树胶封片，盖上盖玻片，注意避免出现气泡，通风橱内晾干后观察。

2.4免疫组化染色结果判读

在低倍镜下，选取肿瘤内区域。对选定区域放大400倍表达VISTA的微血管进行评估。对4个HPF下的VISTA阳性微血管进行分别计数。再对所得的计数值求平均数。当VEMVD≥10.8/HPF时，定义为VEMVD高，当＜10.8/HPF时，定义为VEMVD低。采用相同的方法，对CD34阳性的微血管进行评估，当MVD≥44.5/HPF时定义为高，＜44.5/HPF时定义为低。肿瘤PD-L1表达水平评估：估肿瘤PD-L1膜/胞质阳性的强度，分为0(阴性)、1(弱阳)、2(中等强度阳)、3(强阳)以及肿瘤中存在PD-L1膜/胞质阳性的范围占总肿瘤面积的百分比，用阳性强度乘以百分比得出乘积，乘积≥190时定义为高，当＜190时定义为低。

2.5AJCC分期判定：

(1)肿瘤T分期：根据原发肿瘤情况，可分为T1-4。T1指肿瘤局限于胰腺内，最大径＜2cm；T2指肿瘤局限于胰腺内，最大径为2-4cm；T3指肿瘤局限于胰腺内，最大径＞4cm，或肿瘤侵及十二指肠和(或)胆总管；而T4指肿瘤侵犯邻近器官，如胃、脾、结肠、肾上腺或大血管壁(腹腔干或肠系膜上动脉)。

(2)N分期：根据区域淋巴结阳性情况，可分为N0和N1。N0：无区域淋巴结转移；N1：有区域淋巴结转移，数量不限。

(3)M分期：根据有无远处转移，分为M0和M1。M0：无远处转移；M1：又分为M1a、M1b和M1c。M1a即只存在肝转移，M1b为只有肝外转移，转移部位包括肺、卵巢、非区域性淋巴结、腹膜和骨，M1c则是肝转移和肝外转移兼而有之。

(4)根据T、N、M共同判定神经内分泌瘤的分期(Ⅰ-Ⅳ)。Ⅰ期：T1、N0、M0；Ⅱ期：T2、N0、M0或T3、N0、M0；Ⅲ期：T4、N0、M0、任何T分期、N1、M0；Ⅳ期：任何T分期、任何N分期、M1。

2.6根据CIM模型预测复发风险

根据AJCC分期(Ⅰ/Ⅱ期或Ⅲ/Ⅳ期)和功能状态(胰岛素瘤或非功能性或其他功能性)、肿瘤PD-L1表达水平(高或低)和VEMVD(高或低)以及MVD(高或低)。胰腺神经内分泌瘤患者术后1年、3年和5年无复发生存概率的计算方法为：先估算总得分：总得分＝(某患者具体的功能状态的位置垂直对应到得分轴上的分值)+(某患者AJCC分期的位置垂直对应到得分轴上的分值)+(某患者肿瘤PD-L1评分高低的位置垂直对应到得分轴上的分值)+(某患者VEMVD高低的位置垂直对应到得分轴上的分值)+(某患者MVD高低的位置垂直对应到得分轴上的分值)，再根据总得分值在总得分轴上对应的位置垂直对应到1年、3年和5年概率轴上的数值。如已知某患者肿瘤为非功能性，则其该项得分约为26；其分期为Ⅲ期，则其该项得分为100；肿瘤高表达PD-L1，则其该项得分为0；VEMVD为高，则其该项得分为52.5；MVD为低，则其该项得分为52.5，总得分为(26+100+0+52.5+52.5)＝231，总得分垂直对应到相应的概率轴，其1年、3年、5年无复发生存概率约为0.8、0.5、0.1。

2.7统计分析

利用单、多因素Cox比例风险模型筛选变量，再使用R语言中的rms包绘制成列线图。利用C指数及校准曲线评价列线图对复发预测的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.检测VISTA、PD-L1、CD34试剂在制备G1和G2级PNET复发风险预测制剂的应用，其特征在于，所述制剂还包括检测激素分泌水平的试剂。

2.一种G1和G2级PNET复发风险预测系统，其特征在于，包括VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分。

3.根据权利要求2所述的复发风险预测系统，其特征在于，所述各部分含有检测试剂，所述VEMVD的评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对表达VISTA的微血管进行计数，再对所得的计数值求平均数，VEMVD≥ 10.8 /HPF，定义为VEMVD高；VEMVD＜10.8 /HPF，定义为VEMVD低；

所述肿瘤PD-L1表达水平评估部分包括：评估肿瘤PD-L1膜/胞质阳性的强度，判断为阴性赋予0分、弱阳性赋予1分、中等强度阳性赋予2分、强阳性赋予3分，评估肿瘤中存在PD-L1膜/胞质阳性的范围占总肿瘤面积的百分比，用阳性强度赋予的分数乘以百分比得出乘积，乘积≥190时定义为高，当乘积＜190时定义为低；

所述MVD评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对CD34阳性的微血管进行评估，MVD≥ 44.5 /HPF时定义为高，MVD＜44.5 /HPF时定义为低；

所述 AJCC分期评分部分包括：

（1）肿瘤T分期：肿瘤局限于胰腺内，最大径＜2 cm，判定为T1期；肿瘤局限于胰腺内，最大径为2-4 cm，判定为T2期；肿瘤局限于胰腺内，最大径＞4 cm，或肿瘤侵及十二指肠和/或胆总管，判定为T3期；肿瘤侵犯邻近器官，如胃、脾、结肠、肾上腺或大血管壁，判定为T4期；

（2）N分期：肿瘤无区域淋巴结转移，判定为N0期；有区域淋巴结转移，数量不限，判定为N1期；

（3）M分期：肿瘤无远处转移，判定为M0期；肿瘤只存在肝转移，判定为M1a期，肿瘤只有肝外转移，转移部位包括肺、卵巢、非区域性淋巴结、腹膜和骨，判断为M1b期，肿瘤肝转移和肝外转移兼而有之，判定为M1c期；

（4）根据T、N、M共同判定神经内分泌瘤的分期（Ⅰ-Ⅳ）；Ⅰ期：T1、N0、M0；Ⅱ期：T2、N0、M0或T3、N0、M0；Ⅲ期：T4、N0、M0、任何T分期、N1、M0；Ⅳ期：任何T分期、任何N分期、M1；

将VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分得分相加，得到总得分，根据总得分对应模型列线图判断复发概率。

4.一种G1和G2级PNET复发风险预测方法，其特征在于，包括VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分。

5.根据权利要求4所述的复发风险预测方法，其特征在于，所述各部分含有检测试剂，所述VEMVD的评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对表达VISTA的微血管进行计数，再对所得的计数值求平均数，VEMVD≥ 10.8 /HPF，定义为VEMVD高；VEMVD＜10.8 /HPF，定义为VEMVD低；

所述肿瘤PD-L1表达水平评估部分包括：评估肿瘤PD-L1膜/胞质阳性的强度，判断为阴性赋予0分、弱阳性赋予1分、中等强度阳性赋予2分、强阳性赋予3分，评估肿瘤中存在PD-L1膜/胞质阳性的范围占总肿瘤面积的百分比，用阳性强度赋予的分数乘以百分比得出乘积，乘积≥190时定义为高，当乘积＜190时定义为低；

所述MVD评分部分包括：400倍放大选取的4个视野，对CD34阳性的微血管进行评估，MVD≥ 44.5 /HPF时定义为高，MVD＜44.5 /HPF时定义为低；

所述 AJCC分期评分部分包括：

（1）肿瘤T分期：肿瘤局限于胰腺内，最大径＜2 cm，判定为T1期；肿瘤局限于胰腺内，最大径为2-4 cm，判定为T2期；肿瘤局限于胰腺内，最大径＞4 cm，或肿瘤侵及十二指肠和/或胆总管，判定为T3期；肿瘤侵犯邻近器官，如胃、脾、结肠、肾上腺或大血管壁，判定为T4期；

（2）N分期：肿瘤无区域淋巴结转移，判定为N0期；有区域淋巴结转移，数量不限，判定为N1期；

（3）M分期：肿瘤无远处转移，判定为M0期；肿瘤只存在肝转移，判定为M1a期，肿瘤只有肝外转移，转移部位包括肺、卵巢、非区域性淋巴结、腹膜和骨，判断为M1b期，肿瘤肝转移和肝外转移兼而有之，判定为M1c期；

（4）根据T、N、M共同判定神经内分泌瘤的分期（Ⅰ-Ⅳ）；Ⅰ期：T1、N0、M0；Ⅱ期：T2、N0、M0或T3、N0、M0；Ⅲ期：T4、N0、M0、任何T分期、N1、M0；Ⅳ期：任何T分期、任何N分期、M1；

将VEMVD的评分部分、肿瘤PD-L1表达水平评分部分、MVD评分部分、肿瘤功能状态评分部分、AJCC分期评分部分得分相加，得到总得分，根据总得分对应模型列线图判断复发概率。

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