CN111388651B - Cst-14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了环形多肽CST‑14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用。CST‑14可以通过直接结合骨质疏松症过程中关键受体RANK从而拮抗RANKL所导致的破骨细胞诱导功能，并在骨质疏松症中发挥保护性作用。体外细胞实验结果表明，CST‑14可拮抗骨质疏松关键分子RANKL所导致的破骨细胞分化过程。同时，动物模型显示，CST‑14可抑制骨质疏松性疾病发生，改善病情，且长期应用未见明显毒副作用，可用于骨质疏松症治疗领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及CST-14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用。
背景技术
目前，骨质疏松症在临床上多见，患者一般需要长期药物治疗，其中RANKL信号系统拮抗药物，例如地诺单抗等，是目前治疗效果确切而且具有潜在应用前景的一类药物[1]，在全世界范围内广泛应用。临床使用的RANKL拮抗药物来自生物工程制药，相关药物种类少，患者选择余地小，而且相关药物合成费用较高，给需要长期应用的患者造成经济负担[2]。同时，目前使用的双膦酸盐药物有其自身潜在副作用[3]，在一定程度上影响使用。而RANK作为RANKL的关键受体，属于肿瘤坏死因子受体TNFR超家族的重要成员，且在破骨细胞的分化成熟及功能方面均发挥决定性作用[4]，因此，目前对于拮抗RANK/RANKL分子系统功能的研究也已经成为国际骨质疏松治疗的热点方向。
参考文献：
[1]Gambacciani M,Levancini M.Gambacciani M,et al.Management ofPostmenopausal Osteoporosis and the Prevention of Fractures PanminervaMed.2014 Jun；56(2):115-31.Epub 2014 Jun 19.
[2]Morizio P,Burkhart JI,Ozawa S.Morizio P,et al.Denosumab:A UniquePerspective on Adherence and Cost-effectiveness Compared With OralBisphosphonates in Osteoporosis Patients.Ann Pharmacother.2018 Oct；52(10):1031-1041.doi:10.1177/1060028018768808.Epub 2018 Apr 4.
[3]Lorentzon M.Lorentzon M.Treating Osteoporosis to PreventFractures:Current Concepts and Future Developments J Intern Med.2019 Apr；285(4):381-394.doi:10.1111/joim.12873.Epub 2019 Jan 18.
[4]Feng X.Feng X.Regulatory roles and molecular signaling of TNFfamily members in osteoclasts.Gene.2005 Apr 25；350(1):1-13.doi:10.1016/j.gene.2005.01.014.
发明内容
本发明的目的是提供一种RANKL/RANK信号系统拮抗分子CST-14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用，CST-14作为一种RANKL/RANK拮抗药物，具有改善骨质，减轻老年性及停经后骨质疏松的作用，且体外实验未显示CST-14有增加肿瘤风险，药物长期使用更加安全。
本发明的技术方案是：
CST-14(皮质抑素14)，CAS:186901-48-4。其分子量21kD。
CST-14的氨基酸序列为：Pro-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys(Disulfide bridge:Cys2-Cys13)，制备简单，这也是其相较于其他RANKL/RANK系统拮抗药物的优势所在。同时，目前对于其合成纯度，已经达到99.5％以上，纯度符合药物制备要求。
本发明提供RANKL/RANK信号系统拮抗剂CST-14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用，尤其的，其作为与RANK结合分子，拮抗RANKL促破骨细胞分化功能实现。
具体的，尤其是在制备老年性骨质疏松症治疗药物中的应用。
还包括制备停经后骨质疏松症治疗药物中的应用。
以及可预测的，在制备治疗肿瘤相关骨质疏松症药物上的应用。
本发明所述药物还包括药学上可接受的载体、助剂或稀释剂。
所述药物的形式选自如下之一：喷雾、气溶胶、溶液、洗液、凝胶、软膏、糊剂、乳剂和悬浮液。
所述药物优选注射剂型。
给药模式优选纳米颗粒介导给药、注射水针、注射粉剂、透皮吸收(微针)。
通过体外结合实验及体内动物模型实验，分子间相互作用实验结果表明，CST-14可以直接结合RANKL的细胞表面受体RANK，从而拮抗RANKL功能，在多种骨质疏松模型中发挥保护性作用。CST-14属于新型RANKL拮抗药物，可通过现有技术直接合成，从而降低成本。另外，动物模型中，CST-14的长期应用未见明显毒副作用，可用于老年性骨质疏松，停经后骨质疏松及肿瘤相关性骨质疏松等领域。
附图说明
图1是免疫共沉淀及固相结合实验测定内源性CST及CST-14与RANK结合能力
图2是免疫荧光染色，显示CST-14拮抗RANKL与RANK在RAW264.7细胞的结合过程
图3是TRAP染色，显示CST-14抑制RANKL刺激所导致的破骨细胞分化过程
图4显示CST基因敲除小鼠骨质疏松过程加速。A.TRAP染色，B.HE染色显示CST基因敲除小鼠胫骨骨质疏松。C-H.CT显示6月龄CST基因敲除小鼠胫骨骨质明显疏松。
图5是CT结果显示CST-14改善OVX模型导致的野生型小鼠椎体内骨质疏松。
图6是HE及TRAP染色显示CST-14有效增加OVX术后骨小梁数量并减轻骨质疏松
图7是CT及TRAP染色显示CST-14可有效增加RANKL转基因大鼠骨量
图8是CT及免疫组化显示CST-14明显改善OPG基因敲除导致的小鼠胫骨骨质疏松
图9骨肉瘤HOS细胞细胞划痕实验及EdU实验显示CST-14未加剧肿瘤增殖迁移过程
具体实施方式
以下实施例中涉及的实验动物、试剂、培养基和缓冲液的来源：
CST-14(纯度98.4％，CAS:186901-48-4,其氨基酸序列为Pro-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys(Disulfide bridge:Cys2-Cys13))(吉尔生化有限公司)
野生型BL6/C57雌性小鼠，CST基因敲除小鼠(T003038)，OPG基因敲除小鼠(C57BL/6N-Tnfr11bem1cyagen)，RANKL转基因大鼠(T002583)(山东大学动物中心)
PBS缓冲液，(碧云天生物试剂公司)
Cathepsin K，RANK，RANKL抗体(Santa Cruz Biotechnology,USA)
RIPA细胞蛋白质提取裂解液(Thermo Fisher，Pierce)
蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)
BCA蛋白定量试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)
Complete EDTA-Free(罗氏生物医药)
二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)
中性树胶(上海泰坦科技股份有限公司)
浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)
伊红(上海泰坦科技股份有限公司)
苏木素(上海泰坦科技股份有限公司)
甲醇(国药集团化学试剂有限公司)
柠檬酸盐缓冲液(0.01M，PH＝6.0)(生工生物工程上海股份有限公司)
10％NGS(生工生物工程上海股份有限公司)
过氧化氢(H2O2)(国药集团化学试剂有限公司)
BSA(生工生物工程上海股份有限公司)
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)
细胞计数仪购自美国Thermo Fisher公司
显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司
离心机购自济南欧莱博医疗器械有限公司
电子天平购自济南欧莱博医疗器械有限公司
酶联免疫检测仪(酶标仪)购自北京美华仪科技有限公司
流式细胞仪购自BD公司
制冰机购自济南欧莱博医疗器械有限公司
超纯水系统购自济南欧莱博医疗器械有限公司
涡旋混合器购自济南欧莱博医疗器械有限公司
μCT装置购自瑞士SCANCO Medical AG公司
1.CO-IP及蛋白质印记检测
取出180μl RIPA裂解液，加入10ul蛋白酶抑制剂和10ul磷酸酶抑制剂，制备为200ul组织裂解液。然后将从-80℃冰箱中取出的冷冻巨噬细胞样品置于EP管中，加入制备的组织裂解液，将EP管置于已用液氮预冷却的均化器中进行匀浆；设置均质化时间和数量。在细胞完全均质化后，取出EP管，以12000rpm离心，在15℃下离心15分钟，并将上清液转移到新的1.5ml EP管中。留取20ul左右细胞裂解的上清液加2x loading buffer煮5min，作为input组。提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入CST蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括1:1的beads与2ug CST蛋白抗体。4℃摇床孵化2-4h，Binding结束，1400r x 1min,4℃离心。真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来，离心，洗beads三次最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2x loading buffer煮一次，作为IP组点样。
将电泳槽放在电泳装置上并打开电源，正极和负极都装好。将电压调节至约150V以保持恒定电压。当溴酚蓝标签移动到凝胶底部时，关闭电源并将跑胶缓冲液倒回瓶中。准备1000mL转膜缓冲液并在4℃下预冷；将2片厚滤纸(约8×10cm大小)和硝酸纤维素膜在电泳前30分钟浸泡，将海绵夹浸入转移缓冲液中；将玻璃板浸入转移液中，用塑料铲小心地取出玻璃板，从玻璃上取下凝胶，除去所有的浓缩胶和不必要的分离胶；按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序组装转膜夹层；将转移夹放入转移槽中以确保转移夹的凝胶侧朝向阴极，同时膜的侧面朝向阳极，向转移槽添加适量的缓冲液至确保转移夹完全浸入水中，放入冰盒中；将黑色电极引线插入转膜装置的阴极插座，红色电极引线插入阳极插座，将阳极和阴极引线连接到相应的电源输出；将转膜装置置于冰上，打开电源，将仪器转移条件设定为恒流240mA，薄膜转移时间为90min；转膜完成后，将其从转膜装置中取出转移至盒子里，压板小心地打开用镊子转移PVDF膜层，取出硝酸纤维素PVDF膜，在膜附近的右上方切一个角作为标记。封闭和抗体孵育：取出转移的硝酸纤维素膜，用TBST冲洗1分钟，洗去膜上残留的转移溶液，然后将其面朝上放入5％脱脂奶粉封闭液中。在摇床上室温下，封闭1小时，将膜切成一定大小，准备RANK一抗孵育。一抗孵育：将RANK一抗进行稀释，将膜浸泡在适量稀释的一抗中，并在4℃下放入冰箱中过夜(8～12h)。洗涤一抗：取出膜并用TBST在振荡器上洗涤，5分钟×3次。二抗孵育：山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗用浓度为1：10000的二抗稀释液制备。将膜浸入适量稀释的二抗中并在室温下温育1小时。洗涤二抗：取出膜后，在摇床上用TBST洗涤5分钟×3次。显影：取相同量的超敏ECL化学发光试剂盒，与液体A和液体B充分混合，避开光线，然后将硝酸纤维素膜置于黑色薄膜上，正面朝上，室温下用移液管取适量的显色混合液施加到薄膜上以便在凝胶成像系统中显影和成像。
图1A表明，RAW264.7巨噬细胞系中，内源性CST与细胞表面RANK受体组成复合体。
2.生物素化CST-14与RANK结合的固相结合实验
加入多种剂量(0-250μg/ml)的CST-14或者BSA到包含着0.5％BSA的TBS缓冲液，对每组样本用三份的试剂来进行试验。覆盖上载玻片在室温里过夜。将溶液倒入well中，并用多道移液器向每个well中加入100微升的封闭液。浸湿一分钟后，倒置载玻片并在吸水纸上击打以除去溶液。用多道移液器向每个well中加入200微升的封闭液，在室温下放置1-3小时。倒掉封闭液，用结合缓冲液洗涤三次。将载玻片从最后一次洗涤中猛然拿出，倒置载玻片并在吸水纸上去除残余溶液。在结合缓冲液中稀释标记了维生素H的RANK至1ng/微升。向每个well中加入100微升这种溶液，覆盖载玻片并在37度孵育2-3小时。吸这个well以去除未结合蛋白，用结合缓冲液洗涤三次well,去除残液。在结合缓冲溶液中以1:2500稀释链霉亲和素-HRP，用多道移液器向每个well中加入100微升溶液。在室温下孵育15分钟。吸这个well以除去未结合的链霉亲和素-HRP。用结合缓冲溶液洗涤well十次并去除残液。用多道移液器向每个well中加入100微升的TMB，将载玻片放置在黑暗中直到蓝色出现。用多道移液器向well中加入100微升的2N的硫酸溶液来终止反应。
图1B是CST-14与RANK直接结合的结果图。通过固相结合实验测定，CST-14与RANK具有直接结合能力。
3.免疫细胞染色检测CST-14抑制RANKL与RANK结合过程
首先，RAW264.7细胞行培养后，分为对照组CTL，不加任何处理；PBS组，PBS+RANKL刺激；CST-14治疗组，CST-14预处理3h后加入RANKL。RANKL加入3h后，对各组RAW264.7细胞进行免疫荧光染色，先用4％甲醛固定10分钟，在0.2％Triton-X 100中渗透15分钟，然后在1％BSA中封闭30分钟。然后用抗RANK(稀释1:250，ab13918，abcam)，抗RANKL(稀释1:200，ab45039，abcam)一级抗体在4℃孵育过夜。第二天用PBS洗涤细胞，然后在二级荧光标记的山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)抗体室温下孵育1小时。用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX51)对染色进行图像采集，免疫荧光信号强度测定用ImageJ软件定量分析，通过RANKL在细胞表面的附着情况评价CST-14对于RANKL/RNAK结合过程的抑制功能。
图2是表明CST-14抑制RANKL与RAW264.7细胞表面RANK直接结合的细胞荧光染色图。
4.RANKL诱导破骨细胞分化及TRAP染色分析
使用细胞爬片培养RAW264.7细胞。PBS或CST-14预处理RAW264.7细胞12小时，后用RANKL50ng/ml刺激RAW264.7细胞7天。Fixation solution(固定液)室温放置，细胞爬片浸没30秒，用去离子水彻底清洗，吸弃时注意易将细胞吸掉。使用1.5mlEP管，各加Fastgarnet GBC Base solution(快速石榴石型碱溶液)和Sodium Nitrite Solution(亚硝酸盐溶液),轻轻混匀30秒，室温静置2分钟。两者混合后配置染色液，并倒入染色缸中水浴加热到37℃，避光孵育1小时，用去离子水彻底清洗爬片，在HematoxylinGill NO.3(苏木精溶液)复染2分钟。自然晾干，甘油明胶封片，显微镜观察。
图3是通过TRAP染色显示CST-14抑制RANKL刺激导致的RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程。
5.CT检测动物骨质疏松模型骨质变化
将各处理组样品收集，竖直放入到指定大小直径20mm的micro CT扫描管中，盖上密封盖；打开microct扫描仓，将盛有样品的离心管按顺序依次摆放在自动样本转换器上，然后关闭扫描仓；在电脑端给计划好的样品依次命名，并设置相关扫描参数，主要参数有：精度/层厚15um，电压70kv，电流200uA，旋转角度180度，曝光时间300ms，选用的滤片为0.5mm铝板，图像矩阵为1024*1024。然后选择感兴趣区域ROI，扫描整段脊柱或胫骨组织。待样品扫描完成后，选择感兴趣ROI区域，对ROI内二维图进行阈值设置Threshoid＝210,进行3D重建。同样的方法对感兴趣区域进行数据分析。最后对数据进行汇总及统计分析。
图4，图5，图7，图8为本部分实验的结果图，通过CT分析显示CST-14治疗对于骨质疏松动物模型中的骨质有很好的保护作用。
6.组织切片制备
将来自所有组的动物组织固定在10％福尔马林中，至少在室温下固定72小时。50％乙醇(60分钟)、70％乙醇(60分钟)、85％乙醇(60分钟)、95％乙醇(60分钟)、100％乙醇(30分钟)、100％乙醇(30分钟)依次进行组织脱水；经过乙醇和二甲苯(60分钟)、二甲苯(60分钟)依次处理；然后用二甲苯和石蜡(60分钟)，石蜡(80分钟)透明；将组织放入盒中，用石蜡填充，然后将其放在石蜡包埋机的冷台上。将嵌入的组织石蜡块置于切片机上并切片，组织厚度约4μm；将含有组织的石蜡片轻轻涂抹在42℃的水中。完全展平后，用干净的玻璃片轻轻拨起切片；将切片放在载玻片上，编号，并在68℃的烤箱中烘烤至少6小时。
7.伊红/苏木素(HE)染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
切片常规脂溶性溶剂脱蜡至水(二甲苯两次，15分钟/每次；100％酒精5分钟；95％酒精5分钟；75％酒精5分钟；50％酒精5分钟)，然后使用伊红或TRAP染色液染色5分钟，用清水冲洗干净后，继续使用苏木素染色液染色5分钟，清水冲洗干净后脱水(50％酒精5分钟；75％酒精5分钟；95％酒精5分钟；100％酒精5分钟；二甲苯两次，15分钟/每次)，后等切片晾干后使用中性树胶封片，放在光学显微镜下观察和分析。
图6，图7为本部分实验的结果图，通过组织化学染色显示CST-14治疗对于骨质疏松动物模型中的破骨细胞分化具有极好的缓解作用。
8.免疫组织化学染色
组织切片脱蜡并水合。即连续二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、95％乙醇8分钟、80％乙醇8分钟和75％乙醇8分钟。在70％乙醇8分钟后，将切片用水冲洗4次，每次5分钟；接下来，将脱蜡和水合的切片置于3％过氧化氢溶液中并在37℃下反应20分钟以阻断内源性过氧化物酶。每次用双蒸水洗涤4次，每次5分钟，修复抗原。将柠檬酸盐缓冲液置于金属加热器中并煮沸。煮沸15分钟，关闭电源并保持15分钟。自然冷却至室温；然后每次洗涤PBS 5次，每次5分钟，擦拭周围组织，加入5％山羊血清，阻断非特异性抗原，在室温下反应1小时，然后将抗体逐滴添加至组织切片，并在4℃下在湿盒中孵育过夜；第二天，取出切片，在37℃培养箱中孵育1小时，用PBS冲洗5次，每15分钟，加入增强的辣根过氧化物酶偶联二抗，室温孵育2小时。用PBS清洗多余的二抗(5次，每次5分钟)；滴加新鲜制备的DAB着色溶液，在光学显微镜下观察，并呈现棕黄色，并用PBS洗涤以停止显色；接下来，进行苏木精复染。将有色切片置修饰的苏木精染色中并染色5分钟。在光学显微镜下观察染色。然后用0.2％盐酸分离切片，并用流水冲洗切片。最后，切片通过70％酒精10分钟、75％酒精8分钟、80％酒精8分钟、90％酒精8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、二甲苯8分钟和二甲苯8分钟依次浸洗。脱水2分钟后，擦拭组织周围的组织并擦拭，滴加中性凝胶，将盖玻片置于光学显微镜下观察。
图8F，使用破骨细胞标记分子Cathepsin K行免疫组化，明确CST-14改善OPG基因敲除小鼠骨质疏松的功能。
9.动物实验
9.1.卵巢切除OVX骨质疏松小鼠模型构建
在10周龄野生型BL6/C57雌性小鼠中建立双侧卵巢切除术(OVX)诱导的骨质疏松症小鼠模型(共21只)。首先，用剃刀和脱毛膏剃掉所有小鼠的背部皮肤,切开皮肤，分离皮下组织并逐层分离，直至显露双侧卵巢。假手术组直接逐层缝合(7只)，OVX组行双侧卵巢切除并充分止血冲洗，逐层缝合切口，其中PBS对照组行腹膜内注射无菌PBS缓冲液，CST-14治疗组行腹膜内注射外源性CST-14(50μg/公斤体重)，每周两次。12周后，将所有组的小鼠用过量的10％水合氯醛(中国齐鲁医院)安乐死，收集脊柱及膝关节组织用于后续试验。
图5及图6本实验的结果图，通过μCT结果，TRAP及HE组织学染色显示小鼠的骨质疏松在CST-14治疗下有明显的缓解。
9.2 CST基因敲除骨质疏松小鼠模型构建
选取6月龄雌性野生型及CST基因敲除小鼠，收集胫骨组织，行CT检测骨质情况，并使用组织学检查，分析比较各基因型骨质疏松严重程度。
图4表明内源性CST缺失导致老年性骨质疏松加速，骨质明显减低，而且骨组织中破骨细胞表达增加。
9.3 RANKL转基因骨质疏松大鼠模型构建
选取12周龄RANKL雌性转基因大鼠，行PBS或CST-14治疗12周，后收集各组大鼠脊柱组织行CT检查，并行TRAP染色组织学检测。分析比较两组骨组织的骨质疏松严重程度。
图7表明RANKL过表达导致老年性骨质疏松加速，骨质明显减低，而且骨组织中破骨细胞表达增加。而CST-14治疗组显示骨质明显改善。
9.4 OPG基因敲除骨质疏松小鼠模型构建
选取24周龄雌性OPG基因敲除小鼠，分为PBS对照组及CST治疗组(各治疗12周，12周龄开始)收集胫骨组织，行CT检测骨质情况，并使用组织学检查，分析比较各基因型骨质疏松严重程度。
图8表明内源性OPG缺失导致老年性骨质疏松加速，骨质明显减低，而且骨组织中破骨细胞表达增加。而CST-14治疗组显示骨质明显改善。
另外，动物实验显示，该分子长期使用(小鼠实验超过3个月)并未见明显脏器损害及小鼠行为变化。
同时，前期体外细胞数据显示CST-14刺激骨肿瘤细胞未产生明显迁移增殖迹象。图9中，骨肉瘤HOS细胞细胞划痕实验及其统计学分析(图9A-9B)，CST未明显促进迁移；图9C.EdU实验，相较于对照组，CST刺激未明显刺激HOS细胞增殖。
上述两项试验均为本领域常用公知试验操作，在此不再赘述。
所有数据均以至少三次独立实验的平均数士标准差表示。对于两组数据的统计学分析采用配对t检验多于两组数据的统计学分析采用单因素方差分析。
通过上述实验，证实CST-14能够直接结合RANKL的细胞表面受体RANK，并且对于多种骨质疏松动物模型有确切疗效，并有效抑制破骨细胞分化。同时，CST-14是一种多肽分子，其分子量21kD,明显小于RANKL单抗分子(地诺单抗等)，相比而言可减少单次使用剂量。
更为重要的是，CST-14制备简单，制备方法纯熟，可直接合成，而前期同类药物，如地诺单抗等，均为生物制剂，因此CST-14较其他同类别RANK/RNAKL信号通路抑制剂可明显降低成本，从而降低患者经济负担。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (4)
1.CST-14在制备老年性骨质疏松症治疗药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体、助剂或稀释剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物剂型为注射剂型。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物通过注射水针、注射粉剂、透皮吸收使用。
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