CN104673735A

CN104673735A - 一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用

Info

Publication number: CN104673735A
Application number: CN201510097328.4A
Authority: CN
Inventors: 杨利国; 罗璇; 梁爱心; 韩丽; 董方晓; 淡新钢
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-03-05
Also published as: CN104673735B

Abstract

本发明公开了一种皮质抑素生长抑素双表达DNA疫苗及制备方法和应用，该疫苗是将合成好的皮质抑素14肽基因片段CST14融合乙肝表面抗原基因的融合基因插入到质粒pIRES上获得pIRES-S/CST14质粒，再将双拷贝生长抑素14肽的乙肝表面抗原融合基因片段S/2SS插入到质粒pIRES-S/CST14中，获得皮质抑素生长抑素双表达DNA质粒，将该质粒转化到大肠杆菌DH5a中，获得大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，CCTCC NO：M2014583。将该质粒作为疫苗直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可显著促进动物生长。

Description

一种皮质抑素生长抑素双表达DNA疫苗及制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因免疫技术领域，具体地说涉及一种皮质抑素生长抑素双表达DNA疫苗及制备方法和应用，包括将生长抑素融合乙肝表面抗原表达基因S/2SS和皮质抑素融合乙肝表面抗原表达基因克隆到具有双表达质粒载体pIRES中，之后转化大肠杆菌DH5a；还涉及该疫苗在促进小鼠生长中的应用。

技术背景

生长抑素(SS)是下丘脑释放的14肽激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别对生长及泌乳具有明显的影响。许多研究证实，应用SS主动或被动免疫动物可以提高GH水平，促进动物生长和泌乳。由于生长抑素分子量小(1658kD)，免疫原性弱，生长抑素常规免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组以增强生长抑素的免疫原性。国外已报道的有应用SS抗血清被动免疫或化学合成SS制成免疫原主动免疫羊、牛等家畜，可以显著提高增重效果，但免疫维持时间短，且化学合成多肽疫苗成本高，基因工程表达产物纯化繁杂，不利于生产推广。国内已开发出激生I号、激生II号等促生长产品，即利用基因工程原理将SS与HbsAg融合基因插入到痘苗病毒的TK基因，构建重组痘苗病毒，接种到鸡胚或细胞上培养产生表达SS-HbsAg融合蛋白的痘苗病毒活载体苗。但此重组活载体疫苗常因诱发机体对载体自身的免疫反应而不能重复使用，此外还存在毒力回升等安全性问题。生长抑素基因免疫可望克服这一缺点，成为促进动物生长的新途径。

生长抑素DNA疫苗免疫原理是通过机体免疫体系激活识别反应原从而产生SS抗体，中和内源性SS，达到促使体内GH的增加，从而促进动物机体生长。本实验室在研究生长抑素DNA疫苗优化构建上梁爱心等构建了真核pGM-CSF/SS生长抑素基因疫苗(专利号：ZL 200610125580.2)并在小鼠生长上进行口服免疫观察对其生长的影响，结果显示SS基因免疫可以有效提高小鼠的体增重，且增重与产生的抗生抑素抗体呈显著相关关系。同时利用佐剂来提高生长抑素免疫原性，薛春林等利用CpGDNA序列的核酸佐剂可以提高GH及IGF-1的分泌水平，促进生长抑素DNA疫苗的免疫效果。严婷等(2006)构建含HbsAgPSS的减毒沙门氏菌口服SS基因疫苗，结果表明该疫苗进入体内不仅表达HBsPSS融合蛋白，刺激机体产生SS抗体促进动物生长，还一定程度上产生增强免疫作用。Han等(2008)以VP22作为佐剂构建生长抑素pEGS2SS-V疫苗，证实小鼠试验实验组体增重方面提高14.1％(P＜0.05)。由于DNA载体疫苗的抗性基因引起的生产成本高、导致临床抗药菌株的播散及被免疫动物的过敏不良反应的问题，本实验梁爱心等成功构建非抗性筛选菌生长抑素真核表达质粒pGS/2SS(专利号：ZL 200810197981.8)，采用肌肉注射和口服两种方式免疫Balb/C鼠，且采用了不同剂量组、不同免疫次数来验证生长抑素DNA疫苗效果。其结果发现，肌肉注射免疫效果要比口服注射的免疫效果IgA、IgG、IgG1、gG2a抗体水平反应强烈，且增重效果增加。

生长抑素DNA疫苗发展到现阶段，选用了单表达SS真核质粒，无论是在质粒载体上的选择，SS基因片段数目(单拷贝和双拷贝)以及通过增加佐剂提高生长抑素DNA疫苗促生长效果都做了大量的研究工作，在这些基础上，生长抑素DNA疫苗在免疫小型动物的免疫应答和增重效果方面取得了较好的效果，但在大动物中免疫裸质粒的效果却不是很佳。

皮质抑素(cortistatin,CST)是de Lecea等1996年在哺乳动物大脑皮质中发现的能够抑制皮质活动的神经肽，在结构上与生长抑素SS具有高度同源性。CST能够与三种受体相结合：生长抑素受体(somatostatin receptors,SSTRs)、生长激素促分泌物受体1a(grow hormone secretagogues receptor1a,GHSR1a)和Mas相关基因X2受体(Mas-related geneX2receptor,MrgX2)。CST的初级表达产物前皮质抑素原由116个氨基酸残基组成，其序列同前生长抑素原具有高度同源性。前皮质抑素含有N-末端分泌信号序列和成对的碱性氨基酸残基是激素原转化酶的作用位点。去信号肽序列后，皮质抑素原进一步裂解产生成熟的CST肽：在大鼠和小鼠位14肽的CST(CST-14)和29肽的CST(CST-29)。CST-14与SS-14由11个氨基酸残基相同，其中包括FWKT四聚体结构(FWKT四聚体是SS与其受体结合的关键性结构)和两个同源性胱氨酸残基。研究表明CST-14和SS-14均相似程度地抑制正常人的生长激素(GH)、胰岛素和ghrelin的分泌。CST-14和SST-14也均能相似程度的抑制生长激素释放激素(GHRH)的促GH释放反应。Ghrelin比GHRH具有更强的促GH释放能力，而且能够被CST-14或SS-14抑制(Broglio F,Arvat E,Benso A,et al.Endocrine activities of cortistatin-14and its interaction with GHRH and ghrelin in humans.J ClinEndocrinol Metab.2002；87:3783-90.)。由于生长抑素DNA疫苗在前期的研究主要处在生长抑素SS和其他生长因子的融合蛋白的作用机理研究，但从内分泌调控通路着手,通过利用有IRES元件的双表达载体PIRES(Cat.No.631605)将与SS相似生理作用的CST和SS共通构建双表达DNA疫苗，从单个融合蛋白的表达到SS和CST两种融合蛋白的双表达，从一种内分泌生长调控途径的变成两种，双表达皮质抑素-生长抑素DNA疫苗促生长作用的研究国内外尚无类似报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒pIRES-S/CST14-S/2SS，该质粒可作为DNA疫苗免疫动物。

本发明的另一个目的在于提供了一种促进动物生长的DNA疫苗菌株DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)；该菌株已于2014年11月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，保藏编号：CCTCC NO：M2014583，该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pIRES-S/CST14-S/2SS质粒。

本发明的最后一个目的是提供一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒pIRES-S/CST14-S/2SS或包含其的大肠杆菌在制备促进动物生长疫苗中的应用，将该质粒作为疫苗直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可促进动物生长。

本发明通过如下技术方案实施：

一种皮质抑素生长抑素双表达的DNA疫苗，是将合成好的皮质抑素14肽基因片段CST14融合乙肝表面抗原基因的融合基因(S/CST14)酶切回收后插入到质粒pIRES上获得pIRES-S/CST14质粒，再从质粒pCS/2SS扩增到含有双拷贝生长抑素14肽的乙肝表面抗原融合基因片段(S/2SS)插入到质粒pIRES-S/CST14中，获得皮质抑素生长抑素双表达DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS，该质粒即为本发明的DNA疫苗。

具体如下：

1)根据cortistatin(Mus musculus)基因序列GenBank(NM_007745.3)，合成cortistatin-14(CST-14)的cDNA序列其两端的酶切位点为NdeⅠ和EcoRⅠ，获得CST14片段；以含Hepatitis B virus strain Huashan乙肝表面抗原片段GenBank(EU926424)的质粒pVAX1-S(将S片段(GenBank(EU926424)插入到pVAX1质粒。)为载体，通过碱基合成方法将CST14片段克隆到乙肝表面抗原5'端后酶切位点NdeⅠ，获得能够表达皮质抑素14肽融合乙肝表面抗原质粒pVAX1-S/CST14。

2)将pVAX1-S/CST14和pIRES两个质粒进行NheⅠ和EcoRⅠ酶切，连接，获得质粒pIRES－S/CST14。

3)利用PCS/2SS质粒通过PCR克隆获得生长抑素融合基因片段S/2SS，上下游引物为：

P1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAATTCCCTGCGCTGAACATG-3’；

P2：5’-GCGTCGACCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAC-3’。

4)S/2SS基因片段和真核表达质粒载体pIRES－S/CST14进行NotⅠ和SalⅠ双酶切，连接，即获得皮质抑素生长抑素双表达DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS。

将该质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转化到大肠杆菌DH5a中，获得了一株含有双表达皮质抑素生长抑素双表达质粒的重组大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，该菌株已于2014年11月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，保藏编号：CCTCC NO：M2014583，该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pIRES-S/CST14-S/2SS质粒。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)为含有双表达皮质抑素生长抑素真核表达质粒pIRES-S/CST14-S/2SS的混合培养物，通过SDS碱裂解法抽提即可得到pIRES-S/CST14-S/2SS质粒。培养基：1L LB固体培养基组成：10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、1.5g琼脂粉。培养条件：PH：6.8-7.8，温度：37℃，为Amp+抗性；在LB固体培养基中用平板划线法检测该培养物是否存活。

一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒pIRES-S/CST14-S/2SS在制备促进动物生长疫苗中的应用，将该质粒作为疫苗直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

本发明的有益效果是：

1、双表达皮质抑素生长抑素DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS,该质粒能够表达免疫原性较强的生长抑素(SS)和皮质抑素(CST)两种蛋白。

2、双表达皮质抑素生长抑素DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS通过肌肉注射免疫小鼠后，其生长抑素和皮质抑素联合作用免疫协调促进小鼠生长，其比已知现有的阳性组生长抑素基因疫苗C500/pGS/2SS在免疫后3-4w后增重效果高出41％，促生长增重效果明显。

3、双表达皮质抑素生长抑素DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS，其获取简单便捷和廉价(去内毒素提取DNA，只需简单的去内毒素一步即可提取(降低获取成本)、免疫方法简单(肌肉注射免疫)、增重效果明显(免疫小鼠体重明显增加)。

附图说明

图1：pVAX1-S/CST14和pIRES质粒酶切图谱。

泳道1和2：pIRES质粒双酶切后获得pIRES基因片段；泳道3-6：pVAX1-S/CST14双酶切后获得S/CST14基因片段；M：DL10000(TAKARA公司)的DNA marker；

图2：pIRES－S/CST14质粒双酶切后图谱。

泳道1和2：pIRES和S/CST14目的片段；M1：DL1000(TAKARA公司)的DNA marker；M2：M：DL10000(TAKARA公司)的DNA marker；

图3：pIRES－S/2SS质粒双酶切后图谱。

泳道1和2：pIRES和S/2SS目的片段；M1：DL1000(TAKARA公司)的DNA marker；M2：M：DL10000(TAKARA公司)的DNA marker；

图4：双表达皮质抑素生长抑素质粒pIRES－S/CST14-S/2SS的构建图谱。

图5：PCR扩增获得S/2SS片段。

泳道1-3：S/2SS目的基因片段；M1：DL10000(TAKARA公司)的DNA marker；M2：M：DL1000(TAKARA公司)的DNA marker；

图6：pIRES-S/CST14-S/2SS双酶切鉴定图谱。

1和2泳道：pIRES-S/2SS和S/CST14片段；3和4泳道：pIRES-S/CST14和S/2SS片段；5和6泳道：pIRES(无IRES片段)和S/CST14-S/2SS片段；M1：DL1000(TAKARA公司)的DNA marker；M2：M：DL10000(TAKARA公司)的DNA marker；

图7：双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES－S/CST14-S/2SS在DH5a细胞中转染48小时后通过RT-PCR进行转录水平的检测结果。

泳道1：阳性对照质粒pIRES-S/CST14的PCR产物得到的S/CST14片段；泳道2：pIRES-S/CST14-S/2SS转染后的cDNA的RT-PCR产物S/CST14片段；泳道3：阴性(H₂O)对照组转染后的cDNA的RT-PCR产物S/CST14片段；泳道4：pIRES-S/CST14-S/2SS转染后的cDNA的RT-PCR产物S/2SS片段，泳道5：pIRES-S/2SS转染后的cDNA的RT-PCR产物S/2SS片段，泳道6：阴性组(pIRES)RT-PCR产物S/2SS片段；M1和M2：DL1000(TAKARA公司)的DNA marker。

图8：双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染Hela细胞的细胞免疫荧光鉴定分析。

A(1-1,1-2,1-3)：pIRES-S/CST14-S/2SS质粒转染Hela检测CST表达；A(2-1,2-2,2-3)：pIRES-S/CST14-S/2SS质粒转染Hela检测SS表达；B(1-1,1-2,1-3)：pIRES-S/CST14质粒转染Hela检测CST表达；C(1-1,1-2,1-3)：pIRES-S/2SS质粒转染Hela检测SS表达；D(1-1,1-2,1-3)：pIRES(Control)质粒转染Hela检测CST表达；D(2-1,2-2,2-3)：pIRES(Control)质粒转染Hela检测SS表达；

图9：双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染Hela细胞的S/CST14和S/2SS两种蛋白表达鉴定图谱。

泳道1：pIRES-S/CST14-S/2SS转染组，泳道2：pIRES-S/CST转染，泳道3：pIRES-S/CST14转染组；泳道4：pIRES-S/2SS转染组；泳道5：pIRES转染(阴性对照组)；泳道6：Hela细胞组(空白对照组)

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或原料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：真核单表达皮质抑素质粒载体pIRES－S/CST14的构建

1、皮质抑素14肽(CST-14)基因片段合成、序列分析和酶切

根据已在GenBank(NM_007745.3)登录的cortistatin(Mus musculus)基因序列，合成cortistatin-14(CST-14)的cDNA序列其两端的酶切位点为NdeⅠ和EcoRⅠ，获得CST14片段；以含Hepatitis B virus strain Huashan乙肝表面抗原片段(S片段)GenBank(EU926424)的质粒pVAX1-S(将S片段(GenBank(EU926424)插入到pVAX1(商品质粒，生工生物工程(上海)股份有限公司购得)质粒中得到的。)为载体，通过碱基合成方法(生工生物工程(上海)股份有限公司)将CST14片段克隆到乙肝表面抗原5'端后酶切位点NdeⅠ，获得能够表达皮质抑素14肽融合乙肝表面抗原质粒pVAX1-S/CST14，其融合片段乙肝表面抗原与皮质抑素14肽片段cDNA开放阅读框为717(bp),编码237个氨基酸。

将pVAX1-S/CST14和pIRES两个质粒进行酶切(2个酶切位点，NheⅠ和EcoRⅠ)，获得片段S/CST14(729bp)和pIRES片段(6100bp)，反应体系总体积20μl，其中含：

PVAX1-S/CST14或pIRES质粒14μl

10×O Buffer(Fermentas)2μl

限制性内切酶NheⅠ0.4μl和酶EcoRⅠ0.8μl

ddH₂O 2.8μl

37℃水浴锅反应3h；

最后，将酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳，以DL10000作为分子量标准，观察电泳结果，获得S/CST14片段(729bp)和pIRES片段(6100bp)(见图1)

2、连接

用纯化试剂盒将酶切产物回收和纯化(参照天根生化科技(北京)有限公司生产的DNA产物纯化试剂盒使用说明书)。纯化后的酶切产物S/CST14片段与质粒载体片段pIRES按如下体系进行连接反应，连接目的片段和载体，连接体系为总体积10μl：

16℃过夜。连接产物质粒pIRES－S/CST14-20℃保存，备用。

3、重组质粒pIRES－S/CST14转化感受态细菌

1)感受态细菌DH5α(天根生化科技(北京)有限公司生产)

2)用热休克法将连接产物转化感受态细菌DH5α，方法如下：

(1)取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入5μl重组DNA(pIRES－S/CST14)，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

(2)42℃水浴中热激45秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇动离心管。

(3)向每个离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,200r/min培养1小时，使细菌复苏。

(4)吸取100μl己转化的感受态细胞加到含有Amp抗生素(50mg/ml)的LB培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板，37℃培养12-14h,出现转化菌落。

4、阳性克隆的筛选、鉴定与测序

从上步的平板中挑取阳性克隆(pIRES－S/CST14)，接种于含有1％Amp抗生素的LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切体系为：10×O buffer 2μl，重组质粒6μl，NheⅠ和EcoRⅠ内切酶分别为0.4μl和0.8μl，加ddH₂O至总体积20μl,鉴定片段S/CST14，37℃，反应2-3h，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，观察酶切结果，电泳条带与目的条带大小相符，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体pIRES－S/CST14。(图2)

5、真核单表达生长抑素质粒载体pIRES－S/2SS的构建

将由本实验室构建的PCS/2SS质粒(曹少先,张文伟,茆达干,等.生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建,表达及免疫[J].农业生物技术学报,2005,13(4):477-481.)中通过PCR克隆，获得生长抑素与乙肝表面抗原融合基因片段S/2SS(789bp)。将基因片段S/2SS插入到pIRES的NotⅠ和SalⅠ两个限制性内切酶位点，在进行上述(2和3步骤)连接反应和转化到DH5a感受态细胞，阳性克隆筛选和鉴定获得真核表达生长抑素质粒载体pIRES－S/2SS。(图3)

实施例2：

双表达皮质抑素生长抑素质粒pIRES－S/CST14-S/2SS的构建(图4)

1、真核表达质粒载体pIRES－S/CST14提取与纯化

从LB平板上挑取新活化的含有pIRES－S/CST14的单菌落，接种至含有1％Amp抗生素10mL LB液体培养基中，37℃、240rpm培养过夜，按体积比1：250的比例稀释到适当体积含有1％Amp抗生素LB中，继续培养12h，离心收集菌体，抽提纯化pIRES－S/CST14质粒。

2、生长抑素融合基因片段S/2SS

由本实验室构建的PCS/2SS质粒(曹少先,张文伟,茆达干,等.生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建,表达及免疫[J].农业生物技术学报,2005,13(4):477-481.)中通过PCR克隆，上下游引物为：

P1：5’-ATAAGAATAATTCCCTGCGCTGAACATG-3’(方框内为限制性内切酶NotⅠ)，

P2：5’-GCCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAC-3’(方框内为限制性内切酶SalⅠ)；

PCR样品总体系20μl，其含有：

PCR反应步骤：1.预变性94℃4min，2.变性94℃30sec，3.退火68℃30sec，4.延伸72℃10min，2-4步35循环，5.保温72℃10min。可以得到连有NotⅠ和SalⅠ两个限制性内切酶789bp的生长抑素与乙肝表面抗原融合基因片段S/2SS(图5)。

3、双表达皮质抑素生长抑素重组质粒的连接

将纯化、回收得到的S/2SS基因片段和真核表达质粒载体pIRES－S/CST14(分别按如下体系进行NotⅠ和SalⅠ双酶切，反应体系为：pIRES-S/CST14质粒或S/2SS基因片段14μl，10×O Buffer(TAKARA)2μl，限制性内切酶NotⅠ0.4μl和酶SalⅠ0.8μl，ddH₂O 2.8μl至总体积20μL，37℃，反应3-5h，酶切后，用低融点琼脂糖凝胶电泳分离回收789bp的S/2SS目的片段和6829bp的pIRES-S/CST14大片段。

然后按如下体系进行连接反应：pIRES-S/CST14片段(6829bp)1μl，S/2SS片段6μl，T4DNA连接酶1μl，Buffer 2μl，16℃过夜。

4、将连接产物热休克法转化入大肠杆菌的DH5a感受态细胞，方法如下:

1)取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入5μl重组DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

2)42℃水浴中热激45秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇动离心管。

3)向每个离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,200r/min培养1小时，使细菌复苏。

4)吸取100μl己转化的感受态细胞加到含有Amp抗生素(50mg/ml)的LB培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板，37℃培养12-14h,出现转化菌落。

6、双表达皮质抑素生长抑素DNA疫苗pIRES-S/CST14-S/2SS的筛选和鉴定

挑取阳性克隆，接种于LB液体培养，提取质粒DNA，进行酶切鉴定，双酶切鉴定重组质粒，酶切体系为：

1)10×O buffer 2μl，重组质粒6μl，NheⅠ和EcoRⅠ内切酶分别为0.4μl和0.8μl，加ddH₂O至总体积20μl，37℃，反应2-3h鉴定片段S/CST14；

2)10×O buffer 2μl，重组质粒6μl，NotⅠ和SalⅠ内切酶均为0.5μl，加ddH₂O至总体积20μl，37℃，反应2-3h，鉴定S/2SS片段；

3)10×O buffer 2μl，重组质粒6μl，NheⅠ和NotⅠ内切酶均为0.5μl，加ddH2O至总体积20μl，37℃，反应2-3h，鉴定S/CST14-S/2SS片段；

1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符(图6)，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序，得到鉴定正确的双表达皮质抑素生长抑素DNA疫苗pIRES-S/CST14-S/2SS。

将该DNA疫苗转化到大肠杆菌DH5a中，获得了一株含有双表达皮质抑素生长抑素双表达质粒的重组大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，该菌株已于2014年11月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，保藏编号：CCTCC NO：M2014583，该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pIRES-S/CST14-S/2SS质粒。

实施例4：

双表达皮质抑素生长抑素DNA疫苗pIRES-S/CST14-S/2SS质粒在体外蛋白表达的检测

1、pIRES-S/CST14-S/2SS质粒转染细胞后转录水平的检测：

用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒，待Hela细胞(人子宫颈癌细胞的细胞系)单层长至60％-70％时按Lipofectamine○RLTX&Plus Reagent脂质体转染试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书进行转染。转染Hela细胞48h后，用胰酶消化并收集细胞。按照Trizol(购自Invitrogen公司)使用说明书提取细胞的mRNA，反转录获得cDNA，根据生长抑素和皮质抑素引物进行扩增。

以反转录得到的cDNA为模板，用CST和SS的primers进行S/CST14和S/2SS两个目的片段的扩增。经1％琼脂糖电泳检测可发现729bp(S/CST14)和789bp(S/2SS)左右的片段(图7)，经上海生工生物工程技术有限公司测序鉴定该片段为生长抑素和皮质抑素的片段，片段全长分别为729bp和789bp。

2、双表达皮质抑素生长抑素DNA疫苗质粒pIRES-S/CST14-S/2SS体外表达的检测

质粒pIRES-S/CST14-S/2SS、pIRES-S/CST14、pIRES-S/2SS和pIRES质粒(空载体转染作为对照)转染Hela细胞中，培养48h后，进行细胞免疫荧光，其中这里用到的兔抗-SS和兔抗-CST，二抗为FITC-羊抗兔，通过共聚焦显微镜观察S/CST14和S/2SS融合蛋白的体外表达情况。

将待检测细胞(脂质体转染后Hela细胞)，首先用PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可)清洗细胞3次，再用4％多聚甲醛固定，室温固定15min(注意，4％多聚甲醛不宜过冷，会造成细胞冷休克)，室温干燥5min，PBS清洗3次，2min/次，再用0.5％Trtion-100透化，室温处理20min，用PBS洗涤3次，5min/次；5％BSA封闭30min，一抗(兔抗SS，购自LSBio公司，货号：LS-C172192；兔抗CST，购自LSBio公司，货号：LS-C143715)用封闭液稀释，浓度为1:1000，37℃孵育2h或4℃过夜；PBS清洗3次，5min/次；二抗(FITC-羊抗兔，购自武汉博士得生物工程有限公司)用PBS稀释为1:100，37℃暗盒内孵育1-2h，PBS清洗3次，5min/次；DAPI染色，用PBS配比为1:100，室温染色5min，然后PBS清洗1次，用DABCO封片，用共聚焦显微镜观察拍照。

双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS在转染Hela细胞48h后，通过间接免疫荧光方法检测质粒是否在真核细胞中表达。

结果表明真核表达质粒载体pIRES质粒转染后的Hela细胞用生长抑素或皮质抑素抗体检测后通过荧光显微镜没有发现绿色荧光，而双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染的细胞经检测后发现绿色荧光(图8)。这结果表明重组质粒转染真核细胞后表达的融合蛋白具有生长抑素和皮质抑素的免疫活性。

3、Western-blot法检测Hela细胞表达蛋白产物

将质粒pIRES-S/CST14-S/2SS、pIRES-S/CST14、pIRES-S/2SS和pIRES质粒转染Hela细胞中，转染24小时后细胞培养液中加入500ug/ml G418(Invitrogen,No.10131035)筛选，筛选6天(就是细胞传两代之后)，用胰酶消化并收集细胞进行蛋白提取，其中相关的Western-blot法步骤如下：

(1)蛋白质提取：取适量的细胞，加入适量的含蛋白抑制剂苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA缓冲液裂解组织，放入细胞、组织破碎仪中进行破碎；放入4℃低温离心机中，以1200rpm离心5min；小心吸取上清液、分装保存于-80℃。(2)分离胶的制备：10％分离胶，H₂O 4ml，30％丙烯酰胺(29：1)3.3ml，1.5M TRIS－HCl(PH 8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，AP 0.1ml，TEMED 5μl，总体积10ml；(3)浓缩胶的制备：5％浓缩胶总体积6ml，H₂O 4ml，30％丙烯酰胺(29：1)1ml，1M TRIS－Hcl(PH 6.8)1ml，10％SDS 80μl，AP 60μl，TEMED 8μl；(4)煮样和取样：将样品从-80℃中取出；配制体系：将样品与loading buffer混合，配成一定的比例。(一般为，loading buffer：样品＝1：4)，将标号的样品放入提前煮沸的沸水中煮5min，迅速放入冰中5min，再把其进行冰埋。(5)电泳：盖好电泳盖，将其放入冰盆中进行电泳，先以90V电泳0.5h，再以120V电泳2.5h。(6)转膜：电泳结束后取下电泳架，将胶取出，将有样品的泳道切下，并在胶上切出标记，放入电转移缓冲液中；PVDF的准备：根据切胶的大小，剪裁PVDF膜，先将其放入甲醇中浸泡数分钟，然后浸于电转移缓冲液中；将转移夹，转移用的海绵及滤纸均浸于电转移缓冲液中；转移夹黑板朝下，从下－上依次放入：海绵－滤纸－胶－PVDF膜－滤纸－海绵；用玻璃棒赶走气泡，扣好转移夹，放入转移盒中，放入电泳槽中，倒入4℃预冷的电转移缓冲液，置于冰盒中；以200mA电转2.5h左右。(7)TBS清洗：电转移结束后，取出膜，放入装有1X TBS的平皿中，以1000rpm左右在摇床清洗3次，每次10min。(8)封闭：将膜装入活封口的塑料袋中，用微量移液器加入适量封闭液，赶出气泡，封口，室温放置1.5－2h。(9)孵育一抗(兔抗SS，购自LSBio公司，货号：LS-C172192；兔抗CST，购自LSBio公司，货号：LS-C143715)：将膜取出，放入新袋中，加入用0.5％脱脂奶粉稀释的一抗，将气泡赶出，封口，4℃过夜。TBST清洗：取出膜后，将其放入装有TBST的平皿中清洗3次，每次10min(10)孵育二抗(HRP-羊抗兔IgG，购自武汉博士得生物工程有限公司)：将膜放入一新袋中，加入用TBST稀释的二抗，赶出气泡，封口，以1000rpm左右在摇床孵育1h。(11)TBST清洗：取出膜，放入装TBST的平皿内清洗3次，每次10min。(12)显影及定影：将洗好的膜放在滤纸上吸干；ECL的配制(A液与B液1:1混合)；显影：将配好的ECL均匀加到膜上，暗处放置5min后吸干多余液体，放入暗盒。定影：于暗室内显影定影，结果扫描入电脑。

双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS在转染Hela细胞后，通过Western-blot方法检测质粒是否在真核细胞中表达生长抑素融合乙肝表面抗原蛋白和皮质抑素融合乙肝表面抗原蛋白两种蛋白。

结果表明真核表达质粒载体pIRES质粒转染后的Hela细胞用Western-blot方法检测在26KDa和28KDa附近没有发现蛋白条带，而双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染的Hela细胞经检测后在26KDa和28KDa附近都发现了明显的蛋白条带(图9)。这结果表明重组质粒转染真核细胞后能够表达生长抑素融合乙肝表面抗原和皮质抑素融合乙肝表面抗原两种蛋白。

4、ELISA试剂盒检测双表达生长抑素皮质抑素质粒转染GH3细胞后表达激素水平检测

将质粒pIRES-S/CST14-S/2SS、pIRES-S/CST14、pIRES-S/2SS和对照组pIRES质粒转染到24孔的GH3细胞(大鼠垂体瘤细胞，购自国家实验细胞资源共享平台，资源编号：3111C0001CCC000008)中(每一个转染孔为3个重复孔)，转染24小时后细胞培养液中加入500ug/ml G418(Invitrogen,No.10131035)筛选，筛选6天后(就是细胞传两代之后)，再加入250ml/孔新鲜培养基24h后收集细胞上清液进行激素生长激素(GH)和催乳素(PRL)检测，采用的是小鼠生长激素(GH)检测试剂盒，灵敏度1pg/ml；小鼠催乳素(PRL)检测试剂盒，灵敏度：0.5pg/ml；均购自武汉基因美生物科技有限公司。

双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS在转染GH3细胞48h后，通过双抗体夹心ELISA试剂盒检测质粒是否在真核细胞中表达激素达到使细胞降低分泌生长激素GH和催乳素PRL两种激素。结果表明(表1)转染后的GH3细胞上清液中，对照组pIRES的GH和PRL激素水平都处于最高水平，而双表达生长抑素皮质抑素质粒pIRES-S/CST14-S/2SS组所表达的GH和PRL的水平都是最低，说明双表达生长抑素皮质抑素DNA疫苗能够表达SS和CST从而达到使GH3细胞中的GH和PRL两种激素降低的作用。

表1转染后GH3细胞中生长激素GH和催乳素PRL水平检测

注：同一行中字母完全不同者为差异显著(P＜0.05)，字母有相同者为差异不显著(P＞0.05)

实施例5：

一种皮质抑素生长抑素双表达的质粒pIRES-S/CST14-S/2SS在制备促进动物生长疫苗中的应用：

本实验室已经构建好非抗性筛选生长抑素基因疫苗C500/pGS/2SS(专利号：ZL200810197981.8)接种最佳免疫剂量0.2×10¹⁰CFU/只在疫苗安全性上且对小鼠增重效果上(加强免疫1次)都有显著的促生长作用(P＜0.05)。因此本实验采用非抗性筛选生长抑素基因疫苗C500/pGS/2SS作为阳性参照物，来比较新型的双表达生长抑素皮质抑素基因疫苗pIRES-S/CST14-S/2SS是否能够达到促进小鼠生长，观察鉴定疫苗的免疫效果，试图为新型的双表达生长抑素基因疫苗的发展推动其在生产中的应用。

2材料和方法

2.1质粒和菌株

无抗性筛选生长抑素菌株C500/pGS/2SS，双表达生长抑素皮质抑素菌株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)成功构建并保存于-70℃

2.2实验动物饲养管理

自湖北省疾控中心购买3周龄左右的SPF级雌性昆明小鼠180只，预饲1w后，称重随机分组(各组之间小鼠平均体重无显著差异)，进入试验期，饲养于动物房，控制饲养温度在25℃左右，标准饲料和常规饮水饲养。实行笼养，每笼5只，每周进行一次卫生清洁，每天观察采食、饮水是否正常，是否出现由于肌肉注射或采血应激而死亡现象。每周记录各小鼠的体重，观察小鼠生长发育是否正常。

2.3疫苗的免疫及样品采集(N表示样本数，除C500/pGS/2SS菌免疫组外，每只小鼠共注射100微升免疫疫苗)

免疫前(第一次称重)、在第二次免疫后2周、4周、6周和8周进行称量小鼠体重；

加强免疫(即免疫两次疫苗)后2周、4周、6周和8周对小鼠进行断尾采血，采集血清进行检测激素和抗体水平。

2.4实验试剂及配制

羊抗小鼠辣根过氧化物(HRP)标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；羊抗小鼠IgG1-HRP和IgG2α-HRP标记的二抗购自华瑞康生物公司；DAP、生长抑素标准抗原(S9129)及TMB均购自Sigma-Aldrich公司；ELISA酶标板购自深圳市金灿华实业有限公司；标记物苦味酸和抗凝剂肝素钠购自北京普博欣生物科技有限责任公司；小鼠生长抑素(SS)酶联免疫检测试剂盒及小鼠皮质抑素放射性免疫检测试剂盒、小鼠生长激素放射性免疫检测试剂盒均购自北京华英生物公司。

PBST(pH 7.4)：8g NaCl，0.2g KCl，5.8g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，加ddH2O定容至1000ml，再加0.5ml Tween-200。

包被液：即25mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)；1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加ddH2O定容至1000ml。

封闭液：即含1％BSA的PBST缓冲液。

底物缓冲液：24.3mL 0.1mol/l柠檬酸溶液，25.7mL 0.2mol/l Na2HPO4溶液，加ddH2O定容至100ml。

TMB溶液：0.2g TMB，20μL 30％H2O2，加无水乙醇定容至100ml。

TMB底物显色液：A液：0.75ml TMB溶液加ddH2O至7.5mL；B液：45μl 0.75％过氧化脲溶液，加7.5ml底物缓冲液；A液与B液等比例混合，现配现用。

终止液：即2M H2SO4；21.7ml 98％H2SO4加入178.3mL ddH2O中稀释。

2.5小鼠血液采集

分别于免疫前和试验结束后，用断尾采血法采集小鼠血液，收集于有20μL EDTA抗凝剂/管的1.5mL EP管中，3000r/min离心10min，小心吸取上层血浆，分装约200μL/管，置于-20℃保存备用。2.6抗体检测

2.6.1生长抑素抗体的检测

用间接ELISA方法定量检测SS抗体，具体步骤如下：

(1)96孔酶标板每孔包被标准生长抑素抗原(Sigma-Aldrich，S9129)100ng/100μL，4℃孵育过夜；

(2)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次1min；

(3)加封闭液(即1％BSA溶液)200μl/孔，37℃孵育1h；

(4)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次1min；

(5)加待测血浆(1:200稀释)100μl/孔，同时设置阴性对照孔、非特异性吸附孔(即PBST代替血浆)以及调零孔，37℃孵育1h；

(6)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次1min；

(7)加羊抗鼠IgG-HRP(Boster，BA1050，1:2000稀释)100μl/孔，37℃反应1h；

(8)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次1min；

(9)加TMB底物显色液150μl/孔，避光反应25min；

(10)加2mol/l H2SO4终止液50μl/孔终止反应，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。

3结果与分析

3.1小鼠的增重比较

实验中，对小鼠进行了肌肉注射加强免疫(即连续免疫了小鼠2次，在第一次免疫后1周进行了第二次免疫)。小鼠的体重在加强免疫后的2周、4周、6周和8周进行采集和结果分析。

从表2可以看到低剂量组双表达质粒pIRES-S/CST14-S/2SS免疫小鼠的体重增重在0-2w间，其小鼠的增重体重低于C500/pGS/2SS菌阳性组16％但无差异性，但在3-4w，5-6w和7-8w的时候都处于各时间段的免疫组小鼠增重最高，且小鼠免疫效果的增重都显著高于阳性组41％、4％和10.2％(P＜0.05)。

因此，我们可以认为双表达生长抑素皮质抑素pIRES-S/CST14-S/2SS组低剂量组对小鼠的增重效果相对于原有的非抗性筛选生长抑素疫苗C500/pGS/2SS菌的增重效果显著且有超越其增重优势之趋。

表2：不同剂量和生长抑素基因疫苗免疫小鼠后的增重比较(Mean±SEM)

注：同一列中字母完全不同者为差异显著(P＜0.05)，字母有相同者为差异不显著(P＞0.05)，体重均值用Mean±SD表示

5.4小鼠的SS IgG水平检测

由表3可以看到，在抗体阳性值来看三个剂量组(高、中、低)双表达质粒免疫小鼠的SS IgG阳性率分别为：65％，70％和80％，抗体阳性率与双表达质粒疫苗的剂量成反比关系，而在抗体阳性值浓度上也可以看到三个剂量组的最大阳性值也同样呈反比关系，低剂量组的阳性值高达8.03pg/ml≈2×高剂量组小鼠的抗体阳性值4.49pg/ml。

而在单表达CST组、单表SS组和联合免疫组中，三组间小鼠的SS抗体阳性率一样都是75％，且最高阳性值为7.15，6.42和7.10幅度相差不大，但是在阳性值的平均值却呈现了联合免疫的抗体平均值处于三组间最低。

低剂量组双表达质粒组疫苗与阳性组C500/pGS/2SS菌免疫组小鼠的血浆中的SS抗体阳性率相比较来看，虽然低剂量组的阳性率85％远低于阳性组的100％，但是阳性组的最大值、平均值(5.22和1.80±0.31pg/ml)均比低剂量组的阳性抗体值低(8.03和1.96±0.46pg/ml)。说明在双表达剂量组中，低剂量组的SS抗体阳性值虽然阳性率不能呈现最高100％的阳性率，但是在抗体阳性浓度阈值上呈现了一定的优势。

表3：不同剂量和生长抑素基因疫苗免疫小鼠后的SS IgG阳性值比较

注：同一列中字母完全不同者为差异显著(P＜0.05)，字母有相同者为差异不显著(P＞0.05),SS的IgG的阳性值选择以A-B≥2SD(其中A为待测血样的SS IgG的浓度值，B为阴性对照组的浓度值)，SS IgG浓度值用Mean±SEM表示。

Claims

1.一种促进动物生长的DNA疫苗菌株，所述的菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a(pIRES-S/CST14-S/2SS)，保藏编号：CCTCC NO：M2014583。

2.权利要求1所述菌株包含的皮质抑素生长抑素双表达的DNA质粒。

3.权利要求2所述质粒的制备方法：

1）根据cortistatin(Mus musculus)基因序列GenBank(NM_007745.3)，合成cortistatin-14(CST-14)的cDNA序列其两端的酶切位点为NdeⅠ和EcoRⅠ，获得CST14片段；以含Hepatitis B virus strain Huashan乙肝表面抗原片段GenBank（EU926424）的质粒pVAX1-S为载体，通过碱基合成方法将CST14片段克隆到乙肝表面抗原5'端后酶切位点NdeⅠ，获得能够表达皮质抑素14肽融合乙肝表面抗原质粒pVAX1-S/CST14；

所述的质粒pVAX1-S为将S片段GenBank（EU926424）插入到pVAX1质粒得到；

2）将pVAX1-S/CST14和pIRES两个质粒进行NheⅠ和EcoRⅠ酶切，连接，获得质粒pIRES－S/CST14；

3）利用PCS/2SS质粒通过PCR克隆获得生长抑素融合基因片段S/2SS，上下游引物为：

P1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAATTCCCTGCGCTGAACATG-3’；

P2：5’-GCGTCGACCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAC-3’；

4）S/2SS基因片段和真核表达质粒载体pIRES－S/CST14进行NotⅠ和SalⅠ双酶切，连接，即获得皮质抑素生长抑素双表达DNA质粒pIRES-S/CST14-S/2SS。

4.权利要求1所述菌株或权利要求2所述质粒在制备促进动物生长DNA疫苗中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，所述的动物为小鼠。