CN1366061A - 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 - Google Patents
生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1366061A CN1366061A CN 02103724 CN02103724A CN1366061A CN 1366061 A CN1366061 A CN 1366061A CN 02103724 CN02103724 CN 02103724 CN 02103724 A CN02103724 A CN 02103724A CN 1366061 A CN1366061 A CN 1366061A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbs
- plasmid
- gene
- puc12
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明生长抑素基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程体,属生物新技术领域。其构建过程是:人工合成生长抑素(SS)基因,构建pUC12－SS质粒。并将其改造成pUC12－SS2质粒。然后,从pWR13－HBs/6质粒切下HBs片段,与切开的pUC12/SS2连接,构建成带HBs/SS融合基因的pUC13/－HBs/SS质粒。最后用PCR扩增出该质粒中的HBs/SS与pcDNA3.1质粒连接,构建成pcDNA3.1－HBs/SS质粒。将其转化感受态大肠肝菌,即成本发明的基因工程体－Ecoli－pcDNA3.1－HBs/SS。
Description
本发明为构建生产用于家畜和家禽促进生长的生长抑素基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程体，属生物高新技术领域的尖端产品。
一个世纪以来，对疫苗主动免疫和以抗体被动免疫的研究一直是免疫学的重点。传统的疫苗和抗血清被用于诱导机体产生免疫力，以对抗病原体或毒素。随着生物化学、免疫学、神经内分泌学和生物工程学的发展，一门崭新的边缘学科——激素免疫学相应兴起，并衍生出激素免疫中和技术(HIN)，即用主动诱导或被动输入抗激素抗体以中和内源性激素的生物活性，从而影响、调控内分泌系统的一种极为灵敏的、高特异性的方法。这一技术无论对基础理论研究还是在畜牧业、医学等方面均具有重要意义。
激素在动物体的物质代谢和细胞分裂、分化，组织器官的发育和生长，体内环境的相对恒定，以及对有害环境的适应等生理过程中起着重要作用。体内各种激素的基础分泌量是相对稳定的，激素分泌的调节一是通过中枢神经系统，二是通过反馈方式。以往，人类通过给动物注射额外的激素来调节或打破动物体内自身的生理平衡而达到某种目的。如注射促黄体激素释放激素(LHRH)、绒毛膜促性腺激素(HCG)以促进排卵、提高受胎率和控制同步发情；给肉鸡皮下埋植乙烯雌酚作化学去势，以改善肉质。但外源激素易破坏动物体内激素的平衡，造成激素调节的紊乱，并且当在食用动物上应用时，可能会有激素残留的问题。
应用激素免疫中和技术中和激素活性，通过免疫调节亦能达到相应的目的，但不会造成激素残留，并且更方便。目前，主要通过两种方式：①直接应用激素制成疫苗，激发动物产生抗体以中和激素活性，如用HCG制成避孕疫苗，用雄烯二酮制成多胎疫苗等；②用下丘脑分泌的调控激素制成疫苗，通过调控激素间接调节某种内源激素的释放。
动物生长是一种十分复杂的生理效应，参与生长调节的激素有多种：生长激素(GH)、生长介素(SM)亦称胰岛素样生长因子(TGFs)、生长抑素(SS)、生长激素释放因子(GRF)、胰岛素、甲状腺素(TSH)、催乳素(PRL)等。其中GH和SM为调节核心，GH的主要作用是与肝细胞上的受体结合后，促使肝脏合成和分泌SM，而SM则能直接作用于多种组织，促进蛋白质合成、细胞增殖，促使肌肉、内脏和骨骼的生长。而GH和SM的合成和分泌又受多种激素的影响，下丘脑分泌的两种高位调节激素GRF和SS，前者促进GH合成和分泌，后者起抑制作用。此外，腺垂体产生的TSH、PRL和胰岛细胞产生的胰岛素均对肝脏产生SM起正向调节作用。
直接应用GH、SM等低位调节激素注射动物亦能取得一定的增重效果，但往往因反馈作用和其他影响而破坏激素平衡。例如注射GH时，胰岛素分泌受到抑制，而后者又可影响肝脏SM的生成。其次，直接应用激素，可能会造成激素残留。因此，通过HIN技术中和体内SS，从而解除抑制，使GH、SM及其他正向调节的激素水平提高，必将成为促进动物生长的更理想的方法。
生长抑素(SS)在哺乳动物和鸟类中都是相同的，无种属特异性。SS很小，无免疫原性，必须与蛋白质载体连接后，制成复合抗原，才能激发动物产生抗体。常用的载体蛋白有：人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等。由于天然提取的SS十分昂贵，从50万头绵羊下丘脑中提取才能得到纯品8.5mg。因此，早期多采用人工合成的SS连接载体后，制成免疫原，此类疫苗称为合成肽疫苗。
斯潘塞(Spencer)等将人工合成的SS连接于α-球蛋白，制成合成肽疫苗，用以免疫绵羊，观察3个月，结果试验组比单独注射α-球蛋白的对照组增重17.6％，首次证实SS主动免疫能促进动物生长。随后他们进一步用SS合成肽疫苗免疫妊娠母羊，结果免疫组羔羊初生体重比对照组高10％，免疫母羊早期泌乳量亦比对照组显著增多(9％)，使试验组羔羊差别生长速度显著高于对照组。经屠宰试验，两组骨骼、肌肉、脂肪之间比例正常，不属于畸形发育。
对肉牛免疫试验也获得成功，免疫牛血中SS抗体和GH水平均显著升高，平均日增重提高17.6％，SS抗体效价与日增重呈正相关。
但人工合成SS成本太高，不适于大规模推广应用。发明人之一杜念兴教授，于七五期间主持农业部生物技术重点项目——生长抑素基因工程疫苗研究。最早构建的工程菌，其表达产物为SS与β半乳糖苷酶融合蛋白，用粗提的表达产物免疫大白鼠，取得了初步免疫效果。但考虑到此种单决定簇的可溶性亚单位苗，其免疫原性不强，且提取困难。因此，进一步将SS基因插入人乙肝表面抗原(HBsAg)基因，并在痘苗病毒中得到表达，表达产物——HBsAg/SS呈病毒样颗粒，具有良好的免疫原性。重组痘苗病毒(vv-HBs/SS)大量增殖后，毋需提取，即可应用，称为生长抑素基因工程活载体疫苗，简称激生1号苗。经实验室小试，增重效果显著。于1995年通过农业部鉴定，被认为国内外第一个有望用于促进家畜生长的基因工程苗，处于国际领先水平。建议进行中试，尽快将本成果推广应用，转化为生产力。1997年列入国家科委(科技部)中国生物技术开发中心863中试项目，并经农业部农业生物遗传工程体及其产品安全委员会审批为安全等级1级。经中间试制和田间试验结果表明：该疫苗生产工艺简单，不造成环境污染，免疫猪、牛、羊等家畜安全有效。于1999年批准商品化生产，并申报专利。专利申请号为00107295.1。2000年通过科技部验收，同年获得大北农科技成果奖和香港中华专利博览会金奖。
鉴于激生1号疫苗只能用于家畜，不能用于家禽，免疫期3个月，再次免疫时因产生抗痘苗病毒抗体，效果不理想。为弥补以上缺点，又设计研制了生长抑素基因工程亚单位苗。先后构建了多株基因工程体，所制的疫苗分别简称为激生2号苗和激生3号苗。以上2种疫苗的基因工程体均已报请专利，申请号分别为00105675.1和02104212，8。
但科学的发展是无止境的，特别是近年来生命科学的进展，突飞猛进。在疫苗领域又出现比基因工程更先进的，被称为第三代疫苗的基因疫苗(亦称DNA疫苗)。基因疫苗在动物细胞内能持续表达2～3个月，不断分泌免疫原。强化免疫效果。一次免疫有效期可达5个月。这是基因疫苗的最大优点。目前在生长抑素疫苗的领域内，还没有生长抑素基因疫苗。
本研究的目的是提供生产生长抑素基因疫苗的基因工程体。使其表达产物呈颗粒性多价免疫苗，免疫原性优于常规基因工程亚单位苗。所构建的基因工程体可用发酵生产，回收菌体，提取质粒后，即直接配苗。生产工艺简便，适于大规模生产，成本低廉，使用方便，无激素残留，无潜在危险。疫苗免疫后，该表达质粒能在动物细胞内表达2～3个月，不断分泌免疫原，诱导产生SS抗体，从而促进动物生长。其免疫期较长，且可多次加强免疫，提高免疫增重效果。
本发明为用于生产生长抑素基因疫苗的基因工程体，其特征在于：将SS基因插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密码子之后，构建成HBs/SS融合基因。并将其插入能在直核细胞内持续表达的pcDNA3.1质粒，转化感受态大肠杆菌，即成本发明的基因工程体-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
菌种分类：大肠埃希氏杆菌
命名：E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
保藏单位：中国微生物菌种保管委员会普通微生物中心
保藏地址：中国北京中关村2714信箱
保藏号：0709
其主基因为SS基因，它是14个氨基酸组成的短肽，各种哺乳动物和禽类之间无种属差异。
SS的氨基酸序列和碱基密码如下：
本发明生长抑素基因疫苗的基因工程体，其特征在于：用以下方法构建而成。1 人工合成SS基因
设计将SS基因5’端加BamHI酶切位点，3’加2个终止子和HindIII位点，在2个酶切位点之外均有2个保护性碱基；在BamHI位点之后，加1个框架保证碱基；在SS第1个氨基酸密码子之前，加了1个甲硫氨酸(M)密码子，以便在融合蛋白中，用溴化氰裂解出SS多肽分子。全部基因设计如下：
SS基因
BamHI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’-TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 终止子TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA-3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT-5’
HindIII
人工合成正负2条中间有12个碱基互补的寡聚DNA片段，分别称为L1和L2，序列如下：L15’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT
BamHI
TTC ACA TCC TGT3’L25’-TAAAGC TTA CTA ACA GGA TGT GAA 3’
HindIII 终止子
将L1和L2按常规方法退火、延伸、补齐，即获得按设计要求的SS基因。用BamHI和HindIII双酶切后，回收带粘性末端的SS基因，即可用于连接反应。2 pUC12-SS质粒的构建
从E.coli-pUC12提取pUC12质粒，用BamHI和HindIII双酶切，回收酶切大片段，在连接溶液中，与带粘性末端的SS基因连接，即获得pUC12-SS重组质粒，将其转化感受态大肠杆菌JM103(DE3)。将转化后的大肠杆菌接种含氨卡青霉素(AMP)、β半乳糖苷酶(Lacz)、半乳糖苷(xgal)和异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，在37℃培养12h，挑选白色菌落，大量培养后作酶切鉴定和序列分析。
培养后，提取质粒，分别用SmaI、BamHI和HindIII单酶切。所选菌落不被SmaI切开，而能被HamHI和HindIII切开，表明构建成功。
上述所提取的质粒DNA，用常规双脱氧终止法测序，测序结果如下：
M 1 2 3 4 5 6 7 8.........GGA TCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG
BamHI SS基因9 10 11 12 13 14 终止子
测序结果与设计要求完全符合，表明pUC12-SS质粒构建成功。3 pUC12-SS质粒的改造
在pUC12-SS初级质粒中，在SS基因的3’端之后，尚有一个多酶切位点，其中包括BamHI和HindIII等重复位点。因此加以改造以除去这些重复酶切位点。
提取pUC12-SS质粒，用HindIII单酶切，将其切开后，重新连接。转化感受态大肠杆菌，提取质粒DNA，分别用HamHI和PsTz单酶切，挑选保持有HamHI位点，而PstI位点消失的菌落作进一步鉴定。
从上述重组大肠杆菌提取的质粒DNA，再用HamHI、HindIII、EcoRI、SacI、SalI和PstI作单酶切。结果所选菌株均保持HindIII、BamHI、EcoRI、SacI等位点，而SalI和PstI位点消失。证明pUC13-SS2质粒的改造成功。
上述pUC12-SS2质粒用双脱氧末端终止法测序。
结果，SS的DNA序列以及附近酶切点的DNA序列完全正确，证实了可以用pUC12-SS2作为基因嵌入的受体。所测序列如下：
M 1 2 3 4 5 6.......GAATTC GAGCTC GCCC GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC
EcoRI SacI BamHI SS基因7 8 9 10 11 12 13 14 终止子
4 pUC13-HBs/SS质粒的构建
首先提取带HBs的质粒一pWR13-HBs/6，用SacI和BglII双酶切，回收700bp左右的带粘性末端的HBs-DNA片段，然后提取上述改造的pUC12-SS2质粒，用SacI和BamHI双酶切，回收质粒大片段，与HBs连接后，获得pUC12-HBs/SS重组质粒。
用HindIII和BamHI双酶切pUC12-HBs/SS，得到约为730bp片段，即为HBs/SS融合基因。表明pUC13-HBs/SS质粒构建成功。
同上法测定HBs/SS融合基因的DNA序列，结果如下：5’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCGATCGACCTGCAGGTCGAGGACTGGGA
Sma IBamH IXbal Sal I/Sal I Pst ISal I/Xhol
HBs 1 2 3 4 217 218 219 220 221 222CCCTGCACCGAAC ATG GAG AAC ACA…… ATT TTC TTT TGT CTT TGG223 Ser Asp Pro Met 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10GTA TCA GAT CCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TCC TGG AAG ACT11 12 13 14TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTT GGCA 3’
终止子 HindIII
前1～223为HBs的密码子，后1～14为SS基因的密码子。阅读框架以及起码终止码都完全正确。证实pUC12-HBs/SS质粒建成功。5 pcDNA3.1-HBs/SS质粒的构建
设计和合成1对HBs/SS融合基因的引物L1和L2。
L15’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’
Hind III
L2 5’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT3’
EcoRI 终止子
然后提取pUC12-HBs/SS质粒，供作PCR的DNA模板。用PCR扩增出带有酶切位点和终止密码的HBs/SS融合基因。
提取pcDNA3.1质粒，用HindIII和EcoRI双酶切，用收质粒大片段，与同样酶切的HBs/SS基因连接，获得pcDNA3.1-HBs/SS重组质粒，转化感受态大肠杆菌，即获得用于生产生长抑素基因疫苗的基因工程体-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
本发明所构建的基因工程体，经大量发酵后，回收菌体，提取质粒，即可用以配制，用以促进家畜、家禽生长的SS-DNA疫苗。本疫苗与现有同类产品相比，具有以下优点和积极效果：
1.本基因工程体表达产物-HBs/SS融合蛋白能形成大小20nm左右的病毒样颗粒(VLP)。见图5。颗粒表面暴露有多个SS表位，是一种多价颗粒性抗原，其免疫原性优于常规基因工程亚单位苗。
2.本疫苗中的表达质粒能在宿主肌肉细胞或上皮细胞内，持续表达2～3个月，不断分泌HBs/SS融合蛋白，强化免疫效果，一次免疫可以持续增长5个月以上。仔猪免疫一次即可达到出栏体重。对大家畜如乳牛可间隔一定时间加强免疫一次，可促使整个泌乳期的乳产量增加，亦可用蛋鸡，蛋鸡增加蛋产量。
3.本疫苗中的表达质粒，在宿主细胞内停止表达后，即自行降解，不整合细胞，没有激素和其他有害物质残留，无任何潜在危险。安全性良好。
4.本基因工程体发酵后，回收菌体，提取质粒，即可用以配制SS-DNA疫苗。生产工艺简便，适于大规模工业化生产，成本低廉。在生产过程中，不排毒，不散毒，不污染环境，是一种绿色企业。
5.SS-DNA疫苗可用于家畜、家禽促进生长，可与激生1号苗或激生3号苗配合应用，也可单独应用。可多次加强免疫，其应用面覆盖整畜牧业领域，应用面广，市场前景十分宽阔。
图1 pUC12-SS质粒的构建
图2 pUC12-SS质粒的改造
图3 pUC12-HBs/SS质粒的构建
图4 pcDNA3.1-HBs/SS质粒的构建
图5 由HBs/SS融合蛋白组装成的病毒样颗粒电镜图
实施例：1 人工合成SS基因
为了便于基因操作，设计将SS基因5’端加BamHI酶切位点，3’加2个终止子和HindIII位点，在2个酶切位点之外均有2个保护性碱基；在BamHI位点之后，加1个框架保证碱基；在SS第1个氨基酸密码子之前，加了1个甲硫氨酸密码子，以便在融合蛋白中，用溴化氰裂解出SS多肽分子.全部基因设计如下：
SS基因
BamHI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCGM ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’-TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 终止子TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA 3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT5’
HindIII
人工合成正负2条中间有12个碱基互补的寡聚DNA片段，分别称为L1和L2，序列如下：L15’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT
BamHI
TTC ACA TCC TGT 3’L25’-TAAAGC TTA CTA ACA GGA TGT GAA 3’
HindIII 终止子
化学合成是以保护核苷β-氰乙基-亚磷酰胺为缩合单体，经四氮唑活化后，在固相载体上逐个延长寡核苷酸DNA链。在自动合成仪上进行，待合成至所需长度，取下载体，加浓氨水，置50～55℃处理过夜，即可获得寡聚DNA片段的粗品。经PAGE电泳后，得到纯品。然后在Sephadex G-25柱上，用重蒸去离子水上洗脱去盐，无水乙醇浓缩后，分别溶于一定量的pH8.0的TM缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl、0.1mol/L MgCl2)中。
分别将Ll与L2按常规方法退火。先按《分子克隆实验指南上介绍的方法》配制10×dsDNA合成反应缓冲液，然后按下法配制反应液：
退火后的DNA片段 50μl
10×dsDNA合成反应缓冲液 10μl
10mmol/L dNTP 10μl
灭菌超纯水 20μl
DNA聚合酶Klenew1片段 1.5μl
混匀后，置37℃水浴1.5h，将该DNA片段延伸、补齐。然后再加入5mmol/LNaCl 6μl，无水乙醇300μl，置冰浴中过夜，12000g离心15min，取沉淀，再加入预冷的70％乙醇200μl，混匀，同上法离心，取沉淀悬浮于20μl pH8.0的TME缓冲液中。即获得按设计要求的SS基因。-20℃冻存备用。2 构建pUC12-SS质粒2.1 SS基因的酶切
人工合成、退火、补齐后的SS基因，分别用BamHI和HindIII双酶切，回收带粘性末端的SS基因，即可直接用于连接反应。2.2 pUC12质粒的提取、酶切和回收
质粒的提取按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行，用BamHI和Hind III双酶切。取10μl酶切产物进行1％琼脂糖电泳，回收酶切大片段，置液氮中冷冻10min，然后置37℃水浴中融化，10000r/min离心10min，吸取上清，置-20℃冻存备用。2.3 连接
按DNA连接药盒说明书进行，其反应体系如下：
pET32c质粒双酶切回收产物 2.5μl
SS基因双酶切回收产物 7.8μl
DNA连接溶液 10μl
混匀后，置16℃反应30min后，即为pUC12-SS质粒，立即可用于转化。2.4 感受态细胞的制备
参照《分子克隆实验指南》介绍的方法制备大肠杆菌JM103感受态细胞。2.5 转化
取10μl连接产物转化200μl JM103(DE3)感受态细胞，具体操作参照《分子克隆实验指南》介绍的方法进行。取200μl转化大肠杆菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB琼脂平板，同时设未转化的感受态大肠杆菌作对照(阴性对照)，接种后置37℃液箱，培养18h。2.6 pUC12-SS质粒克隆株的筛选
pUC12质粒含有氨卡青霉素抗性基因，同时还有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。含有该质粒的大肠杆菌在半乳糖苷(Xgal)和异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)存在的情况下，由于β-半乳糖苷酶的诱导表达，而生长为蓝色菌落。外源基因插入后，该基因由于移码而失活，则所长菌落呈白色。将上述转化后大肠杆菌接种于含Amp Xgal和IPTG的LB平板上，37℃培养12h。挑选白色菌落，大量培养后，进一步作酶切鉴定。2.7 重组质粒酶切鉴定
在pUC12质粒的BamHI和HindIII之间尚有1个SmaI位点。SS基因插入后，此位点消失，BamHI和HindIII则仍保留。将上述选出的大肠杆菌大量培养后，提取质粒，分别用SmaI、BamHI和HindIII单酶切。所选菌落均不被SmaI切开，而能被BamHI和HindIII切开，表明克隆成功。2.8 重组质粒序列分析
按《分子克隆实验指南》Sanger双脱氧链终止法测序，由于pUC12质粒DNA与M13菌体在DNA多酶接头处有一致的序列。因此序列分析物采用M13 17寡聚核苷酸片段作引物，并以[r-32P]ATP作同位素源。序列分析结果表明，克隆基因的碱基序列与设计的SS基因完全符合，证实目的的基因已在大肠杆菌JM83中克隆成功，pUC13-SS质粒的构建完成。见图1。所测序列如下：
M 1 2 3 4 5 6 7 8.........GGA TCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG
BamHI SS基因9 10 11 12 13 14 终止子3 pUC12-SS质粒的改造
在pUC12-SS初级质粒中，在SS基因的3’端之后，尚有一个多酶切位点，其中包括BamHI和HindIII等重复位点。因此加以改造以除去这些重复酶切位点。3.1 用HindIII酶切pUC12-SS质粒
取pUC12-SS质粒(0.3mg/μl)5，然后加入10×中盐缓冲液1μl，重蒸离子水2μl，HindIII内切酶2μl，总体积为10μl。37℃保温2h后，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，以检测酶切是否完全。3.2 克隆株的筛选
上述酶切完全的DNA，经过酚、氯仿抽提和酒精沉淀，并溶于7μl重蒸去离子水中，然后分别加入ATP(10mmol/L)1μl。10×T4连接反应缓冲液1μl。T4 DNA连接酶(5u/μl)1μl，混匀，15℃保温过夜。参照《分子克隆实验指南》所示方法，转化感受态大肠杆菌，挑取5个菌落，培养后提取少量质粒DNA。每个样品各取4μl，分别作HamHI和Pst I单酶切。并经琼脂糖凝胶电泳。检查酶切结果。选择保持有HamHI位点，而Pst I位点消失的菌株，作进一步鉴定。3.3 多酶切位点的鉴定
在以后的基因融合的过程中，要运用一些酶切位点，故对克隆株需再用HamHI、HindIII、EcoRI、SacI、SalI和PstI作单酶切。结果所选菌株均保持HindIII、BamHI、EcoRI、SacI等位点，而SalI和PstI位点消失。证明pUC13-SS2质粒的改造成功。3.4 DNA序列分析
采用双脱氧末端终止法，直接以碱裂解的pUC12-SS2 DNA为模板，[α35-S]dATP为同位素源测定，结果，SS的DNA序列以及附近酶切点的DNA序列完全正确，证实pUC12-SS构建成功，见图2。所测序列如下：
M 1 2 3 4 5 6......GAATTC GAGCTC GCCC GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC
EcoRI SacI BamHI SS基因7 8 9 10 11 12 13 14终止子
4 pUC12-SS/HBs的构建4.1 从pWR13-HBs/6质粒切取HBs DNA片段
从本组保存的带HBs的E.coli-pWR13-HBs/6按2.2法提取质粒，取pWR13-HBs/6 DNA 15μl(5μg)，加入中盐缓冲液3μl、水10μl SacI和BglII各1μl，总体积30μl，37℃反应2h。经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切下回收700bp左右面的HBs-DNA片段，并经抽提纯化。4.2 HBs与SS基因融合和pUC13-HBs/SS质粒的构建
提取上述构建的pUC12-SS2质粒经SacI和BamHI双酶切，抽提纯化后，加入HBs-DNA片段，进行连接反应。反应体系为：切开的pUC12-SS DNA 0.1μg，加入HBs基因片段0.5μg、10倍连接缓冲液1μl、10mmol/L ATP 1μl、T4DNA连接酶1μl，补水至10μl，15℃反应过夜。转化、抽提质粒，进行酶切筛选鉴定。
pUC12-SS2经质粒SacI和BamHI酶切后，加入带有SacI和Bgl II粘性末端的HBsDNA片段，所构成的pUC12-HBs/SS不为Bgl II酶切。由于融合基因质粒与非融合基因质粒所转化的细菌都为白色菌落。挑取17株白色菌落，少量抽提质粒DNA，直接置0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果有6株的质粒DNA比pUC12-SS2 DNA大。进一步酶切鉴定都为融合基因克隆质粒，重组率为35.3％(6/17)。用HindIII和BamHI双酶切pUC12-HBs/SS，得到约为730bp片段，即为HBs/SS融合基因。表明pUC13-HBs/SS质粒构建成功。4.3 融合基因的DNA序列分析
同3.4法测定HBs/SS融合基因的DNA序列。正向引物测定中，可从pUC12的HindIII位点开始通读SS基因，经过基因融合处，直到HBs基因C末端的几个氨基酸编码碱基。HBs基因的第233氨基酸后紧接的是由于外加接头生产的Ser密码子，其后的Asp、Pro和M密码子，是SS基因合成片段带进的。然后接SS基因。阅读框架以及起码终止码都完全正确。证实pUC12-HBs/SS质粒建成功。见图3。测定DNA序列如下：S’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCGATCGACCTGCAGGTCGAGGACTGGGA
SmaI BamHI Xbal Sal I/SalI PstI SalI/Xhol
HBs 1 2 3 4 217 218 219 220 221 222CCCTGCACCGAAC ATG GAG AAC ACA…… ATT TTC TTT TGT CTT TGG223 Ser Asp Pro Met 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11GTA TCA GAT CCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TCC TGG AAG ACT12 13 14 15
前1～223为HBs的密码子，后1～14为SS基因的密码子。5 pcDNA3.1-HBs/SS质粒的构建5.1 合成HBs/SS融合基因的引物
设计1对HBs/SS融合基因的引物L1和L2。
L15’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’
Hind III
L25’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT 3’
EcoRI 终止子
由上海博采生物技术公司合成。5.2 提取pUC12-HBs/SS质粒
参照《分子克隆实验指南》新物质，提取pUC12-HBs/SS质粒，供作PCR的DNA模板。5.3 PCR扩增HBs/SS融合基因
取10×反应缓冲液(含15mmol/L MgCl2)3μl，2.5mmal/L dTNP 2μl，TaqDNA聚合酶3μl(1U)，上游引物和下游引物各1μl，模板DNA 0.1μg，加灭菌双蒸水25μl，在反应管内混匀，置TECHNIE公司GENINS自动PCR仪。反应条件：94℃变性5min 1个循环；94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。各取10μl PCR产物与marker一起经1.5％琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察。可见一条730pb左右的带，回收后用于连接。5.4 pcDNA3.1质粒的提取、酶切和回收
参照《分子克隆实验指南》所介绍的方法，用碱裂解法进行，用RNA酶消化RNA，经酚氯仿抽提除去RNA酶，无水乙醇沉淀后，加适量TE缓冲液溶解，即获得纯化的pcDNA3.1质粒。
上述纯化质粒用HindIII和EcoRI双酶切，参照2.2方法回收酶切后的大片段。5.5 连接和转化
按2.3和2.4所示方法将PCR扩增的HBs/SS融合基因，用HindIII和EcoRI双酶切后，与上述酶切、回收的质粒大片段连接。获得pcDNA3.1-HBs/SS重组质粒。按2.5方法转化感受态大肠杆菌，即获得用于生产SS-DNA疫苗的基因工程体-Ecoli-pcDNA3.1-HBs/SS。5.6 重组质粒的酶切鉴定
用Hind III和EcoRI双酶切后的HBs/SS基因片段与同样酶切的表达质粒pcDNA3.1连接后，Hind III和EcoRI位点仍保留，而二者之间的BamHI位点消失。从上述基因工程体中提取质粒，分别用Hind III、EcoRI、BamHI单酶切和用Hind III与EcoRI双酶切。结果用BamHI酶切者质粒不被切开，用Hind III和EcoRI酶切时，质粒被切开；用Hind III与EcoRI双酶切者，则可见一带720bp大小的小带。表明重组质粒构建成功。5.7 重组质粒的序列分析
从重组质粒中插入基因的3’起测序。由上海博生物技术公司测定。结果与原设计完全符合，表明生产用于促进畜禽生长的SS-DNA疫苗的基因工程体构建成功。见图4。6 生产和应用
本发明所提供的基因工程体可用发酵生产，回收菌体，提取质粒后，即直接配苗。生产工艺简便，适于大规模生产，成本低廉，使用方便，无激素残留，无潜在危险。疫苗免疫后，该表达质粒能在动物细胞内表达2～3个月。表达产物能诱导产生SS抗体，从而促进动物生长。其免疫期较长，且可多次加强免疫，提高免疫增高效果。本疫苗既可单独应用，亦可与激生1号苗或激生3号苗配合应用；既可用于家畜亦可用于家禽，更适用于生产期较长的禽、畜。能在不增加饲料，不添加化学添加剂的前提下，增加肉、乳、旦、毛的产量。其应用领域覆盖整畜牧生产领域。
Claims (2)
1 生长抑素(SS)基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程体，其特征在于：将SS基因插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密码子之后，构建成HBs/SS融合基因。并将其插入能在直核细胞内持续表达的pcDNA3.1质粒，转化感受态大肠杆菌，即成本发明的基因工程体-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS；
菌种分类：大肠埃希氏杆菌，命名：E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS
保藏单位：中国微生物菌种保管委员会普通微生物中心
保藏地址：中国北京中关村2714信箱
保藏号：0709
2根据权利要求1所述的基因工程体，其特征在于，由以下方法构建而成：2.1 pUC12-SS质粒的构建和改造
首先合成SS基因，设计的通式为：5′-保护性碱基-内切酶-框架保护碱基-SS基因-终止子-内切酶-保护性碱基-3′，具体设计如下：BamHI SS基因 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCGM ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 终止子 HindIIITTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA 3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT 5’
将上述人工合成的SS基因插入pUC12质粒，构建成pUC12-SS重组质粒。然后除去该质粒重复的酶切位点，将其改造成pUC12-SS2重组质粒，转化感受态大肠杆菌，经酶切鉴定和序列分析，证实构建成功；2.2 pUC12-HBs/SS质粒的构建
从带HBs的pWR13-HBs/6质粒，用SacI和BglII双酶切，切下700bp左右的HBs-DNA片段；将其插入用SacI和BamHI双酶切切开的pUC12-SS2质粒中，构建成pUC12-HBs/SS质粒，转化大肠杆菌，经酶切鉴定和序列分析，证实构建成功；2.3 pcDNA3.1-HBs/SS质粒和基因工程体的构建
设计1对HBs/SS融合基因的引物L1和L2
L1 5’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’
Hind III
L25’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT 3’
EcoRI 终止子
以pUC12-HBs/SS质粒为模板，用PCR扩增出HBs/SS融合基因。
提取pcDNA3.1质粒，用HindIII和EcoRI双酶切后，回收质粒大片段，用连接酶将上述扩增并经同样双酶切形成粘性末端的HBs/SS融合基因连接，构建成pcDNA3.1-HBs/SS重组质粒，转化感受态大肠杆菌，经酶切鉴定和序列分析，证实本发明的基因工程体-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS构建成功。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02103724 CN1207389C (zh) | 2002-03-13 | 2002-03-13 | 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02103724 CN1207389C (zh) | 2002-03-13 | 2002-03-13 | 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1366061A true CN1366061A (zh) | 2002-08-28 |
| CN1207389C CN1207389C (zh) | 2005-06-22 |
Family
ID=4739874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 02103724 Expired - Fee Related CN1207389C (zh) | 2002-03-13 | 2002-03-13 | 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1207389C (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673735A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-06-03 | 华中农业大学 | 一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用 |
-
2002
- 2002-03-13 CN CN 02103724 patent/CN1207389C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673735A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-06-03 | 华中农业大学 | 一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用 |
| CN104673735B (zh) * | 2015-03-05 | 2018-04-27 | 华中农业大学 | 一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1207389C (zh) | 2005-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102333877A (zh) | 利用球虫病疫苗的方法和组合物 | |
| US5747659A (en) | Fusion gene products encoding avian alpha subunit inhibin protein, or an immunogenic fragment thereof, and a carrier protein | |
| CN106399266A (zh) | 一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒及其应用 | |
| CN103193887A (zh) | 一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
| US5786179A (en) | Heterologous protein comprising avian alpha-subunit inhibin protein and methods of producing same | |
| CN109021115A (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
| CN104673735B (zh) | 一种皮质抑素生长抑素双表达dna疫苗及制备方法和应用 | |
| CN1366061A (zh) | 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 | |
| EP0645454A2 (en) | Chimeric somatostatin containing protein and coding DNA, immunogenic compositions and method for increasing farm animal productivity | |
| CN112048459B (zh) | 一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用 | |
| CN104789514B (zh) | 一种生长抑制素超表达dna疫苗及构建方法和应用 | |
| Mohammadzadeh et al. | Applications of recombinant proteins in aquaculture | |
| CN106434684B (zh) | 金钱鱼黄体生成素lh基因、金钱鱼lh重组蛋白及应用 | |
| CN1200101C (zh) | 畜禽通用去势疫苗基因及重组基因载体 | |
| CN1200103C (zh) | 家禽用去势重组基因载体 | |
| CN1200102C (zh) | 家畜用去势重组基因载体 | |
| CN105669854B (zh) | 一种海马催产剂及其编码基因 | |
| CN1116414C (zh) | 动物去势疫苗基因及基因工程体 | |
| CN1384200A (zh) | 畜禽去势基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 | |
| CN104212807B (zh) | 斜带石斑鱼orexin‑A在调控石斑鱼糖代谢中的应用 | |
| CN103194455B (zh) | 高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因及其表达蛋白的用途 | |
| CN1623604A (zh) | 一种基于sry基因的哺乳动物生雌性控方法 | |
| CN1273127A (zh) | 用于生产生长抑素亚单位疫苗的基因工程体 | |
| Shuguang et al. | Prokaryotic Expression and Immunogenicity of Dominant Epitope Region of Goose Parvovirus Structural Protein VP3. | |
| CN1372000A (zh) | 生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050622 Termination date: 20140313 |