CN1200103C - 家禽用去势重组基因载体 - Google Patents

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CN1200103C CNB021552223A CN02155222A CN1200103C CN 1200103 C CN1200103 C CN 1200103C CN B021552223 A CNB021552223 A CN B021552223A CN 02155222 A CN02155222 A CN 02155222A CN 1200103 C CN1200103 C CN 1200103C
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Abstract

本发明家禽用去势重组基因载体,用于生产家畜家禽去势基因工程亚单位疫苗,属于生物技术高科技领域。其方法如下:人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段,其5′端和3′端分别加有NcoI和XhoI酶切位点,插入pET-32c质粒,构建成4种表达LHRH-Trx融合蛋白的pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物为可溶性蛋白,便于提取纯化,家畜、家禽通用,免疫鸡、猪、羊、兔、犬、猫等动物,可有效去势。图为重组质粒pET-32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)-N/X的构建。

Description

家禽用去势重组基因载体
本申请为申请日:2000.6.23,申请号:00107831.3,名称:动物去势疫苗基因及基因工程体的分案申请。
(一)技术领域
本发明动物去势重组基因载体,用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗,属于生物技术高科技领域。
(二)技术背景
促黄体素释放激素(Luteinizing hormore releasing hormore,LHRH)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素,其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH),这些激素能促进性腺及性器官的正常发育,维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平,抑制动物性器官发育,使动物丧失性行为和性功能,从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗,促进动物生长,改善胴体组成和肉质(使肉质鲜嫩并防止膻味),提高饲料报酬。其机理是通过LHRH合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后,在体内形成LHRH抗体,中和内源性LHRH,从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平,达到温和去势的目的。与传统手术去势相比,疫苗去势不仅简便易行,给管理上带来极大的方便,尤其适合于规模化养殖和放牧畜群,而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降,另外疫苗去势可适用于大动物或小动物(鸡等小动物手术较困难)、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物,再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。
通过免疫方法促使动物产生抗LHRH的抗体,以中和LHRH的生理作用,从而抑制性腺的发育以达到去势的目的,其可行性已被国内外许多学者证实,但大多数研究都集中在合成肽疫苗,虽然免疫效果显著,终因成本太高而无法进入实际应用。王彩平等将LHRH/HBsAg融合蛋白在家蚕杆状病毒中进行表达,但也因表达产量低,提纯工艺繁琐而未能推广应用。
(三)发明内容
技术问题  本发明的目的是利用动物去势疫苗基因,构建能高效表达LHRH融合蛋白的动物去势重组基因载体,可以用于研制高产、优质、高效、低成本、工艺简便,适合规模生产、使用方便,而且安全性高,无残留,无潜在危险的动物去势基因工程疫苗,免疫动物,替代传统的手术去势。
技术方案  本发明所提供的动物去势疫苗基因,其通式为:
5′--保护性碱基--限制性酶切位点--框架保证碱基--LHRH基因--终止子--限制性酶切位点--保护性碱基--3′
其中,保护性碱基可以是A、T、G、C任选;
限制性酶切位点是指NcoI、EcoRI、HindHI、XhoI、BamHI等限制性酶的切点;
框架保证碱基可以是A、T、G、C任选;
LHRH基因是指家畜LHRH基因,或者是家禽LHRH基因,或者是LHRH基因和家禽LHRH基因串联。
上述动物去势疫苗基因,例举具体的基因序列如下:
家畜用去势疫苗LHRH基因序列——L1:
5′-GG CCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGT
TAATGAA CTCGAGCA-3′
终止子      HhoI
家禽用去势疫苗LHRH基因序列——L2:
5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT
TAATGAA CTCGAGCA-3′
终止子     XhoI
畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之1——L3:
5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT
GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTG
GTCTTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′
                         终止子    XhoI
畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之2——L4:
5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT
        NcoI
GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACA
TTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCC
TGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGC
GGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTC
TTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′
                    终止子    XhoI
用上述动物去势疫苗基因构建的重组基因载体,pET-32c LHRHn-N/X重组表达质粒,是通过以下方法构建获得的:
1.LHRH基因片段的退火
将人工合成的动物去势疫苗基因片段的正链和负链,分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液,各取2μl加入72μl超纯净水中混匀,置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温,-20℃冻存备用;
2.LHRH基因的酶切
用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切,酶切产物直接用于连接反应;
3.pET-32c质粒的提取、酶切及回收
pET-32c质粒的提取后,用NcoI及XcoI对pET-32c质粒进行双酶切。取10μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,回收酶切大片段,置液氮中冻5min,而后置37℃水浴中融化,10000r/min离心10min,吸取上清-20℃冻存备用;
4.连接
DNA连接反应体系如下:
PET-32c双酶切回收产物       2.5μl
LHRH基因酶切产物            7.5μl
DNA Ligation Kit Solution I 10μl
上述混合物16℃反应30min后立即用于转化;
5.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备;
6.转化
取10μl连接产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞,取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板,平板置37℃温箱中培养18小时,挑取转化后的单个菌落,接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒,即为重组基因载体pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。
有益效果  本发明所提供的动物去势重组基因载体,可高效表达LHRH-Trx融合蛋白(表达量30%以上),用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗。由于鸟类和哺乳动物的LHRH有一个氨基酸不同,分别构建了表达鸟类、哺乳类及不同数量鸟类/哺乳类相间串联的LHRH基因的重组表达质粒(L1、L2、L3、L4)。经检验测试,本发明所提供的重组基因载体,在表达量、免疫原性、生产简便性、去势有效性、安全性、成本等各方面均符合产业化要求。用其制造疫苗,生产简易,成本低廉,安全有效。4种质粒中,L1表达产物对家畜有效,L2对家禽有效,L3及L4家畜家禽通用,L4免疫产生期及免疫持续期等方面的效力又优于L3,可根据各种不同的应用需要加以选择。
采用该工程体在实验室条件下生产L1、L2、L3和L4苗样各3批,其表达产量稳定,表达产物蛋白量均达菌体总蛋白量的30%以上。表达产物均稳定具有良好的免疫原性,表现在:(1)表达产物与Sigma公司的LHRH标准抗体发生特异性反应;(2)免疫动物后能有效激发产生高效价的LHRH抗体,该抗体能在体外试验中与LHRH发生特异性反应。共免疫小鼠210只,兔50只,土鸡30只,猪640头,猫6只,狗4只,免疫动物后均能有效激发抗体,性成熟期观测,在性行为、性功能、性激素水平、性器官发育抑制等各方面综合评定,可有效去势,明显改善肉质,并可明显促进增重和提高饲料报酬。以公兔为例,免疫组平均睾丸重量为1.32±0.38g,对照组平均睾丸重为3.18±0.47g,组织学观察证实,免疫组睾丸实质萎缩,多无精子形成能力(个别有精子,但活检时没有活力)。
(四)附图说明
图1.重组质粒pET-32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)-N/X的构建
图2.不同IPTG浓度诱导对LHRH1-Trx(L1)融合蛋白表达产量的影响
1. 0mM   IPTG    2. 0.05mM IPTG    3. 0.1mM IPTG
4. 0.5mM IPTG    5. 1.0mM  IPTG    6. 2.0mM IPTG
7,8,9. 2.0mM IPTG(不同诱导时间)    M.蛋白质分子量标志
图3.多次转化表达LHRH3-Trx(L3)融合蛋白产量均高效稳定(1mMIPTG诱导4h)
图4.LHRH1-Trx(L1)融合蛋白免疫后的家兔睾丸大小变化
1,2.LHRH-Trx(L1)融合蛋白皮内注射组  3,4.LHRH-Trx融合蛋白肌肉注射组
5,6.PET-32c载体蛋白免疫组           7,8.空白对照组
图5.LHRH1-Trx(L1)融合蛋白免疫后的家兔睾丸组织学变化
A.正常对照兔睾丸组织切片        B.表达产物免疫兔睾丸组织切片
(五)具体实施方式
实施例:
1.LHRH基因的设计和人工合成
根据鸟类、哺乳类LHRH的氨基酸序列设计基因,在5′端和3′端分别加上NcoI和XhoI两个酶切位点及保护性碱基,用DNA自动合成仪合成基因。
1.1.家畜用疫苗LHRH基因序列——L1:
5′-GG CCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGT
TAATGAA CTCGAGCA-3′
终止子      XhoI
1.2.家禽用疫苗LHRH基因序列——L2:
5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT
TAATGAA C TCGAGCA-3′
终止子     XhoI
1.3.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之1——L3:
5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT
GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTG
GTCTTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′
                        终止子    XhoI
1.4.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之2——L4:
5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT
GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACA
TTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCC
TGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGC
GGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTC
TTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′
                    终止子    XhoI
2.LHRH基因克隆(图1)
2.1.LHRH基因片段的退火
将人工合成的动物去势疫苗基因片段的正链和负链,分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液,各取2μl加入72μl超纯水中混匀,置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温,-20℃冻存备用。
2.2.LHRH基因的酶切
用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切。酶切产物直接用于连接反应。
2.3.pET-32c质粒的提取、酶切及回收
pET-32c质粒的提取用碱裂解法,参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著,《分子克隆实验指南》介绍的方法。用NcoI及XhoI对pET-32c质粒进行双酶切。取10μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,回收酶切大片段,置液氮中冻5min,而后置37℃水浴中融化,10000r/min离心10min,吸取上清-20℃冻存备用。
2.4.连接
DNA连接反应体系如下:
        pET-32c双酶切回收产物          2.5μl
        LHRH基因酶切产物               7.5μl
        DNA Ligation Kit Solution I    10μl
上述混合物16℃反应30min后立即用于转化。
2.5.感受态细胞的制备
参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著,《分子克隆实验指南》介绍的方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2.6.转化
取10μl连接产物转化200μlDH5α感受态细胞,具体操作参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著,《分子克隆实验指南》介绍的方法进行。取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板,同时设未转化的感受态细胞对照(阴性对照)及pET-32c质粒转化的感受态细胞对照(阳性对照)。平板置37℃温箱中培养18小时。
2.7.重组质粒的酶切筛选
pET-32c质粒多克隆位点有EcoRI及HandIII酶切位点,当插入LHRH基因后这两个酶切位点应该消失,而NcoI和XhoI酶切位点仍然存在。据此原理,挑取转化后的单个菌落,接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒,分别用HindIII、EcoRI、NcoI及XhoI进行单酶切,挑选HindIII及EcoRI酶切位点消失而NcoI及XhoI酶切位点仍存在的阳性克隆。
2.8.重组质粒的序列测定
挑选经酶切鉴定的重组质粒,以T7 Terminater primer作为测序引物,由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。
3.pET-32c LHRHn-N/X重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
3.1.BL21(DE3)感受态细胞的制备
方法同1.2.5。
3.2.转化
用碱裂解法小量提取经序列测定的重组质粒及pET-32c质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,方法同2.6。
3.3.重组质粒在BL21(DE3)中的表达
挑取重组质粒转化菌落接种5ml含Amp 50μg/ml的LB肉汤,37℃摇震培养过夜(转速为250rpm,下同),次日按1%接种量接种于30ml含Amp 50μg/min的LB肉汤中,于37℃摇床中培养至OD600达0.5左右,取出1ml菌液置Eppendorf管中2000r/min离心1min,弃上清于-20℃冻存备用,作为诱导前对照,其余培养物加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达3-4小时,取1ml诱导后菌液同样离心弃上清保留沉淀。同时对pET-32c质粒转化菌进行同样操作作为对照。
3.4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
将诱导前菌体,诱导后重组质粒转化菌及诱导后pET-32c载体质粒转化菌沉淀用蒸馏水重悬加等体积的2×载体buffer,煮沸5min,各取10μl进行不连续SDS-PAGE(浓缩胶5%,分离胶13%)。电泳结束后,凝胶用考马斯亮蓝(R250)进行染色。用凝胶成像处理系统进行条带灰度扫描,测定表达融合蛋白与菌体总蛋白之比。
3.5.表达蛋白的可溶性
将LHRH-pET-32c质粒转化菌过夜培养物按1%接种量接种100ml LB肉汤,37℃摇床培养至OD600=0.5左右时,加入IPTG至终浓度1mM,继续培养4h后,离心弃上清,全部菌体沉淀用10ml PBS(pH7.4)重悬,超声波破碎(冰浴)5min,超声功率为240W,离心后将上清转移至另一容器中,沉淀用10ml PBS重悬,各取50μl上清及沉淀悬液加入等体积的2×载样buffer,进行SDS-PAGE;同时,对pET-32c质粒转化菌进行上述同样操作作对照。另外设未用超声波裂解的全菌对照。对凝胶进行灰度扫描确定目的蛋白的含量。
4.LHRH-Trx融合蛋白的免疫原性鉴定
4.1.试验动物
小鼠200只,兔50只,土鸡30只,猪600头,猫6只,狗4只。
4.2.免疫方案:
将表达产物用弗氏佐剂及白油佐剂等配制疫苗,通过皮内注射和肌肉注射等免疫途径注射动物,免疫剂量0.2-2ml不等,视动物体重大小而定。一般在动物性成熟前免疫。
4.3.免疫动物性功能及性器官检查
4.3.1.性功能检查
在性成熟期后,将试验动物与同种异性健康成年动物合养,观察性行为、性征及繁殖能力等情况。
4.3.2.性腺、性器官检查
剖解检查,采集睾丸、卵巢,其一立即置中性福尔马林中固定,作组织切片分析,其二称重、测量大小和检查睾丸有无精子及精子活力等。
结果分析:
1.四种能稳定、高效表达LHRH-Trx融合蛋白的重组质粒
构建了表达鸟类、哺乳类及不同数量鸟类/哺乳类相间串联的LHRH融合蛋白的4种重组表达质粒。序列分析表明基因合成和插入正确。质粒经保存后多次转化大肠杆菌,表达量及表达产物的免疫原性均很稳定,表达水平始终在菌体总蛋白的30%以上。
2.可溶性的表达产物
实现了LHRH-Trx融合蛋白的可溶性表达,表达产物几乎完全以可溶性形式存在(而非包涵体)。用渗透休克方法对LHRH融合蛋白及pET-32c载体蛋白进行提取,结果LHRH重组菌经高渗处理后能将LHRH-Trx融合蛋白单一地释放出来,而且纯度达90%以上,而pET-32c空载体蛋白仍存在于菌体中不能释放出来。为提取和纯化表达产物制备疫苗提供了极大的方便。
3.表达产物有很强的LHRH抗原性
表达产物和LHRH抗体有很好的反应性,该反应能被LHRH标准品阻断;免疫动物能有效激发LHRH抗体,中和内源性LHRH,从而显著降低睾酮及FSH等性激素水平,达到温和去势的目的,而且,疫苗免疫可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降。

Claims (1)

1.家禽用去势重组基因载体,是通过以下方法构建获得的:
1)LHRH基因片段的退火
人工合成的家禽用去势疫苗基因片段L2:
5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT
TAATGAA CTCGAGCA-3′
终止子   XhoI
将人工合成的家禽用去势疫苗基因片段的正链和负链,分别用灭菌超纯溶解成浓度为100pmol/l的溶液,各取2μl加入72μl超纯水中混匀,置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温,-20℃冻存备用;
2)LHRH基因的酶切
用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切,酶切产物直接用于连接反应;
3)pET-32c质粒的提取、酶切及回收
pET--32c质粒的提取后,用NcoI及XhoI对PET-32c质粒进行双酶切;取10μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,回收酶切大片段,置液氮中冻5min,而后置37℃水浴融化,10000r/min离心10min,吸取上清-20℃冻存备用;
4)连接
DNA连接反应体系如下:
PET-32c双酶切回收产物          2.5μl
LHRH基因酶切产物               7.5μl
DNA Ligation Kit Solution I    10μl
上述混合物16℃反应30min后立即用于转化;
5)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备;
6)转化
取10μl连接产物转化200μlDH5α感受态细胞,取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板,平板置37℃温箱中培养18小时,挑取转化后的单个菌落,接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒,即为重组质粒。
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Patentee after: Chengdu Rui Zhonghe biological science and Technology Co Ltd

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