CN1200103C - 家禽用去势重组基因载体 - Google Patents

Abstract

本发明家禽用去势重组基因载体，用于生产家畜家禽去势基因工程亚单位疫苗，属于生物技术高科技领域。其方法如下：人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段，其5′端和3′端分别加有NcoI和XhoI酶切位点，插入pET-32c质粒，构建成4种表达LHRH-Trx融合蛋白的pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达产物为可溶性蛋白，便于提取纯化，家畜、家禽通用，免疫鸡、猪、羊、兔、犬、猫等动物，可有效去势。图为重组质粒pET-32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)-N/X的构建。

Description

家禽用去势重组基因载体

本申请为申请日：2000.6.23，申请号：00107831.3，名称：动物去势疫苗基因及基因工程体的分案申请。

(一)技术领域

本发明动物去势重组基因载体，用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗，属于生物技术高科技领域。

(二)技术背景

促黄体素释放激素(Luteinizing hormore releasing hormore，LHRH)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，这些激素能促进性腺及性器官的正常发育，维持动物的生殖功能。去势疫苗可免疫调控动物内分泌系统的性相关激素水平，抑制动物性器官发育，使动物丧失性行为和性功能，从而防止混乱交配(引起畜群退化)和争斗，促进动物生长，改善胴体组成和肉质(使肉质鲜嫩并防止膻味)，提高饲料报酬。其机理是通过LHRH合成抗原或重组抗原作疫苗免疫动物后，在体内形成LHRH抗体，中和内源性LHRH，从而显著降低睾酮及雌激素等性激素水平，达到温和去势的目的。与传统手术去势相比，疫苗去势不仅简便易行，给管理上带来极大的方便，尤其适合于规模化养殖和放牧畜群，而且可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降，另外疫苗去势可适用于大动物或小动物(鸡等小动物手术较困难)、雌性或雄性动物、幼龄和成年动物、畜禽和其他动物，再者疫苗去势可通过配套技术实现可逆性控制。

通过免疫方法促使动物产生抗LHRH的抗体，以中和LHRH的生理作用，从而抑制性腺的发育以达到去势的目的，其可行性已被国内外许多学者证实，但大多数研究都集中在合成肽疫苗，虽然免疫效果显著，终因成本太高而无法进入实际应用。王彩平等将LHRH/HBsAg融合蛋白在家蚕杆状病毒中进行表达，但也因表达产量低，提纯工艺繁琐而未能推广应用。

(三)发明内容

技术问题  本发明的目的是利用动物去势疫苗基因，构建能高效表达LHRH融合蛋白的动物去势重组基因载体，可以用于研制高产、优质、高效、低成本、工艺简便，适合规模生产、使用方便，而且安全性高，无残留，无潜在危险的动物去势基因工程疫苗，免疫动物，替代传统的手术去势。

技术方案  本发明所提供的动物去势疫苗基因，其通式为：

5′--保护性碱基--限制性酶切位点--框架保证碱基--LHRH基因--终止子--限制性酶切位点--保护性碱基--3′

其中，保护性碱基可以是A、T、G、C任选；

限制性酶切位点是指NcoI、EcoRI、HindHI、XhoI、BamHI等限制性酶的切点；

框架保证碱基可以是A、T、G、C任选；

LHRH基因是指家畜LHRH基因，或者是家禽LHRH基因，或者是LHRH基因和家禽LHRH基因串联。

上述动物去势疫苗基因，例举具体的基因序列如下：

家畜用去势疫苗LHRH基因序列——L1：

5′-GG CCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGT

TAATGAA CTCGAGCA-3′

终止子      HhoI

家禽用去势疫苗LHRH基因序列——L2：

5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT

TAATGAA CTCGAGCA-3′

终止子     XhoI

畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之1——L3：

5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT

GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTG

GTCTTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′

                         终止子    XhoI

畜/禽通用去势疫苗LHRH基因序列之2——L4：

5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT

        NcoI

GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACA

TTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCC

TGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGC

GGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTC

TTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′

                    终止子    XhoI

用上述动物去势疫苗基因构建的重组基因载体，pET-32c LHRHn-N/X重组表达质粒，是通过以下方法构建获得的：

1.LHRH基因片段的退火

将人工合成的动物去势疫苗基因片段的正链和负链，分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超纯净水中混匀，置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用；

2.LHRH基因的酶切

用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切，酶切产物直接用于连接反应；

3.pET-32c质粒的提取、酶切及回收

pET-32c质粒的提取后，用NcoI及XcoI对pET-32c质粒进行双酶切。取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切大片段，置液氮中冻5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用；

4.连接

DNA连接反应体系如下：

PET-32c双酶切回收产物       2.5μl

LHRH基因酶切产物            7.5μl

DNA Ligation Kit Solution I 10μl

上述混合物16℃反应30min后立即用于转化；

5.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备；

6.转化

取10μl连接产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒，即为重组基因载体pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。

有益效果  本发明所提供的动物去势重组基因载体，可高效表达LHRH-Trx融合蛋白(表达量30％以上)，用于生产家畜家禽去势用促黄体素释放激素(LHRH)基因工程亚单位疫苗。由于鸟类和哺乳动物的LHRH有一个氨基酸不同，分别构建了表达鸟类、哺乳类及不同数量鸟类/哺乳类相间串联的LHRH基因的重组表达质粒(L1、L2、L3、L4)。经检验测试，本发明所提供的重组基因载体，在表达量、免疫原性、生产简便性、去势有效性、安全性、成本等各方面均符合产业化要求。用其制造疫苗，生产简易，成本低廉，安全有效。4种质粒中，L1表达产物对家畜有效，L2对家禽有效，L3及L4家畜家禽通用，L4免疫产生期及免疫持续期等方面的效力又优于L3，可根据各种不同的应用需要加以选择。

采用该工程体在实验室条件下生产L1、L2、L3和L4苗样各3批，其表达产量稳定，表达产物蛋白量均达菌体总蛋白量的30％以上。表达产物均稳定具有良好的免疫原性，表现在：(1)表达产物与Sigma公司的LHRH标准抗体发生特异性反应；(2)免疫动物后能有效激发产生高效价的LHRH抗体，该抗体能在体外试验中与LHRH发生特异性反应。共免疫小鼠210只，兔50只，土鸡30只，猪640头，猫6只，狗4只，免疫动物后均能有效激发抗体，性成熟期观测，在性行为、性功能、性激素水平、性器官发育抑制等各方面综合评定，可有效去势，明显改善肉质，并可明显促进增重和提高饲料报酬。以公兔为例，免疫组平均睾丸重量为1.32±0.38g，对照组平均睾丸重为3.18±0.47g，组织学观察证实，免疫组睾丸实质萎缩，多无精子形成能力(个别有精子，但活检时没有活力)。

(四)附图说明

图1.重组质粒pET-32c LHRH_n(L1、L2、L3、L4)-N/X的构建

图2.不同IPTG浓度诱导对LHRH₁-Trx(L1)融合蛋白表达产量的影响

1. 0mM   IPTG    2. 0.05mM IPTG    3. 0.1mM IPTG

4. 0.5mM IPTG    5. 1.0mM  IPTG    6. 2.0mM IPTG

7，8，9. 2.0mM IPTG(不同诱导时间)    M.蛋白质分子量标志

图3.多次转化表达LHRH₃-Trx(L3)融合蛋白产量均高效稳定(1mMIPTG诱导4h)

图4.LHRH1-Trx(L1)融合蛋白免疫后的家兔睾丸大小变化

1，2.LHRH-Trx(L1)融合蛋白皮内注射组  3，4.LHRH-Trx融合蛋白肌肉注射组

5，6.PET-32c载体蛋白免疫组           7，8.空白对照组

图5.LHRH₁-Trx(L1)融合蛋白免疫后的家兔睾丸组织学变化

A.正常对照兔睾丸组织切片        B.表达产物免疫兔睾丸组织切片

(五)具体实施方式

实施例：

1.LHRH基因的设计和人工合成

根据鸟类、哺乳类LHRH的氨基酸序列设计基因，在5′端和3′端分别加上NcoI和XhoI两个酶切位点及保护性碱基，用DNA自动合成仪合成基因。

1.1.家畜用疫苗LHRH基因序列——L1：

5′-GG CCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGT

TAATGAA CTCGAGCA-3′

终止子      XhoI

1.2.家禽用疫苗LHRH基因序列——L2：

5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT

TAATGAA C TCGAGCA-3′

终止子     XhoI

1.3.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之1——L3：

5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT

GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTG

GTCTTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′

                        终止子    XhoI

1.4.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之2——L4：

5′-GG CCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGT

GGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACA

TTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCC

TGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGC

GGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTC

TTACGGTCTGCGCCCGGGT TAATGAA CTCGAGCA-3′

                    终止子    XhoI

2.LHRH基因克隆(图1)

2.1.LHRH基因片段的退火

将人工合成的动物去势疫苗基因片段的正链和负链，分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl(相当于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超纯水中混匀，置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用。

2.2.LHRH基因的酶切

用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切。酶切产物直接用于连接反应。

2.3.pET-32c质粒的提取、酶切及回收

pET-32c质粒的提取用碱裂解法，参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著，《分子克隆实验指南》介绍的方法。用NcoI及XhoI对pET-32c质粒进行双酶切。取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切大片段，置液氮中冻5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用。

2.4.连接

DNA连接反应体系如下：

        pET-32c双酶切回收产物          2.5μl

        LHRH基因酶切产物               7.5μl

        DNA Ligation Kit Solution I    10μl

上述混合物16℃反应30min后立即用于转化。

2.5.感受态细胞的制备

参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著，《分子克隆实验指南》介绍的方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

2.6.转化

取10μl连接产物转化200μlDH5α感受态细胞，具体操作参照文献[美]J.萨姆布鲁克等著，《分子克隆实验指南》介绍的方法进行。取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板，同时设未转化的感受态细胞对照(阴性对照)及pET-32c质粒转化的感受态细胞对照(阳性对照)。平板置37℃温箱中培养18小时。

2.7.重组质粒的酶切筛选

pET-32c质粒多克隆位点有EcoRI及HandIII酶切位点，当插入LHRH基因后这两个酶切位点应该消失，而NcoI和XhoI酶切位点仍然存在。据此原理，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒，分别用HindIII、EcoRI、NcoI及XhoI进行单酶切，挑选HindIII及EcoRI酶切位点消失而NcoI及XhoI酶切位点仍存在的阳性克隆。

2.8.重组质粒的序列测定

挑选经酶切鉴定的重组质粒，以T7 Terminater primer作为测序引物，由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。

3.pET-32c LHRH_n-N/X重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

3.1.BL21(DE3)感受态细胞的制备

方法同1.2.5。

3.2.转化

用碱裂解法小量提取经序列测定的重组质粒及pET-32c质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，方法同2.6。

3.3.重组质粒在BL21(DE3)中的表达

挑取重组质粒转化菌落接种5ml含Amp 50μg/ml的LB肉汤，37℃摇震培养过夜(转速为250rpm，下同)，次日按1％接种量接种于30ml含Amp 50μg/min的LB肉汤中，于37℃摇床中培养至OD₆₀₀达0.5左右，取出1ml菌液置Eppendorf管中2000r/min离心1min，弃上清于-20℃冻存备用，作为诱导前对照，其余培养物加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达3-4小时，取1ml诱导后菌液同样离心弃上清保留沉淀。同时对pET-32c质粒转化菌进行同样操作作为对照。

3.4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将诱导前菌体，诱导后重组质粒转化菌及诱导后pET-32c载体质粒转化菌沉淀用蒸馏水重悬加等体积的2×载体buffer，煮沸5min，各取10μl进行不连续SDS-PAGE(浓缩胶5％，分离胶13％)。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝(R250)进行染色。用凝胶成像处理系统进行条带灰度扫描，测定表达融合蛋白与菌体总蛋白之比。

3.5.表达蛋白的可溶性

将LHRH-pET-32c质粒转化菌过夜培养物按1％接种量接种100ml LB肉汤，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.5左右时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养4h后，离心弃上清，全部菌体沉淀用10ml PBS(pH7.4)重悬，超声波破碎(冰浴)5min，超声功率为240W，离心后将上清转移至另一容器中，沉淀用10ml PBS重悬，各取50μl上清及沉淀悬液加入等体积的2×载样buffer，进行SDS-PAGE；同时，对pET-32c质粒转化菌进行上述同样操作作对照。另外设未用超声波裂解的全菌对照。对凝胶进行灰度扫描确定目的蛋白的含量。

4.LHRH-Trx融合蛋白的免疫原性鉴定

4.1.试验动物

小鼠200只，兔50只，土鸡30只，猪600头，猫6只，狗4只。

4.2.免疫方案：

将表达产物用弗氏佐剂及白油佐剂等配制疫苗，通过皮内注射和肌肉注射等免疫途径注射动物，免疫剂量0.2-2ml不等，视动物体重大小而定。一般在动物性成熟前免疫。

4.3.免疫动物性功能及性器官检查

4.3.1.性功能检查

在性成熟期后，将试验动物与同种异性健康成年动物合养，观察性行为、性征及繁殖能力等情况。

4.3.2.性腺、性器官检查

剖解检查，采集睾丸、卵巢，其一立即置中性福尔马林中固定，作组织切片分析，其二称重、测量大小和检查睾丸有无精子及精子活力等。

结果分析：

1.四种能稳定、高效表达LHRH-Trx融合蛋白的重组质粒

构建了表达鸟类、哺乳类及不同数量鸟类/哺乳类相间串联的LHRH融合蛋白的4种重组表达质粒。序列分析表明基因合成和插入正确。质粒经保存后多次转化大肠杆菌，表达量及表达产物的免疫原性均很稳定，表达水平始终在菌体总蛋白的30％以上。

2.可溶性的表达产物

实现了LHRH-Trx融合蛋白的可溶性表达，表达产物几乎完全以可溶性形式存在(而非包涵体)。用渗透休克方法对LHRH融合蛋白及pET-32c载体蛋白进行提取，结果LHRH重组菌经高渗处理后能将LHRH-Trx融合蛋白单一地释放出来，而且纯度达90％以上，而pET-32c空载体蛋白仍存在于菌体中不能释放出来。为提取和纯化表达产物制备疫苗提供了极大的方便。

3.表达产物有很强的LHRH抗原性

表达产物和LHRH抗体有很好的反应性，该反应能被LHRH标准品阻断；免疫动物能有效激发LHRH抗体，中和内源性LHRH，从而显著降低睾酮及FSH等性激素水平，达到温和去势的目的，而且，疫苗免疫可防止手术去势导致的出血、感染及应激造成的减食和体重下降。

Claims (1)

1.家禽用去势重组基因载体，是通过以下方法构建获得的：

1)LHRH基因片段的退火

人工合成的家禽用去势疫苗基因片段L2：

5′-GG CCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGT

TAATGAA CTCGAGCA-3′

终止子   XhoI

将人工合成的家禽用去势疫苗基因片段的正链和负链，分别用灭菌超纯溶解成浓度为100pmol/l的溶液，各取2μl加入72μl超纯水中混匀，置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用；

2)LHRH基因的酶切

用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切，酶切产物直接用于连接反应；

3)pET-32c质粒的提取、酶切及回收

pET--32c质粒的提取后，用NcoI及XhoI对PET-32c质粒进行双酶切；取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切大片段，置液氮中冻5min，而后置37℃水浴融化，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用；

4)连接

DNA连接反应体系如下：

PET-32c双酶切回收产物          2.5μl

LHRH基因酶切产物               7.5μl

DNA Ligation Kit Solution I    10μl

上述混合物16℃反应30min后立即用于转化；

5)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备；

6)转化

取10μl连接产物转化200μlDH5α感受态细胞，取200μl转化产物涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒，即为重组质粒。

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