CN1921883A - 包含血管动蛋白或编码血管动蛋白的多核苷酸的疫苗及其在治疗血管生成相关紊乱中的用途 - Google Patents
包含血管动蛋白或编码血管动蛋白的多核苷酸的疫苗及其在治疗血管生成相关紊乱中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
用于预防血管形成，例如新血管生成，以及抑制与肿瘤及其他疾病有关的现有血管化的疫苗，包括血管动蛋白，例如完整的分子或其片段或基因或mRNA所编码的，或作为表达血管动蛋白的树突状细胞(DC细胞)给予的，其可用于产生对血管动蛋白分子的免疫应答。在癌症动物模型中实现血管生成的抑制和肿瘤生长的延缓。
Description
发明领域
本发明涉及用于阻碍血管形成，例如用于阻碍肿瘤生长、视网膜疾病、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、类风湿性关节炎和炎症病情的预防或治疗疗法。
发明背景
疫苗为源自引起疾病的试剂或其组分的制剂，其被给予以刺激保护人免受因那些试剂而引起的疾病的免疫应答。治疗的(治疗)疫苗在疾病发作后给予并且意图用来降低或停止疾病发展。预防的(预防性的)疫苗意图用来预防最初的疾病发作。用于疫苗的试剂可例如为完全-灭活的(无活性的)、活的-减毒的(削弱的)致病生物体或人造的。
疫苗通过刺激宿主的免疫系统而特异性地产生针对主要靶标的抗体和/或免疫细胞(细胞毒性T细胞)而传递其作用。这些靶标称为″抗原″。针对靶抗原的免疫应答的刺激引起受免疫的宿主体内存在的病原体免疫-介导的破坏和消除。一旦受刺激，免疫系统还通过靶向的试剂维持对随后的感染或疾病发展的监视。因此疫苗为控制现有疾病以及抑制其将来的恶化或复发的有效方法。
存在多种用于针对靶抗原预防接种的方法。其中一些包括注射完整的蛋白质；对应于该蛋白质片段的合成肽；和/或编码该蛋白质的DNA/RNA序列。投递DNA和RNA的投递载体包括与其他的免疫刺激剂如细胞因子或生长因子一起的表达该基因的改变的病毒，表达抗原的裸DNA/RNA或重组质粒。
血管发生为干细胞向内皮细胞的分化，其随后形成血管。血管生成为血管根据先前存在的那些的形成。术语如血管形成、新血管形成和血管化包括血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。
血管生成(血管形成的实例)为新毛细血管通过从先前存在的血管出芽的过程而形成并且在发育期间以及许多生理学和病理学环境中发生(Folkman J.Nature Medicine 1995)。新血管通过血管生成过程的形成包括复杂的一系列事件，包括内皮细胞增殖、迁移、相互作用和粘附以形成索和管，并且最后成熟。生理学上，血管生成是组织生长、伤口愈合和雌性生殖功能必需的并且是病理过程如视网膜疾病、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、类风湿性关节炎和炎症病情的组成部分。然而，血管生成中许多长期以来的兴趣来自这样的概念，即为了使实体瘤生长超过临界大小，其必须从周围的基质补充内皮细胞以形成其自身内源的微循环。为了促进新血管形成，肿瘤释放各种刺激内皮细胞增殖和迁移的因子。所述因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-8(IL-8)、胎盘生长因子以及胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(血小板-来源的内皮细胞生长因子，Relf M等.Cancer Research 1997)。因此，许多工作致力于发现干涉这些信号途径并且由此阻断肿瘤血管生成的分子。
靶向血管生成相比传统的溶瘤(oncolytic)治疗可能具有一些优势。最突出的，所有实体瘤为血管生成-依赖的，靶内皮细胞很易获得用于治疗，为基因组稳定的并且具有较小的对治疗产生抗性的倾向。靶向癌细胞表达蛋白质的一个明显的缺点为遗传变异性以及由于快速的细胞生长和分裂的强选择压力，其常常由于抗性机理以及旁路途径的起始和利用而使得所述药物无效。
血管生成抑制还显示针对糖尿病性视网膜病和黄斑变性的早期希望，这两种疾病均是眼血管过度生长的结果。在这些病症中，血管妨碍眼睛中的正常结构，或其阻断光到达眼睛的后部。新血管本身为主要的病状，而终止血管生长可防止失明。
已鉴定许多天然存在的血管生成抑制剂如血管抑素(Angiostatin)(纤溶酶原片段)抗-血管生成的抗-凝血酶III、内皮抑素(Endostatin)(胶原XVIII片段)、干扰素α/β/γ、催乳激素16kD片段和凝血栓蛋白-1(TSP-1)，其在体外和体内模型中呈现不同程度的作用。这些抑制剂靶向内皮细胞并且抑制血管生成。观察到的血管抑素的抑制与内皮细胞受哪种血管生成因子的刺激无关(Eriksson等.FEBS L.2003)。此与例如结合VEGF的抗体或抑制VEGF-受体激酶活性的低分子化合物的试剂相反。大多数肿瘤表达各种血管生成因子表明靶向一条单一的血管生成途径并不足以抑制肿瘤扩展。因此，直接靶向内皮细胞的疗法具有潜力以避开血管生成受多个源自肿瘤的因子控制的问题。然而，另一方面，所述疗法必须解决能特异性靶向参与新血管形成过程的内皮细胞而避开成熟的血管的问题。
血管动蛋白(Angiomotin)通过其结合至也参与血管生成的另一种分子(血管抑素)而得到鉴定(Troyanovsky等.，J.Cell.Biol.2001；WO99/66038)。初级细胞以及细胞-系中血管动蛋白表达模式的实时PCR分析已表明血管动蛋白主要在内皮细胞中表达。血管动蛋白的体内定位已显示在血管生成组织例如人胎盘以及肿瘤组织中的表达。这些数据提示血管动蛋白在血管生成期间在内皮细胞中上调。WO99/66038论述了血管动蛋白以及其作为例如药物筛选靶标的用途。
本发明提供对应于完整的血管动蛋白分子或其片段的疫苗的用途，用于产生阻碍血管形成(血管生成)的免疫应答。本发明提供用血管动蛋白分子的预防接种以及利用该疫苗防止血管形成的方法，血管形成对于肿瘤生长，以及通过新血管生成而产生或恶化的其他疾病是至关重要的。我们已表明血管动蛋白接种提供抗-肿瘤保护。
发明概述
本发明的第一个方面提供血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸在制备用于预防接种患有或处于血管生成-相关疾病或紊乱风险中受试者的药物(疫苗)中的用途。
本发明的第二个方面提供用于治疗患有或处于血管生成-相关疾病或紊乱风险的受试者的方法，该方法包括利用包含血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸的疫苗预防接种受试者的步骤。
药物或治疗可以是预防性治疗或治疗性治疗。
接种可通过将血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸给药至受试者；或通过将受试者的免疫细胞在受试者体外暴露于血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸，随后将暴露的免疫细胞(和/或其子代)返回至受试者而进行。
疫苗可包括全长蛋白质(序列1)或其部分或编码该蛋白质的核苷酸序列(序列2)或其部分。用血管动蛋白作为免疫原预防接种的范围不受限制并且包括基于蛋白质、肽和基因的接种策略。例如，疫苗可包括血管动蛋白或血管动蛋白的免疫刺激性衍生物或片段。基于蛋白质或肽以及基于多核苷酸/基因的疫苗组分同时或连续给药至个体可能是合乎需要的。此可促进更强、更广或更均衡的免疫应答。
衍生物包括，但不限于，A)血管动蛋白肽的类似物，其中该天然蛋白质的氨基酸序列在一个或多个氨基酸位点经修饰以提高分子的免疫原性，B)一个或多个氨基酸的化学修饰，例如在所述氨基酸上天然存在的一个或多个化学基团用人工化学基团取代以提高所得肽的免疫原性，C)对应于血管动蛋白片段的肽与免疫原性蛋白质(例如钥孔血蓝素KLH)或半抗原(小的化学分子例如二硝基酚(DNP))的偶联。
本发明进一步的方面提供对血管形成(例如血管生成)有效的疫苗，包含如根据本发明之前的方面定义的有效量的血管动蛋白分子和/或多核苷酸。该疫苗认为能在受体中产生针对内源血管动蛋白的免疫应答。例如对人中血管形成有效的疫苗包括有效量的人血管动蛋白分子和/或编码人血管动蛋白分子的多核苷酸。血管动蛋白分子或编码的血管动蛋白多肽可以是全长血管动蛋白或其片段，其促进对内源血管动蛋白中所呈递的并且可接近的表位的免疫应答。
疫苗可进一步包括(作为抗原)一种或多种肿瘤抗原以及其他已知的血管生成因子，例如血管抑素受体。
例如，如以下实施例所示，编码致癌基因片段Her2/neu肿瘤抗原跨膜胞外(TMEC)部分的质粒与编码人血管动蛋白分子的质粒协同作用以降低小鼠中的肿瘤发展。因此，Her2/neu为肿瘤抗原的实例，其包括本发明此方面疫苗的部分。该实例中，TMEC源自大鼠p185(TMEC)的跨膜和胞外(TMEC)部分，其为人Her2/neu致癌基因的同系物。此举例说明了基于血管动蛋白的疫苗如何能作为″佐剂″与肿瘤抗原在协同作用中起作用，在该实例中肿瘤抗原源自Her2/neu，但其可源自人肿瘤中表达的任何肿瘤抗原，包括但不限于例如源自癌症/睾丸肿瘤抗原(例如MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1抗原家族)、分化抗原(例如MART-1/MelanA、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1和-2)、广泛表达的抗原ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、iCE、MUC1和2、PRAME、P15、RU1和2、SART-1和3、WT1及其他更独特的或共有的抗原(例如AFP、b-连环蛋白、Caspase-8、CDK-4、ELF2、G250、HSP70、HST-2、KIAA0205、MUM-1、2和3、RAGE)或病毒抗原(例如HPV-E7、EBV抗原)的那些或源自融合蛋白的那些(例如来自bcr-abl、Del-cain、LDL/FUT、TEL/AML1的那些)的实例。肿瘤抗原可作为这些的完整重组蛋白或质粒或肽或片段或部分(例如I类或II类表位)而给予。
疫苗还可另外包括肿瘤抗原或抗原因子的一种或多种抗体。因此本发明还包括与肿瘤抗原的抗体联合的血管动蛋白疫苗，包括但不限于Her2/neu抗原(例如Herceptin/Traztusumab)、淋巴瘤上的CD20抗原、结肠直肠癌上的EpCAM抗原的抗体。
疫苗用来产生针对血管动蛋白分子的免疫应答。得到的免疫应答可抑制新毛细血管的形成，其是肿瘤及其他疾病状况的产生和/或维持所必需的。此外(或者)，尽管至今在肿瘤细胞中未检测到血管动蛋白，少量的血管动蛋白可通过某些恶性肿瘤表达并且可因此用作肿瘤特异抗原。然而不受理论的束缚，本发明包括利用血管动蛋白疫苗(即在此所述的)的接种，其中与血管动蛋白反应的特异性T细胞和/或抗体识别并且破坏在其表面表达血管动蛋白的肿瘤细胞。利用血管动蛋白作为肿瘤特异抗原用于接种的所有方式和方法利用所表明用于抗-血管生成作用的接种的相同方法。
如本领域技术人员所熟知的，对于疫苗(即通过受体的免疫系统起作用的制剂)，分子和给药方式的选择与直接治疗的制剂不同。例如，与非疫苗血管动蛋白治疗体相对比，作为疫苗给予的血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸与之的差异可包括下列的一种或多种。
非疫苗治疗体必须维持血管动蛋白分子的功能(例如结合血管抑素的能力；或与细胞组分相互作用的能力)。相反疫苗分子不必是功能性的血管动蛋白分子。其可以是(虽然不必是)产生免疫应答的最小的非功能性衍生物(包括片段)或类似物，其与天然的血管动蛋白分子免疫交叉反应。
通常疫苗剂量比非疫苗治疗剂量低一个或两个数量级，例如在″每公斤体重″基础上测定的。
疫苗可包括(或附有)加强免疫应答的″佐剂″，例如细胞因子、BCG、明矾等等。对于非疫苗疗法无所述附加物。佐剂在例如对″自体″蛋白质免疫时，即在人中对人蛋白质免疫时的情况下尤其重要。
尤其在考虑血管动蛋白分子的作用机理时(妨碍血管生成)非疫苗治疗体必须几乎每天给药，与之相对的是两或三周一次的包含加强剂的疫苗给药。例如对于基因疫苗或多肽/肽疫苗，每隔数周的一次或两次给药是必需的。
非疫苗载体应当具有高水平表达功能性分子的能力；此实际上是很难实现的。DNA疫苗可以以低得多的水平表达免疫抗原。许多合适的载体和启动子系统是已知的，包括实施例中所用的基于CMV启动子的系统。免疫抗原可以是能够并且足以产生针对天然血管动蛋白的免疫应答(抗体和/或T细胞)的血管动蛋白最小的无功能肽或区域。无须利用功能性的血管动蛋白分子。
在本发明的实施方案中，包含或编码血管动蛋白或其片段或衍生物的疫苗局部地、局部地、全身地或肠内给药以产生持久的针对该分子的免疫。得到的免疫应答阻碍新血管的形成。新血管形成的预防对肿瘤形成或其他血管发生/血管生成-相关疾病产生预防性的或治疗性的作用。
在本发明的另一个实施方案中，患者的免疫细胞回体(患者体外)通过血管动蛋白分子(其可以是，例如全长血管动蛋白的片段)刺激。随着编码血管动蛋白分子(其可以是，例如全长血管动蛋白的片段)的多核苷酸转染入所谓的抗原呈递细胞，该血管动蛋白分子可呈递至患者的免疫细胞，尤其是T细胞。抗原呈递细胞还可以用血管动蛋白或用源自该血管动蛋白的肽在外部预处理。具有刺激淋巴细胞的能力的任何细胞类型这里有效定义为抗原呈递细胞；这些认为包括所谓的源自单核细胞或源自骨髓淋巴样细胞的树突状细胞；以及用促细胞分裂剂刺激的或通过EB(EpsteinBarr)病毒永生化的B细胞。
受刺激免疫细胞返回患者的继承性转移可通过内皮细胞表达的血管动蛋白由转移的免疫细胞，主要为CD8+或CD4+类型的T细胞识别而导致新血管生成的抑制，并且因此导致肿瘤或其他血管生成-相关疾病发展的限制。受刺激免疫细胞返回患者的继承性转移还可通过作为肿瘤抗原的肿瘤细胞中表达的血管动蛋白由转移的免疫细胞，主要为CD8+或CD4+类型的T细胞识别而导致肿瘤发展的限制。
血管发生/血管生成-相关的疾病包括癌症(尤其是实体瘤)、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症病情(例如牛皮癣、肠慢性炎症、哮喘)和子宫内膜异位。
处于血管发生/血管生成-相关疾病风险的患者可以是处于癌症风险的患者，尤其是处于实体瘤风险的，例如具有导致实体瘤的癌症形式遗传易感性的患者，或处于实体瘤环境风险的患者。例如，处于癌症风险的患者可以是具有癌症家族史的人，其在结肠中呈现息肉；或已知感染与子宫颈癌相关联的人乳头瘤病毒株的和/或呈现表明子宫颈癌早期变化的阴道涂片的妇女。
″血管动蛋白分子″包括任何全长的天然存在的血管动蛋白多肽或其片段，或任何其变体，其保留与天然存在的血管动蛋白多肽或其片段的抗原交叉反应性。术语″血管动蛋白″为本领域技术人员熟知，并且包括具有卷曲螺旋(coiled-coil)和C末端的PDZ结合区域的多肽，认为是具有72kD估计分子量的细胞表面-相关蛋白。其认为结合血管抑素并且介导血管抑素对内皮细胞迁移以及管形成的抑制作用。天然存在的血管动蛋白多肽的实例在以下给出：Troyanovsky等.(2001)J Cell Biol 152，1247-1254；WO99/66038；Levchelio等.(2003)J Cell Sci 116，3803-3810；Bratt等.(2002)Gene 298(1)，69-77；GenBank登录号No NP_573572(人)。血管动蛋白多肽可具有与天然存在的血管动蛋白多肽序列至少50％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至95％的序列同一性，例如在所列的参照或登录号中或序列1中的一种中给出的。在实施方案中，血管动蛋白多肽具有与天然存在的血管动蛋白多肽序列95％和100％之间的序列同一性，例如NP_573572的序列或序列1。血管动蛋白多肽可以是Bratt等.(2002)中所述的“动蛋白”家族成员，即血管动蛋白-样1(amotl1)或血管动蛋白-样2(amotl2)。如果利用所述多肽的片段，则最好其为包括具有血管动蛋白多肽中相应区域的动蛋白多肽区域的片段。所述区域在Bratt等.(2002)，例如在图4中指出，并可包括卷曲螺旋域区域和/或PDZ结合区域的部分或所有。amot 1的合适的片段至少包括amot 1氨基酸439至956的部分。amot 2的合适的片段至少包括amot 2氨基酸307至779的部分。
此外在底下论述提供评估序列同一性方法的参考文献。
本发明还包括有或无糖基化的血管动蛋白来源的多肽。取决于表达系统，在酵母或哺乳动物表达系统中表达的多肽的分子量和糖基化模式与天然分子类似或稍有不同。例如，编码多肽的DNA在细菌例如大肠杆菌中的表达通常提供未糖基化的分子。真核生物蛋白质的N-糖基化位点通过氨基酸三联体Asn-A.sub.1-Z表征，其中A.sub.1为除了Pro外的任何氨基酸，并且Z为Ser或Thr。具有失活的N-糖基化位点的多肽变体可通过本领域技术人员已知的技术产生，如寡核苷酸合成和连接或位点特异的诱变技术，并且落入本发明的范围内。或者，N-连接的糖基化位点可添加至血管动蛋白多肽。
更具体地，本发明的公开证实基于血管动蛋白的疫苗可引起肿瘤排斥应答，其可指已引起胸腺依赖性淋巴细胞(以下为″T细胞″)应答。因此，通过基于血管动蛋白的接种激发的自身免疫T细胞应答可预防性地利用或用于治疗恶性肿瘤或其他血管发生/血管生成相关的疾病。在另一方面，本发明还提供可单独或在病毒载体中利用指导所述肽表达的核酸分子用于免疫。
可通过本领域技术人员熟知的技术鉴定表位序列。例如，可利用例如在Epitope Mapping Protocols(1996)Methods Mol Biol 66，Glenn E Morris，Ed，Humana Press，Totowa，New Jersey；美国专利No4,708,871；Geysen等.(1984)PNAS 81，3998-4002；Geysen等.(1986)Molec Immunol 23，709-71中所述的那些表位作图技术。可利用所述方法鉴定线性的或构象的表位，例如利用源自X-射线晶体衍射或2D核磁共振的结构数据。抗原性或疏水性曲线图(例如利用从Oxford Molecular Group获得的OMIGA软件，根据Hopp等.(1981)PNAS 78，3824-3828和Kyte等.(1982)J Mol Biol 157，105-132的算法产生的)也可用于鉴定表位。
底下详述的表位或组合物或表达血管动蛋白或其表位的全细胞疫苗可在例如实施例中所述肿瘤发展的小鼠模型中检验以便证实免疫应答和/或对血管生成和肿瘤发展的作用的产生。可利用小鼠HLA-A2转基因小鼠模型或其他的人HLAI类或II类抗原的转基因小鼠模型。用于检验基于血管动蛋白的疫苗作用的其他合适的模型包括转基因小鼠模型，其自发生长肿瘤，例如发展乳癌的neu-T BALB/c模型。基于血管动蛋白的接种在这些模型中活化宿主免疫系统的能力可通过利用已知的免疫学测定法测定CD8+和CD4+T细胞应答而评估，例如ELISPOT测定法、细胞因子释放测定法和T细胞增殖测定法以及测定抗体应答的测定法，例如ELISA测定法和基于流式细胞术的测定法。为了测定在用此处提及的血管动蛋白或基于血管动蛋白的其他组合物免疫的小鼠中血管生成是否受抑制，肿瘤中新血管形成的发展通过各种已知的测定法评估，包括″基质凝胶-栓(Matrigel-plug)″测定法(为本领域技术人员熟知并且在(例如)London等.(2003)Cancer Gene Ther10(11)，823-832中描述)或基于成像的测定法例如皮肤-活瓣窗-室模型。
受体可以是人，例如患有或处于血管生成-相关疾病或病情风险的人，例如实体瘤、血管瘤、子宫内膜异位、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症病情(例如牛皮癣、肠慢性炎症、哮喘)。或者，受体可以是患有或处于所述病情风险的动物，例如家养动物(例如陪伴动物如猫或狗)或农业重要动物(即家畜)，例如牛、绵羊、山羊或家禽，例如鸡和火鸡。
在一个实施方案中该多肽或多肽至少包括血管动蛋白区域即血管动蛋白的一部分，其能够或预测能够以类似于折叠成全长血管动蛋白的方式独立折叠。利用计算机分析鉴定所述区域的方法为本领域技术人员所熟知(例如引入疏水性和/或形成α螺旋或β片层链可能性的分析)。认为独立折叠的能力在对天然血管动蛋白产生抗体应答中可能很重要。然而，认为就诱导基于T细胞的免疫应答而论折叠是无关紧要，因为血管动蛋白将由抗原呈递细胞降解为小的肽片段并且因而呈递至T细胞；这里并不认为折叠或构象重要，仅氨基酸序列重要。认为血管动蛋白疫苗主要通过诱导基于T细胞的免疫应答而起作用并且其并不需要利用能独立折叠的区域。
在一个实施方案中该多肽或多肽包括全长血管动蛋白。
可利用代表血管动蛋白一种或多种表位的一种或多种肽或肽模拟化合物(例如在实施例1中论述的)。例如，可利用例如最多约15、12、10或9个氨基酸的短肽(或编码所述短肽的多核苷酸)。表位包括模拟表位，其为本领域技术人员所熟知。
抗体可用作疫苗中的抗原。例如，给予指定靶标(例如血管动蛋白)抗体的抗体，随后免疫系统的B细胞产生该抗体的抗体，该抗体的抗体也识别内源的血管动蛋白。此称为抗-基因型疫苗，并且不同于被动抗体疗法，其中给予指定靶标的抗体。所述抗-基因型抗体包括在此处所用的“血管动蛋白分子”的定义中。
本发明还提供基于血管动蛋白的疫苗和靶向内皮细胞的其他类型抗血管生成疗法或产物间的组合。因此，例如疫苗可此外包括(除血管动蛋白分子或多肽之外)适于充当针对血管生成-促进多肽(除了血管动蛋白)，例如VEGFR-2(例如登录号No AF063658)或Tie2(例如登录号No BC035514)的免疫原的多核苷酸或多肽(或肽模拟化合物)。因此，例如本发明包括(与抗-血管动蛋白接种联合)用血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的接种，例如作为pDNA疫苗、病毒载体给予，或在DC细胞中表达或装载于DC细胞上。存在可用于和抗-血管动蛋白接种联合的许多其他类型的抗-血管生成疗法。血管生成-促进多肽序列的优选对应于对血管动蛋白的优选(合适地修改)。这些其他血管生成-促进多肽-来源的序列(例如VEGFR-2序列)可包括如血管动蛋白-来源的序列相同的或不同的多肽中(或多核苷酸，视情况而定)。治疗或疫苗可进一步包括基于血管动蛋白的疫苗和基于具有抗-肿瘤作用的细胞因子或肿瘤抗原给药的免疫疗法间的组合，例如作为pDNA疫苗、病毒载体给予，或在DC细胞中表达或装载于DC细胞上。
血管动蛋白包括具有抗原性(例如通过抗-血管生成作用评估的)、相互作用或与此处所述的血管动蛋白序列和/或上述引用的参考文献中公开的(包括公共数据库参照)和/或其他公共数据库记录的那些基本上相同活性的变体、片段和融合蛋白。最好血管动蛋白或其片段为天然存在的血管动蛋白或其片段，或所述血管动蛋白或片段与非血管动蛋白-来源的多肽的融合。例如，血管动蛋白-来源的序列可与帮助表达、稳定性和/或纯化的部分融合，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)部分或His标签，其为本领域技术人员所熟知。
如通过Wisconsin序列分析程序包，Unix版本8的Bestfit程序所测定的，″变体″具有和此处所述的或如上所述参考文献中的血管动蛋白多肽至少50％(优选60、70、80、90、95或99％)序列同一性的区域。百分比同一性可通过将候选变体分子至少50个氨基酸的区域(优选至少60、75或100)对照血管动蛋白序列中等长的最类似区域，允许上至5％的缺口而计算。
百分比同一性可例如通过利用Devereux等.(Nucl.Acids res.12：387，1984)所述并且可从威斯康星大学遗传计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序，版本6.0比较序列信息而确定。GAP程序利用如通过Smith和Waterman修正的(Adv.Appl.Math 2.482.1981)Neddleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的比对方法。优选的用于GAP程序的缺省参数包括：(1)用于核苷酸的比较矩阵(含有同一的值为1并且不同一的值为0)，以及Bribskov和Burgess的加权比较矩阵，Nucl.Acids Res.14：6745，1986，如Schwarts和Dayhoffeds，Atlas of Protein and Structure，National BiomedicalResearch Foundation，pp353-358，1979所述；(2)每个空位3.0的罚分和每个空位中每个符号额外0.10的罚分；以及(3)末端空位无罚分。
优选，血管动蛋白多肽由给定的全长野生型血管动蛋白的变体或融合蛋白(或片段)组成，其与所述的天然全长野生型血管动蛋白抗原交叉反应。
优选的血管动蛋白序列在例如序列1和2中显示：
取代、缺失、插入或任何亚组合可用于得到最终的构建体。由于有64种可能的密码子序列而仅有二十个已知的氨基酸，遗传密码在此意义上简并，即不同的密码子可产生相同的氨基酸。因此每种氨基酸有至少一种密码子，即每种密码子产生单一的氨基酸并且没有其他的。很显然在翻译期间，必须维持适当的阅读框架以便获得最终产生的多肽中适当的氨基酸序列。
用于在具有已知序列的预定氨基酸位点的添加、缺失或取代技术为大家所熟知。典型的技术包括寡核苷酸-介导的定点诱变和聚合酶链式反应。
寡核苷酸定点诱变基本包括将编码所需突变体的寡核苷酸与含有将要突变区域的单链DNA杂交并且利用单链作为模板用于寡核苷酸的延伸以产生含有该突变的链。该技术的各种形式在Zoller和Smith(1982)Nucl.AcidsRes.10，6487中描述。
疫苗抗原可包括一种以上血管动蛋白-来源的表位。表位定义为由CD4+或CD8+T细胞识别的多肽。此可用于促进免疫应答，如本领域技术人员所熟知的。
如本领域技术人员所熟知的，疫苗可进一步包括多肽或多核苷酸。多肽或多核苷酸可例如以重组生物体或其部分或其产物(如细胞培养物上清)的形式包含在疫苗中，优选微生物，优选能表达多肽的，即能表达血管动蛋白氨基酸序列，或者能将编码多肽的核酸投递至用于在其中表达的宿主细胞的微生物。如本领域技术人员所知的，重组微生物优选无毒性的微生物。重组微生物可以是例如双歧杆菌(Bifidobacterium)或乳杆菌(lactobacillus)或减毒的沙门氏菌(Salmonella)或BCG或减毒的大肠杆菌。重组生物体或者可以为植物，例如利用WO97/40177的教导。
在另外的一种选择中，疫苗可制备为完整的真核细胞或由该细胞含有的物质。例如细胞可源自将为疫苗所用的生物体类型。例如细胞可以是人细胞。细胞可以是重组细胞。细胞可以是能表达血管动蛋白分子的细胞系的细胞，例如用编码血管动蛋白分子的多核苷酸转染的细胞。因此，细胞可包括编码血管动蛋白分子的重组多核苷酸，并且表达重组的血管动蛋白分子。细胞可经照射、热灭活或低聚甲醛-固定而用于免疫。
细胞可以是表达血管动蛋白的肿瘤细胞，或(人来源的或来自另一物种的异种)新移植的或培养的内皮细胞，其表达血管动蛋白或用血管动蛋白或该分子的部分转染的并且表达其的细胞。可检测细胞以确定其表达血管动蛋白。细胞可以是抗原呈递细胞，如树突状细胞(DC)，其用血管动蛋白分子装载或用编码血管动蛋白或血管动蛋白相关产物的cDNA或mRNA转染。肿瘤细胞疫苗(其可能不一定包括血管动蛋白抗原)可与血管动蛋白疫苗一起使用。对于全细胞疫苗，从患者取出肿瘤细胞并且在实验室中培养。随后肿瘤细胞经处理以确保1)其不再能繁殖，和2)不存在可感染患者的物质。当完整的肿瘤细胞注射入人，产生针对肿瘤细胞上抗原的免疫应答。
有两种类型的全细胞癌症疫苗。自体全细胞疫苗用患者自身完整的、灭活的肿瘤细胞制备。异源的全细胞疫苗用其他人的完整的、灭活的肿瘤细胞或组合的数个人的肿瘤细胞制备。
APC疫苗由启动T细胞而杀死肿瘤细胞的最佳细胞，抗原呈递细胞(APC)制备。所用APC的最常见类型为树突状细胞。例如，癌症疫苗可由树突状细胞制备，其已在实验室中在肿瘤抗原存在时装载或培养。用抗原装载的树突状细胞(或APC)在其表面携带肿瘤抗原并且当注射时即将强烈激活T细胞而繁殖和杀死肿瘤细胞。用血管动蛋白分子作为抗原可利用相同的方法。
抗原疫苗不由完整的细胞而是由肿瘤含有的一种或多种抗原制备。一种肿瘤可具有许多抗原。一些抗原为所有特定类型的癌症共有，并且一些抗原是个体唯一的。一些抗原为不同类型癌症的肿瘤间共有的。可有许多投递抗原疫苗中抗原的方法。来自肿瘤细胞的蛋白质或蛋白质部分可作为疫苗直接给予。
血管动蛋白分子(或其他疫苗抗原)可以是肽模拟化合物，例如对应于如上所述的血管动蛋白表位或模拟表位。术语″肽模拟物″指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和所需特征而避免不想要的特征的化合物。例如，吗啡为可口服给予的化合物，并且其为肽内啡肽的肽模拟物。
由于口服生物利用率的不足以及蛋白水解降解，涉及肽的治疗应用是有限的。例如，通常肽由外和内肽酶在体内快速降解，通常导致非常短的生物半衰期。肽作为潜在治疗剂的另一个缺陷是其通过口服的生物利用率的不足。肽在胃肠道中由蛋白水解酶的降解很可能是重要的作用因素。然而，由于已认识到即使不受快速的代谢物失活影响的小环肽也表现出差的口服生物利用率，该问题更加复杂。此可能归因于透过肠膜的差的转运以及通过肝排出而从血液的快速清除以及随后的分泌入肠中。这些观察提示多个酰胺键可能妨碍口服的生物利用率。认为当肽药物口服给予时肽链中连接氨基酸残基的肽键可能分裂。
有许多用以肽模拟物设计和合成的不同方法。一种方法中，如Sherman和Spatola，J.Am.Chem.Soc.，112：433(1990)公开的，一个或多个酰胺键通过各种化学官能团以电子等排的方式替换。该逐步的方法已获得一些成功，已经获得有活性的类似物。在有些情况下，已显示这些类似物比其天然存在的对应物具有更长的生物半衰期。然而，该方法具有局限性。一个以上酰胺键的成功替换很少。因此，得到的类似物在该分子的别处仍保留对酶促失活易感。当替换肽键时最好是新接头部分作为肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的极性。
其中肽键反转的逆-反(Retro-inverso)肽模拟物，可通过本领域已知的方法合成，例如Meziere等.(1997)J.Immunol.159 3230-3237中所述的那些。该方法包括制备含有涉及主链，而不是侧链方向改变的假肽。含有NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆-反肽更耐蛋白质水解。
另一种方法中，各种未编码的或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸已用于修饰哺乳动物的肽。或者，假定的生物活性构象已通过如环化作用的共价修饰或通过γ-内酰胺或其他类型桥的掺入而稳定。参见，例如Veber等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：2636(1978)和Thursell等.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111：166(1983)。
许多合成策略中常见的论题为一些环状部分导入基于肽的框架中。环状部分限制肽结构的构象空间并且此常常导致肽对于特定生物受体的提高的亲和力。该策略另外的优势为环状部分导入肽还可导致肽具有对细胞肽酶减弱的敏感度。
合成环状稳定肽模拟物的一种方法是环合复分解(ring closingmetathesis)(RCM)。该方法涉及下列步骤：合成肽前体，使其与RCM催化剂接触，产生构象受到限制的肽。合适的肽前体可以包含两个或多个不饱和C-C键。可以使用固相肽合成技术进行所述方法。在该实施方案中，锚定到固体支持物上的所述前体与RCM催化剂接触，然后从所述固体支持物上切割下产物，产生构象受到限制的肽。
可以使用在合成多肽之前或之后化学修饰一个或多个氨基酸残基的多肽作为抗原，只要所述多肽的功能即在体内产生特异性免疫应答基本保持未变。所述修饰包括与酸或碱，尤其是生理上可接受的无机或有机酸和碱形成盐、形成末端羧基的酯或酰胺、以及连接氨基酸保护基如N-叔丁氧羰基。所述修饰可以保护多肽免受体内代谢。多肽可经甘露糖化或经修饰以提高其抗原性，或与用于提高其抗原性和/或免疫原性的化合物结合。
源自血管动蛋白促效表位的用途也包括在本发明中。促效表位设计成通过MHC I类或MHC II类受限制的CD8或CD4+T细胞更有效的活化而更有效地激活免疫系统。本发明包括用以设计来自T细胞表位促效表位的两种常规方法。一种方法要求HLA锚定残基的修饰，产生更高的HLA I类或II类结合。该方法已成功应用于一些源自肿瘤抗原或微生物抗原的HLA I类结合肽。或者，参与T细胞受体(缩写TCR)接触的残基的替换也可通过T细胞产生提高的应答并且由本发明所包括。
通常，如本领域技术人员所熟知并且例如在US5,869,445中所述的，可以各种方法产生氨基酸的取代以提供本发明范围内的其他变体实施方案。例如，首先可保守地产生氨基酸取代；即取代氨基酸替换具有类似性质的氨基酸，使得肽化学领域的技术人员能预知该多肽的二级结构和亲水性质基本不变。通常，下列氨基酸组代表保守改变：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。非保守改变的实例为用另一组的氨基酸替换一个组的氨基酸。
产生氨基酸取代以得到本发明变体的另一种方法为确定和替换T细胞基序中可能结合II类MHC分子(对于CD4+T细胞应答)或I类MHC分子(对于CD8+T细胞应答)的氨基酸。具有理论上可能结合II类MHC分子的基序的肽片段(血管动蛋白分子的)可通过计算机分析确定。例如，可利用蛋白质序列分析程序包，T位点，其引入一些设计成能辨别T细胞识别潜在位点的计算机算法(Feller和delaCruz，Nature 349：720-721，1991)。利用两种检索算法：(1)Margalit所述的AMPHI算法(Feller和de la Cruz，Nature 349：720-721，1991；Margalit等.，J.Immunol.138：2213-2229，1987)根据α-螺旋周期性和两亲性鉴定表位基序；(2)Rothbard和Taylor算法根据电荷和极性模式鉴定表位基序(Rothbard和Taylor，EMBO 7：93-100，1988)。具有两种基序的片段最适合于结合II类MHC分子。CD8+T细胞识别结合I类MHC分子的肽。Falk等已确定结合特定MHC分子的肽共有可辨别的序列基序(Falk等.，Nature 351：290-296，1991)。结合于HLA-A2.1槽中的肽基序已通过剥离自所培养细胞系的HLA-A2.1分子肽的Edman降解确定(表2，Falk等.，上文)。该方法鉴定了在位点2(L)和9(V)存在主要锚定残基的9个氨基酸长度的典型或普通的HLA-A2.1结合肽。已在位点2(M)、4(E、K)、6(V)和8(K)鉴定了通常存在的强结合残基。鉴定的基序代表许多结合肽的平均数。
表位(例如表位-形成的氨基酸序列，或认为包括抗-血管生成表位的区域)可以单一拷贝或多个例如串联重复体而呈递。所述串联或多个重复体可以本身具有充分的抗原性而避免利用载体。对于多肽，可能有利的是形成环，N-末端和C末端连接在一起，或添加一个或多个Cys残基至末端以提高抗原性和/或允许形成二硫键。如果表位，例如表位-形成氨基酸序列共价连接至载体，优选多肽，则优选使得表位-形成氨基酸序列形成环的排列。
根据当前的免疫理论，载体功能应该存在于任何免疫原性制剂中以刺激或增强免疫系统的刺激。以上根据之前本发明的方面定义的表位可与独立的载体，如血清白蛋白、肌红蛋白、细菌类毒素和钥孔血蓝素例如通过交联而结合。血管动蛋白本身可充当载体或佐剂。近来开发的诱导免疫应答中T细胞辅助的载体包括乙肝核心抗原(也称为核壳体蛋白质)、假定的T细胞表位如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys、β-半乳糖苷酶和白介素-1的163-171肽。后者化合物可多方面看作载体或佐剂或两者。
或者，相同或不同表位的一些拷贝可相互交联；因而在该情况中无独立的载体，但可通过所述交联提供载体功能。合适的交联剂包括Sigma和Pierce目录中所列的那些，例如戊二醛、碳二亚胺和琥珀酰亚胺基4-(N-马来亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，后者利用C末端胱氨酸残基(如果存在)上的-SH基团。可利用交联多肽的任何常规方法，如O′Sullivan等.Anal.Biochem.(1979)100，100-108中通常所述的。例如，第一个部分富集巯基以及第二个部分与能与巯基反应的双功能制剂反应，例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-二硫吡啶基)丙酸盐(SPDP)，其为在偶联物之间引入二硫桥的异双功能交联剂。例如利用m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的酰胺和硫醚键通常在体内比二硫键更稳定。
此外有效的交联剂包括S-乙酰基硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)，其为伯胺硫化剂，其提供辛二酰亚胺酸二甲酯(dimethylsuberimidate)二氢氯化物和N，N′-间-苯二马来酰亚胺(phenylenedimaleimide)在温和条件下巯基的脱保护(Julian等.(1983)Anal.Biochem.132，68)。
如果多肽通过合适的核苷酸序列在合适的宿主中的表达而制备，则以与充当载体的肽序列的融合产物表达该多肽将是有利的。Kabigen的″Ecosec″系统为所述方案的实例。
其他有效的的佐剂包括WO02/053181中论述的佐剂，例如VSA3，其包括DDA(参见美国专利No5,951,988)。
可用于制备合适的重组多肽或多核苷酸的合适的载体或构建体为本领域技术人员所知。能表达所需多肽的多核苷酸或多肽可利用本领域技术人员熟知的技术制备。
合乎需要的是多核苷酸能在受体中表达该多肽，以使人或动物可给予多核苷酸，导致抗原多肽(即源自血管动蛋白和任选其他多肽的序列)在人或动物中的表达。多肽，例如血管动蛋白，可从如下所述的任何合适的多核苷酸(遗传构建体)表达并且投递至受体。通常，表达多肽的遗传构建体包括有效连接至启动子的所述多肽编码序列，其可在受体细胞中表达转录的多核苷酸(例如mRNA)分子，其可经翻译以合成所述多肽。合适的启动子为本领域技术人员所知，并且可包括用于遍在表达基因的启动子，例如管家基因或用于组织-选择性基因的启动子，取决于希望其在何处表达所述多肽(例如，在树突状细胞或其他抗原呈递细胞或其前体细胞中)。优选，利用树突状细胞或树突状前体细胞-选择性启动子，但这并不是必要的，尤其在多核苷酸的传递或摄取靶向所选择的细胞，例如树突状细胞或前体细胞时。树突状细胞-选择性启动子可包括CD83或CD36启动子。
其他期望表达的或与基于血管动蛋白的疫苗组合的多肽/蛋白包括免疫刺激剂如细胞因子或生长因子。实例包括GM-CSF、IL-2、IL12或IL-15(参见，例如实施例1)。表达或包括在内的其他免疫刺激剂为结合所谓的Toll受体的因子，其包括小的免疫刺激分子咪喹莫特(Imiquimod)、微生物产物如鞭毛蛋白或未甲基化的细菌CpG基序或基于CpG基序的寡核苷酸。
能表达多肽的核酸序列优选有效连接至所述序列表达必需的调控元件。
“有效连接”指这样的并列设置：在该设置下可以执行各组分的正常功能。因此，与调控元件“有效连接”的编码序列指这样的设置：在该设置下编码抗原(或免疫刺激分子)的核酸序列能够在调控序列的控制下表达。
“调控序列”指在特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列所必需的核酸序列。例如，适合真核细胞的调控序列为启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
“载体”指包括单链、双链、环状或超螺旋DNA的DNA分子。合适的载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、痘病毒和细菌质粒。逆转录病毒载体为通过将其基因组随机整合进宿主而复制的逆转录病毒。合适的逆转录病毒载体在WO92/07573中描述。
病毒载体不能令人不适或带来任何疾病。这些病毒可在实验室中经工程改造以使其感染人细胞时，细胞将产生并且在其表面上呈现所需的抗原。病毒能感染仅少量的人细胞--足以起始免疫应答，而不足以使人不适。
病毒还可以经工程改造以产生细胞因子或在其表面展示蛋白质，其帮助激活免疫细胞。这些可单独或与疫苗一起给予而帮助免疫应答。
腺病毒为线性双链DNA病毒。合适的腺病毒载体在Rosenfeld等.，Science，1991，Vol.252，page 432中描述。
腺病毒相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且由约4-6Kb的单链DNA组成。
痘病毒载体为大病毒并且有几个可插入基因的位点。其为热稳定的并且可在室温下储存。安全性研究表明痘病毒载体是复制缺陷型，并且不能从宿主传播到宿主或从宿主传播到环境。
可例如通过在注射位点利用靶向载体和投递系统或通过所述细胞群从受体的选择性纯化以及肽或核酸的回体(ex vivo)给予而实现将疫苗靶向至特定的细胞群，例如抗原呈递细胞(例如树突状细胞可如Zhou等.(1995)Blood 86，3295-3301；Roth等.(1996)Scand.J.Immunology 43，646-651中所述的分选)。此外，靶向载体可包括组织或肿瘤-选择性启动子，其指导抗原在合适部位的表达。
尽管遗传构建体可以是DNA或RNA，优选DNA。
优选，遗传构建体适合于投递至人细胞。
将遗传构建体导入细胞中的或从动物体中取出的办法和方法为本领域所知。例如，本发明的构建体可通过任何方便的办法，例如涉及逆转录病毒的办法导入细胞，以使构建体插入(正分裂)细胞的基因组中。靶向逆转录病毒可用于本发明中；例如赋予特定结合亲和力的序列可改造入之前存在的病毒env基因中(参见Miller & Vile(1995)Faseb J.9，190-199，对用于基因治疗的该病毒以及其他靶向载体的综述)。
优选的逆转录病毒载体可以是慢病毒载体如Verma &Somia(1997)Nature 389，239-242中所述的那些。
其他的方法包括在有限时间内或随着整合入基因组而长时间内将构建体简单投递入细胞中而用于表达。后者方法的实例包括脂质体(Nassander等.(1992)Cancer Res.52，646-653)。其他的投递方法包括经抗体-聚赖氨酸桥携带外部DNA的腺病毒(参见Curiel Prog.Med.Virol.40，1-18)以及作为载体的转铁蛋白-聚阳离子偶联物(Wagner等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，3410-3414)。这些方法的第一种中用本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成聚阳离子-抗体复合物，其中抗体特异于野生型腺病毒或腺病毒变体，其中已引入结合抗体的新表位。聚阳离子部分通过与磷酸盐主链的静电相互作用结合DNA。腺病毒，由于其含有不变的纤维以及五位体蛋白，包含于细胞内并且将本发明的DNA构建体携带入细胞。在聚阳离子为聚赖氨酸时是优选的。
可能合适的细菌投递方法在Dietrich(2000)Antisense Nucleic Acid DrugDelivery 10，391-399中描述。例如，减毒菌株允许重组疫苗通过粘膜表面给予。然而减毒的细菌通常经改造以表达异种抗原，另外的方法利用用于真核生物抗原表达载体(DNA疫苗)投递的胞内细菌。该策略通过细菌感染允许DNA直接投递至专门的抗原-呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突状细胞(DC)。用于DNA疫苗投递的细菌通过APC的吞噬作用进入宿主细胞的胞质，例如志贺氏菌(Shigella)和李司忒氏菌(Listeria)，或其留在吞噬体区如沙门氏菌(Salmonella)。细菌载体的两种胞内定位均适于本发明DNA疫苗载体的成功投递。
血管动蛋白(或其他)多肽可在诱导型的细菌启动子控制下，例如当细菌遇到或进入宿主生物体环境(例如宿主的消化道)或结合或进入宿主细胞时受诱导的启动子。
基因枪投递为本发明有关的优选的投递方法。尤其是，血管动蛋白质粒DNA可作为″基因-枪″的皮内接种、肌肉内注射，或真皮内或肌内注射并且随后在该注射位点的皮肤或肌内″电穿孔″的质粒DNA接种而给予以提高接种的效力。利用基因-枪投递本发明的疫苗在实施例5中描述并且产生的数据在图5和6中显示。
DNA还可通过腺病毒投递，其中其存在于例如如下所述的腺病毒颗粒内。
可采用利用受体介导的胞吞作用而携带DNA大分子进入细胞的高效核酸投递系统。此通过将铁-转运蛋白转铁蛋白偶联至结合核酸的聚阳离子而完成。人转铁蛋白或鸡同系物伴白蛋白，或其组合通过二硫键共价连接至小DNA-结合蛋白精蛋白或不同大小的聚赖氨酸。这些修饰的转铁蛋白分子保持结合其同源的受体并且介导铁有效的转运进入细胞的能力。与核酸大小无关(从短的寡核苷酸至21kb的DNA)，转铁蛋白-聚阳离子分子与本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成电泳稳定的复合物。当转铁蛋白-聚阳离子和本发明的DNA构建体其他遗传构建体的复合物提供给靶细胞时，预期得到细胞中该构建体的高水平表达。
还可利用本发明DNA构建体或其他遗传构建体的高效的受体-介导的投递，其利用通过Cotten等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6094-6098的方法产生的缺陷型或化学灭活的腺病毒颗粒的核内体-破坏的活性。该方法看来依赖这样的事实，即腺病毒适于从核内体而不经过溶酶体释放其DNA，并且在例如连接至本发明的DNA构建体或其他遗传构建体存在时，构建体由细胞通过与腺病毒颗粒相同的途径吸收。
该方法有下列好处，即不必利用复杂的逆转录病毒构建体；没有在用逆转录病毒感染时出现的基因组的永久修饰；以及靶向的表达系统与靶向的投递系统结合，由此降低对其他细胞类型的毒性。
″裸DNA″和与阳离子的和中性的类脂复合的DNA也可用于将本发明的DNA导入受体细胞中。用以基因治疗的非病毒方法在Ledley(1995)HumanGene Therapy 6，1129-1144中描述。还已知另一种靶向投递系统如在WO94/10323中所述的改进的腺病毒系统，其中通常DNA携带于腺病毒或腺病毒-样粒子内。Michael等.(1995)Gene Therapy 2，660-668描述了腺病毒的修饰以添加细胞-特异性部分进入纤维蛋白质。在p53-缺陷的人肿瘤细胞中选择性复制的突变腺病毒，如在Bischoff等.(1996)Science 274，373-376中所述的，也可用于将本发明的遗传构建体投递至细胞。其他合适的病毒或病毒-样粒子包括HSV、AAV、痘苗病毒(vaccinia)、慢病毒和细小病毒。
免疫脂质体(抗体指导的脂质体)尤其可用于靶向过表达可获得针对所述蛋白的抗体的细胞表面蛋白的细胞类型，这对于树突细胞或前体细胞是有可能的，例如使用针对CD1、CD14或CD83的抗体(或其它树突细胞或前体细胞表面分子，如上文所述)。为制备免疫脂质体，依照Martin &Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288的方法合成MPBPE(N-[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酰]磷脂酰乙醇胺)。将MPB-PE掺入脂质体双分子层中，使抗体或其片段与脂质体表面形成共价偶联。将本发明的DNA或其它遗传构建体方便地加载到脂质体上以传递到靶细胞，例如通过以下步骤：在包含所述DNA或其它遗传构建体的溶液中形成所述脂质体，然后在高达0.8MPa的氮气压力下，顺序挤出通过0.6μtm和0.2μm孔径的聚碳酸酯膜滤器。挤出后，在80000×g超速离心45分钟，从游离的DNA构建体分离截留的DNA构建体。将脱氧缓冲液中新鲜制备的MPB-PE脂质体与新鲜制备的抗体(或其片段)混合，在4℃下氮气环境中恒定竖转式旋转(end over end rotation)过夜，进行所述偶联反应。通过在80000×g超速离心45分钟从未偶联的抗体分离免疫脂质体。免疫脂质体，可以例如经腹膜注射，或例如通过皮下注射直接注射入靶细胞存在的部位。
可以理解的是需要在细胞中能够在时间上调节多肽的表达(例如抗原多肽)。因此，所希望的是多肽的表达直接或间接(见下文)处于启动子的控制下，其例如通过当希望激活或抑制(取决于该小分子是否影响所述启动子的激活或抑制)多肽表达时给予受体的小分子的浓度而调节。可以理解的是如果表达构建体为稳定的，即能在所述细胞中至少一周、一、二、三、四、五、六、八个月或一或多年的时间表达多肽(在任何必需的调控分子存在下)，这将是特别有利的。最好是表达构建体能在所述细胞中表达多肽小于一个月的时间。本发明优选的构建体可包括可调控启动子。可调控启动子的实例包括在下面文献中提到的启动子：Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(15)，8657-62(由雷帕霉素控制，雷帕霉素是一种口服可生物利用的药物，使用两种独立的腺病毒或腺病毒相关病毒(AAV)载体，一种载体编码可诱导型人生长激素(hGH)靶基因，另一种编码双向雷帕霉素调节的转录因子)；Magari等(1997)J Clin Invest 100(11)，2865-72(由雷帕霉素控制)；Bueler(1999)Biol Chem 380(6)，613-22(腺病毒相关病毒的综述)；Bohl等(1998)Blood 92(5)，1512-7(由腺相关载体中的强力霉素控制)；Abruzzese等(1996)J Mol Med 74(7)，379-92(综述诱导因子，如激素、生长因子、细胞因子、细胞抑制剂、辐射、热休克和相关的效应元件)。还可利用四环素-可诱导的载体。这些是由相对无毒的抗生素激活的，并且已经显示可用于调节在哺乳动物细胞培养物中的表达。同时，基于类固醇的诱导剂可能是特别有用的，因为类固醇受体复合物进入核，在核中DNA载体在转录前必须被分离。
可以通过在两个水平上调节表达而进一步改善该系统，例如通过使用如上文讨论并且是本领域内技术人员已知的组织选择性启动子和由外源诱导剂/抑制剂，例如小分子诱导剂控制的启动子。因此，调节的一个水平可能涉及将合适的多肽编码基因连接到诱导型启动子上，而调节的另一水平包括使用组织选择性启动子驱动编码必需的诱导型转录因子(其控制所述多肽(例如抗原多肽)-编码基因从所述诱导型启动子的表达)的基因。通过所述遗传构建体的细胞类型特异性打靶，可以进一步改善控制。
可利用本领域熟知的方法制备本发明的遗传构建体。
治疗剂或分子(疫苗)，例如抗原分子，例如血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的构建体或其制剂，可通过任何常规方法，包括口服和肠胃外的(例如皮下的或肌内的)注射而给予。优选的途径包括口服、鼻内或肌内注射。治疗可由一段时期内的单次剂量或多次剂量组成。可以理解的是诱导剂，例如如上所述的小分子诱导剂可优选口服给予。
将遗传构建体，例如腺病毒载体构建体投递至受体细胞的方法为本领域技术人员所熟知。尤其是，可利用继承性治疗(adoptive therapy)方案，更优选可利用基因枪将构建体投递至例如皮肤中的树突状细胞。
继承性治疗方案在Nestle等.(1998)Nature Med.4，328-332和De Bruijn等.(1998)Cancer Res.58，724-731中描述。
治疗剂(疫苗)可通过其它的方法给予正治疗疾病的受试者。因此，尽管治疗方法可单独使用，但理想的是将其作为一种辅助治疗，例如与常规的预防或治疗方法或靶向肿瘤抗原的免疫疗法一起。例如，血管动蛋白疫苗与基于肿瘤抗原的疫苗的组合作为肽、蛋白质、寡核苷酸或全肿瘤细胞的给药可能是合适的组合治疗。合适的肿瘤抗原的实例在随后的实施例中提供并且另外的实施例提及有关本发明的疫苗。
尽管此处所述的治疗分子例如抗原分子或免疫刺激分子可以单独给药，优选将其与一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂呈现。载体必须是″可接受的″指与治疗分子(其可以是核酸或多肽)相容并且对其受体无害的意思。通常，载体为无菌的以及无热原的水或盐水。
药物组合物可进一步包括用于提高该组合物抗原性和/或免疫原性的组分，例如如上所述的佐剂和/或细胞因子。多价抗原(抗原簇)将是有效的。
商品化类型的细胞因子已用作通常加强免疫系统的非特异性免疫疗法以及用作与其他免疫疗法如肿瘤疫苗一起给予的佐剂。GM-CSF正检验作为非特异性的免疫疗法以及作为与其他类型的免疫疗法一起给予的佐剂而抗癌。
已知加强免疫系统活性的各种其他的化合物并且目前正研究其可能作为佐剂，尤其用于疫苗治疗。一些最常研究的佐剂列于如下，但很多正在开发中。
左旋咪唑(Levamisole)，第一个用于针对寄生虫感染的药物，最近发现当与一些化疗药物一起使用时提高患结肠直肠癌病人的存活率。由于其能激活T淋巴细胞，常常用作免疫治疗佐剂。左旋咪唑目前通常用于患有某阶段结肠直肠癌的人并且正在临床试验中检验作为用于其他类型癌症的治疗。
氢氧化铝(明矾)为临床试验中用于癌症疫苗的最常见佐剂的一种。其已用于针对一些传染物的疫苗中，包括乙型肝炎病毒。
Bacille Calmette-Guérin(BCG)为与引起结核病的细菌有关的细菌。BCG感染对免疫系统的作用使得该细菌可用作抗癌免疫治疗的形式。BCG为最早用于抗癌的免疫疗法的一种。其为FDA批准用于浅表膀胱癌的常规疗法。还检验了其作为非特异性佐剂在其他癌症中的有效性。研究人员正考虑在利用化疗、放疗或其他类型免疫疗法时注射BCG以产生对免疫系统的额外加强。
不完全弗氏佐剂(IFA)与有些实验性疗法一起给予以帮助刺激免疫系统并且增强对癌症疫苗的免疫应答。IFA为由石蜡油中的乳化剂组成的液体。
QS-21为从植物提取物制备的相对新的免疫刺激剂，其增强对用于黑色素瘤的疫苗的免疫应答。
DETOX为另一种相对新的佐剂。其由细菌的细胞壁部分和一种脂组成。其和各种免疫疗法一起用于刺激免疫系统。
钥孔血蓝素(KLH)为用于加强癌症疫苗疗法有效性的另一种佐剂。其从一种海洋软体动物中提取。
二硝基苯酚(DNP)为能附着于肿瘤抗原并且引起增强的免疫应答的半抗原/小分子。其用于修饰某些癌症疫苗中的肿瘤细胞。
制剂可以很方便地以单元剂型存在且可通过药剂学领域熟知的任何方法制备。所述方法包括将活性成分(对于抗原分子，为本发明的构建体或嵌合多肽)与载体相联系的步骤，其构成一种或多种添加剂。通常，制剂通过将活性成分均匀和紧密地加入液体载体或精细粉碎的固体载体或两者中，随后如有必要，将产品定型而制备。
本发明适于口服的剂型可作为每种包含预定量活性成分的分散单元如胶囊剂、扁囊剂或片剂；作为粉剂或粒剂；作为水液体或非水液体的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂而存在。活性成分还可作为丸剂、干药糖剂或糊剂存在。
片剂可通过压制或模制生产，任选同时使用一或多种添加剂。压制片可通过在合适的机械内将任选与下列组分混合的、呈自由流动形式的活性组分例如粉剂或粒剂压缩而制备：粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素)、表面活性剂或分散剂。模制的片剂可通过在合适的机械内模压用惰性液态稀释剂润湿的粉状化合物的混合物而制备。可任选将片剂包衣或压痕，还可配制成提供缓慢释放或控制释放其中的活性组分的形式，应用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供所需的释放分布。
适合在口腔内局部给药的制剂包括锭剂，其包含处于调味基料，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性成分；软锭剂，包含处于惰性基料，例如，明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；以及漱口剂，包含处于合适的液态载体中的活性组分。
适合肠胃外给药的制剂包括水性或非水的无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，该溶质使制剂与预期的受试验者的血液等渗；以及水性和非水的无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。所述制剂可呈单元剂量或多剂量的容器提供，例如，密封的安瓿瓶和管瓶，而且可在冷冻干燥的(冻干的)条件下贮存，只需要就在使用前添加无菌液态载体，例如，注射用水。临时调配的注射液和悬浮液可从之前所述的那种无菌粉剂、粒剂和片剂配制。
鼻喷雾剂可以是有效的制剂。
优选的单元剂量制剂是那些，即，含活性成分的单剂量或日剂量或单元、日再分剂量(subdose)或其合适的部分。
应注意的是，除了上文特别提及的组分外，本发明的制剂还可包括本领域和所述制剂类别相关的其它常规制剂，例如，适合口服的那些可包括调味剂。
可以理解的是治疗分子可通过适于药物局部给药的任何方法投递至部位。例如，治疗分子的溶液可直接注射至该部位或可通过利用输液泵的输液而投递。例如，构建体还可结合入可移植的装置中，其在置于所期望的部位时允许构建体释放进入周围的部位。
治疗分子可通过水凝胶材料给药。水凝胶为非炎性的并且生物可降解的。目前已知许多所述的材料，包括从天然的和合成的聚合物制备的那些。在一个优选的实施方案中，该方法利用这样的水凝胶，其在体温下为液体但在体温时或之上时为凝胶剂以形成维持形状的半固体水凝胶。优选的水凝胶为氧化乙烯-氧化丙烯重复单元的聚合物。聚合物的性质取决于聚合物的分子量和聚合物中聚环氧乙烷和聚氧化丙烯的相对百分比。优选的水凝胶含有约10％至约80％重量比的氧化乙烯和约20％至约90％重量比的氧化丙烯。尤其优选的水凝胶含有约70％的聚环氧乙烷和30％的聚氧化丙烯。可利用的水凝胶例如可从BASF Corp.，Parsippany，NJ获得，商品名为PluronicR。
如上所述，方便的情况下，核酸疫苗可包括任何合适的核酸投递工具。核酸，优选DNA，可以是裸露的(即基本上无所要给药的其他组分)或其可在脂质体中或作为病毒载体投递系统的一部分而投递。
如上所述，受试者可给药以多肽和多核苷酸的组合。
″有效量″包括提供足够量的制剂以产生对受体的健康有益的所期望的药物作用。
为了免除疑问，所有在此参考的文献因此引入作为参考。
本发明现在通过参照下列非限制性的附图和实施例描述。
图1.
小鼠用血管动蛋白疫苗质粒或用有或者没有GM-CSF质粒的对照载体接种。14天后给予加强接种。第二次接种2周后的小鼠用100,000活的、B16肿瘤细胞腹膜内给药而激发。3周后测定肿瘤生长。A和B代表两个独立的实验。
图2.
小鼠用血管动蛋白疫苗或含有GM-CSF质粒的对照质粒接种。14天后给予加强接种。第二次接种2周后小鼠用100,000活的、D2F2肿瘤细胞腹膜内给药而激发。3周后测定肿瘤生长。A代表小鼠的存活率而B代表平均肿瘤体积。
图3
小鼠用血管动蛋白疫苗或含有GM-CSF质粒的对照质粒接种。14天后给予加强接种。第二次接种2周后小鼠用60,000活的、EL4肿瘤细胞腹膜内给药而激发。3周后测定肿瘤生长。A代表小鼠的存活率而B代表平均肿瘤体积。
图4
人血管动蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
图5
抗-血管动蛋白接种。血管动蛋白作为单一治疗剂。BALB-neu T小鼠，其由于在小鼠乳腺瘤病毒启动子调控下过表达转化的大鼠Her2/neu致癌基因而自发产生肿瘤(Boggio等.，J.Exp.Med 1998，188，589-96)，在6周大小时用血管动蛋白疫苗质粒或对照质粒接种，或未治疗。小鼠通过Quaglino等(Cancer Research 64，2858-64，2004)中所述的″电穿孔″方法接种。简要地，总共25μg的EC-TM质粒注射入麻醉小鼠的胫骨肌肉。电脉冲通过置于用导电凝胶覆盖的剃过的皮肤上的两个电极施加。通过T820电穿孔器(BTX，San Diego，CA)产生两个25ms，375V/cm脉冲的方波。2周后给予加强接种。显示每组小鼠中无肿瘤小鼠的百分比。
图6
两种组分的治疗：Amot。BALB-neu T小鼠在10周大小用血管动蛋白疫苗质粒或对照质粒接种，或未治疗。另外的小鼠群体用血管动蛋白疫苗质粒和TMEC(一种肿瘤抗原)接种。2周后给予加强接种。显示每一群体中无肿瘤小鼠的百分比。
图7
肿瘤移植模型
Balb/c小鼠在皮下注射TUBO乳腺癌细胞-系前的第-21天和第-7天接种。显示肿瘤的平均直径。
图8
对小鼠血管动蛋白的抗体应答。
针对来自血管动蛋白接种小鼠的血清中的鼠血管动蛋白的抗体应答在ELISA中测定(图8)。Y轴上的亮度信号代表血管动蛋白特异的IgG抗体的量并且X轴上数字1-6代表不同的血清稀释度(500-16000)。分析来自下列小鼠的血清：
A)Angio #6，小鼠No3、5、10、11、80；BALB/c小鼠每隔一周用血管动蛋白疫苗质粒电穿孔四次。分析第四次电穿孔后采集的血清并且与对照小鼠的相比较，后者已单独用TMEC在第10周和第12周电穿孔。
B)Angio #1A，小鼠No4、5、10、18、20；在第10周和第12周用血管动蛋白疫苗质粒电穿孔的BALB-neu T小鼠。分析第21周采集的血清并且与对照小鼠的相比较，后者已单独用TMEC在第10周和第12周电穿孔。
C)Angio #2，小鼠No0、4、5、6、40：在第10周和第12周用血管动蛋白和TMEC疫苗质粒电穿孔的BALB-neu T小鼠。分析第21周采集的血清并且与对照小鼠的相比较，后者已单独用TMEC在第10周和第12周电穿孔。
图9：抗-血管动蛋白DNA接种在体内抑制血管生成。
BALBc小鼠单独用血管动蛋白或与TMEC联合接种。小鼠用含有200ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的基质凝胶(matrigel)在最后一次接种后两周注射。七天后收集基质凝胶栓并且如Weidner等.N Engl J Med.1991 Jan3；324(1)：1-8所述定量血管密度。
材料方法和实施例
材料
C57B1和Balb/c小鼠获自微生物学和肿瘤生物学中心(Microbiology andTumor Biology Center)，Karolinska研究所的动物单位。用于评估的鼠肿瘤细胞系包括来自Dr.Wei Zen Wei，Karmans Cancer Center的小鼠乳腺癌D2F2、来自MTC科研单位的EL-4淋巴瘤和来自Dr.I.J.Fidler，MD AndersonCancer Center，Houston，TC的B16黑色素瘤。
实施例1：编码血管动蛋白的DNA疫苗的制备。
血管动蛋白-表达质粒按照该载体商品供应商(Invitrogen Inc.)的说明书通过将编码血管动蛋白分子的全长cDNA插入pCDNA3载体而构建。该载体设计用于蛋白质在哺乳动物细胞中的表达并且含有CMV启动子(美国专利No5,168,062和5,385,839；University of Iowa Research Foundation)、多克隆位点、牛生长激素聚腺苷酸化序列(美国专利No.5,122,458)和用于稳定的细胞系选择的新霉素抗性基因。
血管动蛋白的全长cDNA插入pCDNA3载体。用限制位点作图证实所得到质粒的方向和身份。通过蛋白质印迹分析得知，pCDNA3的转染带来血管动蛋白的表达。
实施例2：小鼠用编码血管动蛋白的DNA疫苗的接种。
Balb/c小鼠(每组6只小鼠)(图1)或C57B1小鼠(每组6只小鼠)(图2和3)利用基因枪免疫法用上述的血管动蛋白pDNA构建体，或作为对照的同样的pcDNA″空″对照质粒(PCDNA)以2周的间隔接种两次。
根据Qiaqen标准方案(Qiagen无内毒素的质粒试剂盒，WWRInternational)制备质粒。质粒以1mg/ml的浓度溶解并且保存在水中。根据该原液，质粒在99.5％的乙醇中与金混合并且涂布至塑料管上。从DNA-金混合物制备子弹，并且利用Helios基因枪(Biorad，Stockholm)在腹股沟淋巴结附近经表皮内投递。每只小鼠在不同的部位以每次注射0.6-1.0μg DNA的浓度接受两次注射。该过程以14天的间隔重复两次。该过程对于所有所用的质粒相同，包括下面论述的GM-CSF质粒。
在一些小鼠组中，编码细胞因子GM-CSF的质粒以等摩尔量与血管动蛋白编码质粒(血管动蛋白+GM)混合或与对照质粒(PCDNA+GM)混合，并且通过基因-枪如上所述而给药。GM-CSF表达质粒已在其它地方描述。(Charo，J.等.J.Immunol，163：5913-5919，1991)。
实施例3：接种小鼠的肿瘤生长和存活率的评估
最后一次免疫后两周，小鼠用约5×104活的B16细胞(图1)、D2F2黑色素瘤细胞(图2)或EL4淋巴瘤细胞(图3)激发。小鼠组每周两次检查每组的存活数以及平均肿瘤体积，如通过测微器测定的。
有许多动物研究证实疫苗候选物可预防性地(即在用肿瘤细胞激发的动物中预防肿瘤)以及治疗性地(即疫苗的给药引起之前建立的肿瘤的消退)作用，例如Cavallo等.(1993)Protective and curative potential of vaccination withIL-2 gene-transfected cells from a spontaneous mouse mammaryadenocarcinoma.Cancer Res21：5067；Nanni等.(2001)Combined allogeneictumor cell vaccination and systemic interleukin-12 prevents mammarycarcinogenesis in HER-2/neu transgenic mice.J Exp Med 194：1195。
实施例4：在产生血管动蛋白-特异性免疫应答中可能重要的血管动蛋白肽表位的预测
蛋白质的各种肽衍生物的免疫原性已知在任何个体中是受限制的，取决于组织抗原(HLA)或特定个体。利用建立的计算机算法(
http： //www.bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind/index.html)，确定源自血管动蛋白并且受限于不同HLA抗原的各种肽基序的结合亲和力和预测值。可能是免疫原性的并且受限于HLAA201表位的预测肽在表1中提供。HLAA201在白种人群体中以大约65％的频率存在。还可预测其他的HLA等位基因对免疫疗法具有潜在价值的类似肽基序。
HLA A201为对于接种白种人群体重要的等位基因。另一个重要的等位基因为HLA A2402，其以亚洲人群体的大约60％存在。
表1：
| 得分结果 | |||
| 顺序 | 起始位置 | 子序列残基列表 | 得分(含有该子序列的分子解离半衰期的评估) |
| 1 | 196 | KMQQALVQL | 124.199 |
| 2 | 388 | GLLSHSSTL | 79.041 |
| 3 | 169 | ALSNAQAKV | 69.552 |
| 4 | 285 | FALDAAATV | 67.409 |
| 5 | 94 | RMHDFNRDL | 48.075 |
| 6 | 417 | ILLGGDYRA | 31.249 |
| 7 | 31 | ILSDENRNL | 29.779 |
| 8 | 427 | YVPSTPSPV | 27.995 |
| 9 | 325 | ILMANKRCL | 26.874 |
| 10 | 389 | LLSHSSTLT | 12.668 |
| 11 | 52 | RLQKVETEI | 10.433 |
| 12 | 21 | IVSRAQQMV | 10.346 |
| 13 | 498 | MVAAAPVAV | 10.346 |
| 14 | 536 | GOIPAAASV | 7.052 |
| 15 | 262 | ILALEADMT | 6.208 |
| 16 | 345 | QIIEKDAMI | 5.881 |
| 17 | 62 | RVSEAYENL | 5.633 |
| 18 | 574 | ALVPVPAPA | 4.968 |
| 19 | 200 | ALVQLQAAC | 4.968 |
| 20 | 630 | RLSIPSLTC | 4.968 |
实施例5：作为抗血管生成治疗的血管动蛋白接种
上述的实施例证实了血管动蛋白接种可提供针对肿瘤发生的预防性保护。现在提供数据证实血管动蛋白接种可用作血管生成治疗的一部分。
方法
BALB-neu T小鼠为转基因乳腺癌小鼠模型。BALB-neu T小鼠由于在小鼠乳腺瘤病毒启动子调控下过表达转化的大鼠Her2/neu致癌基因而自发产生肿瘤(参考Boggio等.，J.Exp.Med 1998，188，589-96)。
BALB-neu T小鼠(每组5只)在图5和6中箭头所示年龄用25μg质粒通过T820 Electro square porator利用375V/cm、25ms的脉冲参数电穿孔入胫骨前肌而接种两次。使用以上实施例2中所述方案制备质粒用于电穿孔。
结果和讨论
图5中，三组小鼠在6和8周利用上述电穿孔方法，用空载体对照质粒(pcDNA3)、血管动蛋白质粒接种；或未治疗(以上述实施例1中所述质粒)。如可看到的，用血管动蛋白质粒治疗的小鼠中50％在30周后无肿瘤，而所有未治疗的或对照治疗的小鼠在27周后具有肿瘤。因此血管动蛋白可在该小鼠系中用以预防肿瘤发展。
图6中，四组小鼠在第10和12周大小时用空载体对照质粒(pcDNA3)；TMEC；TMEC+血管动蛋白质粒接种；或未治疗。TMEC为p185neuTM-ECD质粒，其编码p185neu的″胞外跨膜″部分，其为负责BALB-neu T小鼠中肿瘤发生的致癌基因的片段(Boggio等.，J.Exp.Med 1998，188；589-96)。
如可看到的，虽然所有未治疗的或对照治疗的小鼠在27周后具有肿瘤，用TMEC质粒单独治疗的小鼠中40％在50周后无肿瘤。此外，用TMEC质粒和血管动蛋白质粒两者治疗的小鼠100％在50周后无肿瘤。
因此双TMEC/血管动蛋白质粒接种在预防肿瘤发展中比TMEC或血管动蛋白单独接种具有更大的治疗效果。由于在接种年龄(第10和12周)处女BALB-neu T小鼠的乳腺已具有多处原发癌(参见以上给予的参考文献)，此证实用血管动蛋白和肿瘤疫苗的组合接种具有治疗效果并且可中止肿瘤的进一步发展。
图7中，成年Balb/c小鼠用上述的血管动蛋白pDNA疫苗，利用同样上述的电穿孔方法在TUBO乳腺癌细胞皮下(s.q.)注射之前第21天和第7天接种。TUBO乳腺癌细胞为分离自源自上述BALB-neu T小鼠的肿瘤的可移植细胞系。如可看到的，用血管动蛋白pDNA疫苗接种的小鼠中4只(标记为″预防″)完全没有肿瘤，而1只具有1mm大的肿瘤。所有未治疗的小鼠产生大的肿瘤。因此用血管动蛋白作为″单一治疗″的接种可用作小鼠中来自该乳腺癌系的肿瘤发展的预防性疫苗。
图5至7中的数据表明在可移植的肿瘤模型中作为″单一治疗″的血管动蛋白质粒接种可预防肿瘤生长并且，在自发的转基因Her2/neu乳腺癌模型中可明显地降低肿瘤发展。此外，图6中的数据表明给药至已发展多处原位肿瘤前病灶小鼠的组合血管动蛋白质粒/肿瘤抗原疫苗可给予完全的肿瘤保护并且比单独的血管动蛋白质粒或肿瘤抗原具有更大的作用，其表明基于血管动蛋白和肿瘤抗原的疫苗可在治疗肿瘤模型中相互协同作用。此强烈提示作为单一治疗或用于组合疫苗的血管动蛋白在人肿瘤的治疗或其他疾病的血管生成治疗中是有用的。
实施例6：血管动蛋白接种诱导抗-血管动蛋白抗体的产生。
12周大小的BALB-neu T小鼠(图8图B和C)或BALB/c小鼠(图8图A)组如上所述，用人血管动蛋白pDNA通过电穿孔以2周的间隔免疫四次(图A)或两次(图B)。图C显示来自用血管动蛋白pDNA结合TMEC pDNA通过电穿孔免疫的小鼠的结果。在第21周，小鼠通过尾静脉放血并且收集和冰冻血清。来自单只小鼠稀释500-16,000的血清样品在小鼠血管动蛋白抗体特异的ELISA测定法中检验。
利用针对血管动蛋白C-末端的多克隆抗体从血管动蛋白转染的小鼠主动脉内皮细胞提取鼠血管动蛋白。
结果表明尤其是用作为单一治疗的人血管动蛋白pDNA免疫4次后的小鼠，以及用该质粒与TMEC肿瘤抗原一起免疫2次后(图C)的小鼠产生小鼠血管动蛋白的高效价抗体。结果表明用人血管动蛋白pDNA电穿孔的免疫可破坏对小鼠血管动蛋白分子的免疫耐受性，并且还提示，尽管未证实，这些抗体可能为免疫的小鼠中抗-血管生成作用和抗-肿瘤作用背后的活跃机制。
实施例7.抗-血管动蛋白DNA接种在体内抑制血管生成。
5只BALBc小鼠单独用血管动蛋白或与TMEC联合分别在基质凝胶实验开始前的第28天、第14天，即第4周和第2周接种。所用的血管动蛋白疫苗为之前其他的实施例中所述的pcDNA质粒。
小鼠用含有200ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的基质凝胶在最后一次接种后两周注射。七天后收集基质凝胶栓且固定于低聚甲醛中，血管浸润通过用大鼠单克隆的抗小鼠PECAM抗体的免疫组织化学染色而显现。如Weidner等.N Engl J Med.1991 Jan 3；324(1)：1-8所述测量血管密度。如可从图9看到的，血管生成在用血管动蛋白DNA接种的小鼠中受抑制。
在不背离本发明的精神和范围时可以进行上述实施方案的各种修改和改变。可以理解的是相对于在此说明的特定的实施方案，没有想要或应推定的任何限制。当然，其试图通过附加的权利要求涵盖落入权利要求范围内的所有所述的改变。
Claims (21)
1.血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸在制备用于接种患有或处于血管生成-相关的疾病或紊乱风险中受试者的疫苗中的用途。
2.用于治疗患有或处于血管生成-相关的疾病或紊乱风险中的受试者的方法，该方法包括利用包含血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸的疫苗接种受试者的步骤。
3.权利要求1或2的用途或方法，其中血管生成-相关的疾病或紊乱为癌症、实体瘤、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症病情(如牛皮癣、肠慢性炎症、哮喘)或子宫内膜异位。
4.对血管形成有效的疫苗，包括有效量的血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸。
5.引起对血管动蛋白的免疫应答的方法，通过将包含血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸给药至人而实现。
6.之前任何一项权利要求的用途、方法或疫苗，其中血管动蛋白分子为全长人血管动蛋白。
7.之前任何一项权利要求的用途、方法或疫苗，其中血管动蛋白分子为人血管动蛋白的片段。
8.权利要求7的用途、方法或疫苗，其中人血管动蛋白片段为长度为9、10、11或12个氨基酸的片段。
9.权利要求8的用途、方法或疫苗，其中该片段为列于表1的片段。
10.之前任何权利要求的用途、方法或疫苗，其中该疫苗进一步包括作为抗原的肿瘤抗原和/或血管生成因子和/或肿瘤抗原或抗原因子的一种或多种抗体。
11.之前任何一项权利要求的用途、方法或疫苗，其中该疫苗进一步包括免疫刺激分子。
12.权利要求11的用途、方法或疫苗，其中该免疫刺激分子为细胞因子或编码细胞因子的多核苷酸。
13.之前任何一项权利要求的用途、方法或疫苗，其中该疫苗包括细胞或细胞提取物。
14.权利要求13的用途、方法或疫苗，其中该细胞为抗原呈递细胞，其用血管动蛋白分子装载或用编码血管动蛋白分子的多核苷酸转染。
15.权利要求13的用途、方法或疫苗，其中该细胞为表达血管动蛋白的肿瘤细胞或表达血管动蛋白的内皮细胞。
16.权利要求1至3、5至10的任何一项的用途或方法，其中该疫苗通过疫苗回体给予来自患者的细胞，随后受刺激的免疫细胞转移返回该患者而给药于患者。
17.在哺乳动物中产生对血管动蛋白的免疫应答的方法，该方法包括步骤：(i)回体用血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸刺激收集自哺乳动物的免疫细胞，(ii)将该受刺激的免疫细胞转移返回该哺乳动物，使得该细胞转移返回所述哺乳动物产生对血管动蛋白的免疫应答。
18.血管动蛋白分子或编码血管动蛋白分子的多核苷酸在制备用于在哺乳动物中利用一种方法产生对血管动蛋白免疫应答的药物中的用途，该方法包含步骤：(i)回体用所述药物刺激收集自哺乳动物的免疫细胞，(i)将该受刺激的免疫细胞转移返回该哺乳动物，使得该细胞转移返回所述哺乳动物产生对血管动蛋白的免疫应答。
19.权利要求17的方法或权利要求18的用途，其中哺乳动物为人。
20.权利要求17或19的方法或权利要求18或19的用途，其中引起的免疫应答预防性地或治疗性地起作用以用于抑制血管生成-相关疾病的发病或进展。
21.权利要求17、19或20的任何一项的方法或权利要求18至20的任何一项的用途，其中引起的免疫应答用于预防性地或治疗性地抑制恶性疾病的发病或进展。
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