CN1440812A - 一种使用cd137结合激动剂增强免疫应答的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强哺乳动物免疫应答的方法，包括给患病个体施加免疫原性刺激物和CD137结合激动剂。本发明还公开了一种在体外增强T细胞应答的方法，其中涉及将含有T细胞的淋巴细胞与激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂共同培养。

Description

一种使用CD137结合激动剂增强免疫应答的方法

                            技术领域

本发明涉及一种免疫调节方法，具体地说，本发明涉及一种调节T细胞免疫应答的方法。

                            背景技术

哺乳动物T淋巴细胞能够识别结合在抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子上的抗原肽，其中的抗原肽可由APC中的蛋白抗原降解产生。T细胞与APC的相互作用以及随后的T细胞应答反应由于T细胞表面受体、可溶性介质和APC表面的配基之间的相互作用而产生不同的变化。

                            发明内容

本申请的发明人发现，使用一种鼠CD137特异性激动抗体和一种由肿瘤表达的多肽的片段处理携带弱免疫原性肿瘤的小鼠，可导致肿瘤消退。使用同样的CD137抗体和体外由肿瘤细胞初次激活的自体树突细胞处理携带次级弱免疫原性肿瘤的小鼠，也可使肿瘤消退。

因此，本发明的目的是提供一种增强哺乳动物免疫应答的方法，给哺乳动物患病个体(如癌症病人)施加：

(1)一种激发免疫原性刺激物，如肿瘤相关肽-抗原决定簇；

(2)CD137结合激动剂，如CD137特异抗体。

本发明的另一个目的是提供一种在体外增强T细胞应答的方法，将包含T细胞的一组细胞与：

(1)一种激发免疫原性刺激物，如感染微生物的肽-抗原决定簇；

(2)一种CD137配基共同培养。

本发明还提供了一种在体内增强患病个体免疫应答的方法，给患病个体施加：

(1)一种激发免疫原性刺激物；

(2)一种CD137结合激动剂。

本发明的方法针对的对象可以是人，如癌症患者。本发明的方法所增强的应答可以是T细胞应答，如CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞的应答。

本发明还提供了一种在体外活化T细胞的方法，包括：

(1)准备一组包含T细胞的细胞；

(2)将细胞与激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂共同培养。

本发明的方法中，CD137结合激动剂可以是：(1)结合CD137的抗体；(2)CD137的天然配基(CD137L)或其功能片段。激发免疫原性刺激物可以是：(1)一种肿瘤相关抗原(TAA)；(2)一条TAA的功能性片段，可以是一条多肽。其中TAA包括但不限于由白血病、淋巴组织瘤、神经系统瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、脑颈癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、生殖系统癌、前列腺癌、肾癌、骨癌或血管细胞产生的分子。激发免疫原性刺激物还可以是具有结合了肽-抗原决定簇的主要组织相容性复合体(MHC)的树突细胞。其中的肽-抗原决定簇是TAA的一个片段或感染微生物产生的多肽的一个片段；其中的MHC分子可以是MHCI分子或MHCII分子。激发免疫原性刺激物也可以是杂种细胞，如肿瘤细胞与树突细胞的融合产物。激发免疫原性刺激物还可以是肿瘤细胞、肿瘤细胞溶解物、TAA、TAA的肽-抗原决定簇或能结合到由肿瘤细胞表达的蛋白的肽-抗原决定簇上的热休克蛋白。激发免疫原性刺激物还可以是与肿瘤细胞、肿瘤细胞溶解产物、TAA、TAA的肽-抗原决定簇或能结合到由肿瘤细胞表达的蛋白的肽-抗原决定簇上的热休克蛋白一起培养的树突细胞。当激发免疫原性刺激物是肿瘤细胞、APC或杂种细胞时，该细胞可以转染或转化入编码细胞因子或生长因子的核酸，如粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

激发免疫原性刺激物还可以是一种由感染微生物产生的分子，例如：病毒、细菌、真菌或原生动物的寄生物产生的分子。

这里所述的“增强免疫应答”是通过同时施加激发免疫原性刺激物和CD137结合激物剂获得的。在不给予CD137结合激动剂的情况下，激发免疫原性刺激物将不激发免疫应答，或激发比CD137结合激动剂存在条件下明显降低的应答。

这里所述的“CD137结合激动剂”是一种通过结合到靶细胞(如T细胞)的CD137分子上，从而使靶细胞对于激发免疫原性刺激物的应答增强的物质。

这里所述的“肿瘤相关抗原(TAA)的功能片段”是一种TAA的片段，比全长的TAA链短，在CD137结合激动剂存在或不存在的情况下，具有全长TAA至少10％的活化免疫应答能力。这里的“全长TAA”是指成熟TAA，即去掉了天然信号序列的多肽。

这里所述的“肽-抗原决定簇”是一种多肽的片段，能够结合到MHC分子上，与MHC分子形成复合物，被T细胞的抗原特异受体(TCR)识别。这里的MHC分子可以是MHC I或MHC II分子。

本发明中“多肽”和“蛋白”都是指肽连接链。

本发明基于发现使用鼠CD137特异性激动抗体和由肿瘤表达的多肽处理携带弱免疫原性肿瘤的小鼠，可导致肿瘤消退，使用同样的CD137抗体和体外由肿瘤细胞初次激活的自体树突细胞处理携带次级弱免疫原性肿瘤的小鼠，也导致肿瘤消退。这些发现表明，使用结合CD137分子的激动剂和肿瘤或感染微生物特异性的激发免疫原性刺激物处理患有癌症或感染疾病的哺乳动物患病个体，可以使免疫应答增强，这种免疫应答增强可以用于预防和治疗相应的疾病。

本发明提供的活化哺乳动物免疫应答的方法中，给免疫系统细胞施加激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂，激发免疫原性刺激物的施加可以在CD137结合激动剂之前、之中或之后。

本发明的方法所涉及的应答可以是任何免疫应答，特别是T细胞应答。由于B细胞的抗体反应依赖于活化的CD4⁺T细胞的辅助，CD4⁺T细胞应答的增强可以间接地增强B细胞的抗体反应。同样地，免疫系统其它一些细胞的活性也是由T细胞调节的，如单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、天然杀伤细胞(NK)。本发明的方法对于所有这些细胞型的免疫应答都是有效的。

这里所述的“激发免疫原性刺激物”是一种借助表达于T细胞表面的抗原特异性受体(TCR)，递送到T细胞的刺激物，这种刺激物以TCR特异性抗原的形式存在。这些抗原通常是蛋白，也可以是糖类、脂类、核酸或由两种或多种分子型组成的杂种分子，如糖蛋白、脂蛋白。激发免疫原性刺激物也可以由其它激动TCR配基提供，如TCR元件的特异性抗体(如TCRα链或β链可变区)或TCR/CD3复合体特异性抗体。本发明的方法所指的激发免疫原性刺激物不包括抗原非特异性刺激物，如细胞因子、生长因子，共刺激分子或粘附分子，这些刺激物可以在本发明的方法中使用，但不构成本发明所要求的激发免疫性刺激物。对于激发免疫原性刺激物有用的抗原包括异种抗原，如抗原递呈细胞(APC)上的异种抗原，APC可以是树突细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞或B细胞等。本发明中所用的DC是交错树突细胞，而不包括非滤泡树突细胞，从血液、骨髓、脾或淋巴结等组织中分离DC的方法是本技术领域公知的技术。作为激发免疫原性刺激物同样有效的还有多肽抗原和肽-抗原决定簇。未加工的多肽经APC处理后成为肽-抗原决定簇，与APC表面的MHC形成分子复合物，可被递呈到相应的T细胞。作为激发免疫原性刺激物有用的还包括可作为抗原来源的肿瘤细胞或感染微生物感染细胞的溶解产物。预先用抗原多肽、多肽的肽-抗原决定簇或肿瘤、感染细胞处理(如共培养)过的APC也可以作为激发免疫原性刺激物，进行共培养之前，肿瘤或感染细胞最好先经过辐照或加热处理。此外，APC，尤其是DC，也以被总RNA、mRNA或分离的TAA编码RNA初次激活。

作为激发免疫原性刺激物的抗原可以以细胞的形式提供，如肿瘤细胞或感染细胞；激发免疫原性刺激物也可以以融合了APC与肿瘤细胞或感染细胞的杂种细胞的形式提供[参见Gong et al.(2000)Proc.Ntal.Acad.Sci.USA97(6)：2716-2718]。融合细胞技术是本技术领域公知的技术，例如，聚乙烯二醇、电融合等。在杂种细胞中，肿瘤或感染细胞部分为激发免疫原性细胞(IC)。作为免疫原性刺激物的细胞或细胞杂种可以不经处理，也可以先进行代解抑制处理，如辐照或丝裂霉素处理。不论是其本身作为激发免疫原性刺激物，还是用于制备杂种细胞，这里使用的肿瘤细胞或感染细胞优选的是与T细胞来源于相同供体的细胞。如果来源的供体是不同的，优选与T细胞有相同的MHC单型的细胞。同样，用于产生杂种细胞的APC优选与T细胞来源于相同供体的APC。用于制备杂种细胞的APC或IC，优选与T细胞具有相同供体或是MHC相容性的细胞。

作为激发免疫原性刺激物有用的还有一些热休克蛋白，它们能结合到抗原(如肿瘤相关抗原或感染微生物产生的抗原)的肽-抗原决定簇上，热休克蛋白和抗原肽形成的复合物能促进APC对于抗原肽的摄取。这里所说的热休克蛋白包括但不限于糖蛋白96(gp96)、热休克蛋白(hsp)90、hsp70、hsp110和葡萄糖调节蛋白70(grp70)。激发免疫原性刺激物可以包括一个或多个从肿瘤细胞或感染细胞中分离的热休克蛋白。

激发免疫原性刺激物可以从许多感染微生物中获得，比如细菌、真菌、酵母、病毒、寄生物。相应的微生物蛋白包括但限于大肠杆菌的热不稳定肠毒素B亚基、Y.enterocolitica热休克蛋白60和M.tuberculosis热休克蛋白hsp60及hsp70、B.Burgdorferi外表面蛋白GP63等。

激发免疫原性剂刺激物还可以是许多类型的肿瘤细胞、肿瘤细胞初次激活的APC、杂种细胞、TAA、TAA的肽-抗原决定簇和TAA或TAA的肽抗原决定簇初次激活的APC。这里的“TAA”指由肿瘤细胞表达的分子，具有与普通细胞表达的相应分子不同的性质，或者在肿瘤细胞中比在普通细胞中具有更高水平的表达。因而，TAA可能是与普通细胞表达的相应分子不同或相同的分子，本方法优选的是不能在普通细胞中表达的TAA。当一个TAA在肿瘤细胞和普通细胞中均可表达时，要求其在肿瘤细胞中的表达至少2倍高于普通细胞中的表达。这些肿瘤包括但不限于血液癌、神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、肝癌、骨细胞癌、胰癌、前列腺癌、阴茎癌、骨癌和血管癌。TAA包括但不限于癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、MAGE(黑素瘤抗原)-4，6和12、粘蛋白(MVC)、酪氨酸酶、MART(黑素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列、PRAME(黑素瘤抗原)、MUM-1-B(黑素瘤泛素基因突变产物)、GAGE(黑素瘤抗原)2-10、C-ERB2(Her Z/neu)、EBNA(Eptein-Barr病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头状瘤病毒(HPV)E6和E7、P53、LRP Bcl-2和Ki-67。

为了测定CD137结合激动剂的有效性，给实验动物施加致病原，如肿瘤细胞、感染微生物或感染了致病原的细胞，其致病原本身不会产生本发明的方法所指的激发免疫原性刺激物。此外，在给携带致病原的实验动物施加4-1BB结合激动剂的过程中，其致病原本身不会产生本发明的方法所指的激发免疫原性刺激物。

CD137结合激动剂可以是CD137特异性抗体，不仅包括完整的抗体分子，还包括抗原结合片段，如Fab、F(ab’)₂、F_V和单链F_V片段，还包括嵌合抗体。这些抗体可以是单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体。CD137结合激动剂也可以是天然的CD137配基(CD137L)或CD137功能片段。CD137功能片段是指短于全长的、成熟的CD137的片段，具有全长的、成熟的CD137至少10％的增强T细胞应答能力。检测和比较特定分子对T细胞应答的增强能力的方法是本领域技术人员公知的。

CD137结合激动剂可以加入到包含T细胞的介质中(如血液或培养基)，CD137结合激动剂也可由邻近T细胞的细胞分泌或表面表达，如递呈异种抗原或结合到其表面MHC分子上的肽-抗原决定簇的APC，或肿瘤细胞、感染细胞和它们的杂种细胞。分泌或表面表达CD137结合激动剂的细胞可以但不必须与递呈异种抗原或结合到MHC分子的肽-抗原决定簇到T细胞的细胞相同。本发明的方法主要是提供一种外源的CD137结合剂，因此本发明特指的CD137结合激动物是由细胞如APC、肿瘤细胞、感染细胞或杂种细胞分泌或表达的，不包括由这些细胞天然表达的CD137(如CD137L)结合激动剂。

如果活化作用发生在体外，CD137结合剂能够附着到培养容器的底部。

在本发明的方法中，CD137结合激动剂一般结合到T细胞表面的CD137上。但是，由于CD137还能在T细胞以外的细胞中表达，如天然杀伤细胞(NK)和单核细胞，CD137结合激动剂还可以结合到这些非T细胞上，并且促进其分泌辅助细胞因子或使其表面表达共刺激分子或粘附分子，从而使T细胞或T细胞辅助的其它细胞的应答增强。

氨基酸短序列可以作为信号肽，将蛋白(如激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂)输送至特定的细胞部位。本技术领域技术人员都知道：输送到ER上的蛋白的氨基末端含有疏水信号肽，KFERQ短肽可将多肽输送到溶酶体，还有一些序列可将多肽输送到核内体。上述信号肽都可以用于输送激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂到相应的细胞部位。其它有用的信号肽还包括但不限于来源于HIV_tat转导区域、成纤维生长因子、HSV-1结构蛋白VP₂₂的信号肽。编码包含定位信号的多肽的DNA可以通过聚合酶链反应(PCR)或其它遗传工程技术、合成技术获得。

激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂的氨基酸序列可以与其天然序列相同，其中的一些氨基酸也可以由其它保守氨基酸替代。可相互替换的氨基酸，比如甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天门冬酰氨和谷氨酰氨；天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；苯氨酸和酪氨酸。

在体内条件下，本发明的方法所使用的多肽还必须经过适当的处理，在其氨基末端和/或羧基末端加上阻滞剂，使多肽在体内更加稳定，避免在被相应细胞摄取之前其肽末端被蛋白酶降解。可以使用的阻滞剂包括但不限于可以结合到多肽氨端和/或羧端的相关或不相关的肽序列。可以采用化学方法，在肽合成过程中施加阻滞剂，也可以采用本领域技术人员公知的重组DNA技术施加阻滞剂。在进入体内之前，肽化合物可以先共价地或非共价地耦连到药物载体蛋白上。

本发明的方法还可以使用根据所需多肽的氨基酸序列设计的肽聚拟态化合物。肽聚拟态化合物是合成的具有与相应的肽相同的三维构象(肽结构域)的化合物。其所包含的肽结构域使肽聚拟态化合物具有活化免疫应答(发挥激活免疫原性刺激物的功能)和增强免疫应答(发挥CD137结合激动剂的功能)能力。肽聚拟态化合物在体内还具有其它用途，如增强细胞渗透性和延长生物半衰期。

典型的肽聚拟态化合物的骨架可以是部分或完全非肽的，但是含有与其模拟的肽相同的侧链基团。在构建抗蛋白酶的肽聚拟态化合物时，可采用一些化学键，如酯键、硫醚键、硫酰胺键和亚甲基酮键来取代肽键，这是本技术领域公知的技术。

可作为激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂的分子可以采用本技术领域公知的许多技术获得，它们也可以由天然状态纯化而来。短肽(低于100个氨基酸)和其它非蛋白分子可以通过本技术领域公知的化学方法方便地合成。此外，多肽和肽都可以通过体外DNA重组技术和体内转基因技术获得。构建包含相应编码序列和相应转录/翻译调节因子的表达载体的方法也是本技术领域公知的。

前述的转录/调节因子包括但不限于诱导和非诱导启动子、增强子、操纵子和其它本技术领域公知的启动或调节基因。这些调节因子包括但不限于SV40腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统，噬菌体A的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白的控制区域，3-磷酸甘油酸盐激酶启动子，磷酸酶启动子、酵母α-交配因子启动子。

本发明所使用的表达系统包括但不限于：

(1)生物，如细菌。可以建立包含有编码激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体，将它转化入微生物中。

(2)酵母。可以建立包含有编码激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸的重组酵母表达载体，将它转化入酵母。

(3)昆虫细胞系统。可以建立包含有编码激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸的重组病毒表达载体，将它感染昆虫细胞系统。

(4)植物细胞系统。可以建立包含有编码激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸的重组病毒表达载体，将它感染植物细胞；或者可以建立包含有编码激发免疫原性刺物或CD137结合激动剂的核酸的重组质粒表达载体，将它转化入植物细胞。

(5)哺乳动物细胞系统，如CDS，CHO，BHK，VERO，Hela等。可以建立包含来源于哺乳动物细胞基因组或哺乳动物病毒的启动子、并且包含有编码激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸的重组病毒表达载体，将它转化入哺乳动物细胞。

其它可用的宿主细胞还有：直接来源于哺乳动物的初级或次细胞，以及由质粒载体转染或由病毒载体感染的初级或次级细胞。

转染或转导了本发明所述的表达载体的细胞可以用于在体外大规模或小规模生产激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂，采用的方法是本技术领域公知的，还包括在适当条件下培养细胞，以获得最多量的多肽，并且从细胞或培养介质中分离这些多肽。

在本发明的方法中，经常需要进行激发免疫原性刺激物和/或CD137结合激动剂的纯化。纯化生物微分子的方法是本技术领域公知的技术，纯化程度可以通过适当的方法检测，如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。

通过本发明的方法增强应答的T细胞可以是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞。本发明包括但不限于(1)有特定表型(如CD4⁺T或CD8⁺T)或功能的T细胞；(2)将T细胞限定为特定类型的MHC分子。绝大多数具有细胞毒活性的T细胞是CD8⁺T细胞，能识别结合到MHCI分子上的肽-抗原决定簇，也有能识别结合到MHCII分子上的抗原肽的CD4+CTL，还有极少能识别结合到MHCI分子上的肽的CD4⁺CTL以及能识别结合到MHCII分子上的抗原肽的CD8⁺CTL；大多数具有辅助和/或免疫分化活性的T细胞能识别结合到MHCII上的抗原肽，也发现MHCII分子限制的CD8⁺T细胞具有该活性的；大多数免疫抑制T细胞是CD8⁺T细胞，也有CD4⁺T细胞具有该活性的。本发明的方法包括增强所有这些T细胞的应答，特别是MHC I限制的CTL和MHC II限制的CD4⁺辅助/免疫分化T细胞的应答，更特别是MHCII限制的CTL应答。

本发明的方法可以在体外或体内进行。

(1)体外方法

本发明提供的体外方法适用于免疫机制的基本科学研究、活化的T细胞的制备。可以从患病个体中提取T细胞，在体外加入CD137结合激动剂检测其对抗原免疫能力。

本发明提供的体外方法，可将从哺乳动物体内提取的由T细胞组成或包含T细胞的淋巴细胞与激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂共同培养。供给淋巴细胞的动物可以预先施加相关抗原，也可以不必经过抗原处理。细胞培养液中可以加入一种或多种细胞因子或生长因子，包括但不限于白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15，γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

(2)体内方法。

本发明的方法对于在体内增强免疫应答是普遍适用的，可以用于预防或治疗。然而，本发明的方法不限于具有预防或治疗疗效，其它作用包括但不限于(1)生产大量的活化T细胞，以进行T细胞活性的基础科学研究；(2)增强哺乳动物(如兔、山羊、绵羊、马)的T细胞应答，进而产生辅助活性。

本发明的体内方法可用于预防或治疗感染性疾病或癌。对于易患癌症的个体(如超过50岁的男性易患前列腺部、吸烟者易患肺癌、多痣者易患黑素癌)也可以起到预防的作用。此外，本发明的方法对于预防和/或治疗细胞内微生物疾病，本方法是特别有用的。其中微生物疾病包括但不限于病毒(如流感病毒或HIV)、细菌(如M.Guberculosis)、原生动物(如P.falciparam)以及其它感染原引起的微生物感染。

本发明所述的“预防”是指对于疾病症状的完全防止、延缓疾病症状的发生以及对已发生的疾病后续症状的减轻。“治疗”是指疾病症状的完全去除或使疾病症状的严重性降低。

本发明的方法适用于许多种类的动物，例如人、非人灵长目动物、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔子、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等。

在体内，一种或多种激发免疫原性刺激物和一种或多种CD137结合激动剂施加于任何一种前述的哺乳动物，两种物质可以同时给药，也可以分开给药。给药的可以是激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂本身，也可以是分泌或表面表达它们的重组细胞，但在进入体内之前都必须悬浮于一种药物载体(如生理盐水)中，通过口服、经皮吸收、注射或输注的形式经由静脉、皮下、肌肉、腹膜、阴道、鼻、胃、气管或肺进入到体内。也可以直接进入到相应淋巴组织(如脾、淋巴结或粘膜相关淋巴组织)。剂量的不同取决于许多因素，包括给药方法、疾病症状、动物大小、体重、体表面积、年龄、性别等。激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂合适的剂量范围是0.01-100.0ug/kg，根据激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂的不同以及给药途径的不同，剂量有较大的不同。如口服比静脉注射需要更大的剂量。给药的剂量水平可以由本技术领域公知的技术进行调节和优化。将激发免疫原性刺激物和/或CD137结合激动剂包埋于适当的递送载体(如多聚微粒)可以增强递送效率，特别对于口服递送尤为明显。另外，可以将适当的佐剂与激发免疫原性刺激物同时使用，适合的佐剂包括霍乱霉素(CT)，大肠肝菌不耐热毒素(LT)，突变CT(MCT)和突变LT(MLT)。突变后产生的MCT和MLT的毒性大大降低，但不影响其作为佐剂的活性。另外可用的佐剂还包括明矾、弗罗因德氏完全和不完全佐剂和RIPI。还可以使用一种或多种细胞因子或生长因子，在激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂之前、同时或之后施加于患病个体。此外，当肿瘤细胞、APC或杂种细胞作为激发免疫原性刺激物时，可以使这些细胞除了分泌或表面表达CD137结合激动剂以外，也分泌或表面表达一种或多种重组共刺激分子(如B7.1、B7.2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B2-DC)和/或一种或多种重组细胞因子或重组生长因子。

另外，也可将一条或多条含有编码一条或多条激发免疫原性刺激物和/或一条或多条CD137结合激动剂的多核苷酸施加于患病个体，传送到相应细胞。可以用多聚生物可降解微粒或微囊输送多核苷酸，使它直接在患病个体的淋巴组织中表达。这里选用的多聚生物可降解微粒或微囊的大小适于被吞噬细胞如巨噬细胞吞噬，比如直径为1-10um的PLGA微粒。包埋有多核苷酸的微粒被吞噬细胞摄取以后，微粒将逐渐被细胞生物降解，然后释放出多核苷酸，在细胞中表达。多核苷酸还可以包括于另一种类型的微粒，其直径是够大，不能被吞噬细胞吞噬(大于5um，最好大于20um)。这种微粒可以作为核酸缓慢释放的贮器，只有当做微粒被生物降解以后，核酸才能被细胞摄取。

另外的摄取核酸的途径是脂质体输送，载体可以直接或与组织特异性抗体共同进入到脂质体。也可以制备一种由质粒或载体通过静电作用或共价作用附着到多聚-L-赖氨酸上形成的分子复合物，其中多聚-L-赖氨酸部分可以结合到一个能识别靶细胞受体的配基上。还可以使用淋巴组织特异性转录调节因子(TRE)来实现淋巴组织特异定位，其中可以使用的TRE如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突细胞特异性TRE。

在一条多核苷酸(如表达载体)中，编码相应激发免疫原性刺激物或CD137结合激动剂的核酸序列中还包含有一个起始Met和特异定位序列，与启动子或增强子-启动子联合体相连。

启动子是一种转录调节因子，一般位于转录起始位点上游100个碱基对之内。增强子与启动子不同，在距离转录起始位点不同距离的位点皆可发挥功能，它也可以位于转录起始位点的下游，但必须有启动子的存在才能起作用。为了得到一条启动子控制的编码序列，必须确定所需肽的翻译阅读框的翻译起始位点，一般是启动子下游的1个到50个核苷酸处。表达载体的编码序列之后选择性地连接一个转录终止位点。

对于本方法合适的载体包括质粒和病毒载体，如疱疹病毒、反转录病毒、牛痘病毒、解毒的牛痘病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒和腺相关病毒。

多核苷酸可以加入到生物相容性的药用载体中，如生理盐水。通常给药的剂量取决于许多因素，如患者的大小、体表在积、年龄、性别、时间、给药途径、健康状况等。因此，给药的剂量是不同的。本发明的方法一般使用含10⁶到10¹²拷贝的多核苷酸分子，给药的途径和频率可根据个体情况作出不同的选择。

(2)体内与体外相结合(ex vivo)的方法

本发明的ex vivo方法包括：将包含T细胞(CD4⁺和/或CD8⁺T细胞)的淋巴细胞从体内分离出来。在体外用一个或多个激发免疫原性刺激物和一个或多个CD137结合激动剂共同处理，可以进行一次或多次处理，接着进行淋巴细胞免疫活性(如CTL活性)测定，一旦达到所需要的活性，将细胞重新导入供体或导入到其它个体。ex vivo方法的治疗或预防疗效取决于ex vivo处理后活化的淋巴细胞活性，还受中和作用和细胞毒的影响。

本发明的ex vivo方法的另一种方式是：从供体中获取细胞，将编码一个或多个激发免疫原性刺激物和一个或多个CD137结合激动剂的一条或多条多核苷酸转染或转化进入细胞，将该细胞重新导入到供体或其它个体。这里优选的细胞是生血细胞，如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或B细胞。另外还可选择其它类型的细胞，包括但不限于成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞。经过上述转化或转染以后回到动物体内后，这些细胞在体内存活期间一直可以作为激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂的来源。使用上皮细胞，包括前述的APC，尤其具有优势，因为它们能直接定位到淋巴部位，如淋巴结或脾，产生高浓度的激发免疫原性刺激物和CD137结合激动剂。此外，如果使用APC来表达编码一个或多个CD137结合激动剂的转基因，这里表达外源基因的APC通常但不必须与递呈异种抗原或抗原肽到相应T细胞的APC相同。CD137结合激动剂可由APC分泌或表面表达，在施加重组APC之前，可先施加特定的抗原或抗原肽。此外，肿瘤细胞或APC与肿瘤细胞融合而成的杂种细胞也可以转染成转化入一个或多个带有多个CD137结合激动剂的载体，这些细胞通过一定途径到达癌症部位，分泌或表面表达CD137结合激动剂，从而刺激T细胞免疫应答。这里用于转染或转化编码CD137结合激动剂的核酸的肿瘤细胞，可以从患病个体以外的个体中获取。同样，用于制备表达重组CD137结合激动剂的杂种细胞的肿瘤细胞，也可以从患病个体以外的个体中获得。

本发明的ex vivo方法的主要步骤包括：从供体提取细胞(如肿瘤细胞或APC)，培养细胞，在细胞内转导入一种或多种表达载体，将细胞保存在适于激发免疫原性刺激物和/或CD137结合激动剂表达的条件下，这些方法都是分子生物学领域公知的。转导的方法可采用ex vivo基因治疗的标准方法，包括磷酸钙法、电穿孔、病毒感染等。脂质体和多聚微粒也是可以使用的，本方法还包括筛选成功转导的细胞，注射或灌输入患病个体。本方法还包括制备杂种细胞的步骤，并将杂种细胞注射或灌输入患病个体。

本发明的方法也可以是体内方法和ex vivo方法的结合。比如，激发免疫原性刺激物以肽-抗原决定簇的形式制备，而CD137结合激动剂以核酸编码或携带编码核酸的细胞分泌或表面表达的形式制备。

本发明的方法适用于本文涉及的任何疾病和物种，本方法所适用的检测一种用药方式对于某一疾病的治疗或预防作用的方法是本技术领域公知的常规技术。

(4)CD137特异性抗体。

本发明还涉及特异性结合人和鼠CD137的抗体。这些抗体可以是经过CD137多肽或肽段免疫的动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、绵羊、马、山羊、牛或猪)的血清和浆液中的多克隆抗体。多克隆抗体可以通过本技术领域公知的技术从血清、浆液或腹水中分离。本发明的方法还包括结合CD137多肽或肽段的单克隆抗体(mAb)。制造和筛选单抗的方法是本技术领域公知的，首先选择和克隆出产生所需抗体的杂交瘤，然后可使用本技术领域公知的许多体内或体外方法生产抗体。比如，可以在体外合适的条件下培养杂交瘤，一定时间以后在上层清液中收集所需抗体，培养时间的长短和培养液的选择是易于确定的。

本发明还涉及CD137特异的重组抗体，如嵌合体和包含人源、非人源成份的人源化单抗。这些嵌合体或人源化单抗可以由本技术领域公知的重组DNA技术获得。

本发明还涉及包含有抗原结合区域功能部位的CD137特异性抗体片段和衍生物。包含结合区域的抗体片段可以通过公知的技术获得。这种抗体片段包括但不限于：胃蛋白酶所消化抗体分子后获得的F(ab’)₂；降解F(ab’)₂的二硫键后获得的Fab；番木瓜蛋白酶和降解试剂处理抗体分子后获得的Fab。抗体片段也包含F_v，如单键F_v(scF_v)片段，即恒定区很小或没有恒定区的抗体产物。svFv片段仅是一条多肽链，由抗体重链和轻链的可变区部分组成。

                         附图说明

附图1A  mAb 2A结合状况的流式细胞图(FFC)。白色实线区域反映mAb 2A与T细胞的结合情况，白色虚线区域反映mAb 2A和CD137Ig同时与T细胞的结合情况，黑色区域反映对照抗体与T细胞的结合情况。白色实线区域和黑色区域的染色反应是在鼠CD137Ig融合蛋白不存在的情况下进行的；白色虚线区域的染色反应是在鼠4-1BB Ig融合蛋白存在的情况下进行的。

附图1B  mAb 2A结合状况的FFC图。标记“2A”的白色区域反映mAb 2A与T细胞的结合情况，标记“1AH2”的白色实线区域反映CD137特异性mAb与T细胞的结合情况，黑色区域反映同型对照抗体与T细胞的结合情况。

附图1C  ³H-Tdr渗入法测定小鼠T细胞增殖线性图，以每分钟计算(cpm)。

附图2  小鼠的肿瘤生长图。皮下注射C3肿瘤细胞或EL4E7肿瘤细胞，7天后注射mAb 2A或大鼠IgG。

附图3A  不同效应细胞和靶细胞对于靶细胞的溶细胞活性。小鼠皮下注射1×10⁶C3或4×10⁶EL4E7肿瘤细胞，第1天和第4天各注射100ug mAb 2A(白圆)或大鼠IgG(黑圆)。第7天将小鼠处死，收集肿瘤引流淋巴结(TDLN)，TDLN中得到的细胞体外用辐照过的C3细胞(图3A)，或辐照过的EL4E7细胞(图3B)刺激4天。将每中组中2-3只小鼠的TDLN集中起来，用标准4hr⁵¹Cr释放试验测定其对EL4、EL4E7、RMA-S、E7肽刺激的RMA-S或CS靶细胞的溶细胞活性。

附图4A  一系列二维FFC图，显示CD8特异性mAb和结合E7(49-57)肽的H-2D^b类分子四聚体(D^b/E7)结合附图所获得的细胞的情况，闭合圆内区域显示即结合CD8特异性mAb又结合D^b/E7四聚体的细胞。

附图4B  附图4A中，既结合CD8特异性mAb又结合D^b/E7四聚体的细胞相对数量图。

附图5A和5B  经处理后的小鼠淋巴结中同时结合CD8特异性mAb和D^b/E7四聚体的细胞的相对数量图

附图6  携带肿瘤的小鼠的死亡时间(周)图。给所有小鼠皮下注射1×10⁶C3细胞，第7天，1半小鼠用E7(49-57)肽皮下免疫，另一半小鼠用对照Vp2(121-130)肽皮下免疫。第7天和第10天腹腔注射100ug mAb 2A(标记“2A”)或大鼠IgG，每周测定肿瘤直径，当直径达15mm(白色圆)时将小鼠处死，第13周直径仍小于15mm的小鼠用白色圆标记。图上端黑色圆表示没有形成可触知肿瘤的小鼠。

附图7  小鼠存活曲线。给小鼠静脉注射TC-1细胞(图7A)或1×10⁵B16-F10细胞后，在第3天皮下注射对照OVA肽(圆)，E7(49-57)肽(圆7A中三角形)或trp-2肽(图7B中三角形)，第3天和第6天注射100ug 2A mAb(“2A”)或大鼠IgG。每天观察小鼠状况，得到存活数据。

附图8  皮下注射了SCCVII肿瘤细胞后肿瘤生长状况。注射肿瘤细胞后第4天将小鼠分成4个组，每组5只，第4天和11天，给第1组和第2组小鼠皮下注射体外SCCVII细胞初次激活的树突细胞。第4、7、11和14天，第1组小鼠腹腔注射100ug大鼠IgG(上右图)和100ug mAb 2A(上左图)，测定肿瘤直径。

附图9  ³H-Thy渗入法测定细胞增殖图。测定用人CD3特异性刺激的尼龙毛纯化的T细胞的增殖情况，其中人CD3特异性抗体包被在96孔组织培养板底。mAb5.9(“α-h41BB(5.9)”)、mAb5.10(“α-h41BB(5.10)”)，人CD137特异抗体(“α-h41BB”)及小鼠IgG(“mIgG”)都包被在96孔组织培养板的底部，浓度为10ug/ml。

附图10  B6小鼠的存活曲线。给小鼠静脉注射5×10⁵B16-F10细胞后，第3、7和11天皮下注射辐照后的B16-F10细胞(表达重组GM-CSF的B16-10F(三角)和有表达重组GM-CSF的B16-10F(圆))。第4、7、10、12和15天，给小鼠注射100ug2A mAb(黑色圆和黑色三角)或大鼠IgG(白色圆和白色三角)。

                        具体实施方式

实施例1材料和方法(1)肿瘤模型和肽

C3细胞从HPV-16-/EJras转化的C57BL/6(B6)鼠的胚胎细胞获得[参见Feltkampet al.(1993)Eur.J.Immunol.23：2242-2249]。由Loyola大学W.Martin Kast博士赠送。转染了编码的人乳头状瘤病毒-16(HPV-16)E7多肽的cDNA的EL4细胞(EL4E7)[参见Tindle et al.(1995)clin.Exp.Immunol.101：265-271]是由昆士兰大学的Germain J.P.Femando博士赠送的。TC-1细胞系[参见Liu et al.(1996)CancerRes.sb：21-6]是约翰霍普金斯大学T.C.Wu博士赠送的，B16-F10黑素瘤细胞系[参见Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3539-3543]是Dana-FarberCancer Institute的Glenn Dranoff博士赠送的。源于B6的EL4.RMA-S和S49.1鼠T细胞淋巴组织购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有的细胞系保存在完全组织培养基RPMI1640中，培养基中加入10％胎牛血清(FBS)，25mM HEPES，2mM谷氨酸、10u/ml盘尼西林G和100ug/ml硫酸链霉素硫酸盐。

E7肽(RAHYNIVTF)包含HPV-16E7蛋白的H-2D^b-限制的CTL抗原决定簇[参见Feltkamp et al.(1993)Eur.J.Immunol.23：2242-2249]。trp-2肽(SVYDFFVWL)是H-2K^b限制的抗原决定簇。最先发现于B16黑素瘤细胞[参见Bloom et al.(1997)J.Exp.Med.185：453-459]。Vp2对照肽(FHAGSLLVFM)包含一个H-2D^b限制的CTL抗原决定簇，来源于Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒[Johnson et al(1999).J.virol.73：3702-3708]。OVA(257-264)对照肽(SIINFEKL)是一个H-2K^b限制的CTL抗原决定簇，来源于鸡卵清蛋白[参见Curtsinger et al.(1998)J.Immunol.160：3236-3242；Moore et al.(1998)Cell54：777-785]。所有肽都由Mayo Molecular Biology Core Facilty合成的，纯度都大于95％，通过反相HPLC方法纯化。

本实验选用6-10周龄的雌性B6成熟小鼠，将1×10⁶C3细胞和4×10⁶EL4E7细胞加入0.1mlPBS中，注射到B6小鼠体内，使肿瘤在小鼠体内生长。肿瘤大小以两处垂直直径的平均值计算(mm)，每周测一次[参见Tamada et al.(2000)Nature Med.6：283-289]。在肺转移模型中，将含有1×10⁴TC-1或1×10⁵B16-F10细胞的Hank’s缓冲盐溶液注射入小鼠尾静脉。在携带皮下肿瘤的小鼠的肿瘤对侧位置处使用50ug乳化于不完全弗朗德氏佐剂(IFA)的肽进行皮内免疫。对携带肺转移肿瘤的小鼠使用100ug乳化于IFA中的肽进行双侧皮内免疫。抗体溶于0.5ml PBS中，通过腹腔注射进入小鼠。(2)抗体、四聚体和融合蛋白

使用序列特异性引物和从刀豆球蛋白A活化的脾细胞中分离的RNA制备相应cDNA，并且扩增，获得编码鼠CD137胞外区的cDNA，在表达质粒pmIgV[参见Chapoval et al.(2000)Nature Med.6：293-289]中与鼠IgG 2a的CH₂-CH₃区域融合，表达载体转染入CHO细胞，在培养基中培养，培养基上清中的蛋白使用HiTrap蛋白G-Sepharose柱[Amersham Pharmacia Biotech]进行纯化，使用去除脂-多糖复合物的PBS进行透析，最后得到CD137Ig融合蛋白。

鼠的抗CD137单克隆抗体(mAb)通过使用CD137Ig免疫Lewis鼠获得。杂交瘤细胞由鼠脾细胞和鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合而成，培养上清由ELISA法筛选。杂交瘤2A在加有10％ IgG FBS和25mM HEPES的RPMI1640中生长，使用切线流微板浓缩器(Millipore)收集和浓缩，使用5ml(HiTrap蛋白G-Sepharose柱(Amersham Pharmacia Biotech)从浓缩上清中纯化2A mAb，纯化了的mAb进行PBS透析，使用Centriprep浓缩器(Millipore)浓缩。

纯化的鼠CD3、CD28、CD137特异性mAB和异硫氰酸荧光素(FITC)共价结合的CD8mAb购于Pharmingen。FITC-共价结合的山羊抗鼠IgG抗体购于BiosourceInternational。

结合E7肽(H-2D^b-E7)或Vp2肽(H-2D^b-Vp2)的鼠H-2D^b MHC四聚体可由已知的方法制备[参见Johnson et al.(1999)J.Virol.73：3702-2708]。简单地说，是将H-2D^b的α链和人β2微球蛋白从一个细菌表达系统中分离出来，在过量的肽中折叠，单聚复合物共价结合到荧光染料、藻红蛋白(PE)标记物上，形成荧光四聚复合体。PE标记的四聚体使用凝胶滤过法纯化。(3)T细胞共刺激试验：

用于检测mAb共刺激活性的方法是已知的[参见Tamada et al.(2000)Nature.Med.6：283-289]，这里只作简单描述。尼龙毛(NW)纯化的鼠脾T细胞(2.5×10⁶/ml)加入预先包被有抗CD3的mAb(0.1ug/ml)的96孔板，指示大鼠IgG或mAb2A的浓度。T细胞的增殖情况可由[³H]脱氧核苷摄入法测定，在3天的培养液加入1uCi/孔[³H]-胸腺嘧啶脱氧核苷([³H]-Tdr)，15小时后收集在纤维玻璃管，使用MicroBeta Trilux液体闪烁计数器测定渗入T细胞的[³H]-Tdr，即可知道增殖T细胞的多少。(4)荧光激活细胞分离器(FACS)分析：

使用FITC标记的抗CD4和CD8的mAb，包被有FITC特异性抗体的金属微珠和磁铁(miltenyi biotec)。进行T阳性细胞选择。分离的T细胞的纯度通常大于95％，可使用抗CD3的mAb通过流量细胞计数法检测。将从鼠脾中纯化的T细胞(2.5×10⁶个/ml)加入包被有抗CD3(5ug/ml)和抗CD28(1ug/ml)的mAb的24孔组织培养板中，T细胞被激活，24小时后收集T细胞，与1ug mAb 2A共同加入到含5％FBS和0.02％叠氮化物的50ul PBS中，放置30分钟。4℃下用FITC标记的鼠特异性山羊抗体洗涤和孵育30分钟。洗涤后的细胞中渗入多聚甲醛和荧光素，接着进行FACS分析(Becton Dickinson)。S49.1细胞也可用相同的方法处理，1×10⁶S49.1细胞用mAb 2A或CD137特异性mAb处理，洗涤后，用FITC标记的大鼠IgG特异性抗体处理，再洗涤渗入多聚甲醛和荧光素，进行FACS分析。

采集免疫7天的小鼠的肿瘤引流淋巴结(TDLN)，用PE标记的H-2D⁶-E7或H-2D⁶-VP2四聚体复合体以及FITC标记的CD8处理[参见Jonhson et al.(1999)J.Virol.73：3702-3708]。将5×10⁶TDLN细胞与2.5×10⁵UV辐照的C3细胞共同孵育4天。接着细胞用PE标记四聚体和FITC标记的CD8处理，洗涤后重新悬于含有750ng/ml propidium碘化物的PBS中。(5)CTL活性试验：

将draining LN细胞与辐照后的C3细胞共同培养4天，得到效应细胞，从培养液中收集效应细胞，使用标准的4-hr⁵¹Cr释放试验，通过测定效应细胞和靶细胞的比率(E∶T)分析CTL活性。其中肽刺激的靶细胞是将靶细胞与10ug/ml肽28℃下共同培养18小时获得的。(6)鼠DC的制备：

鼠DC从骨髓中获得。将小鼠处死，并且浸入到70％乙醇(EtoH)中，移去EtoH，暴露股骨，从股骨头处脱臼，去除肌肉，将剩下的股骨浸入70％ EtoH，然后加入到完全介质(CM)，介质中包括CM、RPM/1640、10％热失活的FBS，二性霉素B(0.5ug/ml)、β-ME(2×10-5M)，丙酮酸钙(1mM)，非必需氨基酸(0.1Mm)，盘尼西林和链霉素(100ug/ml)，谷氨酸(2mM)和庆大霉素(50ug/ml)。将股骨从头处切开，露出骨髓，使用3cc注射器(充满CM)和23号针头将骨髓抽提出，与CM一起收集到10mm细胞培养皿中。在骨髓抽提后，通过钢筛网和离心法将细胞从介质中分离，重新悬浮在1.0ml包含10ug/ml I-AbmAb、抗Mac3 mAb、抗CD8amAb(HO2.2)、抗CD45R(B220)mAb、抗CD3emAb和抗GR-1mAb的培养液中，在水上放置20分钟，将细胞洗涤后重新悬浮在1∶30稀释的兔血清中，浓度为107个细胞/ml，在37℃下培养45分钟。然后将上述细胞洗涤，加入到10ml含有10mg/ml粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和1ng/ml干扰素4(IL-4)的CM中，置于37℃。第二天将没有粘附的细胞从培养液中移走，第五天收集包含高度纯化的DC的培养液。实施例2  抗CD137mAb 2A及其在体内对EL4E7淋巴组织瘤和C3上皮癌的抗肿瘤影响。

首先检测抗CD137mAb的特异性。用单克隆抗体2A处理已经经过抗CD3和抗CD28mAb刺激24小时的大于80％纯化的T细胞。结果表明，抗体的结合是特异性的，因为当加入小鼠CD137Ig时，结合被竞争性地抑制(图1A)，当加入对照大鼠IgG抗体时却不被抑制。此外，mAb 2A能够特异性结合到表达CD137的小鼠的淋巴瘤T细胞S49.1上，当用1AH2处理后，可观察到抗CD137mAb的结合(图1B)，固定化的mAb 2A也能增强T细胞的繁殖能力，随着剂量的不同而不同，并且需要一定量的抗CD3mAb的参与(图1C)。因此，2A是一种共刺激mAb。

选择EL4E7和C3两种小鼠肿瘤检测mAb对于肿瘤的影响。EL4E7是一种胸腺癌，转染后表达HPV-16E7基因；C3是转化3HPV-16和ras癌症基因的胚胎上皮细胞系。由于两种肿瘤系都表达HPV-16的E7基因，可用于测定CTL对于E7基因产物的反应。准备几组携带EL4E7或C3肿瘤的小鼠，分别在患病第7天和第10天注射2A(100ug)。结果如图2所示，在注射2A的小鼠中，直径达到12mm的EL4E7肿瘤7天后完全消退；用对照大鼠IgG抗体处理的小鼠肿瘤继续生长；携带C3肿瘤的小鼠仅仅是肿瘤边缘受影响，5只小鼠中仅1只发生肿瘤生长延缓，其它4只小鼠的肿瘤继续生长。可见，虽然mAb能够消除EL4E7肿瘤，C3肿瘤还是难于消除，而且这种治疗的抗性不是由于肿瘤的大小或不同肿瘤之间抗原差异导致的。实施例3  携带C3肿瘤的小鼠中，E7抗原对于CTL的不敏感与mAb 2A处理后产生的抗性相关。

为了研究C3肿瘤对于2A mAb产生抗性的原因和机制，本实验对携带C3肿瘤的小鼠中肿瘤特异性CTL的活化状态作了检测。先给小鼠皮下接种C3细胞，3-7天后用mAb 2A或对照大鼠IgG处理。7天后采集TDLN，在体外用辐照后的C3细胞再刺激，从培养液中分离细胞，用标准的⁵¹Cr释放法测定。测定结果如图3A，EL4E7和C3都没有被体外活化的TDLN溶解。这里没有显示CTL活性并非由于测定的不敏感，或CTL不能识别E7肽刺激的RMA-S细胞或EL4E7细胞，它们都是高度敏感的细胞。与之相反，从EL4E7小鼠中分离出的TDLN，可以测定出E7特异性CTL活性，而且在2AmAb处理后E7特异性CTL活性增强(图3B)。在测定中，野生型RMA-S细胞发生非特异性溶解，这是由于EL4和RMA-S具有一种相同的抗原引起的[参见Van Hall et al.(2000)J.Immunol.165：869-877]。

C3TDLN中E7特异性T细胞的频率可由FITC标记的抗CD8mAb和PE标记的E7四聚体双色标记染色法确定。与前述CTL活性测定结果相一致，即使在体外与辐照后的C3细胞共刺激以后，C3TDLN中低于0.1％的CD8+T细胞具有E7特异性，而且，2A mAb也不能增加C3TDLN中E7特异性CTL活性(图4A、B)。相反，用辐照后的C3细胞再刺激和对照抗体处理后，EL4E7小鼠约有1％的CD8⁺T细胞是E7特异性的，在体内用mAb 2A处理后能增加E7特异性CTL活性，如图4B所示，E7特异性T细胞频率增加了4倍。因而E7特异性CTL的频率与CTL活性是密切相关的。更为重要的是，上述结果还证明，缺少活化的E7特异性CTL不仅抑制了特异性CTL的细胞活性，而且影响了C3TDLN中2A mAb对于T细胞反应的增强能力。

为了排除C3鼠中E7特异性CTL消失的可能性，在用包含H-2D⁶限制的CTL抗原决定簇的E7肽免疫以后，对小鼠进行E7特异性CTL活性检测。在肽免疫后第7天，收集draining LN，用辐照的C3细胞重新激活，使用免疫的E7四聚体测定E7特异性CD8⁺T细胞的密集度。E7肽的免疫有效地促进了细胞结合E7四聚体的能力，而用对照Vp2肽免疫后没有发现上述情况。使用mAb 2A处理可以进一步增加E7特异性CTL的频度(图5A)。对na

ve小鼠的免疫也获得了相同的后果(图5B)。因此，E7特异性CTL存在于携带C3的小鼠，但不会被C3细胞活化或去除，即E7特异性CTL对于C3肿瘤的抗原不敏感，而且单独的抗CD137mAb不能打破这种不敏感状态。实施例4  用E7抗原决定簇和抗CD137mAb 2A消除CTL不敏感状态，使C3上皮癌消退。

在实施例3中，E7抗原决定簇的免疫能够增强C3鼠中CTL密集度，这里首先测定E7肽的免疫是否影响C3肿瘤。选择携带C3肿瘤7天的小鼠，用E7或对照Vp2肽免疫，接着至少观察12周，在肿瘤达到15mm直径时将小鼠处死。用E7肽处理后，11只小鼠中观察到1只的肿瘤发生消退，因而E7肽免疫不足以消除C3肿瘤。然而，当用CD137mAb和E7肽共刺激(COPP)处理后，15只小鼠中有11只的肿瘤完全消失，而且没有消失的肿瘤其生长速度也明显慢于对照组小鼠的肿瘤(图6)。10只对照小鼠中仅有2只在mAb 2A和对照Vp2肽处理后肿瘤发生消退。除了仅有1只小鼠在12周后肿瘤仍然小于15mm，用对照Vp2肽和大鼠IgG抗体处理的小鼠肿瘤8周内达到15mm直径(图6)。因此，COPP处理有效地诱导了C3肿瘤的消退。

本实验还检测了COPP处理对于巨大C3肿瘤有效性(表1)。患C3肿瘤14天的小鼠(肿瘤直径5-8mm)进行COPP处理，观察到38只小鼠中有16只肿瘤发生消退，约42％。与之相比，用E7肽、mAb 2A或对照Ig和Vp2肽分别处理小鼠，观察到的肿瘤消退现象是0％、9％和0％。在21天后观察，即使COPP处理后肿瘤没有完全消退的小鼠，其肿瘤直径明显小于3种对照组小鼠。实施例5  TC-1肺癌和B16-F-10黑素瘤转移模型中COPP处理的影响作用。

为了确定COPP处理对于其它弱免疫原性肿瘤是否更有效，制备两种肿瘤模型，TC-1肿瘤系和B16-F10肿瘤系。TC-1肿瘤系从HPV-16E6、HPV-16E7和ras肿瘤基因共转化的主要肺上皮细胞中获得[参见Liu et al.(1996)Cancer Res.56：21-6]。可用E7肽作为免疫原。B16-F10是一个高度转移黑素瘤系，可用H-2K^b限制的trp-2肽作为免疫原[参见Dranaff et al.(1993)Prol.Natl.Acad.Sci.USA90：3539-3543]。给B6小鼠静脉注射10⁴TC-1细胞，建立肺转移模型，3天后，给小鼠皮下注射E7肽，并且腹腔注射2A mAb(COPP)。与C3肿瘤中观察到的相同，单独注射mAb 2A不能延长小鼠的存活，所有小鼠在20天内均死亡；单独的E7肽免疫延长了小鼠的存活，但所有小鼠在35天后死亡。COPP处理使小鼠的存活率明显提高，所有小鼠都至少可存活35天(图7A)，20％的小鼠长时期地存活。在第二个肿瘤模型中，给小鼠静脉注射10⁵B16-F10细胞，3天后用COPP处理。同样地，单独使用mAb 2A或trp-2肽没有效果，而COPP处理明显提高了小鼠的存活率，20％的小鼠存活时期大于90天。因此，用一条抗原性的MHCI限制的肽和抗CD137mAb对于弱免疫原性肿瘤具有治疗作用。实施例6  mAb 2A增强树突细胞疫苗的治疗效果。

为了确定鼠CD137特异的激动mAb(mAb 2A)能否增强DC疫苗刺激的抗肿瘤免疫反应，需制备一个携带头颈磷状细胞癌的小鼠模型，本实验使用的是弱免疫原性鼠(B6)磷状细胞癌系(SCCVII)。将DC(5×10⁶个/孔)与辐照过的SCCVII细胞(1×10⁶个/孔)在24孔组织培养板上培养24小时，DC即被肿瘤抗原初次激活。给每组小鼠皮下注射2×10⁵SCCVII细胞，4天后分别皮下注射下列疫苗：第一组：1×10⁶DC、3×10⁶辐照的SCCVII和大鼠IgG(100ug)第二组：1×10⁶DC、3×10⁶辐照的SCCVII和2A mAb(100ug)第三组：大鼠IgG(100ug)第四组：2A mAb(100ug)

各组小鼠分别注射上述疫苗2次，间隔为1周，每次注射疫苗3天后，给小鼠注射2A mAb或对照大鼠IgG，测定肿瘤生长。结果如图8所示，第三组80％的小鼠肿瘤继续生长，第一组与第四组的小鼠3/5有治疗结果，而第二组的小鼠治疗效果最明显，所有小鼠的肿瘤发生消退。这些结果证明，CD137特异性抗体和肿瘤引发的DC疫苗共同作用能促进抗肿瘤免疫作用。实施例7  鼠抗人CD137mAb的生产。

人CD137特异性激动抗体的制备方法与前面使用的鼠CD137相同。建立由人CD137胞外部分和人IgG1 CH3-CH3区域组成的融合蛋白，用这种蛋白免疫的鼠产生CD137多克隆抗体。将该鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，用荧光流量血细胞计数法筛选，293个细胞转染了编码人4-1BB的cDNA。两个杂交瘤细胞(5.9和5.10)产生表现人CD137特异性的IgG mAb。实施例8  鼠抗人CD137mAb的T细胞共刺激活性。

为了测定前述两个抗人CD137mAb共刺激T细胞应答的能力，本发明人建立了一个标准的体外共刺激测定实验。首先，将人CD3特异性抗体分别以不同的浓度包被在96孔板组织培养板的底部，将纯化的人T细胞加入到上述96孔板中共同培养。培养48小时后，用³H-Tdr渗入法测定T细胞的繁殖情况(图9)。每种抗人CD137都明显刺激了T细胞的增殖，因而证明了这些抗体的T细胞共刺激潜力。实施例9  mAb增强辐照后的表达重组GM-CSF的肿瘤细胞的治疗效果

本实验测定鼠CD137特异性激动mAb(mAb 2A)是否增强由表达重组细胞因子的肿瘤细胞刺激的抗转移免疫反应。给4组、每组5只小鼠静脉注射5×10⁵B16-F10黑素瘤细胞，使它们产生分散的转移肿瘤，在第3、7和11天给小鼠皮下注射4×10⁶辐照过的B16-F10细胞免疫，其中B16-F10细胞预先转染了编码鼠GM-CSF(B16-GM-CSF)的cDNA，并能表达鼠GM-CSF。B16-GM-CSF细胞的制备方法可参见Dranoffet al.(1993)Proc.Natl.Acod.Sci.USA90：(3539-3543)。在第4、7、10、12和15天分别给各组小鼠腹腔注射100ug大鼠IgG或mAb 2A。第一组：大鼠IgG第二组：mAb 2A第三组：B16-GM-CSF和大鼠rat IgG第四组：B16-GM-CSF和mAb 2A

小鼠的存活情况见图10，用B16-GM-CSF和mAb 2A免疫的小鼠比B16-GM-CSF和IgG免疫的小鼠的存活能力明显增强。

Claims (1)

1.一种使患病个体增强免疫应答的方法，其特征在于给患病个体施加：

(1)肿瘤相关抗原的肽-抗原决定簇；

(2)一种结合CD137的单克隆抗体。

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