CN107708725A - 用于引发免疫应答的剂和组合物 - Google Patents

用于引发免疫应答的剂和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107708725A
CN107708725A CN201680029341.9A CN201680029341A CN107708725A CN 107708725 A CN107708725 A CN 107708725A CN 201680029341 A CN201680029341 A CN 201680029341A CN 107708725 A CN107708725 A CN 107708725A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
ifn
mouse
1bbl
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680029341.9A
Other languages
English (en)
Inventor
斯蒂芬·拉尔夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kankoure Co Ltd
Original Assignee
Kankoure Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2015901218A external-priority patent/AU2015901218A0/en
Application filed by Kankoure Co Ltd filed Critical Kankoure Co Ltd
Publication of CN107708725A publication Critical patent/CN107708725A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5152—Tumor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

公开了免疫强化组合物。更具体地，本发明公开了包含表现出增强的抗原呈递功能的细胞的组合物。本发明的组合物通常可用于促进宿主免疫细胞应答(包括选择性和靶向的免疫细胞应答)的刺激，并且特别地可用于治疗和/或预防癌症、肿瘤和病原体感染。

Description

用于引发免疫应答的剂和组合物
发明领域
本发明通常涉及免疫强化组合物(immune potentiating composition)。更具体地，本发明涉及包含表现出增强的抗原呈递功能的细胞的组合物。本发明的组合物通常可用于促进宿主免疫细胞应答(包括选择性和靶向的免疫细胞应答)的刺激，并且特别地可用于治疗和/或预防癌症、肿瘤和病原体感染。
发明背景
癌症仍然为全球发病率和死亡率的主要原因之一，其中恶性黑素瘤为对这些统计数据作出显著贡献的一种(Trotter等，2014；Bray等，2012)。部分地由于这个巨大的全球负担，对癌症的研究才会如此多产(Trotter等，2014；Jemal等，2011)。已经进行了研究恶性黑素瘤的发病机制、分子机制和潜在的治疗选项的大量研究(Lee等，2014；Yang,2011；和Fang等，2008)。然而，尽管已经进行了大量的研究，但仍然不存在被批准用于在预防或治疗恶性黑素瘤中使用的疫苗。
用于将疫苗靶向特定癌症的一种方法依赖于使用患者自己的细胞(黑素瘤细胞和/或树突细胞)来产生定制疫苗，以加强患者针对其自身癌细胞的免疫应答。这项技术已经在若干研究中被采用和测试(Berd等，1997；Soiffer等，2003；O’Rourke等，2003；de Rosa等，2014)。然而，个体化疗法(包括基于自体癌细胞和/或树突细胞疫苗的治疗)带来的担忧是该方法的高度耗时性和制造的巨大成本。这两个特征代表了对于及时和成本有效地产生个体化癌症疫苗的显著障碍，并且可能解释了制药公司无兴趣主动从事此类治疗剂的开发(Jaffee等，2001；Sondak等，2006；Ralph 2007)。可能商业上更可行的相关技术为使用基于同种异体全细胞的疫苗。这些疫苗基于具有有利的免疫原性的同种异体组织，并且越来越受欢迎，且最近的研究提供了有关癌症与患者免疫应答之间关系的有用信息(Dezfouli等，2003；Fang,2008)。
迄今，最成功的全细胞疫苗为CANVAXINTM，其包括三个经辐照的同种异体黑素瘤细胞系，它们之间表达了超过20种不同的黑素瘤抗原(Hsueh和Morton,2003)。尽管这种疫苗达到了III期临床测试，但在数据安全性监测委员会(the Data Safety MonitoringBoard)确定了与未接种疫苗的对照患者相比，CANVAXINTM治疗的患者不太可能显示任何存活益处之后，试验被停止(Sondak等，2006)。然而，这项试验为疫苗开发提供了有用的方法，该方法已经被用于其后的研究中(Faries等，2009；Lotem等，2011)。由Dezfouli等(2003)进行的单独的研究鉴定了在细胞表面表达B7.1的工程化黑素瘤细胞，并随后用IFNγ/β的组合的处理不仅增强了B7.1表达而且还诱导对黑素瘤细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞应答。此外，该研究得出结论，将B7.1添加到黑素瘤疫苗上介导了观察到的独立于CD4+辅助性T细胞的CD8+ T细胞应答(Dezfouli等，2003)。
发明概述
本发明人已经出人意料地发现，对靶抗原的较强的免疫应答可以通过用抗原呈递细胞进行接种疫苗来引发，所述抗原呈递细胞在其表面上具有呈递的B7分子和4-1BB激动剂并且其抗原呈递特性已经通过暴露于干扰素处理被增强。干扰素处理和B7分子和4-1BB激动剂的表面表达的组合产生细胞的抗原呈递功能的协同增强，所述细胞当被引入到合适的宿主中时引发针对由所述细胞呈递的抗原的显著改进的免疫应答。本发明的人工抗原呈递细胞在治疗已经消耗天然抗原呈递细胞群体(例如，巨噬细胞、树突细胞等)的受试者方面具有特别的优势。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种人工抗原呈递细胞，所述人工抗原呈递细胞在其表面上包含B7分子和4-1BB激动剂，其中所述细胞的抗原呈递功能(例如，细胞表面上的较高水平的主要组织相容性复合物)通过暴露于至少一种干扰素(IFN)被增强。合适地，细胞的抗原呈递功能通过使细胞与至少一种外源IFN接触(例如，在至少一种外源IFN的存在下培养)被增强。
在本文描述的方面和实施方案的每一个中，人工抗原呈递细胞通常来源于动物细胞，所述动物细胞通常为脊椎动物细胞(例如，哺乳动物细胞)。合适地，动物细胞为癌细胞或肿瘤细胞(例如，黑素瘤细胞)。
在本文描述的方面和实施方案的每一个中，4-1BB激动剂合适地为4-1BB配体。
在本发明的另一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含B7分子、4-1BB激动剂和动物细胞，所述动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种外源IFN接触(例如，在至少一种外源IFN的存在下培养)。
B7分子可以在细胞的表面上存在或以可溶性形式存在。类似地，4-1BB激动剂可以在所述细胞的表面上存在或以可溶性形式存在。在这种类型的说明性实例中，B7分子和4-1BB激动剂中的一种在细胞表面上存在，且另一种呈可溶性形式。在其他说明性实例中，B7分子和4-1BB激动剂各自在细胞的表面上存在。可选地，B7分子和4-1BB激动剂均呈可溶性形式。
在本文描述的方面和实施方案的每一个中，动物细胞通常为脊椎动物细胞，通常为哺乳动物细胞，其非限制性实例包括癌细胞或肿瘤细胞(例如，黑素瘤细胞)。
在本发明的另外方面，提供了一种用于制备人工抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：
将在其细胞表面上表达B7分子和4-1BB激动剂的动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间暴露于至少一种(通常为外源的)IFN。
仍在本发明的另外方面，提供了一种用于增强动物细胞的免疫强化作用的方法，所述方法包括：
将在其细胞表面上表达B7分子和4-1BB激动剂的动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间暴露于至少一种(通常为外源的)IFN。
在一些实施方案中，该方法还包括从动物细胞的异质群体分离表达B7分子和4-1BB激动剂中的一种或两种的细胞。
在一些实施方案中，该方法还包括修饰动物细胞以在其细胞表面上表达B7分子和4-1BB激动剂中的一种或两种。合适地，修饰步骤包括将B7分子和4-1BB激动剂中的一种或两种可从其表达的至少一种多核苷酸引入到动物细胞中。
在本文描述的方面和实施方案的每一个中，将动物细胞暴露于至少一种IFN合适地包括使所述细胞在足以允许针对至少一种I型IFN的细胞反应性(cellularresponsiveness)的条件下并且持续一段时间与II型IFN接触(例如，在II型IFN的存在下培养)，以及使所述细胞在增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与所述至少一种I型IFN接触。细胞可以与II型IFN和I型IFN依次或同时接触。在这种类型的说明性实例中，细胞首先与II型IFN接触，并且随后与I型IFN接触。在其他说明性实例中，细胞与II型IFN和I型IFN同时接触。
通常，II型IFN选自IFN-γ或其生物活性片段。
至少一种I型IFN通常选自IFN-α、IFN-β或其生物活性片段。
在以上宽泛描述的方法的一些实施方案中，使动物细胞失活或不能够增殖。例如，如本领域已知的，动物细胞可以用合适量的放射物(radiation)，诸如，例如γ-辐照进行辐照，以使动物细胞在预期的宿主中不能够增殖。
又在另一个方面，本发明提供了一种用于增强动物细胞的免疫强化作用的方法，所述方法包括：
将动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间暴露于至少一种(通常为外源的)IFN；以及
将如此暴露的细胞与B7分子和4-1BB激动剂组合，其中B7分子和4-1BB激动剂的至少一种呈可溶性形式。
本发明的另一个方面在于一种组合物，所述组合物包含B7分子、4-1BB激动剂和动物细胞，所述动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与IFN-γ(其通常为外源的)和任选地第一I型IFN(其通常为外源的)和第二I型IFN(其通常为外源的)的一种或两种接触(例如，在IFN-γ(其通常为外源的)和任选地第一I型IFN(其通常为外源的)和第二I型IFN(其通常为外源的)的一种或两种的存在下培养)，其中第一I型IFN选自IFN-β或其生物活性片段，且其中第二I型干扰素选自IFN-α或其生物活性片段。合适地，B7分子和4-1BB激动剂的至少一种在动物细胞的表面上表达或以可溶性形式存在。
本发明的另一个方面提供了一种用于在引发针对靶抗原的免疫应答中使用的组合物，其中所述组合物包含B7分子、4-1BB激动剂和动物细胞，所述动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种(通常为外源的)IFN接触(例如，在至少一种(通常为外源的)IFN的存在下培养)，其中对应于靶抗原的抗原由动物细胞呈递(例如，用于刺激免疫系统)。
在本文描述的方面和实施方案的每一个中，以上宽泛描述的组合物可以包含药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂或辅助治疗剂的任何一种或更多种。合适地，辅助治疗剂包括靶向快速分裂的细胞和/或破坏细胞周期的剂。
又在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防与靶抗原的增强或异常表达相关的疾病或状况的方法，所述方法包括将有效量的如以上宽泛描述的细胞或组合物施用至有相应需要的受试者。在一些实施方案中，疾病或状况为癌症或肿瘤。在一些实施方案中，受试者被暴露于靶向快速分裂的细胞和/或破坏细胞周期的医学治疗。在一些实施方案中，施用的细胞(无论是仅细胞还是作为组合物的一部分)相对于受试者为自体的(autologous)、同基因的(syngeneic)、同种异体的(allogeneic)或异种的(xenogeneic)。
根据另外的方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含一种组合物，所述组合物包含动物细胞以及B7分子和4-1BBL激动剂，所述动物细胞在足以增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种(通常为异源的)IFN接触(例如，在至少一种(通常为异源的)IFN的存在下培养)。
又在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗和/或预防肿瘤发生的方法，所述方法包括将有效量的如以上宽泛描述的细胞或组合物施用至有相应需要的患者。
附图简述
本发明的实例现将参考附图来描述，其中：
图1.(A)筛选包含插入到pGEM-T载体中的4-1BBL cDNA的细菌克隆。质粒DNA从预期包含适当连接的含有4-1BBL转基因的质粒的10个细菌克隆中提取。将DNA使用XbaI和EcoRI双重消化，并在包含0.5μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳。将1kb DNA梯(ladder)装载于泳道1中。将仅用XbaI、仅用EcoRI切割的pUC18载体和未切割的pUC18 DNA分别装载于泳道2-4中。将来自克隆1的未切割DNA的样品装载到泳道5中。泳道6-15包含来自克隆1-10的双重消化的DNA样品。(B)筛选包含插入到pGEM-T载体中的4-1BBL cDNA的细菌克隆。质粒DNA从预期包含适当连接的含有4-1BBL转基因的质粒的10个细菌克隆中提取。将DNA使用XbaI和EcoRI双重消化，并在包含0.5μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳。将1kb DNA梯(ladder)装载于泳道1中。将仅用XbaI、仅用EcoRI切割的pUC18载体和未切割的pUC18 DNA分别装载于泳道2-4中。将来自克隆1的未切割DNA的样品装载到泳道5中。泳道6-15包含来自克隆1-10的双重消化的DNA样品。
图2.B16-F10-4-1BBL细胞表达与4-1BB结合的功能性4-1BBL。将细胞与41BB/TNFRSF9/Fc嵌合体一起孵育，并使用PE缀合的IgG FcγAb进行染色以检测与4-1BBL的结合，使用FACSCalibur流式细胞仪进行测量。黑色和绿色条带图(histogram)分别代表B16-F10和B16-F10-4/1BBL分选的细胞的未染色的对照样品。红色和紫色条带图分别显示仅用IgG FcγPE第二Ab染色的B16-F10和B16-F10/4-1BBL细胞。蓝色条带图代表与4-1BB/TNFRSF9/Fc嵌合体一起孵育并用IgG FcγPE第二Ab染色的B16-F10细胞。褐红色条带图描绘了另外经历了针对4-1BBL的分选、在培养物中再扩增、然后用41BB/TNFRSF9/Fc嵌合体和IgG FcγPE第二Ab免疫染色的细胞群体。
图3.(A)在重复轮的细胞分选和选择后，在B16-F10/B7.1细胞上增强的B7.1表达。进行流式细胞术分析以确定与用pEF-MC1neoN9/B7.1载体转染的细胞相比野生型B16-F10细胞上B7.1表达的水平。来自多个亚系(subline)的所有细胞用PE-缀合的大鼠抗小鼠CD80Ab染色，并使用BD FACSCalibur进行分析。对样品进行门控以代表大部分阳性染色的细胞群体。黑色条带图代表用PE同种型对照染色的第一组B16-F10/B7.1(分选1)细胞。红色条带图显示野生型B16-F10细胞上的B7.1表达谱。蓝色条带图显示转染后的细胞上表达的B7.1的水平。绿色、紫色和褐红色着色的条带图分别显示了细胞在BD FACSAria上被重复分选一轮、两轮和三轮之后表达的B7.1的水平。(B)在克隆选择之后发展和维持的B16-F10/B7.1细胞上的B7.1的高表达。黑色条带图代表同种型染色的B16-F10/B7.1分选3细胞。绿色条带图显示在B16-F10/B7.1分选3细胞上的B7.1表达。深蓝色、黄色和褐红色条带图分别显示在B16-F10/B7.1分选3细胞的克隆1、克隆2和克隆3上表达的B7.1的水平。B7.1表达通过用PE-缀合的大鼠抗小鼠CD80Ab染色细胞来检测，并在FACSCalibur流式细胞仪上进行分析。
图4.根据“方案1”的接种疫苗和收获的时间线，以用于比较来自对照与用两个剂量的疫苗处理的小鼠的脾重量。将C57BL/6对照(n＝9)或用两个剂量的包括1x 107个经辐照的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝6)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝6)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝7)细胞的疫苗腹膜内注射的小鼠根据A)中示出的时间线进行接种疫苗。将脾取出，并将重量记录为平均值±SE并且代表两个独立实验，如B)中示出的。显著性水平使用单因素ANOVA来确定。★p<0.05，★★p<0.01，★★★p<0.005(除非另有说明，与在本文呈现的所有其他附图中相同)。
图5.在来自接受两个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的小鼠的脾和血液而非淋巴结中增加的CD8+ T细胞％。将C57BL/6小鼠用作对照(n＝9)或如示出的使用接种疫苗方案1用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝6)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝6)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝7)疫苗进行注射。在第11天，通过流式细胞术评价脾(A)、血液(B)和淋巴结(C)的CD4+和CD8+ T细胞群体的差异。该数据代表两个独立实验，并示出平均值和标准误差。
图6.(A)给予两个疫苗剂量并在MLC中扩增的小鼠的脾淋巴细胞群体中的增加的CD8+ T细胞％。将C57BL/6小鼠用作对照(n＝9)或如示出的使用接种疫苗方案1用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝6)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝6)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝7)疫苗进行注射。从接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的对照小鼠收获脾，并分离淋巴细胞并在包含单层失活的IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞的MLC中扩增。在MLC中3至5天之后，收集淋巴细胞，并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞群体的变化。示出的数据从4个独立实验来收集。(B)来自在MLC中扩增的脾来源的淋巴细胞响应于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的高度升高的活化的CD8+ T细胞群体。将来自对照小鼠或用两个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞，使用适当的癌症疫苗细胞作为抗原刺激物在MLC中培养5天。表达CD8的淋巴细胞使用流式细胞术进行选择，然后进一步分析活化标志物CD107a和IFNγ的共表达。示出平均值和SE。
图7.如在CTL测定中确定的，来自对照或接种疫苗的小鼠的淋巴结来源的淋巴细胞的细胞毒性无显著差异。将来自对照C57BL/6小鼠或用两个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗细胞接种疫苗的小鼠的淋巴结取出，纯化淋巴细胞并使用B16-F10/B7.1/IFNγ/β活细胞作为靶在细胞毒性测定中分析。将SYTOX Green摄取用于确定细胞死亡的比例，如在分光光度计上使用485nm和525nm的激发和发射波长检测的。示出平均值和标准误差，并且细胞死亡的比例被示为总数的％。组之间的差异使用一般线性模型来确定(n＝4/组)。
图8.在包含来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的培养5天的淋巴细胞的MLC孔中观察到的高水平的癌细胞死亡。将包含单层的丝裂霉素C生长失活的、IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞作为抗原刺激物以及来源于(A)未接种疫苗的小鼠或用(B)B16-F10/4-1BBL-IFNγ/β细胞；(C)B16-F10/B7.1/IFNγ/β细胞或(D)B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的脾淋巴细胞的MLC在倒置显微镜下进行可视化。黑色箭头指示靶细胞，红色箭头显示脾淋巴细胞，且绿色箭头突出在初始目视检查之后被认为是MLC孔内存在的碎片、聚集的死亡细胞和细胞死亡。
图9.在来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的在MLC中生长的淋巴细胞的CTL测定中经由荧光显微术可视化的升高的细胞死亡的代表性实例。将来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾淋巴细胞在MLC中生长5天，并且然后用于CTL测定。靶B16-F10/B7.1黑素瘤细胞用DiI(红色)染色，并且将SYTOX Green用于染色以确定死亡细胞％。对于在CTL测定中的不同孔，记录明视野、绿色和红色荧光图像，所述不同孔包含单独的100％活的靶细胞(IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞)、单独的100％死亡的靶细胞(用0.4％NP9去垢剂处理的IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞)、单独的100％活的效应物细胞(淋巴细胞)或以10:1的比例组合的效应物加靶。还示出了叠加的图像。
图10.在MLC中生长的来自B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞的CTL测定中的增加的细胞死亡。制备来自首次用于实验的、未接种疫苗的C57BL/6小鼠或根据接种疫苗方案1用B16-F10-4-1BBL-IFNγ/β、B16-F10-B7.1-IFNγ/β或B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的脾淋巴细胞、进行纯化并在具有B16-F10-B7.1-IFNγ/β抗原刺激物的MLC中培养5天。使用设置在485nm的激发波长和525nm的发射波长的分光光度计，将SYTOX Green核摄取和免疫荧光用于检测细胞死亡。效应物与活的癌靶细胞的比例的范围为从0.3:1至多达10:1，并绘制每一个比例的平均荧光和标准误差。计算细胞死亡的比例，并使用一般线性模型分析数据。
图11.根据“方案2”的接种疫苗和收获的时间线，以比较来自对照与用四个疫苗剂量处理的小鼠的脾重量。将C57BL/6对照(n＝12)或用四个剂量的包括1x 107个经辐照的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝9)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝10)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝11)细胞的疫苗腹膜内注射的小鼠根据(A)中示出的时间线进行接种疫苗。将脾取出，并将重量记录为平均值±SE，并且代表两个独立实验，如(B)中示出的。
图12.在来自给予四个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的小鼠的脾和血液而非淋巴结中的高度升高的CD8+ T细胞％。将C57BL/6小鼠如在接种疫苗方案2的时间线中示出的用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝9)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝10)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝11)疫苗细胞进行注射或保持未处理作为对照(n＝12)。在第42天，通过流式细胞术评价脾(A)、血液(B)和淋巴结(C)的CD4+和CD8+ T细胞群体的差异。该数据代表两个独立实验，并示出平均值和标准误差。
图13.来自淋巴细胞的CD4+和CD8+ T细胞应答，所述淋巴细胞来源于暴露于4个疫苗剂量的小鼠的脾和淋巴结。(A)将C57BL/6小鼠用作对照(n＝12)或根据接种疫苗“方案2”用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝9)、B16-F10/B7.1-IFNγ/β(n＝10)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝11)疫苗进行接种。收获脾，并将淋巴细胞在包含单层失活的IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞的MLC中生长。在MLC中3至5天之后，收集淋巴细胞，并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞群体的变化。该数据从四个独立实验收集。黑色条：CD8+ T细胞；灰色条：CD4+ T细胞。(B)将来自对照小鼠或用4个疫苗剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞施用的小鼠的淋巴细胞，使用癌症疫苗细胞作为抗原刺激物在MLC中培养5天。进行淋巴细胞的流式细胞术分析，选择表达CD8的那些淋巴细胞，并且然后进一步评价活化标志物CD107a和IFNγ的存在。(A)和(B)的显著性指示物代表：■与对照相比；▲与B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β相比；▼与B16-F10/B7.1/IFNγ/β相比；和◆与B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β相比。(C)将来自对照C57BL/6小鼠或用四个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗细胞接种疫苗的小鼠的淋巴结取出，并且纯化这些淋巴细胞，并使用B16-F10/B7.1/IFNγ/β活细胞作为靶在CTL测定中分析。将SYTOX Green摄取用于确定细胞死亡的比例，如在分光光度计上使用485nm和525nm的激发和发射波长检测的。细胞死亡的比例中的差异使用一般线性模型来确定(n＝4/组)。(D)在最后一次接种疫苗后4天从对照小鼠和根据“方案2”用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠纯化脾淋巴细胞。将SYTOX Green摄取用于确定细胞死亡的比例，如在分光光度计上使用485nm和525nm的激发和发射波长检测的。计算细胞死亡的比例，并且组之间的差异使用一般线性模型来确定(n＝2/组)，并且示出与对照样品相比的统计学显著性。对于(C)和(D)的图迹线(Graph trace)：■对照效应物+靶；▲B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β效应物+靶；▼B16-F10/B7.1/IFNγ/β效应物+靶；和◆B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β效应物+靶。
图14.在包含来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的培养5天的淋巴细胞的MLC孔中观察到的高水平的癌细胞死亡。将包含单层的丝裂霉素C生长抑制的、IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞作为抗原刺激物以及来自(A)未接种疫苗的小鼠或用(B)B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β细胞、(C)B16-F10/B7.1/IFNγ/β细胞、或(D)B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞的MLC在倒置显微镜下进行可视化。
图15.在来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的MLC来源的淋巴细胞的CTL测定中经由荧光显微术可视化的升高的细胞死亡的代表性实例。将来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾淋巴细胞在MLC中培养5天，并且然后用于CTL测定。靶B16-F10/B7.1细胞用DiI(红色)染色，并将SYTOX Green用于检测死亡细胞的百分比。对于在CTL测定中的不同孔，记录明视野、绿色和红色荧光图像，所述不同孔包含单独的100％活的靶细胞(IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞)、单独的100％死亡的靶(用0.4％NP9处理的IFNγ/βB16-F10/B7.1细胞)、单独的100％活的效应物(淋巴细胞)或以10:1的比例组合的效应物加靶。如示出的，还包括了叠加的图像。
图16.(A)在使用响应于B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β疫苗的MLC来源的脾淋巴细胞的CTL测定中的细胞死亡。从首次用于实验的对照C57BL/6小鼠或根据接种疫苗方案2用B16-F10-4-1BBL-IFNγ/β、B16-F10-B7.1-IFNγ/β或B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠纯化脾淋巴细胞并在MLC中作为效应物(E)与B16-F10-B7.1-IFNγ/β抗原刺激物一起培养5天。使用设置为485nm的激发波长和525nm的发射波长的分光光度计，将SYTOX Green核摄取用于检测细胞死亡。效应物(E)与活的癌靶细胞(T)的比例的范围为从0.3:1至多达10:1，并绘制每一个E:T比例的细胞死亡比例的平均值和标准误差。计算细胞死亡的比例，并使用一般线性模型分析数据。(B)、(C)在来源于用B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的脾淋巴细胞的MLC中的减少的CD4+ T细胞％、但增加的CD8+T细胞％。将C57BL/6小鼠用作对照(n＝21)或如示出的使用接种疫苗方案1或2用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝15)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝16)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝18)疫苗进行注射。从对照和接种疫苗的小鼠收获脾，分离淋巴细胞并在包含单层失活的IFNγ/β处理的B16-F10/B7.1细胞的MLC中扩增。在MLC中5天之后，收集混合的淋巴细胞群体，并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞的变化。数据代表四个独立实验。示出平均值和SE，并且数据使用独立样品T检验进行分析。斜条纹条：CD4+ T细胞(方案1)；间格条：CD4+ T细胞(方案2)；空白条：CD8+ T细胞(方案1)；且垂直纹条：CD8+ T细胞(方案2)。平均值之间的差异在箱线图(B)和(C)中示出。
图17.(A)来自遵循方案2用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗处理的小鼠的在MLC中扩增的脾来源的淋巴细胞的活化的CD8+ T细胞群体。来自对照小鼠或根据方案1或2用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞在MLC中培养5天，具有单层B16-F10-B7.1-IFNγ/β细胞作为抗原刺激物。然后通过流式细胞术分析淋巴细胞的CD8的表达以及活化标志物CD107a和IFNγ的表达。该数据代表4个独立实验。示出平均值和SE，并且组之间的差异通过独立样品T检验进行分析。(B)用方案1的两个疫苗剂量的初免/加强策略接种疫苗的小鼠在用5x 105个活的B16-F10-B7.1细胞攻击之后显著增加存活。将C57BL/6小鼠用作对照或遵循接种疫苗方案1用两个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗腹膜内注射(n＝4/组)。在最后一次接种疫苗后四天，将所有小鼠在左后侧腹皮下注射5x105个活的B16-F10/B7.1细胞。肿瘤生长使用卡尺每两至三天进行测量，并且当肿瘤在任一方向上达到最大长度为2.0cm时，将小鼠安乐死。该数据代表单个实验，并且存活使用Log秩检验进行分析。
图18.将小鼠用四个剂量的B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗以评价在攻击后的肿瘤发展。C57BL/6小鼠根据方案2接受四个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝6)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝7)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗(n＝7)或保持未接种疫苗(n＝6)作为对照。在最后一次接种疫苗后四天，将所有小鼠通过在左后侧腹皮下注射5x105个活的B16-F10/B7.1细胞来攻击。(A)肿瘤生长使用卡尺每2至3天进行测量，并且当肿瘤的任一维度达到最大长度为2.0cm时，将小鼠安乐死。(B)在初始肿瘤攻击后存活的小鼠在初始肿瘤攻击后第94天和第98天用另外两个剂量的疫苗进行进一步加强。将接种疫苗的小鼠和另一组首次用于实验的小鼠在最后一次加强注射5x105个活的B16-F10/B7.1细胞后四天(在第102天)进行攻击，并且肿瘤生长每两至三天进行监测。该数据代表两个独立实验，并且存活使用Log秩检验进行分析。(C)将C57BL/6小鼠用作对照(n＝7)或用四个剂量的B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝3)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞(n＝6)进行注射。在第四且最后一次接种疫苗之后四天，将所有小鼠通过在左后侧腹皮下注射1x 106个活的B16-F10/B7.1细胞的增加的肿瘤负荷接受活的肿瘤攻击。肿瘤生长如对于(A)和(B)描述的来测量。图迹线：■对照；◆B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β；▼B16-F10/B7.1/IFNγ/β；和●B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β。
图19.用四个剂量的细胞疫苗处理的小鼠中的肿瘤生长。将C57BL/6小鼠用作对照或用四个剂量的B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β全细胞疫苗进行注射。在最后一次接种疫苗之后四天，将所有小鼠在左后侧腹皮下注射5x 105个活的野生型B16-F10细胞(n＝3)进行攻击。(A)肿瘤尺寸在第17天进行测量并记录，然后将小鼠安乐死。从处死的小鼠收获肿瘤(B)和脾(C)并将其称重。示出数据的平均值±SE，并且进行单因素ANOVA以比较组之间的肿瘤和脾的重量。结果示出为平均值±SE，并且进行单因素ANOVA以比较肿瘤尺寸。
图20.在接受疫苗剂量然后用活的B16-F10细胞攻击的小鼠中的脾、肿瘤、血液和淋巴结中的CD8+ T细胞群体。将C57BL/6小鼠用作对照或用四个剂量的B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗接种疫苗。将所有小鼠用5x105个活的B16-F10细胞进行皮下攻击，并且在攻击后第17天时处死。从所有小鼠收集脾(A)、血液(B)、淋巴结(C)和肿瘤(D)，并且然后进行处理以纯化淋巴细胞。然后通过流式细胞术分析细胞样品的CD4+、CD8+和调节性T细胞群体％。示出平均值和SE。
图21.接受四个剂量的抗癌疫苗然后用活的B16-F10细胞攻击的小鼠的存活。(A)将C57BL/6小鼠用作未接种疫苗的对照或用四个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗(n＝4)，然后用5x104个活的B16-F10细胞皮下攻击。肿瘤生长每两至三天进行监测，并且当肿瘤在任一方向上达到最大为2.0cm时，将小鼠安乐死。将该数据转化为存活分析，并且显著性使用Log秩检验来确定。(B)如(A)中描述的准备小鼠，不同之处为用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击。给予保持无肿瘤至少112天的小鼠另外两个剂量的为B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝2)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝4)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝4)细胞的疫苗。接种疫苗的和未接种疫苗的对照(n＝4)小鼠用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击(n＝4)，并且对照小鼠保持未处理(n＝4)。在用活的肿瘤负荷注射后九天收集脾，并且将重量记录为平均值和SE。
图22.在接种疫苗的用活的肿瘤细胞攻击之后持续延长的时间段保持无肿瘤的小鼠中的CD8+ T细胞群体的分析。将C57BL/6小鼠用作对照或用两个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗进行处理，然后用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击。给予保持无肿瘤至少112天的小鼠另外两个加强剂量的为B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝2)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝4)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝4)细胞的相同疫苗。在最后一次加强接种疫苗后四天，将接种疫苗的或未接种疫苗的对照小鼠(n＝4)用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击，并且对照小鼠保持未处理(n＝4)。在用活的肿瘤负荷注射后九天，将小鼠安乐死，并收获其脾(A)、血液(B)和淋巴结(C)。纯化淋巴细胞并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞群体％。示出平均值和标准误差。
图23.在接种疫苗的用活的肿瘤细胞攻击之后持续延长的时间段保持无肿瘤的小鼠中的TEM细胞的分析。将C57BL/6小鼠用作对照或用两个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗进行处理，然后用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击。给予保持无肿瘤至少112天的小鼠另外两个加强剂量的为B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝2)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝4)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝4)细胞的相同疫苗。在最后一次加强接种疫苗后四天，将接种疫苗的或未接种疫苗的对照小鼠(n＝4)用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击，并且对照小鼠保持未处理(n＝4)。在用活的肿瘤负荷注射后九天，将小鼠安乐死，并收获其脾(A)、血液(B)和淋巴结(C)。纯化淋巴细胞，并通过流式细胞术鉴定CD8+ T细胞群体并同时分析TEM和TCM CD8+ T细胞亚群的存在。示出平均值和标准误差。
图24.在接种疫苗的在双重攻击之后持续延长的时间段保持无肿瘤的小鼠中的脾重量和T细胞群体的分析。将C57BL/6小鼠用作对照或用四个剂量的B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β、B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗进行接种疫苗，并且然后用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击。小鼠保持无肿瘤102天，然后用相同的疫苗细胞进一步加强两次，并用另外的5x105个活的B16-F10/B7.1细胞再次攻击。来自前一个研究(图18)的小鼠当它们在与用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β(n＝3)、B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝7)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝6)细胞接种疫苗间隔四天又被加强两次时，保持无肿瘤至少190天。在最后一次加强接种疫苗后四天，将接种疫苗的和未接种疫苗的对照(n＝4)小鼠用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞进行攻击，并且对照小鼠保持未处理(n＝4)。在注射活的肿瘤负荷后6天将小鼠安乐死，并且将(A)脾重量记录为平均值。收获脾(B)、血液(C)和淋巴结(D)，纯化淋巴细胞并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞群体％。示出平均值和标准误差。
图25.在接种疫苗的用活的肿瘤细胞攻击之后持续延长的时间段保持无肿瘤的小鼠中的TEM细胞。进一步纯化前一个图中描述的脾(A)、血液(B)和淋巴结(C)的淋巴细胞，并通过流式细胞术鉴定CD8+ T细胞群体并同时分析TEM和TCM CD8+ T细胞亚群的存在。
图26.在用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗注射后LTα-/-小鼠产生升高的脾CD8+ T细胞群体。将LTα-/-小鼠用B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝4)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝8)抗癌疫苗进行注射或保持未接种疫苗作为对照(n＝8)。在最后一次接种疫苗后四天，收集脾并(A)称重，并且然后分析(B)脾和(C)外周血的CD4+和CD8+ T细胞群体中的差异。该数据代表两个独立实验，并示出平均值±SE。
图27.来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的CD8+ T细胞％和活化的CD8+ T细胞％在MLC中培养后增加并且在CTL测定中在杀伤靶黑素瘤细胞方面是最有效的。将LTα-/-小鼠用作对照(n＝8)或用B16-F10/B7.1/IFNγ/β(n＝4)或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝8)疫苗进行注射。将脾来源的淋巴细胞在MLC中生长三至五天，然后分析(A)CD4+和CD8+ T细胞群体中的变化及(B)活化的CD8+ T细胞群体中的变化。该数据从四个独立实验来收集。(C)在CTL测定中评价淋巴细胞以确定其杀伤靶黑素瘤细胞的能力。效应物(E)与活的癌靶细胞(T)的比例的范围为从0.3:1至多达10:1，并绘制每一个E:T比例的细胞死亡比例的平均值±SE。图上的值指示能够产生30％靶细胞裂解的效应物细胞的数目(x104)，和以裂解单位/效应物细胞群体计相对于来自未接种疫苗的小鼠的CTL应答的相对倍数增加。
图28.抗癌疫苗对用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞攻击的大部分LTα-/-小鼠具有保护作用，并且随后增加了由这些小鼠产生的TEM细胞群体％。将接种疫苗的在初始肿瘤攻击之后保持无肿瘤的LTα-/-小鼠用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β(n＝3)细胞疫苗加强两次并用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞再次攻击。在最后一次加强接种疫苗后四天，将接种疫苗的和未接种疫苗的对照(n＝3)小鼠用5x105个B16-F10/B7.1细胞进行攻击。未接种疫苗的对照小鼠的组保持未处理(n＝4)。收集脾并(A)称重，并且然后分析来自(B)脾和(C)外周血的淋巴细胞的CD4+和CD8+ T细胞群体。进一步分析(D)脾和(E)外周血中的CD8+ T细胞群体的TEM和TCM CD8+ T细胞亚群的存在。
图29.在用较高浓度的IFNγ/β处理之后B16-F10-4-1BBL分选1细胞上的H-2Kb表达无变化。B16-F10-4-1BBL分选1细胞用不同浓度IFNγ/β处理并且然后用FITC-缀合的抗小鼠H-2Kb Ab染色。细胞上H-2Kb表达的检测使用FACSCalibur进行。黑色条带图代表同种型染色的用1000IU/mL的IFNγ和1000IU/ml的IFNβ处理的B16-F10/4-1BBL细胞样品。红色条带图显示用1000IU/ml的IFNγ和IFNβ处理并用H-2Kb Ab染色的B16-F10/4-1BBL细胞。在用2000IU/mL IFNγ/1000IU/mL IFNβ和3000IU/mL IFNγ/1000IU/mL IFNβ处理之后的细胞上的H-2Kb表达分别通过蓝色条带图和绿色条带图示出。黄色和紫色条带图分别示出在用1000IU/mL IFNγ/2000IU/mL IFNβ和2000IU/mL IFNγ/2000IU/mL IFNβ处理之后的相同细胞上的H-2Kb表达。
发明详述
1.缩写
贯穿本申请使用以下缩写：
aa＝氨基酸
h＝小时
IFN＝干扰素
Ig＝免疫球蛋白
IFN＝干扰素
IL＝白细胞介素
MHC＝主要组织相容性复合物
min＝分钟
MLC＝混合的淋巴细胞培养物
nts＝核苷酸
s＝秒
STAT＝信号转导及转录活化因子(Signal transducers and activators oftranscription)
2.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下文中定义了以下术语。
本文使用的冠词“一(a)”和“一(an)”指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法客体。例如，“一个细胞(a cell)”意指一个细胞或多于一个细胞。
如本文使用的，术语“约”意指大约在大致或周围的区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于修饰高于及低于所陈述的值10％的变化的数值。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。本文通过端点列举的数值范围包括被归入该范围内的所有数字及分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、和5)。还应当理解，所有数字及其分数被推定为由术语“约”修饰。
术语“同时施用(administration simultaneously)”或“同时施用(administering simultaneously)”指包含免疫刺激性分子和干扰素处理的动物细胞两者的单一组合物的施用，或者各活性物质在足够短的时间段内作为单独组合物和/或通过单独途径递送而施用，有效结果等同于当两种此类活性物质作为单一组合物施用时获得的结果。
如本文使用的，“和/或(and/or)”指和涵盖一个或更多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当在替换(或)中解释时缺乏组合。
术语“剂”或“调节剂(modulatory agen)”包括诱导期望的药理学和/或生理学作用的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的且药理上有活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用以上术语时，然后应当理解，这包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学上有活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物，类似物等。术语“剂”不被狭义地解释，而是延伸至小分子、蛋白性分子诸如肽、多肽和蛋白以及包含它们的组合物和遗传分子诸如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞剂。术语“剂”包括能够产生和分泌本文提及的多肽的细胞以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“剂”延伸至核酸构建体，包括载体诸如病毒载体或非病毒载体、用于在一系列细胞中表达和分泌的表达载体和质粒。
如本文使用的术语“4-1BB激动剂”指直接或间接激动或拮抗组分以激动或以其他方式活化或增加4-1BB功能的任何剂。在一些实施方案中，4-1BB激动剂直接激动4-1BB功能。合适地，4-1BB激动剂通过与4-1BB结合并活化受体直接激动4-1BB功能。在一些其他实施方案中，4-1BB激动剂间接激动4-1BB功能。合适地，4-1BB激动剂通过直接或间接增加一种或更多种组分例如4-1BB配体(4-1BBL)的水平来间接激动4-1BB功能。
如本文使用的术语“同种异体(allogeneic)”指来源于尽管属于与受试者相同的物种，但遗传上不同的供体或来源的细胞或组织。
“抗原结合分子”意指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语延伸至表现出抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白来源的蛋白框架。
“人工抗原呈递细胞”意指不是体内天然存在的专职性抗原呈递细胞。如在本申请中描述的，抗原呈递细胞可以由异源细胞样品在体内产生。在被人工产生之前，异源样品可以不是或不包括任何抗原呈递细胞(例如，动物细胞)。可选地，人工抗原呈递细胞可以来源于遗传上被修饰为过表达感兴趣的多肽的抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞)。
“自体(autologous)”意指来源于同一生物体的某物(例如，细胞、组织等)。
“生物活性片段”意指全长亲本多肽的片段，该片段保留亲本多肽的活性。因此，生物活性片段除了其他的以外将具有选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、B7-1分子和B7-2分子的亲本多肽的生物活性。如本文使用的，术语“生物活性片段”包括缺失突变体和小肽，例如至少8个、优选地至少10个、更优选地至少15个、甚至更优选地至少20个、且甚至更优选地至少30个连续氨基酸的缺失突变体和小肽，所述缺失突变体和小肽包括以上活性。这种类型的肽可以通过应用标准的核酸重组技术来获得或通过使用常规的液相或固相合成技术来合成。例如，可以参考由Atherton和Shephard所著的题为“Peptide Synthesis”的文章的第9章所描述的溶液合成或固相合成，该文章被包括在由Nicholson编著的和由Blackwell科学出版社出版(Blackwell Scientific Publication)出版的题为“Synthetic Vaccines”的出版物中。可选地，肽可以通过用蛋白酶诸如内切Lys-C、内切Arg-C、内切Glu-C和葡萄球菌(staphylococcus)V8-蛋白酶消化本发明的多肽来生产。被消化的片段可以通过例如高效液相色谱(HPLC)技术来纯化。
如本文使用的，“细胞组合物”、“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指包含任选地被失活的至少一种细胞群体作为活性成分的组合物。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包含陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指展示与参考核酸序列的实质序列同一性(substantial sequence identity)的核酸序列(例如，与所述参考核酸序列的全部或一部分至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至多达100％序列同一性)或者展示与参考氨基酸序列的实质序列相似性或同一性(substantial sequencesimilarity and identity)的氨基酸序列(例如，与所述参考氨基酸序列的全部或一部分至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至多达100％序列相似性或同一性)。
如本文使用的，术语“培养(culturing)”或“培养的(cultured)”指在支持细胞的生长、存活力、维持和/或分化的条件下孵育细胞群体所必需的体外步骤。在本领域中，广泛认识到，许多形式、介质、温度范围、气体浓度、培养添加剂将支持细胞的生长、存活力、维持和/或分化，并且具体参数需要在感兴趣的培养体系中被定义。培养的参数将根据所选择的格式和培养的具体目标(例如，如本文公开的人工抗原呈递细胞的产生)而变化。认识到，足够的培养参数的确定为本领域常规的。
在治疗状况的上下文中，“有效量”意指施用一定量的剂(例如，本发明的人工抗原呈递细胞或包含此类细胞的组合物)，所述一定量的剂以单一剂量或作为一系列的一部分在需要此类治疗的个体中引发免疫应答，有效治疗该状况。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群(taxonomic group)、组合物的制剂、医学情况的评价及其他相关因素而变化。据预计，该量将落入可通过常规试验确定的相对宽的范围内。
为了增强免疫应答(“免疫增强(immunoenhancement)”)，如为本领域熟知的，意指增加动物响应外源或疾病特异性抗原(例如，癌症抗原)的能力，即，被引发以攻击此类抗原的那些细胞在数目、活性以及检测和破坏那些抗原的能力的增加。免疫应答的强度通过标准测试来测量，包括：通过本领域已知的方法直接测量外周血淋巴细胞；自然杀伤细胞细胞毒性测定(参见，例如，Provinciali M.等(1992,J.Immunol.Meth.155:19-24)、细胞增殖测定(参见，例如，Vollenweider,I.And Groseurth,P.J.(1992,J.Immunol.Meth.149:133-135)、免疫细胞和亚型的免疫测定(参见，例如，Loeffler,D.A.,等(1992,Cytom.13:169-174)；Rivoltini,L.,等(1992,Can.Immunol.Immunother.34:241-251)；或用于细胞介导免疫的皮肤测试(参见，例如，Chang,A.E.等(1993,Cancer Res.53:1043-1050)。如通过前述测试测量的免疫应答的强度的任何统计学上显著的增加均被认为是如本文使用的“增强的免疫应答(enhanced immune response)”、“免疫增强(immunoenhancement)”或“免疫强化(immunopotentiation)”。增强的免疫应答也由物理表现诸如发热和炎症，以及全身和局部感染的愈合和疾病中症状的降低即肿瘤尺寸的减少、疾病或状况(包括癌症或肿瘤)的症状的缓解来指示。此类物理表现也定义如本文使用的“增强的免疫应答”、“免疫增强”或“免疫强化”。在一些实施方案中，术语“增强的免疫应答”、“免疫增强”或“免疫强化”包括刺激或增加细胞和/或体液免疫应答(例如针对靶抗原)。
如本文使用的，术语“外源”指在生物体、细胞、组织或系统之外引入或产生的任何材料。
如本文使用的，术语“表达”及其语法等同物包括多核苷酸和多肽的产生，特别地由基因或基因的一部分产生RNA(例如，mRNA)，并且包括由RNA或基因或基因的一部分编码的多肽的产生，以及与表达相关的可检测材料的出现。例如，细胞表面上多肽的存在被包括在术语“表达”的范围内，这通常被描述为“表面表达”。另一个实例为结合配体诸如杂交探针或抗体与基因或其他多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白片段的结合以及结合配体的可视化。因此，在微阵列上、在杂交印迹诸如RNA印迹上或在免疫印迹诸如蛋白印迹上或在珠阵列上的斑点或通过PCR分析的增加的强度被包括在潜在的生物学分子的术语“表达”内。
“表达构建体”意指这样的遗传构建体，所述遗传构建体包括允许将插入的多核苷酸转录、并任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。表达构建体通常包括处于可操作的连接且在5’至3’方向的：启动子(其在所述构建体将被导入的宿主细胞中有功能)、待表达的多核苷酸和终止子(其在所述构建体将被导入的宿主细胞中有功能)。本文预期的表达构建体可以被插入到可复制的载体中用于克隆或用于表达(也称为“表达载体”)，或可以被掺入到宿主基因组中。
如本文使用的，术语“功能”指生物学、酶促或治疗功能。
如本文使用的术语“基因”指细胞的基因组的任何和所有不连续的编码区域，以及相关的非编码区域和调节性区域。该术语意图包含(mean)编码特定多肽的开放阅读框、内含子和参与表达调节的相邻5'和3'非编码核苷酸序列。在这方面，基因还可以包含与给定基因自然相关的控制信号诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号、或异源控制信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。基因可被引入到适当的载体中用于染色体外维持或用于整合到宿主中。
术语“异质细胞群体”通常指表达不同水平的细胞表面标志物的相同类型的两种或更多种细胞的混合物和/或两种或更多种细胞类型的混合物。异质细胞群体的实例可以包括：体液、生物学样本、解离的肿瘤样本、培养的细胞及其任何组合。
在分子表达的上下文中，“高水平”或“增加的水平”意指大于正常的、大于标准诸如预定确定的量度或亚组量度的、或者相对大于另一个亚组量度的水平。例如，高或增加的B7水平指大于正常B7水平的B7水平。正常的B7水平可以根据本领域技术人员可用的任何方法来确定。B7的高或增加的水平也可以指等于或大于预定水平诸如预定的截止值的水平。B7的高或增加的水平也可以指B7的一种水平，其中B7亚组的高或增加的水平具有比另一个亚组相对更大的B7水平。在一些实施方案中，B7的高或增加的水平是基于具有高于基线时B7的中值水平，其代表性实例包括高于基线水平的2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或200倍。例如，如本文使用的B16高细胞在其表面上表达高水平的B7分子，该水平高于由野生型B16细胞表达的B7水平的10倍、50倍、100倍和200倍。
本文提及“免疫相互作用”包括提及分子之间的任何相互作用、反应或缔合的其他形式，并且特别地其中分子的一个是或模拟免疫系统的组分。
如果组合物能够：a)在首次用于实验的个体中产生针对抗原(例如，肿瘤抗原)的免疫应答，或b)在个体中重构、加强或维持超过如果未施用化合物或组合物会发生的免疫应答，则该组合物为“免疫原性的(immunogenic)”。如果当以单一或多剂量施用时能够达到这些标准中的任一个，则组合物为免疫原性的。
本文使用术语细胞的“失活”指示，已使细胞不能细胞分裂形成后代。然而，细胞可以能够响应于刺激或生物合成和/或分泌细胞产物诸如细胞因子。失活的方法为本领域已知的。优选的失活方法为用毒素诸如丝裂霉素C或辐照的处理。已经被固定或透化并且不能分裂的细胞也为失活细胞的实例。
“分离的”意指实质上或基本上不含在它自然状态中通常伴随它的组分的材料。
“调节”意指直接或间接增加或减少靶分子的水平和/或功能活性。例如，剂可以通过与除了靶分子以外的分子相互作用来间接调节所述水平/活性。在这方面，编码靶多肽的基因的间接调节在其范围内包括调节第一核酸分子的表达，其中第一核酸分子的表达产物调节编码靶多肽的核酸分子的表达。
“从...获得”意指样品诸如，例如核酸提取物或多肽提取物从宿主的特定来源分离或来源于宿主的特定来源。例如，提取物可以从直接从宿主分离的组织或生物学流体获得。
如本文使用的术语“寡核苷酸”指包含经由磷酸二酯键(或其相关结构变体或其合成类似物)连接的多个核苷酸单元(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其相关结构变体或合成类似物)的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常指其中核苷酸和它们之间的键(linkage)为天然存在的核苷酸聚合物，但应当理解，该术语还在其范围内包括多种类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。分子的精确尺寸可以根据特定应用而变化。寡核苷酸通常长度通常相当短，通常为从约10个至30个核苷酸，但该术语可以指任何长度的分子，而术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
如本文使用的，术语“可操作地连接(operably connected)”或“可操作地连接(operably linked)”意指将结构基因置于调节性元件(包括但不限于启动子)的调节性控制下，然后调节性元件控制基因的转录和任选地翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选的是，将遗传序列或启动子放置在离基因转录起始位点的一定距离处，该距离与该遗传序列或启动子和在其自然环境中其控制的基因(即遗传序列或启动子来源于的基因)之间的距离大致相同。如为本领域已知的，该距离中的一些变化可以被调整而不损失功能。类似地，调节性序列元件相对于将被置于其控制下的异源基因的优选放置由元件在其自然环境(即其所来源于的基因)中的定位来定义。
本文可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”指对其期望疗法或预防的任何受试者，特别地脊椎动物受试者，且甚至更特别地哺乳动物受试者。属于本发明范围内的合适的脊椎动物包括，但不限于，亚门脊索动物门(Chordata)的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴和猿，并且包括猴的物种诸如来自猕猴属(Macaca)(例如，食蟹猴(cynomologus monkeys)诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)，和/或恒河猴(rhesusmonkeys)(普通猕猴(Macaca mulatta)))和狒狒(baboon)(豚尾狒狒(Papio ursinus))，以及狨猴(marmosets)(来自狨属(Callithrix)的物种)，松鼠猴(squirrel monkeys)(来自松鼠猴属(Saimiri)的物种)和绢毛猴(tamarins)(来自狨属(柽柳猴属(Saguinus))的物种)，以及猿的物种诸如黑猩猩(chimpanzees)(黑猩猩(Pan troglodytes)))，啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)，兔类动物(例如，兔、野兔)，牛科动物(bovines)(例如，牛(cattle))，似绵羊的(ovines)(例如，绵羊)，如山羊的(caprines)(例如，山羊)，猪科动物(porcines)(例如，猪)，马科动物(equines)(例如，马)，犬科动物(canines)(例如，狗)，猫科动物(felines)(例如，猫)，鸟类(例如，鸡，火鸡，鸭，鹅，伴侣鸟类，诸如金丝雀，虎皮鹦鹉等)，海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)，爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。在具体实施方案中，受试者为灵长类动物诸如人类。然而，应当理解，以上提及的术语并不暗示存在症状。
“药学上可接受的载体”意指一种药物赋形物，所述药物赋形物包含生物学上或以其他方式并非不合意的材料，即该材料可与选择的活性剂一起施用至受试者而不引起任何或实质的不良反应。载体可以包括赋形剂和其他添加剂，诸如稀释剂、去垢剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。
术语“多核苷酸变体”和“变体”指展示与参考多核苷酸序列的实质序列同一性的多核苷酸或在如本领域已知的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸(参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning.A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Press,1989)。这些术语还涵盖其中一个或更多个核苷酸已被添加或缺失，或者被不同的核苷酸替代的多核苷酸。在这方面，本领域充分理解，包括突变、添加、缺失和取代的某些改变可对参考多核苷酸做出，从而改变的多核苷酸保留了该参考多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体。
术语“多肽(polypeptide)”、“蛋白性分子(proteinaceous molecule)”、“肽(peptide)”和“蛋白质(protein)”在本文可互换使用以指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物，所述合成的非天然存在的氨基酸诸如相应天然存在的氨基酸的化学类似物。这些术语不排除修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。主题蛋白性分子的可溶性形式特别有用。在该定义中包括例如包含一个或更多个氨基酸类似物(包括例如非自然氨基酸)的多肽，或具有取代的键的多肽。
术语“多肽变体(polypeptide variant)”指通过至少一个氨基酸的添加、缺失或取代不同于参考多肽的多肽。本领域熟知，一些氨基酸可以被改变为具有广泛相似特性的其他氨基酸而不改变多肽的活性的性质。因此，如本文使用的多肽变体涵盖与选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、B7-1分子和B7-2分子的亲本多肽具有相似活性的多肽。优选的变体多肽包含保守性氨基酸取代。多肽中的示例性保守性取代可以根据下表进行：
表1
功能的实质改变通过选择比表1中示出的那些保守性更低的取代来进行。其他替代将为非保守性取代，并且相对较少的这些替代可以被容忍。通常，可能产生多肽特性最大变化的取代为以下的那些，其中(a)亲水残基(例如，Ser或Asn)取代疏水残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被其取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基或被其取代；(c)具有正电侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代负电残基(例如，Glu或Asp)或被其取代，或者(d)具有较小侧链的残基(例如，Ala、Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)取代具有大体积侧链的残基(例如，Phe或Trp)或被其取代。
“引物”意指当与DNA的链配对时，能够在合适的聚合剂的存在下启动引物延伸产物的合成的寡核苷酸。引物优选地为单链的，以用于在扩增中的最大效率，但可选地可以是双链的。引物必须足够长以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的长度取决于许多因素，包括应用、待采用的温度、模板反应条件、其他试剂以及引物的来源。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15个至35个或更多个核苷酸，但它可以包含较少的核苷酸。引物可以是大的多核苷酸，诸如从约200个核苷酸至数千个碱基或更多。引物可以被选择为与它被设计为与之杂交的模板上的序列“实质上互补”，并用作用于合成的起始的位点。“实质上互补”意指该引物为足够互补的，以与靶核苷酸序列杂交。优选地，引物不包含与该引物被设计成与之杂交的模板的错配，但这不是必不可少的。例如，非互补核苷酸可以被附连至引物的5'末端，其中引物序列的剩余部分与模板互补。可选地，非互补核苷酸或非互补核苷酸的一段可散布于引物中，条件是该引物序列具有与模板的序列足够的互补性以与其杂交，并从而形成模板用于合成引物的延伸产物。
如本文使用的术语“重组多核苷酸”指在体外通过将核酸操作到通常在自然界中未发现的形式而形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以在表达载体的形式中。通常，此类表达载体包括与核苷酸序列可操作地连接的转录和翻译调节性核酸。
“重组多肽”意指使用重组技术(即通过表达重组多核苷酸)制备的多肽。
如本文使用的“刺激”免疫或免疫应答指施用启动、加强或维持宿主免疫系统以将高于以其他方式发生的水平与靶物质诸如外源分子或肿瘤细胞反应的能力的组合物。刺激“初级”免疫应答在本文指在其中未检测到先前的反应性的受试者中引发特异性免疫反应性；例如，由于缺乏靶抗原的暴露、对靶的不耐受性或免疫抑制。刺激“次级”反应指在其中检测到先前的反应性的受试者中重新启动、加强或维持反应性；例如，由于自然免疫、自发免疫或使用一种或更多种组合物或程序的处理。
如本文使用的“严格性”指在杂交期间温度和离子强度条件，以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格性越高，将观察到序列之间的互补性程度越高。如本文使用的“严格条件”指在其下仅具有高比例互补碱基的多核苷酸，优选地具有精确互补性的多核苷酸将杂交的温度和离子条件。所要求的严格性为核苷酸序列依赖性的，并且取决于杂交期间存在的各种组分，并且当使用核苷酸类似物时，严格性有很大变化。通常，选择比对于特定序列在定义的离子强度和pH的热解链温度(thermal melting point)(Tm)低约10℃至20℃的严格条件。Tm为在其50％的靶序列与互补探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。应当理解，多核苷酸将在至少低严格条件下、优选地在至少中度严格条件下且更优选地在高严格条件下与靶序列杂交。本文提及低严格条件包括和涵盖从至少约1％v/v至至少约15％v/v甲酰胺和从至少约1M至至少约2M盐用于在42℃杂交，以及至少约1M至至少约2M盐用于在42℃洗涤。低严格条件还可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mMNaHPO4(pH 7.2)、5％SDS用于在室温洗涤。中度严格条件包括和涵盖从至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和从至少约0.5M至至少约0.9M盐用于在42℃杂交，以及至少约0.5M至至少约0.9M盐用于在42℃洗涤。中度严格条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS用于在42℃洗涤。高严格条件包括和涵盖从至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和从至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃杂交，以及至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃洗涤。高严格条件还可以包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS用于在超过65℃的温度洗涤。高严格条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃杂交，随后是在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃一次或更多次洗涤。非常高严格条件的一个实施方案包括在0.5M磷酸钠、7％SDS在65℃杂交，随后是在0.2×SSC、1％SDS在65℃一次或更多次洗涤。其他严格条件为本领域熟知的。熟练的处理人员(skilled addressee)将认识到，多种因素可以被操作，以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格度的优化可以用于确保高杂交程度。对于详细的实例，参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(同上)，在2.10.1至2.10.16页以及MOLECULAR CLONING.A LABORATORY MANUAL(Sambrook等，编著)(Cold Spring HarborPress1989)在1.101至1.104节。
如本文使用的，术语“同基因(syngeneic)”指来源于与受试者遗传上相同的供体或来源的细胞或组织。
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指获得期望的药理学和/或生理学效果。在部分或完全治愈疾病或状况(例如，血液系统恶性肿瘤)和/或可归因于该疾病或状况的不利影响方面该效果可以是治疗性的。这些术语还涵盖哺乳动物，特别地人类中的状况或疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病或状况，即，阻止其发展；或(b)减轻疾病或状况，即，引起疾病或状况的消退。
如本文使用的，术语“异种(xenogeneic)”指来源于与受试者不同物种的供体或来源的细胞或组织。
3.人工抗原呈递细胞
本发明至少部分地源于以下发现：通过在至少一种干扰素的存在下培养动物细胞，在动物细胞的免疫强化中存在协同增强，其中动物细胞在其表面上表达B7分子和4-1BB激动剂。
因此，在一个方面，本发明提供了一种人工抗原呈递细胞，所述人工抗原呈递细胞在其细胞表面上包含B7分子和4-1BB激动剂，其中细胞的抗原呈递功能通过暴露于至少一种IFN被增强，其中抗原呈递细胞通常来源于动物细胞。优选的细胞为具有限定的MHC基因组区域或等同物并且具有增加或增强抗原分子至细胞表面的I类MHC呈递的能力的那些细胞。
本发明的细胞可以从预期的宿主分离，处理，并然后重新引入或重新输注到该宿主中。使用通过手术切除术、活组织检查、血液取样或其他合适的技术从待治疗的宿主获得的细胞是特别方便的。此类细胞在本文中被称为“自体(autologous)”细胞。可选地，细胞或细胞系(例如，肿瘤细胞系)可以从一个来源制备和/或培养并将其引入到不同的宿主中。此类细胞包括“同基因细胞”、“同种异体”细胞和“异种细胞”。同种异体细胞的一种特定形式包括具有与潜在接受者共有主要和/或次要组织相容性抗原的一般细胞系(generic cellline)。
合适地，一般细胞系自然地以足以触发免疫应答(包括细胞免疫应答和体液免疫应答中的一种或两种)的水平表达B7分子。在优选的实施方案中，免疫应答包括预期宿主中的T细胞免疫应答，且更优选地细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
优选的是，一般细胞系包含与易感或倾向于特定状况的高百分比群体相容的主要组织相容性(MHC)I类抗原。合适地，通过施用人工抗原呈递细胞治疗或预防的状况为癌症或肿瘤。优选地，一般细胞系表达高水平的内源性B7分子。还优选的是，一般细胞系对用如本文描述的至少一种IFN的处理高度敏感(即，暗示高水平表达I类HLA)。
在一个实施方案中，处理的细胞(例如，癌细胞)或细胞系合适地使其失活以阻止在施用至受试者后进一步增殖(例如，以阻止将癌症或肿瘤引入到受试者中)。可以使用任何物理、化学或生物学失活方法，包括但不限于辐照(优选地以至少约5,000cGy，更优选地至少约10,000cGy，更优选地至少约20,000cGy)；或用丝裂霉素C处理(优选地至少10μg/mL；更优选地至少约50μg/mL)。
本发明延伸至来自例如禽类、爬行动物和哺乳动物的动物细胞。哺乳动物为优选的，并且包括人类、家畜动物(例如，绵羊、牛(cow)、马、猪)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，袋鼠、鹿、狐狸)。人类为最优选的动物，并且自体、同基因和同种异体细胞均可以用于人类受试者。
动物细胞优选地为癌细胞或肿瘤细胞。根据本发明的组合物将来源于肿瘤或癌细胞。例如，在根据本发明的实践治疗肺癌时，肺癌细胞将如在上文描述来处理以产生肺癌免疫强化组合物或疫苗。类似地，乳腺肿瘤或癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞等将被产生，并根据预防和/或治疗由其产生根据本发明的组合物的肿瘤或癌细胞的实践用作免疫治疗剂。在优选的实施方案中，动物细胞为黑素瘤细胞。
3.1 B7分子
B7分子为共刺激分子CD28的配体，其已经显示出增强IL-2分泌并且阻止在T细胞克隆和原代T细胞两者中诱导无反应性。B7分子和CD28之间的相互作用通过增加IL-2的mRNA稳定性的转录以及通过上调抗凋亡蛋白Bcl-XL来刺激T细胞增殖。
在优选的实施方案中，该方法还包括从动物细胞的异质群体分离表达B7分子的细胞。本发明预期了任何分离方法。用于分离特定细胞的合适方法为本领域技术人员已知的。例如，人们可以利用细胞的一个或更多个特定特征将该细胞与异质群体特异性地分离。此类特征包括，但不限于，细胞的解剖学定位、细胞密度、细胞尺寸、细胞形态、细胞代谢活性、离子诸如Ca2+、K+、和H+离子的细胞摄取、化合物诸如染色剂的细胞摄取、在细胞表面上表达的标志物、蛋白荧光和膜电位。在这方面可以使用的合适方法包括组织的手术去除、流式细胞术技术诸如荧光活化细胞分选(FACS)、免疫亲和分离(例如，磁珠分离诸如DYNABEADTM分离)、密度分离(例如，甲泛葡胺(metrizamide)、PERCOLLTM或FICOLLTM梯度离心)和细胞类型特异性密度分离。
在本情况下，将细胞通过流式细胞术或通过使用与B7分子免疫相互作用的抗原结合分子的免疫亲和分离进行合适地分离。
根据可选的实施方案，该方法还包括将动物细胞修饰为在其表面上表达B7分子。因此，B7分子为B7膜分子，其中所述分子的至少一部分被暴露于细胞外环境(即，相应细胞的外部)。B7分子包括，但不限于B7.1和B7.2。优选地，B7分子为B7.1。B7.1和B7.2的合适的多肽序列包括，但不限于，分别在SEQ ID NO：2(Uniprot登录号P33681)和SEQ ID NO：4中列出的那些，包括其生物活性片段，以及这些的变体或衍生物。
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV[SEQ ID NO：2]；和，
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGVMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF[SEQ ID NO：4].
在一些实施方案中，修饰步骤包括将B7分子可从其表达的多核苷酸引入到动物细胞中。合适地，多核苷酸与调节性多核苷酸(优选地以表达载体的形式)可操作地连接。可以用于调节多核苷酸表达的调节性多核苷酸包括，但不限于，启动子、增强子和转录终止子。此类调节性多核苷酸为本领域技术人员已知的。表达载体优选地包含至少一个启动子。可以用于诱导多核苷酸表达的合适的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。
可以采用编码B7分子的任何合适的多核苷酸。可以根据本发明利用的编码B7.1分子的多核苷酸描述于以下中：例如，Freeman等(1989,J.Immunol.143:2714-2722)、Freeman等(1992,Blood 79:489-494)，以及在GenBank数据库中在基因座名称HUMIGB7(登录号M27533)和NM_005191(登录号NM_005191)下。编码B7.1的示例性多核苷酸序列被列于SEQID NO:1中。编码B7.2分子的合适的多核苷酸描述于以下中：例如，Azuma等(1993,Nature336:76-79)、Chen等(1994,J.Immunol.152:4929-4963)，以及在GenBank数据库中在基因座名称NM_006889(登录号NM_006889)下。合适的B7.2编码多核苷酸被列于SEQ ID NO:3中。
用于表达B7蛋白的示例性表达载体包括单纯疱疹病毒扩增子，例如，由Fong等在美国专利第6,051,428号中描述的。
本领域技术人员将理解，用于组装和表达编码B7分子的DNA的技术，例如，寡核苷酸的合成、核酸扩增技术、转化细胞、构建载体、表达系统等，以及转导或以其他方式将此类DNA引入到动物细胞中为本领域已经良好建立的，并且大多数从业者熟悉用于特定条件和程序的标准资源材料。
3.2 4-1BB激动剂
4-1BB为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，并且为共刺激性受体分子(Vinay和Kwon,1998；以及Kwon等2000)。4-1BB主要表达于活化的T细胞(Pollok等(1993)J.Immunol.150:771-781)和NK细胞上(Melero等1998)。4-1BB的自然配体为4-1BB配体(4-1BBL)，其已经在活化的B和T细胞、巨噬细胞和树突细胞上被检测到(Goodwin等1993；Pollok等1994；以及Alderson等1994)。如本文描述的，4-1BB激动剂诸如4-1BBL和抗4-1BB抗体可以用于刺激T细胞和自身反应性B细胞的AICD。
因此，方法还包括将动物细胞修饰为在其表面上表达4-1BB激动剂。因此，4-1BB激动剂为膜分子，其中所述分子的至少一部分被暴露于细胞外环境(即，相应细胞的外部)。4-1-BB激动剂包括，但不限于，4-1BBL或其生物活性片段。4-1BBL的合适的多肽序列包括，但不限于，人类4-1BB的以下多肽序列(UniProtKB登录号P41273.1)：
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE[SEQ ID NO：6].
包括其生物活性片段，以及该序列的变体。
编码在SEQ ID NO：6中列出的序列的该野生型多核苷酸序列如下：
AAAAAGCGGCGCGCTGTGTCTTCCCGCAGTCTCTCGTCATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAACGTCCAGCCTGGGTGCAGCCCACCTGGACAGAGTCCGAATCCTACTCCATCCTTCATGGAGACCCCTGGTGCTGGGTCCCTGCTGCTTTCTCTACCTCAAGGGGCTTGGCAGGGGTCCCTGCTGCTGACCTCCCCTTGAGGACCCTCCTCACCCACTCCTTCCCCAAGTTGGACCTTGATATTTATTCTGAGCCTGAGCTCAGATAATATATTATATATATTATATATATATATATATTTCTATTTAAAGAGGATCCTGAGTTTGTGAATGGACTTTTTTAGAGGAGTTGTTTTGGGGGGGGGGGGGTCTTCGACATTGCCGAGGCTGGTCTTGAACTCCTGGACTTAGACGATCCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGCAACTGGGATTCATCCTTTCTATTAATTCATTGTACTTATTTGCTTATTTGTGTGTATTGAGCATCTGTAATGTGCCAGCATTGTGCCCAGGCTAGGGGGCTATAGAAACATCTAGAAATAGACTGAAAGAAAATCTGAGTTATGGTAATACGTGAGGAATTTAAAGACTCATCCCCAGCCTCCACCTCCTGTGTGATACTTGGGGGCTAGCTTTTTTCTTTCTTTCTTTTTTTTGAGATGGTCTTGTTCTGTCAACCAGGCTAGAATGCAGCGGTGCAATCATGAGTCAATGCAGCCTCCAGCCTCGACCTCCCGAGGCTCAGGTGATCCTCCCATCTCAGCCTCTCGAGTAGCTGGGACCACAGTTGTGTGCCACCACACTTGGCTAACTTTTTAATTTTTTTGCGGAGACGGTATTGCTATGTTGCCAAGGTTGTTTACATGCCAGTACAATTTATAATAAACACTCATTTTTCCTCCCTCTGAAAAAAAAAAAAAAA[SEQ ID NO：7].
因此，本发明的人工抗原呈递细胞在其细胞表面上表达与4-1BB结合的分子。因此，合适地，本文提供的分子通常为多肽。在一些优选的实施方案中，可用于本文提供的方法中的4-1BB激动剂可以是4-1BBL或4-1BBL的功能片段(即，4-1BBL的这样的片段，所述片段以全长4-1BBL与4-1BB结合的亲和力的至少20％(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、100％或甚至更多)与4-1BB结合，并且起活化受体并强化免疫应答的作用)。
在可选的实施方案中，4-1BB激动剂可以是对4-1BB具有特异性结合活性的抗体。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”涵盖能够与4-1BB结合并活化4-1BB的完整分子及其片段。抗体可以是任何免疫球蛋白(Ig)类，包括IgM、IgA、IgD、IgE和IgG及其任何亚类。IgM类抗体通常为五价的并且可以是特别有用的，因为一个抗体分子可以交联多个4-1BB多肽。包含交联的(例如，交联的IgG)并且因此为多价的Ig分子的免疫复合物也可以能够交联多个4-1BB分子，并且可以是特别有用的。
对4-1BB特异性的重组抗体，诸如包含人类部分和非人类部分两者的嵌合和人源化单克隆抗体均在本发明的范围内。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以例如，使用以下中描述的方法，通过本领域已知的重组DNA技术产生：国际专利申请第PCT/US86/02269号、欧洲专利申请号第EP184187号、第EP171496号、第EP125023号、第EP173494号；国际专利申请公布第WO86/01533号、美国专利第4,816,567号和第5,225,539号，以及以下期刊文章：Better等(1988)Science 240:1041-43，Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-26，Sun等(1987)PNAS 84:214-18Nishimura等(1987)Canc.Res.47:999-1005,Wood等(1985)Nature314:446-49，Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-59，Morrison,(1985)Science229:1202-07,Oi等(1986)BioTechniques 4:214,Jones等(1986)Nature 321:552-25，Veroeyan等(1988)Science 239:1534；以及Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-60。
还在本发明范围内包括了包含至少与4-1BB特异性结合的抗体的抗原结合结构域的功能部分的抗体片段及衍生物。包含该分子的结合结构域的抗体片段可以通过已知的技术产生。例如，此类片段包括，但不限于：F(ab')2片段，所述F(ab')2片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生；Fab片段，所述Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键来产生；以及Fab片段，所述Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子来产生(参见，例如，National Institutes of Health,Current Protocols In Immunology,Coligan等编著，2.8,2.10(Wiley Interscience,1991)。抗体片段还包括Fv(例如，单链Fv(scFv))片段，即其中存在很少或没有恒定区氨基酸残基的抗体产物。scFv片段为包含ScFv来源于的抗体的重链和轻链可变区的单个多肽链。此类片段可以，例如，如在美国专利第4,642,334号中描述的来产生。
3.3细胞
优选的细胞为具有限定的主要组织相容性复合物(MHC)基因组区域或等同物并且具有增加或增强抗原分子至细胞表面的I类MHC呈递的能力的那些细胞。
本发明的细胞可以从预期的宿主得到，处理，并然后重新引入或重新输注到该宿主中。使用通过手术切除术、活组织检查、血液取样或其他合适的技术从待治疗的宿主得到的细胞是特别方便的。此类细胞在本文中被称为“自体”细胞。可选地，细胞或细胞系(例如，肿瘤细胞系)可以从一个来源制备和/或培养并将其引入到不同的宿主中。此类细胞包括“同基因”和“同种异体”细胞。同种异体细胞的一种特定形式包括具有与潜在接受者共有主要和/或次要组织相容性抗原的一般细胞系。
合适地，一般细胞系以足以在预期的宿主中触发免疫应答、优选地T细胞免疫应答、且更优选地细胞毒性T淋巴细胞免疫应答的水平自然地表达B7分子、优选地B7膜分子。
优选的是，一般细胞系包含与易感或倾向于特定状况的高百分比群体相容的MHCI类抗原。合适地，通过接种疫苗治疗或预防的状况为癌症或肿瘤。优选地，一般细胞系表达高水平的内源性B7分子。还优选的是，一般细胞系对用如本文描述的至少一种IFN的处理高度敏感(即，暗示高水平表达I类HLA)。
在一个实施方案中，人工抗原呈递细胞(例如，癌细胞)或细胞系合适地使其失活，以阻止在施用至受试者后进一步增殖。可以使用任何物理、化学或生物学失活方法，包括但不限于辐照(优选地以至少约5,000cGy，更优选地至少约10,000cGy，更优选地至少约20,000cGy)；或用丝裂霉素C处理(优选地至少10μg/mL；更优选地至少约50μg/mL)。
本发明延伸至来源于例如禽类、爬行动物和哺乳动物的动物细胞。哺乳动物为优选的，并且包括人类、家畜动物(例如，绵羊、牛、马、猪)、实验室测试动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，袋鼠、鹿、狐狸)。人类为最优选的动物，并且自体和同种异体细胞均可以用于人类受试者。
动物细胞优选地来源于肿瘤或癌细胞。优选地，根据本发明的人工抗原呈递细胞或组合物来源于肿瘤或癌细胞。例如，在根据本发明的实践治疗黑素瘤时，黑素瘤细胞将如在上文描述来处理以产生黑素瘤抗原呈递细胞或组合物。类似地，乳腺肿瘤或癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌、胰腺癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞等将被产生，并根据预防和/或治疗由其产生根据本发明的细胞或组合物的肿瘤或癌细胞的实践用作免疫治疗剂。在优选的实施方案中，动物细胞选自黑素瘤细胞。
3.4 IFN预处理
产生人工抗原呈递细胞的步骤包括用至少一种I型干扰素和/或II型干扰素培养所述细胞。至少一种I型干扰素优选地选自IFN-α、IFN-β或其生物活性片段。优选地，II型干扰素选自IFNγ或其生物活性片段。
合适地，IFN-γ包含氨基酸序列(UniProt登录号P01579)：
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ[SEQ ID NO：7].
在一个实施方案中，IFN-β为IFN-β1，其合适地包含SEQ ID NO：8中列出的氨基酸序列(UniProt登录号P01574)。在可选的实施方案中，IFN-β为IFN-β2，其优选地包含SEQ IDNO：9中列出的氨基酸序列，呈现如下：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN[SEQ ID NO：8]；和，
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM[SEQ ID NO：9].
在一个实施方案中，IFN-α包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列。在可选的实施方案中，IFN-α为IFN-α1，其合适地包含SEQ ID NO：11中列出的氨基酸序列。又在另一个实施方案中，IFN-α为IFN-α2，其合适地包含SEQ ID NO：12中列出的氨基酸序列。
例如，IFN-α和/或IFN-β可以直接用于细胞，或者可以在用IFN-α和/或IFN-β处理之前，将细胞首先在IFN-γ的存在下进行培养。尽管不意图将本发明限于任何一种理论或特定作用模式，提出，这种IFN-γ恢复或增强由IFN-α和IFN-β调节的基因的转录活化所需的转录因子的水平。
因此，培养步骤优选地包括使所述细胞在足以允许针对至少一种I型干扰素的细胞反应性的条件下并且持续一段时间与II型IFN接触，并然后使所述培养的细胞在增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与所述至少一种I型IFN接触。
在一个实施方案中，使在II型IFN的存在下培养的细胞与选自IFN-β或其生物活性片段的I型IFN接触。
在另一个实施方案中，使在II型IFN的存在下培养的细胞与选自IFN-α或其生物活性片段的I型IFN接触。
又在另一个实施方案中，使在II型IFN的存在下培养的细胞与选自IFN-β或其生物活性片段的第一I型IFN和选自IFN-α或其生物活性片段的第二I型干扰素接触。
合适地，细胞与II型IFN(例如，IFN-γ)一起培养从约16小时至约96小时，并且随后与一种或更多种I型干扰素(例如，IFN-α和/或IFN-β)一起培养从约16小时至约72小时。优选地，细胞与II型IFN(例如，IFN-γ)一起培养从约48小时至约96小时，并且随后与一种或更多种I型干扰素(例如，IFN-α和/或IFN-β)一起培养从约24小时至约72小时。
细胞可以用在约100个至约2000个国际单位/mL的浓度的IFN-γ进行处理，并且随后用在约100个至约2000个国际单位/mL的浓度的IFN-α和/或IFN-β进行处理。优选地，细胞与在约1000个国际单位/mL的浓度的IFN-γ一起培养，并且随后与在约1000个国际单位/mL的浓度的IFN-α和/或IFN-β一起培养。
应当理解，因此，使动物细胞经历在接受者宿主中不可获得的浓缩形式的至少一种IFN。不希望受任何特定的理论或作用模式束缚，在至少一种IFN存在下的培养强化了动物细胞经由抗原加工途径加工抗原并且将加工的抗原呈递在细胞表面上两者的能力。B7分子在动物细胞表面上的存在提供了通过例如T细胞上存在的CD28或CTLA4受体实现T细胞活化的手段(means)。
在一些实施方案中，培养步骤还包括扩增培养物中分离的细胞群体。此类扩增技术为本领域技术人员已知的。例如，如下文描述的，扩增的细胞群体由在烧瓶中生长的分离的细胞制备。如果需要，扩增的群体的产生可以通过在生物反应器或发酵罐或适用于大量生长细胞的其他此类容器或装置中培养细胞来放大规模。将分离的群体优选地在37℃，5％-7％二氧化碳在一种或更多种细胞因子/生长因子(包括，但不限于，成纤维细胞生长因子)的存在下，在合适的完全生长培养基(例如，包含10％胎牛血清或无血清培养基的RPMI或DMEM)存在下扩增。
4.免疫强化组合物
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物用于增强免疫应答，包括针对靶抗原的细胞(例如，T细胞，包括CD8+ T细胞)应答和/或体液免疫，所述组合物包含本文以上和别处描述的人工抗原呈递细胞和一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。具体地，包含在组合物中的细胞包括将动物细胞在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种干扰素一起培养，其中细胞在其表面表达或以其他方式组合提供B7分子和4-1BB激动剂。通常，洗涤细胞以去除培养基和IFN中的任何一种或更多种。
在一些实施方案中，B7分子由动物细胞表达，以呈递在细胞表面上。在可选的实施方案中，B7分子合适地呈可溶性形式。在这种类型的优选的实施方案中，B7蛋白为缺乏功能性跨膜结构域的B7分子。优选地，可溶性B7分子包含B7细胞外结构域。这种类型的可溶性B7.1分子被以下所公开：例如，由McHugh等(1998,Clin.Immunol.Immunopathol.87(1):50-59)，Faas等(2000,J.Immunol.164(12):6340-6348)和Jeannin等(2000,Immunity 13(3):303-312)。用于可溶性B7.1的多肽序列的实例，包括但不限于，在SEQ ID NO:18和20中列出的那些，包括其生物活性片段，以及这些的变体或衍生物。在这种类型的另一个优选的实施方案中，B7蛋白为B7融合蛋白。B7融合蛋白合适地包含与优选地为抗体或抗体片段的抗原结合分子连接在一起的B7分子或其生物活性片段。
在一些相同和不同的实施方案中，4-1BB激动剂由动物细胞表达，以呈递在细胞表面上。在这种类型的可选的实施方案中，4-1BB激动剂合适地呈可溶性形式。在这种类型(即，可溶性形式)的优选的实施方案中，4-1BB激动剂为缺乏功能性跨膜结构域的蛋白性分子。可溶性4-1BB激动剂，例如，可溶性4-1BBL多肽，由以下所公布：Won等J BiolChem.2010Mar19；285(12):9202-10。在一些实施方案中，4-1BB激动剂为一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与优选地为抗体或抗体片段的抗原结合分子连接在一起的4-1BB激动剂或其生物活性片段。
根据本发明的优选的融合蛋白(通常也称为“嵌合蛋白”或“嵌合分子”)包含对应于B7分子或4-1BB激动剂的生物活性片段的多肽。例如，可用于本发明中的B7嵌合分子为B7Ig融合蛋白，所述B7Ig融合蛋白包含对应于B7分子的细胞外结构域的多肽和改变B7分子的溶解度、亲和力和/或价态的免疫球蛋白恒定区。
在优选的实施方案中，编码对应于B7.1分子的细胞外结构域(包含从约位置1至约位置215的氨基酸)的氨基酸序列的多核苷酸与编码对应于人类Ig Cγ1的铰链、CH2和CH3区的氨基酸序列的多核苷酸使用PCR连接，以形成被表达为B7Ig融合蛋白的构建体。编码对应于B7Ig融合蛋白的氨基酸序列的DNA已经于1991年5月31日根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)在美国洛克维尔(Rockville,Md.)的美国典型培养物保藏中心(American Typeculture Collection)(ATCC)保藏，并且给予的保藏号为68627。用于制备和组装此类B7衍生物的技术例如由Linsley等公开(美国专利第5,580,756号)。也可以参考Sturmhoefel等(1999,Cancer Res.59:4964-4972)，其公开了包含在框架中与IgG2a的Fc部分融合的B7.1或B7.2的细胞外区域的融合蛋白。
在优选的实施方案中，可溶性4-1BB激动剂为4-1BBL构建体。
如果需要，可溶性蛋白的半衰期可以通过任何合适的程序延长。优选地，此类分子用聚乙二醇(PEG)(包括单甲氧基-聚乙二醇)进行化学修饰，如，例如，Chapman等公开的(1999,Nature Biotechnology 17:780-783)。
本发明的一个特别的优势为，由于细胞被用作免疫原的来源，所以不发生细胞上呈递的抗原类型的预定选择。因此，通常由细胞加工的大量抗原将可用于活化免疫细胞过程，导致响应不同抗原靶范围的免疫细胞群体的广泛变化。例如，癌细胞将表达由待治疗的患者的肿瘤共有的多个肿瘤相关抗原。
此外，抗原以通过由抗原呈递细胞使用的自然选择演化的构型呈递，并且因此提供强的免疫细胞活化。可选地，处理的细胞可以装载有特定的抗原肽，其优选地为肿瘤抗原，以产生特异性靶向疫苗。例如，可以参考Van Pel等(1995,Immunol Rev 145:229-50)，其描述了编码由CTL识别的肿瘤抗原的多种基因。也可以参考Itoh等(1994,J.Immunol.153:1202-1215)和Cole等(1995,Cancer Res.55:748-752)，其描述了将肿瘤细胞上装载肽作为CTL杀伤靶的用途。
根据本发明的组合物还可以通过将病原体生物体(例如，病毒、细菌、真菌、原生动物)的抗原装载到经处理的细胞上来制备以治疗影响人类和动物的多种感染性疾病。由于由引起相同疾病的不同品种的生物体表达的免疫原性和保护性抗原的类型存在异质性，多价组合物和疫苗可以通过从表达重要的不同抗原的生物体池制备组合物或疫苗来制备。因此，本发明还涵盖了一种用于刺激患者的免疫系统，并且优选地用于调节患者对一种或更多种抗原的T细胞应答的方法，所述方法通过将动物细胞连同所述或各抗原施用至患者，所述动物细胞在足以增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间在至少一种干扰素(IFN)的存在下进行培养。甚至更优选地，T细胞应答为CD8+ T细胞应答。因此，抗原的免疫原性可以通过从受试者分离动物细胞、“脉冲”或使其与抗原接触，然后使用脉冲的细胞在体外或体内刺激自体T细胞来增强或以其他方式体外改进。
根据本发明的组合物可以被制备以治疗可能罹患或有倾向罹患细菌、病毒或酵母感染、原生动物或其他寄生虫感染或患有癌症诸如黑素瘤或其他肉瘤或肿瘤的免疫妥协动物。
与以上描述的B7分子和4-1BB激动剂组合的动物细胞可以用作用于治疗或预防多种状况，如例如，肿瘤或癌症的活性物质。这些治疗剂可以本身或以免疫强化组合物施用至患者，在免疫强化组合物中它们与一种或更多种药学上可接受的载体、佐剂和/或稀释剂混合。
本发明的免疫强化组合物可以使用本领域技术人员已知的常规方法制备。通常， 此类组合物被制备为作为液体溶液或悬浮液的可注射剂(injectables)；还可以制备适用 于在注射之前在液体中成溶液、或成悬浮液的固体形式。制备物也可以被乳化。活性免疫原 性成分通常与为药学上可接受的和与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如 水、盐水、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，组合物可以包含少量 辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强组合物效力的佐剂。可以是有效的佐 剂的实例包括但不限于：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur- MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为去甲-MDP)、N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基 磷酰基氧基)-乙胺(CGP 1983A，也称为MTP-PE)、以及RIBI，其包含从细菌提取的在2％角鲨 烯/Tween 80乳液中的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。优选地，佐剂选自包括以下的组：半乳凝素抑制 剂、针对免疫抑制性抑制剂诸如CTLA4、PD1、PD-L1受体、吲哚双加氧酶(IDO)和TGF-β抑制剂 的单克隆抗体。例如，佐剂的效力可以通过测量起因于施用组合物的抗体的量来确定，其中 那些抗体针对由组合物的处理的细胞呈递的一种或更多种抗原。
细胞通常在药学上可接受的载体中来施用，所述药学上可接受的载体对细胞和个体为无毒的。此类载体可以是细胞生长于其中的生长培养基。相容的赋形剂包括等渗盐水，具有或不具有生理上相容的缓冲液如磷酸盐或Hepes以及营养物质诸如右旋糖、生理上相容的离子或氨基酸，以及适用于与细胞群体一起使用的多种培养基，特别地不含其他免疫原性组分的那些。还可以使用携带试剂(carrying reagent)，诸如白蛋白和血浆级分和非活性增稠剂。非活性生物学组分在其存在于疫苗中的程度上优选地来源于与待治疗的动物或人类同基因的动物或人类，并且甚至更优选地此前从受试者获得。注射部位可以是皮下、腹膜内、肌内、皮内或静脉内。
如果可溶性免疫刺激性分子被用作组合物中的活性物质，则免疫刺激性分子可以以中性或盐形式被配制为组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成的)，且其是与无机酸，诸如盐酸或磷酸形成的，或与有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的。与游离羧基基团形成的盐也可以来源于无机碱，诸如，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物(ferric hydroxides)，以及有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因，等。
如果需要，包含本发明的动物细胞的装置或组合物适用于持续或间歇释放，并且事实上可以被植入体内或向其局部应用以将此类材料相对缓慢地释放到体内。
应当理解，可溶性免疫刺激性分子可以与包含细胞的组合物的施用分别地施用至患者。根据所治疗的具体状况，免疫刺激性分子可以被配制并全身或局部施用。用于配制和施用的技术可以见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版本。合适的途径可以，例如，包括口服、直肠、经粘膜或肠内施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内，直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
待施用的IFN处理的细胞的数目及任选地免疫刺激性分子的量可以取决于被治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重及其一般健康状况。在这方面，用于施用的剂的精确量将取决于从业者的判断。在确定在治疗疾病或状况时待施用的剂的有效量时，医师可以评价疾病或状况随时间的进展。在任何情况下，本领域技术人员可以容易地确定本发明的剂的合适剂量而无需过度实验。包含细胞的组合物和疫苗以在约104个和1010个之间、且更优选地在约106个和108个之间处理的细胞/施用的范围被合适地施用至患者。被施用至患者的免疫刺激性分子的剂量应该与疫苗的细胞组分组合足以在患者中实现随时间的有益应答，诸如与癌症或肿瘤相关的症状的减少。剂量的量和间隔可以被单独调整以提供足以维持免疫刺激性作用的免疫刺激性分子的血浆水平。用于全身施用的通常患者剂量范围为从1-2000mg/天，通常为从1-250mg/天，且通常为从10-150mg/天。根据患者体重表示，通常剂量范围为从0.02-25mg/kg/天，通常为从0.02-3mg/kg/天，通常为从0.2-1.5mg/kg/天。
5.治疗和预防的方法
本发明还涵盖了一种用于治疗和/或预防疾病或状况的方法，所述方法包括将有效量的如本文以上和别处宽泛描述的细胞或组合物施用至需要此类治疗的患者。
在一个实施方案中，本发明的细胞或组合物也可以用于产生大量的CD8+或CD4+CTL，用于过继转移至无法发动(mount)正常免疫应答的免疫抑制个体。例如，抗原特异性CD8+CTL可以出于治疗目的被过继转移于罹患HIV感染(Koup等1991,J.Exp.Med.174:1593-1600；Carmichael等1993,J.Exp.Med.177:249-256；和Johnson等1992,J.Exp.Med.175:961-971)、疟疾(Hill等1992,Nature 360:434-439)以及恶性肿瘤诸如黑素瘤(Van derBrogen等1991,Science 254:1643-1647；以及Young和Steinman 1990,J.Exp.Med.,171:1315-1332)的个体。
5.1治疗和预防癌症或肿瘤
根据本发明，提出包含B7分子和激动4-1BB的细胞和组合物可用于治疗或预防肿瘤或癌症。本发明的细胞和组合物可以在癌症或肿瘤被诊断之后治疗地使用，或者可以在受试者发展癌症或肿瘤之前预防地使用。可以根据本发明的实践被合适地治疗的癌症或肿瘤包括肺的癌症或肿瘤，诸如小细胞和大细胞腺癌、鳞状细胞癌和支气管肺泡癌；乳腺肿瘤，诸如导管和小叶腺癌；妇科肿瘤，诸如子宫颈鳞状细胞癌和腺癌、以及子宫和卵巢上皮腺癌；结肠肿瘤，诸如上皮腺癌及其转移；胰腺肿瘤如胰腺导管腺癌；前列腺肿瘤，诸如前列腺腺癌；胃肿瘤；膀胱肿瘤，诸如过渡性鳞状细胞癌；肾肿瘤、骨肿瘤、肝肿瘤，诸如肝癌和胆管癌；网状内皮(RES)系统的肿瘤，诸如结节性或弥漫性B或T细胞淋巴瘤；浆细胞瘤和急性或慢性白血病；食管癌；脑肿瘤，诸如星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和胶质肉瘤；睾丸肿瘤；皮肤肿瘤，诸如恶性黑素瘤；软组织肿瘤，诸如软组织肉瘤和平滑肌肉瘤；和各种白血病和淋巴瘤。在优选的实施方案中，癌症为黑素瘤或乳腺癌。
本文以上和别处描述的细胞和组合物特别适用于在针对癌症和/或肿瘤的预防方法中使用。此类方法合适地是针对癌症或肿瘤的初免-加强接种疫苗，这诱导针对癌症或肿瘤的持久的体液、细胞介导的和粘膜免疫应答。
在一些实施方案中，本发明的细胞和组合物以初免-加强方案的多个剂量施用，目的为诱导针对靶抗原的长寿命(long-lived)有效免疫。此类策略使用第二剂量的细胞、组合物或疫苗来加强由初免剂量引发的免疫。
本发明的一些实施方案是基于以下认识：引发针对靶抗原的保护性免疫的最佳策略包括产生针对靶抗原的细胞和体液免疫应答两者。因此，本发明提供了多组分施用策略，其中本发明的第一剂量的细胞、组合物或疫苗通过引发或诱导第一免疫应答初免免疫系统，且本发明的第二剂量的细胞、组合物或疫苗用于加强或引发第二免疫应答，其中以第一剂量施用的细胞、组合物或疫苗与以第二剂量施用的相同。在这种类型的说明性实例中，第一剂量被施用以主要诱导针对靶抗原的细胞免疫应答，而第二剂量被主要施用以引发针对靶抗原的体液免疫应答。在完成该策略的施用步骤后，细胞和体液免疫应答两者均针对靶抗原发展。因此，两种应答一起提供有效或增强的针对与靶抗原(例如，癌症或肿瘤抗原)的存在相关的疾病或状况的保护。
为了使靶向相关抗原的那些CD8+CTL的直接刺激和活化最大化，用于初免和加强施用的细胞、组合物或疫苗优先地相同。
5.2治疗方案
熟知的是，化学疗法和辐射疗法快速靶向分裂细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗几种形式的癌症和自身免疫性疾病的一部分被提供，旨在通过治愈性治疗来减缓其进展或逆转疾病的症状。因此，在一些实施方案中，组合疗法将采用与化学治疗剂一起施用的细胞、组合物或疫苗，所述化学治疗剂合适地选自细胞生长抑制剂和细胞毒性剂。细胞生长抑制剂的非限制性实例选自：(1)微管稳定剂，诸如但不限于，紫杉烷类、紫杉醇、多西紫杉醇(docetaxel)、埃博霉素(Epothilones)和莱利霉素(laulimalides)；(2)激酶抑制剂，其说明性实例包括格列卫(Gleevec)、TarcevaTM、(盐酸厄洛替尼(Erlotinib HCl))、BAY-43-9006，分裂激酶结构域受体酪氨酸激酶亚组的抑制剂(例如，PTK787/ZK 222584和SU11248)；(3)受体激酶靶向抗体，其包括，但不限于，曲妥珠单抗(Trastuzumab)西妥昔单抗(Cetuximab)贝伐单抗(Bevacizumab)(AvastinTM)、利妥昔单抗(Rituximab)帕妥珠单抗(Pertuzumab)(OmnitargTM)；(4)mTOR途径抑制剂，其说明性实例包括雷帕霉素(rapamycin)和CCI-778；(5)Apo2L/Trail，抗血管生成剂，诸如但不限于内皮抑素(endostatin)、卡贝塔汀(combrestatin)、血管抑素(angiostatin)、血小板反应蛋白(thrombospondin)和血管内皮生长抑制剂(VEGI)；(6)抗肿瘤免疫治疗疫苗，其代表性实例包括活化的T细胞、非特异性免疫加强剂(即，干扰素、白细胞介素)；(7)抗生素细胞毒性剂，诸如但不限于，多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素(mitomycin)和米托蒽醌(mitozantrone)；(8)烷化剂，其说明性实例包括美法仑(Melphalan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、福莫司汀(Fotemustine)、白消安(Busulfan)、替莫唑胺(Temozolomide)和噻替哌(Thiotepa)；(9)激素抗肿瘤剂，其非限制性实例包括尼鲁米特(Nilutamide)、乙酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)、阿那曲唑(Anastrozole)、依西美坦(Exemestane)、他莫昔芬(Tamoxifen)、雷洛昔芬(Raloxifene)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、乙酸亮丙瑞林(Leuprorelin acetate)、枸橼酸托瑞米芬(Toremifene citrate)、来曲唑(Letrozole)、氟他胺(Flutamide)、乙酸甲地孕酮(Megestrol acetate)和乙酸戈舍瑞林(Goserelin acetate)；(10)性腺激素类(gonadal hormones)，诸如但不限于，乙酸环丙孕酮(Cyproterone acetate)和乙酸甲羟孕酮；(11)抗代谢物，其说明性实例包括阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、托泊替康(Topotecan)、羟基脲(Hydroxyurea)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、门冬酰胺酶(Colaspase)、雷替曲塞(Raltitrexed)和卡培他滨(Capecitabine)；(12)同化剂(anabolic agent)，诸如但不限于，诺龙(Nandrolone)；(13)肾上腺类固醇激素，其说明性实例包括，甲基泼尼松龙乙酸酯(Methylprednisolone acetate)、地塞米松(Dexamethasone)、氢化可的松(Hydrocortisone)、泼尼松龙(Prednisolone)和强的松(Prednisone)；(14)肿瘤剂(neoplastic agent)，诸如但不限于，伊立替康(Irinotecan)、卡铂(Carboplatin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、依托泊苷(Etoposide)和达卡巴嗪(Dacarbazine)；以及(15)拓扑异构酶抑制剂，其说明性实例包括托泊替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)。
示例性细胞毒性剂可以选自sertenef、恶病质素(cachectin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、他索纳明(tasonermin)、氯尼达明(lonidamine)、卡铂、六甲蜜胺(altretamine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、二溴卫矛醇(dibromodulcitol)、雷莫司汀(ranimustine)、福莫司汀、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂、替莫唑胺(TEMODARTM，来自Schering-Plough Corporation,Kenilworth,N.J.)、环磷酰胺、舒铂(heptaplatin)、雌莫司汀(estramustine)、甲磺丙胺(improsulfan tosilate)、曲磷胺(trofosfamide)、尼莫司汀(nimustine)、二溴螺氯铵(dibrospidium chloride)、嘌嘧替派(pumitepa)、洛铂(lobaplatin)、赛特铂(satraplatin)、泊非霉素(profiromycin)、顺铂、多柔比星、伊洛福芬(irofulven)、右异环磷酰胺(dexifosfamide)、顺-胺二氯(2-甲基-吡啶)铂(cis-aminedichloro(2-methyl-pyridine)platinum)、苄基鸟嘌呤(benzylguanine)、葡磷酰胺(glufosfamide)、GPX100、(反式，反式，反式)-双-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物)((trans,trans,trans)-bis-mu-(hexane-1,6-diamine)-mu-[diamine-platinum(II)]bis[diamine(chl oro)platinum(II)]tetrachloride)、二氮丙啶精胺、三氧化二砷(arsenic trioxide)、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星(zorubicin)、伊达比星(idarubicin)、道诺霉素、比生群(bisantrene)、米托蒽醌(mitoxantrone)、吡柔比星(pirarubicin)、吡萘非特(pinafide)、戊柔比星(valrubicin)、氨柔比星(amrubicin)、抗瘤酮(antineoplaston)、3'-脱氨基-3'-吗啉代-13-脱氧-10-羟基洋红霉素、安那霉素(annamycin)、加柔比星(galarubicin)、依利奈法德(elinafide)、MEN10755、4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲基磺酰基-柔红霉素(参见国际公布WO 00/50032)、甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)及其混合物。
放射疗法包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如，γ-辐照、X-射线、UV辐照、微波、电子发射、放射性同位素等。疗法可以通过用以上描述的辐射形式辐照局部肿瘤部位来实现。最有可能的是，所有这些因素对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛范围的损伤。
X-射线的剂量范围为范围从50-200伦琴的每天剂量持续延长的时间段(3-4周)，至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很宽，并且取决于同位素的半衰期、发射的放射线的强度和类型，以及被赘生性细胞的摄取。
放射疗法的非限制性实例包括单次击发或分次击发的适形外部束放射疗法(50-100格雷作为在4-8周内的分次(fractions)提供)、高剂量率近距离放射疗法、永久性间质近距离放射疗法、全身放射性同位素(例如，锶89)。在一些实施方案中，放射疗法可以与放射增敏剂组合施用。放射增敏剂的说明性实例包括但不限于乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑(etanidazole)、氟路索(fluosol)、米索硝唑(misonidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、替莫泊芬(temoporfin)和替拉扎明(tirapazamine)。
化学治疗剂可以选自以下类别的任何一种或更多种：
(i)抗增殖药/抗肿瘤药及其组合，如医学肿瘤学中使用的，诸如烷基化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，抗叶酸剂诸如含氟吡啶类化合物(fluoropyridines)如5-氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、氨甲蝶呤(methotrexate)、阿糖胞苷和羟基脲；抗肿瘤抗生素(例如，蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素(mithramycin))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨、以及紫杉烷类如紫杉醇和多西他赛；和拓扑异构酶抑制剂(例如，表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康以及喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂诸如抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)和艾多昔芬(iodoxyfene))、雌激素受体下调物(例如氟维司群(fulvestrant))、抗雄激素类(例如比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和乙酸环丙孕酮)、UH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorozole)和依西美坦(exemestane))以及5α-还原酶抑制剂诸如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵袭的剂(例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他(marimastat)和尿激酶型纤溶酶原活化物受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗-erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法呢基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂诸如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼(erlotinib)，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板来源的生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成剂，诸如抑制血管内皮生长因子作用的那些，(例如，抗-血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，化合物诸如在国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物)和通过其他机制工作的化合物(例如，罗喹美克(linomide)，整合素αvβ3功能的抑制剂、和血管抑素)；
(vi)血管损伤剂，诸如考布他汀A4和在国际专利申请WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对以上列出的靶的那些，例如ISIS 2503，一种抗-ras反义物；以及
(viii)基因治疗方法，包括例如替代异常基因诸如异常p53或异常GDEPT(基因导向的酶前药治疗)方法的方法，诸如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及增加患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法，诸如多-药物耐受性基因疗法。
免疫治疗方法包括，例如，增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，诸如用细胞因子诸如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的转染；减少T细胞无反应性的方法，使用转染的免疫细胞诸如细胞因子转染的树突细胞的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法，和使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应物细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。单独的抗体可以用作疗法的效应物，或者单独的抗体可以募集其他细胞以事实上促进细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。可选地，效应物可以是携带与恶性细胞靶直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
其他癌症疗法的实例包括光线疗法、冷冻疗法、毒素疗法或促凋亡疗法。本领域的技术人员将知道，该列表并非可用于癌症和其他增生性损伤的治疗方式的类型的穷举。
通常，如例如以上描述的治疗剂将连同药学上可接受的载体以药物组合物及以实现其预期目的的有效量来施用。施用至受试者的活性化合物的剂量应该足以在受试者中随时间实现有益响应，诸如减少、或缓解其症状。待施用的药物活性化合物的量可取决于被治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况。在这方面，用于施用的活性化合物的精确量将取决于从业者的判断。在确定在治疗或预防癌症或肿瘤时待施用的活性化合物的有效量时，医学从业者可以评价与癌症或肿瘤的存在相关的任何症状的严重程度，包括肿块的存在、不愈合的疮、不会消失的咽痛、吞咽困难、声音变化或声音嘶哑、炎症等。在任何情况下，本领域技术人员可以容易地确定治疗剂的合适剂量和合适的治疗方案而无需过度实验。
可以使用任何合适的技术来评价免疫的效力。例如，可以使用51Cr或AlamarBlueTM标记的靶细胞，使用经刺激的脾细胞或外周血单核细胞(PBMC)，对肽包被的或重组病毒感染的细胞采用CTL裂解测定。此类测定可以使用例如灵长类、小鼠或人类细胞进行(Allen等,2000,J.Immunol.164(9):4968-4978以及Woodberry等，下文)。可选地，免疫的功效可以使用一种或更多种技术来监测，所述一种或更多种技术包括，但不限于，新鲜及经刺激的两种PBMC的HLA I类四聚体染色(HLA class I tetramer staining)(参见，例如，Allen等，同上)、增殖测定(Allen等，同上)、ELISPOT测定和细胞内IFN-γ染色(Allen等，同上)、用于线性B细胞应答的ELISA测定；以及表达合成多核苷酸的细胞样品的蛋白印迹。
在一些实施方案中，以上描述的疗法或组合疗法还包括克服癌症的免疫逃避机制的其他佐剂。在一些实施方案中，用于该目的的合适的佐剂选自由以下组成的组：半乳凝素抑制剂、针对免疫抑制抑制剂诸如CTLA4、PD1、PD-L1受体、吲哚双加氧酶(IDO)、TGF-β抑制剂以及其他免疫应答的逃避方法的单克隆抗体(参见，例如，JP Allison的综述和文章)。
5.3病原体感染疫苗
又在另一个实施方案中，细胞、组合物或疫苗适用于治疗或预防病毒、细菌或寄生虫感染。由本发明预期的病毒感染包括但不限于，由HIV、肝炎、流感、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、EB病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染。细菌感染包括，但不限于，由奈瑟氏菌属(Neisseria)物种、脑膜炎球菌属(Meningococcal)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、链球菌属(Streptococcal)物种、军团菌属(Legionella)物种和分枝杆菌属(Mycobacterium)物种引起的那些。由本发明涵盖的寄生虫感染包括但不限于，由疟原虫属(Plasmodium)物种、血吸虫属(Schistosoma)物种、利什曼虫属(Leishmania)物种、锥虫属(Trypanosoma)物种、弓形虫属(Toxoplasma)物种和贾第虫属(Giardia)物种引起的那些。
已知，病毒感染可以导致个体中抗原呈递细胞(包括树突细胞)的消耗。例如，已经观察到HIV血清反应阳性个体在外周血中具有消耗数目的DC，并且存活的DC由于HIV基因组感染而失调(参见，Macatonia等，1990)。特别地，HIV感染DC阻断这些细胞诱导对其他抗原的应答的能力(参见，Macatonia等，1989)。
因此，在本发明的一些实施方案中，如本文以上和别处描述的免疫调节组合物用于替代受试者中对健康的树突细胞(DC)群体的需要。因此，本发明的免疫调节组合物和方法特别地适用于治疗和/或预防导致DC消耗的许多病毒感染(诸如HIV)，并且本发明的免疫调节组合物对于治疗此类病毒感染是特别地有用的。
此外，本发明还可适用于治疗和/或预防与病毒感染相关的辅助适应症。以说明性实例的方式，观察到罹患HIV感染的受试者具有显著减弱的免疫系统，导致发展某些癌症的风险增加。在这方面，罹患获得性免疫缺陷综合征(AIDS；HIV感染的晚期)的个体经常发展卡波西肉瘤(KS)。因此，在一些实施方案中，本发明的免疫调节组合物用于在治疗或预防HIV相关疾病和/或状况(例如，卡波西氏肉瘤)的发展中使用。
6.用于评价细胞毒性T淋巴细胞活性的方法
T淋巴细胞的细胞毒性活性可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来评价。例如，获得包含待测定细胞毒性活性的T淋巴细胞的样品，并且然后将T淋巴细胞暴露于IFN-处理的靶细胞(即，根据本发明的)。在可以通过评价已知能够被诱导变成细胞毒性细胞的T淋巴细胞的对照群体的细胞毒性活性来确定的适当时间段之后，在标准细胞毒性测定中测试待评价的T淋巴细胞的细胞毒性活性。此类测定可以包括，但不限于，本领域已知的铬释放CTL测定和ALAMAR BLUETM荧光测定。
评价CTL活性的方法对于评价个体产生针对表达肿瘤或病原体生物体的抗原(例如，病毒抗原)的细胞的细胞毒性应答的能力是特别地有用的。因此，该方法对于评价个体针对癌症或病原体生物体发动免疫应答的能力是有用的。
本发明还预期了根据本发明的教导使用IFN治疗，以增强检测细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)介导的靶细胞裂解的灵敏度。因此，靶细胞的IFN处理可以有利地用于开发具有改进的灵敏度的测定，以用于检测针对该靶细胞的免疫应答，特别地是CTL应答，且更特别地是CD8+CTL应答。
7.试剂盒
本文描述的任何组合物或组分可以被包含在试剂盒中。在非限制性实例中，检测和确定本文描述的一种或更多种糖蛋白物类(glycospecies)生物标志物的水平所需的材料和试剂可以被一起组装在试剂盒中。试剂盒还可以任选地包括用于检测标记物的适当的试剂、阳性和阴性对照，洗涤溶液，印迹膜，微量滴定板、稀释缓冲剂等。
因此，试剂盒将在合适的容器装置中包含凝集素结合免疫吸附测定，可以包括对待检测的糖蛋白物类生物标志物特异性的凝集素、对糖蛋白物类生物标志物特异性的抗体(即，对糖基化的多肽骨架特异性)和任选地可以用作阳性对照的糖蛋白物类生物标志物。还可以包括缓冲液、洗涤溶液或封闭试剂，以及用于检测标记物的酶和/或底物。试剂盒还可设有用于进行本文描述的测定中的一个的多种装置和试剂，和/或用于使用试剂盒确定糖蛋白物类生物标志物水平的印刷的说明。
试剂盒的组分可以以水性介质或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常将包括组分可以被放置，并且优选地合适地被等分到其中的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置。在试剂盒中存在多于一种的组分(标记试剂和标记物可以被包装在一起)的情况下，试剂盒通常还将包含另外的组分可以被单独地放置到其中的第二、第三或其他另外的容器。然而，组分的多种组合可以被包括在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳核酸的装置，以及用于商业销售的处于紧密密封(close confinement)的任何其他试剂容器。此类容器可以包括将期望的小瓶保持在其中的注射或吹塑塑料容器。
当试剂盒的组分以一种和/或更多种液体溶液来提供时，液体溶液为水溶液，其中无菌水溶液为特别优选的。
然而，试剂盒的组分可以以干燥粉末来提供。当试剂和/或组分作为干燥粉末来提供时，粉末可以通过添加合适的溶剂来重构。可设想，溶剂也可以被提供于另外的容器装置中。在一些实施方案中，标记染料作为干燥粉末来提供。预期的是，在本发明的试剂盒中提供了10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、120μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1000μg或至少或至多那些量的干燥染料。然后可以将染料重悬于任何合适的溶剂诸如DMSO中。
容器装置通常将包括核酸制剂被放置，优选地合适地被分配到其中的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置。试剂盒还可以包含用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器装置。
本发明的试剂盒通常还将包含用于商业销售的处于紧密密封(closeconfinement)的用于容纳小瓶工具，例如将期望的小瓶保持在其中的注射和/或吹塑塑料容器。
试剂盒通常还将包括用于采用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其他试剂的说明。说明可以包括可以被实施的变化形式。
试剂盒可以包含辅助进行本发明的方法的另外的组分，诸如，例如，实施装置、缓冲液和/或稀释剂。试剂盒可以包括用于容纳多种组分的容器和用于在本发明的方法中使用试剂盒组分的说明。
为了本发明可以容易地被理解并付诸实践，现在将以以下非限制性实施例的方式描述特定的优选实施方案。
实施例
实施例1
三种高度免疫原性的疫苗细胞系的开发
B16-F10/4-1BBL细胞的产生
在开发pEFIRES-Puro/4-1BBL载体和pEF-MC1neoN9/B7.1表达构建体之后，将它们转染到B16-F10细胞中。尽管在抗生素选择期间观察到转染效率和耐受性为非常有效的，但转染的细胞使用BD FACSAria来分选以进一步增加表达水平并消除较弱地表达的细胞。在细胞分选之后，收集前2％的高度表达的细胞，并将其在嘌呤霉素的存在下培养。转染的细胞用PE-缀合的抗小鼠4-1BBL抗体(Ab)的抗体染色表明，pEFIRES-Puro/4-1BBL构建体上调可通过Ab结合检测的细胞表面上完整的4-1BBL分子。AB也被用于染色未转染的B16-F10细胞，这揭示了与背景相比，野生型细胞已经表达了低水平的该分子。根据每一个条带图的平均荧光强度(MFI)，计算来自每一个条带图的倍数增加(参见，表2)。
表2
为了进一步测试在B16-F10/4-1BBL细胞上表达的4-1BBL是完整的和有功能的，进行了另外的测定以确定细胞上的4-1BBL与其受体4-1BB的结合。这通过以下进行：将转染的或野生型B16-F10细胞两者与或不与4-1BB/TNFRSF9/Fc嵌合体一起孵育，并且然后使用PE缀合的IgG FcγAb用于使用流式细胞术检测嵌合4-1BB。测定的结果示于图2中。
图2中的红色和紫色条带图表明，IgG FcγPE第二Ab染色不展示任何背景结合或与细胞上的其他分子的交叉反应。可以得出这一结论是因为，第二Ab对照样品和两个未染色的对照样品之间的条带图谱不存在差异(图2)。然而，与4-1BB/TNFRSF9/Fc嵌合体孵育并用IgG FcγPE第二Ab染色的B16-F10野生型细胞检测到低水平的4-1BBL表达的存在，表明这些细胞在转染之前已经表达了一些功能性4-1BBL，与表2中的结果一致。来自4-1BB与4-1BBL结合的PE缀合的抗小鼠4-1BBL Ab以及4-1BB/TNFRSF9/Fc嵌合体/IgG FcγPE第二Ab的结果，提供了用编码鼠(murine)4-1BBL cDNA的载体转染的细胞有效表达功能性细胞表面4-1BBL分子的证据支持。
B16-F10/B7.1细胞和B16-F10/4-1BBL/B7.1细胞的产生
与pEFIRES-Puro/4-1BBL载体不同，pEF-MC1neoN9/B7.1载体被证明难以转染到B16-F10细胞中。用于转染B16-F10和B16-F10/4-1BBL细胞的最有效的试剂为与Plus试剂组合使用的Lipofectamine LTX。转染效率比用pEFIRES-Puro/4-1BBL载体的低得多，因此需要另外轮的细胞分选来选择稳定的、高度表达B7.1的细胞系。用pEF-MC1neoN9/B7.1载体转染的B16-F10细胞被重新命名为B16-F10/B7.1，并且转染的B16-F10/4-1BBL细胞被重新命名为B16-F10/4-1BBL-B7.1。使B16-F10/B7.1细胞在BD FACSAria上经历三轮分选和选择，并且B16-F10/4-1BBL/B7.1细胞通过五轮重复进行类似地分选，以确保均匀、高度稳定表达的细胞系。在每一轮分选中收集两种细胞系的前1％-5％的表达细胞，并且随后通过与所需的抗生素一起培养来扩增。B16-F10/B7.1细胞分选结果示于图3A和表3中。在每一次分选之后，培养并扩增细胞直至存在可以在BD FACSCalibur上进行分析的充足细胞，以使用PE缀合的抗小鼠CD80Ab评价B7.1表达的效率和稳定性。
表3
对B16-F10/B7.1细胞进行的分选在第一次分选之后将总体B7.1表达增加至为未转染的亲本细胞的13倍，以及为转染但未分选的细胞上的B7.1表达的3倍。在第三轮分选之后，B7.1表达水平被增加至同种型对照或未转染的细胞群体的24倍。尽管该细胞上B7.1的表达比野生型细胞上的大得多，但甚至在暴露于高浓度抗生素选择之后，群体仍然不能稳定表达基因。开发更稳定的细胞系的下一阶段包括个体B16-F10/B7.1细胞的克隆衍生(clonal derivation)。从第三轮分选中收集的三个克隆存活并经历单细胞克隆，并被扩增，使得它们的B7.1表达水平可以在BD FACSCalibur上被分析(图3B)。
克隆选择B16-F10-B7.1细胞没有进一步增加B7.1表达水平，如通过图3B中的条带图示出的。然而，在对这些克隆的细胞经过数周的继代培养和传代之后，确定了与未进行克隆分选的亲本细胞群体相比，B7.1的水平显示出少得多的变化。因此，克隆分选B16-F10-B7.1细胞产生更稳定的表达群体。因此，将相同的分选程序也应用于B16-F10-4-1BBL-B7.1细胞。在分选之前和在5轮分选后的扩增之后的B16-F10-4-1BBL-B7.1细胞示于表8中。
实施例概述
总之，成功地产生了稳定表达4-1BBL、B7.1或4-1BBL和B7.1两者的三种疫苗细胞系。衍生得到适当的细胞系并对其进行选择用于在攻击实验中使用，并且使用荧光染料SYTOX Green开发了新的CTL测定方案。在细胞和程序优化之后，合适地准备三种疫苗细胞系以用于施用至C57BL/6小鼠。
材料和方法
4-1BBL构建体的产生
为了开发高表达、稳定转染的细胞系，首先产生编码4-1BBL以及嘌呤霉素耐受性基因的载体构建体。包含被克隆到pcDNA3载体中的鼠4-1BBL cDNA的载体被用作起始点。然而，为了与实验154设计相兼容，需要用于选择4-1BBL(嘌呤霉素)和B7.1(新霉素)表达载体中的每一种的独特耐受性基因。
开发了两种引物，其位于4-1BBL cDNA的任一末端的侧翼。正向引物(5'-CTCGAATTCGGTAATGGACCAGCACA-3')被工程化为包含EcoRI限制性内切酶位点(加下划线的)，且反向引物(5'-GACAACCCATGGGAATGATGTACAGG-3')已经包含XbaI限制性内切酶位点。使用两种新设计的引物对包含全长鼠4-1BBL cDNA的pcDNA3构建体进行高保真PCR反应，并且经由琼脂糖凝胶电泳分离产物。在检查琼脂糖凝胶之后，观察到分离产物的尺寸为约1kb，这密切对应于950bp长度的4-1BBL mRNA，如从NCBI公布的基因序列(登录号NM_009404)确定的。在PCR反应后，DNA使用试剂盒来提取，并然后被连接到pGEM-T Easy载体中。
在纯化4-1BBL PCR产物并使用DyNAzyme II DNA聚合酶加A尾后，进行产物与pGEM-T载体的连接反应，随后将连接反应物转化到感受态DH5α细菌中。为了证实4-1BBL成功连接到pGEM-T中，从氨苄青霉素琼脂平板上选择十个白色菌落，将其在培养物中扩增，并且使用Mini-Prep试剂盒来提取质粒DNA。然后使用EcoRI和XbaI对所有十个DNA样品进行双重消化。将几个对照用于确定：首先，当DNA用每一个单酶单独切割时以及当一起使用多次切割时两种酶均起作用，并且其次，确定两种酶是否会释放出长度为950bp的正确尺寸的4-1BBL片段。pUC18载体包含EcoRI和XbaI限制性内切酶位点两者，并用作消化的对照载体。将疑似包含连接的4-1BBL片段的双重消化的pGEM-T载体和消化的pUC18载体在琼脂糖凝胶上电泳(图1A)。所有十个双重消化的克隆释放出尺寸为约1kb的DNA片段。这表明，连接反应成功地将4-1BBL连接到pGEM-T载体中。在泳道14中装载的克隆9的双重消化的DNA表现为具有在3kb和2kb条带之间存在的另一个模糊的条带，因此为了预防措施，克隆9未被用于进一步的实验。
将包含4-1BBL cDNA的pGEM-T载体和pEFIRES-Puro载体用XbaI和EcoRI消化。消化产生了预测的950kb 4-1BBL片段和5689kb pEFIRES-Puro载体片段。使用试剂盒从琼脂糖凝胶中提取4-1BBL和pEFIRES-Puro片段，纯化并连接在一起。然后将连接反应的产物转化到感受态DH5α中。挑取在氨苄青霉素琼脂板上生长的菌落，并且使用Mini-Prep试剂盒提取DNA。来自每一个克隆的DNA用EcoRI切割，以使DNA线性化并装载到琼脂糖凝胶上(图1B)。对应于克隆3、7和8的泳道6、10和11中的条带都表现为与被装载到泳道3中的从双重消化的pEFIRES-Puro产生的骨架载体尺寸相似。由克隆5、9和10(泳道8、12和13)产生的条带比由泳道3中双重消化的pEFIRES-Puro样品产生的5689bp条带迁移慢，表明它们各自包含可能的插入片段。
为了进一步测试具有包含4-1BBL插入片段的pEFIRES-Puro载体的克隆，对图1B中鉴定为潜在候选物的克隆5、9和10进行了另外的限制性分析。然而，这次选择限制性内切酶EcoRI和SacI，因为根据载体图谱，这两个位点仅存在于4-1BBL序列内，其中这两个位点间隔约500bp。因此，如果这两种酶能够切割任何DNA样品以仅释放出500bp的片段，这将有助于证实pEFIRES-Puro载体中4-1BBL插入片段的存在。进行双重消化并将样品装载在琼脂糖凝胶上(图1C)。克隆5、9和10(来自图1B中的泳道8、12和13)均显示出长度为约500bp的片段，如在图1C中的泳道7、10和13中检测到的。因此，非常可能的是，所有三个克隆包含正确插入到pEFIRES-Puro载体中的4-1BBL cDNA。
实施例2
由在B7.1和4-1BBL共刺激物表达方面不同的全细胞疫苗诱导的T细胞免疫应答
研究了被工程化为表达关键的免疫共刺激分子4-1BBL、B7.1或两者的组合的三种不同的全细胞黑素瘤疫苗的效力。将小鼠用三种经辐照的细胞疫苗系的一种接种疫苗，并与未接种疫苗的对照小鼠一起进行大量实验以评价不同疫苗的效力。
在接受两个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1-IFNγ/β全细胞疫苗的小鼠中产生了增 加的CD8+ T细胞应答。
将C57BL/6小鼠用在前一实施例中描述的三种不同的经辐照的全细胞黑素瘤疫苗(B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β；B16-F10/B7.1/IFNγ/β；或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β)中的一种接种疫苗。比较三种疫苗的目的首先为确立三种疫苗中具体哪一种将产生最强的抗癌免疫应答。其次，目的为确定当与国际专利申请公布第WO2005/037293号中首次描述的B16-F10/B7.1疫苗相比时，较强的T细胞应答是否响应于配制在疫苗中的细胞的细胞表面上呈递的单独的4-1BBL或4-1BBL与B7.1的组合的存在而产生。
初始研究使用初免/加强接种疫苗方案，其包括将首次用于实验的小鼠经过7天间隔接种疫苗两次，然后将小鼠在加强注射之后4天处死以用于随后的免疫分析。详细说明接种疫苗何时被履行的时间线示于图4A中。在第11天，收获小鼠。从所有小鼠分别收集脾、血液和淋巴结。将脾称重并且被比较，作为免疫反应是否发生的基础指示物(图4B)。接下来，细胞制备物(preparation)被分析，并且T细胞数目通过流式细胞术来确定(图5)。
脾重量的分析显示，组间差异是不显著的(p＝0.1)。然而，对照脾和用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗注射的小鼠之间存在显著差异，用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗注射的小鼠的脾重量显著增加(p<0.05)。尽管对于所测试的其他疫苗并不显著，但与对照小鼠相比，脾平均重量存在增加的趋势。
T细胞亚群％的分析显示，与对照小鼠或来自其他接种疫苗的组的脾相比，在来自给予B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的小鼠的脾中，CD4+脾群体无变化，而CD8+ T细胞％增加(p<0.005，事后检验；图5A)。血液内的CD8+ T细胞％的分析也显示了相似的显著增加，以及揭示了与B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠相比，在B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠中显著增加的CD8+ T细胞％(p＝0.036)，如图5B中示出的。当进行事后检验时发现，用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗处理的小鼠的血液中的CD8+ T细胞％显著大于对照小鼠或用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β疫苗处理的那些小鼠(分别为p＝0.007和p＝0.0008，图5B)。与所有其他组相比，在来自B16-F10-4-1BBL-IFNγ/β疫苗处理的小鼠的外周血淋巴细胞(PBL)中检测到CD4+和CD8+ T细胞两者水平的减少(图5B)。然而，与对照小鼠或B16-F10/B7.1/IFNγ/β疫苗处理的小鼠相比，在B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β疫苗处理的小鼠中仅PBL CD4+ T细胞水平被显著降低(p<0.05；图5B)。图5C显示在所有处理组之间的CD4+和CD8+ T细胞％仅有较小差异。
用癌症疫苗细胞抗原性刺激的脾MLC中增强的CD8+ T细胞群体。
先前的实验确定，与所有其他组相比，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来源的CD8+ T细胞被大大增加。因此，设想这些淋巴细胞群体可以在混合淋巴细胞培养物(MLC)中扩增3至5天，并且然后分析抗原性刺激的CD4+和CD8+ T细胞数目的变化(图6)。
特别地注意到在具有癌细胞作为刺激物的三至五天MLC中扩增的CD8+ T细胞群体中的显著差异，如图6中示出的(p<0.0001)。还观察到CD4+ T细胞％中的差异，尽管这些差异不如在CD8+ T细胞数目中检测到的增加那样明显。MLC中增加的CD8+ T细胞群体与先前的结果(图5)一致，其中直接分析脾和PBL群体以确定它们的T细胞水平。来自所有接种疫苗的小鼠的MLC的CD8+ T细胞％显著大于从对照小鼠获得的那些。具体地，在MLC中培养之后，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞比对照或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞产生显著更大的CD8+ T细胞％(分别为p<0.0001和0.001)。这些结果表明，显著活化的效应物CD8+CTL可以在用合适的癌症疫苗免疫的小鼠的脾中被产生。
响应于抗癌疫苗被诱导的MLC来源的CD8+ T细胞的活化状态的表征。
已知活化的、抗原特异性CD8+ T细胞表达IFNγ和CD107a，如由Betts等(2003)描述的。因此，使用流式细胞术分析在MLC中生长五天的脾来源的淋巴细胞，以确定其活化的、CD8+效应物T细胞％(图7)。这要求根据CD8的表达对淋巴细胞进行进一步门控，并且然后确定同时表达表面标志物CD107a和细胞内细胞因子IFNγ的CD8+ T细胞％。
ANOVA比较活化的T细胞％发现为非常显著的(p<0.005)。图6B显示，当与所有其他组相比时，来自用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞在MLC中生长五天之后产生显著更高的活化的CD8+ T细胞％(p<0.05)。此外，与对照(p＝0.0009)和B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠相比，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠在MLC中产生多于七倍的活化的CD8+ T细胞％(p＝0.0008)，并且活化的CD8+ T细胞的数目是来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的多于两倍(p＝0.014)。已经分析了来自所有组小鼠的多种免疫器官的T细胞群体，下一阶段为评价淋巴细胞的细胞毒性活性。
从接受两个疫苗剂量的抗癌疫苗的小鼠的淋巴结中分离的淋巴细胞的低细胞毒 性活性。
在评价从对照和接种疫苗的小鼠采集的样品中发现的不同的T细胞群体％之后，重要的是确定处理组之间的T细胞群体中的差异是否会转化为在细胞毒性T细胞测定中杀伤黑素瘤细胞。在收获当天使用从淋巴结分离的淋巴细胞进行CTL测定(图7)。
分析确定，在来自四个处理组中任一组的淋巴结来源的淋巴细胞产生的细胞死亡的比例中不存在显著差异(p＝0.488；图7)。该分析证实了图5C中呈现的结果，其确定了与任何接种疫苗的组相比，在对照小鼠的淋巴结中发现的相对CD8+ T细胞％中不存在显著差异。
由在MLC中扩增的来自接受两个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β抗癌疫苗 的小鼠的脾来源的淋巴细胞增加的CTL杀伤。
在评价来自淋巴结的淋巴细胞的细胞毒性能力之后，接下来，将脾淋巴细胞群体在MLC中扩增五天，并且然后评价以确认它们的细胞毒性活性(图8)。鉴于先前的结果(图5B和6)显示在MLC中仅来自接种疫苗的小鼠，特别是给予B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的那些小鼠的增加的CD8+ T细胞％，预期更大的CTL活性也可以被诱导。
包含来自对照或B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的那些MLC包含具有橙色着色的色调的培养基(数据未示出)，表明高水平的细胞代谢活性，从而降低培养基的pH(Gerweck 1977,Welshons等1988)。相比之下，包含来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的MLC包含具有较为微红色素的培养基，表明培养物中存在较高的pH和较低水平的代谢活性(数据未示出)。这些结果揭示，颜色变化可以用作MLC中发生的事件的早期指示，因为当通过倒置显微术进一步研究时，发现在包含来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的MLC中的大部分抗原刺激物(黑素瘤细胞)与平板表面脱离并且表现为已经死亡，如在图8C和D中突出的。除了活的淋巴细胞以外，所有6孔板均包含B16-F10/B7.1抗原刺激物细胞(丝裂霉素C处理以抑制细胞增殖)。尽管肿瘤细胞没有活跃地生长或分裂，这两种类型的细胞代谢培养基。这些观察结果表明，MLC孔中的肿瘤细胞可能是利用培养基用于其代谢的主要细胞组分。这一发现表明，来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞最可能是能够在培养的五天内活跃地杀伤抗原刺激物细胞的高度活跃的CTL，使得这些孔中代谢培养基的活的肿瘤细胞的数目大大被降低，具有在这些MLC中的培养基的较不显著的颜色变化(数据未显示)。
在注意到这些初始观察结果之后，将淋巴细胞随后从MLC中取出并制备用于在CTL测定中使用，并且记录来自CTL测定板中的孔的代表性绿色(死亡的细胞)和红色(预染色的黑素瘤细胞)荧光图像(图9和10)。
在CTL测定分析期间，对于CTL测定中的特定孔，拍摄了明视野、红色荧光(DiI)和绿色荧光图像(SYTOX Green)(图9)。来自所有4个CTL测定的用DiI染色的单独的100％活的靶细胞的明视野和红色荧光图像显示，尽管靶癌细胞建立为接近汇合的单层，但在该群体中非常少的死亡的细胞通过被摄取到细胞核中的SYTOX染料的绿色荧光图像被检测到。该结果表明，单独的靶细胞主要是健康的活的群体，并且因此不会显著促进由于受损或濒死的靶细胞产生的背景信号。然而，靶细胞被MLC来源的淋巴细胞有效地杀伤，如图像的底行示出的(标记为“CTL测定中的效应物+靶”，图9)。100％死亡的靶细胞(通过添加0.4％NP9去垢剂诱导)的对照孔显示当整个靶细胞群体被杀伤时的可能的最大荧光。
在单独的“100％活的效应物细胞”群体中检测到的绿色荧光被用作细胞死亡的基础水平，当图像使用分光光度计定量时将其从与靶细胞组合的淋巴细胞(标记为“CTL测定中的效应物+靶”)的绿色荧光值中减去。在包含单独的100％活的效应物淋巴细胞的孔中可检测到的小比例的细胞死亡表明，它们主要包含健康细胞，并且仅少数淋巴细胞在MLC的处理和制备期间濒死。此外，非常可能的是，在包含单独的100％活的效应物淋巴细胞的孔中观察到的细胞死亡可能是由MLC携带的抗原刺激物靶细胞碎片的结果，其中观察到抗原刺激物靶细胞正在经历凋亡；特别是在包含更强效疫苗的MLC中(图8)。
以上描述的死亡的细胞材料的碎片具有与淋巴细胞相似的尺寸，这使得甚至当使用FICOLL-PAQUETM PLUS或其他分离技术时，其分离和去除也非常困难。尽管如此，即使具有该基线水平的死亡细胞，对于所有四种CTL测定，在包含效应物和靶细胞的组合的那些孔中检测到显著增加的绿色荧光水平。同样，在这些孔中检测到不同水平的细胞死亡，并且与掺入来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的效应物的其他测试反应物相比，对照效应物和靶的反应物显示出最低水平的绿色荧光(图9)。来自MLC的细胞培养基的照片结果支持通过分光光度法定量的CTL数据，如图10中示出的。
图10中示出的数据的分析揭示，接种疫苗对增加CTL活性存在非常显著的作用(p<0.0001)。然后将事后检验用于确定CTL测定中细胞死亡的比例，并且显示，来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞比所有其他CTL测定中的那些显著更有活性(p<0.005)。类似地，来自使用来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定的细胞死亡的比例也与所有其他CTL测定显著不同(p<0.005)。该分析还确定，在用来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定中发现细胞死亡关于比值(ratio)的最高变化率(rate)，随后是来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β、B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞，且最小活性为来源于对照小鼠的淋巴细胞。该统计分析证实了图10中示出的结果。此外，与来自未接种疫苗的对照小鼠的淋巴细胞相比，使用来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定中的细胞死亡的比例的相对倍数增加为5.7，如表4中示出的。另外，显示在由来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞诱导的癌症(靶)细胞杀伤方面的高于使用来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β和B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的组合结果的约两倍的协同增加(表4)。
表4
1值从图10中的点得到，图在所述点处截取出＝产生30％靶细胞裂解的效应物细胞的数目(x 104)的1个裂解单位的线。
2结果相对于未接种疫苗的对照小鼠的CTL应答(被分配值1)来确定。
在接受4个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β全细胞抗癌疫苗的小鼠中产生 了高度升高的CD8+ T细胞应答。
如以上描述的，该研究中利用的初始接种疫苗方案包括初免/加强策略。进行了具有另外的两个更为加强的注射的可选的接种疫苗方案(“接种疫苗方案2”)，其目的为进一步增强抗癌免疫应答。因此，对于接种疫苗方案2，首次用于实验的小鼠接受两个剂量(剂量之间通过七天的间隔分开)的疫苗(使用初免/加强策略)，随后是用于小鼠休息的二十七天的时间段，然后施用另外两个加强注射(由四天的间隔分开)。然后在最后一次注射之后四天将小鼠处死。在收获当天(第42天)，从所有小鼠分别收集脾、血液和淋巴结，并且测定免疫应答。显示小鼠根据方案2被接种疫苗的天数的时间线示于图11A)中。将脾称重(图11B)，并且然后对来自脾、血液和淋巴结的细胞制备物进行分析，并且T细胞数目通过流式细胞术来确定(图12)。
当比较处理组时，观察到脾重量的显著差异(p＝0.002)。经由事后检验的进一步分析确定，与对照小鼠相比，来自所有三组接种疫苗的小鼠的脾的平均重量显著较重，如图11B中示出的。确定了在B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(平均值＝111.8mg)和对照小鼠(平均值＝84.3mg)之间的脾重量的高度显著差异(p<0.005)。此外，当比较来自任何接种疫苗的小鼠组间的脾重量时，未观察到差异。
从图12A和B中明显的是，与所有其他处理组相比，在B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾和血液中产生显著更高的CD8+ T细胞％(对于两者，p<0.005)。此外，事后检验确定，与对照相比(p<0.0001)、与B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠相比(p<0.0001)以及与B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠相比(p<0.0001)，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾具有显著更高的CD8+ T细胞％。从分析脾得到的这些结果与血液中检测到的CD8+ T细胞％的变化非常相似。因此，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠比所有其他组具有显著更高的PBL样品中的CD8+ T细胞％(p<0.0001)。未检测到处理组之间的脾、血液或淋巴结样品中的CD4+ T细胞％的差异。此外，在任一测试组之间的淋巴结中产生的CD8+ T细胞％不存在差异。
用癌症疫苗细胞进行抗原性刺激的脾MLC中增加的CD8+ T细胞群体。
鉴于这些结果，下一阶段为通过流式细胞术分析脾来源的CD4+和CD8+ T细胞群体在MLC中被抗原性刺激3至5天之后的变化，如图13A中示出的。
注意到在MLC中扩增的脾来源的T细胞群体中的显著差异，特别地在MLC中扩增三至五天的CD8+ T细胞群体中的显著差异，其中癌细胞用作抗原性刺激物(p<0.0001)。相比之下，未记录到CD4+ T细胞％中的差异。脾来源的MLC中增加的CD8+ T细胞群体与分析从接种疫苗的小鼠直接收获的脾和PBL水平两者的先前的结果(图12)一致。来自所有接种疫苗的小鼠的MLC的CD8+ T细胞％显著大于从对照小鼠分离的那些CD8+ T细胞％。具体地，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞产生比对照(p<0.0001)、B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.034)以及B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p<0.0001)显著更高的CD8+ T细胞％。这些结果进一步支持以上描述的部分中的发现结果：显著的效应物CD8+CTL在用癌症疫苗免疫的小鼠的脾中产生并扩增。
响应于癌症疫苗被诱导的MLC来源的CD8+ T细胞的活化状态的表征。
如以上研究中描述的，在培养物中五天之后对MLC脾来源的淋巴细胞进行CD4+和CD8+分析后，下一阶段为通过经由流式细胞术检测CD107a的存在和IFNγ的细胞内水平来评价CD8+ T细胞的活化状态(图13B)。
组间分析比较活化的CD8+ T细胞％发现为非常显著的(p<0.005)。图13B指示，来自对照组和B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的MLC来源的淋巴细胞之间的活化的CD8+ T细胞％不存在差异。相比之下，与对照(p<0.0001)、B16-F10/4-1BB/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p<0.0001)和B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.004)相比，来自用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞在MLC中生长五天之后产生显著更高的活化的CD8+ T细胞％。此外，从B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的MLC产生的约75％的CD8+ T细胞被活化，这是从对照小鼠获得的数目的约107倍，且是来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的活化的CD8+ T细胞的数目的1.7倍。
与对照小鼠相比，来自给予四个疫苗剂量的小鼠的淋巴结来源的淋巴细胞的细胞 毒性潜力无差异。
在分析来自对照和接种疫苗的小鼠的多种样品的T细胞群体之后，如先前描述的，将在收获当天收集的淋巴结来源的淋巴细胞在CTL测定中进行测定以确定其杀伤黑素瘤细胞的细胞毒性能力。
图13C中示出的数据的一般线性模型分析指示，四组中任何组之间的淋巴结来源的淋巴细胞产生的细胞死亡比例中不存在显著差异(p＝0.145)。该分析支持图12C中呈现的结果，其得出结论，在来自四个处理组中任何组的淋巴结中未检测到CD8+ T细胞群体的相对百分比中的显著差异(图13C)。
与对照小鼠相比，在来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来 源的淋巴细胞中检测到低水平的细胞毒性。
对在收获的当天测定的来自首次用于实验的对照小鼠和接受四个剂量的疫苗的小鼠的脾淋巴细胞的细胞毒性活性进行分析以确定其在CTL测定中杀伤作为靶的黑素瘤细胞的能力(图13D)。该实验的目的为确定在收获当天直接分析的脾来源的淋巴细胞是否会比淋巴结来源的淋巴细胞产生更强的CTL杀伤。预期脾来源的淋巴细胞，特别是来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞将比淋巴结来源的淋巴细胞表现出更大的CTL活性，这是由于在收获当天在这些小鼠的脾中检测到显著更高的CD8+T细胞％，如图12中示出的。
全局F检验分析确定，在收获当天，由脾来源的淋巴细胞产生的处理组之间细胞死亡比例中存在显著差异(p<0.0001)。随后，事后检验显示，来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞比其他CTL测定中的那些淋巴细胞显著更有活性(p<0.005)。此外，与来自未接种疫苗的对照小鼠的淋巴细胞相比，使用来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞观察到肿瘤(靶)细胞杀伤的两倍相对增加，如表5中示出的。该分析还确定，基于表5中计算出的比值，CTL活性的最大增加通过来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞产生，随后是来自B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠、B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的那些淋巴细胞，且最小活性为来自对照小鼠的那些淋巴细胞。这些结果由图12A中呈现的数据支持，其中来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞显示出最大的CD8+ T细胞％。这些发现指示，这些CD8+ T细胞的一部分已经被抗原性刺激，允许在CTL测定中检测到有效和直接的癌细胞杀伤，而无需在测定之前在MLC中扩增。
表5
1值从图13D中的点得到，该图在所述点处截取出＝产生30％靶细胞裂解的效应物细胞的数目(x 104)的1个裂解单位的线。
2结果相对于未接种疫苗的对照小鼠的CTL应答(被分配值1)来确定。
因此，由于在收获当天来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β的脾来源的淋巴细胞展示出超过来自所测试的所有其他组的淋巴细胞的最大的CTL活性(图13D)，下一阶段为确定脾来源的淋巴细胞对活的癌细胞的细胞毒性活性是否可以通过将其在MLC中扩增5天通过抗原性刺激被增强。基于先前实验中的高度升高和活化的CD8+ T细胞群体的检测水平，预期MLC来源的脾淋巴细胞，特别是来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的MLC来源的脾淋巴细胞可以显示出升高的CTL活性(图13A-B)。记录MLC平板(数据未示出)以及混合细胞群体的代表性分析，然后在CTL测定中分析淋巴细胞。
在组织培养基中观察到的颜色变化与以上描述的非常相似。在包含来自对照或B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞的MLC孔中的培养基显示分别包含具有黄色或橙色色素的培养基。如先前解释的，这种颜色指示较低的pH和较高的细胞代谢活性。相比之下，包含来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的MLC孔被观察到包含具有较为微红色素的培养基，基于先前实验中的高度升高和活化的CD8+ T细胞群体的检测水平，这指示较高的pH和较低的细胞代谢活性。存在于图14中示出的MLC孔中的活的代谢细胞的数目直接对应于孔中组织培养基的颜色。所有的孔用相同数目的肿瘤饲养细胞和淋巴细胞接种。然而，从目视检查明显的是，来源于B16-F10/B7.1/IFNα/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNα/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞已经杀伤了高百分比的肿瘤抗原性刺激物细胞(图14C和D)。结果，这些孔中存在较少活的细胞来代谢组织培养基，并且培养基保留了红色色素，如先前描述的。下一阶段为在CTL测定中定量来自这些MLC的淋巴细胞的细胞毒性活性。
图15突出了与图9中记录的相似的观察结果。单独的100％活的靶黑素瘤细胞的明视野和红色荧光(DiI染色)图像显示，癌细胞建立为接近汇合单层，而绿色荧光(SYTOXGreen染色)图像指示在相同群体中的低水平的死亡。与包含单独的活的效应物细胞的孔相比，包含SYTOX Green染色的效应物加靶细胞的孔显示包含更高数目的已经摄取绿色核染色染料的细胞。这一观察结果指示，在效应物加靶的孔中的一部分靶癌细胞在四小时CTL测定的过程期间被淋巴细胞直接杀伤。
一般线性模型分析确定，图16A中示出的所有组之间存在非常显著的差异(p<0.0001)。事后检验揭示，与测试的所有其他CTL测定相比，来自使用来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定的细胞死亡的比例显著增加(p<0.0001)。细胞死亡相对于比值的变化率的等级次序显示，具有来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定提供了最大增加的细胞死亡/单位比值增加。相对于增加的比值的次高变化率由B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠展示，并且对照小鼠显示出最低水平的细胞死亡。表6展示了在使用来源于多种接种疫苗的小鼠的淋巴细胞的CTL测定中观察到的细胞死亡比例的相对倍数增加。与来自对照小鼠的淋巴细胞相比，用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗注射的小鼠展示出裂解单位/效应物细胞群体的11.1倍的增加。来源于B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞各自显示出相对于对照约4倍的细胞毒性活性增加。重要地，从这些结果可以得出结论，在IFNγ/β处理的B16-F10/4-1BBL/B7.1细胞上共表达4-1BBL和B7.1分子对细胞毒性活性产生协同作用，其中观察到的裂解单位/效应物细胞群体相对于对照的11.1倍增加，大于将单独的B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的值加到一起得到的由淋巴细胞引发的细胞毒性潜力的倍数增加的总和。因此，发现最有活性的淋巴细胞为来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞，这证实并支持图13A和B中示出的结果。
表6
1值从图16中的点得到，该图在所述点处截取出＝产生30％靶细胞裂解的效应物细胞的数目(x 104)的1个裂解单位的线。
2结果相对于未接种疫苗的对照小鼠的CTL应答(被分配值1)来确定。
实施例3
对小鼠中CD8+ T细胞应答的接种疫苗方案的比较
在先前的实施例中，当小鼠根据接种疫苗方案1或2被注射时比较了首次用于实验的或抗癌接种疫苗的小鼠中的CD4+和CD8+ T细胞群体％(如实施例2中描述的)。该实施例聚焦于比较用两个剂量(即，方案1)或四个剂量(即，方案2)的在MLC中扩增五天之后的相同疫苗细胞注射的小鼠中产生的T细胞应答。
在接受B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β抗癌疫苗的小鼠中的接种疫苗方案1和方案2之间进行比较，记录到了在MLC中扩增的CD4+ T细胞群体％中的显著差异(图16B)。在两组处理小鼠中，观察到根据方案2接种疫苗的那些小鼠比使用方案1接受相同疫苗的小鼠具有显著更低的CD4+ T细胞％。在来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的MLC淋巴细胞中检测到最大的差异，因为与用方案1注射的小鼠相比，根据方案2注射的小鼠产生显著更低的CD4+ T细胞％(p<0.0001)。相比之下，与遵循方案1给予B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗的那些小鼠相比，来自根据方案2用相同疫苗处理的小鼠的MLC来源的淋巴细胞产生显著升高的CD8+ T细胞群体％(p＝0.001；图16C)。结果还显示，来自根据方案2处理的接种疫苗的小鼠的所有组的平均CD8+ T细胞群体％高于来自使用方案1处理的小鼠的平均CD8+ T细胞群体％。在这些研究中，使用方案2通过B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β疫苗观察到的CD8+CTL的轻微增加与方案1的在统计学上不显著。
使用方案2产生的增加比例的活化的CD8+ T细胞
下一目的为比较由来自用方案1或方案2处理的接种疫苗的小鼠的扩增五天的MLC来源的淋巴细胞产生的活化的CD8+ T细胞％。
独立样品t检验比较使用来自B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾来源的淋巴细胞在MLC中产生的活化的CD8+ T细胞％，确定为显著不同的(图17)。遵循方案2用B16-F10/B7.1-IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠与遵循方案1用相同疫苗处理的小鼠相比在MLC中产生多于五倍的活化的CD8+ T细胞％(p＝0.023)。此外，与来自根据方案1处理的类似地接种疫苗的小鼠的MLC中产生的平均为17％的活化的CD8+ T细胞相比，来自遵循方案2用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠的MLC产生平均为74％的活化的CD8+ T细胞(p<0.0001)。这些数据清楚地显示，与方案1接种疫苗的小鼠相比，用接种疫苗方案2处理小鼠显著增强了MLC中产生的活化的CD8+ T细胞群体的比例。
实施例4
接受全细胞疫苗然后用活的肿瘤细胞攻击的小鼠的增加的存活
该研究的下一目的为评价当接种疫苗的小鼠随后用活的黑素瘤细胞攻击时每一种疫苗引发免疫应答的能力。测试预防形式的处理以确定当接种疫苗的小鼠用活的癌细胞攻击时，升高和活化的CD8+ T细胞群体是否能够促进存活，特别是来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的升高和活化的CD8+ T细胞群体(如在先前实施例中确定的)是否能够促进存活，以及疫苗接种是否可以保护小鼠免于发展肿瘤。
用活的癌细胞攻击之后引发的保护性免疫应答。
将小鼠根据方案2(以上描述的)暴露于4个疫苗剂量，然后在用5x105个活的B16-F10/B7.1黑素瘤细胞攻击之后根据存活评价免疫应答。根据图12中示出的结果，预期根据方案2接种疫苗然后用活的癌细胞攻击的小鼠的存活时间长度可以与用接种疫苗方案1处理的小鼠的存活时间长度相似，如果不是相似的，那么则大于用接种疫苗方案1处理的小鼠的存活时间长度(图18A)。该实验以一式两份进行以验证结果。分别持续102天和98天的时间段监测这两个实验中小鼠的存活时间，并将两个实验的结果合并以提供小鼠的总体存活百分比，如图18B和C中示出的。
未接种疫苗的对照小鼠具有25天的中位存活期(median survival)。然而，由于其肿瘤的尺寸，所有对照小鼠到第31天时需要被安乐死。用B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β细胞疫苗处理的60％的小鼠到第35天时死于其肿瘤负荷，且剩余40％保持无肿瘤。尽管如此，与用B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗处理的其他组群相比，该组群存活显著较短的时间长度(p＝0.014)。此外，当将对照小鼠与用B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗处理的小鼠进行比较时，记录到了非常显著的存活差异(p＝0.0003)，其中所有后面提及的接种疫苗的小鼠被完全保护免受用活的肿瘤细胞的攻击。
为了进一步测试存活的接种疫苗的小鼠的抗肿瘤免疫应答，将它们在最初肿瘤攻击后的第94天和第98天用另外的两个剂量的疫苗加强，然后在第102天用5x 105个活的B16-F10/B7.1细胞再次攻击。确定肿瘤生长和存活，如图18C中示出的。未接种疫苗的对照小鼠的中位存活期再次被确定为19天，这与先前的未接种疫苗的对照小鼠组群的中位存活期(25天，图18B)相似。相比之下，所有接种疫苗和再次攻击的小鼠保持完全免疫，被保护免于随后的肿瘤发展。
用B16-F10-B7.1-IFNγ/β细胞疫苗处理然后通过用1x106个活的B16-F10-B7.1细 胞注射进行攻击的小鼠的增加的存活
前一实施例确定，B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗能够产生导致肿瘤细胞排斥的抗肿瘤免疫应答。为了进一步测试进行类似地接种疫苗、但用更大的肿瘤负荷攻击的小鼠中免疫应答的性质，注射两倍数目的活的B16-F10/B7.1细胞(1×106个)，并且监测肿瘤生长(图18C)。鉴于最高活化的CD8+ T细胞群体％在这些小鼠中产生(如由来自图12和13B的结果证明的)，将这些小鼠根据方案2进行处理。
用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞接种疫苗的小鼠比未接种疫苗的对照小鼠存活显著更长的时间(p＝0.0005)，其中50％的接种疫苗的小鼠在活的肿瘤攻击中存活(图18C)。B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠也显示出改进的存活结果，并完全被保护免于肿瘤发展(p＝0.0096)。在这些研究中，在接受两种不同抗癌疫苗的任一种的两组小鼠之间的存活差异未达到统计学显著性。
在用四个剂量的B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β抗癌疫苗处理然后用活的黑素瘤 细胞负荷攻击的小鼠中产生的CD8+ T细胞应答
当接种疫苗的小鼠随后用活的B16-F10细胞攻击时，先前开发的疫苗已经不能预防肿瘤的形成，因为这些活的B16-F10细胞为所有B16-F10变体中最具侵袭性和最快速生长的，如本研究所证实的(图22)。为了进一步测试响应于B16-F10/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗产生的抗肿瘤免疫应答，将接受这些抗癌疫苗中任一种的小鼠用5×105个活的野生型B16-F10细胞攻击(图19)。
在通过用活的野生型B16-F10细胞注射进行攻击之后17天将所有小鼠处死，因为根据动物伦理学指南，肿瘤测量结果已经达到最大允许尺寸。图19A显示，所有小鼠(无论其是否被接种疫苗)均发展肿瘤。分析确定，尽管所有小鼠均发展肿瘤，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠上的肿瘤尺寸显著小于B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.019)或未接种疫苗的对照小鼠(p＝0.002)上的肿瘤。
在记录初始测量结果之后，将肿瘤和脾收获并称重，如图19B和C中示出的。接下来，将脾、血液、淋巴结和肿瘤进行处理并通过流式细胞术分析以确定它们的CD4+和CD8+ T细胞和调节性T细胞群体(图20)。
结果显示任何处理组中的小鼠之间的肿瘤或脾的重量无差异(图19C和D)。然而，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的平均肿瘤重量小于其他组的平均肿瘤重量，与图19A中示出的比较肿瘤的物理尺寸中测量的差异的数据一致。
特别注意到在脾和肿瘤样品中的CD8+ T细胞群体中的显著差异。因此，与对照(p＝0.041)或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.018)相比，在来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾中发现显著更高的CD8+ T细胞％(图20A)。类似地，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的血液中的平均CD8+ T细胞％高于其他两个组，尽管这种增加不是统计学上显著的(图20B)。此外，与未接种疫苗的对照小鼠相比，发现B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠在肿瘤中产生显著更高的CD8+ T细胞％(p＝0.002)，如图20D中示出的。
观察到CD4+和调节性T细胞群体％的仅微小变化。然而，发现B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的血液产生比未接种疫苗的对照小鼠(p＝0.005)或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.006)的血液中的水平轻微更高的调节性T细胞％，如图20B中示出的。
在接受四个剂量的B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β疫苗然后用较低剂量的活的 B16-F10细胞攻击的小鼠的增加的存活。
承接先前包括用活的野生型B16-F10细胞攻击小鼠的实验，下一实验包括比较未接种疫苗的然后通过注射10倍更少的B16-F10细胞(5x 104个B16-F10细胞)攻击的小鼠与接受四个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β抗癌疫苗然后通过注射10倍更少的B16-F10细胞(5x 104个B16-F10细胞)攻击的小鼠中的肿瘤的生长。该实验的目的为确定使用较少数目的活的肿瘤细胞是否对在小鼠需要被安乐死之前小鼠能够存活的时间长度具有影响(图21A)。
在用活的癌细胞攻击之后，在未接种疫苗的对照小鼠与B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠之间的存活时间长度的差异被确定为统计学上显著的(p＝0.0058)。所有未接种疫苗的被攻击的小鼠在用活的肿瘤细胞注射之后21天内不得不被安乐死(图21A)。由于B16-F10细胞系为侵袭性和快速生长的细胞系，与如图19A中示出的已经用10倍更多的B16-F10细胞攻击的对照小鼠在第17天被安乐死相比，这些小鼠仅能够存活另外的四至五天。另外，施用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗的四只小鼠中的一只小鼠产生保护性的抗肿瘤应答，因它未发展肿瘤。此外，发展肿瘤的三只接种疫苗的小鼠在其肿瘤达到最大尺寸并需要被安乐死之前比未接种疫苗的被攻击的小鼠存活平均长另外10天。
实施例5
在接受不同疫苗剂量并且在活的肿瘤攻击之后保持无肿瘤的小鼠中产生的T细胞水平
该实施例承接以上描述并体现于图17B中的实验，其显示，用两个剂量的三种不同抗癌疫苗中的任一种接种疫苗的许多小鼠在用5×105个活的B16-F10/B7.1细胞攻击之后未形成肿瘤。该实施例的目的为分析来自存活小鼠的组织样品中的CD4+和CD8+ T细胞群体，并将记忆T细胞％鉴定为存在于样品中的效应物记忆(TEM)或中枢记忆(TCM)CD8+ T细胞。
给予在用活的肿瘤细胞注射后保持无肿瘤至少112天的接种疫苗的小鼠另外两次加强注射的抗癌细胞疫苗，然后用活的肿瘤细胞负荷再次攻击。未接种疫苗的小鼠也用活的肿瘤细胞攻击或保持未处理。从所有小鼠收集脾并将其称重，如图21B中示出的，然后对血液、脾和淋巴结进行处理并分析CD4+和CD8+ T细胞群体的变化(图22)。同时，通过流式细胞术进一步分析CD8+ T细胞群体以确认记忆T细胞分子CD62L和CCR7的存在或不存在，以鉴定TEM和TCM细胞亚群(图23)。
图21B中脾重量数据分析显示，组之间存在显著差异(p＝0.007)。进一步分析确定，用B16-F10/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗接种疫苗的小鼠比未接种疫苗的对照小鼠(p＝0.004)、用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠(p＝0.002)或用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗处理的小鼠(p＝0.004)具有显著更重的脾。重要地，已经用活的肿瘤细胞注射的未接种疫苗的小鼠为仅有的发展肿瘤的小鼠，如在动物被安乐死当天检测到的。未接种疫苗并被攻击的小鼠发展的肿瘤的平均尺寸为6×4.5mm。先前已经接种疫苗然后用活的黑素瘤细胞攻击的小鼠均没有进行发展肿瘤。
在分析所有处理组中小鼠脾中产生的CD8+ T细胞时，检测到显著的组间变异(p<0.0001；图22A)。事后检验显示，当与所有其他处理组相比时，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾中产生的CD8+T细胞群体％被显著增加。当分析这些B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的血液中的CD8+ T细胞群体％时，得到了同样的观察结果(图22B)。相比之下，当与未接种疫苗的对照小鼠或已经用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠相比时，在所有接种疫苗的小鼠组的淋巴结中观察到较低的CD4+ T细胞群体％(图22C)。
当分析作为CD8+ T细胞群体的亚群的TEM群体时，来自所有接种疫苗的小鼠的脾和血液具有超过未接种疫苗的对照小鼠或用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠的显著升高的群体。此外，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾产生最高的平均TEM细胞群体％，显著大于未接种疫苗的对照小鼠、用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠或B16-F10-B7.1-IFNγ/β接种疫苗的小鼠的平均TEM细胞群体％(图23A)。还发现B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的血液包含最高的TEM细胞群体％，其同样显著大于未接种疫苗的对照小鼠、用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠(p<0.00022)或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的TEM细胞群体％(p＝0.049；图23B)。仅在B16-F10-4/1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴结中发现TCM细胞群体的差异，其中TCM细胞％轻微高于未接种疫苗的对照小鼠的淋巴结中的水平(p＝0.004)(图23C)。
高度升高的CD8+和TEM细胞％在用四个剂量的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β细胞疫苗处理的、在用活的肿瘤细胞攻击之后保持无肿瘤的小鼠中产生。
该部分承接体现于图18中的实施例，其指示用四个剂量的三种疫苗细胞系中任一种接种疫苗(使用接种疫苗方案2)的许多小鼠在用5x 105个活的B16-F10/B7.1细胞在两次不同场合攻击之后未形成肿瘤。因此，小鼠保持无肿瘤至少190天，然后将其随后用另外2个剂量的疫苗加强，并用5x105个活的B16-F10/B7.1细胞再次攻击。在注射活的肿瘤细胞之后6天，从接种疫苗的小鼠和对照小鼠收集脾，并且记录其重量(图24A)。然后从脾、血液和淋巴结纯化淋巴细胞并通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞群体％的任何差异。通过流式细胞术进一步分析CD8+ T细胞群体以确认用于鉴定TEM和TCM细胞亚群的记忆T细胞标志物的存在或不存在。
脾重量分析显示，处理组和对照小鼠之间存在显著差异(p＝0.004；图24A)。确定所有接种疫苗的小鼠比未接种疫苗的对照小鼠具有显著更重的脾。发现B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠具有最重的平均脾重量，其显著重于未接种疫苗的对照小鼠(p＝0.0004)或已经用活的肿瘤细胞注射的未接种疫苗的小鼠(p＝0.024)的平均脾重量。
在处理组之间检测到脾中的CD4+ T细胞群体的显著差异(p＝0.0013；图24B)。显示B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾中产生最低的CD4+ T细胞％，其显著低于对照(p＝0.0034)、用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠(p＝0.0001)或B16-F10/4-1BBL/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的CD4+值(p＝0.022)。此外，发现所有接种疫苗的小鼠的血液和淋巴结中产生的CD4+ T细胞群体％低于未处理的对照小鼠或用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠中产生的水平(图24C和D)。
相比之下，当与所有其他组的小鼠相比时，在B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的脾和血液两者中产生显著升高的CD8+ T细胞群体％(p<0.0027；图24B和C)。另外，所有接种疫苗的小鼠的淋巴结中产生的平均CD8+ T细胞％大于未处理的对照小鼠或用活的肿瘤细胞攻击的未接种疫苗的小鼠的值(图24D)。
分析脾(p<0.0001)、血液(p<0.0001)和淋巴结(p＝0.002)中的TEM细胞确定为在处理组之间显著变化，如图25中示出的。与未处理的对照小鼠相比，在所有接种疫苗的小鼠组的脾和血液中检测到显著更高的TEM细胞％。然而，与所有其他组的小鼠相比，TEM细胞％的最显著增加在来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的样品中产生，其中脾和血液中分别75％和87％的CD8+ T细胞被鉴定为TEM细胞。此外，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠为仅有的在其淋巴结中具有显著升高的TEM细胞％的组，并且与所有其他组的小鼠的淋巴结中的TEM细胞群体％相比，该群体被高度升高(图25C)。
实施例6
用B16-F10-4-1BBL-B7.1-IFNγ/β疫苗注射的LTΑ-/-小鼠在树突细胞的不存在下产生增强的CD8+ T细胞应答。
该实施例评价以B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗细胞的形式将4-1BBL包含到表达B7.1的黑素瘤疫苗上是否能够引发CD8+ T细胞免疫应答，而无需由树突细胞(DC)提供的任何共刺激活性。这通过表征用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β或B16-F10/B7.1/IFNγ/β疫苗处理的LTα-/-小鼠的免疫应答来实现。
在接种疫苗后，与未接种疫苗的小鼠(p＝0.002)和用B16-F10/B7.1/IFNγ/β疫苗处理的小鼠(p＝0.022)相比，用B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β疫苗处理的LTα-/-小鼠具有显著更重的脾(图26A)。与对照或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠相比，在来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的脾中产生增加的CD8+ T细胞群体％和减少的CD4+ T细胞群体％(图26B)。与对照小鼠相比，B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠还展示出外周血中增加的CD8+ T细胞群体％，但处于临界的显著性(p＝0.057；图26C)。
接下来，来自对照和接种疫苗的LTα-/-小鼠的脾淋巴细胞在MLC中经历抗原性刺激。来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的CD8+ T细胞在MLC中有效扩增，与由对照(p＝0.003)或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠(p＝0.048)产生的群体相比展示出显著增加的CD8+ T细胞群体％(图27A)。随后，来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的MLC中的39％的CD8+ T细胞被表征为活化的，其是从来源于未接种疫苗的动物的MLC获得的群体的多于4倍(图27B)。
使用MLC中培养的脾淋巴细胞的CTL分析确定，来源于B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的淋巴细胞诱导最高比例的细胞死亡，这显著大于来自未接种疫苗的或B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的CTL测定(p<0.001；图27C)。此外，与来自对照小鼠的淋巴细胞相比，来自B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠的淋巴细胞能够产生裂解单位/效应物细胞群体的5.63倍增加。
然后通过用活的肿瘤细胞攻击接种疫苗的LTα-/-小鼠评价疫苗以确认它们在体内刺激T细胞应答的能力。75％的B16-F10/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠在活的肿瘤攻击后存活60天的时间段，且67％的B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠在肿瘤攻击后存活共131天的时间，这两者显著长于未接种疫苗的对照小鼠(对于B16-F10/B7.1/IFNγ/β和B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β分别为p＝0.001，和p<0.001；数据未示出)。然后，将在B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的小鼠中产生的长期的抗肿瘤应答在加强和用肿瘤细胞再次攻击后进行表征。初始脾重量和T细胞分析表明，与未接种疫苗的小鼠相比，接种疫苗的小鼠中的免疫应答未改变，因为组之间在脾重量和脾CD8+ T细胞群体％方面未检测到差异(图28A、B)。在B16-F10/4-1BBL/B7.1/IFNγ/β接种疫苗的LTα-/-小鼠的外周血中检测到较高的平均CD8+ T细胞群体％，然而，该差异仅显著高于用活的肿瘤细胞注射的未接种疫苗的小鼠(图28C)。更有趣地，当评价CD8+ T细胞群体的TEM和TCM亚群时，45％的脾T细胞(图28D)和60％的外周血T细胞(图28E)被分类为TEM CD8+ T细胞。与未接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的携带肿瘤的小鼠相比，这些亚群被显著升高，表明接种疫苗能够诱导对先前遇到的抗原的有效记忆应答。
实施例7
上调免疫调节制备物的B16-F10细胞表面上的H-2KB表达的IFN处理的优化。
除了表达高水平的B7和/或4-1BBL以外，为了免疫治疗目的，有益的是细胞还在细胞表面上表达升高水平的I类MHC分子H-2Kb，以增加抗原呈递的可能性。显著地，H-2Kb的水平通过用IFNγ和IFNβ的组合处理细胞被增强，如通过用FITC缀合的抗小鼠H-2Kb抗体的免疫染色使用流式细胞术评价的。
如先前描述的，将细胞用单独的各IFN和组合(即，IFNγ和IFNβ)进行处理，然后比较细胞表面上的H-2Kb表达水平。表7中的数据显示将B16-F10和B16-F10/4-1BBL用IFNγ处理44小时、用IFNβ处理20小时或者通过用IFNγ初免44小时然后用IFNβ处理另外的20小时的作用。发现，通过进一步延长IFN处理的时间长度，显著降低细胞产量和存活力(数据未示出)。
用单独的IFNγ或单独的IFNβ处理的B16-F10细胞可以将细胞表面上的MHC I类表达分别上调11倍和10倍。此外，B16-F10/4-1BBL细胞在用每一种IFN单独处理之后也表现出上调的MHC I类表达。然而，显示B16-F10/4-1BBL细胞更加响应于IFNγ，且较少响应于IFNβ(参见，表7)。尽管野生型和亚系细胞对单独的每一种IFN表现出不同的应答，但当施用IFNγ和IFNβ两者的组合时，两种细胞系显示最显著的MHC上调。B16-F10/4-1BBL细胞上的MHCI类表达的总体水平是同种型染色的细胞上的表达的28倍。
为了确定B16-F10/4-1BBL细胞上的MHC I类的表达是否可以被进一步增加，还测试了更高浓度的IFNγ和IFNβ。图29展示了来自在用1000IU/mL、2000IU/mL或3000IU/mL的单独的IFNγ或IFNβ处理B16-F10/4-1BBL分选1细胞之后产生的流式细胞术分析的条带图。在B16-F10/4-1BBL细胞上表达的H-2Kb的水平在用递增浓度的IFNγ和/或IFNβ处理之后未显示任何进一步的变化，如图29中示出的。因此，结论是，1000IU/mL的IFNγ和IFNβ将被用于处理所有疫苗细胞系，因为这种组合协同上调H-2Kb表达，其与当使用更多IFN时一样有效。
表7
用IFNγ/β的组合处理增加B16-F10黑素瘤细胞系上的H-2Kb表达
实施例8
分析疫苗制备物的H-2KB、B7.1和4-1BBL共表达。
使用BD LSRFortessa流式细胞仪允许PC缀合的抗体的高效信号检测，其中激发波长为566nm，且发射波长为576nm(由于与BD FACSCalibur机器中存在的588nm蓝色激光相比，LSRFortessa流式细胞仪使用561nm的绿色激光激发PE)。将一些细胞表面标志物在两种机器上进行分析，并且因此，这些已被包括用于进行比较，如表8中示出的。
当与同种型染色的样品相比时，分析的所有细胞系显示细胞表面上的高度上调的H-2Kb水平，如使用FACSCalibur和LSRFortessa两者进行定量的。显示，与野生型B16-F10细胞相比，在FACSCalibur上分析的三种疫苗细胞系具有相似的H-2Kb表达水平。相比之下，当使用LSRFortessa评价时，与野生型B16-F10细胞相比，三种免疫调节细胞系在其H-2Kb表达方面具有更大的增加倍数。还使用两种流式细胞仪分析细胞上的4-1BBL和B7.1表达水平。使用LSRFortessa产生的B7.1和4-1BBL表达数据同样显示较大的增加倍数，这指示，LSRFortessa更灵敏并且展示出更高的检测荧光信号的效率。
表8
使用FACSCalibur和LSRFortessa流式细胞仪检测的B16-F10野生型和亚系上的H- 2Kb、B7.1和4-1BBL表达的比较。
示出了共刺激分子表达相对于同种型染色的样品的值(即，高于相同样品的背景)的所有增加倍数值。
材料和方法
一般流式细胞术方案
对于所有免疫荧光染色程序，洗涤细胞并在染色介质中染色，所述染色介质包含在1×PBS中的2％FCS。对于染色步骤，将细胞常规重悬于100μL染色介质中，然后添加抗体。除了免疫荧光染色的样品以外，还制备未染色和同种型匹配的样品并对其进行分析以用于比较目的。使用下文的等式，以通过从抗体(Ab)染色的样品的平均荧光强度(MFI)减去未染色的样品的平均荧光强度(MFI)来计算细胞表面标志物表达水平的系数增加。FCS Express和FACS Diva软件程序用于分析从FACSCalibur和LSRFortessa流式细胞仪产生的数据。
疫苗细胞上的免疫刺激性细胞表面分子的分析
转染效率通过用抗体染色B16-F10亚系检测细胞表面标志物B7.1和4-1BBL来确定。将细胞从其培养容器脱离并用染色介质洗涤。为了检测细胞上4-1BBL的存在，在100μL染色介质中，以1μg/1x 106个细胞的浓度使用PE缀合的抗小鼠4-1BBL抗体。为了检测细胞上B7.1的存在，在100μL染色介质中，以0.2μg/1x 106个细胞的浓度使用PE缀合的抗小鼠CD80抗体。PE缀合的大鼠IgG2a同种型匹配的抗体被用于染色用作同种型对照的样品。这两种细胞表面分子的存在使用任一种流式细胞仪来检测。为了证实表达4-1BBL的细胞是否事实上表达了功能性且完整的4-1BBL分子，将细胞与重组小鼠4-1BB/Fc嵌合体第一抗体一起孵育。4-1BB/Fc嵌合体为4-1BBL的受体。为了检测第一抗体是否与4-1BBL结合，添加PE缀合的山羊抗人类IgG Fcγ片段特异性抗体(其还表现出与小鼠抗原的交叉反应性)，并且然后在BD FACSCalibur流式细胞仪上进行分析。为了检测IFN处理的细胞上的上调的H-2Kb水平，将细胞用在100μL染色介质中的2.5μg/1x 106个细胞的浓度的FITC缀合的抗小鼠H-2KbAb进行染色。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本文。
本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献作为本申请的“现有技术”可用。
贯穿本说明书中，目的为描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限制于任何一个实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本发明的公开内容，可以在所示例的具体实施方案中做出各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。所有此类修改和改变均意图被包括在所附权利要求的范围内。
参考文献
Berd,D.,Maguire,H.C.,Jr.,Schuchter,L.M.,Hamilton,R.,Hauck,W.W.,Sato,T.和Mastrangelo,M.J.,Autologous hapten-modified melanoma vaccine aspostsurgical adjuvant treatment after resection of nodal metastases,J ClinOncol,1997,15(6):2359-70.
Bray,F.,Jemal,A.,Grey,N.,Ferlay,J.,Forman,D.,Global cancertransitions according to the Human Development Index(2008-2030):a population-based study,Lancet Oncol.,2012,13(8):790-801.
de Rosa,F.,Ridolfi L.,Ridolfi R.,Gentili G.,Valmorri L.,Nanni O.,Petrini M.,Fiammenghi L.,Granato A.M.,Ancarani V.,Pancisi E.,Soldati V.,Cassan S.,Riccobon A.,Parisi E.,Romeo A.,Turci L.,Guidoboni M.,Vaccinationwith autologous dendritic cells loaded with autologous tumor lysate orhomogenate combined with immunomodulating radiotherapy and/orpreleukapheresis IFN-αin patients with metastatic melanoma:a randomised"proof-of-principle"phase II study,J Transl Med,2014,12:209.
Dezfouli,S.,Hatzinisiriou,I.和Ralph,S.J.,Enhancing CTL responses tomelanoma cell vaccines in vivo:synergistic increases obtained using IFNgammaprimed and IF Nbeta treated B7-1+B16-F10 melanoma cells,Immunol Cell Biol,2003,81(6):459-71.
Fang,L.,Lonsdorf,A.S.,Hwang,S.T.,Immunotherapy for advanced melanoma,J Invest Dermatol,2008,128(11):2596-605.
Faries,M.B.,Hsueh,E.C.,Ye,X.,Hoban,M.和Morton,D.L.,Effect ofgranulocyte/macrophage colony-stimulating factor on vaccination with anallogeneic whole-cell melanoma vaccine,Clin Cancer Res,2009,15(22):7029-35.
Hsueh,E.C.和Morton,D.L.,Antigen-based immunotherapy of melanoma:Canvaxin therapeutic polyvalent cancer vaccine,Semin Cancer Biol,13(6):401-7.
Jaffee,E.M.,Hruban,R.H.,Biedrzycki,B.,Laheru,D.,Schepers,K.,Sauter,P.R.,Goemann,M.,Coleman,J.,Grochow,L.,Donehower,R.C.,Lillemoe,K.D.,O'Reilly,S.,Abrams,R.A.,Pardoll,D.M.,Cameron,J.L.和Yeo,C.J.,Novel allogeneicgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor-secreting tumor vaccine forpancreatic cancer:a phase I trial of safety and immune activation,2001,J ClinOncol,19(1):145-56.
Jemal,A.,Saraiya,M.,Patel,P.,Cherala,S.S.,Barnholtz-Sloan,J.,Kim,J.,Wiggins,C.L.,Wingo,P.A.,Recent trends in cutaneous melanoma incidence anddeath rates in the United States,1992-2006,J Am Acad Dermatol,2011,65(5Suppl1):S17-25.e1-3.
Lotem,M.,Kadouri,L.,Merims,S.,Ospovat,I.,Nissan,A.,Ron,I.,Frankenburg,S.,Machlenkin,A.,Israel,S.,Steinberg,H.,Hamburger,T.和Peretz,T.,HLA-B35correlates with a favorable outcome following adjuvant administrationof an HLA-matched allogeneic melanoma vaccine,Tissue Antigens,2011,78(3):203-7.
Macatonia,S.E.,Patterson,S.,Knight,S.C.,Suppression of immuneresponses by dendritic cells infected with HIV,Immunology,1989,67(3):285-9,
Macatonia,S.E.,Lau,R.,Patterson,A.,Piching,A.J.,Knight,S.C.,Dendriticcell infection,depletion and dysfunction in HIV-infected individuals,Immunology,1990,71:38-45.
O'Rourke,M.G.,Johnson,M.,Lanagan,C.,See,J.,Yang,J.,Bell,J.R.,Slater,G.J.,Kerr,B.M.,Crowe,B.,Purdie,D.M.,Elliott,S.L.,Ellem,K.A.和Schmidt,C.W.,Durable complete clinical responses in a phase I/II trial using an autologousmelanoma cell/dendritic cell vaccine,Cancer Immunol Immunother,2003,52(6):387-95.
Ralph,S.J.,An update on malignant melanoma vaccine research:insightsinto mechanisms for improving the design and potency of melanoma therapeuticvaccines,Am J Clin Dermatol,2007,8(3):123-41.
Soiffer,R.,Hodi,F.S.,Haluska,F.,Jung,K.,Gillessen,S.,Singer,S.,Tanabe,K.,Duda,R.,Mentzer,S.,Jaklitsch,M.,Bueno,R.,Clift,S.,Hardy,S.,Neuberg,D.,Mulligan,R.,Webb,I.,Mihm,M.和Dranoff,G.,Vaccination with irradiated,autologous melanoma cells engineered to secrete granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor by adenoviral-mediated gene transfer augmentsantitumor immunity in patients with metastatic melanoma,J Clin Oncol,2003,21(17),3343-50.
Sondak,V.K.,Sabel,M.S.和Mule,J.J.,Allogeneic and autologous melanomavaccines:where have we been and where are we going？,Clin Cancer Res,2006,12(7Pt 2):2337s-2341s.
Trotter,A.S.,Sroa,N.,Weinkelmann,R.R.,Olencki,T.,Bechtel,M.,A globalreview of melanoma follow-up guidelines.J Clin Aesth Derm,2014,6(9):18-26.
Yang,J.C.,Melanoma vaccines,Cancer J,2011,17(5):277-82.

Claims (59)

1.一种人工抗原呈递细胞，所述人工抗原呈递细胞在其表面上包含B7分子和4-1BB激动剂，其中所述细胞的抗原呈递功能(例如，细胞表面上的较高水平的MHC，诸如MHC I类)通过暴露于至少一种干扰素(IFN)被增强。
2.根据权利要求1所述的人工抗原呈递细胞，其中所述细胞来源于癌细胞或肿瘤细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的人工抗原呈递细胞，其中所述细胞的抗原呈递功能通过使所述细胞与至少一种外源IFN接触(例如，在至少一种外源IFN的存在下培养)被增强。
4.一种组合物，所述组合物包含B7分子、4-1BB激动剂和动物细胞，所述动物细胞在足以增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种外源IFN接触(例如，在至少一种外源IFN的存在下培养)。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞被洗涤以去除所述至少一种外源IFN。
6.一种用于增强受试者中对靶抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的人工抗原呈递细胞或根据权利要求4或权利要求5所述的组合物施用至所述受试者。
7.一种治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法，其中所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的人工抗原呈递细胞或根据权利要求4或权利要求5所述的组合物。
8.一种治疗受试者中的病原体感染的方法，其中所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的人工抗原呈递细胞或根据权利要求4或权利要求5所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病原体感染为病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒感染选自包括以下、由以下组成、或基本上由以下组成的组：HIV、肝炎、流感、日本脑炎病毒、EB病毒和呼吸道合胞病毒。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述受试者的抗原呈递细胞被消耗或数目降低。
12.根据权利要求11所述的方法，其中被消耗或数目降低的抗原呈递细胞为巨噬细胞、树突细胞和/或B细胞。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，所述方法还包括将所述受试者暴露于免疫抑制治疗。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述B7分子为B7.1分子或B7.2分子。
15.根据权利要求14中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述B7.1分子包含SEQID NO:2中列出的序列、或其生物活性片段，或对应于这些中任何一个的序列。
16.根据权利要求14中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述B7.2分子包含SEQID NO:4中列出的序列、或其生物活性片段，或对应于这些中任何一个的序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述B7分子在所述细胞的表面上表达，其中所述分子的至少一部分被暴露于细胞外环境。
18.根据权利要求4至16中任一项所述的组合物或方法，其中所述B7分子以可溶性形式存在。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述B7分子为嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含对应于B7分子的细胞外结构域的与免疫球蛋白恒定区融合或以其他方式连接的多肽。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物或方法，其中所述4-1BB激动剂在所述细胞的表面上表达，其中所述分子的至少一部分被暴露于细胞外环境。
21.根据权利要求4至18中任一项所述的组合物或方法，其中所述4-1BB激动剂以可溶性形式存在。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述可溶性4-1BB激动剂为嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含对应于B7分子的细胞外结构域的与免疫球蛋白恒定区融合或以其他方式连接的多肽。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：多肽、多核苷酸、抗体、碳水化合物和小分子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述4-1BB激动剂为4-1BBL分子或其生物活性片段。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中动物细胞来源于选自由以下组成的组的组织、器官或系统：肺、乳腺、子宫、子宫颈、卵巢、结肠、胰腺、前列腺、睾丸、胃、膀胱、肾、骨、肝、网状内皮系统、食管、脑、皮肤和软组织。
26.根据权利要求25所述的细胞、组合物或方法，其中所述动物细胞为黑素瘤细胞。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞、组合物或方法，其中所述细胞已经与IFNγ(其通常为外源的)和任选地第一I型IFN(其通常为外源的)和第二I型IFN(其通常为外源的)的一种或两种接触(例如，在IFNγ(其通常为外源的)和任选地第一I型IFN(其通常为外源的)和第二I型IFN(其通常为外源的)的一种或两种的存在下培养)，其中所述第一I型IFN选自IFNβ或其生物活性片段，且其中所述第二I型干扰素选自IFNα或其生物活性片段。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至5和14至27中任一项所述的细胞或组合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
29.一种免疫强化组合物，所述免疫强化组合物包含根据权利要求1至3、5或13至27中任一项所述的细胞或组合物以及药学上可接受的佐剂。
30.根据权利要求29所述的免疫强化组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：半乳凝素抑制剂、针对免疫抑制抑制剂诸如CTLA4、PD1、PD-L1受体、吲哚双加氧酶(IDO)和TGF-β抑制剂的单克隆抗体。
31.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，所述方法还包括从动物细胞的异质群体分离表达所述B7膜分子的细胞。
32.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，所述方法还包括从动物细胞的异质群体分离表达所述4-1BB激动剂的细胞。
33.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，所述方法还包括修饰所述动物细胞以表达所述B7膜分子和/或4-1BB激动剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述修饰包括将所述B7膜分子和/或4-1BBL激动剂可从其表达的多核苷酸引入到所述动物细胞中。
35.根据权利要求6至27和31至34中任一项所述的方法，其中将所述动物细胞通过以下进行培养：使所述细胞在足以允许针对至少一种I型IFN的细胞反应性的条件下并且持续一段时间与II型IFN接触，并然后使所述培养的细胞在增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与所述至少一种I型IFN接触。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述II型IFN选自IFNγ或其生物活性片段。
37.根据权利要求35和权利要求36所述的方法，其中所述至少I型IFN选自IFNα、IFNβ或其生物活性片段。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述IFNγ包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列或对应于其的序列。
39.根据权利要求37中任一项所述的方法，其中所述IFNβ为IFNβ1。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述IFNβ1包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列或对应于其的序列。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述IFNβ为IFNβ2。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述IFNβ2包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列或对应于其的序列。
43.根据权利要求37中任一项所述的方法，其中所述IFNα为IFNα1。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述IFNα1包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或对应于其的序列。
45.根据权利要求37中任一项所述的方法，其中所述IFNα为IFNα2。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述IFNα2包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或对应于其的序列。
47.根据权利要求6至27和231至34中任一项所述的方法，其中所述细胞在II型IFN的存在下培养从约16至约96小时，并且随后在至少一种I型IFN的存在下培养从约16至约72小时。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述II型IFN为IFNγ，并且其中所述I型IFN选自IFNα和IFNβ。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述II型IFN为IFNγ，并且其中所述I型IFN为IFNβ。
50.根据权利要求6至27和31至34中任一项所述的方法，其中所述细胞在IFNγ的存在下培养从约48至约96小时，并且随后在IFNα和/或IFNβ的存在下培养从约24至约72小时。
51.根据权利要求6至27和31至34中任一项所述的方法，其中所述细胞在IFNγ的存在下培养从约48至约96小时，并且随后在IFNβ的存在下培养从约24至72小时。
52.一种用于治疗和/或预防疾病或状况的方法，所述方法包括将有效量的根据任一项前述权利要求所述的组合物施用至需要此类治疗的患者。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述施用包括将可溶性B7分子、可溶性4-1BBL激动剂和经培养的动物细胞单独、依次或同时施用至所述患者。
54.一种用于治疗或预防受试者中的疾病或状况的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求29或权利要求30所述的免疫强化组合物施用至需要此类治疗的受试者。
55.一种试剂盒，所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含动物细胞以及B7分子和4-1BB激动剂，所述动物细胞在足以增强所述细胞的抗原呈递功能的条件下并且持续一段时间与至少一种IFN接触(例如，在至少一种IFN的存在下培养)。
56.一种用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的方法，所述方法包括将有效量的根据任一项前述权利要求所述的细胞或组合物施用至需要此类治疗的患者。
57.一种用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求29或权利要求30所述的免疫强化组合物施用至需要此类治疗的患者。
58.一种用于治疗和/或预防病毒感染、细菌感染或寄生虫感染的方法，所述方法包括将有效量的根据任一项前述权利要求所述的细胞或组合物施用至需要此类治疗的患者。
59.一种用于治疗和/或预防病毒感染、细菌感染或寄生虫感染的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求29或权利要求30所述的免疫强化组合物施用至需要此类治疗的患者。
CN201680029341.9A 2015-04-02 2016-04-01 用于引发免疫应答的剂和组合物 Pending CN107708725A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2015901218 2015-04-02
AU2015901218A AU2015901218A0 (en) 2015-04-02 Agents and compositions for eliciting an immune response
PCT/AU2016/050250 WO2016154684A1 (en) 2015-04-02 2016-04-01 Agents and compositions for eliciting an immune response

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107708725A true CN107708725A (zh) 2018-02-16

Family

ID=57003687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680029341.9A Pending CN107708725A (zh) 2015-04-02 2016-04-01 用于引发免疫应答的剂和组合物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10953045B2 (zh)
EP (1) EP3277313B1 (zh)
JP (1) JP6841812B2 (zh)
CN (1) CN107708725A (zh)
AU (1) AU2016240411A1 (zh)
CA (1) CA2980622A1 (zh)
HK (1) HK1250637A1 (zh)
WO (1) WO2016154684A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019521643A (ja) 2016-04-15 2019-08-08 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８０バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11201903407XA (en) * 2016-10-20 2019-05-30 Alpine Immune Sciences Inc Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
CA3053812A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
BR112019018747A2 (pt) 2017-03-16 2020-05-05 Alpine Immune Sciences Inc proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas
EP3694870A1 (en) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040197312A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
US20040235156A1 (en) * 2000-05-17 2004-11-25 Ralph Stephen John Immune potentiating compositions

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316256B1 (en) * 2000-01-03 2001-11-13 Tr Associates, L.L.C. Method for protein transfer
WO2003006632A2 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 Canvac Methods and compisitions for activation human t cells in vitro
US7651686B2 (en) * 2001-10-09 2010-01-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Enhancement of immune responses by 4-1bb-binding agents
AU2005250408B2 (en) * 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
MX2008007292A (es) * 2005-12-08 2008-10-17 Univ Louisville Res Found Composiciones inmunoestimuladoras y metodos.
AU2016215175B2 (en) * 2015-02-06 2021-09-16 Heat Biologics, Inc. Vector co-expressing vaccine and costimulatory molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040235156A1 (en) * 2000-05-17 2004-11-25 Ralph Stephen John Immune potentiating compositions
US20040197312A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHAO-YANG LU: "B7-1 and 4-1BB ligand expression on a myeloma cell line makes it possible to expand autologous tumor-specific cytotoxic T cells in vitro", 《EXPERIMENTAL HEMATOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3277313A1 (en) 2018-02-07
EP3277313A4 (en) 2018-11-21
JP6841812B2 (ja) 2021-03-10
EP3277313B1 (en) 2021-06-23
US10953045B2 (en) 2021-03-23
WO2016154684A1 (en) 2016-10-06
AU2016240411A1 (en) 2017-10-12
JP2018511656A (ja) 2018-04-26
HK1250637A1 (zh) 2019-01-11
US20180360879A1 (en) 2018-12-20
CA2980622A1 (en) 2016-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107708725A (zh) 用于引发免疫应答的剂和组合物
CN109789190A (zh) Nant癌症疫苗
CN101918544B (zh) 提高免疫反应性的方法
CN110267978A (zh) 用于治疗癌症的表达膜锚定的il-12的t细胞
CN109563521A (zh) 用于新表位呈递的序列排列和序列
CN109152827A (zh) 重组mva或表达人flt3l的mvaδe3l及其作为抗固体肿瘤的免疫治疗剂的用途
TW202134430A (zh) 腫瘤細胞疫苗
CN108473960A (zh) 树突细胞组合物
CN107406857A (zh) 用于联合免疫治疗的方法和组合物
CN109152830A (zh) 用于免疫疗法的核/壳结构平台
Slingluff Jr et al. Immunity to melanoma antigens: from self‐tolerance to immunotherapy
CN109069603A (zh) 全细胞癌症疫苗及其选择方法
CN107847577A (zh) 包含编码类M蛋白质的mRNA的癌症疫苗
CN110461345A (zh) 用于调控免疫应答的包含乳酸细菌的口服组合物和与其相关的方法
CN107847534A (zh) Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
CN107847567A (zh) 方法
CN104262459A (zh) 一种急性单核细胞白血病相关抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制药应用
US7795020B2 (en) Tumor cell vaccines
JP7040701B2 (ja) 抗がん腫瘍溶解性ウイルス併用療法および優良レスポンダー選択プラットフォーム
Yei et al. Novel membrane-bound GM-CSF vaccines for the treatment of cancer: generation and evaluation of mbGM-CSF mouse B16F10 melanoma cell vaccine
CN106456730A (zh) 用于诱导或延长细胞之细胞毒性免疫应答的方法的药物
CN110484504A (zh) 一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法
US20230000963A1 (en) Tumor cell vaccines
Mao et al. PD-1 blockade-driven anti-tumor CD8+ T cell immunity requires XCR1+ dendritic cells
CN109891238A (zh) 免疫治疗剂的剂量确定

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180216