JP6841812B2 - 免疫応答を惹起するための作用物質及び組成物 - Google Patents

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Description

本願発明は、概して、免疫を可能にする組成物に関する。より具体的には、本発明は、増強された抗原提示機能を示す細胞を含んでいる組成物に向けられる。本発明の組成物は、概して、選択的、且つ、標的化された免疫細胞応答を含めた宿主の免疫細胞応答の刺激を容易にするのに有用であり、そして癌、腫瘍、及び病原性感染症の処置及び／又は予防に特に有用である。
癌は、これらの統計に大きく寄与する１つのタイプである悪性メラノーマを含め世界中の罹患率及び死亡率の主な原因の１つとして解決されないままである（Trotter et al.,. 2014; Bray et al., 2012）。癌に関する研究がとても豊富であるのは、このかなり大きな世界的な負担に一部起因している（Trotter et al., 2014; Jemal et al., 2011）。悪性メラノーマの発症機序、分子機構、及び可能性のある治療オプションを調査する極めて多くの研究がおこなわれた（Lee et al., 2014; Yang, 2011; and Fang et al., 2008）。しかしながら、実施された研究量にもかかわらず、悪性メラノーマを予防するか又は処置する際に使用するために承認されたワクチンは、いまだに存在しない。
特定の癌に対するワクチンを標的化するための１つの方法論は、彼ら自身の癌細胞に対して患者の免疫応答を強化するためにカストマイズされたワクチンを作り出すために、メラノーマ細胞及び／又は樹状細胞のいずれかの患者自身の細胞を使用することに頼っている。この技術は、いくつかの試験で採用され、試験された（Berd et al., 1997; Soiffer et al., 2003; O’Rourke et al., 2003; de Rosa et al., 2014）。しかしながら、自己癌細胞及び／又は樹状細胞ワクチンベースの処置を含めた、個別化された治療法に対する懸念は、非常に時間の斯かるプロセス特性と実質的な製造コストである。これらの２つの特徴が、個別化された癌ワクチンのタイムリー且つ費用対効果が高い製造の大きな障害の典型であり、斯かる治療薬の開発に積極的に従事することに対する薬品会社の無関心は明白である（Jaffee et al., 2001; Sondak et al., 2006; Ralph 2007）。より商業的に実施可能な関連技術は、同種異系の全細胞ベースのワクチンの使用である。これらのワクチンは、有利な免疫特性を有する同種異系組織ベースなので、評判が高まっており、更に、最近の研究では、癌と患者の免疫応答との間の相関に関する役に立つ情報が提供された（Dezfouli et al., 2003; Fang, 2008）。
これまで最も成功した全細胞ワクチンはＣＡＮＶＡＸＩＮ(商標)であり、そしてそれは、２０種類を越える様々なメラノーマ抗原をそれらの間で発現する３種類の放射線照射された、同種異系のメラノーマ細胞株から成る（Hsueh and Morton, 2003）。このワクチンは第ＩＩＩ相臨床試験に至ったが、ワクチン接種しなかった対照患者と比較してＣＡＮＶＡＸＩＮ(商標)処置患者がいずれの生存利益も示さなかったとデータ安全性監視委員会が決定した後、治験は中止された（Sondak et al., 2006）。しかしながら、この治験はワクチン開発に関する有効な方法論を提供し、そしてそれは、その後の試験で利用されている（Faries et al., 2009; Lotem et al., 2011）。Dezfouliらによる別々の試験（2003）は、細胞表面にＢ７．１を発現するようにメラノーマ細胞を遺伝子操作し、それに続いて、ＩＦＮ−γ／βの組み合わせで処置することが、Ｂ７．１発現を高めただけではく、メラノーマ細胞に対して特異的な細胞傷害Ｔリンパ球応答も誘導したことを同定した。更に、この試験は、メラノーマワクチンへのＢ７．１の添加が、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とは無関係に観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を媒介したとの結論を下した（Dezfouli et al., 2003）。
本発明者らは、標的抗原に対するより強い免疫応答が、その表面に提示されたＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を有する抗原提示細胞を用いたワクチン接種によって惹起され得ること、更に、その抗原提示特性が、インターフェロン処置に晒されることによって強化されたことを驚いたことに発見した。インターフェロン処置と、Ｂ７分子及び４−１ＢＢ作動薬表面発現との組み合わせは、好適な宿主内に導入されると、その細胞によって提示された抗原に対する免疫応答が顕著に改善される細胞の抗原提示機能の相乗的な増強を引き起こす。本発明の人工的な抗原提示細胞は、天然型の抗原提示細胞集団（例えば、マクロファージ、樹状細胞など）を使い尽くした対象の処置において特定の利点を有する。
よって、本発明の一態様において、その表面にＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を備える人工的な抗原提示細胞を提供し、ここで、その細胞の抗原提示機能（例えば、細胞表面の主要組織適合性複合体のより高いレベル）は、少なくとも１つのインターフェロン（ＩＦＮ）に晒されることによって高められる。好適には、細胞の抗原提示機能は、その細胞を少なくとも１つの外因性ＩＦＮと接触させること（例えば、その存在下で培養すること）によって高められる。
本明細書中に記載したそれぞれの態様及び実施形態において、人工的な抗原提示細胞は、通常、動物細胞から得、そしてそれは、典型的には脊椎動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。好適には、動物細胞は、癌又は腫瘍細胞（例えば、メラノーマ細胞）である。
本明細書中に記載したそれぞれの態様及び実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、好適には４−１ＢＢリガンドである。
本発明の別の態様において、Ｂ７分子、４−１ＢＢ作動薬、及びその細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１つの外因性ＩＦＮと接触させた（例えば、その存在下で培養すること）動物細胞を含んでいる組成物を提供する。
Ｂ７分子は、細胞の表面に存在しても、又は可溶形で存在してもよい。同様に、４−１ＢＢ作動薬は、前記の細胞の表面に存在しても、又は可溶形で存在してもよい。このタイプに関する説明に役立つ例において、Ｂ７分子及び４−１ＢＢ作動薬のうちの一方が細胞表面に存在し、そして、もう片方が可溶形で存在する。他の説明に役立つ例において、Ｂ７分子及び４−１ＢＢ作動薬は、細胞の表面にそれぞれ存在する。或いは、Ｂ７分子及び４−１ＢＢ作動薬の両方が可溶形で存在する。
本明細書中に記載したそれぞれの態様及び実施形態において、動物細胞は、通常、脊椎動物細胞であり、典型的には哺乳動物細胞であって、その制限されることのない例としては、癌又は腫瘍細胞（例えば、メラノーマ細胞）が挙げられる。
本発明の更なる態様において、人工抗原提示細胞を製造する方法であって：
それらの細胞表面にＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を発現する動物細胞を、細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１つの（典型的には外因性）ＩＦＮに晒すこと、を含む方法を提供する。
本発明のより一層更なる態様において、動物細胞の免疫増強を強化する方法であって：
それらの細胞表面にＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を発現する動物細胞を、細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１つの（典型的には外因性）ＩＦＮに晒すこと、を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、その方法は、動物細胞の不均一集団からＢ７分子と４−１ＢＢ作動薬の一方又は両方を発現する細胞を単離することを更に含む。
いくつかの実施形態において、その方法は、それらの細胞表面にＢ７分子の一方又は両方を発現するように動物細胞を改変することを更に含む。好適には、改変ステップは、それからＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬の一方又は両方を発現できる少なくとも１つのポリヌクレオチドを動物細胞内に導入することを含む。
本明細書中に記載したそれぞれの態様及び実施形態において、少なくとも１つのＩＦＮへの動物細胞の暴露は、好適には、細胞を、少なくとも１つのＩ型ＩＦＮに対する細胞応答性を可能とするのに十分な時間及び条件下でII型ＩＦＮと接触させること（例えば、その存在下で培養すること）、及び細胞を、細胞の抗原提示機能を強化する時間及び条件下で少なくとも１つのＩ型ＩＦＮと接触させることを含む。細胞は、連続して又は同時に、II型ＩＦＮ及びＩ型ＩＦＮと接触させてもよい。このタイプに関する説明に役立つ例において、細胞を、最初にII型ＩＦＮと接触させ、その後II型ＩＦＮと接触させる。他の説明に役立つ例において、細胞を、II型ＩＦＮ及びＩ型ＩＦＮと同時に接触させる。
通常、II型ＩＦＮは、ＩＦＮ−γ又はその生物活性断片から選択される。
少なくとも１つのＩ型ＩＦＮは通常、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はその生物活性断片から選択される。
先に広く記載した方法のいくつかの実施形態において、動物細胞は、不活性に又は増殖できないようにされる。例えば、動物細胞は、当該技術分野で知られているように、例えば、ガンマ線照射などの好適な量の放射線を照射されて、意図された宿主内でその動物細胞が増殖できないようにされてもよい。
更に別の態様において、本発明は、動物細胞の免疫増強を強化する方法であって：
動物細胞を、細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１つの（典型的には外因性）ＩＦＮに晒し；そして
そのようにＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬に晒された細胞を組み合わせること、を含み、ここで、少なくとも１つのＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬が可溶形である方法を提供する。
本発明の別の態様は、Ｂ７分子、４−１ＢＢ作動薬、及び（典型的には外因である）ＩＦＮ−γ、並びに任意選択的に第一の（典型的には外因である）Ｉ型ＩＦＮと第二の（典型的には外因である）Ｉ型ＩＦＮの一方又は両方と、細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で接触させた（例えば、その存在下で培養した）動物細胞を含む組成物に属し、ここで、第一のＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ−β又はその生物活性断片から選択され、及びここで、第二のＩ型インターフェロンには、ＩＦＮ−α又はその生物活性断片が選択される。好適には、少なくとも１つのＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬は、動物細胞の表面で発現されるか、又は可溶形で存在する。
本発明の別の態様は、標的抗原に対して免疫応答を惹起するのに使用するための組成物を提供し、ここで、その組成物は、Ｂ７分子、４−１ＢＢ作動薬、及び細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件で少なくとも１つの（典型的には外因性）ＩＦＮと接触させた（例えば、その存在下で培養した）動物細胞を含み、ここで、標的抗原に相当する抗原は、（例えば、免疫系の刺激のために）その動物細胞によって提示される。
本明細書中に記載したそれぞれの態様及び実施形態において、先に広く記載した組成物は、任意の１若しくは複数の医薬的に許容し得る担体、アジュバント、希釈剤又は補助的な治療薬を含んでもよい。好適には、補助的な治療薬は、急速に分裂している細胞を標的とする及び／又は細胞周期を混乱させる作用物質を含む。
更に別の態様において、本発明は、標的抗原の強化された又は異常な発現に関連している疾患又は健康状態の処置及び／又は予防の方法であって、それを必要としている対象に、先に広く記載した細胞又は組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患又は健康状態は、癌又は腫瘍である。いくつかの実施形態において、対象は、急速に分裂している細胞を標的とする及び／又は細胞周期を混乱させる医学的処置を受ける。いくつかの実施形態において、（そのままであるか又は組成物の一部として）投与される細胞は、対象に対する自己、同系、同種異系又は異種である。
更なる態様によれば、本発明は、動物細胞であって、前記細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件で少なくとも１つの（典型的には外因性）ＩＦＮと接触させた（例えば、その存在下で培養した）動物細胞を、Ｂ７分子及び４−１ＢＢＬ作動薬と一緒に含む組成物を含むキットを提供する。
更に別の態様において、本発明の方法は、腫瘍形成の処置及び／又は予防を提供する方法であって、それを必要としている患者に、先に広く記載した細胞又は組成物の有効量を投与することを含む方法である。
本発明の例を、以下の添付図面を参照してここで記載する。
（Ａ）ｐＧＥＭ−Ｔベクター内に挿入した４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含有する細菌クローンのスクリーニング。プラスミドＤＮＡを、４−１ＢＢＬ導入遺伝子を含む適切に連結されたプラスミドを含むと予想された１０個の細菌クローンから抽出した。ＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを使用して二重消化し、０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含有する１％のアガロースゲルで電気泳動した。１ｋｂのＤＮＡラダーをレーン１に添加した。ＸｂａＩだけ、ＥｃｏＲＩだけで切断したｐＵＣ１８ベクター、及び未切断ｐＵＣ１８ ＤＮＡを、それぞれレーン２〜４に添加した。クローン１からの未切断ＤＮＡサンプルをレーン５に添加した。レーン６〜１５には、ＤＮＡがクローン１〜１０からの二重消化サンプルを入れた。（Ｂ）ｐＧＥＭ−Ｔベクター内に挿入した４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含有する細菌クローンのスクリーニング。プラスミドＤＮＡを、４−１ＢＢＬ導入遺伝子を含む適切に連結されたプラスミドを含むと予想された１０個の細菌クローンから抽出した。ＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを使用して二重消化し、０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含有する１％のアガロースゲルで電気泳動した。１ｋｂのＤＮＡラダーをレーン１に添加した。ＸｂａＩだけ、ＥｃｏＲＩだけで切断したｐＵＣ１８ベクター、及び未切断ｐＵＣ１８ ＤＮＡを、それぞれレーン２〜４に添加した。クローン１からの未切断ＤＮＡサンプルをレーン５に添加した。レーン６〜１５には、ＤＮＡがクローン１〜１０からの二重消化サンプルを入れた。
Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ細胞は、４−１ＢＢに結合した機能的な４−１ＢＢＬを発現する。細胞を、４１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラと一緒にインキュベートし、４−１ＢＢＬへの結合を検出するために、ＰＥを結合したＩｇＧ ＦｃγＡｂを使用して染色し、そして、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して計測した。黒色のヒストグラム及び緑色のヒストグラムは、それぞれＢ１６−Ｆ１０及びＢ１６−Ｆ１０−４／１ＢＢＬ選別細胞の無染色対照サンプルを表す。赤色及び紫色のヒストグラムは、それぞれＩｇＧＦｃγＰＥ二次Ａｂだけで染色したＢ１６−Ｆ１０及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞を示す。青いヒストグラムは、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラと一緒にインキュベートし、ＩｇＧ ＦｃγＰＥ二次Ａｂで染色したＢ１６−Ｆ１０細胞を表す。栗色のヒストグラムは、更に４−１ＢＢＬについて選別にかけ、４１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラ及びＩｇＧ ＦｃγＰＥ二次Ａｂでの免疫染色の前に、培養により再び増殖させた細胞集団を示す。
（Ａ）セルソーティングと選択の頻回ラウンド後にＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞上の強化されたＢ７．１発現。フローサイトメトリー解析を実施して、ｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏＮ９／Ｂ７．１ベクターで形質移入された細胞と比較した、野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＢ７．１発現のレベルを測定した。様々な亜株からのすべての細胞を、ＰＥを結合したラット抗マウスＣＤ８０ Ａｂで染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。サンプルを、陽染性細胞集団の大部分に対応するようにゲートでコントロールした。黒色のヒストグラムは、ＰＥアイソタイプ対照で染色されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１（ソート１）細胞の第一群を表す。赤色のヒストグラムは、野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞上のＢ７．１に関する発現プロファイルを示す。青いヒストグラムは、トランスフェクション後に細胞上で発現されたＢ７．１のレベルを示す。緑色、紫色、及び栗色のヒストグラムは、細胞をそれぞれ１、２、及び３ラウンドに応じてＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａにより繰返し選別した後のＢ７．１発現のレベルを示す。（Ｂ）クローン選択後に発生及び維持されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞におけるＢ７．１の高発現。黒色のヒストグラムは、アイソタイプ染色されたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１ソート３細胞を表す。緑色のヒストグラムは、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１ソート３細胞上のＢ７．１発現を示す。紺青色、黄色、及び栗色のヒストグラムは、それぞれＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１ソート３細胞、クローン１、クローン２、及びクローン３上のＢ７．１発現のレベルを示す。Ｂ７．１発現を、ＰＥを結合したラット抗マウスＣＤ８０ Ａｂで細胞を染色し、そして、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析することによって検出した。
二種類の用量のワクチンで処置されたマウスに対する対照からの脾臓重量の比較のための「プロトコール１」によるワクチン接種及び摘出のタイムライン。Ｃ５７ＢＬ／６対照（ｎ＝９）又は１×１０７の放射線照射Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝７）細胞を含むワクチンの二種類の用量が腹腔内注射されたマウスは、Ａ）に示したタイムラインに従ってワクチン接種した。脾臓を摘出し、重量を平均±ＳＥとして記録し、それはＢ）に示した２つの独立した実験を代表するものである。有意水準を、一元配置分散分析を使用して決定した。★★ｐ＜０．０５、★★ｐ＜０．０１、★★★ｐ＜０．００５（別段の記述のない限り、本明細書中に提示された他のすべての図面でも同様）。
二種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを受けたマウスからの（リンパ節ではなく）脾臓及び血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の増加％。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ｎ＝９）として使用したか、又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝７）ワクチンのいずれかでワクチン接種プロトコール１を使用して示したように注射した。１１日目に、脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）、及びリンパ節（Ｃ）を、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の違いを評価した。このデータは、２つの独立した実験から収集され、平均及び標準誤差を示した。
（Ａ）二種類のワクチン用量を投与し、そして、ＭＬＣで増殖させたマウスの脾リンパ球集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加％。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ｎ＝９）として使用したか、又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝７）ワクチンのいずれかでワクチン接種プロトコール１を使用して示したように注射した。ワクチン接種及び非ワクチン接種、対照マウスからの脾臓を摘出し、リンパ球を単離し、そして、不活性化ＩＦＮ−γ／β処置したＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の単層を含んだＭＬＣで増殖させた。ＭＬＣで３〜５日後に、リンパ球を回収し、そして、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の変化について分析した。示したデータは、４つの独立した実験から収集された。（Ｂ）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンに対応して、ＭＬＣで増殖させた脾臓由来リンパ球からの活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団が大きく上昇した。対照マウス又は二種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞のいずれかをワクチン接種したマウスからのリンパ球を、抗原性刺激因子として適当な癌ワクチン細胞を使用したＭＬＣで５日間培養した。ＣＤ８を発現するリンパ球を、フローサイトメトリーを使用して選択し、次に、活性化マーカーＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの同時発現について更に分析した。平均及びＳＥを示す。
ＣＴＬアッセイで測定した場合、対照又はワクチン接種マウスからのリンパ節由来リンパ球の細胞毒性に有意差はなかった。対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス、又は二種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン細胞のいずれかをワクチン接種したマウスからのリンパ節を摘出し、リンパ球を精製し、そして、標的としてＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β生細胞を使用して細胞毒性アッセイにより分析した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ取り込みを使用して、分光光度計により４８５ｎｍ及び５２５ｎｍの励起及び発光波長を使用して検出される細胞死の割合を決定した。平均及び標準誤差を示し、そして、細胞死の割合を合計に対する％として示す。群間の違いを、一般線形モデルを使用して決定した（１群あたりｎ＝４）。
５日間培養したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球を含むＭＬＣウェルで観察された高レベルの癌細胞死。（Ａ）非ワクチン接種マウス又は（Ｂ）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ−ＩＦＮ−γ／β細胞；（Ｃ）Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞若しくは（Ｄ）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種されたマウスのいずれか由来の脾リンパ球と共に、抗原性刺激因子としての、マイトマイシンＣで成長不活性化したＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の単層を含有するＭＬＣを、倒立顕微鏡下で視覚化した。黒色の矢印は標的細胞を示し、赤色の矢印は脾リンパ球を示し、そして、緑色の矢印は、破片、凝集した瀕死の細胞、及び初期の目視検査後にＭＬＣウェル内に存在した細胞死と考えられるものを強調する。
ＭＬＣで培養したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球のＣＴＬアッセイにおいて蛍光顕微鏡によって視覚化された高い細胞死の代表例。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾リンパ球を、５日間、ＭＬＣで培養し、その後、ＣＴＬアッセイに使用した。標的Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１メラノーマ細胞をＤｉＩ（赤色）で染色し、そして、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを使用して、％死細胞のために染色した。明視野、緑色、及び赤色蛍光画像を、ＣＴＬアッセイ内の様々なウェルについて記録し、そしてそれは、１００％生きた標的細胞のみ（ＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞）、１００％死滅した標的細胞のみ（０．４％のＮＰ９界面活性剤で処置されたＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞）、１００％生きたエフェクター細胞（リンパ球）のみ又は１０：１比で組み合わせられたエフェクター及び標的のいずれかを含んだ。重ね撮り画像も示した。
ＭＬＣで培養したＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球を用いたＣＴＬアッセイにおいて増強された細胞死。投薬を受けていない、非ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウス、又はワクチン接種プロトコール１に従ってＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種されたマウスからの脾リンパ球を、調製し、精製し、そして、Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β抗原性刺激因子と共にＭＬＣで５日間培養した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ核取り込み及び免疫蛍光法を使用して、４８５ｎｍの励起波長及び５２５ｎｍの発光波長に設定された分光光度計を使用して細胞死を検出した。エフェクター対生きた癌標的細胞の比は０．３：１〜最大１０：１の範囲にあり、各比に関する平均蛍光及び標準誤差をプロットする。細胞死の割合を計算し、そして、データを一般的な線形モデルを使用して分析した。
四種類のワクチン用量で処置されたマウスに対する対照からの脾臓重量の比較のための「プロトコール２」によるワクチン接種及び摘出のタイムライン。Ｃ５７ＢＬ／６対照（ｎ＝１２）又は１×１０７の放射線照射Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝９）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１０）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１１）細胞を含むワクチンの四種類の用量が腹腔内注射されたマウスは、（Ａ）に示したタイムラインに従ってワクチン接種した。脾臓を摘出し、重量を平均±ＳＥとして記録し、それは（Ｂ）に示した２つの独立した実験を代表するものである。
四種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを受けたマウスからの（リンパ節ではなく）脾臓及び血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の高い上昇％。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝９）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１０）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１１）ワクチン細胞のいずれかをワクチン接種プロトコール２のタイムラインで注射したか、又は対照（ｎ＝１２）として無処置のままにした。４２日目に、脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）、及びリンパ節（Ｃ）を、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の違いを評価した。このデータは、２つの独立した実験を代表するものであり、平均及び標準誤差を示した。
四種類のワクチン用量に晒されたマウスの脾臓及びリンパ節由来のリンパ球からのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ｎ＝１２）として使用されたか、又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝９）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１０）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１１）ワクチンのいずれかを用いてワクチン接種「プロトコール２」に従ってワクチン接種した。脾臓を摘出し、そして、リンパ球を、不活性化したＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の単層を含んだＭＬＣで培養した。ＭＬＣで３〜５日後に、リンパ球を回収し、そして、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団における変化について分析した。このデータは、４つの独立した実験から収集された。黒色の棒線：ＣＤ８＋Ｔ細胞；灰色の棒線：ＣＤ４＋Ｔ細胞。（Ｂ）対照マウス、又は４種類のワクチン用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞のいずれかを投与したマウスからのリンパ球を、抗原性刺激因子として癌ワクチン細胞を使用したＭＬＣで５日間培養した。リンパ球のフローサイトメトリー解析を実施し、ＣＤ８を発現するものを選択し、次に、活性化マーカーＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの存在について更に評価した。（Ａ）及び（Ｂ）の有意性の指標は：■対照との比較；▲Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βとの比較；▼Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βとの比較；及び◆Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βとの比較、を表す。（Ｃ）対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス、又は４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン細胞のいずれかをワクチン接種したマウスからのリンパ節を摘出し、これらのリンパ球を精製し、そして、標的としてＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β生細胞を使用したＣＴＬアッセイで分析した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ取り込みを使用して、分光光度計により４８５ｎｍ及び５２５ｎｍの励起及び発光波長を使用して検出される細胞死の割合を決定した。細胞死の割合の違いを、一般線形モデルを使用して測定した（１群あたりｎ＝４）。（Ｄ）対照マウス及び「プロトコール２」に従ってＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞のいずれかをワクチン接種したマウスからの脾リンパ球を、最後のワクチン接種の４日後に精製した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ取り込みを使用して、分光光度計により４８５ｎｍ及び５２５ｎｍの励起及び発光波長を使用して検出される細胞死の割合を決定した。細胞死の割合を計算し、そして、群間の違いを、一般線形モデルを使用して決定し（１群あたりｎ＝２）、そして、対照サンプルと比較した統計的有意性を示した。（Ｃ）及び（Ｄ）をトレースするグラフ：■対照エフェクター＋標的；Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βエフェクター＋標的；▼Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βエフェクター＋標的；及び◆Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βエフェクター＋標的。
５日間培養したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球を含むＭＬＣウェルで観察された高レベルの癌細胞死。（Ａ）非ワクチン接種マウス又は（Ｂ）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ−ＩＦＮ−γ／β細胞；（Ｃ）Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞若しくは（Ｄ）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種されたマウスのいずれかの脾臓由来のリンパ球と共に、抗原性刺激因子としての、マイトマイシンＣで成長不活性化したＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の単層を含有するＭＬＣを、倒立顕微鏡下で視覚化した。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのＭＬＣ由来のリンパ球のＣＴＬアッセイにおいて蛍光顕微鏡によって視覚化された高い細胞死の代表例。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾リンパ球を、５日間、ＭＬＣで培養し、その後、ＣＴＬアッセイに使用した。標的Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞をＤｉＩ（赤色）で染色し、そして、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを使用して、死細胞のパーセンテージを検出するために染色した。明視野、緑色、及び赤色蛍光画像を、ＣＴＬアッセイ内の様々なウェルについて記録し、そしてそれは、１００％生きた標的のみ（ＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞）、１００％死滅した標的のみ（０．４％のＮＰ９で処置されたＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞）、１００％生きたエフェクター（リンパ球）のみ又は１０：１比で組み合わせられたエフェクター及び標的のいずれかを含んだ。重ね撮り画像も示されているとおり含めた。
（Ａ）Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／βワクチンに応答したＭＬＣ由来脾リンパ球を使用したＣＴＬアッセイにおける細胞死。投薬を受けていない、対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス、又はワクチン接種プロトコール２に従ってＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種されたマウスからの脾リンパ球を、調製し、精製し、そして、エフェクターとして（Ｅ）Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β抗原性刺激因子を用いてＭＬＣで５日間培養した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ核取り込みを使用して、４８５ｎｍの励起波長及び５２５ｎｍの発光波長に設定された分光光度計を使用して細胞死を検出した。エフェクター（Ｅ）対生きた癌標的細胞（Ｔ）の比は０．３：１〜最大１０：１の範囲にあり、Ｅ：Ｔの各比に関する細胞死の割合の平均及び標準誤差をプロットする。細胞死の割合を計算し、そして、データを一般的な線形モデルを使用して分析した。（Ｂ）、（Ｃ）Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウス由来の脾リンパ球のＭＬＣにおける％ＣＤ４＋Ｔ細胞、にもかかわらず増強された％ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ｎ＝２１）として使用したか、又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１５）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１６）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝１８）ワクチンのいずれかをワクチン接種プロトコール１若しくは２を使用して示しされたように注射した。対照及びワクチン接種されたマウスからの脾臓を摘出し、リンパ球を単離し、そして、不活性化したＩＦＮ−γ／β処置Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の単層を含むＭＬＣで増殖させた。ＭＬＣで５日後に、混合リンパ球集団を回収し、そして、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における変化について分析した。データは４つの独立した実験を代表するものである。平均及びＳＥが示され、そして、データを対応のない標本のＴ検定を使用して分析した。斜め縞模様の棒線：ＣＤ４＋Ｔ細胞（プロトコル１）；チェック模様の棒線：ＣＤ４＋Ｔ細胞（プロトコル２）；透明な棒線：ＣＤ８＋Ｔ細胞（プロトコル１）；及び縦縞模様の棒線：ＣＤ８＋Ｔ細胞（プロトコル２）。平均値の違いを、ボックスプロット（Ｂ）及び（Ｃ）で示す。
（Ａ）プロトコール２に従ってＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンで処置されたマウスからのＭＬＣで増殖させた脾臓由来リンパ球からの活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団。対照マウス、又はプロトコール１又は２に従ってＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞のいずれかをワクチン接種したマウスからのリンパ球を、抗原性刺激因子としてのＢ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞の単層と共にＭＬＣで５日間培養した。次に、リンパ球を、ＣＤ８の発現、並びに活性化マーカーのＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γについてフローサイトメトリーによって分析した。このデータは、４つの独立した実験を代表するものである。平均及びＳＥを示し、そして、群間の違いを対応のない標本のＴ検定で分析した。（Ｂ）２種類のワクチン用量から成るプロトコール１プライム／ブーストストラテジーを用いたマウスワクチン接種は、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１細胞を用いた抗原投与後の生存を有意に増加させる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用したか、又はワクチン接種プロトコール１に従って、二種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／−Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンのいずれかを腹腔内に注射した（１群あたりｎ＝４）。最後のワクチン接種の４日後に、すべてのマウスに、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を左側後脇腹に皮下注射した。腫瘍増殖を、２〜３日おきにノギスを使用して計測し、そして、腫瘍がいずれかの方向で最大２．０ｃｍの長さに達したとき、マウスを安楽死させた。このデータは一つの実験を代表するものであり、そして、生存は、ログランク検定を使用して分析した。
抗原投与による腫瘍成長を評価するための、４種類の用量でＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞のいずれかを用いたマウスのワクチン接種。マウスに、プロトコール２に従って４種類の用量でＣ５７ＢＬ／６Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝７）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチン（ｎ＝７）のいずれかを与えたか、又は対照として非ワクチン接種（ｎ＝６）のままにした。最後のワクチン接種の４日後に、すべてのマウスに、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の左側後脇腹への皮下注射によって抗原投与した。（Ａ）腫瘍増殖を、２〜３日おきにノギスを使用して計測し、そして、腫瘍がいずれかの寸法で最大２．０ｃｍの長さに達したとき、マウスを安楽死させた。（Ｂ）初期腫瘍抗原投与を生き残ったマウスに、初期腫瘍抗原投与の９４及び９８日後に、追加の２種類の用量のワクチンを用いて更にブーストした。ワクチン接種されたマウス及び別個の群の投薬を受けていないマウスに、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の最後のブースター注射の４日後に（１０２日目に）抗原投与し、そして、腫瘍増殖を２〜３日おきに観察した。このデータは、２つの独立した実験を代表するものであり、そして、生存を、ログランク検定を使用して分析した。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照（ｎ＝７）として使用したか、又は４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝３）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞（ｎ＝６）のいずれかを注射した。四回目及び最後のワクチン接種の４日後に、すべてのマウスに、１×１０６の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞の高い腫瘍負荷の左側後脇腹への皮下注射によって生きた腫瘍抗原投与を与えた。腫瘍増殖を、（Ａ）及び（Ｂ）に記載したように計測した。グラフにトレースする：■対照；◆Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β；▼Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β；及び・Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β。
４種類の用量の細胞ワクチンで処置されたマウスにおける腫瘍増殖。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用したか、又は４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β全細胞ワクチンのいずれかを注射した。最後のワクチン接種の４日後に、すべてのマウスに、５×１０５の生きた野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞（ｎ＝３）の左側後脇腹への皮下注射によって抗原投与した。（Ａ）それらを安楽死させる前に、腫瘍の大きさを、１７日目に計測し、記録した。腫瘍（Ｂ）及び脾臓（Ｃ）を、屠殺したマウスから摘出し、計量した。データの平均±ＳＥを示し、そして、一元配置分散分析を実施して、群間の腫瘍及び脾臓の重量を比較した。結果を平均±ＳＥとして示し、一元配置分散分析を実施して、腫瘍のサイズを比較した。
生きたＢ１６−Ｆ１０細胞を用いた抗原投与前に、ワクチン用量を受けたマウスの脾臓、腫瘍、血液、及びリンパ節のＣＤ８＋Ｔ細胞集団。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用したか、又は４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかをワクチン接種した。すべてのマウスに、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０細胞を用いて皮下に抗原投与し、抗原投与の１７日後に、屠殺した。脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）、リンパ節（Ｃ）及び腫瘍（Ｄ）をすべてのマウスから摘出し、次に、加工してリンパ球を精製した。次に、細胞サンプルを、フローサイトメトリーによって％ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及び制御性Ｔ細胞集団について分析した。平均及びＳＥを示す。
生きたＢ１６−Ｆ１０細胞を用いた抗原投与前に４種類の用量の抗癌性ワクチンを受けたマウスの生存。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、非ワクチン接種、対照として使用したか、又は５×１０４の生きたＢ１６−Ｆ１０細胞を用いた皮下抗原投与前に、４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞（ｎ＝４）をワクチン接種した。腫瘍増殖を、２〜３日おきに観察し、そして、腫瘍がいずれかの方向で最大２．０ｃｍに達したとき、マウスを安楽死させた。このデータを、生存分析に移し、そして、有意性を、ログランク検定を使用して測定した。（Ｂ）マウスを、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与したことを除いて、（Ａ）に記載のとおり調製した。少なくとも１１２日間腫瘍なしのままにしたマウスに、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝２）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）細胞のいずれかの追加の２種類の用量のワクチンを与えた。ワクチン接種及び対照、非ワクチン接種（ｎ＝４）マウスに、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞（ｎ＝４）を用いて抗原投与し、対照マウスは、無処置（ｎ＝４）のままにした。脾臓を、生きた腫瘍負荷注射の９日後に採取し、そして、重量を平均及びＳＥとして記録した。
生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した後に長期間、腫瘍なしのままにしたワクチン接種マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用するか、又は５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いた抗原投与前に、２種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかで処置した。少なくとも１１２日間腫瘍なしのままにしたマウスに、Ｂ１６Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝２）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）細胞のいずれか同じワクチンの追加の２種類のブースター抗原投与量を与えた。ワクチン接種又は対照、非ワクチン接種マウス（ｎ＝４）に、最後のブースターワクチン接種の４日後に、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与し、そして、対照マウスを無処置（ｎ＝４）のままにした。生きた腫瘍負荷注射の９日後に、マウスを安楽死させ、それらの脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）及びリンパ節（Ｃ）を摘出した。リンパ球を精製し、フローサイトメトリーによって％ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団について分析した。平均及び標準誤差を示す。
生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した後に長期間、腫瘍なしのままにしたワクチン接種マウスにおけるＴＥＭ細胞の分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用するか、又は５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いた抗原投与前に、２種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかで処置した。少なくとも１１２日間腫瘍なしのままにしたマウスに、Ｂ１６Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝２）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）細胞のいずれか同じワクチンの追加の２種類のブースター抗原投与量を与えた。ワクチン接種又は対照、非ワクチン接種マウス（ｎ＝４）に、最後のブースターワクチン接種の４日後に、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与し、そして、対照マウスを無処置（ｎ＝４）のままにした。生きた腫瘍負荷注射の９日後に、マウスを安楽死させ、それらの脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）及びリンパ節（Ｃ）を摘出した。リンパ球を精製し、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞集団を同定し、同時に、ＴＥＭ及びＴＣＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の存在について分析した。平均及び標準誤差を示す。
二重抗原投与した後に長期間、腫瘍なしのままにしたワクチン接種マウスにおける脾臓重量及びＴ細胞集団の分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、対照として使用するか、又は４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかをワクチン接種し、次に、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与した。マウスは、同じワクチン細胞を用いて二度の更にブーストされる前、及び別の５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて再抗原投与される前、１０２日間腫瘍なしのままにした。先の試験（図１８）からのマウスは、それらがＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝３）、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝７）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝６）細胞のいずれかを用いて更に４日あけて二度ブーストされたとき、少なくとも１９０日間腫瘍なしのままにした。ワクチン接種又は対照、非ワクチン接種マウス（ｎ＝４）に、最後のブースターワクチン接種の４日後に、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与し、そして、対照マウスを無処置（ｎ＝４）のままにした。生きた腫瘍負荷注射の６日後に、マウスを安楽死させ、そして、脾臓重量を平均として記録した。脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）及びリンパ節（Ｃ）を摘出し、リンパ球を精製し、フローサイトメトリーによって％ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団について分析した。平均及び標準誤差を示す。
生きた腫瘍細胞を用いた抗原投与後に、長期間腫瘍なしのままにしたワクチン接種マウスのＴＥＭ細胞。先の図面に記載した脾臓（Ａ）、血液（Ｂ）及びリンパ節（Ｃ）のリンパ球を更に精製し、そして、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞集団を同定し、同時に、ＴＥＭ及びＴＣＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の存在について分析した。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンを注射した後に、ＬＴα−／−マウスは高い脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を産生した。ＬＴα−／−マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝８）抗癌ワクチンのいずれかを注射したか、又は対照（ｎ＝８）として非ワクチン接種のままにした。最後のワクチン接種の４日後に、脾臓を摘出し、計量し（Ａ）、次に、（Ｂ）脾臓及び（Ｃ）末梢血を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の違いについて分析した。このデータは、２つの独立した実験を代表するものであり、平均±ＳＥを示す。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種ＬＴα−／−マウス由来の％ＣＤ８＋Ｔ細胞及び％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＬＣでの培養後に高められ、そして、ＣＴＬアッセイにおいて標的メラノーマ細胞を死滅させるのに最も効果的であった。ＬＴα−／−マウスを、対照（ｎ＝８）として使用したか、又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝４）若しくはＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝８）ワクチンのいずれかを注射した。脾臓由来リンパ球を、３〜５日間ＭＬＣで培養し、次に、（Ａ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団、並びに（Ｂ）活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の変化について分析した。このデータは、４つの独立した実験から収集した。（Ｃ）リンパ球を、ＣＴＬアッセイにおいて標的メラノーマ細胞を死滅させるそれらの能力を評価した。エフェクター（Ｅ）対生きた癌標的細胞（Ｔ）の比は、０．３：１〜最大１０：１の範囲にわたり、そして、Ｅ：Ｔの各比について細胞死の割合の平均±ＳＥをプロットする。グラフの値は、３０％の標的細胞溶解を生じることができるエフェクター細胞（×１０４）の数、及び非ワクチン接種マウスのＣＴＬ反応に対するエフェクター細胞集団あたりの溶解単位の相対的増加倍率を示す。
抗癌ワクチンは、５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与したＬＴα−／−マウスの大部分に対して防御効果を有し、それに続いて、これらのマウスによって産生される％ＴＥＭ細胞集団を増強する。初期腫瘍抗原投与後に、腫瘍なしのままのワクチン接種ＬＴα−／−マウスを、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β（ｎ＝３）細胞ワクチンを用いて二度ブーストし、及び５×１０５の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて再抗原投与した。ワクチン接種及び対照、非ワクチン接種（ｎ＝３）マウスに、最後のブースターワクチン接種の４日後に、５×１０５のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて抗原投与した。対照、非ワクチン接種マウスの群（ｎ＝４）は無処置のままにした。脾臓を摘出し、そして、（Ａ）計量し、次に、（Ｂ）脾臓及び（Ｃ）末梢血からのリンパ球を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団について分析した。（Ｄ）脾臓及び（Ｅ）末梢血のＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、ＴＥＭ及びＴＣＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団の存在について更に分析した。
高濃度のＩＦＮ−γ／βでの処置後のＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬソート１細胞上のＨ−２Ｋｂ発現の無変化。Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬソート１細胞を、様々な濃度のＩＦＮ−γ／βで処置し、次に、ＦＩＴＣ結合抗マウスＨ−２Ｋｂ Ａｂで染色した。細胞のＨ−２Ｋｂ発現の検出を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用しておこなった。黒色のヒストグラムは、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ及び１０００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−βで処置したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞のアイソタイプ染色サンプルを表す。赤色のヒストグラムは、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βで処置し、そして、２ＫＢ−Ｈ Ａｂで染色したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞を示す。２０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ／１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ／１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−βで処置した後の細胞におけるＨ−２Ｋｂの発現を、それぞれ青色及び緑色のヒストグラムで示す。黄色及び紫色のヒストグラムは、それぞれ１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ／２０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β及び２０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ／２０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−βを用いた処置後の同じ細胞におけるＨ−２Ｋｂ発現を示す。
発明の詳細な説明
１．略語
当該出願を通じて、以下の略語が使用される：
ａａ＝（単数若しくは複数の）アミノ酸
ｈ＝時間
ＩＦＮ＝インターフェロン
Ｉｇ＝免疫グロブリン
ＩＦＮ＝インターフェロン
ＩＬ＝インターロイキン
ＭＨＣ＝主要組織適合性複合体
ｍｉｎ＝分
ＭＬＣ＝混合リンパ球培養
ｎｔｓ＝ヌクレオチド
ｓ＝秒
ＳＴＡＴ＝シグナルトランスデューサー及び転写の活性化因子
２．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同義である。本明細書で記載されたものと類似の又は同等の任意の方法及び材料は本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料が記述されている。本発明ために、下記の用語については以下に定義される。
冠詞「a」及び「an」は、本明細書で用いられるとき、この冠詞の文法上の客体の一つ又は二つ以上（即ち、少なくとも一つ）を指す。例を挙げれば、「an cell」は一つの細胞又は複数の細胞を意味する。
用語「about」は、本明細書中に使用される場合、約、そのあたり、おおまかに、又はおよそ、を意味する。用語「about」が、数値域に関連して使用されるとき、それは境界を説明する数値の上下に延長することによって、その範囲を変更する。一般に、用語「about」は、１０％の変化まで表示値の上下に数値を変更するために本明細書中に使用される。そのため、約５０％は、４５％〜５５％の範囲を意味する。
終点によって本明細書中に列挙される数値域は、すべての数及びその範囲内に組み込まれた部分を包含する（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４及び５を包含する）。すべての数及びその部分が用語「about」によって変更されたと見なされることも理解されるべきである。
用語「同時投与」又は「同時に投与する」とは免疫刺激性分子とインターフェロン処置された動物細胞の両方を含む単一の組成物の投与、又はそれぞれの活性物を別の組成物として投与すること及び／又はこれらの活性物の両方が単一の組成物として投与される場合に得られる効果と同等の効果が得られるような十分に短い時間内に別の経路により送達されることを意味する。
本明細書中に使用される「and/or」は、関連して列挙されたアイテムの１若しくは複数の可能性のある組み合わせのいずれか及びすべて、並びに代替（ｏｒ）と解釈されるとき、組み合わせの欠如に関し、且つ包含する。
用語「作用物質」又は「調節性作用物質」は、所望の薬理学的及び／又は生理作用を引き起こす化合物を包含する。その用語はまた、これだけに限定されるものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などを含めた、本明細書中に特に言及されたそれらの化合物の医薬的に許容される及び／又は薬理学的な有効成分も包含する。上記用語が使用されるとき、これが活性物質自体、並びに医薬的に許容される、薬理学的な活性塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを包含することは理解すべきである。用語「作用物質」は、狭く解釈されるべきではなく、小分子、ペプチドやポリペプチドやタンパク質などのタンパク様分子、並びにそれらを含む組成物、そして、ＲＮＡやＤＮＡやその模倣体や化学類似体、並びに細胞作用物質などの遺伝子分子に及ぶ。用語「作用物質」は、本明細書中に言及したポリペプチドを産生及び分泌できる細胞、並びにそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。よって、用語「作用物質」は、さまざまな細胞における発現及び分泌のためのウイルス若しくは非ウイルス性ベクター、発現ベクター及びプラスミドなどのベクターを含めた核酸構築物に及ぶ。
用語「４−１ＢＢ作動薬」は、本明細書中で使用される場合、４−１ＢＢの機能を作動させるか、そうでなければ、活性化若しくは増強するように、成分を直接的又は間接的に作動させるか又は拮抗する任意の作用物質を指す。いくつかの実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、直接的４−１ＢＢ機能を作動させる。好適には、４−１ＢＢ作動薬は、４−１ＢＢと結合し、そして、受容体を活性化することによって、直接的に４−１ＢＢ機能を作動させる。ある他の実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、間接的に４−１ＢＢ機能を作動させる。好適には、４−１ＢＢ作動薬は、直接的又は間接的に１若しくは複数の成分、例えば４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）のレベルを強化することによって、間接的に４−１ＢＢ機能を作動させる。
用語「同種異系」は、本明細書中で使用される場合、遺伝的には異なるが、対象と同じ種に属しているドナー又は起源から得られる細胞又は組織を指す。
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対し結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、及び非免疫グロブリンから誘導された抗原結合活性を示すタンパク質枠組みにまで及ぶものと理解される。
「人工抗原提示細胞」とは、インビボでは天然に生じない専門家向けの抗原提示細胞を意味する。抗原提示細胞は、本願に記載のように、異種細胞サンプルからインビボにおいて作り出され得る。人工的に作り出される前に、異種サンプルは、いずれかの抗原提示細胞（例えば、動物細胞）でなくても、又はそれを含んでいなくてもよい。或いは、人工抗原提示細胞は、着目のポリペプチドを過剰発現するように遺伝子を組み換えられた抗原提示細胞（例えば、マクロファージ）から得られる場合もある。
「自己由来の」とは、同一生物から誘導したあるもの（例えば、細胞、組織など）を意味する。
「生物活性断片」とは、全長親ポリペプチドの断片であって、親ポリペプチドの活性を保持する断片を意味する。従って、生物活性断片は、とりわけ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、Ｂ７−１分子及びＢ７−２分子から選択される親ポリペプチドの生物活性を有する。本明細書で用いるとき、用語「生物活性断片」には、例えば、少なくとも８個の、好ましくは少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも１５個の、更により好ましくは少なくとも２０個の、そして更に一層好ましくは少なくとも３０個の連続したアミノ酸の、上記の活性を含む欠失突然変異体及び小さなペプチドが含まれる。このタイプのペプチドは標準的組み換え核酸技術の適用により得られ、又は通常の液相若しくは固相合成法を用いて合成しうる。例えば、上述の溶液合成又は固相合成については、例えば、ニコルソンにより編集されブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズにより出版された「合成ワクチン」という表題の出版物に含まれるアサートンとシェパードによる「ペプチド合成」という表題の第９章を参照らしうる。または、ペプチドは本明細書のポリペプチドを、エンドＬｙｓ−Ｃ、エンドＡｒｇ−Ｃ、エンドＧｌｕ−Ｃ、及びスタフィロコッカスＶ−８−プロテアーゼなどのプロテイナーゼで消化することにより調製できる。この消化された断片は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により精製することができる。
本明細書で用いられるとき、「細胞性組成物」、「細胞性ワクチン」又は「細胞性免疫原」とは、活性成分として、任意選択的に失活されている、少なくとも一つの細胞集団を含む組成物を意味する。
本明細書を通じて、文脈が他の意義を要求しない限り、語「含む（comprise）」、「含む（comprises ）」及び「含む（comprising）」は、述べられた工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を含むことを意味するが、如何なる他の工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を排除することを意味するものではないと理解される。
「相当する」又は「相当している」とは、基準核酸配列に対して実質的な配列同一性を示す核酸配列（例えば、基準核酸配列の全部又は一部に対して、少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、或いは最大１００％の配列同一性）又は基準アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性又は同一性を示すアミノ酸配列（例えば、基準アミノ酸配列の全部又は一部に対して、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、或いは最大１００％の配列類似性又は同一性）を意味する。
本明細書中に使用される場合、用語「培養する」又は「培養された」は、細胞の成長、生存能力、維持、及び／又は分化をサポートする条件下で細胞集団をインキュベートするために必要なインビトロのステップを指す。当該技術分野では、培地、温度範囲、ガス濃度、培養添加剤の多くの形式が、細胞の成長、生存能力、維持、及び／又は分化をサポートすること、並びに特異的なパラメーターが、着目の培養系において規定される必要があることが広く認識されている。培養に関するパラメーターは、選択された様式及びその培養物の具体的な目標（例えば、本明細書中に開示される人工抗原提示細胞の産生）によって異なる。適切な培養パラメーターの決定が当該技術分野において日常的であることは認識されている。
「有効量」とは、健康状態の処置との関連において、単回投与または一連の投与の一部として、斯かる処置を必要とする個人の免疫応答を惹起する量の作用物質（例えば、本発明の人工的な抗原提示細胞又は斯かる細胞を含む組成物）の投与を意味する。有効量は、治療されるべき個人の健康および身体状態、治療されるべき個人の分類学的グループ、組成物の調製物、医学的状況の評価、およびその他の関連する要因に応じて変化する。その量は、定型の試験を通じて決定することのできる比較的広い範囲に収まることが期待される。
当分野で良く知られているように、免疫応答を強化すること（「免疫強化」）とは、外来性の抗原又は疾病特異的抗原（例えば、癌抗原）に応答する動物の能力を強化する、即ち、そのような抗原を攻撃するように準備されたこれらの細胞は、その数、活性、及びこれらの抗原を検出し破壊する能力において強化されることを意味する。免疫応答の強度は、当分野で知られた手段による末梢血リンパ球の直接測定、天然キラー細胞の細胞障害性検定法（例えば、プロヴィンシアリ，Ｍら（Provinciali M. et al (1992, J. Immunol. Meth. 155: 19-24を参照) 、細胞増殖検定法( 例えば、Vollenweider, I. And Groseurth, P. J. (1992, J. Immunol. Meth. 149: 133-135を参照) 、免疫細胞及び下位集合の免疫検定法（例えば、Loeffler, D. A., et al. (1992, Cytom. 13: 169-174); Rivoltini, L., et al. (1992, Can. Immunol. Immunother. 34: 241-251)を参照) 、又は細胞により媒介された免疫についての皮膚試験（例えば、Chang, A. E. et al (1993, Cancer Res. 53: 1043-1050)を参照) を含む標準的試験により測定される。前記の試験により測定された免疫応答の強さにおける統計学的に有意の増加はすべて、本明細書で用いられる「強化された免疫応答」、「免疫強化」又は「免疫増強」と考えられる。強化された免疫応答は、発熱や炎症並びに全身的及び局部的感染の回復などの肉体的発現、及び疾病の症候の緩和、癌若しくは腫瘍を含めた疾病又は健康状態の症候の緩和によっても示される。斯かる肉体的発現も、本明細書で使用される「強化された免疫応答」、「免疫強化」又は「免疫増強」を明確に確定する。いくつかの実施形態において、用語「高められた免疫応答」、「免疫強化」又は「免疫増強」としては、（例えば、標的抗原に対する）細胞及び／又は液性免疫応答の刺激又は増強を含む。
本明細書中に使用される場合、用語「外因」とは、生物体、細胞、組織又は系の外側から導入されたか又は外側で製造された任意の材料を指す。
本明細書中に使用される場合、用語「発現」及びその同義語には、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生、特に、遺伝子又は遺伝子の一部からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の産生、及びＲＮＡ又は遺伝子若しくは遺伝子の一部によってコードされたポリペプチドの産生、並びに発現に関連している検出可能な材料の出現が含まれる。例えば、細胞表面のポリペプチドの存在は、用語「発現」の範囲内に含まれ、そしてそれは、「表面発現」と記述されることが多い。別の例は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ又は抗体などの結合リガンドの、遺伝子又は他のポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、又はポリペプチド若しくはタンパク質断片への結合、並びに結合リガンドの視覚化である。よって、マイクロアレイ上の、ノーザンブロットなどのハイブリダイゼーションブロット上の、又はウエスタンブロットなどの免疫ブロット上の、又はビーズアレイ上の、又はＰＣＲ分析によるスポットの高められた強度は、基本的な生物学的分子の用語「発現」の範囲内に含まれる。
「発現構築物」とは、挿入したポリヌクレオチドの転写を可能にする、そして任意選択的に、転写産物をポリペプチドの翻訳を可能にする必要な要素を含む遺伝子構築物を意味している。発現構築物は、典型的には、機能し得る状態、且つ、５’から３’への方向で：構築物が導入される宿主細胞内で機能するプロモーター、発現されるポリヌクレオチド、及び構築物が導入される宿主細胞内で機能するターミネーター、を含む。本明細書中に企図された発現構築物は、クローニング又は発現のために複製可能なベクター内に挿入されても（「発現ベクター」としても知られている）、又は宿主ゲノム内に組み込まれてもよい。
本明細書中に使用される場合、用語「機能」は、生物学的、酵素的、又は治療上の機能を指す。
用語「遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、細胞のゲノムの個別のコード領域、並びに関連非コーディング及び調節領域のいずれか及びすべてを指す。その用語は、特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、及び発現調節にかかわる隣接する５’及び３’非コーディングヌクレオチド配列を意味することを意図している。この点で、遺伝子は、所定の遺伝子に天然に関連しているプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び／又はポリアデニル化シグナルなどの制御シグナル、又は異種の制御シグナルを更に含んでもよい。ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその断片であってもよい。遺伝子は、染色体外での維持のため又は宿主への組み込みのために適当なベクター内に導入されてもよい。
用語「異種細胞集団」は、通常、異なったレベルの細胞表面マーカーを発現する２以上の同じ細胞型及び／又は２以上の細胞型の混合物を指す。異種細胞集団の例としては：体液、生物材料、解離した腫瘍標本、培養細胞、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
分子発現との関連において、「高レベル」又は「増加したレベル」とは、通常より高い、あらかじめ決定された測定値又はサブグループ測定値などの標準より高い、又はそれが別のサブグループ測定値より比較的高いレベルを意味する。例えば、高い又は増加したＢ７レベルは、通常のＢ７レベルより高いＢ７レベルを指す。通常のＢ７レベルは、当業者が利用可能な任意の方法によって測定され得る。高い又は増加したＢ７レベルはまた、あらかじめ決定されたカットオフなどのあらかじめ決定されたレベルと等しいか又はそれより高いレベルを指してもよい。高い又は増加したＢ７レベルはまた、高い又は増加したＢ７レベルのサブグループが別のサブグループより比較的高いＢ７レベルを有するＢ７レベルを指してもよい。いくつかの実施形態において、高い又は増加したＢ７レベルは、ベースラインにて中央Ｂ７レベルより高いことに基づいており、その代表的な例としては、ベースラインレベルを２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍又は２００倍上回る。例えば、本明細書中に使用されるＢ１６Ｈｉｇｈ細胞は、それらの表面に高レベルのＢ７分子を発現し、そしてそれは、野生型Ｂ１６細胞によって発現されるＢ７のレベルを１０倍、５０倍、１００倍又は２００倍上回る。
本明細書で「免疫−相互作用性」というときは、分子の間の、とりわけ該分子の一方が免疫システムの一成分又はそれを模倣するものである場合の、如何なる相互作用、反応、又は結合の他の形態への言及をも含む。
組成物は、若しそれがａ）本来の個体中で抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する免疫応答を形成すること、又はｂ）該化合物又は組成物が投与されなかったならば起こったであろう免疫応答を越えて個体における免疫応答を再構成し、増強し、又は維持すること、のいずれかができるならば、「免疫原性」である。組成物は、若しそれが単一投与又は複数投与で投与される場合、これらの基準のいずれかを達成できるならば、免疫原性である。
細胞の「不活性化」とは、細胞が、子孫を形成するための細胞分割ができないようにされたことを示すために本明細書で用いられる。それにもかかわらず該細胞は刺激に対し応答することができ、或いはサイトカインなどの細胞生産物の生合成及び／又は分泌をすることができる。不活性化の方法は当分野で知られている。不活性化の好ましい方法は、マイトマイシンＣなどの毒素での処置、又は照射である。固定された細胞又は透過可能とされた細胞や分裂できない細胞は不活性化された細胞の例でもある。
「単離された」とは、その天然の状態でそれを通常伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。
「調節する」とは、標的分子のレベル及び／又は機能的活性を、直接的又は間接的に増加させ又は減少させることを意味する。例えば、ある作用物質は標的分子以外の分子と相互作用することにより該レベル／活性を間接的に調節しうる。この点で、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的調節の範囲には、第一の核酸分子の発現生成物が標的ポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節するものである場合、この第一の核酸分子の発現の調節が含まれる。
「から得られる」とは、例えば、核酸抽出物又はポリペプチド抽出物などのサンプルが宿主の特定の供給源から単離され、又は誘導されることを意味する。例えば、該抽出物は宿主から直接単離された組織又は生体液から得られうる。
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して連結された複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの関連する構造変異体若しくは合成類似体）から成るポリマー（又はその関連する構造変異体若しくは合成類似体）を意味するために本明細書で用いられる。こうして、用語「オリゴヌクレオチド」は、通常そのヌクレオチド残基及びそれらの間の結合が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを意味するが、この用語はその範囲内にペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸などの種々の類似体を含むが、これらに限定されないものと理解される。この分子の正確な大きさは具体的適用に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは通常長さはかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチド残基までであるが、この用語は如何なる長さの分子をも意味し得る。もっとも、大きなオリゴヌクレオチドに対しては用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」が通常用いられる。
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に結合された」又は「作動可能に連結された」は、構造遺伝子を、これだけに限定されるものではないが、プロモーターを含めた調節要素の調節制御下に置いて、続いて遺伝子の転写及び任意で翻訳を制御することを意味する。異種性プロモーター／構造遺伝子組み合わせの構築において、一般に、遺伝子配列又はプロモーターは、その遺伝子配列又はプロモーター及び自然状況において制御する遺伝子、即ち、遺伝的配列又はプロモーターが派生する遺伝子とほぼ同一距離にある転写開始位置から離れた位置にあることが好ましい。当技術分野において公知であるように、この距離におけるいくつかの変更は機能の消失を伴うことなく受け入れることができる。同様に、制御下に置かれるべき異種性遺伝子に関して調節配列エレメントの好ましい位置はその自然状況、即ち、それが派生する遺伝子内でのそのエレメントの位置によって規定される。
本明細書において互換的に用いられる「患者」、「対象」、「宿主」、又は「個体」という用語は、療法又は予防が所望される任意の対象、特に脊椎動物の対象、より具体的には哺乳動物の対象を示す。本発明の範囲に該当する適切な脊椎動物には、霊長類（例えば、ヒト、サル及び類人猿、そして、マカク属（例えば、Macaca fascicularis及び／又はアカゲザル（Macaca mulatta）などのカニクイザル）及びヒヒ（Papio ursinus）からのサルの種、並びにキヌザル（Callithrix属からの種）、リスザル（Saimiri属からの種）及びタマリン（Saguinus属からの種）、並びにチンパンジー（Pan troglodytes）などの類人猿の種）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目（例えば、ウサギ、野ウサギ）、ウシ亜科(例えば、ウシ）、ヒツジ（例えば、ヒツジ）、ヤギ（例えば、ヤキ）、ブタ（例えば、ブタ）、ウマ（例えば、ウマ）、イヌ（例えば、イヌ）、ネコ（例えば、ネコ）、トリ（例えば、ニワトリ、七面鳥、カモ、アヒル、ガン、セキセイインコのようなコンパニオンバード）、海洋哺乳類（例えば、イルカ、クジラ）、は虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、及び魚類を含む脊索動物亜門の任意のメンバーが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、対象はヒトなどの霊長類動物である。但し、前記の用語は症状が存在することを意味しないことが理解されるであろう。
「医薬的に許容し得る担体」とは、生物学的に又は別の面で好ましくないことのない材料から成る医薬ビヒクルを意味する、すなわち、その材料が、いずれの又は実質的な有害反応を引き起こすことなく、選択された活性物質と共に対象に投与され得る。担体としては、賦形剤及び他の添加剤、例えば希釈剤、洗浄薬、着色剤、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存料、トランスフェクション剤などを挙げることができる。
用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列又は当該技術分野で知られているストリンジェントな条件下において参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的に配列同一性を示すポリヌクレオチドを示す（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, 1989を参照）。これらの用語は、一つ又は複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失、又は異なるヌクレオチドと置換したポリヌクレオチドも含む。この点に関して、当技術分野では、参照ポリヌクレオチドには突然変異、付加、欠失及び置換を含む一部の変化が起こることができて、それによって変化したポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持するということが十分に理解される。「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」という用語は、自然に発生する対立遺伝子変異型も含む。
用語「ポリペプチド」、「タンパク様分子」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマー、ならびに同一物の変異型及び合成類似体を示すために互換的に用いられる。従って、これらの用語は、対応する天然アミノ酸及び天然アミノ酸ポリマーの化学的類似物ように、一つ又は複数のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに当てはまる。これらの用語は、改変、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを除外しない。対象のタンパク様分子の可溶形は、特に有用である。例えば、非天然アミノ酸を含むアミノ酸の１若しくは複数の類似体を含有するポリペプチド、又は置換された連結を伴ったポリペプチドが、定義の中に含まれる。
「ポリペプチド変異型」という用語は、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失又は置換によって参照ポリペプチドから変化するポリペプチドを示す。当技術分野では、いくつかのアミノ酸は大まかに言ってほぼ等しい特性を持つ別のアミノ酸に変化し得て、そのポリペプチドの活性の特徴は変化しないことが十分に理解される。従って、本明細書において用いられるようにポリペプチド変異型は、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、B7-1分子及びB7-2分子から選択される親ポリペプチドとほぼ等しい活性を持つポリペプチドを含む。好ましい変異型ポリペプチドは保存的なアミノ酸置換を含む。ポリペプチドにおける例示的な保存的置換は下表に従って行われ得る：
表１
機能の実質的変更は、表１に示されるものよりも保存性の低い置換を選択することにより行なう。他の置換は、非同類置換となり、それらの比較的少数が許容されるであろう。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化を生ずる可能性のある置換は、（ａ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ又はＡｓｎ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ）の代わりに、又は疎水性残基により置換される場合、（ｂ）システイン又はプロリンが他の任意の残基の代わりに、又は他の任意の残基により置換される場合、（ｃ）正電荷の側鎖を持つ残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）が負電荷残基の代わりに、又は負電荷残基（例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）により置換される場合、又は（ｄ）小さな側鎖を持つ残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）又は側鎖を持たない残基（例えば、Ｇｌｙ）が大きな側鎖を持つもの（例えば、Ｐｈｅ又はＴｒｐ）の代わりに、又は大きな側鎖を持つものにより置換される場合である。
「プライマー」とは、ＤＮＡの１本の鎖と対になると、適切な重合化物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは増幅の最大効率のためには１本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であることもできる。プライマーは重合化物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの長さは、適用、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの供給源などの多くの要因に左右される。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチド残基を含むが、より少ないヌクレオチド残基しか含まなくてもよい。プライマーは約２００ヌクレオチドから数キロ塩基以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリダイズしそして合成の開始のための部位として役立つように設計された鋳型上の配列に「実質的に相補的」であるように選択され得る。「実質的に相補的」とは、該プライマーが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするための十分な相補性を有することを意味する。プライマーはそれがハイブリダイズするように設計された鋳型との不適合を含まないことが好ましいが、これは本質的ではない。例えば、プライマー配列の残りの部分が鋳型に相補的である場合は、非−相補的ヌクレオチド残基をプライマーの５’末端に結合させうる。または、プライマー配列がハイブリダイズする鋳型の配列と十分な相補性を有することにより、プライマーの伸長生産物の合成のための鋳型を形成するのであれば、非−相補的ヌクレオチド又は非−相補的ヌクレオチドの断片をプライマー中に散在させることができる。
用語「組み換えポリヌクレオチド」とは、本明細書で用いられるとき、核酸の操作によりインビトロで天然では通常見出されない形に形成されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、組み換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形であってもよい。一般に、斯かる発現ベクターには、ヌクレオチド配列に機能しうるように連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸が含まれる。
「組み換えポリペプチド」とは、組み換え技術を用いて、即ち、組み換えポリヌクレオチドの発現により、作製されたポリペプチドを意味する。
本明細書で用いるとき、免疫応答又は免疫学的応答を「刺激する」とは、外来分子、又は腫瘍細胞などの標的物質に宿主の免疫系が反応する能力を、そうでなければ生ずるであろうレベルよりも高いレベルで開始させ、強化し、又は維持する組成物の投与を意味する。「一次」免疫応答を刺激するとは、本明細書では、例えば、標的抗原との接触の欠如、標的への無反応性、又は免疫抑制により、以前に反応性が検出されなかった被験者に特異的な免疫反応性を誘発することを意味する。「二次的」応答を刺激するとは、例えば、天然の免疫、自発的免疫化、又は一つ若しくは複数の組成物若しくは手順を用いる処置により、以前に反応性が検出された被験者の反応性の再開始、強化、又は維持を意味する。
「ストリンジェンシー」とは、本明細書中で使用される場合、ハイブリダイゼーション中の、温度及びイオン強度条件、並びに特定の有機溶媒の存在又は不存在を指す。ストリンジェンシーが高ければ高いほど、観察される配列間の相補性の程度がより高くなる。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェント条件」とは、その条件下では、高い割合で相補的塩基を有する、好ましくは厳密な相補性を有するポリヌクレオチドのみがハイブリダイズする温度及びイオン条件を指す。必要であるストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存性であり、且つ、ハイブリダイゼーション中に存在する種々成分に依存し、そして、ヌクレオチド類似体が使用された場合、大きく変更される。
典型的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約１０℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度及びｐＨ下で）標的配列の５０％が相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。当然のことながら、ポリヌクレオチドは、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下で、そして、より好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、標的配列にハイブリダイズする。本明細書中における低ストリンジェンシー条件への言及としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖホルムアミドと少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、及び４２℃での洗浄のための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩が挙げられ且つ包含される。低ストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、及び室温での洗浄のための（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；又は（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳを含んでもよい。中程度のストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドと少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、及び４２℃での洗浄のための、少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩が挙げられ且つ包含される。中程度のストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、及び４２℃での洗浄のための（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；又は（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳを含んでもよい。高ストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドと少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、及び４２℃での洗浄のための少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩が挙げられ且つ包含される。高ストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、及び６５℃を超える温度での洗浄のための（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；又は（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳを含んでもよい。高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６×ＳＳＣ中のハイブリダイズ、続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の１若しくは複数回の洗浄を含む。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃での０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイズ、続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中の１若しくは複数回の洗浄を含む。他のストリンジェント条件は、当該技術分野で周知である。当業者は、様々な因子がハイブリダイゼーションの特異性を最適化するように操作できることを認識する。最後の洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確実にするのに役立ち得る。詳細な例については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前掲）のページ2.10.1〜2.10.16及びMOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL（Sambrook, et al., eds.）（Cold Spring Harbor Press 1989）の1.101〜1.104の項を参照のこと。
本明細書中に使用する場合、用語「同系」は、遺伝学的に対象と同一であるドナー又は起源に由来する細胞又は組織を指す。
本明細書中に使用する場合、用語「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理及び／又は生理学的影響を得ることを指す。効果は、疾患又は健康状態（例えば、血液悪性腫瘍）、及び／又は疾患又は健康状態に起因する不利な影響の部分的な又は完全な治癒に関して治療学的であり得る。これらの用語はまた、哺乳動物、特にヒトの健康状態又は疾患の任意の処置も網羅し、そして：（ａ）疾患又は健康状態を阻害すること、すなわち、発生を抑えること；又は（ｂ）疾患又は健康状態を退縮させること、すなわち、疾患又は健康状態の軽減を引き起こすこと、を含む。
本明細書中に使用する場合、用語「異種」は、対象と異なる種類のものであるドナー又は起源に由来する細胞又は組織を指す。
３．人工抗原提示細胞
本発明は、少なくとも部分的には、少なくとも一つのインターフェロンの存在下で、動物細胞を培養することにより動物細胞の免疫増強の相乗的強化が見られるという発見に端を発する。ここで、該動物細胞はその表面にＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を発現する。
従って、本発明は、一態様において、その細胞表面にＢ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を含む人工的な抗原提示細胞を提供し、ここで、該細胞の抗原提示機能は、少なくとも１つのＩＦＮに晒すことによって強化され、ここで、該抗原提示細胞は、典型的には動物細胞に由来する。好ましい細胞は、規定されたＭＨＣゲノム領域若しくは同等物を持つ細胞、及び細胞表面への抗原性分子のＭＨＣクラスＩ提示を増加若しくは強化する能力を持つ細胞である。
本発明の細胞は意図された宿主から単離され、処置され、次いで該宿主中に再導入若しくは再注入され得る。外科的切断、生検、採血又は他の適当な技術により治療されるべき宿主から得られる細胞を使用することが特に好ましい。斯かる細胞は、本明細書では「自己由来」細胞と呼ばれる。または、細胞若しくは細胞株（例えば、腫瘍細胞株）は一つの起源から調製及び／又は培養されそして異なる宿主中に導入される。斯かる細胞は、「同系」細胞、「自己由来」細胞、及び「異種」細胞を含む。同種異系細胞の一つの具体的な形は、潜在的受容体と主要及び／又は少量組織適合性抗原を共有している一般的な細胞株を含む。
好適には、上記一般的な細胞株は、細胞免疫応答及び液性免疫応答の一方又は両方を含めた、免疫応答を引き起こすのに十分なレベルでＢ７分子を自然に発現する。好ましい実施形態において、免疫応答は、意図された宿主内でのＴ細胞免疫応答、より好ましくは細胞傷害Ｔリンパ球免疫応答を含む。
該一般的細胞株は、特定の状態に罹り易い又は罹る傾向を持つ集団の高いパーセンテージと適合しうる主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ抗原を含むことが好ましい。人工的な抗原提示細胞の投与によって処置若しくは予防される健康状態は、癌又は腫瘍であることが好適である。該一般的細胞株は内因性Ｂ７分子を高レベルで発現することが好ましい。該一般的細胞株は少なくとも本明細書で記述された一つのＩＦＮによる処置に高度に感受性である（即ち、クラスＩのＨＬＡの高レベル発現を意味する）ことも好ましい。
一実施形態において、処置された細胞（例えば癌細胞）若しくは細胞株は被験体に投与された場合さらなる増殖を防止するため失活させることが好ましい（例えば、対象への癌又は腫瘍の導入を予防する）。物理的、化学的、若しくは生物学的な任意の失活手段を使用しうる。例えば、照射（好ましくは少なくとも約５，０００ｃＧｙ、更に好ましくは少なくとも約１０，０００ｃＧｙ、更に好ましくは少なくとも約２０，０００ｃＧｙ）、又はマイトマイシンＣでの処置（好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約５０μｇ／ｍＬ）が含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、例えば、鳥類種、爬虫類及び哺乳動物から得られる動物細胞にまで及ぶ。哺乳動物が好ましく、そしてこれにはヒト、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）、及び捕獲野性動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が含まれる。ヒトは最も好ましい動物であり、自己由来、同系及び同種異系の細胞の両者がヒト被験者で使用され得る。
動物細胞は癌又は腫瘍の細胞であることが好ましい。本発明のワクチンは該腫瘍細胞又は癌細胞から誘導されるであろう。例えば、本発明の方法に従って肺癌の治療をする場合、該肺癌細胞が本明細書で先に記載したように処置されて肺癌の免疫を可能にする組成物又はワクチンとなるであろう。同様に、乳房腫瘍若しくは乳癌の細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、腎臓癌細胞、なども作製され、本発明による組成物がそれから作製された腫瘍細胞若しくは癌細胞の予防及び／又は治療のために、本発明の方法に従って免疫治療物質として用いられるであろう。好ましい実施形態において、該動物細胞はメラノーマ細胞である。
３．１ Ｂ７分子
Ｂ７分子は、共刺激分子ＣＤ２８のリガンドであり、そしてそれは、ＩＬ−２分泌を促進し、且つ、Ｔ細胞クローン及び一次Ｔ細胞の両方でアネルギーの誘導を予防することが示された。Ｂ７分子及びＣＤ２８の相互作用は、ＩＬ−２のｍＲＮＡ安定性の転写を増強し、並びに抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬを上方制御することによって、Ｔ細胞増殖を刺激する。
好ましい実施形態において、この方法は動物細胞の不均質集団からＢ７分子を発現する細胞を単離する工程を更に含む。本発明では、任意の単離方法が意図される。特定の細胞を単離するための適切な方法は当業者に知られている。例えば、不均質集団からその細胞を特異的に単離するため、該細胞の一つ以上の特定の特性を利用することができる。斯かる特性には、細胞の解剖学的位置、細胞の密度、細胞の大きさ、細胞の形態学、細胞の代謝活性、細胞によるＣａ２＋、Ｋ＋、及びＨ＋イオンなどのイオンの取り込み、細胞による染料などの化合物の取り込み、細胞表面に発現されるマーカー、タンパク質蛍光、及び膜電位などが含まれるが、これらに限定されない。この点で、用いられる適切な方法には、組織の外科的切除、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法、免疫アフィニティ分離（例えば、Dynabead (商標) 分離などの磁気ビーズ分離) 、密度分離（例えば、メトリザミド、Percoll(商標) 、又は Ficoll(商標) 勾配遠心分離) 、及び細胞型特異的密度分離が含まれる。
本発明では、該細胞はフローサイトメトリーにより、又はＢ７分子と免疫相互作用する抗原結合分子を用いる免疫アフィニティ分離により単離することが好適である。
別の実施形態によれば、この方法はその表面上にＢ７分子を発現するように動物細胞を改変する工程を更に含む。こうして、該Ｂ７分子は、該分子の少なくとも一部が細胞外の環境（即ち、各細胞の外側）に露出されているＢ７膜分子であることができる。このＢ７分子には、Ｂ７−１及びＢ７−２が含まれるが、これらに限定されない。該Ｂ７分子はＢ７−１であることが好ましい。Ｂ７−１及びＢ７−２の適切なポリペプチド配列には、それぞれ配列番号２（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ３３６８１）及び配列番号４に記載されたもの、それらの生物活性断片、及びこれらの変異型若しくは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、該改変の工程は、Ｂ７分子がそれから発現されるポリヌクレオチドを動物細胞中に導入する工程を含む。該ポリヌクレオチドは、好ましくは発現ベクターの形で調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されることが好ましい。該ポリヌクレオチドの発現を調節するために利用され得る調節ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結区を含むが、これらに限定されない。斯かる調節ポリヌクレオチドは当業者に知られている。この発現ベクターは少なくとも一つのプロモーターを含むことが好ましい。該ポリヌクレオチドの発現を誘導するために利用できる適切なプロモーターには、構成プロモーター及び誘導可能プロモーターが含まれる。
Ｂ７分子をコードする適切なポリヌクレオチドはすべて使用できる。本発明に従って利用できるＢ７−１分子をコードするポリヌクレオチドは、例えば、フリーマンら (1989，J. Immunol. 143: 2714-2722) 、フリーマンら(1992, Blood 79: 489-494) 、及びゲンバンク・データベース[(位置指定 HUMIGB7、受託番号 M27533)及び (位置指定 NM 005191、受託番号 NM 005191)]に記載されている。Ｂ７−１をコードする典型的ポリヌクレオチド配列は配列番号１３に記載されている。Ｂ７−２分子をコードする適切なポリヌクレオチドは、例えば、アズマら（1993, Nature 336: 76-79)、チェンら (1994, J. Immunol. 152: 4929-4963) 、及びゲンバンク・データベース (位置指定 NM 006889、受託番号 NM 006889) に記載されている。Ｂ７−２をコードする適切なポリヌクレオチドは配列番号１５に記載されている。
Ｂ７タンパク質の発現のための典型的な発現ベクターには、例えば、フォングらによる米国特許第６，０５１，４２８号に記載された単純ヘルペス・アンプリコンが含まれる。
Ｂ７分子をコードするＤＮＡを組み立てそして発現させる技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、核酸増幅法、細胞の形質転換、ベクター、発現系などの構築、及び斯かるＤＮＡを動物細胞中に形質導入又は他の方法で導入すること、は当分野で良く確立されており、ほとんどの実務家は特定の条件や手順についての標準的供給源に通暁しているということは当業者に理解される。
３．２ ４−１ＢＢ作動薬
４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであり、且つ、共刺激受容体分子である（Vinay and Kwon, 1998; and Kwon et al 2000）。４−１ＢＢは、活性Ｔ細胞（Pollok et al. (1993) J. Immunol. 150:771-781）及びＮＫ細胞（Melero et al. 1998）で主に発現される。４−１ＢＢの天然のリガンドは４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）であり、そしてそれは、活性化されたＢ及びＴ細胞、マクロファージ、並びに樹状細胞（Goodwin et al 1993; Pollok et al. 1994; and Alderson et al. 1994）で検出された。本明細書中に記載する場合、４−１ＢＢＬ及び抗−４−１ＢＢ抗体などの４−１ＢＢ作動薬は、Ｔ細胞及び自己反応性Ｂ細胞のＡＩＣＤを刺激するように使用できる。
そのため、方法は、４−１ＢＢ作動薬をそれらの表面に発現するように動物細胞を改変することを更に含む。よって、４−１ＢＢ作動薬は膜分子であり、ここで、前記分子の少なくとも一部が細胞外環境（すなわち、それぞれの細胞の外部）に晒される。４−１−ＢＢ作動薬としては、これだけに限定されるものではないが、４−１ＢＢＬ又はその生物活性断片が挙げられる。４−１ＢＢＬの好適なポリペプチド配列としては、これだけに限定されるものではないが、その生物活性断片を含めた、以下のヒト４−１ＢＢのポリペプチド配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ４１２７３．１）：
及びこの配列の変異型が挙げられる。
配列番号６で説明した配列をコードするこの野生型ポリヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
従って、本発明の人工抗原提示細胞は、４−１ＢＢに結合するそれらの細胞表面分子上に発現する。そのため、本明細書中に提供された分子は、通常、ポリペプチドであることが好適である。いくつかの好ましい実施形態において、本明細書中に提供された方法において有用な４−１ＢＢ作動薬は、４−１ＢＢＬ、又は４−１ＢＢＬの機能的な断片（すなわち、完全長の４−１ＢＢＬが４−１ＢＢに結合する結合力、並びに受容体を活性化する及び免疫応答を増強する機能の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、１００％又はそれ以上）を有する４−１ＢＢに結合する４−１ＢＢＬの断片）であり得る。
代替の実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、４−１ＢＢに対して特異的結合活性を有する抗体であり得る。用語「抗体」及び「（複数の）抗体」は、４−１ＢＢに結合及び活性化できる完全な分子及びその断片を包含する。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＧを含めた任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）クラス、及び任意のそのサブクラスのものであり得る。ＩｇＭクラスの抗体は、典型的には５価であるため、１個の抗体分子が多くの４−１ＢＢポリペプチドを架橋できるので、特に有用であり得る。架橋され（例えば、架橋ＩｇＧ）、これにより多価になるＩｇ分子を含む免疫複合体もまた、複数の４−１ＢＢ分子を架橋できる場合があるので、特に有用であり得る。
ヒト及び非ヒト部分の両方を備えているキメラ及びヒト化モノクローナル抗体などの４−１ＢＢに特異的な組み換え抗体は、本発明の範囲内にある。斯かるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えば国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、欧州特許出願番号ＥＰ１８４１８７、ＥＰ１７１４９６、ＥＰ１２５０２３、ＥＰ１７３４９４；国際特許出願公開番号ＷＯ８６／０１５３３、米国特許番号第４，８１６，５６７号、及び同第５，２２５，５３９号、並びに以下の雑誌記事：Better et al. (1988) Science 240: 1041-43, Liu et al (1987) J. Immunol. 139: 3521-26, Sun et al. (1987) PNAS 84:214-18 Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005, Wood et al (1985) Nature 314: 446-49, Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-59, Morrison, (1985) Science 229: 1202-07, Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214, Jones et al. (1986) Nature 321: 552-25, Veroeyan et al. (1988) Science 239: 1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-60、に記載の方法を使用して当該技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術によって製造され得る。
４−１ＢＢに特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインの少なくとも機能部分を含む抗体フラグメント及び誘導体もまた、本発明の範囲内に含まれる。その分子の結合ドメインを含む抗体フラグメントは、既知の技術で製造され得る。例えば、斯かる断片としては、これだけに限定されるものではないが：抗体分子のペプシン消化によって製造され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；ジスルフィドがＦ（ａｂ’）２フラグメントの架橋を還元することによって製造されるＦａｂフラグメント；及びパパイン及び還元剤で抗体分子を処置することによって製造され得るＦａｂフラグメント、が挙げられる（例えば、National Institutes of Health, Current Protocols In Immunology, Coligan et al. ed. 2.8, 2.10 (Wiley Interscience, 1991を参照）。抗体フラグメントとしては、Ｆｖ（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））フラグメント、すなわち、定常領域のアミノ酸残基をわずかしか含まないか又はまったく含まない抗体生成物もまた挙げられる。ｓｃＦｖフラグメントは、そこからＳｃＦｖが誘導される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含む単一ペプチド鎖である。斯かるフラグメント、例えば、米国特許番号第４，６４２，３３４号に記載されているとおり製造され得る。
３．３ 細胞
好ましい細胞は、規定された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）若しくは同等物を有する細胞、及び細胞表面への抗原性分子のＭＨＣクラスＩの提示を増大若しくは促進する能力を有する細胞である。
本発明の細胞は意図された宿主から得られ、処置され、次いで該宿主中に再導入若しくは再注入され得る。外科的切断、生検、採血又は他の適当な技術により治療されるべき宿主から得られる細胞を使用することが特に好ましい。斯かる細胞は、本明細書では「自己由来」細胞と呼ばれる。または、細胞若しくは細胞株（例えば、腫瘍細胞株）は一つの起源から調製及び／又は培養されそして異なる宿主中に導入される。斯かる細胞は、「同系」及び「自己由来」細胞を含む。同種異系細胞の一つの具体的な形は、潜在的受容体と主要及び／又は少量組織適合性抗原を共有している一般的細胞株を含む。
上記一般的細胞系統は、意図された宿主中で免疫応答、好ましくはＴ細胞免疫応答、更に好ましくは細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答を開始させるのに十分なレベルでＢ７分子、好ましくはＢ７膜分子を自然に発現することが好ましい。
該一般的細胞系統は、特定の状態に罹り易い又は罹る傾向を持つ集団の高いパーセンテージと適合しうるＭＨＣクラスＩ抗原を含むことが好ましい。ワクチン注射により治療され若しくは予防される該状態は癌又は腫瘍であることが適当である。該一般的細胞系統は内因性Ｂ７分子を高レベルで発現することが好ましい。該一般的細胞系統は少なくとも本明細書で記述された一つのＩＦＮによる処置に高度に感受性である（即ち、クラスＩのＨＬＡの高レベル発現を意味する）ことも好ましい。
一実施形態において、人工抗原提示細胞（例えば癌細胞）若しくは細胞系統は被験体に投与された場合さらなる増殖を防止するため失活させることが好ましい。物理的、化学的、若しくは生物学的な任意の失活手段を使用しうる。例えば、照射（好ましくは少なくとも約５，０００ｃＧｙ、更に好ましくは少なくとも約１０，０００ｃＧｙ、更に好ましくは少なくとも約２０，０００ｃＧｙ）、又はマイトマイシンＣでの処置（好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約５０μｇ／ｍＬ）が含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、例えば、鳥類種、爬虫類及び哺乳動物から得られる動物細胞にまで及ぶ。哺乳動物が好ましく、そしてこれにはヒト、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）、及び捕獲野性動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）が含まれる。ヒトは最も好ましい動物であり、自己由来及び同種異系の細胞の両者がヒト被験者で使用され得る。
動物細胞は動物細胞由来であることが好ましい。本発明による人工的な抗原提示細胞又は組成物は、該腫瘍細胞又は癌細胞から誘導されることが好ましい。例えば、本発明の方法に従ってメラノーマの治療をする場合、該メラノーマ細胞が本明細書で先に記載したように処置されてメラノーマ抗原提示細胞又は組成物となるであろう。同様に、乳房腫瘍若しくは乳癌の細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、肺癌、膵臓癌細胞、胃癌細胞、膀胱癌細胞、腎臓癌細胞、なども作製され、本発明の細胞又は組成物がそれから作製された腫瘍細胞若しくは癌細胞の予防及び／又は治療のために、本発明の方法に従って免疫治療物質として用いられるであろう。好ましい実施形態では、該動物細胞はメラノーマ細胞より選択される。
３．４ ＩＦＮ前処置
人工抗原提示細胞を製造するステップは、少なくとも１つのＩ型インターフェロン及び／又はＩＩ型インターフェロンと共に前記細胞を培養することを含む。少なくとも１つのＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はその生物活性断片から選択されるのが好ましい。ＩＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−γ又はその生物活性断片から選択されるのが好ましい。
ＩＦＮ−γは、アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１５７９）を含むことが好適である：
一実施形態において、ＩＦＮ−βはＩＦＮ−β１であり、これは配列番号８（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１５７４）に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。別の実施形態において、ＩＦＮ−βはＩＦＮ−β２であり、これは配列番号９に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい：
一実施形態において、該ＩＦＮ−αは配列番号１０に記載されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ＩＦＮ−αはＩＦＮ−α１であり、これは配列番号１１に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。更に別の実施形態において、該ＩＦＮ−αはＩＦＮ−α２であり、これは配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を含むことが好ましい。
例えば、ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−βは該細胞に対し直接使用しうるし、又は該細胞をＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−βで処置する前に、ＩＦＮ−γの存在下でまず培養してもよい。本発明を如何なる一つの理論又は特定の作用様式に制限する意図はないが、このＩＦＮ−γはＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βにより調節された遺伝子の転写活性化に要求される転写因子のレベルを回復させ又は強化させるものと提唱する。
従って、培養の工程は、少なくとも一つのＩ型ＩＦＮに該細胞が応答できるほどに十分な時間及び条件の下でＩＩ型ＩＦＮと該細胞とを接触させる工程、及び、次いで該細胞の抗原提示機能を強化する時間及び条件の下で該培養された細胞を少なくとも一つのＩ型ＩＦＮと接触させる工程を含むことが好ましい。
一実施形態において、ＩＩ型ＩＦＮの存在下で培養された細胞は、ＩＦＮ−β又はその生物活性断片より選択されたＩ型ＩＦＮと接触させられる。
別の一実施形態において、ＩＩ型ＩＦＮの存在下で培養された該細胞は、ＩＦＮ−α又はその生物活性断片より選択されるＩ型ＩＦＮと接触させられる。
更に別の一実施形態において、ＩＩ型ＩＦＮの存在下で培養された細胞は、ＩＦＮ−β又はその生物活性断片より選択される第一のＩ型ＩＦＮと接触させられ、そしてＩＦＮ−α又はその生物活性断片より選択される第二のＩ型ＩＦＮと接触させられる。
該細胞は約１６時間から約９６時間までＩＩ型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−γ）と共に培養し、次いで約１６時間から約７２時間まで一つ以上のＩ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）と共に培養することが好ましい。該細胞は約４８時間から約９６時間までＩＩ型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−γ）と共に培養し、次いで約２４時間から約７２時間まで一つ以上のＩ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）と共に培養することが好ましい。
該細胞は、約１００から約２０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γで処置し、次いで約１００から約２０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−βで処置しうる。該細胞は約１０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γと共に培養し、次いで約１０００国際単位／ｍＬの濃度のＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−βと共に培養することが好ましい。
従って、動物細胞は、宿主受容者では達成し得ない濃縮型の少なくとも一つのＩＦＮに接触させられることが認められる。如何なる一つの特定の理論又は作用様式により縛られることは望まないが、少なくとも一つのＩＦＮの存在下での培養は、抗原処置経路を介して抗原を処置する動物細胞の能力及び処置されたその抗原を該細胞の表面上に提示する能力の両方を増強する。動物細胞の表面上に、Ｂ７分子が存在することは、例えばＴ細胞上に存在するＣＤ２８又はＣＴＬＡ４受容体を通じてＴ細胞活性化を行なう手段を与えることになる。
いくつかの実施形態において、該培養ステップは、培養中に単離された細胞の集団を拡大させることを更に含むことが好ましい。斯かる拡大法は当業者に知られている。例えば、以下に記載されるような細胞集団の拡大はフラスコ中で増殖させた単離細胞から調製される。拡大集団の生産は、必要ならば、バイオリアクター又は発酵槽又は大量に細胞を増殖させるのに適した他の斯かる容器又は装置中で、該細胞を培養することによりスケールアップすることができる。この単離された集団は繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定されない一つ以上のサイトカイン／成長因子の存在下で、適当な完全な成長培地（例えば、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ又はＤＭＥＭ、又は無血清培地）の存在下で、３７℃で、５〜７％の二酸化炭素の下で拡大することが好ましい。
４．免疫増強組成物
本発明は、別の態様において、先に若しくは本明細書中のほかの場所に記載した人工抗原提示細胞、並びに１若しくは複数の医薬的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又はアジュバントを含んでいる、標的抗原に対する細胞免疫（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含めたＴ細胞）応答及び／又は液性免疫を含めた、免疫応答を促進する組成物を提供する。具体的には、組成物中に含まれる細胞は、動物細胞を、その細胞の抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件下で、少なくとも１つのインターフェロンと共に培養すること、を含み、ここで、その細胞は、Ｂ７分子及び４−１ＢＢ作動薬を、それらの表面に発現するか、又は別の方法で組み合わせて提供する。典型的には、細胞は、１若しくは複数のいずれかの培地及びＩＦＮを取り除くために洗浄される。
いくつかの実施形態において、Ｂ７分子は、動物細胞によって発現され、細胞表面に提示される。代替の実施形態において、Ｂ７分子は、可溶形であることが好ましい。このタイプの好ましい実施形態において、該Ｂ７タンパク質は機能性の膜貫通ドメインを欠いているＢ７分子である。可溶性のＢ７分子はＢ７細胞外ドメインを含むことが好ましい。このタイプの可溶性Ｂ７−１分子は、例えば、マックヒューら（1998，Clin. Immunol. Immunopathol. 87(1): 50-59)、ファースら (2000, J. Immunol. 164(12): 6340-6348) 及びジーニンら (2000, Immunity 13(3): 303-312)により開示されている。可溶性Ｂ７−１のポリペプチド配列の例としては、配列番号１８及び配列番号２０に記載されたもの、それらの生物活性断片、及びこれらの変異形又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。このタイプの別の好ましい実施形態において、該Ｂ７タンパク質はＢ７融合タンパク質である。このＢ７融合タンパク質は、好ましくは抗体又は抗体フラグメントである抗原結合性分子と連結したＢ７分子又はその生物活性断片を含むことが好ましい。
同じ及び異なる実施形態のいくつかにおいて、４−１ＢＢ作動薬は、動物細胞によって発現され、細胞表面に提示される。このタイプの代替の実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、可溶性であることが好適である。このタイプ（すなわち、可溶性タンパク質）の好ましい実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、機能性の膜貫通ドメインを欠いているタンパク様分子である。可溶性の４−１ＢＢ作動薬、例えば可溶性の４−１ＢＢＬポリペプチドは、Won et al., J Biol Chem. 2010 Mar 19;285(12):9202-10によって公開された。いくつかの実施形態において、４−１ＢＢ作動薬は、抗体又は抗体フラグメントであることが好ましい、抗原結合性分子と一緒に連結された４−１ＢＢ作動薬又はその生物活性断片を含む融合タンパク質である。
本発明による好ましい融合タンパク質（一般的に「キメラタンパク質」又は「キメラ分子」としても知られている）は、Ｂ７分子の生物活性断片、又は４−１ＢＢ作動薬に相当するポリペプチドを含む。例えば、本発明の方法に有用なＢ７キメラ分子は、Ｂ７分子の細胞外ドメインに対応するポリペプチド及びＢ７分子の溶解性、親和性及び／又は原子価を変更するイムノグロブリン定常領域を含むＢ７Ｉｇ融合タンパク質である。
好ましい実施形態において、Ｂ７−１分子の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードし、約１位から約２１５位までのアミノ酸を含むポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて、ヒトＩｇＣγ１のヒンジ領域ＣＨ２及びＣＨ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合させて、Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質として発現する構築物を形成させる。Ｂ７Ｉｇ融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ブダペスト条約に従って1991年 5月31日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、Ｍｄ）に寄託し、受託番号 68627を受けた。斯かるＢ７誘導体を作製し組み立てる方法は、例えば、リンスレーら（米国特許第５，５８０，７５６）により開示されている。ＩｇＧ２ａのＦｃ部分に枠を揃えて融合したＢ７−１又はＢ７−２の細胞外領域を含む融合タンパク質を開示するシュトルムヘーフェルら（1999, Cancer Res. 59: 4964-4972)も参照しうる。
好ましい実施形態において、可溶性の４−１ＢＢ作動薬は、４−１ＢＢＬ構築物である。
可溶性タンパク質の半減期は、望ましいときは、任意の適切な手順で延長させうる。斯かる分子は、例えば、チャップマンら（1999，Nature Biotechnology 17: 780-783) により開示されたように、モノメトキシ−ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて化学的に改変されることが好ましい。
本発明の一つの特別な利点は、該細胞の上に提示される抗原のタイプが予め選択されることがないことである。その理由は、該細胞が免疫原の供給源として用いられるからである。従って、該細胞により正常にプロセスされた抗原の多数のものが免疫細胞のプロセスを活性化するのに利用でき、その結果異なる抗原性標的の範囲に応答する免疫細胞の集団の広範なバリエーションを生ずることになる。例を挙げれば、ある癌細胞は治療される患者の腫瘍により共有される多数の腫瘍関連抗原を発現することになる。
更に、抗原は、抗原提示細胞により用いられる天然の選択により展開されるコンフィギュレーションで提示され、その結果強力な免疫細胞の活性化を生ずる。または、治療される細胞は、腫瘍抗原であることが好ましい特定の抗原性ペプチドを負荷されると特異的標的ワクチンとなる。例えば、ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原をコードする種々の遺伝子を記述するヴァンペルら（1995, Immunol Rev 145: 229-250) 及びＣＴＬ死滅のため標的として腫瘍細胞の上にペプチドを負荷する方法の使用を記述するイトーら (1994，J. Immunol. 153: 1202-1205) 及びコールら（1995, Cancer Res. 55: 748-752)を参照しうる。
本発明の組成物は、該処置された細胞の上に病原生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物の）の抗原を負荷させることによりヒト及び動物に悪影響を与える様々な感染性疾病を治療するために調製することもできよう。同一の疾病を惹き起こす種々の異なる生物により発現される免疫原性の抗原及び防御的抗原のタイプに不均質性があるので、多価組成物及び多価ワクチンが重要な異種抗原を発現する生物のプールから組成物又はワクチンを調製することにより調製され得るであろう。従って、本発明は、患者の免疫系を刺激する方法、そして好ましくは、該細胞の抗原提示機能を増強するのに十分な時間及び条件の下で、この又は各抗原と共に少なくとも一つのインターフェロン（ＩＦＮ）の存在下で培養された動物細胞を患者に投与することにより一つ以上の抗原に対する該患者のＴ細胞応答を調節する方法をも包含する。より一層好ましくは、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。従って、抗原の免疫原性は、被験体から動物細胞を単離し、それらを該抗原と「パルスさせ」即ち接触させ、次いでインビトロ又はインビボで自己由来のＴ細胞を刺激するため該パルスさせた細胞を使用することによりインビトロで増強又は他の方法で改善され得る。
本発明の組成物は、細菌、ウイルス若しくは酵母の感染、原生動物若しくは他の寄生体の感染を受けている若しくは受ける性質を有する動物又はメラノーマ若しくは他の肉腫若しくは腫瘍などの癌を患っている動物で免疫障害を有する動物を治療するために調製され得るであろう。
該処置された細胞を上記のＢ７分子と４−１ＢＢ作動薬の組み合わせると、例えば腫瘍又は癌のような種々の状態の治療又は予防のための活性物として使用することができる。これらの治療用物質は単独でか、又は１若しくは複数の医薬的に許容し得る担体、アジュバント及び／又は希釈剤と混合した免疫強化組成物の形で患者に投与することができる。
本発明の免疫強化組成物は、当業者に既知の慣習法を使用して調製できる。典型的には、斯かる組成物は液状の溶液か懸濁液かのいずれかで注射可能なものとして調製される。注射前に液体中の溶液又は懸濁液とするのに適した固状製剤も調製され得る。この調製物は乳化剤としてもよい。この活性な免疫原成分は医薬的に許容し得るそして該活性成分と適合しうる賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組み合わせである。更に、必要ならば、該組成物は加湿剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、及び／又は組成物の有効性を高めるアジュバントなどの補助的物質を少量含んでもよい。効果的なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及び細菌、モノホスホリルリピドＡ、ジミコール酸トレハロース及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出した３成分を２％スクアレン／トゥイーン８０乳液中に含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アジュバントは、ガレクチン阻害剤、ＣＴＬＡ４や、ＰＤ１や、ＰＤ−Ｌ１受容体や、インドールジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）や、ＴＧＦ−β阻害剤などの免疫抑制性阻害剤に対するモノクローナル抗体を含む群から選択される。例えば、アジュバントの有効性は該ワクチンの投与から生ずる抗体であって、該ワクチンの処置細胞により提示される１若しくは複数の抗原に対して向けられる抗体、の量を測定することにより決定される。
典型的には、この細胞は細胞や個体にたいして毒性のない医薬的に許容し得る担体に混ぜて投与される。斯かる担体は該細胞が生育させられた成長培地であってもよい。適合性の賦形剤には、生理学的に適合するリン酸塩若しくはヘペスなどの緩衝液及びデキストロースなどの栄養素、生理学的に適合するイオン若しくはアミノ酸、及び細胞集団と共に使用するのに適する種々の培養培地、とりわけ他の免疫原成分を含まないものを含む又は含まない等張食塩水が含まれる。アルブミンや血漿画分や非活性な濃化剤などの担体試薬も使用しうる。ワクチン中に存在する限りでは活性のない生体成分は処置されるべき動物若しくはヒトと同系の動物若しくはヒトから誘導することが好ましく、被験体から先に得たものが更に好ましい。注射部位は皮下、腹腔内、筋肉内、皮内又は静脈内であってよい。
組成物中の活性物質として可溶性の免疫刺激分子を用いる場合は、該免疫刺激分子は中性形又は塩形として該組成物中に調剤できる。医薬的に許容し得る塩には、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸とで形成される酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基とで形成される）が含まれる。遊離のカルボキシル基とで形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導してもよい。
もし必要ならば、本発明の動物細胞を含む装置又は組成物は、徐放性若しくは断続的放出に適するものであって、そして、効力を持った状態で体内に埋め込まれ、或いは体内に斯かる物質を比較的ゆっくりと放出するために局所的に適用され得るであろう。
可溶性の免疫刺激分子が細胞含有組成物の投与とは別に患者に投与され得ることも認められる。治療される特定の状態に応じて、該免疫刺激分子は調剤され、全身的に若しくは局所的に投与され得る。調剤及び投与の方法は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, Pa.の最新版に載っている。適当な経路には、例えば、経口、経直腸、経粘膜、又は経腸の投与、そして筋肉内注射、皮下注射、脊髄内注射並びにくも膜下注入、直接脳室内注入、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注入又は眼球内注射を含む非経口的送達が含まれる。
投与すべきＩＦＮ処置細胞の数及び任意選択的に免疫刺激分子の量は、治療すべき被験体に依存し、被験体の年齢、性別、体重及び全身健康状態に依存する。この点で、該物質（単数又は複数）の正確な投与量は実務家の判断に依存することになる。疾病又は状態の治療において投与されるべき物質（単数又は複数）の有効量を決定する場合は、医師が経時的に該疾病又は状態の進行を評価しうる。いずれにしても当業者は不当な実験なしに、本発明の物質の適切な用量を容易に決定しうる。細胞含有組成物及びワクチンは投与当たり約１０4 〜１０10処置細胞の範囲で、より好ましくは約１０6 〜１０8 処置細胞の範囲で患者に投与するのが好ましい。患者に投与される免疫刺激分子の用量は、該ワクチンの細胞成分との組み合わせで、該癌又は腫瘍と関連する症状の低減などの長期にわたる患者に有益な応答を惹き起こすのに十分なものであるべきである。用量の量及び間隔は免疫刺激効果を維持するのに十分な免疫刺激分子の血漿レベルを与えるように個々に調節しうる。全身投与のための通常の患者用量は１〜２０００ｍｇ／日の範囲であり、普通には１〜２５０ｍｇ／日、典型的には１０〜１５０ｍｇ／日の範囲である。患者の体重当たりで言えば、通常の用量は０．０２〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、普通には０．０２〜３ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には０．２／１．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
５．処置及び予防の方法
本発明は、疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、先に大まかに説明した及び本明細書中にほかの場所で説明したような細胞又は組成物の有効量をそのような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法を包含する。
一実施形態において、本発明の細胞又は組成物は、正常な免疫応答に達することができない免疫抑制された個体に養子免疫細胞移入を行なうため、大量のＣＤ８＋ＣＴＬ又はＣＤ４＋ＣＴＬを形成させるのに用いることもできよう。例えば、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬはＨＩＶ感染（Koup et al. 1991, J. Exp. Med. 174: 1593-1600; Carmichael et al. 1993, J. Exp. Med. 177: 249-256; and Johnson et al. 1992, J. Exp. Med. 175: 961-971）、マラリア（Hill et al. 1992, Nature 360: 434-439）及びメラノーマなどの悪性腫瘍（Van der Brogen et al. 1991, Science 254: 1643-1647; and Young and Steinman 1990, J. Exp. Med., 171: 1315-1332）で苦しんでいる個体に治療上の目的で養子免疫細胞移入を行なうことができる。
５．１ 癌又は腫瘍の処置及び予防
本発明によると、Ｂ７分子を含み、且つ４−１ＢＢを作動させる細胞及び組成物が、腫瘍又は癌の処置又は予防における有用性を見い出すように提案される。本発明の細胞及び組成物は、癌又は腫瘍が診断された後に治療的に使用され得るか、又は対象が癌若しくは腫瘍を発症する前に予防的に使用され得る。本発明の方法に従って治療されるのが好ましい癌又は腫瘍には、小細胞や大細胞の腺癌や扁平上皮細胞癌や気管支肺胞癌などの肺の癌若しくは腫瘍、導管又は小葉の腺癌などの乳腫瘍、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌や子宮・卵巣の上皮腺癌などの婦人科腫瘍、上皮腺癌及びそれらの転移などの大腸腫瘍、膵臓導管腺癌などの膵臓腫瘍、前立腺癌などの前立腺腫瘍、胃癌や移行性の扁平上皮細胞癌などの膀胱腫瘍、肝癌や胆管癌などの腎臓・骨・肝臓の腫瘍、節の又は拡散性のＢ若しくはＴ細胞リンパ腫などの網内系（ＲＥＳ）の腫瘍、プラズマ細胞腫や急性若しくは慢性白血病や食道癌や星状細胞腫や突起神経膠細胞腫や上衣腫や髄芽細胞腫や原始中性外胚葉腫や神経膠腫や膠芽腫やグリオ肉腫などの脳腫瘍、精巣腫瘍、悪性メラノーマなどの皮膚腫瘍、柔組織肉腫や平滑筋肉腫などの柔組織腫瘍、及び種々の白血病やリンパ腫が含まれる。好ましい実施形態において、該癌はメラノーマ又は乳癌である。
上記及び本明細書中のほかの場所に記載した細胞及び組成物は、癌及び／又は腫瘍に対して予防方法で使用するのに特に好適である。斯かる方法は、癌又は腫瘍に対する持続的な液性、細胞媒介及び粘膜免疫応答を引き起こす、癌又は腫瘍に対するプライムブーストワクチン接種に好適である。
いくつかの実施形態において、本発明の細胞及び組成物は、標的抗原に対して長命の強力な免疫を引き起こす目標のために、プライムブーストレジメンにおいて反復投与で投与される。斯かるストラテジーは、第二の用量の細胞、組成物又はワクチンを使用して、初回抗原刺激によって惹起された免疫を増強する。
本発明のいくつかの実施形態は、標的抗原に対して保護免疫を惹起するために最適なストラテジーが、細胞及び液性免疫応答の両方の発生を伴うという認識に基づいている。よって、本発明は、本発明の細胞、組成物又はワクチンの初回投与が、第一の免疫応答を惹起又は誘発することによって免疫系を準備し、そして、本発明の細胞、組成物又はワクチンの第二の用量が、第二の免疫応答を高めるか又は惹起するのに使用される、多成分系の投与ストラテジーを提供し、ここで、初回投与で投与された細胞、組成物又はワクチンが、その投与された第二の細胞と同じである。このタイプに関する説明に役立つ例において、初回投与は、標的抗原に対して主に細胞免疫反応を引き起こすために投与され、その一方で、第二の用量は、標的抗原に対して主に液性免疫応答を惹起するために投与される。ストラテジーの投与ステップの完了によって、細胞及び液性免疫応答の両方が、標的抗原に対して発現される。よって、２つの応答が一緒になって、標的抗原、例えば、癌又は腫瘍抗原の存在に関連する疾患又は健康状態に対して有効な又は強化された防御を提供する。
関連抗原を標的とするＣＤ８＋ＣＴＬｓの直接刺激及び活性化を最大にするために、プライム及びブースト投与に使用される細胞、組成物又はワクチンは、優先的に同じである。
５．２ 治療計画
化学治療法及び放射線療法が、急速に分裂する細胞を標的とし、及び／又は細胞周期若しくは細胞分裂を中断させることは、周知である。これらの処置は、癌及び自己免疫疾患を治療するいくつかの形態の一部として、その進行を遅らせるか、又は治療的処置によって疾患の症状を退行させるかのいずれかを目的として提案されている。そのため、いくつかの実施形態において、併用療法は、化学療法薬と一緒に投与される細胞、組成物又はワクチンを利用し、そしてそれは、細胞静止剤及び細胞毒性薬から選択されるのが好適である。細胞静止剤の限定されることのない例は：（１）タキサン、パクリタキセル、ドセタセル、エポチロン及びラウリマライドなどであるが、これらに限定されない微小管安定化剤；（２）キナーゼ阻害剤（これらの説明的な例は、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、グリーベック、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブ塩酸）、ＢＡＹ−４３−９００６、スプリットキナーゼドメイン受容体チロシンキナーゼのサブグループの阻害剤（例えば１５ ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４及びＳＵ１１２４８）を含む））；（３）受容体キナーゼ標的抗体（これらはトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、リツキシマブ（ｒｉｔｕｓａｎ（登録商標））、パーツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標））を含むが、これらに限定されない）；（４）ｍＴＯＲ経路阻害剤（これらの説明的な例はラパマイシン及びＣＣＩ−７７８を含む）；（５）Ａｐｏ２Ｌ／Ｔｒａｉｌ、エンドスタチンなどであるがこれに限定されない抗血管新生剤、コンブレスタチン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン及び血管内皮増殖阻害因子（ＶＥＧＩ）；（６）抗新生物性免疫療法ワクチン（それらの代表的な例は活性化Ｔ細胞、非特異的免疫ブースト剤（すなわちインターフェロン、インターロイキン）を含む）；（７）ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシン及びミトザントロンなどであるが、これらに限定されない抗生細胞毒性剤；（８）アルキル化剤（それらの説明的な例はメルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブチル、ホテムスチン、ブスルファン、テモゾロマイド及びチオテパを含む）；（９）ホルモン性抗腫瘍薬（それらの限定されることのない例はニルタミド、酢酸シプロテロン、アナストロゾール、エキセメスタン、タモキシフェン、ラロキシフェン、ビカルタミド、アミノグルテチミド、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、レトロゾール、フルタミド、酢酸メゲストロール及び酢酸ゴセレリンを含む）；（１０）酢酸シプロテロン及び酢酸メドキシプロゲステロンなどであるが、これらに限定されない生殖腺ホルモン；（１１）抗代謝剤（それらの説明的な例はサイトシンアラビノサイド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トポテカン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、メトトレキサート、コラスパーゼ、ラルチトレキセド及びカピシタビンを含む）；（１２）ナンドロロンなどであるが、これらに限定されない同化剤；（１３）副腎ステロイドホルモン（それらの説明的な例は酢酸メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン及びプレドニゾンを含む）；（１４）イリノテカン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシド及びダカルバジンなどであるが、これらに限定されない新生物剤；及び（１５）トポイソメラーゼ阻害剤（それらの説明的な例はトポテカン及びイリノテカンを含む）から選択される。
説明的な細胞毒性薬は、これだけに限定されるものではないが、セルテネフ、カケクチン、イホスファミド、タソネルミン、ロニダミン、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモダルシトール、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロホスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン、シスプラチン、イロフルベン、デキシホスファミド、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルホスファミド、ＧＰＸ１００、（トランス，トランス，トランス）−ビス−μ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−μ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトザントロン、ピラルビシン、ピナフィド、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アンナマイシン、ガラルビシン、エリナフィド、ＭＥＮ１０７５５、および４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（国際公開第００／５００３２号を参照）が挙げられる。
放射線療法は、ＤＮＡ損傷を誘発する放射波、例えば、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体等を含む。療法は限局した腫瘍部位を上記される形態の放射線で照射することにより達成され得る。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、染色体の集合及び維持に広範囲に及ぶ損傷をもたらす可能性が極めて高い。
Ｘ線の線量範囲は、長期間（３ないし４週間）にわたって日線量が５０ないし２００レントゲンの範囲にあり、単回線量が２０００ないし６０００レントゲンの範囲にある。放射性同位体の線量範囲は、大きく変化し、その同位体の半減期、放出される放射線の強度及び型、及び新生細胞による摂取に応じて変化する。
放射線療法の例として、限定されるものではないが、原体体外照射療法（conformal external beam radiotherapy）（４−８週間にわたって５０−１００グレイを少しずつ投与する）、単発又は分割して投与するかのいずれかの高線量率近接照射療法、持続性組織内近接照射療法、全身性放射性同位体（例、ストロンチウム８９）療法が挙げられる。ある実施態様において、放射線療法は、放射線感作剤と組み合わせて行われてもよい。放射線感作剤の典型例として、限定されるものではないが、エファプロキシラル、エタニタゾール、フルオソール（fluosol）、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン及びチラパザミンが挙げられる。
化学治療剤は、以下の１又は複数のいずれかのカテゴリーより選択され得る：
（ｉ）アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン及びニトロソウレア）、抗代謝剤（例えば、抗葉酸剤、フルオロピリジン系５−フルオロウラシル及びテガフール、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド及びヒドロキシウレアなど）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン系アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン及びミトラマイシン）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンカアルカロイド系ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン、ならびにトキソイド様パクリタキセル及びドセタキセル）、及びトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロキシン系エトポシド及びテニポシド、アムサクリン、トポテカン及びカンプトテシン）などの腫瘍内科学にて使用されるような、抗増殖性／抗新生物性薬物及びそれらの組み合わせ；
（ｉｉ）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びイドキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、及び酢酸シプロテロン）、ＵＨアンタゴニスト又はＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン及びブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール及びエキセメスタンなど）及び５α−レダクターゼ阻害剤（例えば、フィナステリド）などの細胞分裂阻害剤；
（ｉｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリスタットなどのメタロプロテイナーゼ阻害剤、及びウロキナーゼプロスミノゲンアクチベータ受容体機能の阻害剤）；
（ｉｖ）成長因子機能阻害剤（例えば、かかる阻害剤として、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体のトラスツズマブ［ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）］及び抗ｅｒｂｂ１抗体のセツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば表皮成長因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ギフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６,７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）及び６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）などの他のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、例えば血小板誘導成長因子ファミリーの阻害剤、及び例えば造血細胞成長因子ファミリーの阻害剤が挙げられる）；
（ｖ）抗血管新生剤（血管内皮細胞成長因子の作用を阻害する薬剤（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体のベバシズマブ［Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）］、国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ９７／３００３５、ＷＯ９７／３２８５６及びＷＯ９８／１３３５４）に開示されるような化合物、及び他の作用機序により作動する化合物（例えば、リノミド、αｖβ３機能阻害剤及びアンギオスタチンなど）；
（ｖｉ）コンブレタスタチン（Combretastatin）Ａ４及び国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６、ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４及びＷＯ０２／０８２１３に開示される化合物などの血管新生阻害剤；
（ｖｉｉ）アンチセンス治療剤（例えば、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンスなどの上記される標的と対象とする治療剤）；及び
（ｖｉｉｉ）遺伝子治療法（例えば、異常ｐ５３などの異常遺伝子を置換する方法又は異常ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ又は細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いる方法、及び化学療法又は放射線療法に対する患者の耐性を増大させる方法、例えば多剤耐性遺伝子療法を包含する）。
免疫療法として、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでトランスフェクトするなどの、患者の腫瘍細胞の免疫原性を向上させるエクスビボ及びインビボでの方法、Ｔ細胞アネルギーを減少させる方法、サイトカインでトランスフェクトした樹状細胞などのトランスフェクトされた免疫細胞を用いる方法、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞系を用いる方法、及び抗イディオタイプの抗体を用いる方法が挙げられる。これらの方法は、一般に、免疫エフェクター細胞及び分子を用い、腫瘍細胞を標的として破壊することに依拠する。その免疫エフェクターは、例えば、悪性腫瘍細胞の表面にあるマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体は単独で治療のエフェクターとして供してもよく、又は細胞死滅を実際に促進するように他の細胞を募ってもよい。抗体はまた薬物又はトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等）とコンジュゲートし、単に標的剤として供してもよい。あるいはまた、エフェクターは、悪性腫瘍細胞の標的と、直接的又は間接的に相互に作用する表面分子を担持するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
癌治療法の他の例として、光療法、冷凍療法、トキシン療法又はアポトーシス促進療法が挙げられる。当業者であれば、この列挙により癌及び他の過形成性病変のために利用可能な治療様式の型が排除されないことが分かるであろう。
典型的には、例えば、先に記載した治療薬は、医薬的に許容し得る担体と一緒に医薬組成物で、且つ、それらの本来の目的を達成するための有効量で投与される。対象に投与された活性化合物の用量は、症状の軽減又は症状からの解放をなど、対象の有益な応答を達成するのに十分な期間にわたるものでなければならない。投与される（単数若しくは複数の）医薬的に活性な化合物の量は、対象の年齢、性別、体重、及び健康条件全般を含めて処置される対象に依存し得る。この点で、投与のための活性化合物の正確な量は、開業医の判断による。癌又は腫瘍の処置又は予防において投与される（単数若しくは複数の）活性化合物の有効量を決定する際、開業医は、しこりの存在、回復しない痛み、治らない咽頭痛、嚥下困難、変声又は嗄声、炎症などを含めた、癌又は腫瘍の存在に関係する任意の症状の重症度を評価してもよい。いずれにしても、当業者は、必要以上の実験なしで治療薬の好適な投薬量及び好適な治療計画を容易に決定し得る。
免疫化の有効性は適当な方法を用いて評価しうる。例えば、ＣＴＬ溶解検定はペプチドを被覆した又は組み換えウイルスを感染させた細胞の上の刺激された脾臓細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、51Ｃｒ又は Alamar Blue（商標）で標識した標的細胞を用いて行ないうる。斯かる検定は例えば霊長類、マウス又はヒトの細胞（Allen et al., 2000, J. Immunol. 164(9): 4968-4978、下記のWoodberryらも同様）を用いて行なうことができる。または、免疫化の有効性は、新鮮なＰＢＭＣ及び刺激されたＰＢＭＣの両方のＨＬＡクラスＩテトラマー染色（例えば、上掲のAllenらを参照）、増殖検定（Allenら，上掲）、ＥＬＩＳＰＯＴ検定及び細胞内ＩＦＮ−γ染色（Allenら，上掲）、Ｂ細胞の線形の応答に対してＥＬＩＳＡ検定、及び合成ポリヌクレオチドを発現する細胞サンプルのウェスタンブロットを含む１若しくは複数の方法、これらに限定されないが、を用いて監視してもよい。
いくつかの実施形態において、先に記載の治療法又は併用療法はまた、癌の免疫回避機構を克服するための他のアジュバントも含む。いくつかの実施形態において、この目的のためのアジュバントは、ガレクチン阻害剤、ＣＴＬＡ４や、ＰＤ１や、ＰＤ−Ｌ１受容体や、インドールジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）や、ＴＧＦ−β阻害剤などの免疫抑制性の阻害剤に対するモノクローナル抗体、及び他の免疫応答回避方法から成る群から選択される（例えばＪＰ Ａｌｌｉｓｏｎの総説及び論文を参照）。
５．３ 病原性感染症のワクチン
更に別の一実施形態において、細胞含有組成物又はワクチンはウイルス、細菌又は寄生体の感染の治療又は予防に好ましい。本発明が意図するウイルス感染には、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザ、日本脳炎ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、及びＲＳウイルスにより惹き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。細菌性感染には、ナイセリア（Neisseria）属、メニンゴコッカス（Meningococcal）属、ヘモフィラス（Haemophilus）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトコッカス（Streptococcal）属、レジオネラ（Legionella）属、及びマイコバクテリウム（Mycobacterium）属により引き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。本発明により包含される寄生体感染には、プラスモディウム（Plasmodium）属、シストソーマ（Schistosoma）属、ライシュマニア（Leishmania）属、トリパノソーマ（Trypanosoma）属、トキソプラスマ（Toxoplasma）属及びギアルディア（Giardia）属により引き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。
ウイルスの感染が個体の（樹状細胞を含めた）抗原提示細胞の減少を引き起こし得ることが知られている。例えば、ＨＩＶ血清陽性個体では、末梢血中のＤＣ数を減少させることが観察され、生き残っているＤＣがＨＩＶゲノムの感染の結果として無調節になる（Macatonia et al, 1990を参照）。特に、ＨＩＶによるＤＣの感染症は、他の抗原に対する応答を引き起こすこれらの細胞の能力を妨げる（Macatonia et al., 1989を参照）。
従って、本発明のいくつかの実施形態において、上記及び本明細書中のほかの場所に記載した免疫調節組成物は、対象の樹状細胞（ＤＣ）の健康集団の必要性に取って代わるために使用される。このように、本発明の免疫調節組成物及び方法は、特にＤＣ減少をもたらす多くのウイルス感染（ＨＩＶなどの）の処置及び／又は予防に好適なので、本発明の免疫調節組成物は、特に斯かるウイルス感染の処置に有用である。
更に、本発明はまた、ウイルス感染に関連している付随的適応症の処置及び／又は予防にも適用可能である。説明的な例を通して、ＨＩＶ感染に罹患している対象は、著しく弱められた免疫系を有し、特定の癌を発症する高いリスクをもたらすことが観察された。この点で、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；ＨＩＶ感染の後期）に罹患している個人はがカポジ肉腫（ＫＳ）を発症することが多い。従って、いくつかの実施形態において、本発明の免疫調節組成物は、ＨＩＶ関連疾患及び／又は健康状態（例えば、カポジ肉腫）の発生を処置又は予防する際に使用するためのものである。
６．細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を評価する方法
Ｔリンパ球の細胞障害活性は当業者に知られた適切な方法により評価しうる。例えば、細胞障害活性について検定すべきＴリンパ球を含むサンプルを調製し、次いでそのＴリンパ球を本発明のＩＦＮ処置標的細胞と接触させる。適当な時間、これは細胞障害性細胞になるように誘導できることが知られているＴリンパ球の対照集団の細胞障害活性を評価することにより決定しうる、の後、標準的細胞障害性検定法で評価対象であるＴリンパ球を細胞障害活性について試験する。斯かる検定法には、当分野で知られたクロム放出ＣＴＬ検定法及びＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）蛍光検定法が含まれるが、これらに限定されない。
ＣＴＬ活性を評価するこの方法は、腫瘍又は病原性生物の抗原（例えば、ウイルス抗原）を発現する細胞に対して細胞障害性応答を形成する個体の能力を評価する場合にとりわけ有用である。従って、この方法は癌又は病原性生物に対する免疫応答を形成する個体の能力を評価する場合に有用である。
本発明は、標的細胞の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により媒介される溶解の検出感度を増強するための、本発明で教示されたＩＦＮ処置の使用をも意図する。従って、標的細胞のＩＦＮ処置は、標的細胞に対する免疫応答とりわけＣＴＬ応答、及びより具体的にはＣＤ８＋ＣＴＬ応答の検出感度の改善された検定法を開発するために有利に使用できる。
７．キット
本明細書中に記載した任意の組成物又は成分がキットに含まれ得る。限定されることのない例では、本明細書中に記載した１若しくは複数の糖類（glycospecies）バイオマーカーのレベルを検出及び測定するのに必要な材料及び試薬が、キットの形で一緒に組み立てられてもよい。キットはまた、標識の検出のために適当な試薬、陽性及び陰性対照、洗浄溶液、ブロッティング膜、マイクロタイタープレート、希釈バッファーなどを任意選択的に含んでもよい。
よって、キットは、レクチン結合イムノソルベントアッセイは、検出すべき糖類バイオマーカーに特異的なレクチン、糖類バイオマーカーに特異的な抗体（すなわち、グリコシル化反応のポリペプチド骨格に特異的なもの）、及び任意選択的に、糖類バイオマーカー（正の対照として使用し得る）を、好適なコンテナ手段内に含む。バッファー、洗浄溶液、ブロッキング試薬、並びに標識の検出のための酵素及び／又は基質もまた含んでもよい。キットはまた、本明細書中に記載したアッセイの１つを実施するための様々なデバイスと試薬、及び／又は糖類バイオマーカーのレベルを測定するためのキットを使用するための印刷した取扱説明書もまた考慮され得る。
キットの構成要素は、水性媒体でパッケージされても、又は凍結乾燥形態でパッケージされてもよい。典型的には、キットのコンテナ手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他のコンテナ手段を含み、その中に、構成要素が入れられていて、そして、好ましくは、等分されているのが好適である。典型的には、キット内に２以上の構成要素が存在する場合（標識試薬と標識は一緒にパッケージされてもよい）、キットはまた、その中に追加の構成要素を別々に入れることができる第二、第三又はその他の追加コンテナを含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、バイアル内に含まれていてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、核酸を入れるための手段、及び商業販売向けにしっかり閉じられたその他の試薬コンテナも含む。斯かるコンテナは、その中に所望のバイアルが保持される射出成形又は吹き込み成形プラスチックコンテナを含んでもよい。
キットの構成要素が１つ及び／又は複数の液体溶液であるとき、その液体溶液は水性溶液であり、無菌の水性溶液が特に好まれる。
しかしながら、キットの構成要素は、（単数若しくは複数の）乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶剤の添加によって再構成できる。その溶媒が別のコンテナ手段内に提供されてもよいことが想定され得る。いくつかの実施形態において、標識色素は乾燥粉末として提供される。１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｇ、又は少なくともも多くてもその量の乾燥色素が本発明のキット中に提供されることが、企図される。その色素は、その後、ＤＭＳＯなどの任意の好適な溶剤中に再懸濁されてもよい。
典型的には、コンテナ手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ及び／又は他のコンテナに手段を含み、その中に、核酸配合物が入れられていて、そして、好ましくは、配分されているのが好適である。キットは、無菌の、医薬的に許容され得るバッファー及び／又は他の希釈剤を含む第二のコンテナ手段を含んでもよい。
本発明のキットはまた、典型的には、例えば、その中に所望のバイアルが保持される射出成形及び／又は吹き込み成形プラスチックコンテナなどの商業販売向けにしっかり閉じられたバイアルを含むための手段も含む。
典型的には、キットはまた、キットに含まれていないその他の試薬の使用と同様に、キット構成要素を利用するための取扱説明書も含む。取扱説明書は、実装され得るバリエーションを含んでもよい。
キットは、例えば、（単数若しくは複数の）投与デバイス、（単数若しくは複数の）バッファー、及び／又は（単数若しくは複数の）希釈剤などの本発明の方法の実施を支援するために追加の構成要素を含んでもよい。キットは、本発明の方法においてキット構成要素を使用するための様々な構成要素及び取扱説明書を収容するためのコンテナを含んでもよい。
本発明が容易に理解され実施できるように、特に好ましい実施形態を以下の限定されることのない実施例を用いてここに説明する。
実施例１
３種類の高免疫原性ワクチン細胞株の開発
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞の作出
ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ／４−１ＢＢＬベクター及びｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏＮ９／Ｂ７．１発現構築物を開発した後に、それらをＢ１６−Ｆ１０細胞内に形質移入した。抗生物質選択中のトランスフェクション効率及び抵抗性は、非常に効果的であることが観察されたが、発現レベルを更に増強し、且つ、弱い発現細胞を排除するために、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａを使用して、トランスフェクト細胞を選別した。セルソーティング後に、高発現細胞の上位２％を回収し、そして、ピューロマイシンの存在下で培養した。ＰＥを結合した抗マウス４−１ＢＢＬ抗体（Ａｂ）を用いたトランスフェクト細胞の抗体染色法は、細胞表面上の、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ／４−１ＢＢＬ構築物で上方制御された完全な４−１ＢＢＬ分子がＡｂ結合で検出可能であることを実証した。ＡＢはまた、非形質導入Ｂ１６−Ｆ１０細胞を染色するのも使用し、そしてそれは、バックグラウンドと比較して、野生型細胞がこの分子を低レベルで既に発現していることを明らかにした。それぞれのヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）から、各ヒストグラムからの増加倍数を計算した（表２を参照）。
表２
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞上で発現された４−１ＢＢＬが完全、且つ、機能的であるか更に試験するために、その受容体４−１ＢＢへの細胞上の４−１ＢＢＬの結合について、追加アッセイを実施した。これは、形質移入及び野生型Ｂ１６−Ｆ１０細胞を４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラあり又はなしの両方でインキュベートし、次に、フローサイトメトリーを使用したキメラ４−１ＢＢの検出のために、ＰＥを結合したＩｇＧ ＦｃγＡｂを使用することによって実施した。アッセイの結果を図２に示す。
図２の赤色及び紫色のヒストグラムは、ＩｇＧ ＦｃγＰＥ二次Ａｂ染色が、いずれかのバックグラウンド結合又は細胞上の他の分子との交差反応を示さないことを示唆する。二次Ａｂ対照サンプルと２つの無染色対照サンプルの間に、ヒストグラムプロファイルの違いが全くなかったので、この結論を下すことができた（図２）。しかしながら、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラと共にインキュベートし、そして、ＩｇＧ ＦｃγＰＥ二次Ａｂで染色したＢ１６−Ｆ１０野生型細胞で、低レベルの４−１ＢＢＬ発現の存在を検出し、そして、これらの細胞が、トランスフェクション前に既にいくらかの機能的４−１ＢＢＬを発現していることを示され、表２の結果と一致した。４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／Ｆｃキメラ／ＩｇＧ ＦｃγＰＥ二次Ａｂを伴ったＰＥを結合した抗マウス４−１ＢＢＬ Ａｂからの結果である、４−１ＢＢＬへの４−１ＢＢの結合は、マウス４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡをコードするベクターを用いて形質移入した細胞が、機能的な細胞表面４−１ＢＢＬ分子を効果的に発現した証拠に基づく支持を提供する。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞の作出
ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ／４−１ＢＢＬベクターとは対照的に、ｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏＮ９／Ｂ７．１ベクターは、Ｂ１６−Ｆ１０細胞内に形質移入するのが難しいと判明した。Ｂ１６−Ｆ１０及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞に形質移入するための最も効果的な試薬は、Ｐｌｕｓ試薬と組み合わせて使用されたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸであった。安定した、高度に発現しているＢ７．１細胞株を選択するために追加ラウンドのセルソーティングが必要とされるように、トランスフェクション効率が、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ／４−１ＢＢＬベクターよりはるかに低かった。ｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏＮ９／Ｂ７．１ベクターで形質移入したＢ１６−Ｆ１０細胞をＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１と改名し、そして、形質移入したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞をＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１と改名した。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａによる３ラウンドのソーティング及び選択にかけ、そして、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１細胞を、５ラウンドの反復によって同様に選別して、均一な、非常に安定した発現性細胞株を確保した。発現性細胞の上位１〜５％を、ソーティングのラウンド毎に両細胞株について回収し、それに続いて、必要な抗生物質と共に培養することによって増殖させた。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１のセルソーティング結果を、図３Ａ及び表３に示す。各ソート後に、細胞を培養し、そして、ＰＥを結合した抗マウスＣＤ８０ Ａｂを使用したＢ７．１発現の効率及び安定性を評価するためにＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析され得るのに十分な細胞が存在するようになるまで増殖させた。
表３
ソーティングＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞は、第一のソート後に非形質移入親細胞に比べ１３倍に全体的なＢ７．１発現が増大し、形質導入した、非ソート細胞のＢ７．１発現に比べて３倍に増大した。第三のラウンドのソーティング後に、Ｂ７．１発現レベルはアイソタイプ対照又は非形質導入細胞集団のそれの２４倍に増大した。野生型細胞のものよりはるかに大きな細胞上のＢ７．１発現にもかかわらず、集団は、高濃度の抗生物質選択に晒された後でさえ、まだ遺伝子を安定して発現していなかった。より安定した細胞株を開発する際の次の段階は、個々のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞のクローン導出に関与する。第三のラウンドのソーティングから回収した３種類のクローンが、生き残り、単独細胞クローニングを受け、そして、Ｂ７．１発現のそれらのレベルがＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析できるように増殖させた（図３Ｂ）。
Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１細胞のクローン的選択は、図３．８のヒストグラムによって示したように、Ｂ７．１発現レベルを更に増強しなかった。しかしながら、数週間にわたりこれらの細胞を継代培養し、そして、クローン化した後、Ｂ７．１のレベルが、非クローン的に選別した親細胞集団と比較してほとんど変動を示さないことを確認した。その結果として、Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１細胞のクローン的ソーティングは、より安定した発現集団を作出した。従って、同じソーティング手順を、Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１細胞にも適用した。ソーティング前、及び５ラウンドのソーティングに続く増殖後のＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１細胞を図３．９に示す。
実施例の概要
要約すれば、４−１ＢＢＬ、Ｂ７．１又は４−１ＢＢＬとＢ７．１の両方を安定して発現する３種類のワクチン細胞株を首尾よく作出した。抗原投与実験に使用するために、適当な細胞株を誘導及び選択し、そして、新しいＣＴＬアッセイプロトコールを、蛍光色素ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを使用して開発した。細胞及び手順の最適化後に、３修理のワクチン細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの投与のために好適に調製した。
材料と方法
４−１ＢＢＬ構築物の作製
高い発現性の、安定して形質移入された細胞株を開発するために、ピューロマイシン耐性遺伝子と一緒に４−１ＢＢＬをコードするベクター構築物をまず作製した。ｐｃＤＮＡ３ベクター内にクローン化したマウス４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含むベクターを、出発点として使用した。しかしながら、実験的な１５４種類のデザインに適合できるように、それぞれ４−１ＢＢＬ（ピューロマイシン）及びＢ７．１（ネオマイシン）発現ベクターの選択のための独特な耐性遺伝子が必要である。
４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡのどちらの末端が隣接した２つのプライマーを開発した。順方向プライマー（５’ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡ−３’）を、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位（下線部）を含むように遺伝子操作したが、逆方向プライマー（５’ＧＡＣＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＧＧ−３’）は既に、ＸｂａＩ制限酵素を含んでいた。高忠実度のＰＣＲ反応を、２つの新たに設計したプライマーを使用し、完全長のマウス４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３構築物に対して実施し、そして、生成物をアガロースゲル電気泳動によって分解した。アガロースゲルの調査のときに、分解した生成物が、約１ｋｂのサイズであることを観察し、そしてそれは、ＮＣＢＩ公開遺伝子配列（受入番号ＮＭ＿００９４０４）で規定される、９５０ｂｐの長さの４−１ＢＢＬ ｍＲＮＡと厳密に対応していた。ＰＣＲ反応に続いて、ＤＮＡを、キットを使用して抽出し、次に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター内に連結した。
４−１ＢＢＬ ＰＣＲ生成物を精製し、そして、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼを使用してＡ−テール化した時点で、ｐＧＥＭ−Ｔベクターを用いた生成物の連結反応を実施し、続いて、コンピテントＤＨ５α細菌内への連結反応物の形質転換を実施した。ｐＧＥＭ−Ｔ内への４−１ＢＢＬの連結反応の成功を確認するために、１０個の白色コロニーをアンピシリン寒天平板から選択し、培養により増殖させ、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを抽出した。次に、二重消化を、１０個のＤＮＡサンプルに対してＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを使用して実施した。数個の対照を使用して、第一に、１５５酵素が、ＤＮＡを単一酵素をそれぞれ単独で用いて切断したときに働くこと、及び一緒に使用したときに、複数切断することを特定するため、そして、第二に、２つの酵素が、長さ９５０ｂｐの妥当な大きさの４−１ＢＢＬ断片を放出するか否か測定するために使用した。ｐＵＣ１８ベクターは、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位の両方を含むので、消化についての対照ベクターとして使用した。連結した４−１ＢＢＬ断片及び消化したｐＵＣ１８ベクターを含むと推察された二重消化したｐＧＥＭ−Ｔベクターを、アガロースゲル上で電気泳動した（図１Ａ）。二重消化した１０つのクローンすべてが、約１ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を放出した。これは、ｐＧＥＭ−Ｔベクター内に４−１ＢＢＬを連結する際に、連結反応が成功したことを示唆した。レーン１４に添加したクローン９の二重消化ＤＮＡは、３ｋｂと２ｋｂのバンドの間に存在する別の薄いバンドを有するように見え、そのため予防策として、クローン９は追実験に使用しなかった。
４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含むｐＧＥＭ−Ｔベクター及びｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。消化産物は、予測される９５０ｋｂの４−１ＢＢＬ断片及び５６８９ｋｂのｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター断片を生じた。４−１ＢＢＬ及びｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ断片を、キットを使用してアガロースゲルから抽出し、精製し、そして、一つに連結した。次に、連結反応の生成物を、コンピテントＤＨ５α内に形質転換した。アンピシリン寒天平板上に生じたコロニーを、釣り上げ、そして、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを抽出した。それぞれクローンからのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断してＤＮＡを線状にし、アガロースゲルに添加した（図１Ｂ）。クローン３、７、及び８に相当するレーン６、１０、及び１１のバンドはすべて、レーン３に添加した二重消化ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏから生じた骨格ベクターと同様のサイズを有するように見えた。クローン５、９、及び１０（レーン８、１２、及び１３）から生じたバンドは、レーン３の二重消化ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏサンプルによって生じた５６８９ｂｐのバンドより遅く移動し、それらがそれぞれ可能性のある挿入物を含んでいることが示唆された。
４−１ＢＢＬ挿入物を含有するｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターを有するクローンを追加試験するために、別の制限解析を、有力候補であることが図１Ｂで同定されたクローン５、９、及び１０に対して実施した。しかしながら、この時、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩを選択したのは、ベクターマップによると、これらの２つの部位が、それらが約５００ｂｐ離れて、４−１ＢＢＬ配列の中だけに存在していたからである。そのため、酵素の両方が５００ｂｐの断片を放出するだけであるようにＤＮＡサンプルのいずれかを切断することができれば、これは、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター内の４−１ＢＢＬ挿入物の存在を確認する助けとなる。二重消化を実施し、そして、サンプルをアガロースゲルに添加した（図１Ｃ）。（図１Ｂのレーン８、１２、及び１３からの）クローン５、９、及び１０はすべて、図１Ｃのレーン７、１０、及び１３で検出されたように、長さ約５００ｂｐの断片を示した。そのため、４−１ＢＢＬ ｃＤＮＡを含有する３つのクローンすべてが、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター内に正しく挿入された可能性が非常に高い。
実施例２
Ｂ７．１及び４−１ＢＢＬ共刺激因子の発現が異なる全細胞ワクチンによって誘発したＴ細胞免疫応答
主要な免疫共刺激分子４−１ＢＢＬ、Ｂ７．１、又はその両方の組み合わせを発現するように遺伝子操作した３つの異なる全細胞メラノーマワクチンの有効性を調査した。マウスに、３つの放射線照射細胞ワクチン株のうちの１つをワクチン接種し、そして、対照である非ワクチン接種マウスと共に、多くの実験を実施して、様々なワクチンの有効性を評価した。
二種類の用量のＢ７．１Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β全細胞ワクチンを受けたマウスで生じたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増大
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、先の実施例に記載の３種類の別個の放射線照射全細胞メラノーマワクチン（Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β；Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β；又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β）のうちの１つをワクチン接種した。３つのワクチンを比較する目的は、第一に、３つのワクチンのうちで最も強い抗癌免疫応答を生じる特定の１つを確定することであった。第二に、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０３７２９３に最初に記載したＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１ワクチンと比較したときに、ワクチンに処方された細胞の細胞表面に提示された４−１ＢＢＬ単独、又はＢ７．１と組み合わせた４−１ＢＢＬの存在に対する応答において、より強いＴ細胞応答が生じたるか否かを決定することが目的であった。
初期研究では、その後の免疫分析のためのブースター注射の４日後のマウスを屠殺する前の７日間内の二度の、投薬を受けていないマウスのワクチン接種を伴うプライム／ブーストワクチン接種プロトコールを使用した。ワクチン接種をいつ送達したかを詳しく述べるタイムラインを図４Ａに提示する。１１日目に、マウスから摘出した。脾臓、血液、及びリンパ節を別々に、すべてのマウスから摘出した。脾臓を計量し、そして、免疫反応が起こったか否かに関する基本的な指標として比較した（図４Ｂ）。次に、細胞調製物を分析し、そしてフローサイトメトリーによってＴ細胞数は決定した（図５）。
脾臓重量の分析は、群間の変動が有意でないことを示した（ｐ＝０．１）。しかしながら、有意差が、対照脾臓とＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを注射したマウスとの間に存在し、その脾臓重量は有意に増加した（ｐ＜０．０５）。試験した他のワクチンは有意でなかったが、対照マウスと比較して、脾臓の平均体重は増加傾向があった。
％Ｔ細胞亜集団の分析は、ＣＤ４＋脾臓集団に変化がないことを示したが、その一方で、％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照マウス又は他のすべてのワクチン接種群からの脾臓と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを投与したマウスからの脾臓で増大した（事後試験によりｐ＜０．００５；図５Ａ）。図５Ｂに示したように、血液中の％ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析もまた同様の有意な増大、並びにＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスと比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスにおける％ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増大が明らかになった（ｐ＝０．０３６）。事後試験を実施したとき、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン処置したマウスの血液中の％ＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照マウス又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチンで処置したマウスに比べて、有意に多かったことがわかった（それぞれｐ＝０．００７とｐ＝０．０００８、図５Ｂ）。他のすべての群（図５Ｂ）と比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のレベルの減少は、Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−ＩＦＮ−γ／βのワクチン処置マウスからの末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）で検出した。しかしながら、ＰＢＬ ＣＤ４＋Ｔ細胞レベルだけが、対照マウス又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βのワクチン処置マウスと比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βのワクチン処置マウスにおいて有意に低かった（ｐ＜０．０５；図５Ｂ）。図５Ｃは、処置群のすべての間の、％ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるわずかな違いしか示さなかった。
癌ワクチン細胞で抗原性刺激した脾臓ＭＬＣにおける強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団
先の実験は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来ＣＤ８＋Ｔ細胞が、他のすべての群と比較して大きく増大したことを測定した。よって、これらのリンパ球集団が、３〜５日間のリンパ球混合培養（ＭＬＣ）で増殖することができ、その後、抗原性刺激されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数の変化を分析されることが想定された（図６）。
図６に示したように、刺激剤として癌細胞を用いた３〜５日間のＭＬＣで増殖させたＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、特に、有意差を認めた（ｐ＜０．０００１）。これらはＣＤ８＋Ｔ細胞数で検出したほど増大が著しくなかったが、％ＣＤ４＋Ｔ細胞における違いもまた観察された。ＭＬＣにおいて強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、脾臓及びＰＢＬ集団をそれらのＴ細胞レベルについて直接分析した先の結果と一致していた（図５）。すべてのワクチン接種マウスのＭＬＣからの％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照マウス由来のものより有意に多かった。特に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球は、ＭＬＣでの培養後に、対照又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したマウスより有意に多い％ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた（それぞれｐ＜０．０００１及び０．００１）。これらの結果は、有意に活性化されたエフェクターＣＤ８＋ＣＴＬｓが、好適な癌ワクチンによって免疫したマウスの脾臓に生じる場合があることを実証する。
抗癌性ワクチンに対する応答で誘発されたＭＬＣ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の特徴づけ
活性化した、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａを発現することは、Bettsら（2003）が記載したように、知られている。そのため、ＭＬＣで５日間培養した脾臓由来リンパ球を、フローサイトメトリーを使用して分析して、それらの％活性化、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を測定した（図７）。これは、ＣＤ８の発現に従ってリンパ球を更にゲートでコントロールし、次に、表面マーカーＣＤ１０７ａ及び細胞内サイトカイン、ＩＦＮ−γも発現する％ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定することを必要とした。
％活性化Ｔ細胞を比較する分散分析では、高度に有意であることがわかった（ｐ＜０．００５）。図６Ｂは、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウスからのリンパ球が、他のすべての群と比較すると、５日間（ｐ＜０．０５）ＭＬＣで培養された後に有意に高い％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じたことを示す。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したマウスは、対照（ｐ＝０．０００９）及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０００８）と比較して、ＭＬＣにおいて７倍超多くの％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じ、そして、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０１４）からのものより２倍超の数の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた。すべてのマウス群からの様々な免疫器官からのＴ細胞集団を分析したので、次の段階はリンパ球の細胞毒活性を評価することであった。
２つのワクチン用量の抗癌性ワクチンを受けたマウスのリンパ節から単離したリンパ球の低い細胞毒活性
対照及びワクチン接種したマウスから採取したサンプル中に見出された％Ｔ細胞集団の違いを評価した後、処置群間のＴ細胞集団の違いが、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいてメラノーマ細胞の死滅に変換されるか否か確認することは、重要であった。採取の日にリンパ節から単離したリンパ球を使用して、ＣＴＬアッセイを実施した（図７）。
分析では、４つの処置群のいずれからのリンパ節由来リンパ球によって生み出される細胞死の割合にも有意な違いは認められなかった（ｐ＝０．４８８；図７）。この分析では図５Ｃに示した結果を確認し、そしてそれは、ワクチン接種群のいずれと比較しても、対照マウスのリンパ節の中に見出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対％の有意差がなかったことを確認した。
二種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β抗癌性ワクチン受けたマウスからの、ＭＬＣで増殖させた脾臓由来リンパ球による増強されたＣＴＬ死滅
リンパ節からのリンパ球の細胞傷害性能力を評価した後、次に、脾リンパ球集団を、５日間ＭＬＣで増殖させ、そして、それらの細胞毒活性について評価した（図８）。
ワクチン接種マウス、特にＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを与えられたマウスからのＭＬＣにおいてのみ、増加した％ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す先の結果（図５Ｂ及び６）を考えれば、より大きいＣＴＬ活性もまた誘発されたであろうことが予想された。
対照又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウスからのリンパ球を含有するそれらのＭＬＣは、オレンジ色がかった培地を含み（データ未掲載）そして、細胞の高レベルの代謝活性を示し、その結果培地のｐＨを低下させた（Gerweck 1977, Welshons et al. 1988）。比較すると、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウスからのリンパ球を含有するＭＬＣは、より赤みがかった顔料を伴った培地を含み、より高いｐＨ及びより低レベルの代謝活性が培養物中に生じていたことが示唆された（データ未掲載）。これらの結果は、色の変化がＭＬＣ中で起こる事象の早期指標として使用できることを明らかにした。なぜなら、倒立顕微鏡による更なる調査によって、図８Ｃ及びＤに強調表示したように、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球を含有するＭＬＣ中の抗原性刺激因子（メラノーマ細胞）の大部分が、プレート表面から剥がれ、死滅したように見えることがわかったからである。すべての６穴プレートが、生きたリンパ球に加えて、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１抗原性刺激因子細胞（細胞増殖を阻害するためにマイトマイシンＣ処置した）を含んだ。両方の細胞型が培地を代謝するにもかかわらず、腫瘍細胞は、活発に成長もしないし、分裂もしない。これらの観察は、ＭＬＣウェルの腫瘍細胞がそれらの代謝に培地を利用する主な細胞構成要素であろうことを示唆する。この知見は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球が、培地を代謝するこれらのウェル内の生きた腫瘍細胞の数が、これらのＭＬＣ中の培地に対する色の変化をほとんど目立たせずに大きく低下したように（データ未掲載）、培養中の５日間にわたって抗原性刺激因子細胞を活発に死滅させることができる高活性なＣＴＬｓである可能性が最も高い。
これらの初期観察に注目した後、次に、リンパ球をＭＬＣから取り出し、ＣＴＬアッセイで使用するために調製し、そして、代表的な緑色（死細胞）及び赤色（あらかじめ染色したメラノーマ細胞）の蛍光画像をＣＴＬアッセイプレートのウェルから記録した（図９及び１０）。
ＣＴＬアッセイの分析中、明視野の、赤色蛍光（ＤｉＩ）及び緑色蛍光画像（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を、ＣＴＬアッセイ内の特定のウェルについて取得した（図９）。４つのＣＴＬアッセイすべてからの、ＤｉＩで染色した１００％の生標的細胞のみの明視野及び赤色蛍光画像は、標的癌細胞をほぼコンフルエントな単層として確立したが、この集団内のほんのわずかな死細胞を、核に取り込まれたＳＹＴＯＸ色素の緑色蛍光画像によって検出した。この結果は、標的細胞のみがほとんど健康な生きた集団であり、これにより、減弱された標的細胞又は死んだ標的細胞の結果として生じたバックグラウンドシグナルに有意に貢献しなかったことを示す。しかしながら、標的細胞を、画像の最終行に示したように、ＭＬＣ誘導リンパ球によって効果的に死滅させた（標識された「ＣＴＬアッセイにおけるエフェクター＋標的」、図９）。（０．４％のＮＰ９界面活性剤の添加によって引き起こされた）１００％死滅標的細胞の対照ウェルは、標的細胞の集団全体を死滅させたとき、予定の最大蛍光を示した。
「１００％の生きたエフェクター細胞」単独の集団において検出される緑色蛍光を、細胞死の基準レベルとして使用し、そしてそれは、分光光度計を使用して画像を定量したとき、標的細胞と組み合わせたリンパ球の緑色蛍光値から引き算された（標識された「ＣＴＬアッセイにおけるエフェクター＋標的」）。単独で１００％の生きたエフェクターリンパ球を含むウェルにおいて検出可能な細胞死のわずかな割合は、優性な正常細胞及び少数のみのリンパ球を含有するそれらがＭＬＣの処置及び調製中に死滅したことを示した。そのうえ、１００％の生きたエフェクターリンパ球を単独で含むウェル観察された細胞死は、おそらく、抗原性刺激因子標的細胞がアポトーシスを受けることが観察されたＭＬＣから；特に、より強力なワクチンを含むＭＬＣにおいて、持ち越された抗原性刺激因子標的細胞破片の結果である可能性が高い（図８）。
先に記載した死細胞材料の破片は、リンパ球のものと同様のサイズのものであり、そしてそれは、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥＴＭ ＰＬＵＳ又は他の分離技術を使用したときさえ、その分離及び除去を非常に困難にした。それにもかかわらず、このベースラインレベルの死細胞であっても、有意に増強された緑色蛍光レベルは、４個のＣＴＬアッセイのすべてについてエフェクターと標的細胞の組み合わせを含むそれらのウェルで検出された。また一方、異なるレベルの細胞死は、これらのウェルにおいて検出され、そして、対照エフェクターと標的の反応は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからエフェクターを組み込んだ他の試験反応と比較して、最低レベルの緑色蛍光を示した（図９）。ＭＬＣの細胞培地からの写真結果は、図１０に示したように、分光測光で定量化したＣＴＬデータを支持した。
図１０に示したデータの分析は、ＣＴＬ活性を増強するというワクチン接種の非常に顕著な効果があったこと明らかにした（ｐ＜０．０００１）。次に、事後試験を使用し、ＣＴＬアッセイにおける細胞死の割合を決定し、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球が他のすべてのＣＴＬアッセイにおけるそれらより有意に活性であることを示した（ｐ＜０．００５）。同様に、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからリンパ球を使用したＣＴＬアッセイからの細胞死の割合もまた、他のすべてのＣＴＬアッセイと有意に異なっている（ｐ＜０．００５）。分析はまた、割合に関して細胞死の最も高い変化率は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球を用いたＣＴＬアッセイにおいて見出され、続いて、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのもの、そして、最も活性の低いものは、対照マウス由来のリンパ球のものであることも確認した。この統計解析は、図１０に示した結果を立証する。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球を使用したＣＴＬアッセイにおける細胞死の割合の相対的増加倍率は、表４に示したように、対照、非ワクチン接種マウスからのリンパ球と比較して、５．７であった。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球によって誘発した癌（標的）細胞の死滅の約２倍の相乗的増大は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球を使用した統合成績を先に示した（表４）。
表４
１値は、グラフが１溶解単位の線と交差する点＝３０％の標的細胞溶解を生じるエフェクター細胞数（×１０４）に基づいて図４．９から得られる。
２結果は、１の値を付与した、対照である非ワクチン接種マウスのＣＴＬ反応に対して決定する。
４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β全細胞抗癌性ワクチンを受けたマウスで生じたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高度に上昇させた
先に記載したように、この試験で利用した初回接種プロトコールは、プライム／ブーストストラテジーに関与する。２回の更なるブースター注射の追加を伴った代替ワクチン接種プロトコール（「ワクチン接種プロトコール２」）を、抗癌性免疫応答を更に強化する目的で実施した。よって、ワクチン接種プロトコール２のために、投薬を受けていないマウスに、投薬間を７日間隔で隔てた二種類の用量の（プライム／ブーストストラテジーを使用した）ワクチンを与え、続いて、マウスを休ませる２７日間の後に、４日間隔で隔てた、更に２回のブースター注射を投与した。次に、マウスを、最後の注射の４日後に屠殺した。採取の日（４２日目）に、脾臓、血液、及びリンパ節を、すべてのマウスから別々に採取し、そして、免疫応答についてアッセイした。プロトコール２に従ってマウスにワクチン接種した日を示したタイムラインを、図１１Ａに例示する。脾臓を計量し（図１１Ｂ）、次に、脾臓、血液及びリンパ節からの細胞調製物を分析し、そして、フローサイトメトリーでＴ細胞数を確認した（図１２）。
脾臓重量の有意差は、処置群と比較したときに観察された（ｐ＝０．００２）。事後検定による更なる分析では、３つのすべてのワクチン接種マウス群からの脾臓の平均重量が、図１１Ｂに示したように、対照マウスと比較して、有意に重いことを確認した。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（平均＝１１１．８ｍｇ）と対照マウス（平均＝８４．３ｍｇ）との間の脾臓重量における高度に有意な違いを確認した（ｐ＜０．００５）。更に、いずれのワクチン接種マウス群同士も、そこからの脾臓重量を比較したとき、違いは見られなかった。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの脾臓及び血液で生じた％ＣＤ８＋Ｔ細胞が、他のすべての処置群と比較して有意に高いことは、図１２Ａ及びＢから明白である（両方についてｐ＜０．００５）。更に、事後試験は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの脾臓が、対照と比較して（ｐ＜０．０００１）、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスと比較して（ｐ＜０．０００１）、及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスと比較して（ｐ＜０．０００１）、有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞を有することを確認した。脾臓の分析からのこれらの結果は、血液中で検出される
％ＣＤ８＋Ｔ細胞の変化と非常に類似していた。よって、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスは、他のすべての群に比べて、ＰＢＬサンプル中に有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞を有した（ｐ＜０．０００１）。処置群の間で脾臓、血液又はリンパ節サンプル中の％ＣＤ４＋Ｔ細胞の違いは、検出されなかった。更に、あらゆる試験群の間で、リンパ節の中に生じた％ＣＤ８＋Ｔ細胞に違いがなかった。
癌ワクチン細胞を用いて抗原性刺激した脾臓ＭＬＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増大
これらの結果の観点から、次の段階は、図１３Ａに示したように、３〜５日間、ＭＬＣで抗原性刺激した後のフローサイトメトリーによる脾臓由来ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団における変化を分析することであった。
ＭＬＣで増殖させた脾臓由来Ｔ細胞集団、特に、癌細胞を抗原性刺激因子として使用した３〜５日間のＭＬＣで増殖させたＣＤ８＋Ｔ細胞集団の有意差に留意した（ｐ＜０．０００１）。比較によって、％ＣＤ４＋Ｔ細胞の違いは記録されなかった。脾臓由来ＭＬＣにおいて強化したＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、ワクチン接種マウスから直接摘出した脾臓及びＰＢＬレベルの両方を分析した先の結果と一致していた（図１２）。すべてのワクチン接種マウスのＭＬＣからの％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照マウスから単離したものより有意に多かった。特に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球は、対照（ｐ＜０．０００１）、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０３４）、及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＜０．０００１）よりも有意に多い％ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じる。これらの結果は、有意なエフェクターＣＤ８＋ＣＴＬｓが癌ワクチンによって免疫されたマウスの脾臓で生じ、そして、増殖したという先の項に記載した知見を更に支持する。
癌ワクチンに対する応答で誘発されたＭＬＣ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の特徴づけ
先の試験で記載したとおり、培養で５日後のＭＬＣ脾臓由来リンパ球ＣＤ４＋及びＣＤ８＋分析に続いて、次の段階は、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａの存在及びＩＦＮ−γの細胞内レベルを検出することによってＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態を評価することであった（図１３Ｂ）。
％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を比較する群間分析では、高度に有意であることがわかった（ｐ＜０．００５）。図１３Ｂは、対照とＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのＭＬＣ由来リンパ球の間に、％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の違いがないことを示す。比較により、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウスからのリンパ球は、対照（ｐ＜０．０００１）、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＜０．０００１）、及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．００４）と比較して、
５日間のＭＬＣでの培養後に、有意に高い％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスのＭＬＣから生じた活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の約７５％が活性化され、そしてそれは、対照マウスから得た数より１０７倍多く、かつ、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の数より１．７倍多かった。
対照マウスと比較して、４種類のワクチン投与量を与えたマウスからのリンパ節由来リンパ球の細胞傷害能に違いはない
対照及びワクチン接種マウスからの様々なサンプルのＴ細胞集団を分析した後に、採取日に回収したリンパ節由来リンパ球を、先に記載したように、メラノーマ細胞を死滅させるそれらの細胞傷害能についてＣＴＬアッセイでアッセイした。
図１３Ｃに示したデータの一般線形モデル分析は、４つの群のいずれかの間のリンパ節由来リンパ球によって生じた細胞死の割合の有意差がないことを示す（ｐ＝０．１４５）。この分析は、図１２Ｃに示した結果を支持し、そしてそれは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の相対パーセンテージの有意差がないことを、４つの処置群のいずれかからのリンパ節内で確認したと結論を下した（図１３Ｃ）。
対照マウスと比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球で検出される低レベルの細胞毒性
投薬を受けていない対照マウス及び４種類の用量のワクチンを受けたマウスからの採取の日にアッセイした脾リンパ球の細胞毒活性は、ＣＴＬアッセイにおいて標的としてのメラノーマ細胞を死滅させるそれらの能力について分析した（図１３Ｄ）。この実験の目的は、採取の日に直接分析した脾臓由来リンパ球が、リンパ節由来リンパ球より強いＣＴＬ死滅を作り出すか否を確認することであった。特にＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球が、図１２に示したように、採取の日にこれらのマウスの脾臓において検出された有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞のため、リンパ節由来リンパ球より大きいＣＴＬ活性を示すと予想した。
包括Ｆ検定分析は、採取の日に脾臓由来リンパ球によって製造した処置群間の細胞死の割合の有意差であることを確認した（ｐ＜０．０００１）。事後検定は、次に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球が、他のＣＴＬアッセイにおけるそれらより有意に活性であることを示した（ｐ＜０．００５）。更に、腫瘍（標的）細胞死滅の２倍の相対的増加は、表５に示したように、対照、非ワクチン接種マウスからのリンパ球と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球を使用して観察した。分析ではまた、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球の後に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス、対照マウス、及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのものが続く結果となった、表５で計算した割合に基づくＣＴＬ活性の最大の増大も確認した。これらの結果は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球が最大％ＣＤ８＋Ｔ細胞を示した図１２Ａにあるデータによって支持された。これらの知見は、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の一部が、既に抗原性刺激されており、アッセイする前にＭＬＣ中で増殖させる必要なしに、ＣＴＬアッセイの中で検出される強力且つ直接的な癌の細胞死滅を可能にすることを示す。
表５
１値は、グラフが１溶解単位の線と交差する点＝３０％の標的細胞溶解を生じるエフェクター細胞数（×１０４）に基づいて図１３Ｄから得られる。
２結果は、１の値を付与した、対照である非ワクチン接種マウスのＣＴＬ反応に対して決定する。
４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β全細胞抗癌性ワクチンを受けたマウスで生じたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高度に上昇させた
よって、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βからの脾臓由来リンパ球は、採取日に、最大ＣＴＬ活性を示し、他のすべて試験群からのリンパ球を上回った（図１３Ｄ）。次の段階は、脾臓由来リンパ球の細胞毒活性が、ＭＬＣで５日間それらを増殖させることによる生きた癌細胞に対する抗原刺激によって高められる場合があるかを確認することであった。特に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのＭＬＣ誘導脾リンパ球は、先の実験における非常に高められ、且つ、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団の検出レベルに基づいてＣＴＬ活性が上昇したと予想した（図１３Ａ〜Ｂ）。ＭＬＣプレート（データ未掲載）並びに混合細胞集団の代表的な分析が、リンパ球がＣＴＬアッセイで分析される前に記録された。
組織培養液で観察した変色は、先に記載したものと非常に類似していた。対照又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球を含むＭＬＣウェル内の培地は、それぞれ、黄色又はオレンジ色の顔料を有する培地を含むことを示した。以前に明白になったとおり、この色は、低いｐＨ及び細胞のより高い代謝活性を示す。対照的に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチン接種マウス由来のリンパ球を含むＭＬＣウェルは、より赤みがかった顔料を有する培地を含むことを観察し、先の実験における、非常に高く、且つ、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞集団の検出のレベルに対して細胞のより高いｐＨ及び低い代謝活性を示唆した。図１４に示したＭＬＣウェル内に存在する生きた、代謝細胞の数は、ウェル内の組織培養液の色に直接対応する。すべてのウェルには、同じ数の腫瘍支持細胞及びリンパ球を播種した。しかしながら、目視検査から、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−α／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−α／βワクチン接種マウス由来のリンパ球が、高率で腫瘍抗原性刺激因子細胞を死滅させたことは明らかであった（図１４Ｃ及びＤ）。その結果、これらのウェル内には、組織培養液を代謝し、そしてその培地が先に記載したように赤色色素を維持するまでのわずかな生細胞しか存在しない。次の段階は、ＣＴＬアッセイにおいてこれらのＭＬＣからリンパ球の細胞毒活性を定量化することであった。
図１５は、図９に記録したものと同様の観察を強調表示する。１００％生きた標的メラノーマ細胞だけの明視野及び赤色蛍光（ＤｉＩ染色）画像は、癌細胞がほぼコンフルエントな単層として樹立したことを示したが、その一方で、緑色蛍光（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ染色）画像は同じ集団内の低レベルの死亡を示した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ染色したエフェクター及び標的細胞を含むウェルは、生きたエフェクター細胞を単独で含んでいるウェルと比較して、緑色の核染色色素を取り込んだ多数の細胞を含むことが示された。この観察は、エフェクター及び標的ウェル内の標的癌細胞の一部が、４時間のＣＴＬアッセイのコース中にリンパ球によって直接殺滅したことを示した。
一般線形モデル分析は、高度に有意な違いが図１６Ａに示した群間のすべてに存在したことをを確認した（ｐ＜０．０００１）。事後試験は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球を使用したＣＴＬアッセイからの細胞死の割合が、試験した他のすべてのＣＴＬアッセイと比較して、有意に増強されたことを明らかにした（ｐ＜０．０００１）。比に関する細胞死の変化率の順位序列は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球を用いたＣＴＬアッセイが、比で増加単位あたり細胞死の最大増加を提供したことを示した。比の増加に関する変化の次の最高比率は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスと、最低レベルの細胞死を示した対照マウスとによって示された。表６は、種々でワクチン接種マウス由来のリンパ球を使用したＣＴＬアッセイで観察した細胞死の割合における相対的増加倍率を示す。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンを注射したマウスは、対照マウスからリンパ球と比較して、エフェクター細胞集団あたりの溶解単位で１１．１倍の増大を示した。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のリンパ球は、対照に対して、細胞毒活性に関してそれぞれ約４倍の増大を示した。重要なことには、ＩＦＮ−γ／β処置したＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１細胞における４−１ＢＢＬ及びＢ７．１分子の同時発現は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの値の合計から導かれるリンパ球から引き出された細胞毒活性の増加倍数の合計より大きかった対照に対して、エフェクター細胞集団あたりの溶解単位において１１．１倍の増大が観察される、細胞傷害能に対する相乗効果を生じさせたと、これらの結果から結論づけられる。そのため、最も活性なリンパ球は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のものであることがわかり、そしてそれは、図１３Ａ及びＢに示した結果を確認し、且つ、支持する。
表６
１値は、グラフが１溶解単位の線と交差する点＝３０％の標的細胞溶解を生じるエフェクター細胞数（×１０４）に基づいて図１６から得られる。
２結果は、１の値を付与した、対照である非ワクチン接種マウスのＣＴＬ反応に対して決定する。
実施例３
マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するワクチン接種レジメンの比較
先の実施例において、投薬を受けていない又は抗癌性ワクチン接種マウスの％ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、マウスにワクチン接種プロトコール１又は２（実施例２に記載）のいずれかを注射したときに比較した。この実施例は、５日間ＭＬＣで増殖させた後、２種類（すなわち、プロトコル１）又は４種類の用量（すなわち、プロトコル２）の同じワクチン細胞を注射したマウスで生じるＴ細胞応答を比較することに焦点を合わせる。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β抗癌性ワクチンを受けたマウスにおけるワクチン接種プロトコール１とプロトコール２との間で比較して、ＭＬＣで増殖させた％ＣＤ４＋Ｔ細胞集団で有意差が記録された（図１６Ｂ）。処置マウスの両群において、プロトコール２に従ってワクチン接種したものは、プロトコール１を使用して同じワクチンを受けたマウスより有意に低い％ＣＤ４＋Ｔ細胞を有したことが観察された。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス由来のＭＬＣリンパ球において、最も大きい違いが検出された、すなわち、プロトコール２に従って注射したマウスは、プロトコール１を用いて注射したマウスと比較して、有意に低い％ＣＤ４＋Ｔ細胞を生じた（ｐ＜０．０００１）。対照的に、プロトコール２に従ってＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンで処置したマウスからのＭＬＣ由来リンパ球は、プロトコール１に従って同じワクチンを与えたマウスと比較して、有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を生じた（ｐ＝０．００１；図１６Ｃ）。結果はまた、プロトコール２に従って処置したすべてのワクチン接種マウス群からの平均％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が、それらにプロトコール１を使用して処置したマウスからのものより高かったことを示した。プロトコール２を使用してＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチンを用いて観察されたＣＤ８＋ＣＴＬｓの微増は、これらの試験において、プロトコール１のものから統計的に有意でなかった。
プロトコール２を使用して生じた活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞の増大した割合
次の目的は、プロトコール１又はプロトコール２のいずれかで処置したワクチン接種マウスから５日間増殖させたＭＬＣ由来リンパ球から生じる％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を比較することであった。
Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓由来リンパ球を使用してＭＬＣで生じる％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を比較する対応のない標本のＴ検定で、有意に異なることを確認した（図１７）。プロトコール２に従ってＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞を用いてワクチン接種したマウスは、プロトコール１に従って同じワクチンで処置したマウスと比較して、ＭＬＣにおいて５倍超多い％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じる（ｐ＝０．０２３）。更に、プロトコール２に従ってＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をもちいてワクチン接種したマウスからのＭＬＣは、プロトコール１に従って処置した同様のワクチン接種マウスからのＭＬＣで生じた１７％と比較して、平均７４％活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた（ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、ワクチン接種プロトコール２を用いた処置マウスが、プロトコール１ワクチン接種マウスと比較して、ＭＬＣで生じる活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の割合を有意に高めたことを明確に示す。
実施例４
生きた腫瘍細胞を用いた抗原投与前に全細胞ワクチンを受けたマウスの生存率上昇
試験の次の目的は、ワクチン接種マウスが続いて生きたメラノーマ細胞によって抗原投与されたとき、免疫応答を惹起するそれぞれワクチンの能力を評価することであった。予防形態の治療を試験して、上昇及び活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、特に（先の実施例で確認した）Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスは、ワクチン接種マウスが生きた癌細胞を用いて抗原投与されたとき、生存を促進できるか否か、そして、ワクチン接種が、腫瘍の発症からマウスを保護するか否かを確認した。
生きた癌細胞を用いた抗原投与後に惹起された防御免疫反応
５×１０５個の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１メラノーマ細胞を用いた抗原投与後に、マウスを、プロトコール２（上記）に従って４種類のワクチン用量に晒し、その後、生存に関して免疫応答を評価した。図１２に示した結果から、ワクチン接種プロトコール１を用いて処置したマウスのものより大きくない場合、生きた癌細胞を用いた抗原投与前に、プロトコール２に従ってワクチン接種したマウスの生存の長さは類似することが予想される（図１８Ａ）。この実験を二重反復試験で実施し、結果を正当性を立証した。これらの２つの実験におけるマウスの生存を、それぞれ１０２日間及び９８日間の期間観察し、そして、図１８Ｂ及びＣに示したように、両実験の結果を組み合わせて、全体的なマウスの生存率（パーセンテージ）を提供する。
対照である非ワクチン接種マウスは、２５日間の生存期間の中央値を有した。しかしながら、すべての対照マウスは、それらの腫瘍のサイズのため、３１日目までに安楽死させる必要があった。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンで処置したマウスの６０％は、３５日目までにそれらの腫瘍負荷のために死滅し、４０％が腫瘍なしのままであった。それにもかかわらず、このコホートは、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかで処置した他のものと比較して、有意に短期間しか生きていなかった（ｐ＝０．０１４）。更に、生存における高度に有意な違いは、対照マウスを、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかで処置したものと比較したときに記録され（ｐ＝０．０００３）、後者のワクチン接種マウスのすべてが、生きた腫瘍細胞を用いた抗原投与に対して完全に保護されていた。
生き残っているワクチン接種マウスの抗腫瘍性免疫応答を更に試験するために、１０２日目に５×１０５個の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を再抗原投与する前に、それらに、初期腫瘍抗原投与後９４及び９８日目に、追加２種類の用量のワクチン用いてブーストした。腫瘍の増殖及び生存を、図１８Ｃに示したように確認した。非ワクチン接種である対照マウスの生存期間の中央値が１９日間であることを再び確認し、そしてそれは、非ワクチン接種である対照マウスの先のコホートの生存期間の中央値と同様であった（２５日間、図１８Ｂ）。比較により、ワクチン接種及び再抗原投与マウスのすべてが、その後の腫瘍成長に対して完全な免疫で、保護された状態を維持した。
生きた１×１０６個のＢ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１細胞の注射による抗原投与前に、Ｂ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンで処置したマウスの増化された生存
先の実施例は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンが、腫瘍細胞の排除をもたらす抗腫瘍性免疫応答を生じることができたことをを確認した。同様にワクチン接種したが、より大きい腫瘍負荷で抗原投与したマウスにおいて免疫応答の性質を更に試験するために、２倍の数の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞（１×１０６）を注射し、そして、腫瘍増殖を観察した（図１８Ｃ）。図１２及び１３Ｂからの結果によって証明されるように、最も高い％活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞集団がこれらのマウスで生じると仮定して、これらのマウスをプロトコール２に従って処置した。
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞をワクチン接種したマウスは、ワクチン接種したマウスの５０％が生きた腫瘍抗原投与を生き残り、対照である非ワクチン接種マウスより有意に（ｐ＝０．０００５）長く生き残った（図１８Ｃ）。
Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスはまた、改善された生存転帰も示し、腫瘍成長に対して完全に保護した（ｐ＝０．００９６）。２種類の異なる抗癌性ワクチンのいずれかを受けた２つのマウス群間の生存における違いは、これらの試験において統計的有意性に達しなかった。
生きたメラノーマ細胞負荷を用いた抗原投与前に、４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／β抗癌ワクチンで処置したマウスで生じるＣＤ８＋Ｔ細胞応答
これまでに開発されたワクチンは、ワクチン接種マウスに、それに続いて生きたＢ１６−Ｆ１０細胞を用いて抗原投与したとき、腫瘍形成を予防できなかった。なぜなら、本試験で確認したように、これらが、すべてのＢ１６−Ｆ１０変異型の中で最も攻撃的で、且つ、最も速く増殖するからである（図２２）。Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンのいずれかに対して生じる抗腫瘍性免疫応答を更に試験するために、これらの抗癌性ワクチンのいずれか一方を受けたマウスに、５×１０５個の生きた野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞を用いて抗原投与した（図１９）。
腫瘍の測定値が動物倫理ガイドラインによる最大許容寸法に達したので、生きた野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞の注射による抗原投与の１７日後にすべてのマウスが屠殺した。図１９Ａは、すべてのマウスで、それらがワクチン接種したか否かに関係なく、腫瘍を発症したことを示す。分析では、すべてのマウスが腫瘍を発症したにもかかわらず、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの腫瘍サイズは、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０１９）又は非ワクチン接種対照マウス（ｐ＝０．００２）の腫瘍に比べて有意に小さかったことを確認した。
最初の測定を記録した後に、図１９Ｂ及びＣに示したように、腫瘍及び脾臓を摘出し、計量した。次に、脾臓、血液、リンパ節及び腫瘍を加工し、フローサイトメトリーによって、それらのＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び制御性Ｔ細胞集団について分析した（図２０）。
結果は、いずれの処置群のマウス間にも腫瘍又は脾臓のいずれの重量も違いを示さなかった（図１９Ｃ及びＤ）。しかしながら、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの腫瘍の平均重量は、他の群でそれより小さく、腫瘍の物理的大きさで計測された違いの比較は、図１９Ａに示したデータと一致していた。
特に脾臓及び腫瘍サンプルの中のＣＤ８＋Ｔ細胞集団において有意差が注目された。よって、有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照（ｐ＝０．０４１）又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０１８；図２０Ａ）のいずれかと比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからの脾臓に見出された。同様に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの血液の中の平均％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、他の両群より高かったが、この増大は統計的に有意でなかった（図２０Ｂ）。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスは、対照、非ワクチン接種マウスと比較して（ｐ＝０．００２）、図２０Ｄに示したように、腫瘍中に有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じることがわかった。
％ＣＤ４＋及び制御性Ｔ細胞集団におけるわずかな変化だけが観察された。しかしながら、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの血液は、図２０Ｂに示したとおり、対照、非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．００５）又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．００６）の血液中のレベルよりわずかに高い％制御性Ｔ細胞を生じることがわかった。
低用量の生きたＢ１６−Ｆ１０細胞の抗原投与前に、４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／βワクチンを受けたマウスの生存上昇
生きた野性型Ｂ１６−Ｆ１０細胞を用いてマウスに抗原投与することを伴う先の実験を受けて、次の実験は、非ワクチン接種マウスと、１０分の一のＢ１６−Ｆ１０細胞（５×１０４個のＢ１６−Ｆ１０細胞）を注射することによる抗原投与前に、４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β抗癌性ワクチンを受けたマウスとの腫瘍の成長を比較することを伴う。この実験の目的は、より少数の生きた腫瘍細胞を使用することが、マウスを安楽死させることが必要になるまで、長期間マウスを生き残らせるのに効果があるか否か、確認することであった（図２１Ａ）。
生きた癌細胞を抗原投与した後の、非ワクチン接種、対照マウス対Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの間の生存の長さにおける違いは、統計的に有意であることをを確認した（ｐ＝０．００５８）。非ワクチン接種、抗原投与マウスのすべてを、生きた腫瘍細胞の注射後２１日以内に安楽死させなければならなかった（図１７Ａ）。Ｂ１６−Ｆ１０細胞株は攻撃的、且つ、急速に成長する細胞株なので、これらのマウスは、図１９Ａに示したように、１０倍多くのＢ１６−Ｆ１０細胞を用いて抗原投与した対照マウスの１７日目の安楽死と比較して、更に４〜５日間生き伸びることができただけであった。加えて、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンを投与した４匹のマウスのうちの１匹だけが、腫瘍を発症しなかったので、保護的な抗腫瘍性応答をもたらした。更に、腫瘍を発症した３匹のワクチン接種マウスは、それらの腫瘍が最大寸法に達し、安楽死が必要となるまで、非ワクチン接種、抗原投与マウスより、平均で更に１０日間長く生き延びた。
実施例５
様々なワクチン用量を受け、しかも生きた腫瘍抗原投与後に腫瘍なしのままであったマウスで生じたＴ細胞レベル
この実施例は、先に記載した実験から続き、そして、二種類の用量の３種類の異なる抗癌性ワクチンのいずれかでワクチン接種した多くのマウスが、５×１０５個の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を抗原投与の後に、腫瘍を形成しなかったことを示す図１７Ｂで実施した。この実施例の目的は、生き残っているマウスからの組織サンプル中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団を分析し、そして、サンプル中のエフェクターメモリ（ＴＥＭ）又は中央メモリー（ＴＣＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかとして％メモリーＴ細胞を同定することであった。
生きた腫瘍細胞の注射後、少なくとも１１２日間腫瘍なし状態を維持したワクチン接種マウスに、生きた腫瘍細胞負荷の再抗原投与前に、抗癌性細胞ワクチンの更に２回のブースター注射を与えた。非ワクチン接種マウスにはまた、生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与したか、又は無処置で維持した。脾臓を、すべてのマウスから摘出し、図２１Ｂに示したように計量し、その後、血液、脾臓、及びリンパ節を加工し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の変化について分析した（図２２）。並行して、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、ＴＥＭ及びＴＣＭ細胞亜集団を同定するために、フローサイトメトリーによって、メモリーＴ細胞分子、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７の存在又は不存在について更に分析した（図２３）。
図２１Ｂの脾臓重量データの分析は、群間に有意差があったことを示した（ｐ＝０．００７）。更なる分析は、Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンをワクチン接種したマウスが、対照、非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．００４）、生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．００２）又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンで処置したマウス（ｐ＝０．００４）より有意に重い脾臓を有したことを確認した。重要なことには、生きた腫瘍細胞を注射した非ワクチン接種マウスは、動物を安楽死させた日に検出したように、腫瘍を発症する唯一のマウスであった。非ワクチン接種、且つ、抗原投与マウスで発症した腫瘍の平均寸法は、６並びに４．５ｍｍであった。腫瘍を発症するように生きたメラノーマ細胞を用いた抗原投与前に、予めワクチン接種したマウスは存在しなかった。
すべての処置群のマウスの脾臓中に生じたＣＤ８＋Ｔ細胞を分析するとき、有意な群間変動を検出した（ｐ＜０．０００１；図２２Ａ）。事後試験は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスから生じる％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、他のすべての投与群と比較したときに、脾臓中に有意に増加したことを示した。同じ観察を、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの血液の中の％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を分析するときに実施した（図２２Ｂ）。比較によって、生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した対照、非ワクチン接種マウス又は非ワクチン接種マウスと比較したときに、低％ＣＤ４＋Ｔ細胞集団をワクチン接種マウスのすべての群のリンパ節で観察した（図２２Ｃ）。
ＴＥＭ集団をＣＤ８＋Ｔ細胞集団の小集団として分析したとき、すべてのワクチン接種マウスからの脾臓及び血液は、対照、非ワクチン接種マウス又は生きた腫瘍細胞用いて抗原投与した非ワクチン接種マウスのいずれかを超える有意に上昇した集団を有する。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの脾臓は、最も高い平均％ＴＥＭ細胞集団を生じ、対照、非ワクチン接種マウス、生きた腫瘍細胞で抗原投与した非ワクチン接種マウス、又はＢ１６−Ｆ１０−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスより有意に大きかった（図２３Ａ）。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの血液はまた、最高の％ＴＥＭ細胞集団を含むこともわかり、そしてそれは、対照、非ワクチン接種マウス、生きた腫瘍細胞（ｐ＜０．０００２２）を用いて抗原投与した非ワクチン接種マウス、又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスのいずれのものより再び有意に大きかった（ｐ＝０．０４９；図２３Ｂ）。ＴＣＭ細胞集団における唯一の違いは、Ｂ１６−Ｆ１０−４／１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスのリンパ節で見出され、その％ＴＣＭ細胞は、対照、非ワクチン接種マウスのリンパ節中のレベルよりわずかに高い（ｐ＝０．００４）（図２３Ｃ）。
大きく上昇した％ＣＤ８＋及びＴＥＭ細胞は、４種類の用量のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β細胞ワクチンで処置し、且つ、生きた腫瘍細胞を用いた抗原投与後に腫瘍なし状態を維持したマウスで生じた。
この項は、図１８に例示した実施例から続き、そしてそれは、（ワクチン接種プロトコール２を使用して）４種類の用量の３種類のワクチン細胞株のいずれかを用いてワクチン接種した多くのマウスが、５×１０５個の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて別々の２回、抗原投与した後に腫瘍を形成しなかったことを示した。よって、マウスは、それらが次に追加の２種類の用量でブーストされ、そして、ワクチンので上げられて、５×１０５個の生きたＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１細胞を用いて再抗原投与される前に、少なくとも１９０日間の腫瘍なし状態を維持した。脾臓を、生きた腫瘍細胞の注射の６日後にワクチン接種及び対照マウスから摘出し、そして、それらの重量を記録した（図２４Ａ）。リンパ球を、次に、脾臓、血液、及びリンパ節から精製し、フローサイトメトリーによって、％ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の任意の違いについて分析した。フローサイトメトリーによってＴＥＭ及びＴＣＭ細胞亜集団を同定するのに使用されるメモリーＴ細胞マーカーの存在又は不存在について、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を更に分析した。
脾臓重量の分析は、処置群と対照マウスとの間に有意差があることを示した（ｐ＝０．００４；図２４Ａ）。ワクチン接種マウスのすべてを、対照、非ワクチン接種マウスに比べて、有意に重い脾臓を有することを確認した。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスが、最も重い平均脾臓重量を有することがわかり、そしてそれは、対照、非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．０００４）又は生きた腫瘍細胞を注射した非ワクチン接種マウスのものより有意に重かった（ｐ＝０．０２４）。
脾臓の中のＣＤ４＋Ｔ細胞集団の有意差を、処置群の間で検出した（ｐ＝０．００１３；図２４Ｂ）。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスが、脾臓中に最低％ＣＤ４＋Ｔ細胞を生じることを示し、そしてそれは、対照（ｐ＝０．００３４）、生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．０００１）、又はＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０２２）のＣＤ４＋値より有意に低かった。更に、すべてのワクチン接種マウスの血液及びリンパ節に生じた％ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、対照、未処置マウス又は生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した非接種のマウスで生じたレベルより低いことがわかった（図２４Ｃ及びＤ）。
対照的に、有意に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、他のすべての群のマウスと比較したときに（ｐ＜０．００２７；図２４ＢとＣ）、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスの脾臓及び血液の両方に生じた。加えて、すべてのワクチン接種マウスのリンパ節に生じる平均％ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照、未処置マウス又は生きた腫瘍細胞を用いて抗原投与した非接種のマウス（図２４Ｄ）のいずれかの値より多かった。
脾臓（ｐ＜０．０００１）、血液（ｐ＜０．０００１）及びリンパ節（ｐ＝０．００２）中のＴＥＭ細胞の分析は、図２５に示したように、処置群間で高度に有意であることを確認した。有意に高い％ＴＥＭ細胞を、対照、未処置マウスと比較して、マウスのワクチン接種した群のすべての脾臓及び血液の中に検出した。しかしながら、％ＴＥＭ細胞の最も有意な増強は、脾臓及び血液中のそれぞれ７５％及び８７％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＥＭ細胞として同定された、マウスの他のすべての群と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからサンプル中に生じた。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスは、それらのリンパ節中に有意に高い％ＴＥＭ細胞を有する唯一の群であり、そして、この集団は、マウスの他のすべての群のリンパ節の％ＴＥＭ細胞集団と比較して、非常に高かった（図２５Ｃ）。
実施例６
Ｂ１６−Ｆ１０−４−１ＢＢＬ−Ｂ７．１−ＩＦＮ−γ／βワクチンを注射したＬＴΑ −／−マウスは、樹状細胞の不在下で、高ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じた
この実施例は、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン細胞の形態で、Ｂ７．１発現メラノーマワクチンへの４−１ＢＢＬにおける封入が、樹状細胞（ＤＣｓ）によって提供される任意の共刺激活性なしに、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を惹起することができるか否か評価する。これは、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンのいずれかで処置したＬＴα−／−マウスの免疫応答を特徴づけすることによって達成される。
ワクチン接種に続いて、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンで処置したＬＴα−／−マウスは、非ワクチン接種マウス（ｐ＝０．００２）及びＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチンで処置したマウス（ｐ＝０．０２２；図２６Ａ）と比較して有意に重い脾臓を有した。高％ＣＤ８＋Ｔ及び低％ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、対照又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスと比較して、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したＬＴα−／−マウスからの脾臓において生じた（図２６Ｂ）。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスはまた、対照マウスと比較して、末梢血中に高い％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を示しもしたが、ぎりぎり有意であった（ｐ＝０．０５７；図２６Ｃ）。
次に、対照及びワクチン接種したＬＴα−／−マウスからの脾臓リンパ球を、ＭＬＣで抗原刺激にかけられた。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したＬＴα−／−マウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＬＣにおいて効果的に増殖し、そして、対照（ｐ＝０．００３）又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウス（ｐ＝０．０４８；図２７Ａ）のいずれかから生じた集団と比較して、％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の有意な増強を示した。それに続いて、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したＬＴα−／−マウス由来のＭＬＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の３９％は、活性化されたと特徴づけられ、そしてそれは、非ワクチン接種動物からのＭＬＣ由来の集団より４倍超高かった（図２７Ｂ）。
ＭＬＣで培養した脾リンパ球を使用したＣＴＬ分析が、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したＬＴα−／−マウス由来のリンパ球が、最も高い割合の細胞死を誘発し、そしてそれは、非ワクチン接種又はＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種ＬＴα−／−マウス（ｐ＜０．００１；図２７Ｃ）からのＣＴＬアッセイより有意に大きいことを確認した。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスからのリンパ球が、対照マウスからリンパ球と比較して、エフェクター細胞集団あたりの溶解単位で５．６３倍の増大を生み出すことができた。
次に、ワクチンを、インビボでＴ細胞応答を刺激するそれらの能力について、ワクチン接種したＬＴα−／−マウスに生きた腫瘍細胞を抗原投与することによって評価した。７５％のＢ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種ＬＴα−／−マウスが６０日間、生きた腫瘍抗原投与を生き残り、６７％のＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスが、合計１３１日間、腫瘍抗原投与を生き残り、その両方が、非ワクチン接種対照マウスより有意に長かった（Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／β及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βそれぞれについてｐ＝０．００１及びｐ＜０．００１；データ未掲載）。次に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種マウスで生じた長命の抗腫瘍性応答を、腫瘍細胞を用いたブースティング及び再抗原投与に続いて特徴づけした。初期脾臓重量及びＴ細胞分析は、脾臓重量及び％脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞集団に関して群間で違いが検出されなかったので、非ワクチン接種マウスと比較して、免疫応答がワクチン接種マウスで変更されなかったことを示唆した（図２８Ａ，Ｂ）。より高い平均％ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ／Ｂ７．１／ＩＦＮ−γ／βワクチン接種したＬＴα−／−マウスの末梢血中に検出したが、しかしながら、この違いは、生きた腫瘍細胞（図２８Ｃ）を注射した非ワクチン接種マウスより有意に高いだけであった。より興味深いことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団をＴＥＭ及びＴＣＭ亜集団に関して評価したとき、４５％の脾臓Ｔ細胞（図２８Ｄ）及び６０％の末梢血Ｔ細胞（図２８Ｅ）がＴＥＭＣＤ８＋Ｔ細胞に分類された。これらの亜集団は、非ワクチン接種マウス及び非ワクチン接種、腫瘍担持マウスと比較して、有意に高く、ワクチン接種が、これまでに遭遇した抗原に対して強力なメモリー応答を引き起こすことができたことを示した。
実施例７
免疫調節性調製物のＢ１６−Ｆ１０細胞表面におけるＨ−２Ｋｂ発現を上方制御するためのＩＦＮ処置の最適化
高レベルのＢ７及び／又は４−１ＢＢＬを発現することに加えて、免疫治療目的のために、細胞がその細胞表面に高レベルのクラスＩＭＨＣ分子Ｈ−２Ｋｂを発現することはまた、抗原性提示の可能性を高めるので有益である。重大なことには、Ｈ−２Ｋｂのレベルは、ＦＩＴＣ結合抗マウスＨ−２Ｋｂ抗体の免疫染色によってフローサイトメトリーを使用して評価されるので、ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βの組み合わせで細胞を処置することによって強化された。
先に記載したように、細胞を、細胞表面でＨ−２Ｋｂの発現レベルを比較する前に、それぞれＩＦＮ単独及び組み合わせ（すなわち、ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−β）で処置した。表１のデータは、ＩＦＮ−γで４４時間、ＩＦＮ−βで２０時間、又はＩＦＮ−βで更に２０時間処置前のＩＦＮ−γで４４時間のプライミングによってＢ１６−Ｆ１０及びＢ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬを処置することの効果を示す。更に長時間のＩＦＮ処置によって、細胞収率及び生存能力が有意に低下することが見出された（データ未掲載）。
ＩＦＮ−γのみ又はＩＦＮ−βのみのいずれかで処置したＢ１６−Ｆ１０細胞は、それぞれ１１及び１０倍、細胞表面のＭＨＣクラスＩ発現を上方制御する。更に、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞もまた、個別の各ＩＦＮでの処置後に上方制御されたＭＨＣクラスＩ発現を示す。しかしながら、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞は、ＩＦＮ−γに対してより高い応答性であり、そして、ＩＦＮ−βに対してより低い応答性であることを示した（表７を参照）。野生型と亜株細胞は、単独の各ＩＦＮに対して異なる応答を示すが、両細胞株は、ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βの両方の組み合わせを投与したとき、ＭＨＣの最も効果的な上方制御を示した。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞における総合的なＭＨＣクラスＩ発現レベルは、アイソタイプ染色細胞上での発現より２８倍多かった。
ＭＨＣクラスＩの発現が、Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞で更に増強され得るか否かを確認するために、高濃度のＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βもまた試験した。図２９は、
Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬソート１細胞を、１０００、２０００又は３０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ単独又はＩＦＮ−βで処置した後に作成したフローサイトメトリー解析からのヒストグラムを示した。Ｂ１６−Ｆ１０／４−１ＢＢＬ細胞で発現されたＨ−２Ｋｂのレベルは、図２９に示したように、高い濃度のＩＦＮ−γ及び／又はＩＦＮ−βで処置した後、更なる変化はまったく示されなかった。そのため、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−βを、すべてのワクチン細胞株を処置するのに使用したと結論づけられた。なぜなら、この組み合わせは、より多くのＩＦＮを使用した場合と同じくらい効果的にＨ−２Ｋｂ発現を相乗的に上方制御するからである。
表７
ＩＦＮ−γ／βを用いた併用処置は、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞株のＨ−２Ｋｂ発現を増強した
実施例８
Ｈ−２Ｋｂ、Ｂ７．１、及び４−１ＢＢＬ同時発現のためのワクチン製剤の分析
ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターの使用は、５６６ｎｍの励起波長及び５７６ｎｍの発光波長を有するＰＣ結合抗体の高能率シグナル検出を可能にした（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器で与えられる５８８ｎｍの青色レーザーと比較して、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターはＰＥを励起するために５６１ｎｍの緑色レーザーを使用するので）。いくつかの細胞表面マーカー分析を、両方の機器で実施し、これをもとに、それらを表８に示したように比較した。
分析した細胞株のすべてが、アイソタイプ染色サンプルと比較したときに、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａの両方を使用して定量されたように、細胞表面のＨ−２Ｋｂの大きな上方制御レベルを示した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析した３種るのワクチン細胞株は、野生型Ｂ１６−Ｆ１０細胞と比較して、同じレベルのＨ−２Ｋｂ発現を有することを示した。比較すると、３種類の免疫調節細胞株は、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して評価すると、野生型Ｂ１６−Ｆ１０細胞と比較して、それらのＨ−２Ｋｂ発現においてより大きい増加倍数を有した。４−１ＢＢＬ及びＢ７．１発現レベルもまた、両方のフローサイトメーターを使用して細胞で分析した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して作成したＢ７．１及び４−１ＢＢＬ発現データはより大きな増加倍数を示し、そしてそれは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａがより高感度なので、蛍光シグナルの検出に関してより高い効率を示すことを改めて示した。
表８
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して検出したＢ１６−Ｆ１０野生型及び亜株のＨ−２Ｋｂ、Ｂ７．１及び４−１ＢＢＬ発現の比較
共刺激分子発現におけるすべての増加倍数値は、アイソタイプ染色サンプルの値に対して示される（すなわち、同じサンプルのバックグラウンドを超える）。
材料と方法
一般的なフローサイトメトリープロトコール
すべての免疫蛍光染色手順において、細胞を洗浄し、そして、１×ＰＢＳ中に２％のＦＣＳを含んだ染色培地中で染色した。染色ステップにおいて、細胞を、ごく普通に、１００μＬの染色培地中に再懸濁し、その後、抗体を添加した。免疫蛍光染色サンプルに加えて、無染色及びアイソタイプ対応サンプルもまた調製し、そして、比較目的で分析した。無染色サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、抗体（Ａｂ）染色サンプルのそれから引き算することによって、以下の方程式を、細胞表面マーカー発現レベルの係数増加について計算するのに使用した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ及びＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアプログラムを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターの両方から生じたデータを分析するのに使用した。
ワクチン細胞の免疫刺激性細胞表面分子の分析
Ｂ１６−Ｆ１０亜株を、細胞表面マーカーＢ７．１及び４−１ＢＢＬを検出するための抗体で染色することによって、トランスフェクション効率を確認した。細胞を、それらの培養器から剥がし、染色培地で洗浄した。細胞上の４−１ＢＢＬの存在を検出するために、ＰＥ結合抗マウス４−１ＢＢＬ抗体を、１００μＬの染色培地中、１×１０６細胞あたり１μｇの濃度にて使用した。細胞上のＢ７．１の存在を検出するために、ＰＥ結合抗マウスＣＤ８０抗体を、１００μＬの染色培地中、１×の１０６細胞あたり０．２μｇの濃度にて使用した。ＰＥ結合ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対応抗体を、アイソタイプ対照として使用するサンプルを染色するために使用した。これらの細胞表面分子の両方の存在を、フローサイトメーターを使用して検出した。４−１ＢＢＬ発現性細胞が実際に機能的、且つ、完全な４−１ＢＢＬ分子を発現しているか否かを確認するために、細胞を組み換えマウス４−１ＢＢ／Ｆｃキメラ一次抗体と一緒にインキュベートした。４−１ＢＢ／Ｆｃキメラは４−１ＢＢＬの受容体である。一次抗体が４−１ＢＢＬに結合したか否かを検出するために、マウス抗原との交差反応性も示したＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的抗体を加え、そして、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析した。ＩＦＮ処置細胞上のＨ−２Ｋｂレベルの上方制御を検出するために、細胞を、１００μＬの染色培地中に１×１０６細胞あたり２．５μｇの濃度にてＦＩＴＣ結合抗マウスＨ−２Ｋｂ Ａｂを用いて染色した。
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、及び出版物の開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書における参考文献の引用は斯かる参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解すべきではない。
本明細書の全体を通じて、その目的は本発明の好ましい実施形態を説明することであって、如何なる一実施形態又は特定の特性の集合に本発明を限定するためのものではない。当業者は、従って、本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施形態に様々な修正及び変更を加え得ることを認めるであろう。斯かる修正及び変更は全て添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
参照文献

Claims (12)

  1. 対象における癌又は腫瘍を治療するための医薬組成物であって、Ｂ７分子、４−１ＢＢ作動薬、並びに動物癌又は腫瘍細胞を含有し、当該細胞が、その抗原提示機能を強化するのに十分な時間及び条件で少なくとも１つの外因性ＩＦＮと接触させたものであり：
    当該Ｂ７分子がＢ７．１分子であり；かつ
    当該４−１ＢＢ作動薬が４−１ＢＢＬ又はその生物活性断片である；
    医薬組成物。
  2. 前記細胞が、前記接触させられた少なくとも１つの外因性ＩＦＮが洗浄によって取り除かれたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記Ｂ７分子が、該細胞表面で発現され、ここで、該分子の少なくとも一部が細胞外環境に晒される、請求項１又は２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  4. 前記Ｂ７分子が可溶形で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記Ｂ７分子が、免疫グロブリン定常領域に融合するか又は別の方法で連結したＢ７分子の細胞外ドメインに相当するポリペプチドを含むキメラタンパク質である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 前記４−１ＢＢ作動薬が、該細胞の表面に発現され、ここで、該作動薬の少なくとも一部が細胞外環境に晒される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記４−１ＢＢ作動薬が、可溶形で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記可溶性４−１ＢＢ作動薬が、免疫グロブリン定常領域に融合するか又は別の方法で連結した４−１ＢＢＬの細胞外ドメインに相当するポリペプチドを含むキメラタンパク質である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記動物細胞が、肺、乳房、子宮、子宮頚部、卵巣、結腸、膵臓、前立腺、精巣、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、網内細胞系、食道、脳、皮膚、及び軟組織から成る群から選択される組織、臓器又は系に由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 対象の抗原提示細胞が、数的に消耗しているか又は低減している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記数的に消耗しているか又は低減している抗原提示細胞が、マクロファージ、樹状細胞、及び／又はＢ細胞である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記対象が免疫抑制療法を受けている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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