KR20240007911A - Cd5-양성 암을 표적화하기 위한 키메라 항원 수용체 - Google Patents

Cd5-양성 암을 표적화하기 위한 키메라 항원 수용체 Download PDF

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엘리자베쓰 슈팔
라페트 바사르
메이 대허
수닐 아카리아
나디마 업레티
코르테스 아나 카렌 누네즈
에밀리 엔슬레이
코스타 데이비드 마르틴
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Abstract

본원 개시내용의 구현예는 특정 가공된 수용체를 갖는 CD5-발현 세포의 표적화와 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, NK 세포는 특정 키메라 항원 수용체 작제물을 사용하여 CD5 항원에 결합하도록 특이적으로 가공된다. 특정 구현예에서, CD5 표적화 CAR을 발현하는 벡터는 또한 특정 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 특정 사이토킨을 발현한다.

Description

CD5-양성 암을 표적화하기 위한 키메라 항원 수용체
[0001] 본 출원은 2021년 4월 14일자로 출원된 미국 가출원 US 63/174,990에 대한 우선권을 주장하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
분야
[0002] 본원의 개시내용은 적어도, 암 의학을 비롯한, 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다.
[0003] 재발성 불응성 환경에서 T 세포 악성종양은 특히 예후가 좋지 않은 혈액학적 악성종양 그룹을 나타내고 새로운 치료요법이 절실히 요구된다. CD5는 다수의 T-세포 악성종양에 존재하는 범-T 세포 표면 마커이다. 이는 또한 맨틀 세포 림프종(MCL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)과 같은 일부 B세포 악성종양에서도 발현된다.1,2 한편, 정상 세포에 의한 CD5 발현은 흉선세포, 말초 T 세포 및 B 림프구의 소수 서브집단으로 제한되고 다른 조혈 세포에서는 발현되지 않는다. 따라서 CD5는 입양 CAR 가공된 세포 치료요법을 위한 훌륭한 표적 항원이다. 그러나 T 세포 기원의 신생물을 표적화하는 CAR-T 세포의 개발은 악성 T 림프구와 정상 T 림프구 둘다에서 대부분의 표적화할 수 있는 항원의 공유된 발현에 의해 인해 방해를 받아 CAR-T 세포 동족살해를 촉진할 수 있다.3 동족살해 문제에도 불구하고 CD5 CAR-T 세포는 성공적으로 개발되었고 예비 보고서에서 T 세포 악성 종양 환자의 전임상 효능4과 임상 안전성 및 임상 효능의 초기 징후를 보여주었다.5 그럼에도 불구하고, 이들의 표면상에 CD5를 발현하지 않는 대체 면역 이펙터 세포를 사용하는 것은 동족살해에 대한 우려를 제거하기 때문에 매력적인 접근법이 될 것이다. NK 세포는 CD5를 표적화하기 위한 CAR 가공을 위한 플랫폼으로서 매력적인 대안인데 그 이유는 이들이 이들의 표면에서 상기 항원을 발현하지 않기 때문이다. CAR 가공용 NK 세포의 또 다른 이점은 T 세포와 달리 동종이계 환경에서 이식편대숙주질환(GVHD)을 일으키지 않아 치료 시점에서 사용될 완전한 기성 세포 제품을 생산하는 잠재력의 길을 열었다는 것이다. 임의의 잠재적인 안전성 문제를 해결하기 위해 CB 유래 NK 세포를 유전학적으로 변형하여 CAR를 발현하고, 이소성으로 IL-15를 생성하여 생체 내 NK 세포 증식과 지속성을 지원하며, 자살 유전자인 유도성 카스파제 9(iC9)를 발현하는 새로운 플랫폼이 개발되었다.6 이들 iC9/CAR19/IL15-NK 세포는 전임상 및 임상 환경에서 B세포 악성 종양에 대한 효능을 입증하였다.6,7 CAR-NK 세포 제품과 관련된 임의의 사이토킨 방출 증후군(CRS), 면역 이펙터 세포 관련 신경독성 증후군(ICANS) 또는 기타 독성은 관찰되지 않았다.7 본원의 개시내용은 상기 치료요법의 임상적 영향력을 광범위하게 하기 위해 CD5를 포함한 다른 암 항원을 표적화하기 위한 CAR-NK 세포 플랫폼의 확장에 관한 것이다.
[0004] 여러 연구는 CAR-T 세포에서 동시 자극 영역 선택이 이들의 기능, 지속성 및 대사 프로필에 영향을 미침을 입증하였다.8-10 CAR-NK 세포 분야에서 임상에서 시험된 첫 번째 작제물은 CAR-T 세포의 디자인으로부터 차용한 T 세포 특이적 동시 자극 도메인인 CD28을 혼입하였다. 다양한 NK 특이적 동시 자극 분자의 기능을 살펴본 전임상 CAR-NK 세포 연구가 일부 있지만, 동시 자극 도메인이 NK 세포의 증식, 전사체 및 단백질체 프로필, 다기능성, 대사 및 적합성에 미치는 영향을 체계적으로 살펴본 연구는 아직 없다. 본원 개시내용에서, NK 세포 생물학을 위해 보다 관련된 일부를 포함하는 동시 자극 도메인, 즉, 사람 NK 세포에서 주요 어댑터 단백질 및 NKG2D의 독점적 신호 전달 중간체인 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10), 다수의 활성화 수용체(예를 들어, NKG2C, NKp44, 활성화 KIR)와 연합하는 중요한 어댑터 분자인 DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 및 항종양 면역에 필수적인 가장 강력한 NK 세포 독성 수용체 중 하나인 NKG2D와 연합하는 중요한 어댑터 분자(예를 들어, NKG2C, NKp44, 활성화 KIR)의 영향을 포괄적으로 연구함에 의해 이를 수행하는 것이 목표였다.11 그 결과는 DAP10 동시 자극 분자를 갖는 CD5 CAR-NK 세포가 다른 동시 자극 분자를 함유한 CD5 CAR-NK 세포에 비해 시험관 및 생체 내에서 훨씬 더 양호하게 수행함을 보여주고, 항종양 활성을 증강시키는 특징과 같은 다기능성, 대사 적합성 및 기억력을 증진시킴을 보여준다. 이들 전임상 데이터를 기준으로 CD5-DAP10-CD3ζ CAR-NK 세포의 안전성과 효능을 평가하는 단계 I/II 임상시험을 준비 중이다.
[0005] 따라서, 본원 개시내용은 특정 구현예에서 CD5 양성 암을 포함하는 암을 표적화하는 사람 NK 세포를 포함한 입양 세포 치료요법을 위한 세포의 유전학적 가공에 관한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
간략한 개요
[0006] 본원 개시내용의 구현예는 CD5(또한 예를 들어, 분화 5 또는 LEU1 또는 T1의 클러스터로서 공지된)를 표적화하는 가공된 세포 수용체와 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, CD5을 표적화하는 가공된 수용체는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드의 형태로 존재하거나 면역 세포를 비롯한 모든 종류의 세포 표면상에 포함된다. 특정 경우에, 세포는 면역 세포이고, 특정 구현예에서 면역 세포는 임의의 공급원으로부터의 NK 세포, NK T 세포, 불변 NKT 세포, 감마 델타 T 세포, 조절 T 세포, B 세포, 대식세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 수지상 세포 및 임의의 공급원의 수지상 세포 등이다. 특정 구현예에서, 제대혈로부터의 재프로그래밍된 NK 세포(CB-NK)는 CD5 분자를 발현하는 암을 표적화하기 위해 포함된다.
[0007] CD5는 만성 림프증식성 장애/림프종, T세포 백혈병(T-ALL), T세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 맨틀 세포 림프종과 같은 일부 B세포 악성 종양을 포함한 다수의 암에서 발현되기 때문에 방법 및 조성물에 대한 표적 항원으로 활용되고 있다. 갑상선암, 간암, 대장암, 자궁경부암뿐만 아니라 흉선암에서도 발현된다.
[0008] 특정 구현예에서, NK 세포 치료요법을 포함하는 본원 개시내용의 입양 세포 치료요법은 암에 재노출되는 경우에도 암 세포를 박멸시키는 데 특히 효과적이다. 따라서, 일부 구현예에서, 개체에서 검출 가능한 암이 없는 경우 본원에 포함된 임의의 세포 치료요법이 개체에게 제공될 수 있다. 특정한 경우, 개체은 일반 집단 보다 보다 높은 위험에 처한 것과 같은 임의의 종류의 암에 걸릴 위험이 있을 수 있다. 일부 경우에, 개체는 암에 대해 하나 이상의 치료를 받았을 수 있고, 본원 개시내용의 세포 치료요법을 투여할 시점에 암이 없는 것으로 간주될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 개체에게 치료학적 유효량의 본원에 포함된 임의의 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 예방하거나 암의 전이를 예방하는 방법이 있다. 투여 단계는 1회 초과로 수행할 수 있다. 1회 초과로 수행하는 경우 1-24시간, 1-7일, 1-4주, 1-12개월 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상의 투여 간격을 포함하여 투여 간격의 적합한 기간일 수 있다.
[0009] CD5-표적화 CAR T 세포의 일부 구현예는 T 세포 악성종양의 치료를 위해 시험되었다. 그러나 CD5는 T 세포 백혈병/림프종뿐만 아니라 정상 T 세포에서도 항시성으로 발현되고, CAR T 세포 치료요법에서 이의 용도는 CAR T 제조 중 동족살해를 방지하기 위해 CD5 유전자의 유전학적 결실을 필요로 한다. 대조적으로, 정상 NK 세포는 CD5를 발현하지 않기 때문에 이들은 동족살해의 대상이 되지 않는다. 따라서, 본원 개시내용의 특정 구현예에서, (제대혈(CB)을 포함하는) NK 세포는 CD5를 발현하는 암을 표적화하기 위해 재프로그래밍된 NK 세포이다. 분원의 개시내용은 사람 CD5 항원을 표적화하는 scFv와 하나 이상의 활성화 신호 전달 엔도도메인의 융합을 포함하는 다수의 새로운 CAR 분자를 포함하고, 일부 경우에 CD3ζ 단독 또는 NKG2D, 41BB, CD28, DAP10 및/또는 DAP12와 같은 동시 자극 또는 어댑터 신호 전달 도메인와 조합하여 혼입하는 것을 포함한다. 특정 경우에, 동종이계 CB­NK 세포는 레트로바이러스로 형질도입되어 CD5 CAR을 발현한다.
[0010] 특정 구현예에서, CD5 CAR 분자를 포함하는 본원 개시내용의 면역 세포는 또한 이들의 생존 및 증식을 지원하는 하나 이상의 단백질을 발현한다. 특정 경우, 면역 세포는 세포의 확장과 지속을 촉진하는 하나 이상의 사이토킨을 발현하도록 가공된다. 특정 경우, 사이토킨은 면역 세포(예를 들어, NK 세포)의 생존과 유지에 도움이 되는 인터류킨 15(IL-15), IL-2, IL-7, IL-12, IL-18 및/또는 IL-21이다. 특정 양상에서, CAR을 암호화하는 벡터는 또한 사이토킨도 암호화하고, 궁극적으로 각각은 별도의 폴리펩타이드로서 생성된다.
[0011] 본원 개시내용의 구현예는 하나 이상의 신호전달 도메인에 이종성으로 융합된 CD5 scFv가 혼입된 다양한 신규하고 특이적인 CAR 작제물 (예를 들어, CD247 (예를 들어, CD3ζ의 세포질 부분 및 CD28, DAP10, DAP12, 및 NKG2D 중 하나 이상을 포함하는)을 포함한다. scFv는 일부 경우에 사람 CD5 항원에 대한 특이성을 갖는 뮤린 또는 사람 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)로부터 유래된 가변 단편의 융합을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 NK 세포의 생존과 유지를 도와주는 사람 IL-1, IL-2, IL-21, IL-12, IL-7, IL-23, 및/또는 IL-18을 생성시키는 유전자를 포함하는, 하나 이상의 사이토킨 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 예로서, 이와같이 변형된 CB-NK 세포는 CAR로부터 별도의 분자로서 생성되는 IL15에 추가하여 하나 이상의 동시 자극 도메인 및 CD3z를 포함하는 CAR에서 CD5 scFv를 암호화하는 벡터를 포함한다.
[0012] 본원 개시내용의 특정 구현예는 수용자 개체에 대해 동종이계이고, 임의의 종류의 CD5-양성 세포를 표적화하고, 또한 IL15, IL-2, IL-21, IL-12, IL-7, IL-23 및/또는 IL-18과 같은 하나 이상의 사이토킨을 발현하도록 형질도입될 수 있거나 형질도입될 수 없는 적어도 NK 세포를 포함하는 기성 (off-the-shelf) 면역 세포의 사용을 가능하게 한다.
[0013] 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 면역 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현은 변형되었고, 예를 들어, 상기 발현은 부분적으로 또는 완전히 발현에서 감소될 수 있다. 변형은 특정 구현예에서 임의의 수단에 의해 수행될 수 있지만, 하나 이상의 유전자의 발현은 예를 들어, 발현 수준이 감소됨에 의해 변형되었고, 이것은 CRISPR 또는 임의의 다른 유전자 편집 기술을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 수행할 수 있다. 단지 예로서, 내인성 유전자는 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, CTLA-4, TDAG8, CD38, CREM 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
[0014] 하나의 구현예에서, CD5-특이적 가공된 수용체를 암호화하고, 하기 중 하나 또는 둘다를 임의로 암호화하는 서열을 포함하는 발현 작제물이 있다: (a) 자살 유전자; 및 (b) 사이토킨. 특정 경우에, CD5-특이적 가공된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체이다. CD5-특이적 CAR은 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 갖는 scFv를 포함할 수 있고 여기서 CAR을 암호화하는 서열 내의 중쇄는 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 업스트림에 있다. 다른 경우에, CD5-특이적 CAR은 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 포함하고, 여기서 CAR을 암호화하는 서열 내의 중쇄는 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 다운스트림에 있다. 본원의 임의의 경우에서, CD5-특이적 CAR은 코돈 최적화된 scFv를 포함하거나 포함하지 않는다. 본원의 임의의 경우에서, CD5-특이적 CAR은 사람화된 scFv를 포함하거나 포함하지 않는다. 본원의 임의의 경우에, CD5-특이적 CAR은 신호전달 펩타이드, 예를 들어, CD8알파, Ig 중쇄, 또는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체로부터의 것 또는 하나 이상의 다른 표면 수용체로부터 유래된 신호 펩타이드를 포함하거나 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, CD5-특이적 CAR은 하나 이상의 동시 자극 도메인, 예를 들어, CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12, 4-1BB (CD137), CD40L, 2B4, DNAM, CS1, CD48, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, ICOS 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 동시 자극 도메인을 포함한다.
[0015] 임의의 CD5-특이적 CAR은 CD3제타 및/또는 scFv와 막관통 도메인 사이에 힌지를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 경우에, 힌지는 CD8-알파 힌지이고, 상기 힌지는 Gly3로 구성된 인공 스페이서를 포함하거나, 상기 힌지는 IgG의 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, IL-21, IL-7, 또는 이의 조합이다. 자살 유전자가 사용되는 경우, 자살 유전자는 돌연변이체 TNF-알파(예를 들어, 가공된 분비될 수 없는 돌연변이체), 유도성 카스파제 9, HSV-티미딘 키나제, CD19, CD20, CD52 또는 EGFRv3일 수 있다.
[0016] 본원 개시내용의 구현예는 본원에 포함된 임의의 발현을 포함하는 임의의 종류의 면역 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, MSC, 수지상 세포 또는 이의 혼합물이다. 면역 세포가 NK 세포인 경우, NK 세포는 제대혈(풀링된 제대혈 유닛을 포함하는), 말초혈액, 유도만능 줄기 세포, 골수로부터, 또는 세포주로부터 유래될 수 있다. 특정 양상에서, NK 세포주는 NK-92 세포주 또는 종양으로부터 또는 건강한 NK 세포 또는 전구체 세포로부터 유래된 또 다른 NK 세포주이다.
[0017] 특정 구현예에서, 면역 세포는 제대혈 단핵 세포와 같은, 제대혈로부터 유래된 것과 같은 NK 세포이다. NK 세포는 특정 경우에 CD56+ NK 세포일 수 있다. NK 세포는 하나 이상의 외인성으로 제공된 사이토킨, 예를 들어, IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, IL-7, 또는 이의 조합을 발현할 수 있다. 특정 구현예는 본원 개시내용의 임의의 종류의 면역 세포 집단을 포함하고, 상기 세포는 임의의 종류의 적합한 배지 또는 적합한 담체에 존재할 수 있다.
[0018] 하나의 구현예에서, 본원 개시내용에 포함되는 임의의 발현 작제물을 보유하는 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 CD5-양성 세포를 사멸시키는 방법이 있다. 특정 구현예에서, 세포는 NK 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, 감마 델타 T 세포 또는 수지상 세포이다. NK 세포는 제대혈, 말초혈액, 유도만능 줄기 세포, 골수로부터, 또는 세포주로부터 유래될 수 있다. NK 세포는 제대혈 단핵 세포로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에, CD5 양성 세포는 조혈암이나 고형 종양을 포함한 암세포이다. 세포는 사람일 수도 있고 아닐 수도 있는 개체와 관련하여 동종이계 또는 자가일 수 있다. 세포는 주사, 정맥내, 동맥내, 복막내, 기관내, 흉막내, 종양내, 근육내, 내시경적으로, 병변내, 두개내, 경피, 피하, 국소적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합에 의해 개체에게 투여될 수 있다.
[0019] 상기 방법의 특정 구현예에서, 세포는 1회 이상 개체에게 투여될 수 있다. 세포의 개체로의 투여 간의 지속 시간은 1-24 시간, 1-7 시간, 1-4 주, 1-12 개월 또는 1년 이상일 수 있다. 상기 방법은 수술, 방사선 조사, 유전자 치료요법, 면역치료요법 및/또는 호르몬 치료요법과 같은 추가의 치료요법의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가의 치료요법은 일부 경우에 하나 이상의 항체 또는 항체 기반 제제를 포함할 수 있다. 상기 방법의 일부 양상에서, 이들은 추가로 개체에서 CD5-양성 세포를 동정하는 단계를 포함할 수 있다.
[0020] 본원 개시내용의 구현예는 CD5 특이적 가공된 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 작제물을 포함하고, 여기서 상기 수용체는 다음 중 하나를 포함한다: (a) CD28 막관통 도메인(TM) 및 CD28 세포질 내 도메인(ICD); (b) CD28 TM, CD28 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (c) CD28 TM 및 DAP12 ICD; (d) CD28 TM, DAP12 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (e) DAP12 TM 및 DAP12 ICD; (f) DAP12 TM, DAP12 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (g) CD28 TM 및 4-1BB ICD; (h) CD28 TM, CD28 ICD 및 4-1BB ICD; (i) CD28 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (j) CD28 TM 및 DAP10 ICD; (k) CD28TM, DAP10 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (l) DAP10 TM 및 DAP10 ICD; (m) DAP10 TM, DAP10 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (n) NKG2D ICD; (o) NKG2D TM; (p) NKG2D TM 및 NKG2D ICD; (q) NKG2D TM, NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (r) CD28 TM 및 NKG2D ICD; (s) NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (t) CD28 TM, NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (u) 4-1BB TM 및 4-1BB ICD; (v) 동시 자극 도메인인 ICD가 없는 경우의 CD28TM 및 CD3제타; (w) CD8 TM 및 CD28 세포질내 도메인(ICD); (x) CD8 TM, CD28 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (y) CD8 TM 및 DAP12 ICD; (z) CD8 TM, DAP12 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (aa) CD8 TM 및 DAP12 ICD; (bb) CD8 TM, DAP12 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (cc) CD8 TM 및 4-1BB ICD; (dd) CD8 TM, CD28 ICD 및 4-1BB ICD; (ee) CD8 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (ff) CD8 TM 및 DAP10 ICD; (gg) CD8 TM, DAP10 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (hh) CD8 TM 및 DAP10 ICD; (ii) CD8 TM, DAP10 ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (jj) CD8 ICD; (kk) CD8 TM; (ll) CD8 TM 및 NKG2D ICD; (mm) CD8 TM, NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (nn) CD8 TM 및 NKG2D ICD; (oo) CD8, NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (pp) CD8 TM, NKG2D ICD 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (qq) CD8 TM 및 4-1BB ICD; 또는 (rr) 동시 자극 도메인인 ICD가 없는 경우 CD8TM 및 CD3제타. 일부 경우에, CD5-특이적 가공된 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체이다. CD5 특이적 가공된 수용체가 CAR인 경우, CAR은 CD5에 대한 scFv 또는 리간드인 CD 표적화 세포 외 도메인을 포함할 수 있다. CD5-특이적 CAR은 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 갖는 scFv를 포함할 수 있고 여기서 CAR을 암호화하는 서열 내의 중쇄는 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 업스트림에 있다. CD5-특이적 CAR은 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 갖는 scFv를 포함할 수 있고 여기서 CAR을 암호화하는 서열 내의 중쇄는 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 다운스트림에 있다. 특정 경우, CD5 특이적 CAR은 코돈 최적화된 scFv를 포함하거나 사람화된 scFv를 포함한다. scFv는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 의해 암호화될 수 있다. scFv는 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함할 수 있다.
[0021] 특정 구현예에서, CD5-특이적 CAR은 신호 전달 펩타이드, 예를 들어, CD8알파, Ig 중쇄, 또는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체로부터의 것 또는 하나 이상의 다른 표면 수용체로부터 유래된 신호 펩타이드를 포함한다.
[0022] CD5-특이적 CAR의 일부 구현예에서, TM은 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 의해 암호화되어 있다. Tm은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14를 포함할 수 있다. 특정 ICD가 활용되는 경우, 이것은 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19 또는 서열번호 21에 의해 암호화될 수 있다. ICD는 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 또는 서열번호 22를 포함할 수 있다. 특정 경우에, CD5-특이적 CAR은 CD27, OX-40 (CD134), CD40L, 2B4, DNAM, CS1, CD48, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, ICOS, 또는 이의 조합으로부터의 ICD를 포함한다.
[0023] 특정 구현예에서, CD5-특이적 가공된 수용체는 CD5-특이적 scFv와 막관통 도메인 사이의 힌지를 포함하는 CD5-특이적 CAR이다. 힌지는 IgG 힌지(예를 들어, IgG1 힌지, IgG2 힌지, IgG3 힌지 또는 IgG4 힌지, CD28 힌지, CD8-알파 힌지)일 수 있고, 상기 힌지는 Gly3으로 구성된 인공 스페이서를 포함하거나, 힌지는 IgG의 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 힌지는 서열번호 23 또는 25에 의해 암호화될 수 있거나, 서열번호 24 또는 서열번호 26을 포함할 수 있다.
[0024] 발현 작제물은 CD5 특이적 가공된 수용체 이외의 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 이는 2A 요소(예를 들어, E2A, 서열 번호 31에 의해 암호화된 것 또는 서열 번호 32를 포함하는 것을 포함) 또는 IRES 요소에 의해 작제물 상에서 분리될 수 있다. 관심 대상의 폴리펩타이드는 치료학적 단백질 또는 세포 활성, 확장 및/또는 지속성을 증진시키는 단백질일 수 있다. 관심 대상의 폴리펩타이드는 자살 유전자(예를 들어, 비분비성 돌연변이체 TNF-알파, 유도성 카스파제 9, HSV-티미딘 키나제, CD19, CD20, CD52 또는 EGFRv3), 사이토킨, 증식, 확장 및/또는 대사 적합성을 증진시키는 사람 또는 바이러스 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 작제물은 CD5-특이적 CAR에 추가로 하나 이상의 사이토킨을 암호화하고, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, IL-21, IL-23, IL-7 또는 이들의 조합일 수 있다. IL-15가 활용되는 경우, 이것은 서열번호 29에 의해 암호화될 수 있거나 서열번호 30을 포함한다.
[0025] 특정 경우, 발현 작제물은 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 또는 서열번호 47에 의해 암호화된 CD5-특이적 CAR을 암호화한다. CD5-특이적 가공된 수용체는 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46 또는 서열번호 48을 포함하는 CAR일 수 있다.
[0026] 구현예는 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터) 또는 비바이러스 벡터(플라스미드, 리포좀, 나노입자, 지질, 탄수화물 또는 이들의 조합)를 포함하는 본원에 포함되는 임의의 발현 작제물을 포함하는 임의의 벡터를 포함한다. 구현예는 또한 본원 개시내용의 발현 박제물을 포함하는 임의의 면역 세포를 포함하고 면역 세포는 천연 킬러(NK) 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, MSC, 또는 수지상 세포일 수 있다. 면역 세포가 NK 세포인 경우, 이는 제대혈, 말초혈액, 유도만능 줄기 세포, 골수로부터, 또는 세포주로부터 유래될 수 있다. NK 세포주는 NK-92 세포주 또는 종양으로부터 또는 건강한 NK 세포 또는 전구 세포로부터 유래된 또 다른 NK 세포일 수 있다. 특정 경우에, NK 세포는 제대혈 단핵 세포로부터 유래된다. NK 세포는 CD56+ NK 세포일 수 있다. NK 세포는 IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, IL-7, 또는 이의 조합을 포함하는, 하나 이상의 외인성으로 제공된 사이토킨을 발현할 수 있다. 면역 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자는 CRISPR을 사용함을 포함하는 발현이 부분적으로 또는 완전히 감소하는것과 같은 변형된 발현일 수 있다. 내인성 유전자는 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, CTLA-4, TDAG8, CD38, CREM 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
[0027] 본원 개시내용의 구현예는 본원에 기재된 면역 세포 집단을 포함하고, 상기 세포는 적합한 배지에 존재한다. 집단은 냉동 상태를 포함하여 저장 시설에 보관할 수 있고, 배지는 하나 이상의 동결 보호제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포 집단은 CAR 및 IL-15를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 NK 세포이다. CAR 및 IL-15는 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 또는 서열번호 47에 의해 암호화될 수 있고, 이들은 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 또는 서열번호 48에 포함될 수 있다.
[0028] 본원 개시내용의 구현예는 개체에서 CD5 양성 암을 갖는 것과 같은 CD5 양성 세포를 사멸시키는 방법을 포함하고, 본원에 포함되는 임의의 발현 작제물을 보유한 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 세포는 NK 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, 감마 델타 T 세포, 수지상 세포 또는 이의 혼합물과 같은 면역 세포일 수 있다. NK 세포는 제대혈, 제대혈 단핵 세포, 말초 혈액, 유도 만능 줄기 세포, 골수, 세포주 또는 이들의 혼합물로부터 유래할 수 있다. 세포는 개체에 대해 동종이계 또는 동계일 수 있다. 개체는 사람과 같은 포유류일 수 있다. 세포는 개체에게 1회 초과로 투여될 수 있다. 세포의 개체로의 투여 간의 지속 시간은 1-24 시간, 1-7 일, 1-4 주, 1-12 개월 또는 1년 이상일 수 있다. 임의의 치료 방법은 수술, 방사선 조사, 유전자 치료요법, 면역치료요법 (하나 이상의 항체를 포함하는), 또는 호르몬 치료요법과 같은 추가의 치료요법의 유효량을 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포는 주사, 정맥내, 동맥내, 복막내, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경적으로, 병변내, 두개내, 경피, 피하, 국소적으로, 전신적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 상기 방법은 개체에서 CD5 양성 암을 동정하고/하거나 발현 작제물을 보유한 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
[0029] 본 발명의 하나의 구현예와 관련하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 구현예에 적용될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 추가로, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 임의의 조성물을 생성하거나 사용할 수 있다. 실시예에 제시된 구현예의 양상은 또한 상이한 실시예에서 다른 곳 및 본원의 다른 곳, 예를 들어, 발명의 개요, 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면의 간단한 설명에서 논의된 구현예와 관련하여 수행될 수 있는 구현예이다.
[0030] 상기한 내용은, 후술하는 본 발명의 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 본 발명의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 개략적으로 기재하였다. 본원의 청구항들의 주제를 형성하는 추가적인 특징 및 이점이 이하에서 기재될 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 개시되는 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명의 디자인과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형 또는 디자인하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자는, 이러한 균등한 구성이 첨부된 청구항들에 제시된 바와 같은 취지 및 범위를 벗어나지 않는다는 것을 이해해야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께 그 구성 및 조작 방법 모두에 대하여 본 발명의 특징인 것으로 간주되는 신규한 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기의 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 각 도면은 예시 및 설명의 목적으로 만 제공되며 본원 개시내용의 범위의 정의로서 의도되지 않는다는 것을 명백하게 이해해야 한다.
[0031] 본원 개시내용을 보다 완전하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부된 도면과 관련하여 주어진 하기 설명을 참조한다.
[0032] 도 1a-1h. 제대혈 NK 세포에는 CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CAR 작제물이 성공적으로 형질도입될 수 있고, CD5+ 종양 세포를 표적화할 수 있지만 생체 내에서 장기적인 치유를 유도하지 못한다. 1a. CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CAR 작제물의 맵. 1b. CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CAR 작제물이 형질도입된 NK 세포의 형질도입 효율을 비형질도입된 (NT) NK 세포와 비교한 것을 보여주는 막대 그래프(좌측에서 우측으로 막대는 형질도입되지 않은 세포, CD5CAR 41BB-CD3z가 있는 세포, CD5CAR CD28-CD3z가 있는 세포를 나타냄). 1c. CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CAR-NK세포의 배수 변화 확장을 NT NK 세포와 비교한 것을 보여주는 그래프로서, 여기서 0일은 형질도입 일을 지적한다. 1d. CD5+CCRF-CEM 종양과 6시간 동안 공동 배양한 후 NT NK 세포와 비교한 CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CAR-NK 세포의 사이토킨 생산(IFNg, TNFa) 및 탈과립화(CD107a) 퍼센트를 보여주는 막대 그래프(좌측에서 우측으로, 막대는 형질도입되지 않은 세포, CD5CAR 41BB-CD3z가 있는 세포, CD5CAR CD28-CD3z가 있는 세포를 나타낸다). 1e. CD5-CD28-CD3ζ 또는 CD5-41BB-CD3ζ CAR-NK 세포 또는 NT NK 세포와 4시간 동안 공동 배양한 후 CD5+ CCRF-CEM의 용해 퍼센트를 보여주는 그래프(NT는 바닥에 있고, CD5CAR CD28-CD3z는 상부에 있다). 1f. 반딧불이루시퍼라제(Ffluc)가 형질도입된 CD5+ CCRF-CEM 종양이 생착된 마우스에서 치료하지 않거나 NT NK 세포 또는 CD5-CD28-CD3ζ 또는 CD5-41BB-CD3ζ CAR-NK 세포로 치료한 후 시간 경과에 따른 종양 성장을 보여주는 생발광 이미지화(BLI). 1g. 1f 패널에 나타낸 상이한 마우스 그룹을 비교한 BLI 데이터의 평균 방사휘도를 플롯팅하는 그래프(CCRF-CEM 단독은 좌측에 있고, CCRF-CEM+CD5CAR CD28-CD3z는 우측에 있다). 1h 1f 패널에 나타낸 상이한 마우스 그룹의 생존 곡선을 보여주는 그래프(CCRF-CEM 단독은 좌측에 있고, CCRF-CEM+CD5CAR CD28-CD3z는 우측에 있다).
[0033] 도 2a-2e. NK 세포 생물학과 관련된 동시 자극 분자를 혼입함에 의한 CD5 CAR 작제물 디자인의 최적화. 2a. 상이한 막관통 도메인 및 동시 자극 도메인을 갖는 다양한 CD5 CAR 작제물의 맵. 2b. 다양한 CD5 CAR 작제물이 형질도입된 NK 세포의 형질도입 효율을 형질도입되지 않은 (NT) NK 세포와 비교한 것을 보여주는 막대 그래프. 2c. 다양한 CD5 CAR-NK 세포 생성물의 확장(시간 경과에 따른 수백만 개의 세포 수)을 NT NK 세포와 비교한 그래프로, 여기서 0일은 형질 도입된 일을 나타낸다. 2d. CD5+CCRF-CEM 종양과 6시간 동안 공동 배양한 후 NT NK 세포와 비교한 다양한 CD5 CAR-NK 세포의 사이토킨 생산(IFNg, TNFa) 및 탈과립화(CD107a)의 퍼센트를 보여주는 막대 그래프. 2e. 다양한 CD5 CAR-NK 세포 또는 NT NK 세포와 4시간 동안 공동 배양한 후 CD5+ CCRF-CEM의 용해 퍼센트를 보여주는 그래프.
[0034] 도 3a-3e. DAP10 동시 자극 도메인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포는 CD28 또는 DAP12 동시 자극 도메인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포에 비해 종양 제어 능력을 크게 개선시킨다. 3a. 반딧불이루시퍼라제(Ffluc)가 형질도입된 CD5+ CCRF-CEM 종양이 생착된 마우스에서 치료하지 않거나 NT NK 세포 또는 CD5-CD28-CD3ζ 또는 CD5--DAP12-CD3ζ 또는 CD5-DAP10-CD3ζ CAR-NK 세포로 치료한 시간 경과에 따른 종양 성장을 보여주는 생발광 이미지화(BLI). 3b. 3a 패널에 나타낸 여러 마우스 그룹을 비교한 BLI 데이터의 평균 방사휘도를 플롯팅하는 그래프로, 각 마우스로부터의 데이터는 동일한 그룹에 속하는 마우스를 다른 색상으로 표지화하여 개별적으로 플롯팅한다(높은 CD5 CCRF-CEM 단독은 좌측으로의 선이고, CCRF-CEM +CD5 CAR CD28CD3z는 우측으로의 선이다). 3c. 3a 패널에 나타낸 상이한 마우스 구룹의 생존 곡선을 보여주는 그래프. 3d. 패널 3a에 기재된 다양한 그룹에서 마우스의 체중을 보여주는 그래프로, 각 마우스로부터의 데이터는 상이한 색상으로 표지화된 동일한 그룹에 속하는 마우스와 별도로 플롯팅한다(NT는 좌측으로의 세로선이고, CCRF-CEM +CD5 CAR CD28CD3z는 우측으로의 세로선이고, CCRF-CEM +CD5 CAR DAP10CD3z는 약 40일 후 상부에 있는 수평선이다). 3e. DAP10-CD3z 신호 전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 CD5 발현이 낮은 경우에도 T-ALL 세포주에 대해 우수한 활성을 보여준다. CD5 발현이 낮은 CCRF-CEM 종양을 생착시킨 후 치료하지 않거나 형질도입되지 않은(NT) NK 세포 또는 다양한 디자인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포(CD5-41BB-CD3ζ, CD5-DAP12-CD3ζ, CD5-CD28-CD3ζ, CD5-DAP10-CD3ζ)로 치료한 다양한 마우스 그룹의 생존 곡선을 보여주는 그래프(낮은 CD5 CRF 단독은 가장 좌측으로의 세로선이고; 낮은 CD5 CCRF-CEM +CD5CAR DAP10-Cd3z는 상부에서 수평선, 낮은 CD5 CCRF-CEM _CD5CAR CD28-Cd3z는 약 60% 생존에서 가장 우측 말단의 짧은 세로선).
[0035] 도 4a-4b. DAP10 신호 전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 CD5+ 맨틀 세포 림프종의 PDX 마우스 모델에서의 결과를 개선시킨다. 4a. 마우스 실험 계획의 개략도로서, 0일차에 마우스에 PDX 세포주를 피하 주사하고, 21일차에 마우스에 꼬리 정맥을 통해 DAP10 동시 자극이 적용된 CD5-DAP10-CD3z CD5 CAR-NK 세포를 주사한 후 60일차에 마우스를 희생시키고 유동세포측정으로 조직을 분석하였다. 4b. 치료를 받지 않았거나 DAP10 동시 자극을 사용한 CD5 CAR로 치료한 마우스의 피하 종양, 비장 및 골수에서 CD45+CD5+ 종양 세포의 절대 수를 보여주는 막대 그래프(종양 단독은 좌측으로의 막대이다).
[0036] 도 5a-5c. DAP10-CD3z 신호 전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 단백질체 수준 상에서 증진된 활성화 프로필을 보여준다. 5a. 함께 조합된 Nt와 CD5 CAR-NK 세포로부터의 다양한 클러스터를 보여주는 TSNE 플롯. 5b. DAP10 동시 자극을 사용한 형질도입되지 않은 (NT) NK 세포 및 CD5 CAR-NK 세포에서 클러스터를 보여주는 TSNE 플롯. 클로스터 8 및 11은 DAP10 동시 자극과 함께 CD5 CAR-NK 세포에 특이적인 것으로 보인다. 5c. X축상의 다양한 NK 세포의 다양한 마커 및 Y축 상에 다양한 클러스터를 보여주는 히트맵. 이것은 DAP10 동시 자극을 사용한 CD5 CAR-NK 세포에 특이적인 클러스터 8과 11이 NK 세포 활성화 마커(DNAM, NKG2D, CD69, 성숙화 마커(EOMES 및 T-BET) 및 세포 독성 마커(Perforin, Granzyme B, TRAIL)가 풍부함을 보여준다.
[0037] 도 6a-6d. DAP10 동시 자극 도메인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포는 증진된 다기능성 및 대사 적합성을 입증한다. 6a. CD5+ 항원으로 자극한 후 형질도입되지 않은 (NT), 또는 CD5 CAR-NK 세포(동시 자극이 없는(CD3z 단독)) 또는 다양한 동시 자극 도메인으로 형질전환된 NK 세포의 다기능성을 보여주는 막대 그래프로, 이것은 항원 자극에 반응하여 단일 세포 수준에서 2, 3, 4 또는 5+ 단백질을 생성하는 NK 세포의 퍼센트를 보여준다. 6b. 단일 세포 수준에서 사이토킨의 생성을 보여주는 다기능성 히트맵. 각 행은 NK 세포 상태를 나타내고, 각 열은 특정 사이토킨 세트를 생성하는 NK 세포의 클러스터를 나타내고, 클러스터가 많을수록 NK 세포의 다기능성이 보다 높다. 6c. 단일 세포 수준에서 이펙터, 자극성 또는 화학 유인성 사이토킨을 생성하는 NK 세포(NT 또는 다양한 CD5 CAR-NK 세포 디자인)의 비율을 보여주는 다기능성 강도 지수를 나타내는 막대 그래프(화학 유인성 스코어링은 막대 상부에, 이펙터 스코어링은 막대의 하부에 나타냄). 6d. 다양한 CD5 CAR-NK 세포 작제물로 형질도입된 NT NK 세포 또는 NK 세포의 산소 소비율(OCR)을 보여주는 그래프. 이는 DAP10 동시 자극 도메인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포가 미토콘드리아 활성 및 대사 적합성의 척도인 OCR이 가장 높다는 것을 보여준다.
[0038] 도 7a-7c. DAP10-CD3z 신호 전달 도메인을 가진 CD5 CAR-NK 세포는 기억과 유사한 특징을 나타내고 다수의 종양 재챌린지 후에도 CD5+ CCRF-CEM을 계속 사멸시킨다. 7a. 다수의 CD5+ CCRF-CEM 종양 재챌린지를 사용한 Incucyte 실시간 세포 독성 검정에 대한 실험 계획을 자세히 설명하는 개략도. 종양 세포를 적색 염료로 표지화하여 실시간 이미지화로 추적한다. 7b. 생존 종양 세포의 부담과 상관관계가 있는 시간 경과에 따른 적색 수를 보여주는 그래프. 이는 처음에는 모든 NK 세포, 심지어 형질도입되지 않은(NT) NK 세포가 CD5+CCRF-CEM 종양을 사멸시킬 수 있고, 다수의 종양 재챌린지 후 시간 경과에 따라 DAP10 동시 자극과 함께 CD5 CAR-NK 세포만이 종양을 제어할 수 있음을 보여준다. CD19 CAR-NK 세포 및 CD19/IL-15 CAR-NK 세포를 관련 없는 CAR 대조군으로 사용하였다. 7c. 생존 종양 세포의 부담과 상관관계가 있는 시간 경과에 따른 세포 컨플루언스(%)를 보여주는 그래프. 이는 처음에는 모든 NK 세포, 심지어 형질도입되지 않은(NT) NK 세포가 CD5+CCRF-CEM 종양을 사멸시킬 수 있고, 다수의 종양 재챌린지 후 시간 경과에 따라 DAP10 동시 자극과 함께 CD5 CAR-NK 세포만이 종양을 제어할 수 있음을 보여준다.
[0039] 도 8a-8b. CD5 CAR-NK 세포는 생체 내에서 종양 재챌린지에 대한 리콜을 지속하고 수행할 수 있다. 8a. 방사선 조사 시기, CD5+ CCRF-CEM 종양 주사 시기, CD5 CAR-NK 세포 주입 시기 및 CD5+ CCRF-CEM 종양(GFP가 형질도입된)에 대한 재챌린지 시기를 보여주는 생체 내 마우스 모델의 실험 계획의 세부 사항을 보여주는 개략도. 8b. 재챌린지 전(좌측 패널) 및 재챌린지 후 유동세포 측정 데이터(우측 패널)를 보여주는 FACS 플롯으로, 사람 CD45+ 게이트와 NK 세포 게이트(CD56+ 및 GFP-)를 보여준다. 이는 CD5 CAR-NK 세포가 종양 재챌린지 후 확대되어 CD5+CCRF-CEM 종양에 대한 리콜 반응을 일으킬 수 있음을 보여준다.
[0040] 본원 개시내용의 다양한 구현예를 나타내고 본원에 기재하였지만, 상기 구현예가 단지 예시로 제공됨은 당업자에게 자명하다. 많은 변형, 변화 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나는 것 없이 당업자에게 고려된다. 본원에 기재된 개시내용의 구현예에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.
1. 정의의 예시
[0041] 오랫동안 유지되어 온 특허법 협약에 따라, 청구항을 비롯하여 본 명세서에서 단어 "포함하는"과 협력하여 사용될 때의 단수 형태의 단어는 "하나 이상"을 의미한다. 본원 개시내용의 일부 구현예는 본원 개시내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실시될 수 있고, 상이한 구현예가 조합될 수 있는 것으로 고려된다.
[0042] 본원 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 경우, “포함한다(comprise)”, “포함한다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”이라는 용어는 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. “로 이루어진”은 “로 이루어진”에 이어지는 무엇이든 포함하지만 이에 제한됨을 의미한다. 따라서, 용어 “로 이루어진”은 열거된 요소들이 요구되거나 의무적이고 어떠한 다른 요소들이 존재하지 않을 수 있음을 지적한다. “필수적으로 이루어진”은 용어 후 열거되고 열거된 요소들에 대해 본원 개시내용에 특정된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된 임의의 요소를 포함함을 의미한다. 따라서, 용어 “필수적으로 이루어진”은 열거된 요소들이 요구되거나 의무적이지만 어떠한 다른 요소들은 임의의적이지 않고 열거된 요소들의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 미치지 않은지의 여부에 의존하여 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 지적한다.
[0043] 본원 명세서 전반에 걸쳐 “하나의 구현예”, “구현예”, “특정 구현예”, “관련 구현예”, “특정 구현예”, “추가의 구현예” 또는 “추가의 구현예” 또는 이의 조합에 대한 언급은 상기 구현예와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본원 개시내용의 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본원 명세서의 다양한 위치에서 이전의 문장의 출현은 모두 동일한 구현예를 필수적으로 언급하지는 않는다. 추가로, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
[0044] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “또는” 및 “및/또는”을 사용하여 조합하여 또는 서로 배타적으로 다수의 성분들을 기재한다. 예를 들어, “x, y, 및/또는 z”는 “x” 단독, “y” 단독, “z” 단독, “x, y, 및 z,” “(x 및 y) 또는 z,” “x 또는 (y 및 z),” 또는 “x 또는 y 또는 z”을 언급할 수 있다. 이것은 구체적으로 x, y, 또는 z가 하나의 구현예로부터 배제될 수 있는 것으로 고려된다.
[0045] 본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 명시하기 위해 세포 및 분자 생물학 분야에서 이의 명백하고 통상적인 의미에 따라 사용된다.
[0046] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “가공된”은 세포, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 등을 포함하는, 사람의 손에 의해 생성된 실체를 언급한다. 적어도 일부 경우에, 가공된 실체는 합성이고 천연적으로 존재하지 않거나 본원의 개시내용에 사용되는 방식으로 구성되지 않는 요소를 포함한다.
[0047]본원에 사용된 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다. 하나의 양상에서, "단리된"이라는 용어는 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 기관 또는 각각 천연 공급원에 존재하는 것과 같은 조직 또는 기관으로부터 분리된 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 기관, 또는 조직 또는 기관을 지칭한다. 용어 “단리된”이란 또한 재조합 DNA 기술로 제조될 때 세포 물질, 바이러스 물질 및 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩타이드를 지칭한다. 더욱이, “단리된 핵산”은 단편으로서 자연적으로 존재하지 않고 천연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것으로 의미된다. 용어 “단리된”은 또한 본원에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용되고, 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘다를 포괄하는 것으로 의미된다. 용어 “단리된”은 또한 본원에서 다른 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 사용되고, 배양되고 가공된 세포 또는 조직 둘다를 포괄하는 것으로 의미된다.
[0048] 본원에 사용된 "예방한다" 및 "예방된", "예방하는" 등과 같은 유사한 용어는 질환 또는 병태, 예를 들어, 암의 발생 또는 재발 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 또한 질환 또는 병태의 발병 또는 재발을 지연시키거나 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 “예방” 및 유사 용어는 또한 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부하를 감소시킴을 포함한다.
[0049] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “샘플”은 일반적으로 생물학적 샘플을 지칭한다. 샘플은 개체로부터의 조직 또는 세포로부터 취득될 수 있다. 일부 예에서, 샘플은 조직 생검, 혈액(예를 들어, 전혈), 혈장, 세포외 유체, 건조된 혈반, 배양된 세포, 폐기된 조직을 포함할 수 있거나, 이들로부터 유래될 수 있다. 샘플은 수거 전에 공급원으로부터 단리될 수 있다. 비제한적인 예는 혈액, 뇌척수액, 흉막액, 양수, 림프액, 타액, 소변, 대변, 눈물, 땀 또는 점막 배설물, 및 수집 전에 1차 공급원으로부터 분리된 기타 체액을 포함한다. 일부 예에서, 샘플은 샘플 제조 동안 이의 1차 공급원(세포, 조직, 혈액과 같은 체액, 환경 샘플 등)으로부터 단리된다. 샘플은 이의 1차 공급원으로부터 정제되거나 농축될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 경우에, 1차 공급원은 추가 처리 전에 균질화된다. 샘플은 여과하거나 원심분리하여 버피코트, 지질 또는 미립자 물질을 제거할 수 있다. 샘플은 또한 핵산에 대해 정제되거나 농축될 수 있거나 RNase로 처리될 수 있다. 샘플은 온전하거나, 단편화되거나 부분적으로 분해된 조직 또는 세포를 함유할 수 있다.
[0050] 본원에 사용된 용어 "대상체"는 일반적으로 처리 또는 분석을 진행하고, 특정 경우에 암이 있거나 암이 있을 것으로 의심되는 생물학적 샘플을 갖는 개체를 지칭한다. 대상체는 포유류, 예를 들어, 사람, 연구 동물(예를 들어, 영장류, 래트, 마우스, 토끼), 가축(예를 들어, 소, 양, 염소, 돼지, 칠면조 및 닭), 가정용 애완동물(예를 들어, 개, 고양이 및 설치류), 말 및 유전자전이 비-사람 동물을 포함하는 방법 또는 재료의 대상인 임의의 유기체 또는 동물 대상체일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있고, 예를 들어, 양성 또는 악성의 신생물 또는 암과 같은 질환 (의학적 병태로서 언급될 수 있는)을 가질 수 있거나 갖는 것으로 의심될 수 있다. 대상체는 치료를 받고 있는 중이거나 치료를 받은 대상체일 수 있다. 대상체는 무증상일 수 있다. 대상체는 건강한 개체일 수 있지만 암의 예방을 원하는 개체일 수 있다. 용어 “개체”는 적어도 일부 경우에 상호교환적으로 사용될 수 있다. “대상체” 또는 "개체”는 본원에 사용된 바와 같이 의학 시설에 거주하거나 거주하지 않을 수 있고 의학 설비의 외래 환자로서 치료될 수 있다. 개체는 인터넷을 통해 하나 이상의 의학적 조성물을 투여받을 수 있다. 개체는 임의의 연령의 사람 또는 비-사람 동물을 포함할 수 있고, 따라서 성인 및 청소년(즉, 어린이) 둘다 및 유아를 포함하고, 자궁내 개체를 포함한다. 상기 용어가 의학적 치료의 필요성을 암시하는 것은 아니므로 개체가 자발적으로 또는 비자발적으로 임상 또는 기초 과학 연구의 지원 여부에 관계없이 실험의 일부가 될 수 있다.
[0051] 본원에 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은, 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리학에 대한 임의의 유익한 또는 바람직할 수 있는 효과를 포함하고, 심지어 치료하고자 하는 질환 또는 병태, 예를 들어, 암의 1종 이상의 측정 가능한 마커의 최소 감소도 포함할 수 있다. 치료는 임의로 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 병태의 진행의 지연을 포함할 수 있다. “치료"란 반드시 질환 또는 병태 또는 이의 관련 증상의 완전한 근절 또는 치유를 필수적으로 나타내지 않는다.
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[0052] 본원 개시내용은 CD5 양성 암에 대한 치료요법과 관련된, 특히 CD5 양성 암세포를 표적화하는 입양 세포 치료요법을 활용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서 CD5 양성 암을 표적화하기 위해 임의의 종류의 유전학적으로 가공된 포유동물 면역 세포(적어도 사람 NK 세포 포함)를 생성한다. 본원 개시내용은 CD5에 대해 지시된 임의의 종류의 유전학적으로 가공된 수용체(키메라 항원 수용체(CAR)를 포함)를 포함한다. 특정 구현예에서, 다수의 신규 발현 작제물이 제공되고, 이는 CAR에서 사용되는 CD5 표적화 단일쇄 가변 단편(scFv)을 발현하고 또한 NK 세포 생존 및 증식을 지원하기 위해 IL-15와 같은 하나 이상의 사이토킨을 발현하는 레트로바이러스 작제물을 포함한다.
[0053] 본원에서는 T세포 백혈병(T-ALL) 및 T세포 림프종과 같은 적어도 T 세포 악성 종양에서 발현되는 CD5를 표적화하는 디자인된 CAR이 제공된다. NK 세포는 정상 T 세포와 달리 정상 T 세포뿐만 아니라 모든 T 림프구성 백혈병 세포상에서 발현되는 분자인 CD5를 발현하지 않기 때문에 T 세포 악성 종양의 면역 치료요법를 위해 CD5를 표적화하는 것이 특히 유리하다. 따라서 CAR T 세포와 달리 CAR NK 세포는 CAR.CD5 매개된 동족살해에 의해 표적화되지 않는다. 따라서 본원의 개시내용은 CD5에 대해 단일쇄 가변 단편(scFv)을 발현하고 일부 경우 IL-15도 발현하여 NK 세포의 생존과 증식을 지원하는 다수의 신규 레트로바이러스 작제물을 제공한다. 일련의 시험관내 및 생체내 연구에서, 본원 발명자들은 T-세포 악성종양에 대해 CAR5/IL-15 형질도입된 CB-NK 세포의 활성을 확인시켜 주었다.
I. 유전학적으로 가공된 수용체
[0054] 본원 개시내용의 면역 세포는 유전학적으로 가공되어 CD5를 표적화하는 하나 이상의 항원-결합 수용체, 예를 들어, 가공된 CAR, 대안적으로 가공된 TCR을 발현하도록 발현하도록 유전학적으로 가공될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 CD5에 대해 항원 특이성을 갖는 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 변형된 NK 세포일 수 있다. 다른 CAR 및/또는 TCR은 CD5 항원 수용체-발현 세포와 동일한 세포에 의해 발현될 수 있고, 이들은 상이한 항원에 대해 지시될 수 있다. 일부 양상에서, 면역 세포는 CRISPR을 사용한 CAR 또는 TCR을 녹-인시킴에 의해 CD5-특이적 CAR 또는 CD5-특이적 TCR을 발현하도록 가공된다.
[0055] 세포의 변형에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌(Sambrook and Ausubel)을 참조한다. 예를 들어, 세포는 문헌(참조: Heemskerk et al., 2008 and Johnson et al., 2009)에 기재된 형질도입 기술을 사용하여, 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 CAR 또는 TCR을 발현하도록 형질도입될 수 있다.
[0056] 일부 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 항원 표적화 수용체(이의 적어도 하나는 CD5에 대해 지시된다)를 암호화하는 유전학적 가공을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 상기 핵산의 유전학적으로 가공된 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 즉, 통상적으로 가공된 세포 및/또는 상기 세포가 유래되는 유기체에서 발견되지 않는, 또 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포로부터 수득된 세포 또는 샘플 중에 존재하지 않는 이종성이다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 천연에서 발견되지 않는 핵산(예를 들어, 키메라)이다.
[0057] CAR 및 재조합 TCR을 포함하는 예시적 항원 수용체, 및 수용체를 가공하고 세포에 도입하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌(참조: 국제 특허 출원 공개 공보 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 공보 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 제6,451,995호, 제7,446,190호, 제8,252,592호, 제8,339,645호, 제8,398,282호, 제7,446,179호, 제6,410,319호, 제7,070,995호, 제7,265,209호, 제7,354,762호, 제7,446,191호, 제8,324,353호, 및 제8,479,118호, 및 유럽 특허 출원 EP2537416)에 기재된 것들, 및/또는 문헌(참조: Sadelain et al., 2013; Davila et al. 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012)에 기재된 것들을 포함한다. 일부 양상에서, 유전학적으로 가공된 항원 수용체는 미국 특허 제7,446,190호에 기재된 바와 같은 CAR, 및 국제 특허 출원 공개 공보 WO/2014055668 Al에 기재된 것들을 포함한다.
A. 키메라 항원 수용체
[0058] 특정 구현예에서, CD5-특이적 CAR이 활용되고 적어도 하기를 포함한다: a) 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD5에 특이적으로 결합함을 포함하여 표적화하는 적어도 하나의 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인. 특정 구현예에서, 항원 결합 영역은 항체 또는 이의 기능성 단편이지만 다른 경우에, CAR의 항원 결합 영역은 항체 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, CD5 에 대한 리간드)이 아니다. 일부 구현예에서, CD5 특이적 CAR은 CD5에만 결합하는 반면, 다른 경우에는 단일 폴리펩타이드로서 CAR은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하여 이중특이적이고, 그 중 하나는 CD5에 결합하고 다른 하나는 다른 비동일한 항원에 결합한다.
[0059] 일부 구현예에서, 가공된 항원 수용체는 CAR을 포함하고 이는 활성화 또는 자극 CAR 또는 동시 자극 CAR을 포함한다(문헌참조: WO2014/055668. CAR은 일반적으로 일부 양상에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 상기 분자는 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 동시 자극 수용체와 조합된 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 단독의 동시 자극 수용체를 통한 신호를 모방하거나 근접한다.
[0060] 키메라 작제물은 나출된 DNA로서 또는 적합한 벡터에서 면역 세포로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 세포를, 누출된 DNA를 사용하는 전기천공에 의해 안정하게 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,410,319호를 참조한다. 누출된 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향에서 플라스미드 발현 벡터 내 함유된, 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 언급한다.
[0061] 대안적으로, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 CAR 작제물을 면역 세포에 도입할 수 있다. 본원의 개시내용의 방법에 따라 사용하기 위해 적합한 벡터는 면역 세포에서 비-복제성이다. 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서, 세포에 유지되는 바이러스의 카피수는 세포의 생존율을 유지하기에 충분히 낮고, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터가 있다.
[0062] 본원의 개시내용의 특정 구현예는 적어도 하나의 세포내 신호 전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성(hCAR)을 감소시키기 위해 사람화된 CAR을 포함하는 CD5-특이적 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CD5-특이적 CAR은 하나 이상의 항원 간의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인지할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토킨)로부터 유래한다.
[0063] 사람 CD5 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포성 면역치료요법을 증진시키기 위해 사용되는 사람 유전자들일 수 있는 것으로 고려된다. 특이적 구현예에서, 본원의 개시내용은 전장 CD5-특이적 CAR cDNA 또는 암호화 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,109,304호에 기재된 것들과 같은 특정 사람 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원-특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법을 위해 최적화된 서열에 의해 암호화된 CD5-특이적 scFv이다.
[0064] 정렬은 다량체성, 예를 들어, 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변부의 가교 결합쌍에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은 전체적으로 결실되고, 제1 시스테인이 유지되고, 세린 보다는 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 다중 대안물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 상기 목적에 작용할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린으로부터의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파 부분을 사용할 수 있다.
[0065] 일부 구현예에서, CD5-특이적 CAR은 CD5에 대한 특이성과 함께 작제되고, 예를 들어, CD5는 환부 세포 유형 상에서 발현된다. 따라서, CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에서, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 항체 가변 도메인 및/또는 임의의 종류의 항체 분자를 포함한다. 사람 CD5 핵산의 예는 국립생명공학정보센터의 GenBank® 데이터베이스(승인 번호 NM_014207)에 있다. 사람 CD5 폴리펩타이드의 예는 GenBank® 승인 번호 Np_055022에 있다. 당업자는 적어도 폴리펩타이드 및 일상적인 관행에 대한 지식을 바탕으로 CD5에 대한 scFv를 포함한 항체를 생성할 수 있지만, 수많은 항-CD5 scFv 및 모노클로날 항체가 당업계에 이미 존재한다.
[0066] 일부 구현예에서, CD5-특이적 CAR은 모노클로날 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 기능성 단편은 H65 (문헌참조: Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, Calif.); 클론 CRIS1 또는 클론 4C7 (문헌참조: Abnova Corporation; Walnut, Calif.); OX-19 (문헌참조: Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, Calif.); Leu-1 (문헌참조: Becton-Dickinson; Mountain View, Calif.) 및 UCHT2 (문헌참조: Accurate Scientific; Westbury, N.Y.); 53-7.3 (문헌참조: Affymetrix; Santa Clara, Calif.); 4H8E6 (문헌참조: Life Technologies; Grand Island, N.Y.); T101; EP2952 (문헌참조: Abcam, Cambridge Mass.); 또는 L17F12이거나 이들로부터 유래한다. 다른 구현예에서, 항체는 예를 들어, scFv는 항-CD5 항체 D-9, H-3, HK231, N-20, Y2/178, H-300, L17F12, CD5/54/F6, Q-20, 또는 CC17 (모두는 제조사(Santa Cruz Biotechnology, Dallas Tex.)로부터 시판됨)이거나 이들로부터 유래한다. 항체는 CD5에 대해 드 노보 생성된 항체일 수도 있고, scFv 서열은 이러한 드 노보 항체로부터 수득하거나 유래될 수 있다.
[0067] 특정 구현예에서, 항-CD5 CAR은 CD5에 대한 리간드이거나 이를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD5 CAR은 CD72(Lyb-2), gp40-80, gp150, gp200, IgVH 프레임워크 영역, IL-6 및 이들의 단편 및 모방체를 포함하는 세포 외 도메인을 포함한다.
[0068] 키메라 수용체를 암호화하는 개방 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나 합성되거나 (예를 들어, PCR을 통해) 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 의존하여, 인트론이 mRNA를 안정화시키는것으로 밝혀짐에 따라 cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 추가로, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
[0069] 일부 양상에서, 항원-특이적 결합, 또는 인지 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 천연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인으로의 도메인의 결합을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연인 경우, 일부 양상에서 도메인은 임의의 막 결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, DAP10, NKG2D, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357 등의 알파, 베타, 또는 제타 쇄로부터 유래된 것들(즉, 이의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다)을 포함한다. 대안적으로, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 양상에서, 합성 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기들, 예를 들어, 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양상에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견된다.
[0070] 일부 구현예에서, CD5 CAR 핵산은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인과 같은, 다른 동시 자극 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 1차 T 세포 활성화 신호에 추가로, 예를 들어, CD3ζ 및/또는 FcεRIγ에 의해 개시될 수 있는 바와 같이, 표적 항원과 함께 키메라 수용체의 개입 후 면역 이펙터 세포 증식 및 이펙터 기능에 대한 추가의 자극 신호가 활용될 수 있다. 예를 들어, 세포의 활성화를 증진시키기 위한 사람 동시 자극 수용체의 일부 또는 전부를 활용하여 생체 내 지속성을 개선하고 입양 면역 치료요법의 치료학적 성공을 개선하는 것을 도와줄 수 있다. 이의 예는 DAP12, DAP10, NKG2D, CD2, CD28, CD27, 4-1BB, (CD137), OX40, ICOS, (CD278), CD30, HVEM, CD40, LFA-1 (CD11a/CD18), 및/또는 ICAM-1과 같은 분자로부터의 동시 자극 도메인을 포함하지만, 특정 대안적 구현예에서, 이들 열거된 것 중 어느 하나는 CAR에서 사용이 배제될 수 있다.
[0071] 특정 구현예에서, NK 세포와 같은 면역 세포를 유전학적으로 변형시키기 위해 본원에 기재된 플랫폼 기술은 (i) 전기천공 장치 (예를 들어, 뉴클레오펙터)를 사용한 비-바이러스 유전자 전달, (ii) 엔도도메인(예를 들어, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ, 또는 다른 조합)을 통해 신호를 전달하는 CAR, (iii) CD5-인지 도메인을 세포 표면으로 연결하는 다양한 길이의 세포외 도메인을 갖는 CAR 및 일부 경우에, (iv) CAR+ 면역 세포를 강하게 및 수적으로 확장시킬 수 있도록 K562로부터 유래된 인공 항원 제공 세포 (aAPC)(문헌참조: Singh et al., 2008; Singh et al., 2011)를 포함한다.
B. 특이적 CAR 구현예의 예
[0072] 특정 구현예에서, 특정 CD5 CAR 분자가 본원에 포함된다. 일부 경우에, CAR의 CD5 결합 도메인은 scFv이고, CD5에 결합하는 임의의 scFv 및/또는 CD5에 결합하는 리간드는 본원에 사용될 수 있다. CAR의 세포 외 도메인에서 항-CD5 scFv가 활용되는 경우, scFv의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 임의의 순서로 배치될 수 있다. 예를 들어, 가변 중쇄는 가변 경쇄의 N-말단 측면 상에 있을 수 있거나 그 반대일 수 있다. CAR에서 CD5와 결합하는 scFv 및/또는 리간드는 코돈에 최적화되어 있을 수도 있고 최적화되어 있지 않을 수도 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 CD5-특이적인 CAR을 암호화하고 하나 이상의 다른 분자도 암호화한다. 예를 들어, 벡터는 CD5 특이적 CAR를 암호화할 수도 있고, 다른 가공된 항원 수용체, 자살 유전자 및/또는 특정 사이토킨과 같은 관심 대상의 또 다른 단백질을 암호화할 수도 있다.
[0073] 동일한 분자상에서, CD5-특이적 CAR은 하나 이상의 항원-특이적 세포 외 도메인, 특정 힌지, 특정 막관통 도메인, 하나 이상의 특정 동시 자극 도메인 및 하나 이상의 특정 활성화 신호를 포함할 수 있다. 2개의 서로 다른 항원(그 중 하나는 CD5)을 표적화하는 것과 같이 하나 초과의 항원 특이적 세포외 도메인이 활용되는 경우, 2개의 항원 특이적 세포외 도메인 사이에 링커가 있을 수 있다.
[0074] 특정 CAR 분자의 특정 구현예에서, CAR은 DAP10, DAP12, 4-1BB, NKG2D, 또는 기타 동시 자극 도메인(본원에서는 세포질내 도메인으로 지칭될 수 있음)을 활용할 수 있다. 일부 경우에는 동시 자극 도메인 없이 CD3제타가 활용된다. 특정 CAR 분자의 특정 구현예에서, CAR은 DAP12, DAP10, NKG2D 또는 CD28으로부터의 것들과 같은 임의의 적절한 막관통 도메인을 활용할 수 있다.
[0075] 특정 구현예에서, 특정 CD5-특이적 가공된 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 작제물이 있다. 특정 구현예에서, 임의의 CD5 CAR은 하기 중 하나를 포함할 수 있다: (a) CD28 막관통 도메인 (TM) 및 CD28 세포질내 도메인 (ICD); (b) CD28 TM, CD28 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (c) CD28 TM 및 DAP12 ICD; (d) CD28 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호 전달 도메인; (e) DAP12 TM 및 DAP12 ICD; (f) DAP12 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (g) CD28 TM 및 4-1BB ICD; (h) CD28 TM, CD28 ICD, 및 4-1BB ICD; (i) CD28 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (j) CD28 TM 및 DAP10 ICD; (k) CD28TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (l) DAP10 TM 및 DAP10 ICD; (m) DAP10 TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (n) NKG2D ICD; (o) NKG2D TM; (p) NKG2D TM 및 NKG2D ICD; (q) NKG2D TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (r) CD28 TM 및 NKG2D ICD; (s) NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; (t) CD28 TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; 또는 (u) 동시 자극 도메인인 ICD가 부재인 CD28TM 및 CD3제타.
[0076] 특정 서열 구현예의 예는 하기에 제공된다.
1. 항원-특이적 세포외 도메인
[0077] 특정 구현예에서, 항-CD5 scFv (사람화된) 뉴클레오타이드 서열이 활용되고 다음과 같다:
ATGGAGTTCGGTCTCAGTTGGCTGTTTTTGGTTGCTATCTTGAAGGGCGTCCAATGCAGCCGGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCCTCTAGCATGTCAGCGAGTCTTGGTGATCGAGTGACGATTACCTGCAGAGCCTCTCAAGATATAAACAGCTATCTTTCATGGTTCCAACAGAAGCCGGGGAAGTCCCCAAAAACTCTCATATACAGGGCGAATCGACTCGTAGACGGTGTGCCTTCAAGGTTTTCCGGGAGTGGTAGTGGCACAGATTACACACTTACAATCTCTTCATTGCAGTATGAGGATTTCGGGATCTACTACTGTCAACAGTACGACGAATCCCCATGGACGTTTGGGGGCGGGACCAAACTTGAGATAAAAGGGAGCACATCTGGAAGTGGTAAACCTGGGTCAGGGGAGGGTTCCACAAAAGGACAAATTCAACTTGTCCAAAGCGGTCCTGGTCTTAAGAAGCCTGGAGGGTCTGTCAGGATAAGTTGTGCGGCATCCGGCTACACCTTCACCAACTATGGGATGAACTGGGTGAAACAAGCGCCTGGGAAAGGTCTTCGATGGATGGGCTGGATTAATACCCACACTGGAGAGCCCACTTACGCTGATGATTTCAAAGGACGATTTACCTTCTCCTTGGATACTTCCAAGAGTACCGCGTACTTGCAAATCAACAGTCTCCGGGCTGAAGACACGGCCACATACTTCTGTACGCGGAGAGGGTATGACTGGTATTTTGATGTGTGGGGTCAGGGAACAACCGTGACTGTTTCAAGC (서열번호 1)
[0078] 해독된 scFv (사람화된) (서열번호 1로부터 해독된) 아미노산 서열은 다음과 같다:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPGLKKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFTFSLDTSKSTAYLQINSLRAEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS (서열번호 2)
[0079] 특정 구현예에서, 항-CD5 scFv [뮤린] 뉴클레오타이드 서열이 활용되고 다음과 같다:
ATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGC (서열번호 3)
[0070] 해독된 scFv (뮤린) (서열번호 3으로부터 해독된) 아미노산 서열은 다음과 같다:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSS (서열번호 4)
2. 막관통 도메인
[0071] 임의의 적합한 막관통 도메인은 CD5-특이적 CAR에서 활용될 수 있다. 이의 예는 적어도 DAP10, DAP12, CD28, NKG2D, CD3 엡실론, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터의 것들, T-세포 수용체 a 또는 b 쇄, CD3 제타 쇄, ICOS, 이의 기능성 유도체로부터의 것들 및 이의 조합물을 포함한다. 특정 경우에, DAP10, DAP12, CD28, 또는 NKG2D로부터의 막관통 도메인이 활용된다. 특정 막관통 도메인 서열의 예가 사용될 수 있고 다음과 같다:
[0072] 4-1BB 막관통 도메인 뉴클레오타이드 서열:
ATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT (서열번호 5)
[0073] 4-1BB 막관통 도메인 아미노산 서열:
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (서열번호 6)
[0074] CD28 막관통 도메인 뉴클레오타이드 서열:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (서열번호 7)
[0075] CD28 막관통 도메인 아미노산 서열:
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열번호 8)
[0076] DAP10 막관통 도메인 뉴클레오타이드 서열:
CTCCTGGCAGGCCTCGTGGCTGCTGATGCGGTGGCATCGCTGCTCATCGTGGGGGCGGTGTTC (서열번호 9)
[0077] DAP10 막관통 도메인 아미노산 서열:
LLAGLVAADAVASLLIVGAVF (서열번호 10)
[0078] DAP12 막관통 도메인 뉴클레오타이드 서열:
GGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTG (서열번호 11)
[0079] DAP12 막관통 도메인 아미노산 서열:
GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV (서열번호 12)
[0080] NKG2D 막관통 도메인 뉴클레오타이드 서열:
GCGGTGATGATTATTTTTCGCATTGGCATGGCGGTGGCGATTTTTTGCTGCTTTTTTTTTCCG (서열번호 13)
[0081] NKG2D 막관통 도메인 아미노산 서열:
AVMIIFRIGMAVAIFCCFFFP (서열번호 14)
3. 세포질 내 도메인 (ICD)
[0082] 하나 이상의 세포질내 도메인(적절한 경우에 본원에서 동시 자극 도메인으로서 언급될 수 있는)은 본원 개시내용의 특이적 항-CD5 CAR에서 활용되거나 활용되지 않을 수 있다. 특정 구현예는 4-1BB, NKG2D, DAP10, DAP12, B7-1/CD80, CD28, 4-1BBL, B7-2/CD86, CTLA-4, B7-H1/PD-L1, ICOS, B7-H2, PD-l, B7-H3, PD-L2, B7-H4, PDCD6, BTLA; 또는 이의 조합물로부터의 ICD를 포함한다.
[0083] 특정 ICD 서열의 예는 CAR에서 사용될 수 있고 다음과 같다:
[0084] 4-1BB 세포질내 도메인 뉴클레오타이드 서열:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (서열번호 15)
[0085] 4-1BB 세포질내 도메인 아미노산 서열:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열번호 16)
[0086] DAP10 세포질내 도메인 뉴클레오타이드 서열:
CTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGC (서열번호 17)
[0087] DAP10 세포질내 도메인 아미노산 서열:
LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG (서열번호 18)
[0088] DAP12 세포질내 도메인 뉴클레오타이드 서열:
TACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAA (서열번호 19)
[0089] DAP12 세포질내 도메인 아미노산 서열:
YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (서열번호 20)
[0090] NKG2D 세포질내 도메인 뉴클레오타이드 서열:
AGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATG (서열번호 21)
[0091] NKG2D 세포질내 도메인 아미노산 서열:
SANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGM (서열번호 22)
4. 힌지
[0092] CAR의 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지 영역이 있다. 특정 구현예에서, 힌지는 예를 들어 10-20, 10-15, 11-20, 11-15, 12-20, 12-15 또는 15-20개의 아미노산 길이와 같은 특정 길이를 갖는다. 힌지는 임의의 적합한 힌지일 수 있고 일부 경우에 IgG 또는 CD28로부터의 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 힌지는 IgG Fc의 CH2-CH3 및 CH1 도메인을 연결하는 작은 가요성 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 다양한 IgG 서브클래스(IgG1-4, 변형되거나 변형되지 않음)로부터 CH2-CH3 힌지(일부 또는 전부)를 활용할 수 있다. 그러나 일부 경우에 전체 CH2-CH3 힌지가 활용되지 않지만 힌지의 일부가 사용된다(예를들어, CH3 자체 또는 CH3 자체의 일부). 특정 구현예에서, IgG1로부터 유래된 CH2-CH3 힌지가 활용되고, 일부 경우에는 전체 CH2-CH3 힌지가 사용되거나(모두 229개 아미노산), CH3 힌지(119개 아미노산)만이 사용되거나, 짧은 힌지(12개 아미노산)가 사용된다.
[0093] 특정 경우에는 CAR의 효율성을 최적화하기 위해 스페이서 및/또는 힌지의 정체성 또는 길이를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌(Hudecek et al. (2014) and Jonnalagadda et al. (2015))을 참조한다. 특정 구현예에서, CD5 CAR은 예를 들어 IgG4 힌지+CH3을 활용하거나 CD8a 스톡을 활용한다.
[0094] 따라서, 특정 구현예에서 활용되는 IgG 힌지 영역은 전형적으로 IgG1 또는 IgG4이며, 일부 경우 CAR은 IgG Fc의 CH2-CH3 도메인을 포함한다. IgG Fc 도메인의 사용은 CAR에 가요성을 제공할 수 있고, 면역원성이 낮으며, 항-Fc 시약을 사용하여 CAR 발현을 용이하게 검출할 수 있고, 하나 이상의 CH2 또는 CH3 모듈을 제거하여 다양한 스페이서 길이를 수용할 수 있다. 그러나, 하나의 구현예에서 FcγR 결합을 회피하기 위한 특정 스페이서의 돌연변이는 CAR+ T 세포 생착 및 항종양 효능을 개선하여 가용성 및 세포 표면 Fc 감마 수용체의 결합을 회피하면서도 항원-특이적 용해를 매개하는 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, CH2 영역에서 변형된 IgG4-Fc 스페이서를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 CH2 영역은 점 돌연변이 및/또는 결실을 포함하여 돌연변이될 수 있다. 특정 변형은 CH2 영역 내의 2개의 부위(L235E; N297Q)에서 입증되었고/되었거나 CH2 결실을 혼입한다(문헌참조: Jonnalagadda et al, 2015). 특정 구현예에서, IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인(길이 229 aa) 또는 힌지 도메인(길이 12 aa)만을 사용할 수 있다(문헌참조: Hudeeck et al., 2015).
[0095] 특정 구현예에서, 힌지는 IgG, CD28, CD-8 알파, 4-1BB, 0X40, CD3-제타, T 세포 수용체 a 또는 b 쇄, CD3 제타 쇄, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, 또는 CD154로부터 기원한다.
[0096] 활용될 수 있는 힌지의 특정 서열의 예는 적어도 하기를 포함한다:
[0097] IgG 힌지 뉴클레오타이드 서열:
GTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATT (서열번호 23)
[0098] IgG 힌지 아미노산 서열:
TVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK (서열번호 24)
[0099] CD28 힌지 뉴클레오타이드 서열:
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC (서열번호 25)
[0100] CD28 힌지 아미노산 서열:
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호 26)
5. 신호 활성화 도메인
[0101] 특정 경우에, 항-CD5 CAR 분자는 예를 들어 CD3제타 또는 FcεRIγ와 같은 신호 활성화 도메인을 포함한다.
[0102] 활용될 수 있는 CD3 제타 뉴클레오타이드 서열의 하나의 예는 다음과 같다:
CGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAC (서열번호 27)
[0103] 활용될 수 있는 CD3 제타 아미노산 서열의 하나의 예는 다음과 같다:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRG (서열번호 28)
6. 기타 단백질
[0104] 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 단백질은 항-CD5 CAR과 함께 활용된다. 하나 이상의 기타 단백질은 어떠한 이유로든 활용될 수 있고, 이는 CAR 자체 및/또는 CAR을 발현하는 임의의 종류의 세포의 효능을 촉진시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 기타 단백질(들)이 CAR 또는 세포의 활성에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치는지의 여부에 관계없이, 기타 단백질은 치료요법으로서 CAR을 발현하는 세포를 투여받은 개체의 치료를 촉진한다. 일부 경우에 다른 단백질은 자살 유전자, 하나 이상의 사이토킨 또는 둘 다이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 기타 단백질은 벡터로부터 제조되고 궁극적으로 2개의 별도의 폴리펩타이드로서 생성된다. 예를 들어, 항-CD5 CAR 및 기타 단백질(들)은 예를 들어 2A 서열 또는 IRES에 의해 분리될 수 있다.
[0105] 특정 구현예에서, 사이토킨, 예를 들어, IL-15는 항-CD5 CAR과 연계하여 활용된다.
[0106] IL-15 뉴클레오타이드 서열의 하나의 예는 다음과 같다:
[0107] IL-15 뉴클레오타이드 서열:
GCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGACAATT (서열번호 29)
[0108] IL-15 아미노산 서열:
ISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 30)
[0109] 동일한 벡터 내 CAR과 또 다른 단백질이 두 개의 다른 폴리펩타이드로 생산하려는 경우, 특정 2A 서열이 활용될 수 있다.
[0110] 하나의 예에서, E2A 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같이 활용된다:
CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCC (서열번호 31)
[0111] E2A 아미노산 서열은 다음과 같이 활용될 수 있다:
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열번호 32)
[0112] 기타 2A의 예가 활용될 수 있고 다음과 같다:
T2A: E G R G S L L T C G D V E E N P G P (서열번호 49)
P2A: ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열번호 50)
F2A: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열번호 51)
[0113] 본원 개시내용은 또한 임의의 유형의 면역 이펙터 세포에서의 발현을 포함하여 특정 CAR 분자를 포함한다.
[0114] 하나의 예에서, IgG1 힌지, CD28 막관통 도메인 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-CD28TMD-CD3제타-2A-IL15 ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 33)
[0115] CD5-IgG1-CD28TMD-CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 34)
[0116] 하나의 예에서, IgG1 힌지, DAP10 막관통 도메인 및 DAP10 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-DAP10TMD-DAP10 ICD.CD3제타-2A-IL15 ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGCTCCTGGCAGGCCTCGTGGCTGCTGATGCGGTGGCATCGCTGCTCATCGTGGGGGCGGTGTTCCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 35)
[0117] CD5-IgG1-DAP10TMD-DAP10ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 36)
[0118] 하나의 예에서, IgG1 힌지, CD28 막관통 도메인 및 4-1BB 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-CD28TMD-41BB-CD3제타-2A-IL15 ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 37)
[0119] CD5-IgG1-CD28TMD-41BB-CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 38)
[0120] 하나의 예에서, IgG1 힌지, CD28 막관통 도메인 및 DAP10 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-CD28TMD-DAP10 ICD.CD3제타-2A-IL15 ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 39)
[0121] CD5-IgG1-CD28TMD-DAP10 ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 40)
[0122] 하나의 예에서, IgG1 힌지, DAP12 막관통 도메인 및 DAP12 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-DAP12TMD-DAP12 ICD.CD3제타-2A-IL15 ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAAACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 41)
[0123] CD5-IgG1-DAP12TMD-DAP12 ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 42)
[0124] 하나의 예에서, IgG1 힌지, CD28 막관통 도메인 및 DAP12 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-CD28TMD-DAP12 ICD.CD3제타-2A-IL15
ATGCTCGAGatggagttcggcttgagttggttgttccttgtggcgatactcaaaggcgttcaatgtagccgagacataaaaatgacccagtctccgtcatctatgtatgcaagcctcggcgagcgagtgaccatcacgtgcaaggcgagtcaagatataaacagctacttgtcatggttccaacaaaaaccagggaaatcacctaagaccctgatctatagagccaatcgcctggttgacggtgtcccctcccgctttagcggctccggaagcggtcaagattactctctcacaatttcttccttggattatgaagacatggggatctactattgtcaacagtatgacgaatccccgtggactttcggtggcggtaccaaattggaaataaagggctctacaagcggctcaggaaaacctggatcaggcgaagggtctacgaagggccagatacaactcgttcaaagtgggccagaactcaaaaaaccgggagaaacagtgaaaatttcttgtaaggcatcaggatacacattcacaaactacgggatgaattgggtcaaacaagcacccggaaaggggctgcgctggatggggtggatcaacacacatactggggaacctacttacgcagacgatttcaagggcagattcgccttttctttggagacctccgcctctactgcatacttgcagataaacaacctgaagaatgaagataccgccacctacttctgtacgcgcaggggctacgattggtattttgatgtatggggggcaggcaccactgttactgtgtcaagcCGTACGgTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAAACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 43)
[0125] CD5-IgG1-CD28TMD-DAP12 ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 44)
[0126] 하나의 예에서, IgG1 힌지, NKG2D 막관통 도메인 및 NKG2D 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-NKG2DTMD-NKG2D ICD.CD3제타-2A-IL15
ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGCGGTGATGATTATTTTTCGCATTGGCATGGCGGTGGCGATTTTTTGCTGCTTTTTTTTTCCGAGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 45)
[0127] CD5-IgG1-NKG2DTMD-NKG2D ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGMTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 46)
[0128] 하나의 예에서, IgG1 힌지, CD28 막관통 도메인 및 NKG2D 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있고, 이는 예를 들어 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
CD5-IgG1-CD28TMD-NKG2D ICD.CD3제타-2A-IL15
ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 47)
[0129] CD5-IgG1-CD28TMD-NKG2D ICD.CD3제타-2A-IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGMTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 48)
[0130] 하나의 예에서, CD28 힌지, CD28 막관통 도메인 및 DAP10 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있거나 발현될 수 없고, 이는 예를 들어 하나의 예로서 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
iC9.CD5CARCD28힌지.tmdDAP103z.IL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 52)
[0131] iC9.CD5CARCD28힌지.tmdDAP103z.IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 53)
[0132] 하나의 예에서, CD28 힌지, CD28 막관통 도메인 및 CD28 세포질내 도메인, 및 CD3제타를 포함하는 항-CD5 CAR이 활용된다. 벡터에서 CAR은 IL-15와 함께 발현될 수 있거나 발현될 수 없고, 이는 예를 들어 하나의 예로서 2A 서열에 의해 CAR로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, CAR 및 IL-15 작제물은 하기의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
iC9.CD5CARCD28힌지.28tmd3z.IL15
ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCGCGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGGCCCCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCAACGCGTGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA (서열번호 54)
[0133] iC9.CD5CARCD28힌지.28tmd3z.IL15에 대한 상응하는 아미노산 서열은 다음과 같다:
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 55)
C. T 세포 수용체 (TCR)
[0134] 일부 구현예에서, CD5-표적화 유전학적으로 가공된 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 천연적으로 존재하는 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. “T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (또한 각각 TCRα 및 TCRβ로서 공지된) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (또한 각각 TCRγ 및 TCRδ로서 공지된)를 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다.
[0135] 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만 이들을 발현하는 T 세포는 고유의 해부하적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면상에서 발견되고, 여기서, 이것은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인지하는데 관여한다. 일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Janeway et al, 1997) 예를 들어, 일부 양상에서, TCR의 각각의 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 영구적 단백질과 연관된다. 달리 기재되지 않는 경우, 용어 "TCR"은 이의 기능성 TCR 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야만 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는, 온전하거나 전장의 TCR를 포괄한다.
[0136] 따라서, 본원의 목적을 위해, TCR에 대한 언급은 임의의 TCR 또는 MHC 분자, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특이적 항원 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원-결합 부분과 같은 기능성 단편을 포함한다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 "항원 결합 부분" 또는 항원 결합 단편" 은 TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만 완전한 TCR이 결합하는 항원(예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 분자를 언급한다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 것에 대한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유하고, 여기서, 각각의 쇄는 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다.
[0137] 일부 구현예에서, TCR 쇄의 가변 도메인은 연합하여 TCR 분자의 결합 부위를 형성함에 의해 항원 인지를 부여하고 펩타이드 특이성을 결정하는, 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 형성한다. 전형적으로, 면역글로불린과 같이, CDR은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된다(문헌참조: 예를 들어, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003). 일부 구현예에서, CDR3은 가공된 항원을 인지하기 위해 관여하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호작용하는 것으로 나타난 반면 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인지하는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, β-쇄의 가변 영역은 추가로 초가변 (HV4) 영역을 함유할 수 있다.
[0138] 일부 구현예에서, TCR 쇄는 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린과 같이, TCR 쇄(예를 들어, α-쇄, β-쇄)의 세포외 부분은 N-말단에서 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, Va 또는 Vp; 전형적으로 캐뱃 넘버링을 기준으로 아미노산 1 내지 116: Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인(예를 들어, α-쇄 불변 도메인 또는 Ca, 전형적으로 캐뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 259, β-쇄 불변 도메인 또는 Cp, 전형적으로 캐뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 295)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 쇄에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 CDR을 함유하는, 2개의 막-근접 불변 도메인 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 짧은 연결 서열을 함유하고, 여기서, 시스테인 잔기는 디설파이드 결합을 형성하고 이는2개의 쇄 사이를 연결한다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β 쇄 각각에서 추가의 시스테인 잔기를 가져 TCR은 불변 도메인에서 2개의 디설파이드 결합을 함유한다.
[0139] 일부 구현예에서, TCR 쇄는 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 상기 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 연합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 영구 서브유닛과 연합할 수 있다.
[0140] 일반적으로, CD3은 포유동물 및 ζ-쇄에서 3개의 고유 쇄(γ, δ, 및 ε)를 가질 수 있는 다중-단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄 및 CD3ζ 쇄의 동종이량체를 함유할 수 있다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도의 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 막관통 영역은 음으로 하전되어 있고, 이는 이들 쇄가 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특징이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리 각각은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관여한다. 이들 악세서리 분자는 음으로 하전된 막관통 영역을 갖고 TCR로부터 세포로 신호를 전파하는 역할을 수행한다. CD3- 및 ζ-쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로서 공지된 것을 형성한다.
[0141] 일부 구현예에서, TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 임의로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나 이것은 단일쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 다설파이드 결합들에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하고 세포에 도입한다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 공용의 TCR DNA 서열의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 (PCR)에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공용의 공급원과 같은 세포로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 고친화성 T 세포 클론은 환자로부터 단리될 수 있고 TCR이 단리된다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 사람 면역계 유전자 (예를 들어, 사람 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 가공된 유전자전이 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 문헌(tumor antigens (Parkhurst et al., 2009; Cohen et al., 2005))을 참조한다. 일부 구현예에서 파아지 디스플레이를 사용하여 표적 항원에 대한 TCR을 단리한다(문헌참조: 예를 들어, Varela-Rohena et al., 2008, 및 Li, 2005). 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분은 합성적으로 TCR의 서열 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
II. 사이토킨
[0142] 하나 이상의 사이토킨은 CD5-특이적 CAR과 같은 하나 이상의 CD5-표적화 유전학적으로 가공된 수용체와 함께 활용될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 사이토킨은 가공된 수용체와 동일한 벡터 분자상에 존재하지만 다른 경우에는 이들은 별도의 벡터 분자 상에 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토킨은 가공된 수용체와 동일한 벡터로부터 공동 발현된다. 하나 이상의 사이토킨은 CD5-특이적 수용체로부터 분리된 폴리펩타이드로서 생산될 수 있다. 하나의 예로서, 인터류킨-15 (IL-15)가 사용된다. lL-15는 조직 제한적이고 병리학적 조건하에서만 혈청내 또는 전신적으로 임의의 수준으로 관찰되기 때문에 IL-15가 사용될 수 있다. IL-15는 입양 치료요법을 위해 바람직할 수 있는 여러 속성들을 소유한다. IL-15는 천연 킬러 세포의 발육 및 세포 증식을 유도하고, 종양-잔류 세포의 기능적 억제를 완화시킴을 통해 확립된 종양의 소거를 촉진시키고 활성화-유도된 세포사를 억제하는 항상성 사이토킨이다. IL-15에 추가로, 다른 사이토킨이 고려된다. 이들은 사이토킨, 케모킨, 및 사람 적용을 위해 사용되는 세포의 활성화 및 증식에 기여하는 다른 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 예로서, 사이토킨은 IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, IL-21, IL-7, 또는 이의 조합이다. IL-15를 발현하는 NK 세포가 사용될 수 있고 계속되는 지원 사이토킨 신호전달할 수 있고, 이는 주입 후 이들의 생존을 위해 유용하다.
[0143] 특이적 구현예에서, NK 세포는 하나 이상의 외인성으로 제공되는 사이토킨을 발현한다. 사이토킨은 세포 내 발현 벡터로부터 발현되기 때문에 및/또는 세포의 배양 배지에서 제공되기 때문에 NK 세포에 외인성으로 제공될 수 있다. 대안적인 경우에, 세포 내의 내인성 사이토킨은 사이토킨의 프로모터 부위(들)에서의 유전학적 재조합과 같은 내인성 사이토킨의 발현 조절의 조작시 상향조절된다. 사이토킨이 세포에 대한 발현 작제물 상에 제공되는 경우, 사이토킨은 자살과 동일한 벡터로부터 암호화될 수 있다. 사이토킨은 자살 유전자로서 별도의 폴리펩타이드 분자로서 및 세포의 가공된 수용체로부터 분리된 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 특히 NK 세포에서 IL-15와 함께 CAR 및/또는 TCR 벡터의 공동 사용에 관한 것이다.
III. 자살 유전자
[0144] 특정 구현예에서, 자살 유전자는 이의 용도를 제어하고 목적하는 이벤트 및/또는 시간에 세포 치료요법의 종료를 허용하기 위해 임의의 종류의 세포 요법과 함께 이용된다. 자살 유전자는 필요한 경우 형질도입된 세포에 대해 사멸을 유발하는 목적을 위해 형질도입된 세포에 사용된다. 본원 개시내용에 의해 포함되는 벡터를 함유하도록 변형된 본원 개시내용의 CD5-표적화 세포는 하나 이상의 자살 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 “자살 유전자”는 프로드럭 또는 다른 제제의 투여시, 유전자 생성물을 숙주 세포를 사멸시키는 화합물로 전이시키는 유전자로서 정의된다. 다른 구현예에서, 자살 유전자는 목적하는 경우 자살 유전자 생성물을 표적화하는 제제(예를 들어, 항체)에 의해 표적화되는 유전자 생성물을 암호화한다.
[0145] 사용될 수 있는 자살 유전자/프로드럭 조합의 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus)-티미딘 키나제(HSV-tk) 및 간시클로비르(ganciclovir), 아시클로비르(acyclovir), 또는 FIAU; 옥시도리덕타제 및 사이클로헥시미드; 사이토신 데아미나제 및 5-플루오로시토신; 티미딘 키나제 티미딜레이트 키나제 (Tdk::Tmk) 및 AZT; 및 데옥시시티딘 키나제 및 시토신 아라비노사이드이다. 프로드럭 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드를 독성의 퓨린 6-메틸퓨린으로 전환시키는 소위 자살 유전자로 불리우는 이. 콜리 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제가 사용될 수 있다. 프로드럭 치료요법과 함께 사용되는 자살 유전자의 다른 예는 이. 콜리 시토신 데아미나제 유전자 및 HSV 티미딘 키나제 유전자이다.
[0146] 예시적인 자살 유전자는 또한 CD20, CD52, EGFRv3, 또는 유도성 카스파제 9을 포함한다. 하나의 구현예에서, 절단된 버젼의 EGFR 변이체 III (EGFRv3)은 세툭시맙에 의해 제거될 수 있는 자살 항원으로서 사용될 수 있다. 본원의 개시내용에서 사용될 수 있는 당업계에 공지된 추가의 자살 유전자들은 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 (PNP), 시토크롬 p450 효소 (CYP), 카복시펩티다제 (CP), 카복실에스테라제 (CE), 니트로디럭타제 (NTR), 구아닌 리보실트랜스퍼라제 (XGRTP), 글리코시다제 효소, 메티오닌-α,γ-리아제 (MET), 및 티미딘 포스포릴라제 (TP)를 포함한다.
[0147]특정 구현예에서, CD5-표적화 CAR을 암호화하는 벡터, 또는 본원에 포함된 NK 세포 내의 임의의 벡터는 하나 이상의 자살 유전자를 포함한다. 자살 유전자는 CD5-표적화 CAR과 동일한 벡터 상에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 자살 유전자가 CD5-표적화 CAR과 동일한 벡터에 존재하는 경우, 자살 유전자와 CAR은 예를 들어 IRES 또는 2A 요소에 의해 분리될 수 있다.
IV. 벡터
[0148] CD5-표적화 CAR은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에 의한 것을 포함하는 임의의 적합한 벡터에 의해 수용자 면역 세포에 전달될 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 적어도 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 비-바이러스 벡터의 예는 적어도 플라스미드, 트랜스포존, 지질, 나노입자 등을 포함한다.
[0149] 면역 세포가 CD5-표적화 수용체를 암호화하는 벡터로 형질도입되고 자살 유전자 및/또는 사이토킨 및/또는 임의의 치료학적 유전자 생성물과 같은 다른 유전자 또는 유전자들의 세포 내로의 형질도입을 또한 필요로 하는 경우, CD5-표적화 수용체, 자살 유전자, 사이토킨, 및 임의의 치료학적 유전자는 동일한 벡터 상에 또는 이와 함께 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 일부 경우에, CD5-표적화 CAR, 자살 유전자, 사이토킨 및 임의의 치료학적 유전자는 동일한 바이러스 벡터 분자와 같은 동일한 벡터 분자로부터 발현된다. 이러한 경우에, CD5-표적화 CAR, 자살 유전자, 사이토킨 및 임의의 치료학적 유전자의 발현은 동일한 조절 요소(들)에 의해 조절되거나 조절되지 않을 수 있다. CD5-표적화 CAR, 자살 유전자, 사이토킨 및 임의의 치료학적 유전자가 동일한 벡터 상에 있는 경우, 이들은 별도의 폴리펩타이드로 발현되거나 발현되지 않을 수 있다. 이들이 별도의 폴리펩타이드로 발현되는 경우, 이들은 예를 들어 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 벡터 상에서 분리될 수 있다(또는 두 종류가 동일한 벡터 상에 1회 또는 1회 초과로 사용될 수 있음).
A. 일반 구현예
[0150] 당업자는 본원 개시내용의 항원 수용체의 발현을 위한 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 장비를 잘 갖추고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et al., 2001 and Ausubel et al., 1996, 이 둘다는 본원에 참조로 인용된다).
1. 조절 요소들
[0151] 본원의 개시내용에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 특히 (5'-에서-3' 방향으로) 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결된 진핵 전사 프로모터, 삽입 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 진핵 세포에서 단백질 암호화 유전자의 전사를 제어하는 프로모터 및 인핸서는 다중 유전학적 요소들로 구성될 수 있다. 세포 기구는 각각의 요소에 의해 전달되는 조절 정보를 수집하고 통합할 수 있어 상이한 유전자들이 전사 조절의 별개의 흔한 복합 패턴으로 전개되도록 한다. 본원 개시내용과 관련하여 사용되는 프로모터는 예를 들어, 항시성, 유도성 및 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 벡터가 암 치료요법의 생성을 위해 사용되는 경우, 프로모터는 저산소 상태하에서 효과적일 수 있다.
2. 프로모터/인핸서
[0152] 본원에 제공된 발현 작제물은 항원 수용체 및 다른 시스트론 유전자 생성물의 발현을 구동시키기 위해 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 최상의 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유동물 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 레이트 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 박스가 부재인 일부 프로모터에서, 개시 부위 자체 위에 위치한 구분된 요소는 개시 위치를 고정시키는 것을 도와준다. 추가의 프로모터 요소들은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소들을 함유하는 것으로 나타났다. 암호화 서열을 프로모터“의 제어하에” 있도록 하기 위해, 하나는 선택된 프로모터의 “다운스트림”(즉, 이의 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한다. “업스트림” 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
[0153] 프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 가요성이어서 프로모터 기능은 요소들이 서로 상대적으로 역위되거나 이동되는 경우 보존된다. tk 프로모터에서, 예를 들어, 프로모터 요소들 간의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 이격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 이것은 개별 요소들이 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있음을 나타낸다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 언급하는 “인핸서”와 연계하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
[0154] 프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비-암호화 서열을 단리시킴에 의해 수득될 수 있는 바와 같이 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 “내인성”으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 상기 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 정상적으로 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 연합되지 않은 프로모터 프로모터를 언급하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 분절을 위치시킴에 의해 획득될 수 있다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 천연 환경에서 핵산 성려과 정상적으로 연합되지 않은 인핸서를 언급한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “천연적으로 존재”하지 않는, 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조절 영역, 및/또는 돌연변이의 상이한 요소들을 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물에서 대부분 통상적으로 사용되는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 및 트립토판 (trp-) 프로모터 시스템을 포함한다. 합성적으로 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것에 추가로, 서열은 본원에 기재된 조성물과 연계하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 추가로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[0155] 천연적으로, 기관(organelle), 세포 유형, 조직, 기관(organ), 또는 발현을 위해 선택된 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자 생물학적 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et　al. 1989, 본원에 참조로 인용됨). 사용되는 프로모터는 항상성, 조직-특이적, 유도성일 수 있고/있거나 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하기 위해 적당한 조건하에서 유용할 수 있고, 예를 들어, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생성에 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
[0156] 추가로 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들어, epd.isb-sib.ch/의 월드 와이드 웹을 통해, 진핵 세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB 당)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적당한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전학적 발현 작제물의 일부로서 제공된 경우 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
[0157] 프로모터의 비제한적인 예는 어얼리 또는 레이트 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 어얼리 또는 레이트 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 이메디에이트 어얼리 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 어얼리 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터, GADPH 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 및 연결된(concatenated) 반응 요소 프로모터들, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터들 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 (phorbol) 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 부근의 반응 요소 프로모터들 (tre)를 포함한다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank®에 기재된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터, 승인 번호 X05244, 뉴클레오타이드 283-341) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 가용한)를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 프로모터이지만 치료학적 유전자의 발현을 구동시키기 위해 유용한 임의의 다른 프로모터는 본원 개시내용의 수행에 적용될 수 있다.
[0158] 특정 양상에서, 본원 개시내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키고 시스로 작용하고 이들의 배향과 무관하에 심지어 보다 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수킬로베이스까지 이격되어 있는)에서 작용할 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 이들이 또한 소정의 프로모터에 근접하여 기능할 수 있으므로 필수적으로 상기 긴 거리에 제한되지 않는다.
3. 개시 신호 및 연계된 발현
[0159] 특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 본원의 개시내용에 제공된 발현 작제물에 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. 외인성 해독 제어 신호는 ATG 개시 코돈을 포함하고 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 “인 프레임”으로 있어야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 해독 제어 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소들의 내포에 의해 증진될 수 있다.
[0160] 특정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소들을 사용하여 다중유전자, 또는 폴리시스트론, 메시지를 생성한다. IRES 요소들은 5’ 메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다. 피코나바이러스 패밀리의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌척수심근염)으로부터의 IRES 요소들은 개시되어 있고, 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 기재되어 있다. IRES 요소들은 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고 각각은 IRES에 의해 분리되어 있고 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 해독을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다.
[0161] 본원의 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이, 특정 2A 서열 요소들을 사용하여 본원의 개시내용에 제공된 작제물 내 유전자들의 연결되거나 공동 발현을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 절단 서열을 사용하여 단일 시스트론을 형성하기 위해 개방 판독 프레임들을 연결시킴에 의해 유전자들을 공동 발현시킬 수 있다. 예시적인 절단 서열은 말 비염 A 바이러스(E2A) 또는 F2A(수족구 질환 바이러스 2A) 또는 "2A-유사" 서열(예를 들어, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A; T2A) 또는 돼지 테스코바이러스-1(P2A))이다. 특정 구현예에서, 단일 벡터에서 다수의 2A 서열은 동일하지 않지만, 대안적 구현예에서 동일한 벡터는 동일한 2A 서열 중 2개 이상을 사용한다. 2A 서열의 예는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 US 2011/0065779에 제공된다.
4. 복제 오리진
[0162] 숙주 세포 내 벡터를 증가시키기 위해, 하나 이상의 복제 오리진 부위 (흔히 “ori”로 칭함), 예를 들어, 상기된 바와 같이 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖고, 유전학적으로 가공된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기된 바와 같이 다른 염색체외 복제 바이러스의 복제 오리진 또는 자발적으로 복제하는 서열 (ARS)가 사용될 수 있다.
5. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
[0163] 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 CD5-표적화 수용체 작제물을 포함하는 NK 세포는 발현 벡터 내 마커를 포함시킴에 의해 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 상기 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 하는 세포에 동정가능한 변화를 부여한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 성질을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 마커이고 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 차단시키는 마커이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
[0164] 일반적으로, 약물 선택 마커의 내포는 형질전환체의 클로닝 및 동정을 원조하고, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 수행을 기반으로 하는 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가로, 스크리닝가능한 마커, 예를 들어, 이의 기반이 비색 분석인 GFP를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 능히 FACS 분석과 연계된 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있다. 사용되는 마커는 이것이 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 공동 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 사료되지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
B. 다중시스트론 벡터
[0165] 특정 구현예에서, CD5-표적화 수용체, 임의의 자살 유전자, 임의의 사이토킨, 및/또는 임의의 치료학적 유전자는 다중시스트론 벡터로부터 발현된다(본원에서 사용된 용어 "시스트론"은 유전자 생성물이 이로부터 생성될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다). 특정 구현예에서, 다중시스트론 벡터는 CD5-표적화 수용체, 자살 유전자, 및 적어도 하나의 사이토킨, 및/또는 가공된 수용체, 예를 들어, T-세포 수용체 및/또는 추가의 비-CD5-표적화 CAR을 암호화한다. 일부 경우에, 다중시스트론 벡터는 적어도 하나의 CD5-표적화 CAR, 적어도 하나의 TNF-알파 돌연변이체, 및 적어도 하나의 사이토킨을 암호화한다. 사이토킨은 사람 또는 마우스 또는 임의의 종과 같은 특정 유형의 사이토킨일 수 있다. 특정 경우에, 사이토킨은 IL15, IL12, IL2, IL18, 및/또는 IL21이다.
[0166] 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 실질적으로 동일한 수준에서 다중 시스트론을 발현하는 능력을 갖는 폴리시스트론 벡터를 사용하는 가요성 모듈식 시스템을 제공한다(여기에서 사용된 용어 "모듈식"은 예를 들어, 표준 재조합 기술을 사용함에 의해 각각 전체 시스트론 또는 시스트론의 성분의 제거 및 대체에 의해 이의 상호교환성을 가능하게 하는 시스트론 또는 시스트론의 성분을 지칭한다). 시스템은 다수의 유전자의 조합 발현(과발현 포함)을 허용하는 세포 가공을 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 벡터에 의해 발현되는 유전자 중 하나 이상은 1개, 2개 또는 그 이상의 항원 수용체를 포함한다. 다중 유전자는 CAR, TCR, 사이토킨, 케모킨, 귀소 수용체, CRISPR/Cas9-매개 유전자 돌연변이, 유인 수용체, 사이토킨 수용체, 키메라 사이토킨 수용체 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 추가로 포함할 수 있다: (1) 하나 이상의 리포터, 예를 들어 세포 검정 및 동물 영상화를 위한 형광 또는 효소 리포터; (2) 하나 이상의 사이토킨 또는 다른 신호전달 분자; 및/또는 (3) 자살 유전자.
[0167] 특정 경우에, 벡터는 2A 절단 부위와 같은 임의의 종류의 절단 부위에 의해 분리된 적어도 4개의 시스트론을 포함할 수 있다. 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV 또는 MMLV)-기반일 수 있거나 아닐 수 있고 이는 pUC19 골격 내 psi 팩키징 서열을 갖는 3’ 및 5’ LTR을 포함한다. 벡터는 유전자 스와핑(swapping)을 위해 3개 이상의 2A 절단 부위 및 다중 ORF를 갖는 4개 이상의 시스트론을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 서브클로닝을 통한 신속한 통합을 위해 제한 부위(들)에 의해 플랭킹된 다중 유전자 (7개 이상)의 조합적 과발현을 가능하게 하고, 상기 시스템은 또한 일부 구현예에서 적어도 3개의 2A-절단 부위를 포함한다. 따라서, 상기 시스템은 다중 CAR, TCR, 신호전달 분자, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 및/또는 귀소(homing) 수용체의 발현을 가능하게 한다. 상기 시스템은 또한 다른 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있고, 이는 렌티바이러스, 아데노바이러스 AAV, 및 비-바이러스 플라스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0168] 시스템의 모듈식 성질은 또한 신속한 시험과 같이 폴리시스트론 발현 벡터의 4개 시스트론 각각에 유전자를 효율적으로 서브클로닝하고 유전자 스와핑을 가능하게 한다. 폴리시스트론 발현 벡터에 전략적으로 위치한 제한 부위는 효율적인 유전자의 스와핑을 가능하게 한다.
[0169] 본원 개시내용의 구현예는 폴리시스트론 벡터를 사용하는 시스템을 포함하고, 여기서 벡터의 적어도 일부는 예를 들어 벡터의 모듈식 사용을 용이하게 하기 위해 실체(identity) 및 위치가 특이적으로 선택된 하나 이상의 제한 효소 부위를 사용함에 의해 하나 이상의 시스트론 (또는 하나 이상의 시스트론의 성분(들)의 제거 및 대체를 가능하게 함에 의한 모듈식이다. 벡터는 또한 다수의 시스트론이 단일 폴리펩타이드로 해독되고 별도의 폴리펩타이드로 가공됨으로써 벡터가 실질적으로 등몰 농도로 별개의 유전자 생성물을 발현하는 이점을 부여하는 구현예를 갖는다.
[0170] 본원 개시내용의 벡터는 벡터의 하나 이상의 시스트론을 변화시키고/시키거나 하나 이상의 특정 시스트론의 하나 이상의 성분을 변화시킬 수 있도록 하는 모듈성을 위해 구성된다. 벡터는 하나 이상의 시스트론의 말단을 플랭킹하고/하거나 특정 시스트론의 하나 이상의 성분의 말단을 플랭킹하는 독특한 제한 효소 부위를 사용하도록 디자인될 수 있다.
[0171] 본원 개시내용의 구현예는 각각 하나 이상의 제한 효소 부위에 의해 플랭킹된 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 시스트론을 포함하는 폴리시스트론 벡터를 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 시스트론은 적어도 하나의 항원 수용체를 암호화한다. 일부 경우에, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 시스트론은 단일 폴리펩타이드로 해독되어 별도의 폴리펩타이드로 절단되는 반면, 다른 경우에는 다수의 시스트론이 단일 폴리펩타이드로 해독되어 별도의 폴리펩타이드로 절단된다. 벡터 상에 인접한 시스트론은 자가 절단 부위, 예를 들어, 2A 자가 절단 부위에 의해 분리될 수 있다. 일부 경우에, 시스트론 각각은 벡터로부터 별도의 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 경우에, 벡터 상에 인접한 시스트론은 IRES 요소에 의해 분리되어 있다.
[0172] 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 예를 들어, 1개, 2개 또는 그 이상의 항원 수용체를 포함할 수 있는 다중 시스트론의 과발현을 포함하는 조합 발현을 가능하게 하는 세포 가공을 위한 시스템을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리시스트론 벡터의 사용은 벡터가 동일한 mRNA로부터 등몰 수준의 다중 유전자 생성물을 생성하도록 한다. 다중 유전자는 CAR, TCR, 사이토킨, 케모킨, 귀소 수용체, CRISPR/Cas9-매개 유전자 돌연변이, 유인 수용체, 사이토킨 수용체, 키메라 사이토킨 수용체 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 추가로 예를 들어, 세포 검정 및 동물 이미지화를 위한 하나 이상의 형광성 또는 효소 리포터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 이들이 더 이상 필요하지 않거나 이들이 제공된 숙주에 유해하게 될 때 벡터를 보유하는 세포의 종결을 위한 자살 유전자 생성물을 포함할 수 있다.
[0173] 특정 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스 벡터) 또는 비-바이러스 벡터이다. 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 5’ LTR, 3’ LTR, 및/또는 psi 팩키징 요소를 포함할 수 있다. 특정 경우에, psi 팩키징은 5’ LTR과 항원 수용체 암호화 서열 사이에 혼입된다. 벡터는 pUC19 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 벡터의 일부 양상에서, 적어도 하나의 시스트론은 사이토킨(예를 들어, 인터류킨 15 (IL-15), IL-7, IL-21, IL-18, IL-12, 또는 IL-2), 케모킨, 사이토킨 수용체 및/또는 귀소 수용체를 암호화한다.
[0174] 2A 절단 부위가 벡터에서 이용되는 경우, 2A 절단 부위는 P2A, T2A, E2A 및/또는 F2A 부위를 포함할 수 있다.
[0175] 제한 효소 부위는 임의의 종류일 수 있고, 이의 인지 부위에 임의의 수의 염기, 예를 들어 4 내지 8개 염기를 포함할 수 있고; 인지 부위의 염기 수는 적어도 4, 5, 6, 7, 8개 이상일 수 있다. 절단되는 경우 상기 부위는 평활 절단 또는 접착 (sticky) 말단을 생성할 수 있다. 제한 효소는 예를 들어, I형, II형, III형, 또는 IV형일 수 있다. 제한 효소 부위는 가용한 데이터베이스, 예를 들어, 통합 관계 효소 데이터베이스 (IntEnz) 또는 BRENDA (포괄적 효소 정보 시스템)으로부터 수득될 수 있다.
[0176] 예시적인 벡터는 원형일 수 있고 관례에 따라 여기서, 위치 1(원의 상단에서 12시 위치, 서열의 나머지는 시계 방향으로)은 5' LTR의 시작 부분에 설정된다.
[0177] 자가 절단 2A 펩타이드가 사용되는 구현예에서, 2A 펩타이드는 진핵 세포에서 해독 동안 폴리펩타이드의 "절단"을 매개하는 18 내지 22개의 아미노산(aa) 길이의 바이러스 올리고펩타이드일 수 있다. "2A"라는 명칭은 바이러스 게놈의 특정 영역을 언급하고, 상이한 바이러스 2A는 일반적으로 이들이 파생된 바이러스의 이름을 따서 명명되었다. 최초로 발견된 2A 는 F2A(구제역 바이러스 ) 이고, 그 후 E2A(말 비염 A 바이러스 ), P2A(돼지 테스코바이러스-1 2A ), T2A( 토세아 아시냐 바이러스 2A )도 확인되었다. 2A 매개 "자가-절단"의 기전은 2A의 C-말단에서 글리실-프롤릴 펩타이드 결합의 형성을 건너뛰는 리보솜인 것으로 밝혀졌다.
[0178] 특정 경우에, 벡터는 γ-레트로바이러스 전달 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 전달 벡터는 pUC19 플라스미드(HindIII와 EcoRI 제한 효소 부위 사이의 큰 단편(2.63kb))와 같은 플라스미드를 기반으로 하는 골격을 포함할 수 있다. 골격은 5' LTR, psi 팩키징 서열 및 3' LTR을 포함하는 MoMLV(몰로니 뮤린 백혈병 바이러스) 기원의 바이러스 성분을 함유할 수 있다. LTR은 레트로바이러스 프로바이러스의 어느 한 말단상에서 발견되는 긴 말단 반복체이고, 전달 벡터의 경우 CD5 표적화 CAR 및 관련 성분과 같은 관심 대상 유전자 카고를 포함한다. 뉴클레오캡시드에 의한 팩키징에 대한 표적 부위인 psi 팩키징 서열도 5' LTR과 CAR 암호화 서열 사이에 샌드위치된 시스로 혼입된다. 따라서, 전달 벡터의 하나의 예의 기본 구조는 pUC19 서열 - 5' LTR - psi 팩키징 서열 - 관심 대상 유전자 카고 - 3' LTR - pUC19 서열과 같이 구성될 수 있다. 상기 시스템은 또한 다른 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있고, 이는 렌티바이러스, 아데노바이러스 AAV, 및 비-바이러스 플라스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
V. 세포
[0179] 본원 개시내용은 CD5-표적화 수용체를 암호화하고 또한 적어도 하나의 사이토킨 및/또는 적어도 하나의 자살 유전자를 암호화할 수 있는 적어도 하나의 벡터를 보유하는 임의의 종류의 면역 세포 또는 줄기 세포를 포함한다. 일부 경우에, 상이한 벡터가 CAR을 암호화하고, 자살 유전자 및/또는 사이토킨을 암호화한다. NK 세포를 포함하는 면역 세포는 제대혈(다중 공급원으로부터 풀링된 제대혈), 말초 혈액, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포(HSC), 골수 또는 이들의 혼합물로부터 유래될 수 있다. NK 세포는 예를 들어 NK-92 세포와 같은 세포주로부터 유래할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. NK 세포는 제대혈 단핵 세포, 예를 들어, CD56+ NK 세포일 수 있다.
[0180] 본원 개시내용은 통상적인 T 세포, 감마-델타 T 세포, NKT 및 불변 NK T 세포, 조절 T 세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 중간엽 기질 세포(MSC), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 종류의 면역 또는 기타 세포를 포괄한다.
[0181] 일부 경우에, 세포는 임의의 적합한 비율을 포함하여 유효량의 범용 항원 제공 세포(Universal Antigen Presenting Cell(UAPC))의 존재 하에 확장되었다. 세포는 예를 들어, 1:2의 비율을 포함하는, 10:1 내지 1:10; 9:1 내지 1:9; 8:1 내지 1:8; 7:1 내지 1:7; 6:1 내지 1:6; 5:1 내지 1:5; 4:1 내지 1:4; 3:1 내지 1:3; 2:1 내지 1:2; 또는 1:1의 비율로 UAPC와 함께 배양될 수 있다. 일부 경우에, NK 세포는 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-50, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-500, 200-400, 200-300, 300-500, 300-400, 또는 400-500 U/mL의 농도에서와 같이 IL-2의 존재하에 확장시켰다.
[0182] 벡터(들)를 사용한 유전학적 변형 후, NK 세포는 즉시 주입되거나 저장될 수 있다. 특정 양상에서, 유전학적 변형 후, 상기 세포는 세포로의 유전자 전달 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내에 벌크 집단으로서 수일. 수주 또는 수개월 동안 생체외 증식시킬 수 있다. 추가의 양상에서, 형질감염체를 클로닝하고 단일 통합되거나 에피좀으로 유지되는 발현 카세트 또는 플라스미드 및 CD5-표적화 CAR의 발현의 존재를 입증하는 클론을 생체외 확장시킨다. 확장을 위해 선택된 클론은 CD5 발현 표적 세포를 특이적으로 인지하고 용해시키는 능력을 입증한다. 재조합 면역 세포는 IL-2 또는 통상의 감마-쇄에 결합하는 다른 사이토킨 (예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23 등)으로 자극에 의해 확장될 수 있다. 재조합 면역 세포는 인공 항원 제공 세포를 사용한 자극에 의해 확장될 수 있다. 추가의 양상에서, 유전학적으로 변형된 세포는 냉동보존시킬 수 있다.
[0183] 본원 개시내용의 구현예는 본원에 포함된 바와 같은 하나 이상의 CD5-표적화 CAR 및 하나 이상의 자살 유전자를 발현하는 세포를 포함한다. NK 세포는 특정 구현예에서 하나 이상의 CD5-표적화 CAR 및 하나 이상의 가공된 비분비성 막 결합 TNF-알파 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 CD5-표적화 CAR 및 TNF-알파 돌연변이체 폴리펩타이드를 발현하는 것 외에, 세포는 또한 하나 이상의 치료학적 유전자 생성물을 암호화하는 핵산을 포함한다.
[0184] 세포는 개체로부터 직접 수득될 수 있거나 보관소 또는 기타 저장 시설에서 수득될 수 있다. 치료요법으로서의 세포는 세포가 치료요법으로서 제공되는 개체에 대해 자가 또는 동종이계일 수 있다.
[0185] 세포는 의학적 병태에 대한 치료요법을 필요로 하는 개체로부터 기원할 수 있고, CD5-표적화 CAR, 임의의 자살 유전자, 임의의 사이토킨(들) 및 임의의 치료학적 유전자 생성물(들)을 발현하기 위한 이들의 조작 후(예를 들어, 입양 세포 치료요법을 위한 형질도입 및 확장을 위한 표준 기술 사용), 이들은 원래 공급이었던 개체에게 다시 제공될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 개체 또는 또 다른 개체에 이후 사용을 위해 저장된다.
[0186] 면역 세포는 세포 집단에 포함될 수 있고, 그 집단은 하나 이상의 CD5-표적화 수용체 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨으로 형질도입된 다수를 가질 수 있다. 세포 집단은 하나 이상의 CD5-표적화 수용체 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨이 형질도입된 면역 세포의 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%를 포함할 수 있다. 하나 이상의 CD5-표적화 수용체 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨은 별도의 폴리펩타이드일 수 있다.
[0187] 면역 세포는 특정 목적과 관련하여 모듈식이될 의도로 하나 이상의 CD5-표적화 수용체 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상업적 유통을 위해 CD5-표적화 CAR 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨을 발현하는(또는 후속 형질도입을 위해 돌연변이체를 암호화하는 핵산과 함께 유통되는) 세포가 생성될 수 있고, 사용자는 의도된 목적(들)에 따라 하나 이상의 다른 관심 대상 유전자(치료학적 유전자 포함)를 발현하도록 이들을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, CD5-양성 암을 포함한 CD5-양성 세포 치료에 관심이 있는 개체는 자살 유전자-발현 세포(또는 이종 사이토킨-발현 세포)를 수득하거나 생성할 수 있고, CD5-특이적 scFv를 포함하는 수용체를 발현하도록 이들을 변형시킬 수 있거나, 그 반대일 수 있다.
[0188] 특정 구현예에서, NK 세포가 이용되고, 하나 이상의 CD5-표적화 CAR 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨을 발현하는 형질도입된 NK 세포의 게놈은 변형될 수 있다. 게놈은 임의의 방식으로 변형될 수 있지만, 특정 구현예에서 게놈은 예를 들어 CRISPR 유전자 편집에 의해 변형된다. 세포의 게놈을 변형시켜 임의의 목적을 위해 세포의 효과를 증진시킬 수 있다.
VI. CD5-특이적 CAR 세포의 유전자 편집
[0189] 특정 구현예에서, 적어도 CD5-특이적 가공된 수용체를 포함하는 세포는 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 변형시키도록 유전자 편집된다. 특정 경우에, CD5-특이적 CAR 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 억제(녹아웃으로 지칭될 수 있음)를 포함하여, 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 수준의 발현을 갖도록 변형된다. 상기 세포는 확장될 수 있거나 확장될 수 없다.
[0190] 특정 경우에, CD5-특이적 CAR 세포의 하나 이상의 내인성 유전자는 변형되고, 예를 들어, 발현이 중단되어 상기 발현이 부분적으로 감소되거나 완전히 감소된다. 특정 경우에, 하나 이상의 유전자들은 본원 개시내용의 공정을 사용하여 녹다운되거나 녹아웃된다. 특정 경우에, 다중 유전자는 녹다운되거나 녹아웃되고, 이것은 이들의 생성에서 동일한 단계로 수행되거나 수행되지 않을 수 있다. CD5-특이적 CAR 세포에서 편집되는 유전자는 임의의 종류일 수 있지만, 특정 구현예에서 유전자는 이의 유전자 생성물이 CD5-특이적 CAR NK 세포, 예를 들어, 하나의 예로서 제대혈로부터 유래된 것들을 포함하는 CD5-특이적 CAR 세포의 활성 및/또는 증식을 억제하는 유전자이다. 특정 경우에 CD5 특이적 CAR 세포에서 편집된 유전자는 CD5 특이적 CAR 세포가 종양 미세 환경에서 보다 효과적으로 작동하도록 한다. 특정 경우에, 유전자는 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, CD38, CREM, IL10R, CD5, 및 CD7 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, TGFBR2 유전자는 CD5-특이적 CAR 세포에서 녹아웃되거나 녹다운된다.
[0191] 일부 구현예에서, 유전자 편집은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN)를 통한 변경과 같은, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 변경은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-연합 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있고; 일부 구현예에서, CpF1이 Cas9 대신 사용된다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 총체적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-쌍(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “직접적인 반복체” 및 tracrRNA-가공된 부분 직접적인 반복체), 가이드 서열(또한, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “스페이서”로서 언급되는)), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연합 (“Cas”) 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소들을 언급한다.
[0192] CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 뉴클레아제 기능 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)과 함께 DNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)에 서열 특이적으로 결합하는 비-암호화 RNA 분자(가이드) RNA를 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 예를 들어, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[0193] 일부 양상에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함하는)는 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5’ 말단에서 표적 부위는 Cas 뉴클레아제를 상보성 염기 쌍형성을 사용하여 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화시킨다. 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 5’ 위치를 기준으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴에 의해 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소들에 의해 특징화된다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 언급하고, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 완전한 상보성은 필수적으로 요구되지 않고, 단, 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다.
[0194] CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)에 이어서 본원에 논의된 바와 같은 파괴 또는 변경을 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, “닉카제”로 간주되는 Cas9 변이체를 사용하여 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nick)한다. 쌍 형성 닉카제를 사용하여, 예를 들어, 각각 닉의 동시 도입시, 5’오버행이 도입되도록 하는 한쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시되는 특이성을 개선시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 촉매적 불활성 Cas9는 전사 리프레서 또는 활성화인자와 같은 이종성 이펙터 도메인에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
[0195] 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에, 예를 들어, 세포의 기관 내 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 언급된다. 일부 양상에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 언급될 수 있다. 일부 양상에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[0196] 전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함하는)의 형성은 표적 서열에서 또는 이의 부근에서 (예를 들어, 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내) 하나의 가닥 또는 가닥 둘다의 절단을 유도한다. 야생형 tracr 서열 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 이상의 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한 예를 들어, tracr 서열의 적어도 일부를 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 쌍 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화함에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 관여하는 tracr 쌍 서열에 충분한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬되는 경우 tracr 쌍 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
[0197] CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터는 세포에 도입되어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISRR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 성분들은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-쌍 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상에 별도의 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현되는 2개 이상의 요소들은 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분들을 제공하는 하나 이상의 추가의 벡터와 함께 단일 벡터에 조합될 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열 (또한 “클로닝 부위”로서 언급되는)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소들의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물은 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
[0198] 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 효소-암호화 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지된), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버젼을 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있고; 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 Q99ZW2하에 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
[0199] CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 또는 에스. 뉴모니아(S. pneumonia)로부터)일 수 있다. 일부 경우에, CpF1은 Cas9 대신 엔도뉴클레아제로서 사용될 수 있다. CRISPR 효소는 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내, 표적 서열의 위치에서 가닥 하나 또는 가닥 둘다의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여 상기 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥 하나 또는 가닥 둘다를 절단하는 능력이 부재일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트 대 알라닌 치환 (D10A)은 가닥 둘다를 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단하는)로 Cas9를 전환시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 가이드 서열(들), 예를 들어, 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조합은 가닥 둘다를 닉킹하도록 하고 NHEJ 또는 HDR을 유도하기 위해 사용된다.
[0200] 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 특정 세포에서, 예를 들어, 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 진핵 세포는 특정 유기체, 예를 들어, 사람, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 비-사람 영장류를 포함하는 포유동물의 세포이거나 이들로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 고유 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 흔하게 또는 가능 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함에 의해 관심 대상의 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 언급한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 용법에서의 차이)은 흔히 전령 RNA (mRNA)의 해독 효율과 상호관련되고, 이는 이어서 무엇 보다 해독될 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 사료된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자들은 코돈 최적화를 기준으로 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
[0201] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분히 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우 약 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%이상이다.
[0202] 최적의 정렬은 서열을 정렬시키기위한 임의의 적합한 알고리듬을 사용하여 결정될 수 있고 상기 알고리즘의 비제한적인 예는 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform)을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, 버로우 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner), 클러스탈 더블유 (Clustal W), 클러스탈 엑스(Clustal X), BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 가용한), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 가용한)를 포함한다.
[0203] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안(cyan) 형광성 단백질 (CFP), 황색 형광성 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP 16 단백질 융합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참조로 인용된 US 20110059502에 기재되어 있다.
VII. 치료 방법
[0204] 다양한 구현예에서, 이들의 표면 상에 내인성 CD5를 발현하는 환부 세포 또는 기타 세포는 의학적 병태를 갖는 개체에서 의학적 상태를 개선할 목적으로 또는 개체에서 의학적 병태의 위험을 감소시키거나 중증도 및/또는 발병을 지연시킬 목적으로 표적화된다. 특정 경우에, 내인성 CD5를 발현하는 암 세포는 암 세포를 사멸시킬 목적으로 표적화된다.
[0205] 본원에서 고려되는 바와 같은 CD5-표적화 CAR 작제물, 핵산 서열, 벡터, 면역 세포 등, 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 종양성 질환과 같은 암성 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 예를 들어 CD5을 발현하고 고형 종양일 수 있거나 아닐 수 있는 암을 비롯한 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 특히 유용할 수 있다.
[0206] CD5-표적화 수용체가 활용되는 면역 세포는 NK, T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 NKT 또는 불변 NKT(iNKT), 또는 특정 구현예에서, 포유류에 대한 세포 치료요법을 위해 가공된 불변 NKT 세포일 수 있다. 세포가 NK 세포인 상기 경우에, NK 세포 치료요법은 임의의 종류의 것일 수 있고, NK 세포는 임의의 종류의 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 CD5-표적화 CAR 및/또는 하나 이상의 자살 유전자 및/또는 하나 이상의 사이토킨을 발현하도록 가공된 NK 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 CD5-표적화 CAR로 형질도입된 NK 세포이다.
[0207] 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 단독으로 또는 표준 벡터 및/또는 유전자 전달 시스템을 사용하고 적어도 일부 양상에서 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 임의의 조합으로 투여될 수 있는 CD5 CAR-발현 세포, CD5 표적화 CAR 작제물, CD5-표적화 CAR 핵산 분자 및 CD5-표적화 CAR 벡터를 부분적으로 고려한다. 특정 구현예에서, 투여에 이어서 핵산 분자 또는 벡터는 대상체의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다.
[0208] 특정 구현예에서, 특정 세포 또는 조직에 대해 특이적이고 NK 세포에서 지속적으로 존재하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 본원 개시내용에 따라 제조되는 조성물은 상기 동정된 질환의 예방, 치료 또는 지연을 위해 사용될 수 있다.
[0209] 추가로, 본원의 개시내용은 종양 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에서 고려되고/되거나 본원에서 고려된 바와 같은 공정에 의해 생성되는 CD5-표적화 CAR, 핵산 서열, 벡터를 발현하는 유효량의 세포를 이를 필요로 하는 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
[0210] 예시적인 CD5-표적화 CAR 세포의 조성물(들)의 투여를 위해 가능한 적응증은 예를 들어, B 세포 악성종양, 다발성 골수종, 유방암, 교모세포종, 신장암, 췌장암 또는 폐암을 포함하는 종양성 질환을 포함하는 암성 질환이다. CD5-표적화 CAR 세포의 조성물(들) 투여에 대한 예시적인 적응증은 CD5를 발현하는 임의의 악성 종양을 포함하는 암성 질환이다. 본원 개시내용의 조성물(들)의 투여는 예를 들어, 최소 잔류 질환, 조기 암, 진행성 암 및/또는 전이성 암 및/또는 불응성 암을 포함하는 암의 모든 병기(I, II, III, 또는 IV) 및 유형을 위해 유용하다.
[0211] 본원 개시내용은 다른 화합물, 예를 들어, 이중특이성 항체 작제물, 표적화된 독소 또는 면역 세포를 통해 작용하는 기타 화합물과의 공동 투여 프로토콜을 추가로 포함한다. 본 발명의 화합물(들)의 공동-투여를 위한 임상 용법은 동시에, 다른 성분의 투여 전 또는 후에 공동-투여를 포함할 수 있다. 특정 조합 치료요법은 화학치료요법, 방사선 조사, 수술, 호르몬 치료요법 또는 다른 유형의 면역치료요법을 포함한다.
[0212] 구현예는 본원에 정의된 바와 같은 CD5-표적화 CAR 작제물, 본원에 정의된 바와 같은 핵산 서열, 본원에 정의된 바와 같은 벡터 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한 본원 개시내용의 키트는 단독으로 또는 의학적 치료 또는 개입을 필요로 하는 개체에게 투여될 추가 의약과 조합하여 상기 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 것으로 고려된다.
A. 약제학적 조성물
[0213] 또한, 본원에서는 NK 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다. 형질도입된 세포는 개체로의 이동에 적합한 배지 및/또는 개체로의 전달 전을 포함하는 동결보존과 같은 보존에 적합한 배지에 포함될 수 있다.
[0214] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 세포)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 사이의 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 -활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP, 및 rHuPH20을 포함하는 사용 방법은 미국 특허 공개 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 조합된다.
B. 조합 치료요법
[0215] 특정 구현예에서, 본원 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 치료요법과 조합된 면역 세포 집단(NK 세포 집단을 포함하는)을 포함한다. 추가의 치료요법은 방사선 치료요법, 수술 (예를 들어, 종괴절제술 및 유방절제술), 화학치료요법, 유전자 치료요법, DNA 치료요법, 바이러스 치료요법, RNA 치료요법, 면역치료요법, 골수 이식, 나노치료요법, 모노클로날 항체 치료요법, 호르몬 치료요법, 암용해 바이러스 또는 이전의 치료 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 보조제 또는 신규보조제 치료요법 형태일 수 있다.
[0216] 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 소분자 효소 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 부작용 제한 제제 (예를 들어, 항오심 제제 등과 같은 치료의 부작용의 발병 및/또는 중증도를 감소시키는 것으로 의도된 제제)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법과 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료요법은 감마 방사선 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 PBK/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제, 및/또는 화학예방제를 표적화하는 치료요법이다. 추가의 치료요법은 당업계에 공지된 하나 이상의 화학치료학적 제제일 수 있다.
[0217] 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 본 발명의 세포 치료요법 이외에, 개체는 수술, 방사선 조사, 면역 치료요법(본원 개시내용의 세포 치료요법 외), 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법, 화학 치료요법 등을 포함하는 암에 대한 특정 추가 요법을 제공받았었거나, 제공받을 수 있거나, 제공받게 될 수 있다.
[0218] 면역 세포 치료요법은 추가의 암 치료요법과 관련하여, 치료요법 전, 치료요법 동안에, 치료요법 후 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 면역 세포 치료요법이 추가의 치료학적 제제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 당업자는 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 충분한 시기가 만료되지 않도록 보장하여 2개의 화합물은 여전히 환자에 대한 유리한 조합 효과를 발휘할 수 있다. 상기 경우에, 당업자는 환자에게 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 서로 약 12 내지 24 또는 72 h 내에, 보다 특히 서로 약 6-12 h 내에 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우, 치료를 위한 시기를 유의적으로 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
[0219] 다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 예시에 대해, 면역 세포 치료요법은 “A”이고 항암 치료요법은 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0220] 본 구현예의 임의의 화합물 또는 세포 치료요법의 환자로의 투여는 경우에 따라 제제의 독성을 고려하여 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 조합 치료요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
1. 화학치료요법
[0221] 광범위한 화학치료학적 제제는 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 “화학치료요법”은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 언급한다. “화학치료학적 제제”는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 이들이 세포 주기에 영향을 미칠지 및 어느 단계에서 영향을 미칠지와 같은 세포 내 이들의 활성 방식에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 가교결합시키거나 DNA에 삽입되거나 핵산 합성에 영향을 미침에 의해 염색체 및 유사분열 일탈을 유도하는 이의 능력을 기준으로 특징 분석될 수 있다.
[0222] 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드,트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 , KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감몰 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모프폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 이오니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 플라티늄 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체를 포함한다.
2. 방사선 치료요법
[0223] DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포의 직접적인 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려되고, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호), 및 UV-조사가 있다. 모든 이들 인자들은 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선에 대한 용량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
3. 면역치료요법
[0224] 당업자는 추가의 면역치료요법이 구현예의 방법과 조합하거나 연계하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료와 관련하여, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)은 그러한 예이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 이것은 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소) 등에 접합될 수 있고 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[0225] 항체-약물 접합체는 암 치료제의 개발을 위한 획기적 접근법인 것으로 나타났다. 암은 전세계 사망의 주요 원인 중 하나이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 모노클로날 항체 (Mab)를 포함한다. 상기 접근법은 이들의 항원 표적에 대한 고특이성의 Mab와 상당히 강력한 세포독성 약물을 조합하여 농축된 수준의 항원과 함께 페이로드 (약물)를 종양 세포에 전달하는 “무장된(armed)” Mab를 유도한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서 이의 노출을 최소화하여 감소된 독성 및 개선된 치료학적 지수를 유도한다. 2개의 ADC 약물로서 2011년에 FDA에 의해 승인된 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년에 FDA에 의해 승인된 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)은 상기 접근법을 검증하였다. 현재, 암 치료를 위한 임상 시험의 다양한 단계에서 30개 초과의 ADC 약물 후보물이 있다(문헌참조: Leal et al., 2014). 항체 조작 및 링커-페이로드 최적화가 보다 더 발전함에 따라서, 새로운 ADC의 발견 및 발전은 날로 상기 접근법 및 표적화 Mab의 생성에 적합한 새로운 표적의 동정 및 검증에 의존한다. ADC 표적을 위한 2개의 기준은 종양 세포에서 상향조절된/고수준의 발현 및 강력한 내재화이다.
[0226] 면역치료요법의 하나의 양상에서, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉, 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 임의의 이들 마커는 본 발명의 구현예와 관련하여 표적화를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역치료요법의 대안적 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함한다: 사이토킨, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모킨, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
[0227] 현재 연구중에 있거나 사용중에 있는 면역치료요법의 예는 면역 보조제, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(문헌참조: 미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토킨 치료요법, 예를 들어, 인터페론, 및 , IL-1, GM-CSF, 및 TNF (문헌참조: Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); 유전자 치료요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53 (문헌참조: Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185 (문헌참조: Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 치료요법은 본원에 기재된 항체 치료요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[0228] 일부 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 관문은 신호 (예를 들어, 동시 자극 분자)를 상향시키거나 신호를 하향시킨다. 면역 관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (또한 CD276로서 공지된), B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA), 세포독성 T-림프구-연합 단백질 4 (CTLA-4, 또한 CD152로서 공지된), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 서프레서(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
[0229] 면역 관문 억제제는 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체와 같은 약물일 수 있거나 특히 항체, 예를 들어, 사람 항체이다(문헌참조: 예를 들어, 국제 특허 공개 공보 WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012; 둘다는 본원에 참조로 인용된다). 면역 관문 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있고 특히 키메라화된, 사람화된 또는 사람 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 대안적 및/또는 균등한 명칭이 본원 개시내용에 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 상기 대안적 및/또는 균등한 명칭은 본원 개시내용과 관련하여 상호교환될 수 있다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적 및 균등한 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로 공지되어 있다.
[0230] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 이의 리간드 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 예시적인 항체는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 US8735553, US8354509, 및 US8008449에 기재되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 US20140294898, US2014022021, 및 US20110008369에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
[0231] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로서 공지된 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로서 또한 공지된 Ct-011은 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
[0232] 본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 공지된 세포독성 T-림프구-연합된 단백질 4 (CTLA-4)이다. 사람 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 승인 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되고 항원-제공 세포의 표면 상에 CD80 또는 CD86에 결합하는 경우 “오프” 스위치로서 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T-세포 동시 자극 단백질 CD28과 유사하고 분자 둘다는 각각 항원-제공 세포 상에서 B7-1 및 B7-2으로 불리우는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전송하는 반면 CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되고 이들의 기능을 위해 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 증가된 발현을 유도한다.
[0233] 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
[0234] 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-사람-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인지된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, US 8,119,129, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (또한 트레멜리무맙으로서 공지된 CP675,206; 이전에 티실리무맙), 미국 특허 제6,207,156호; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304)에 기재된 항-CTLA-4 항체가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 상기 언급된 공개 공보 각각의 교시는 참조로 인용된다. CTLA-4와 결합하는 것에 대해 임의의 당업계에 인지된 항체와 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람화된 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 WO2001014424, WO2000037504, 및 미국 특허 제8,017,114호에 기재되어 있고; 이 모두는 본원에 참조로 인용된다.
[0235] 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(또한 10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 Yervoy®로서 공지된) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다(문헌참조: 예를 들어, WO 01/14424). 다른 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 CTLA-4상의 동일한 항체에 결합하는 것에 경쟁하고/하거나 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.
[0236] CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 US5844905, US5885796 및 국제 특허 출원 WO1995001994 및 WO1998042752에 기재된 바와 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체, 및 본원에 참조로 인용된 미국 특허 US8329867에 기재된 바와 같은 면역어드헤신을 포함한다.
4. 수술
[0237] 암을 갖는 사람의 대략 60%는 동일한 유형의 수술을 진행하고 이는 예방적, 진단학적 또는 단계 결정, 치유적 및 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴된 절제술을 포함하고 본 발명의 구현예의 치료, 화학치료요법, 방사성 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모흐 수술(Mohs’surgery))을 포함한다.
[0238] 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제 시, 공동이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적인 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 사용한 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
5. 다른 제제
[0239] 다른 제제는 치료의 치료학적 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 추가의 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 접속부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식 억제 및 분화제, 세포 접착의 억제제, 과증식성 세포의 아폽토시스 유도제에 대한 민감성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접속부의 수를 상승시킴에 의한 세포내 신호전달의 증가는 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포증식억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착의 억제제는 본 구현예의 효능을 개선시키는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예는 병소 접착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 과증식성 세포의 아폽토시스에 대한 민감성을 증가시키는 다른 제제, 예를 들어, 항체 c225는 치료 효능을 개선하기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
VIII. 본 개시 내용의 키트
[0240] 본원에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 세포, 세포를 생성하기 위한 시약, 벡터, 및 벡터 및/또는 이의 성분을 생성하기 위한 시약이 키트에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, NK 세포는 키트에 포함될 수 있고, 이들은 CD5-표적화 수용체, 임의의 사이토킨, 또는 임의의 자살 유전자를 아직 발현하거나 발현하지 않을 수 있다. 이러한 키트는 세포 조작을 위한 하나 이상의 시약을 가질 수도 있고 없을 수도 있다. 상기 시약은 예를 들어 소분자, 단백질, 핵산, 항체, 완충액, 프라이머, 뉴클레오타이드, 염 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 하나 이상의 CD5 표적화 CAR, 자살 유전자 생성물 및/또는 사이토킨을 암호화하는 뉴클레오타이드가 키트에 포함될 수 있다. 사이토킨 또는 모노클로날 항체를 포함한 항체과 같은 단백질이 키트에 포함될 수 있다. 가공된 CAR 수용체의 성분들을 암호화하는 뉴클레오타이드는 키트에 포함될 수 있고 이는 상기 뉴클레오타이드를 생성하기 위한 시약을 포함한다.
[0241] 특정 양상에서, 키트는 본원 개시내용의 NK 세포 치료요법 및 또한 또 다른 암 치료요법을 포함한다. 일부 경우에, 키트는 세포 치료요법 구현예에 추가하여 예를 들어 화학치료요법, 호르몬 치료요법 및/또는 면역치료요법과 같은 제2 암 치료요법을 또한 포함한다. 키트(들)는 개체에 대한 특정 암에 맞춰질 수 있고 개체에 대한 각각의 2차 암 치료요법을 포함할 수 있다.
[0242] 키트는 본원 개시 내용의 적절하게 분취된 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 성분들은 수성 매질에 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다. 키트의 용기 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 구성성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 적어도 하나가 포함된다. 키트 내에 1개 초과의 성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 컨테이너들을 포함할 수 있다. 그러나, 성분들을 다양하게 조합하여 하나의 바이알에 포함시킬 수도 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 긴밀하게 밀폐된 상태로 조성물 및 임의의 다른 시약 컨테이너를 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 컨테이너들로는 목적하는 바이알들이 보유되는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다.
IX. 실시예
[0243] 하기 실시예는 본원 개시내용의 특정 비제한적 양상을 입증하기 위해 포함된다. 후속 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 수행에서 잘 기능하는 것으로 본원 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것으로 당업자는 인지해야 한다. 그러나, 당업자는 본원의 개시내용의 측면에서, 기재된 주요 요지에서 많은 변화가 만들어 질 수 있고 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 인지해야 한다.
실시예 1
DAP10 동시 자극은 제대혈 유래 CAR-NK 세포를 표적화하는 CD5에 기억과 유사한 기능을 부여한다.
[0244] 본원의 실시예는 CD5+ 암세포 치료를 위한 입양 세포 치료요법에 사용하기 위한 다양한 CD5 키메라 항원 수용체(CAR) 관련 작제물의 분석에 관한 것이다.
[0245] CD5 CAR-NK 세포의 디자인에서 T-세포 중심 동시 자극 도메인 CD28 또는 4-1BB를 시험한다. CAR 작제물에서 동시 자극 도메인으로서 CD28 또는 4-1BB를 혼입하는 CD5 CAR-NK 세포의 효능을 특징 분석하였다. CD28 또는 4-1BB 동시 자극 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인, 사이토킨으로서 IL-15를 가진 CD5 항원에 대해 지시된 scFv를 가진 2개의 CD5 CAR 작제물을 생산하여 생체 내 증식 및 지속성을 향상시켰다(도 1a). 제대혈(CB) 유래 NK 세포는 이들 작제물로 성공적으로 형질도입되었고(도 1b), 동족살해의 증거 없이 양호한 증식을 입증하였다(도 1c). 이들 CD5 CAR-NK 세포는 또한 CD5+ T세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL) 세포주인 CCRF-CEM에 대해 비형질도입(NT)된 NK 세포에 비해 증진된 사이토킨 생성(IFNγ, TNFα), 탈과립화(CD107a) 및 세포 독성을 입증하였다(도 1. d,e). T-ALL의 생체내 마우스 모델에서, 반딧불이루시퍼라제 (CCRF-CEM-FFluc)가 형질도입되고 CD5-CD28-CD3ζ-IL-15 또는 CD5-41BB-CD3ζ-IL-15 CAR-NK 세포로 처리된 CCRF-CEM이 생착된 마우스는 종양이 단독으로 생착된 마우스 또는 종양이 생착되고 NT NK 세포로 처리된 마우스와 비교하여 개선된 종양 제어 및 생존을 보여주었으나(도 1f-1h), 모든 마우스는 결국 종양에 굴복하였다.
[0246] CD5 CAR-NK 세포의 시험관 내 기능에서 NK 관련 동시 자극 도메인의 역할을 평가한다. CD28과 4-1BB가 T세포 중심 동시 자극 도메인이고 CD28이 가공되지 않은 NK 세포에서는 발현되지 않는다는 사실을 고려할 때, NK 세포 생물학 및 신호 전달과 더 관련이 있는 동시자극 분자를 혼입하면 특정 구현예에서 CD5 CAR-NK 세포의 효능을 향상시킬 것으로 고려되었다. 3개의 추가의 레트로바이러스 작제물을 디자인하였고; 작제물은 생체내 지속성 및 증식을 증진시키기 위해 공통으로 CD5, CD28 막관통 (TM) 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 사이토킨으로서 IL-15에 대해 동일한 scFv를 가졌지만 동시 자극 도메인(NKG2D 대 DAP10 대 DAP12)에는 차이가 있었다(도 2a). DAP10 및 DAP12 동시 자극 도메인을 갖는 작제물의 경우, DAP10 및 DAP12 TM 도메인을 갖는 디자인이 또한 포함되었다(도 2a). 동시 자극 도메인이 포함되지 않은 1세대 CAR 작제물을 음성 대조군으로 사용하여 CAR-NK 세포의 기능에서 동시 자극의 역할을 분석하였다. CD5-CD28-CD3ζ-IL-15 CAR-NK 세포는 CD5+ T-ALL 표적에 대한 시험관 내 및 생체 내 효능을 입증했기 때문에 T세포 중심 동시 자극의 양성 대조군으로 사용되었다. 감염의 다중성(MOI)을 조정하여 시험한 모든 작제물에 대해 유사한 형질도입 효율(50-60%)을 수득하였다(도 2b). 다양한 CD5 CAR-NK 세포의 증식은 확장 프로토콜이 이전에 기재된 바와 같이 범용 항원 제공 세포 (uAPCs) 및 IL-2를 포함하고 있기 때문에 시험관내 매우 유사하였고,12 이들의 가공과는 상관 없이 NK 세포의 증식을 최적화한다(도 2c). CAR 디자인과 상관없이 모든 CD5 CAR-NK 세포는 CD5+ CCRF-CEM 종양 세포와 6시간 동안 동시 배양하는 경우 대조군 NT NK 세포 및 관련 없는 표적 CAR 대조군으로 사용된 CD19 CAR-NK 세포(IL-15의 존재 또는 부재)에 비해 증진된 사이토킨 생산(IFNγ 및 TNFα) 및 탈과립화(CD107a)를 입증하였다(도 2d). 51Cr 방출 세포독성 검정에서, 모든 CD5 CAR-NK 세포는 NT NK 세포 보다는 양호하게 CD5+ 종양 표적을 사멸시켰지만, 세포독성에서 어떠한 유의적인 차이가 다양한 CAR-NK 세포 디자인에서 식별되지 않았다(도 2e).
[0247] DAP10으로 동시 자극받은 CD5 CAR-NK 세포는 CD5+ 악성 종양 마우스 모델에서 증진된 종양 제어 및 생존을 유도하였다. 다양한 CD5 CAR-NK 세포 디자인의 생체내 항종양 활성을 조사하기 위해, 동일한 NSG 마우스 모델을 보다 초기에 사용된 CD5+ CCRF-CEM대신 사용하여 CD5-CD28-CD3ζ 및 CD5-41BB-CD3ζ CD5 CAR-NK 세포의 생채내 효능을 시험하였다. 종양만 생착된 마우스와 종양으로 생착되고 NT NK 세포로 처리된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스에게 -1일차에 방사선 조사(225cGy)를 실시한 후, 0일차에 마우스당 CCRF-CEM-FFluc 종양 100,000개의 세포를 정맥내 주사하였다. 2일차에는 치료 그룹에 NT NK 세포 2x106개 또는 다양한 제제의 CAR-NK 세포 2x106개를 투여하였다. DAP10 신호전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 대조군 마우스와 다른 동시 자극 도메인을 혼입하는 CD5 CAR-NK 세포를 투여한 마우스에 비해 종양 제어가 명백하게 우수하고 생존율이 현저히 개선됨을 보여주었다(도 3a-c). 추가로, 이들 CAR-NK 세포로 치료한 동물은 체중 모니터링(체중 감소 없음)에서 입증된 바와 같이 독성 징후가 나타나지 않았다(도 3d). 흥미롭게도, CD5 발현이 낮은 CCRF-CEM이 생착된 마우스에서도 DAP10 동시 자극을 받은 CD5 CAR-NK 세포에 의해 부여받은 생존 이점이 유지되었다(도 3e). 추가로, 피하 주사한 CD5+ 맨틀 세포 림프종의 생체 내 PDX 마우스 모델에서 DAP10으로 동시 자극한 CD5 CAR-NK 세포는 종양만이 생착된 미치료 마우스에 비해 CAR-NK 세포 치료된 마우스의 피하 종양, 비장 및 골수로부터의 CD45+CD5+ 림프종 세포의 절대 수가 현저히 감소하면서 개선된 종양 제어를 유도하였다(도 4a,4b).
[0248] DAP10 동시 자극은 CD5 CAR-NK 세포에 활성화된 표현형을 부여한다.
DAP10 동시 자극 도메인을 가진 CD5 CAR-NK 세포가 다른 CAR 디자인에 비해 생체 내에서 현저하게 보다 양호한 성능을 수행하는 이유를 특징 분석하기 위해 해당 세포의 단백질체 프로필을 보다 자세히 살펴보았다. NT NK 세포와 관련하여 다양한 CD5 CAR-NK 세포의 표현형을 조사하기 위해 질량 세포측정법 및 활성화 및 억제성 NK 세포 수용체와 증식, 분화 및 성숙화 마커에 대한 47개의 항체 패널을 사용하였다. t-분포 확률적 이웃 임베딩(embedding)(t-SNE) 알고리즘인 viSNE를 사용하여 DAP10 동시 자극 도메인을 가진 CD5 CAR-NK 세포가 NT NK 세포에 비해 2개의 특이적 클러스터(클러스터 8 및 11)를 보이는 것으로 관찰되었다(도 5a, 5b). 각 클러스터를 한정하는 마커의 조합을 면밀히 살펴보면, 8번과 11번 클러스터에는 활성화 마커(NKG2D, DNAM, CD69, CD3ζ), 세포 독성 마커(퍼포린, 그랜자임 B, TRAIL) 및 성숙화 마커(에오메소더민 ((eomes) 및 T-bet)가 풍부하였다(도 5c).
[0249] DAP10 동시 자극 도메인을 갖는 CD5 CAR-NK 세포는 증진된 다기능성 및 대사 적합성을 입증한다.
DAP10 신호전달과 함께 CAR-NK 세포가 다른 CAR-NK 세포 디자인에 비해 생체 내에서 기능 소진이 적은 이유를 파악하기 위해 다양한 동시 자극 도메인을 갖는 CAR-NK 세포의 다기능성과 대사를 평가하는 일련의 실험을 수행하였다. 단일 세포 수준에서 사이토킨 분비를 평가하기 위해 면역 세포의 효능과 상관관계가 있는 다기능성을 평가하는 널리 검증된 도구인 IsoPlexis 단일 세포 분비체 검정을 사용하였다. 플레이트 결합된 CD5 항원으로 4시간동안 자극한 후, DAP10 신호전달과 함께 CAR-NK 세포는 최고의 다기능성을 보여주었고 보다 큰 비율의 세포는 단일 세포 수준에서 3, 4 또는 5+ 사이토킨을 분지한다(도 6a,6b). CD5 CAR-NK 세포를 포함하는 DAP10에서 분비된 사이토킨 중 보다 높은 비율은 이펙터, 자극성 또는 화학 유인제 카테고리에 속하였다(도 6c). 대사적 관점에서 볼 때, DAP10 신호전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 산화적 인산화 및 미토콘드리아 적합성의 척도인 산소 소비율(OCR)이 다른 작제물 및 대조군 NT NK 세포에 비해 현저히 높음을 입증하였다(도 6d).
[0250] DAP10 동시 자극 도메인을 가진 CD5 CAR-NK 세포는 메모리 유사 특징을 나타낸다.
이어서, CD5 CAR-NK 세포에서 DAP10 동시 자극에 수반되는 유리한 전사체, 단백질체 및 대사 변화가 생체 내 현저한 효능을 설명할 수 있는 메모리 유사 특성으로 변환되는지의 여부가 조사되었다. 따라서 종양을 적절히 제어하기 위해 CAR-NK 세포가 연쇄사멸 능력을 발휘해야 하고 따라서 소진되기 쉬운 생체 내 세팅을 시뮬레이션하였다. 2-3일마다 수행된 다수의 종양 재챌린지와 함께 장기 Incucyte® 세포독성 검정에서 (도 7a), DAP10 신호전달과 함께 CD5 CAR-NK 세포는 다수의 종양 재챌린지 후에도 지속적인 살상 능력으로 다른 CAR-NK 세포 디자인에 비해 CD5+ CCRF-CEM에 대해 우수한 세포 독성을 나타낸 반면, NT NK 세포, 관련 없는 표적 CD19 또는 CD19/IL-15 CAR이 형질도입된 NK 세포 및 기타 CD5 CAR 작제물이 형질도입된 NK 세포는 시간 경과에 따라 살상 능력을 상실하였다(도 7b,c). 유사하게, 생체 내 모델에서 장기 생존하고 질환에서 치유된 것처럼 보이는 CD5 CAR-NK 세포를 함유한 DAP10으로 치료한 마우스에 CD5+ CCRF-CEM을 재챌린지하였고 종양 발생의 증거가 나타나지 않았고, 이는 이들 CD5 CAR-NK 세포에 기억 특성이 부여되어 재노출 시 종양을 박멸할 수 있음을 시사한다(도 7d-7f).
재료 및 방법의 예
세포주 및 배양 배지
[0251] CCRF-CEM(T-ALL 세포주)은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Manassa, VA, USA)으로부터 구입하였다. CCRF-CEM 세포에는 생체 내 실험을 위해 반딧불이 루시퍼라제(CCRF-CEM-FFluc)를 형질도입하였다. CD5가 낮은 모델의 경우, shRNA를 사용하여 CCRF-CEM에서 CD5의 발현을 녹다운시켰다. K562 기반 피더 세포는 레트로바이러스적으로 형질도입하여 4-1BBL, CD48 및 막 결합된 IL-21을 동시 발현하고 uAPC로서 지칭된다. 모든 세포주는 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute (RPMI)) 배지에서 배양하였다. NK 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 줄기 세포 성장 배지 (SCGM)에서 배양하였다.
제대혈 NK 세포 확장
[0252] 연구를 위한 CB 유닛은 기관(MD Anderson Cancer Center CB Bank)에 의해 제공되었다. CB는 밀도 구배 기술 (Ficoll-Histopaque; Sigma, St Louis, MO, USA)에 의해 단리하였다. NK 단리 키트(Miltenyi Biotec, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 정제된 CD56+ NK 세포는 0일째 완전한 줄기 세포 성장 배지 (CellGenix GmbH, Freiburg, Germany)에서 방사선 조사된 (100Gy) uAPC (2:1 피더 세포:NK 비율) 및 재조합 사람 IL-2 (Proleukin, 200 U/ml; Chiron, Emeryville, CA, USA)로 자극하였다. 활성화된 NK 세포는 사람 피브로넥틴-코팅된 플레이트 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA)에서 +6일자로 레트로바이러스 상등액으로 형질도입하였다. +7일 및 +14일에, NK 세포는 다시 방사선 조사된 uAPC 및 IL-2로 자극하였다. +21일째에, CAR-형질도입된 NK 세포는 이전에 기재된 실험에 사용하기 위해 수집하였다.
레트로바이러스 형질감염 및 형질도입:
[0253] 다양한 CD5 작제물을 암호화하는 레트로바이러스 벡터는 인하우스 디자인하였고, 플라스미드는 GeneArtTM에서 주문하였다. CD19-CD28-CD3z 및 CD19-CD28-CD3z-IL-15 벡터는 이전에 기재되었다.6 일시적 레트로바이러스 상등액은 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다.14 활성화된 NK 세포는 사람 피브로넥틴-코팅된 플레이트 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA)에서 +6일자로 레트로바이러스 상등액으로 형질도입하였다. +8일째, CAR 형질도입 효율은 유동 세포측정에 의해 측정하였고 NK 세포는 다시 방사선 조사된 uAPC 및 IL-2로 자극하였다.
기능성 검정
[0254] CAR19 또는 CAR19/IL-15 NK 세포, 또는 CD5 CAR-NK 세포를 100 × 10e3개의 세포/웰로, 2:1의 이펙터: 표적 세포 비율(E:T)로 CCRF-CEM 세포 또는 K562 표적 (양성 대조군)과 함께 환저 96웰 플레이트에서 6시간 동안 브레펠딘 A의 존재하에 동시 배양하였다. 탈과립화를 측정하기 위해, CD107a 항체 (Brilliant Violet 785™ 항-사람 CD107a (LAMP-1) 항체, 바이오레전드(Biolegend), San Diego, CA, USA)를 동시 배양 초기에 웰에 첨가하였다. 세포를 수거하여 CD56, CD3 및 CAR에 대한 표면 염색을 한 후 세포를 고정하고 TNFα(TNF 알파 모노클로날 항체(MAb11), Alexa Fluor 700, eBiosience Inc., San Diego, CA, USA) 및 IFNγ(BD Horizon™ V450 마우스 항-사람 IFNγ, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 대한 세포 내 염색을 수행하였다. 세포는 유동 세포측정에 의해 이전에 기재된 바와 같이 평가하였다.15
세포독성 검정
크로뮴 방출 검정:
[0255] 세포 독성을 평가하기 위해, 생체 외에서 확장된 NT 또는 CAR 형질도입된 NK 세포를 다양한 E:T 비율로 51Cr 표지된 CCRF-CEM 표적과 동시 배양하고, 이전에 기재한 바와 같이 51Cr 방출을 통해 세포 독성을 측정하였다.15
Incucyte 생존 세포 이미지화 검정
[0256] 생체 외에서 확장된 NT 및 CAR 형질도입된 NK 세포를 96 웰 또는 48 웰 플레이트에서 1:1 E:T 비율로 렌티바이러스로 형질도입된 CCRF-CEM 종양 표적과 동시 배양하여 적색 염료(PE-Texas red)를 발현하도록 하였다. 각각의 웰은 5 x104 CCRF-CEM 세포 및 5 x 104 NK 세포를 함유하였다. 아폽토시스는 CellEventTM 카스파제-3/7 녹색 검출 시약(ThermoFisher)을 사용하여 검출하였다. 종양 단독 또는 NK 세포 단독의 그룹을 함유하는 웰은 음성 대조군으로서 사용하였다. 프레임은 IncuCyte S3 생세포 분석 시스템(Sartorius)을 사용한 10x 대물렌즈와 함께 웰당 4개의 개별 1.75 x 1.29 mm2 영역에서 1시간 간격으로 시간 경과에 따라 캡처하였다. 각각의 웰의 모든 4개의 영역으로부터의 값을 수집하고 모든 3개의 레플리케이트에 걸쳐 평균화하였다. 결과는 적색 및 녹색 신호가 중첩되는 비율(이미지당 개수)을 적색 신호(이미지당 개수)로 나눈 비율을 계산하여 세포 독성 퍼센트로 그래픽으로 표현하였다. 재챌린지 실험을 위해, CCRF-CEM은 2 내지 3일마다 모든 웰(NK 세포 단독 그룹을 함유하는 대조군 웰을 제외한)에 첨가하였다. 적색 수 및 컨플루언스는 시간 경과에 따라 플롯팅하여 종양 성장 또는 NK 세포에 의한 제거를 추적하였다.
질량 세포측정
항체 접합
[0257] 38개 금속-태그된 항체를 포함하는 패널은 NK 세포의 면밀한 특징 분석을 위해 사용하였다. 상응하는 금속 태그 동위원소를 갖는 항체의 목록은 표에 나타낸다, 모든 비표지화된 항체는 캐리어-부재 형태로 구입하고 제조업자의 지침 (Fludigm)에 따라 Maxpar X8 또는 MCP9 중합체를 사용하여 상응하는 금속 태그와 인하우스 접합시켰다. 모든 금속 동위원소는 인듐 (III) 클로라이드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 제외하고 Fludigm으로부터 획득하였다. 항체 농도는 Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma)을 사용하여 A280 단백질의 양을 측정함에 의해 결정하였다. 접합된 항체는 이어서 0.05% 아지드화나트륨 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)이 0.5 mg/ml의 최종 농도로 보충된 PBS계 항체 안정화 용액 또는 LowCross-완충액 (Candor Bioscience GmbH, Wangen, Germany) 중에 희석시켰다. 연속 적정 실험을 수행하여 각각의 항체에 대해 최적의 신호 대 노이즈 비율로 농도를 결정하였다.
표 1: 항체
샘플 제조 및 획득:
[0258] NT 또는 다양한 CD5 CAR 형질도입된 NK 세포를 수거하여 4℃, 5분 동안 400g에서 세포 염색 완충액(0.5% 소 혈청 알부민, 0.02% PBS 중의 아지드화나트륨)으로 2회 세척하고 암실에서 2.5μM 시스플라틴-198Pt로 2분동안 항온처리하였다. 이어서 세포를 FACS 완충액(PBS 중의 2% 태아 소 혈청)으로 1회, 세포 염색 완충액으로 1회 세척하였다.　 사람 Fc 수용체 차단 용액(Milteny Biotec, 130-059-901) 10μl를 실온에서 10분동안. 이어서 세포는 진탕기 (130 rpm) 상에서 실온에서 40분동안 PBS 중에서 1% 소 혈청 알부민 중에 희석된 세포 표면 마커에 대해 새롭게 제조된 항체 혼합물로 염색하였다.　 세포를 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 1.8% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 10분간 암실에서 고정하였다. 세포를 4°C, 5분동안 800g에서 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고, 1ml의 메탄올 중에서 -80°C에서 밤새 보관하였다. 다음 날, 샘플을 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고, PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 + 0.2% 사포닌에서 희석한 세포 내 마커에 대해 새롭게 제조된 항체 혼합물로 염색하였다. 세포를 세포 염색 완충액으로 2회 세척하고 실온에서 20분동안 1ml 인터컬레이터 이리듐(1ml PBS중의 125uM 1ul)에서 항온처리하였다. 세포는 세포 염색 완충액 중에서 2회 세척하고 Milli-Q®dH2O 중의 1ml의 0.1% 소 혈청 알부민에서 재현탁시키고, 35 μm 나일론 메쉬(세포 스트레이너 캡 튜브, BD, San Jose, Ca)를 통해 여과하고 계수하였다. 분석 전에, 샘플을 0.5x105/ml의 농도로 EQTM 4개의 요소 보정(calibration) 비드가 보충된 MilliQ® dH2O 중에 현탁시켰다. 샘플을 Helios 6.5.358 획득 소프트웨어 (Fluidigm)를 사용하여 Helios 장비 (Fluidigm) 상에서 300 이벤트/초로 획득하였다.
데이터 분석
[0259] 질량 세포측정 데이터는 Fluidigm 정규화 소프트웨어 2를 사용한 시간 경과에 따른 EQTM 4개 요소 신호 전환을 기준으로 정규화하였다. 초기 데이터 품질 관리를 Flowjo 버젼 10.2를 사용하여 수행하였다. 보정 비드를 게이트 아웃시키고 이리듐 193 염색 및 이벤트 길이를 기준으로 단일선을 선택하였다. 죽은 세포를 Pt195 채널에 의해 배제시키고 추가로 게이팅을 수행하여 CD45+ 세포에 이어서 관심 대상의 NK 세포 집단(CD3-CD56+)을 선택하였다. 총 320,000개의 세포를 비례적으로 모든 샘플로부터 채취하여 자동화 클러스터링을 수행하였다. 데이터는 이전에 공개된 바와 같이 면역 세포의 심층적 표현형 분류용 클러스터링을 위해16 FlowSOM과의 조합을 포함하는 자동화된 차원 감소 (viSNE)를 사용하여 분석하였다17.
이소플렉시스 단일 세포 분비체 검정
[0260] 형광 염료(이소플렉시스 염색 세포막 405)로 형광 표지화하고, 플레이트 결합된 CD5 항원으로 4시간 동안 자극하거나, CCRF-CEM 세포와 4시간 동안 동시 배양한 후, CD56+ 마이크로비드로 양성 선택을 사용하여 정제하였다. 정제된 집단으로부터 3 x104개의 NK 세포를 제조업체의 지침(Isoplexis, Branford, CT, USA)에 따라 개별 이소코드(Isocode) 칩상에 부하하고, 이소플렉시스 단일 세포 플랫폼상에서 완전히 검증된 사이토킨 패널을 사용하여 단일 세포 32-플렉스 사이토킨 분비체 프로파일링을 실시하였다. 이전에 기재된 바와 같이,18,19 IsoSpeak 소프트웨어를 사용하여 다기능성 NK 세포의 수를 정량화하고, 각 샘플에서 다수의 사이토킨(2+, 3+, 4+ 또는 5+)을 분비하는 세포의 비율을 측정하고, 분비되는 사이토킨의 카테고리(이펙터, 자극성, 조절성 또는 화학 유인성)를 할당하고, 다기능성 세포의 퍼센트로서 정의되는 다기능성 강도 지수(PSI)에 NK 세포가 분비하는 단백질의 평균 형광 강도(MFI)를 곱하여 측정하였다.
Seahorse 검정
[0261] NT-NK 세포 또는 다양한 CD5 CAR 형질도입된 NK 세포를 Seahorse XF 당분해 스트레스 및 Mito 스트레스 시험 키트(Agilent)를 사용하여 검정하였다. 세포 외 산성화율(ECAR)과 산소 소비율(OCR)은 제조업체의 지침에 따라 Agilent Seahorse XFe96 분석기(Agilent)를 사용하여 측정하였다.
이종이계 마우스 모델
[0262] 생체 내 CD5 CAR 형질도입된 CB-NK 세포의 항종양 효과를 평가하기 위해 CCRF-CEM 세포주와 생착된 NOD/SCID IL-2Rγnull(NSG) 이종 이식 모델을 사용하였다. 마우스 실험은 위원회 (the Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜 하에 NIH 추천에 따라 수행하였다. NSG 마우스 (10-12주령; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)에 -1일째에 300 cGy로 방사선 조사하였고 0일째, 반딧불이 루시퍼라제-표지화된 CCRF-CEM 세포(1 × 10e5)로 정맥내 접종하였다. 지시된 경우, 새로운 확장된 NT 또는 CD5 CAR 형질도입된 CB-NK 세포를 2일째 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 마우스는 매주 생발광 이미지화 (Xenogen-IVIS 200 Imaging system; Caliper, Waltham, MA, USA)에 적용하였다. 광자/초의 신호 정량은 생이미지화 소프트웨어(Caliper)를 사용한 관심 대상의 표준화된 영역 내 광자 유입률을 결정함에 의해 수행하였다.20 NK 세포의 트래픽킹, 지속성 및 확장은 유동 세포측정에 의해 측정했다. 또한 마우스의 체중과 스코어링을 기록하여 생존율과 독성을 모니터링하였다.
NK 세포의 생체 내 트래픽킹, 지속성 및 확장을 검사하는 데 사용되는 항체
[0263] 하기의 항체는 유동 세포측정 염색을 위해 사용되었다: APC/Cy7 항-사람 CD3 항체(클론 HIT3a, Biolegend), 브릴리언트 바이올렛 605TM 항-사람 CD56(NCAM) 항체(클론 HCD56, Biolegend), 항-CAR 항체 염소 F(ab')2 항-사람 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647(Jackson), PE 마우스 항-사람 CD7 클론 M-T701(BD biosciences), BV711 마우스 항-사람 CD5 클론 UCHT2(BD biosciences), BV650 마우스 항-사람 CD16 클론 3G8(BD 바이오사이언스), PerCP 항-사람 CD45 항체 클론 HI30(Biolegend), 생/사 아쿠아 죽은 세포 염색(ThermoFisher).
통계
[0264] 양방향(Two-way) Anova 시험을 사용하여 그룹 간의 정량적 차이(평균 ± sd)를 비교하였고; P-값은 2개 측면이고 P<0.05는 유의적인 것으로 간주되었다. 모든 생발광 실험을 위해, 강도 신호는 마우스의 각각의 그룹에 대해 기준선에서 및 다수의 후속 시점에서 평균±sd로서 요약하였다20. 생존 확률은 캐플란-메이어 (Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 계산하였다. 지적된 통계학적 시험은 프리즘 소프트웨어 (GraphPad version 7.0c)를 사용하여 수행하였다.
특정 구현예의 유의성
[0265] 다양한 동시 자극 도메인이 CAR-T 세포 기능 및 적합성에 미치는 효과는 잘 연구되어 있다. CAR-NK 세포 분야에서 다양한 동시 자극 분자의 역할을 조사한 연구는 거의 보고되지 않았지만, 동시 자극의 선택이 증식, 전사체 프로필, 표현형, 다기능성, 대사, 세포 독성 및 기억 형성에 미치는 영향을 체계적으로 조사한 연구는 없었다. 상기 연구는 이들 구체적인 질문을 탐구하여 NK 중심 동시 자극 도메인인 DAP10이 유리한 표현형 변화와 상승작용 신호전달로 이어져 CD5 CAR-NK 세포의 최적의 범용 항종양 활성과 적합성 및 기억 형성의 특성으로 절정에 이른다는 것을 보여준다.
[0266] CAR-T 세포에서 4-1BB와 CD28의 동시 자극이 T 세포의 신호 전달 및 대사에 미치는 영향은 철저하게 조사되었고, 세포 치료요법 생성물의 지속성 및 소진에 관한 임상 결과 및 데이터와 상호관련되어 있다.21 DAP10은 이전에 CAR-T 세포 및 NKG2D 기반 CAR-NK 세포 기능을 증진시키는 것으로 나타났지만22,23, 다른 동시 자극 분자에 비해 유리한 점을 설명할 수 있는 기계적인 통찰력이 제시되지 않았다. 또한, CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 설정에서 DAP10 동시 자극의 다운스트림의 신호전달 경로는 설명되지 않았다.
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참조문헌
[0267] 하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
[0268] 본원 개시내용 및 이의 이점이 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구들에 의해 정의되는 바와 같은 본원 개시내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경, 대체 및 변형이 본 명세서에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 구현예에 한정하려는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본원 개시 내용으로부터 용이하게 인식할 것이기 때문에, 본원 개시내용에 기재된 상응하는 구현예와 동일한 결과를 실질적으로 달성하거나 동일한 기능을 실질적으로 수행하는 현재 존재하거나 나중에 개발되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들이, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항들은 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들을 청구 범위내에 포함시키고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TO TARGET CD5-POSITIVE CANCERS <130> MDAC-P1285WO-1001206830 <140> PCT/US2022/024842 <141> 2022-04-14 <150> 63/174,990 <151> 2021-04-14 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atggagttcg gtctcagttg gctgtttttg gttgctatct tgaagggcgt ccaatgcagc 60 cgggacatcc agatgaccca gtctccctct agcatgtcag cgagtcttgg tgatcgagtg 120 acgattacct gcagagcctc tcaagatata aacagctatc tttcatggtt ccaacagaag 180 ccggggaagt ccccaaaaac tctcatatac agggcgaatc gactcgtaga cggtgtgcct 240 tcaaggtttt ccgggagtgg tagtggcaca gattacacac ttacaatctc ttcattgcag 300 tatgaggatt tcgggatcta ctactgtcaa cagtacgacg aatccccatg gacgtttggg 360 ggcgggacca aacttgagat aaaagggagc acatctggaa gtggtaaacc tgggtcaggg 420 gagggttcca caaaaggaca aattcaactt gtccaaagcg gtcctggtct taagaagcct 480 ggagggtctg tcaggataag 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gaaaatttct tgtaaggcat caggatacac attcacaaac 540 tacgggatga attgggtcaa acaagcaccc ggaaaggggc tgcgctggat ggggtggatc 600 aacacacata ctggggaacc tacttacgca gacgatttca agggcagatt cgccttttct 660 ttggagacct ccgcctctac tgcatacttg cagataaaca acctgaagaa tgaagatacc 720 gccacctact tctgtacgcg caggggctac gattggtatt ttgatgtatg gggggcaggc 780 accactgtta ctgtgtcaag ccgtacggtc actgtctctt cacaggatcc cgccgagccc 840 aaatctcctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 900 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 960 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1020 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1080 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1140 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1200 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1260 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1320 gccgtggagt gggagagcaa tgggcaaccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1440 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1500 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa aaagatccca aattttggct cctggcaggc 1560 ctcgtggctg ctgatgcggt ggcatcgctg ctcatcgtgg gggcggtgtt cctttgcgca 1620 cgcccacgcc gcagccccgc ccaagaagat ggcaaagtct acatcaacat gccaggcagg 1680 ggcacgcgtg tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1740 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaaaaga 1800 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1860 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1920 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1980 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcggaccgca gtgtactaat 2040 tatgctctct tgaaattggc tggagatgtt gagagcaatc ccgggcccat gcgcattagc 2100 aagccccacc tgcggagcat cagcatccag tgctacctgt gcctgctgct gaacagccac 2160 ttcctgaccg aggccggcat ccacgtgttc 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caaggcgagt caagatataa acagctactt gtcatggttc 180 caacaaaaac cagggaaatc acctaagacc ctgatctata gagccaatcg cctggttgac 240 ggtgtcccct cccgctttag cggctccgga agcggtcaag attactctct cacaatttct 300 tccttggatt atgaagacat ggggatctac tattgtcaac agtatgacga atccccgtgg 360 actttcggtg gcggtaccaa attggaaata aagggctcta caagcggctc aggaaaacct 420 ggatcaggcg aagggtctac gaagggccag atacaactcg ttcaaagtgg gccagaactc 480 aaaaaaccgg gagaaacagt gaaaatttct tgtaaggcat caggatacac attcacaaac 540 tacgggatga attgggtcaa acaagcaccc ggaaaggggc tgcgctggat ggggtggatc 600 aacacacata ctggggaacc tacttacgca gacgatttca agggcagatt cgccttttct 660 ttggagacct ccgcctctac tgcatacttg cagataaaca acctgaagaa tgaagatacc 720 gccacctact tctgtacgcg caggggctac gattggtatt ttgatgtatg gggggcaggc 780 accactgtta ctgtgtcaag ccgtacggtc actgtctctt cacaggatcc cgccgagccc 840 aaatctcctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 900 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 960 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Met Leu Glu Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile 1 5 10 15 Leu Lys Gly Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 65 70 75 80 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 165 170 175 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys 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60 caatgtagcc gagacataaa aatgacccag tctccgtcat ctatgtatgc aagcctcggc 120 gagcgagtga ccatcacgtg caaggcgagt caagatataa acagctactt gtcatggttc 180 caacaaaaac cagggaaatc acctaagacc ctgatctata gagccaatcg cctggttgac 240 ggtgtcccct cccgctttag cggctccgga agcggtcaag attactctct cacaatttct 300 tccttggatt atgaagacat ggggatctac tattgtcaac agtatgacga atccccgtgg 360 actttcggtg gcggtaccaa attggaaata aagggctcta caagcggctc aggaaaacct 420 ggatcaggcg aagggtctac gaagggccag atacaactcg ttcaaagtgg gccagaactc 480 aaaaaaccgg gagaaacagt gaaaatttct tgtaaggcat caggatacac attcacaaac 540 tacgggatga attgggtcaa acaagcaccc ggaaaggggc tgcgctggat ggggtggatc 600 aacacacata ctggggaacc tacttacgca gacgatttca agggcagatt cgccttttct 660 ttggagacct ccgcctctac tgcatacttg cagataaaca acctgaagaa tgaagatacc 720 gccacctact tctgtacgcg caggggctac gattggtatt ttgatgtatg gggggcaggc 780 accactgtta ctgtgtcaag ccgtacggtc actgtctctt cacaggatcc cgccgagccc 840 aaatctcctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 900 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 960 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1020 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1080 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1140 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1200 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1260 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1320 gccgtggagt gggagagcaa tgggcaaccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1440 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1500 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa aaagatccca aattttgggg cgtgctggca 1560 gggatcgtga tgggagacct ggtgctgaca gtgctcattg ccctggccgt gtacttcctg 1620 ggccggctgg tccctcgggg gcgaggggct gcggaggcag cgacccggaa acagcgtatc 1680 actgagaccg agtcgcctta tcaggagctc cagggtcaga ggtcggatgt ctacagcgac 1740 ctcaacacac 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caaaagacgt 2460 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 2520 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 2580 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 2640 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgcg gaccgcagtg tactaattat 2700 gctctcttga aattggctgg agatgttgag agcaatcccg ggcccatgcg cattagcaag 2760 ccccacctgc ggagcatcag catccagtgc tacctgtgcc tgctgctgaa cagccacttc 2820 ctgaccgagg ccggcatcca cgtgttcatc ctgggctgct tcagcgccgg actgcccaag 2880 accgaggcca actgggtgaa cgtgatcagc gacctgaaga agatcgagga cctgatccag 2940 agcatgcaca tcgacgccac cctgtacacc gagagcgacg tgcaccccag ctgcaaggtg 3000 accgccatga agtgctttct gctggaactg caggtgatca gcctggaaag cggcgacgcc 3060 agcatccacg acaccgtgga gaacctgatc atcctggcca acaacagcct gagcagcaac 3120 ggcaacgtga ccgagagcgg ctgcaaagag tgcgaggaac tggaagagaa gaacatcaaa 3180 gagtttctgc agagcttcgt gcacatcgtg cagatgttca tcaacaccag ctga 3234 <210> 53 <211> 1077 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Met Leu Glu Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg 1 5 10 15 Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met 20 25 30 Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro 35 40 45 Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu 50 55 60 Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro 85 90 95 His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Val Asp Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser 115 120 125 Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys 130 135 140 Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly 145 150 155 160 Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg 165 170 175 Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr 180 185 190 Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His 195 200 205 Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln 210 215 220 Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys 225 230 235 240 Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys 245 250 255 Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly 260 265 270 Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu 275 280 285 Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln 290 295 300 Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro 305 310 315 320 Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val 325 330 335 Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp 340 345 350 Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu 355 360 365 Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met 370 375 380 Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser 385 390 395 400 Ala Ser Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val 405 410 415 Glu Glu Asn Pro Gly Pro Leu Glu Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu 420 425 430 Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Lys 435 440 445 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val 450 455 460 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp 465 470 475 480 Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala 485 490 495 Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 500 505 510 Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met 515 520 525 Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly 530 535 540 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys 545 550 555 560 Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln 565 570 575 Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys 580 585 590 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys 595 600 605 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His 610 615 620 Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe 625 630 635 640 Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu 645 650 655 Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Arg Gly Tyr Asp 660 665 670 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 675 680 685 Arg Thr Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys 690 695 700 Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser 705 710 715 720 Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 725 730 735 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 740 745 750 Ile Phe Trp Val Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu 755 760 765 Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Thr Arg Val Lys 770 775 780 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 785 790 795 800 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 805 810 815 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 820 825 830 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 835 840 845 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 850 855 860 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 865 870 875 880 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Pro Gln 885 890 895 Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 900 905 910 Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile 915 920 925 Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala 930 935 940 Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys 945 950 955 960 Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu 965 970 975 Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser 980 985 990 Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu 995 1000 1005 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His 1010 1015 1020 Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 1025 1030 1035 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu 1040 1045 1050 Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His 1055 1060 1065 Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 1070 1075 <210> 54 <211> 3285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 atgctcgagg gagtgcaggt ggaaaccatc tccccaggcg acgggcgcac cttccccaag 60 cgcggccaga cctgcgtggt gcactacacc gggatgcttg aagatggaaa gaaagttgat 120 tcctcccggg acagaaacaa gccctttaag tttatgctag gcaagcagga ggtgatccga 180 ggctgggaag aaggggttgc ccagatgagt gtgggtcaga gagccaaact gactatatct 240 ccagattatg cctatggtgc cactgggcac ccaggcatca tcccaccaca tgccactctc 300 gtcttcgatg tggagcttct aaaactggaa tctggcggtg gatccggagt cgacggattt 360 ggtgatgtcg gtgctcttga gagtttgagg ggaaatgcag atttggctta catcctgagc 420 atggagccct gtggccactg cctcattatc aacaatgtga acttctgccg tgagtccggg 480 ctccgcaccc gcactggctc caacatcgac tgtgagaagt tgcggcgtcg cttctcctcg 540 ctgcatttca tggtggaggt gaagggcgac ctgactgcca agaaaatggt gctggctttg 600 ctggagctgg cgcagcagga ccacggtgct ctggactgct gcgtggtggt cattctctct 660 cacggctgtc aggccagcca cctgcagttc ccaggggctg tctacggcac agatggatgc 720 cctgtgtcgg tcgagaagat tgtgaacatc ttcaatggga ccagctgccc cagcctggga 780 gggaagccca agctcttttt catccaggcc tgtggtgggg agcagaaaga tcatgggttt 840 gaggtggcct ccacttcccc tgaagacgag tcccctggca gtaaccccga gccagatgcc 900 accccgttcc aggaaggttt gaggaccttc gaccagctgg acgccatatc tagtttgccc 960 acacccagtg acatctttgt gtcctactct actttcccag gttttgtttc ctggagggac 1020 cccaagagtg gctcctggta cgttgagacc ctggacgaca tctttgagca gtgggctcac 1080 tctgaagacc tgcagtccct cctgcttagg gtcgctaatg ctgtttcggt gaaagggatt 1140 tataaacaga tgcctggttg ctttaatttc ctccggaaaa aacttttctt taaaacatca 1200 gcttcgcgag ccgagggcag gggaagtctt ctaacatgcg gggacgtgga ggaaaatccc 1260 gggcccctcg agatggagtt cggcttgagt tggttgttcc ttgtggcgat actcaaaggc 1320 gttcaatgta gccgagacat aaaaatgacc cagtctccgt catctatgta tgcaagcctc 1380 ggcgagcgag tgaccatcac gtgcaaggcg agtcaagata taaacagcta cttgtcatgg 1440 ttccaacaaa aaccagggaa atcacctaag accctgatct atagagccaa tcgcctggtt 1500 gacggtgtcc cctcccgctt tagcggctcc ggaagcggtc aagattactc tctcacaatt 1560 tcttccttgg attatgaaga catggggatc tactattgtc aacagtatga cgaatccccg 1620 tggactttcg gtggcggtac caaattggaa ataaagggct ctacaagcgg ctcaggaaaa 1680 cctggatcag gcgaagggtc tacgaagggc cagatacaac tcgttcaaag tgggccagaa 1740 ctcaaaaaac cgggagaaac agtgaaaatt tcttgtaagg catcaggata cacattcaca 1800 aactacggga tgaattgggt caaacaagca cccggaaagg ggctgcgctg gatggggtgg 1860 atcaacacac atactgggga acctacttac gcagacgatt tcaagggcag attcgccttt 1920 tctttggaga cctccgcctc tactgcatac ttgcagataa acaacctgaa gaatgaagat 1980 accgccacct acttctgtac gcgcaggggc tacgattggt attttgatgt atggggggca 2040 ggcaccactg ttactgtgtc aagccgtacg attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 2100 gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 2160 cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 2220 gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 2280 agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 2340 aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc aacgcgtgtg 2400 aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 2460 gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaaaagacg tggccgggac 2520 cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 2580 cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 2640 ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 2700 gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggaccgcagt gtactaatta tgctctcttg 2760 aaattggctg gagatgttga gagcaatccc gggcccatgc gcattagcaa gccccacctg 2820 cggagcatca gcatccagtg ctacctgtgc ctgctgctga acagccactt cctgaccgag 2880 gccggcatcc acgtgttcat cctgggctgc ttcagcgccg gactgcccaa gaccgaggcc 2940 aactgggtga acgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac 3000 atcgacgcca ccctgtacac cgagagcgac gtgcacccca gctgcaaggt gaccgccatg 3060 aagtgctttc tgctggaact gcaggtgatc agcctggaaa gcggcgacgc cagcatccac 3120 gacaccgtgg agaacctgat catcctggcc aacaacagcc tgagcagcaa cggcaacgtg 3180 accgagagcg gctgcaaaga gtgcgaggaa ctggaagaga agaacatcaa agagtttctg 3240 cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc atcaacacca gctga 3285 <210> 55 <211> 1094 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Met Leu Glu Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg 1 5 10 15 Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met 20 25 30 Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro 35 40 45 Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu 50 55 60 Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro 85 90 95 His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Val Asp Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser 115 120 125 Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys 130 135 140 Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly 145 150 155 160 Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg 165 170 175 Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr 180 185 190 Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His 195 200 205 Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln 210 215 220 Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys 225 230 235 240 Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys 245 250 255 Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly 260 265 270 Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu 275 280 285 Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln 290 295 300 Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro 305 310 315 320 Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val 325 330 335 Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp 340 345 350 Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu 355 360 365 Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met 370 375 380 Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser 385 390 395 400 Ala Ser Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val 405 410 415 Glu Glu Asn Pro Gly Pro Leu Glu Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu 420 425 430 Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Lys 435 440 445 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val 450 455 460 Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp 465 470 475 480 Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala 485 490 495 Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 500 505 510 Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met 515 520 525 Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly 530 535 540 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys 545 550 555 560 Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln 565 570 575 Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys 580 585 590 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys 595 600 605 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His 610 615 620 Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe 625 630 635 640 Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu 645 650 655 Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Arg Gly Tyr Asp 660 665 670 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 675 680 685 Arg Thr Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys 690 695 700 Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser 705 710 715 720 Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 725 730 735 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 740 745 750 Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr 755 760 765 Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln 770 775 780 Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Val 785 790 795 800 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 805 810 815 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 820 825 830 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 835 840 845 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 850 855 860 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 865 870 875 880 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 885 890 895 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Pro 900 905 910 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 915 920 925 Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser 930 935 940 Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu 945 950 955 960 Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro 965 970 975 Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile 980 985 990 Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu 995 1000 1005 Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 1010 1015 1020 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser 1025 1030 1035 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser 1040 1045 1050 Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys 1055 1060 1065 Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe 1070 1075 1080 Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 1085 1090

Claims (87)

  1. CD5 특이적 가공된 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 작제물로서, 상기 수용체가 다음 중 하나를 포함하는, 발현 작제물:
    (a) CD28 막관통 도메인 (TM) 및 CD28 세포질내 도메인 (ICD);
    (b) CD28 TM, CD28 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (c) CD28 TM 및 DAP12 ICD;
    (d) CD28 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (e) DAP12 TM 및 DAP12 ICD;
    (f) DAP12 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (g) CD28 TM 및 4-1BB ICD;(h) CD28 TM, 4-1BB ICD 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (h) CD28 TM, CD28 ICD, 및 4-1BB ICD;
    (i) CD28 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (j) CD28 TM 및 DAP10 ICD;
    (k) CD28TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (l) DAP10 TM 및 DAP10 ICD;
    (m) DAP10 TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (n) NKG2D ICD;
    (o) NKG2D TM;
    (p) NKG2D TM 및 NKG2D ICD;
    (q) NKG2D TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (r) CD28 TM 및 NKG2D ICD;
    (s) NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (t) CD28 TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (u) 4-1BB TM 및 4-1BB ICD;
    (v) 동시자극 도메인인 ICD의 부재하에 CD28TM 및 CD3제타;
    (w) CD8 TM 및 CD28 세포질내 도메인 (ICD);
    (x) CD8 TM, CD28 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (y) CD8 TM 및 DAP12 ICD;
    (z) CD8 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (aa) CD8 TM 및 DAP12 ICD;
    (bb) CD8 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (cc) CD8 TM 및 4-1BB ICD;(ee) CD8 TM, 4-1BB ICD 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (dd) CD8 TM, CD28 ICD, 및 4-1BB ICD;
    (ee) CD8 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (ff) CD8 TM 및 DAP10 ICD;
    (gg) CD8 TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (hh) CD8 TM 및 DAP10 ICD;
    (ii) CD8 ICD;
    (jj) CD8 TM;
    (kk) CD8 TM 및 NKG2D ICD;
    (ll) CD8 TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (mm) 동시자극 도메인인 ICD의 부재하에 CD8TM 및 CD3제타;
    (nn) CD27 TM 및 CD28 세포질내 도메인 (ICD);
    (oo) CD27 TM, CD28 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (pp) CD27 TM 및 DAP12 ICD;
    (qq) CD27 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (rr) CD27 TM 및 DAP12 ICD;
    (ss) CD27 TM, DAP12 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (tt) CD27 TM 및 4-1BB ICD;
    (uu) CD27 TM, 4-1BB ICD 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (vv) CD27 TM, CD28 ICD, 및 4-1BB ICD;
    (ww) CD27 TM, CD28 ICD, 4-1BB ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (xx) CD27 TM 및 DAP10 ICD;
    (yy) CD27 TM, DAP10 ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인;
    (zz) CD27 TM 및 DAP10 ICD;
    (aaa) CD27 TM;
    (bbb) CD27 TM 및 NKG2D ICD;
    (ccc) CD27 TM, NKG2D ICD, 및 CD3제타 신호전달 도메인; 또는
    (ddd) 동시자극 도메인인 ICD의 부재하에 CD27TM 및 CD3제타.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD5-특이적 가공된 수용체가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체인, 발현 작제물.
  3. 상기 CD5-특이적 가공된 수용체가 CAR인, 발현 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 CAR이 CD5에 대한 scFv 또는 리간드인 CD 표적화 세포 외 도메인을 포함하는, 발현 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CD5-특이적 CAR이 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 포함하고, 여기서 상기 CAR을 암호화하는 서열 내의 상기 중쇄가 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 업스트림에 있는, 발현 작제물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 CD5-특이적 CAR이 중쇄 및 경쇄를 갖는 scFv를 포함하고, 여기서 상기 CAR을 암호화하는 서열 내의 상기 중쇄가 5'에서 3' 방향으로 경쇄의 다운스트림에 있는, 발현 작제물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 CAR이 코돈 최적화된 scFv를 포함하는, 발현 작제물.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 CAR이 사람화된 scFv를 포함하는, 발현 작제물.
  9. 제4항 내지 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv가 서열번호 1에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  10. 제4항 내지 제6항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv가 서열번호 2를 포함하는, 발현 작제물.
  11. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv가 서열번호 3에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  12. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv가 서열번호 4를 포함하는, 발현 작제물.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 CAR이 신호전달 펩타이드를 포함하는, 발현 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신호전달 펩타이드가 CD8알파, Ig 중쇄, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체, CD3 신호전달 펩타이드, CD4 신호전달 펩타이드 또는 하나 이상의 다른 표면 수용체로부터 유래된 신호 펩타이드인, 발현 작제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TM이 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TM이 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 또는 서열번호 14를 포함하는, 발현 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ICD가 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 또는 서열번호 21에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ICD가 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 22를 포함하는, 발현 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체가 추가로 CD27, OX-40 (CD134), CD40L, 2B4, DNAM, CS1, CD48, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, ICOS, 또는 이의 조합으로부터의 ICD를 포함하는, 발현 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 가공된 수용체가 CD5-특이적 scFv와 막관통 도메인 사이에 힌지를 포함하는 CD5-특이적 CAR인, 발현 작제물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 힌지가 IgG 힌지, CD28 힌지, CD8 알파 힌지이고, 상기 힌지가 Gly3로 이루어진 인공 스페이서를 포함하거나, 상기 힌지가 IgG의 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인을 포함하는, 발현 작제물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 IgG 힌지가 IgG1 힌지, IgG2 힌지, IgG3 힌지 또는 IgG4 힌지인, 발현 작제물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 힌지가 서열번호 23 또는 25에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 힌지가 서열번호 24 또는 서열번호 26을 포함하는, 발현 작제물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토킨이 IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, IL-21, IL-7, IL-23 또는 이의 조합인, 발현 작제물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 가공된 수용체가 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45 또는 서열번호 47에 의해 암호화된 CAR인, 발현 작제물.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5-특이적 가공된 수용체가 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46 또는 서열번호 48을 포함하는 CAR인, 발현 작제물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물이 CD5-특이적 가공된 수용체 이외에 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는, 발현 작제물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리펩타이드 및 상기 CD 특이적 가공된 수용체가 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 작제물 상에서 분리된, 발현 작제물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 2A 요소가 E2A, T2A, 또는 P2A인, 발현 작제물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 E2A 요소가 서열번호 31에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 E2A 요소가 서열번호 32를 포함하는, 발현 작제물.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리펩타이드가 치료학적 단백질, 또는 상기 단백질을 포함하는 세포의 세포 활성, 확장 및/또는 지속성을 증진시키는 단백질인, 발현 작제물.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리펩타이드가 자살 유전자; 사이토킨; 단백질을 포함하는 세포의 증식, 확장 및/또는 대사 적합성을 증진시키는 사람 또는 바이러스 단백질인, 발현 작제물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 자살 유전자가 분비될 수 없는 돌연변이체 TNF-알파, 유도성 카스파제 9, HSV-티미딘 키나제, CD19, CD20, CD52, 또는 EGFRv3인, 발현 작제물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 사이토킨이 IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, IL-7, 또는 이의 조합인, 발현 작제물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 IL-15가 서열번호 29에 의해 암호화된, 발현 작제물.
  38. 제36항에 있어서, 상기 IL-15가 서열번호 30을 포함하는, 발현 작제물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
  42. 제40항에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터가 플라스미드, 리포좀, 나노입자, 지질, 탄수화물 또는 이의 조합인, 벡터.
  43. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 발현 작제물 또는 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 면역 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 면역 세포가 천연 킬러(NK) 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, MSC, 또는 수지상 세포인, 면역 세포.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 면역 세포가 NK 세포인, 면역 세포.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 NK 세포가 제대혈, 말초혈액, 유도만능 줄기 세포, 사람 배아 줄기 세포, 골수로부터, 또는 세포주로부터 유래되는, 면역 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 NK 세포주가 NK-92 세포주 또는 종양으로부터 또는 건강한 NK 세포 또는 전구체 세포로부터 유래된 또 다른 NK 세포주인, 면역 세포.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 제대혈 단핵 세포로부터 유래된, 면역 세포.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 CD56+ NK 세포인, 면역 세포.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 하나 이상의 외인성으로 제공된 사이토킨을 발현하는, 면역 세포.
  51. 제50항에 있어서, 상기 사이토킨이 IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, IL-7, IL-23 또는 이의 조합인, 면역 세포.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 변형된, 면역 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 발현이 부분적으로 또는 완전히 발현에서 감소된, 면역 세포.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자의 발현이 CRISPR 또는 TALEN을 사용하여 변형된, 면역 세포.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자가 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, CTLA-4, TDAG8, CD38, CREM 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역 세포.
  56. 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 적합한 배지에 존재하는, 면역 세포 집단.
  57. 제56항에 있어서, 상기 집단이 보관 설비에 수용되는, 집단.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 집단이 동결된, 집단.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 하나 이상의 사이토킨과 함께 동결보호제 또는 하나 이상의 사이토킨의 부재하에 동결보호제를 포함하는, 집단.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 NK 세포인, 집단.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 CAR 및 사이토킨을 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 NK 세포인, 집단.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 CAR 및 IL-15를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 NK 세포인, 집단.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 CAR 및 IL-15가 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 또는 서열번호 47에 의해 암호화된, 집단.
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 CAR 및 IL-15가 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 또는 서열번호 48에 포함되는, 집단.
  65. 개체에서 CD5-양성 세포를 사멸시키는 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 함유하는 유효량의 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 세포가 면역 세포인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 면역 세포가 NK 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 불변 NKT (iNKT) 세포, B 세포, 대식세포, 수지상 세포 또는 이의 혼합체인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 NK 세포가 제대혈, 말초혈액, 유도만능 줄기 세포, 사람 배아 줄기 세포, 골수로부터, 또는 세포주 또는 이들의 혼합체로부터 유래되는, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 NK 세포가 제대혈 단핵 세포로부터 유래하는, 방법.
  70. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 암을 갖는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 암이 고형 종양인, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 암이 혈액암인, 방법.
  73. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 개체에 대해 동종이계인, 방법.
  74. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 개체에 대해 자가인, 방법.
  75. 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 사람인, 방법.
  76. 제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 1회 또는 1회 초과로 상기 개체에게 투여되는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 세포의 개체로의 투여 사이의 지속 시간이 1-24 시간, 1-7 일, 1-4 주, 1-12 개월 또는 1년 이상인, 방법.
  78. 제65항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 추가의 치료요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 추가의 치료요법이 수술, 방사선 조사, 유전자 치료요법, 면역치료요법 또는 호르몬 치료요법을 포함하는, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 추가의 치료요법이 하나 이상의 항체를 포함하는, 방법.
  81. 제65항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 주사, 정맥내, 동맥내, 복막내, 흉막내, 기관내, 종양내, 근육내, 내시경적으로, 병변내, 두개내, 척추강내, 경피, 피하, 국소적으로, 관류에 의해, 종양 미세환경에서, 또는 이들의 조합에 의해 개체에게 투여되는, 방법.
  82. 제65항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에서 CD5-양성 암을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  83. 제65항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물을 함유하는 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  84. 개체에서 암을 예방하거나 암의 전이를 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 함유하는 치료학적 유효량의 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 개체가 암에 대한 위험에 처해있거나 이전에 암을 가진적 있는, 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 투여 단계가 1회 수행되는, 방법.
  87. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 투여 단계가 1회 초과로 수행되는, 방법.
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