KR102193635B1 - 복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102193635B1 KR102193635B1 KR1020177022200A KR20177022200A KR102193635B1 KR 102193635 B1 KR102193635 B1 KR 102193635B1 KR 1020177022200 A KR1020177022200 A KR 1020177022200A KR 20177022200 A KR20177022200 A KR 20177022200A KR 102193635 B1 KR102193635 B1 KR 102193635B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- delete delete
- antigen
- vector
- cea
- muc1
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 151
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title claims description 64
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 368
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 102
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 323
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 323
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 321
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 252
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 188
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 141
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 101
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 101
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 80
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 75
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 70
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 63
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 61
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 53
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 48
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 44
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 40
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 37
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 19
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 18
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 18
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 17
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 16
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 15
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 15
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 11
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 claims description 8
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 claims description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 7
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 claims 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract description 175
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 26
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 160
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 104
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 102
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 97
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 83
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 80
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 72
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 71
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 69
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 68
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 58
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 47
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 45
- 230000004044 response Effects 0.000 description 45
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 39
- 230000008088 immune pathway Effects 0.000 description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 36
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 35
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- -1 IL- 6 Proteins 0.000 description 34
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 29
- 230000006870 function Effects 0.000 description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 24
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 23
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 22
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 22
- 238000011220 combination immunotherapy Methods 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 20
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 19
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 241000894007 species Species 0.000 description 19
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 18
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 18
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 18
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 17
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 17
- 239000002585 base Substances 0.000 description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 15
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 15
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 15
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 13
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 12
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 12
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 12
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 11
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 description 11
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 10
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 10
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 10
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 9
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 9
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 9
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 8
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 8
- 102100033627 Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL1 Human genes 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 7
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 7
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 7
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 7
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 7
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 7
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 7
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 6
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 6
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 5
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 5
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102100031351 Galectin-9 Human genes 0.000 description 5
- 101100229077 Gallus gallus GAL9 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 5
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 5
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 5
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 description 5
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 5
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 5
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 5
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 5
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 5
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 5
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 5
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 5
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 5
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 5
- 206010067868 Skin mass Diseases 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 5
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 5
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 5
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 5
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 5
- 229940027570 adenoviral vector vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 5
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 5
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 4
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 4
- 102100035445 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 16 Human genes 0.000 description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 4
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 4
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 4
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 4
- 102100040578 G antigen 7 Human genes 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 description 4
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000737645 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 16 Proteins 0.000 description 4
- 101000893968 Homo sapiens G antigen 7 Proteins 0.000 description 4
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 4
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 4
- 102100021983 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 9 Human genes 0.000 description 4
- 101710164463 Preterminal protein Proteins 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 4
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 4
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 4
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 4
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 3
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 3
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 3
- 229940023835 Ad-based vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 3
- 101150108242 CDC27 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000589874 Campylobacter fetus Species 0.000 description 3
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100024530 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 20 Human genes 0.000 description 3
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 3
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 3
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 3
- 102100028914 Catenin beta-1 Human genes 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 description 3
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 3
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 3
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 3
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000981108 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 20 Proteins 0.000 description 3
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 3
- 101000916173 Homo sapiens Catenin beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 101001037256 Homo sapiens Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000614481 Homo sapiens Kidney-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000945351 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 3DL1 Proteins 0.000 description 3
- 101000617728 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 9 Proteins 0.000 description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 101000648075 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 3
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100040442 Kidney-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 3
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 3
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 3
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 102100025256 Trafficking protein particle complex subunit 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 3
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- FUHMZYWBSHTEDZ-UHFFFAOYSA-M bispyribac-sodium Chemical compound [Na+].COC1=CC(OC)=NC(OC=2C(=C(OC=3N=C(OC)C=C(OC)N=3)C=CC=2)C([O-])=O)=N1 FUHMZYWBSHTEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940126546 immune checkpoint molecule Drugs 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 2
- WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-4-methylphenyl)-3-{2-[({5-[(dimethylamino)methyl]-2-furyl}methyl)thio]ethyl}urea Chemical compound O1C(CN(C)C)=CC=C1CSCCNC(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 WEYNBWVKOYCCQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021305 Acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 101710137115 Adenylyl cyclase-associated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 102000052587 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Human genes 0.000 description 2
- 108700004606 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc3 Subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000004149 Annexin A2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 2
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 241001443586 Atadenovirus Species 0.000 description 2
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 2
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- 101000653197 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Movement protein TGB3 Proteins 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 2
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000039968 CEA family Human genes 0.000 description 2
- 108091069214 CEA family Proteins 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 102100035440 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 18 Human genes 0.000 description 2
- 102100024531 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 21 Human genes 0.000 description 2
- 102100025472 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 4 Human genes 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 102100024462 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor B Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102100040606 Dermatan-sulfate epimerase Human genes 0.000 description 2
- 101710127030 Dermatan-sulfate epimerase Proteins 0.000 description 2
- 101100216227 Dictyostelium discoideum anapc3 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100039699 G antigen 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100039698 G antigen 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710092267 G antigen 5 Proteins 0.000 description 2
- 102100039713 G antigen 6 Human genes 0.000 description 2
- 101710092269 G antigen 6 Proteins 0.000 description 2
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 2
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 101001042227 Homo sapiens Acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000737663 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 18 Proteins 0.000 description 2
- 101000981110 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 21 Proteins 0.000 description 2
- 101000914325 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000980919 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor B Proteins 0.000 description 2
- 101000954709 Homo sapiens Doublecortin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000886678 Homo sapiens G antigen 2D Proteins 0.000 description 2
- 101000886136 Homo sapiens G antigen 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000985516 Homo sapiens Hermansky-Pudlak syndrome 5 protein Proteins 0.000 description 2
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 2
- 101001134060 Homo sapiens Melanocyte-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000721712 Homo sapiens NTF2-related export protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000617708 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000617707 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 11 Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000842302 Homo sapiens Protein-cysteine N-palmitoyltransferase HHAT Proteins 0.000 description 2
- 101001109419 Homo sapiens RNA-binding protein NOB1 Proteins 0.000 description 2
- 101000620554 Homo sapiens Ras-related protein Rab-38 Proteins 0.000 description 2
- 101001010819 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000665137 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000813738 Homo sapiens Transcription factor ETV6 Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101710082837 Ice-structuring protein Proteins 0.000 description 2
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108050002021 Integrator complex subunit 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 2
- 102100034216 Melanocyte-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 2
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101001062862 Mus musculus Fatty acid-binding protein, adipocyte Proteins 0.000 description 2
- 241001138504 Mycoplasma bovis Species 0.000 description 2
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 2
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 2
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 2
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 2
- 101000621505 Peanut clump virus (isolate 87/TGTA2) Suppressor of RNA silencing Proteins 0.000 description 2
- 241000191992 Peptostreptococcus Species 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 2
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 2
- 102100022491 RNA-binding protein NOB1 Human genes 0.000 description 2
- 102100022305 Ras-related protein Rab-38 Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 102100023606 Retinoic acid receptor alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108050003189 SH2B adapter protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 2
- 102100038689 Scm-like with four MBT domains protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710185775 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 101710086566 T-box transcription factor T Proteins 0.000 description 2
- 102100033130 T-box transcription factor T Human genes 0.000 description 2
- 102100033082 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039580 Transcription factor ETV6 Human genes 0.000 description 2
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 2
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710107540 Type-2 ice-structuring protein Proteins 0.000 description 2
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710155955 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000028227 Viral hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 2
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 description 2
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 2
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009827 complement-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Chemical group 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100001223 noncarcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008726 retinoic acid receptors α Proteins 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- CDKIEBFIMCSCBB-UHFFFAOYSA-N 1-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1h-isoquinolin-2-yl)-3-(1-methyl-2-phenylpyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CCN1C(=O)C=CC(C1=CC=CN=C1N1C)=C1C1=CC=CC=C1 CDKIEBFIMCSCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039583 116 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein component Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100022089 Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 241000193798 Aerococcus Species 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 102100040069 Aldehyde dehydrogenase 1A1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102100032959 Alpha-actinin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710115256 Alpha-actinin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 241000498253 Ancylostoma duodenale Species 0.000 description 1
- 241000243790 Angiostrongylus cantonensis Species 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000244185 Ascaris lumbricoides Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241001148536 Bacteroides sp. Species 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 241001235572 Balantioides coli Species 0.000 description 1
- 241000606685 Bartonella bacilliformis Species 0.000 description 1
- 102100022970 Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like Human genes 0.000 description 1
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061692 Benign muscle neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000335423 Blastomyces Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 1
- 101000964894 Bos taurus 14-3-3 protein zeta/delta Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 1
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 1
- 241000439541 Brucella microti Species 0.000 description 1
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 1
- 241000244036 Brugia Species 0.000 description 1
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101150045267 CEA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001493160 California encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000190890 Capnocytophaga Species 0.000 description 1
- 101710198223 Capsid fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 102100035439 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 19 Human genes 0.000 description 1
- 102100025473 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100025474 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Human genes 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100026549 Caspase-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100038918 Caspase-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102100039361 Chondrosarcoma-associated gene 2/3 protein Human genes 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 102000011591 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010076130 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Proteins 0.000 description 1
- 241001327965 Clonorchis sinensis Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 241000223205 Coccidioides immitis Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100032368 Coiled-coil domain-containing protein 110 Human genes 0.000 description 1
- 241000204955 Colorado tick fever virus Species 0.000 description 1
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241000606678 Coxiella burnetii Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 201000003075 Crimean-Congo hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 1
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 1
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- 241000179197 Cyclospora Species 0.000 description 1
- 102100027816 Cytotoxic and regulatory T-cell molecule Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100181139 Drosophila melanogaster Pkcdelta gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026245 E3 ubiquitin-protein ligase RNF43 Human genes 0.000 description 1
- 102100037238 E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 Human genes 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241001184475 Echinococcus granulosus granulosus Species 0.000 description 1
- 241000244163 Echinococcus multilocularis Species 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 1
- 241000605314 Ehrlichia Species 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 description 1
- 101710144543 Endosialin Proteins 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010055191 EphA3 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100030324 Ephrin type-A receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241001480036 Epidermophyton floccosum Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000000832 Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100026693 FAS-associated death domain protein Human genes 0.000 description 1
- 241000242711 Fasciola hepatica Species 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024405 GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710144640 GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 241000193814 Gemella haemolysans Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021309 Germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000190708 Guanarito mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 102100040754 Guanylate cyclase soluble subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040735 Guanylate cyclase soluble subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100040739 Guanylate cyclase soluble subunit beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028963 Guanylate cyclase soluble subunit beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010019143 Hantavirus pulmonary infection Diseases 0.000 description 1
- 101150046249 Havcr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710100504 Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100028008 Heme oxygenase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100038970 Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Human genes 0.000 description 1
- 241000228402 Histoplasma Species 0.000 description 1
- 241000228404 Histoplasma capsulatum Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000608799 Homo sapiens 116 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein component Proteins 0.000 description 1
- 101000824278 Homo sapiens Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000890570 Homo sapiens Aldehyde dehydrogenase 1A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 description 1
- 101000903742 Homo sapiens Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like Proteins 0.000 description 1
- 101000765923 Homo sapiens Bcl-2-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100165850 Homo sapiens CA9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000737655 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000914326 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000983518 Homo sapiens Caspase-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000741072 Homo sapiens Caspase-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000741087 Homo sapiens Caspase-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000741014 Homo sapiens Caspase-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000983528 Homo sapiens Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000745414 Homo sapiens Chondrosarcoma-associated gene 2/3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000868824 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 110 Proteins 0.000 description 1
- 101000909516 Homo sapiens Contactin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000692702 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF43 Proteins 0.000 description 1
- 101000807547 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 Proteins 0.000 description 1
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000911074 Homo sapiens FAS-associated death domain protein Proteins 0.000 description 1
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 101001038755 Homo sapiens Guanylate cyclase soluble subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001038749 Homo sapiens Guanylate cyclase soluble subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001038731 Homo sapiens Guanylate cyclase soluble subunit beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001059095 Homo sapiens Guanylate cyclase soluble subunit beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001079615 Homo sapiens Heme oxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000882127 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Proteins 0.000 description 1
- 101001003149 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000599056 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000971605 Homo sapiens Kita-kyushu lung cancer antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100346929 Homo sapiens MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 1
- 101001057156 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133088 Homo sapiens Mucin-21 Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000588345 Homo sapiens Nuclear transcription factor Y subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001091194 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase G Proteins 0.000 description 1
- 101000619805 Homo sapiens Peroxiredoxin-5, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000829725 Homo sapiens Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000610208 Homo sapiens Poly(A) polymerase gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000617726 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000617727 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000617720 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000617721 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000617723 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001130763 Homo sapiens Protein OS-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000877404 Homo sapiens Protein enabled homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000591201 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase kappa Proteins 0.000 description 1
- 101001073409 Homo sapiens Retrotransposon-derived protein PEG10 Proteins 0.000 description 1
- 101001068027 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 1
- 101001068019 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform Proteins 0.000 description 1
- 101000863882 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000863883 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000688930 Homo sapiens Signaling threshold-regulating transmembrane adapter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000665150 Homo sapiens Small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 Proteins 0.000 description 1
- 101000665250 Homo sapiens Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2 Proteins 0.000 description 1
- 101000740162 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent transporter XTRP3 Proteins 0.000 description 1
- 101001056234 Homo sapiens Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 1
- 101000596234 Homo sapiens T-cell surface protein tactile Proteins 0.000 description 1
- 101000664703 Homo sapiens Transcription factor SOX-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 101000904724 Homo sapiens Transmembrane glycoprotein NMB Proteins 0.000 description 1
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001087422 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 13 Proteins 0.000 description 1
- 101001135589 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 22 Proteins 0.000 description 1
- 101000617285 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100020788 Interleukin-10 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 102000007482 Interleukin-13 Receptor alpha2 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010085418 Interleukin-13 Receptor alpha2 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100037795 Interleukin-6 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000712890 Junin mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 102100034872 Kallikrein-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100021533 Kita-kyushu lung cancer antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001466978 Kyasanur forest disease virus Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 1
- 241000222732 Leishmania major Species 0.000 description 1
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000712898 Machupo mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000005727 Mammaglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010031030 Mammaglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 208000009018 Medullary thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100027252 Melanoma-associated antigen C2 Human genes 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241001480037 Microsporum Species 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100025748 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710143111 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100034260 Mucin-21 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100403745 Mus musculus Myot gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 241000202952 Mycoplasma fermentans Species 0.000 description 1
- 241000963347 Mycoplasma haemocanis Species 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 241000202894 Mycoplasma orale Species 0.000 description 1
- 241000202889 Mycoplasma salivarium Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 description 1
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000016798 Myosin Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010028277 Myosin Type I Proteins 0.000 description 1
- DWAICOVNOFPYLS-OSMVPFSASA-N N-acetyl-D-galactosaminitol Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO DWAICOVNOFPYLS-OSMVPFSASA-N 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N N-acetyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-L-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102100022913 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 241000224438 Naegleria fowleri Species 0.000 description 1
- 241000498271 Necator Species 0.000 description 1
- 241000498270 Necator americanus Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 1
- 241000604969 Neorickettsia sennetsu Species 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 102100031719 Nuclear transcription factor Y subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000710944 O'nyong-nyong virus Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000011448 Omsk hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 241000243981 Onchocerca Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000242716 Opisthorchis Species 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000150218 Orthonairovirus Species 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100024894 PR domain zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000206591 Peptococcus Species 0.000 description 1
- 108010067163 Perilipin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000017794 Perilipin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022078 Peroxiredoxin-5, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000713137 Phlebovirus Species 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037419 Pituitary tumor-transforming gene 1 protein-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 101710199379 Pituitary tumor-transforming gene 1 protein-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 241000607000 Plesiomonas Species 0.000 description 1
- 102100040153 Poly(A) polymerase gamma Human genes 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010009975 Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010007288 PrPSc Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100022020 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100022021 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022025 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022026 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100022018 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100031492 Protein OS-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100035093 Protein enabled homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100030616 Protein-cysteine N-palmitoyltransferase HHAT Human genes 0.000 description 1
- 102000018471 Proto-Oncogene Proteins B-raf Human genes 0.000 description 1
- 108010091528 Proto-Oncogene Proteins B-raf Proteins 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102100034089 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase kappa Human genes 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037421 Regulator of G-protein signaling 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710140403 Regulator of G-protein signaling 5 Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100035844 Retrotransposon-derived protein PEG10 Human genes 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000606723 Rickettsia akari Species 0.000 description 1
- 241000606716 Rickettsia canadensis Species 0.000 description 1
- 241000606697 Rickettsia prowazekii Species 0.000 description 1
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 description 1
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 description 1
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 101000767160 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Intracellular protein transport protein USO1 Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000531795 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102100034464 Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 1
- 102100034470 Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform Human genes 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000620568 Siadenovirus Species 0.000 description 1
- 102100029946 Sialic acid-binding Ig-like lectin 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100029965 Sialic acid-binding Ig-like lectin 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100024453 Signaling threshold-regulating transmembrane adapter 1 Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000150288 Sin Nombre orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010041216 Sirtuin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038685 Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026503 Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Human genes 0.000 description 1
- 241001149963 Sporothrix schenckii Species 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001478880 Streptobacillus moniliformis Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101150050863 T gene Proteins 0.000 description 1
- 102000052935 T-box transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700035811 T-box transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100035268 T-cell surface protein tactile Human genes 0.000 description 1
- 108700019889 TEL-AML1 fusion Proteins 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- 241000244159 Taenia saginata Species 0.000 description 1
- 241000244157 Taenia solium Species 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000130764 Tinea Species 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 241000244030 Toxocara canis Species 0.000 description 1
- 241000244020 Toxocara cati Species 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 1
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 1
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 1
- 241001489145 Trichuris trichiura Species 0.000 description 1
- 241000223105 Trypanosoma brucei Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 1
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 1
- 101710165474 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100033014 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 13 Human genes 0.000 description 1
- 102100033138 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 22 Human genes 0.000 description 1
- 102100021657 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100031929 UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit Human genes 0.000 description 1
- 101710117112 UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 206010047697 Volvulus Diseases 0.000 description 1
- 241000244005 Wuchereria bancrofti Species 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 1
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 208000007456 balantidiasis Diseases 0.000 description 1
- FSVHTWITPYPMHK-UHFFFAOYSA-L barium(2+);2-carboxyphenolate Chemical compound [Ba+2].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O.OC1=CC=CC=C1C([O-])=O FSVHTWITPYPMHK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940092528 bartonella bacilliformis Drugs 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000006783 calponin Human genes 0.000 description 1
- 108010086826 calponin Proteins 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 108010072917 class-I restricted T cell-associated molecule Proteins 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940085435 giardia lamblia Drugs 0.000 description 1
- 210000001703 glandular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000005648 hantavirus pulmonary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000057860 human MUC1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- 201000007647 intestinal volvulus Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 108010024383 kallikrein 4 Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000026535 luminal A breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000026534 luminal B breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- XCKKIKBIPZJUET-VYKNHSEDSA-N morphine hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O XCKKIKBIPZJUET-VYKNHSEDSA-N 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 201000011682 nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108010000627 pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 7 Proteins 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046939 rickettsia prowazekii Drugs 0.000 description 1
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000007181 unidentified human coronavirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/235—Adenoviridae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
동일한 아데노바이러스 벡터로의 다중 백신접종 및 아데노바이러스에 대해 기존의 면역을 가진 개체에서의 백신접종을 가능하게 하는 아데노바이러스 벡터를 이용한 면역 반응의 생성 방법을 제공한다.
Description
상호 참조
본 출원은 2015년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/101,969호, 및 2015년 4월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/150,236호에 우선권을 주장하며, 이들은 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다.
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2013/032688호와 관련되며, 그 내용은 이로써 그 전문으로 참고로 포함된다.
연방정부로부터 후원 받은
연구에 대한 진술
본 발명은 미 국립 암 연구소(NCI)에서 주는 계약 번호 HHSN 261200900059C호, 및 NCI에서 주는 계약 번호 HHSN 261201100097C호; NCI에서 주는 보조금 번호 1R43CA134063호; NCI에서 주는 보조금 번호 2R44CA134063호; NCI에서 주는 보조금 번호 1R43CA186357호; 미 국립 치과 및 두개 안면 연구기관(NIDCR)에서 주는 보조금 번호 1R43DE21973호; 및 NIDCR에서 주는 보조금 번호 2R44DE021973호 아래 마국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포멧으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 이에 따라 그 전문을 참고 인용한다. 2016년 3월 4일에 생성된 상기 ASCII 카피는, 39891-718.601_SL.txt로 명명되며 크기는 64,101 바이트이다.
백신은 유해 물질 및 질환 세포를 인식하고 파괴하는 면역계를 단련시킴으로써 신체가 질병과 싸우는 것을 돕는다. 백신은 크게 두 가지 유형, 예방 및 치료 백신으로 나뉠 수 있다. 예방 백신은 건강한 사람들에게 특정 질환의 발생을 방지하기 위해 제공되는 한편, 면역요법으로도 언급되는 치료 백신은 질환이 있다고 진단받은 사람에게 질환이 진행되고 확산하는 것을 방지하는 것을 돕기 위해서나 예방법으로서 제공된다. 현재 감염증 및 암과 싸우는 것을 돕기 위해 바이러스 백신이 개발되고 있다. 이러한 바이러스 백신은 숙주 세포 내에서 질환과 관련된 유전자의 작은 부분의 발현을 유도하여 작용하고, 이는 차례로 숙주 세포 면역계가 질환 세포를 확인하고 파괴하는 것을 향상시킨다. 이와 같이, 바이러스 백신의 임상 반응은 백신이 고수준의 면역원성을 획득하고 지속적으로 장기간 발현하는 능력에 따라 결정될 수 있다. 면역 관문(immune checkpoint), 예를 들어 면역 억제 경로는 면역원성의 기초가 되는 생리학적 면역 반응의 기간 및 크기를 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 백신의 투여를 면역 관문 면역 억제 경로를 억제하는 약물과 병용함으로써 환자에서 백신의 효능 및 효과를 향상시킬 수 있다.
종양 관련 항원(TAA)을 전달하여 달성되는 암 면역요법은 생존 이점을 가질 수 있다; 그러나 이 전략에는 한계가 존재하며 면역학적으로 더 강력한 백신이 요구된다. 애주번트와 면역 자극 사이토카인의 동시 투여를 포함한 다양한 백신접종 전략은 낮은 면역원성의 자가-종양 항원을 다루는데 이용되어왔다. 또 다른 방법은 선천적인 염증유발(pro-inflammatory) 신호를 고유하게 제공하고 관심 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 아데노바이러스(adenovirus) 혈청형-5(Ad5)-기반 면역치료제는 안전하게 유지하면서 강한 T 세포 매개 면역(CMI) 반응을 유도하기 위해 인간에서 반복 사용되어왔다. Ad5 벡터는 다량으로 제조되어왔고 외래환자 투여를 위해 저장 및 전달에 안정하지만, 1세대(E1-결실된) Ad5-기반 벡터 사용의 주요 장애는 각각 결과적으로 표적 TAA에 대해 부적합한 면역 자극을 일으키는 이전의 야생형 아데노바이러스 감염 또는 Ad5-기반 백신의 반복 주사에 의한 Ad5 NAb의 유도로 인해서 숙주에서 존재할 수 있는 높은 빈도의 기존의 항-Ad5 중화 항체(NAb)이다.
아데노바이러스(Ad) 벡터의 주요 문제는 이들이 장기간 전이유전자 발현을 지속할 수 없다는 것이었는데, 그 이유는 주로 면역 적격 피험체에서 Ad 벡터 및 바이러스가 형질도입된 세포를 제거하는 숙주 면역 반응 때문이다. 1세대 Ad 벡터 백신의 사용은 Ad에 대한 기존의 또는 유도된 면역에 의해 엄격히 제한된다. 대부분의 인간은 Ad5 NAb를 가지며, 2/3는 Ad에 대한 림프구 증식 반응을 보인다. HIV-1 외피 유전자를 포함하는 Ad 벡터 백신은 애주번트가 없이 DNA를 이용하여 초회 감작된 면역 반응을 재면역화할 수 없었다. 비인간 영장류의 단일 면역화는 HIV 단백질에 대한 전이유전자 특이적 항체를 생성하거나, 전체 T-세포 반응을 변경할 수 없었다.
기존의 면역이 Ad 벡터 백신을 방해하는 여러 기전이 존재하지만, 한 가지 주요 관심사는 NAb의 존재에 뒤따르는 Ad 감염된 항원을 보유하는 세포의 CMI 제거이다. 이들 두 가지 반응은 모두 여러 Ad 단백질에 대한 것일 수 있다. 백신 용량의 증가는 Ad-면역 동물에서 바람직한 CMI 반응의 유도를 증가시킬 수 있지만, 결과적으로 동물 및 인간에서 대개 허용될 수 없는 부작용을 일으킨다. 1세대 Ad5 벡터를 이용하여, 초회 감작 백신접종으로서 네이키드(naked)(비벡터(non-vectored)) DNA, 이어서 Ad5 벡터 면역화를 이용하는 이종의 초회 감작-부스트(prime-boost) 레지멘(regimen)은 결과적으로 Ad5에 대한 후속적인 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 그래서 동일한 바이러스 골격을 이용하는 동일한 (또는 상이한) Ad 벡터 백신으로 추가의 재면역화(부스트)를 투여할 수 없다. 따라서, 현재 1세대 Ad5 벡터를 이용한 상기 접근법의 이용은 Ad5 벡터 면역화의 추가 사용을 방해할 수 있다.
1세대(E1-결실된) Ad 벡터 백신은, 수준이 감소되고 야생형 Ad 바이러스보다 더 긴 시간이 걸리긴 하지만, Ad 후기 유전자를 발현하고, 백신 항원은 높은 면역원성의 Ad 캡시드 단백질과 동시에 면역계에 제시된다. 항원의 경쟁으로 인해, 생성된 면역 반응은 바람직한 백신 에피토프에 대해 가능성이 작고 Ad-유래한 항원에 대해 가능성이 더 크다. Ad5 기반 벡터에 직면한 주요 문제 중 하나는 인간 집단에서 Ad에 대한 기존의 면역의 성향이 높다는 것과 이것이 어떻게 임의의 추가의 백신 적용에 대부분의 인간 집단에서 종래의 [E1-] 결실된 Ad5(1세대 Ad)의 사용을 불가능하게 할 수 있느냐이다. 1세대(E1-결실된) Ad5-기반 벡터 사용의 주요 장애는 높은 빈도의 기존의 항-아데노바이러스 5형 중화 항체이다. 이들 항체는, 각각 결과적으로 표적 TAA에 대한 부적합한 면역 자극을 일으키는 이전의 야생형 아데노바이러스 감염 및/또는 Ad5-기반 백신의 반복 주사에 의한 아데노바이러스 중화 항체의 유도로 인해 가능한 백신에 존재할 수 있다.
따라서, 더 효과적인 암 백신 벡터 후보물질이 필요하다. Ad에 대한 기존의 면역을 가진 개체에서 복합 백신접종 및 백신접종을 가능하게 하는 암표적화 Ad 백신 벡터가 요구된다. 종양 관련 항원(TAA)을 전달하여 달성되는 암 면역요법이 생존 이점을 제공하지만, 이들 전략에 제약이 존재하고 면역학적으로 더 강력한 백신이 요구된다.
발명의 요약
상기 문제를 극복하기 위해서, 본 발명은 감염증 및 암과 같은 복합 질환에 대해 향상된 치료 반응을 위한 복합 다중 표적화 백신, 면역요법 및 방법을 제공한다. 본 개시는 감염증 및 암과 싸우는 개체에서 면역 반응을 생성하기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 개시는 표적 항원에 대한, 또는 표적 항원 또는 적어도 하나의 표적 항원을 포함하는 표적 항원 시그니쳐를 발현하거나 제시하는 세포에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 항원 특이적 면역 반응의 유도와 관련하여 Ad5 [E1-] 벡터보다 안전할 뿐만 아니라 우수해 보여, 이들을 결과적으로 임상 반응을 일으킬 수 있는 MUC1, T 및/또는 CEA 백신을 전달하는 플랫폼으로서 훨씬 더 적합하게 만들 수 있다는 것이 발견되었다. 다른 경우에, 면역 유도는 수개월이 걸릴 수 있다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 항원 특이적 면역 반응의 유도와 관련하여 Ad5 [E1-] 벡터보다 안전할 뿐만 아니라 우수해 보여, 이들을 결과적으로 임상 반응을 일으킬 수 있는 MUC1c, T 및/또는 CEA 백신을 전달하는 플랫폼으로서 훨씬 더 적합하게 만들 수 있다.
본 발명의 여러 실시양태는 MUC1, T 및/또는 CEA에 대한 치료 백신 개발에 대해 오랫동안 찾아왔던 요구를 전달하는 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용하여 다른 Ad5 시스템으로 발견된 장애를 극복하고 Ad5에 이전에 노출되었던 사람들의 면역화를 허용한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, MUC1c, T 및/또는 CEA에 대한 치료 백신 개발에 대해 오랫동안 찾아왔던 요구를 전달하는 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용하여 다른 Ad5 시스템으로 발견된 장애를 극복하고 Ad5에 이전에 노출되었던 사람들의 면역화를 허용한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, MUC1n, T 또는 CEA에 대한 치료 백신 개발에 대해 오랫동안 찾아왔던 요구를 전달하는 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용하여 다른 Ad5 시스템으로 발견된 장애를 극복하고 Ad5에 이전에 노출되었던 사람들의 면역화를 허용한다.
자가 종양 항원의 낮은 면역원성을 다루기 위해, 애주번트와 면역 자극 사이토카인의 동시 투여를 포함한 다양한 진보된 다중 구성요소 백신접종 전략을 제공한다. 본 발명은 선천성 염증유발 신호를 제공하면서, 동시에 관심 항원을 발현하도록 조작된 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 모두 광범위한 안전성 프로파일을 유지하면서 강력한 T 세포 매개 면역(CMI) 반응을 유도하기 위해 인간에서 반복적으로 사용되어온 아데노바이러스 혈청형-5(Ad5)-기반 면역치료제가 특히 관심받고 있다.
한 측면에서, MUC1-C 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, MUC1-C 항원을 코딩하는 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, MUC1-C 항원은 서열 번호 9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 측면에서, 브라큐리(Brachyury) 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 브라큐리 항원을 코딩하는 서열은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응은 바이러스 벡터를 투여받은 인간에서 유도된다.
한 측면에서, MUC1-C 항원, 브라큐리 항원, 및 CEA 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 항원 또는 2가지 이상의 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응은 바이러스 벡터를 투여받은 인간에서 유도된다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원에 대한 항체의 생성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 세포 매개 면역(CMI)을 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC1-C 항원을 코딩하는 서열은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 브라큐리 항원을 코딩하는 서열은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CEA 항원을 코딩하는 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항원은 25, 15, 10, 5개 또는 그 이하의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 1개의 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 사이토메갈로바이러스, 센다이 바이러스, HPV 바이러스, 및 아데노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E4 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 형질감염된 세포에서 항원의 과발현을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 인간에서 항원을 발현하는 세포에 대해 기준선보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25배인 특이적 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 인간은 50, 75, 100, 125, 150, 160, 175, 또는 200보다 큰 역수의 Ad5 중화 항체 역가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간은 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 4767보다 큰 역수의 Ad5 중화 항체 역가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 항체 반응으로서 측정된다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 세포 매개 면역(CMI)으로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 IFN-γ 분비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 IL-2 분비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 ELISpot 분석법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 CMI는 106 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 IFN-γ 반점 형성 세포(SFC: spot forming cell)보다 많다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 종양 세포주 또는 자가 종양으로부터의 동종이형 항원 발현 세포, CAP-1 펄스된(pulsed) 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역원성 구성요소를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 구성요소는 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 구성요소는 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7과 실질적인 동일성을 갖는 단백질, 및 IL-7과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CEA 항원은 서열 번호 3에서 위치 610에 상응하는 위치에서 아스파테이트의 치환을 포함하는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 면역 반응을 활성화 또는 강화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 면역 반응 억제제를 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문은 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3, GAL9, ADORA, CD276, VTCN1, IDO1, KIR3DL1, HAVCR2, VISTA, 및 CD244로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 면역 경로 관문 단백질 또는 이들의 단편을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1 단백질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 siRNA, 안티센스, 소분자, 모방체, 리간드의 재조합 형태, 수용체의 재조합 형태, 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 조성물의 투여를 위한 인간의 선택 방법으로서, 인간의 HLA 아형을 결정하는 단계; 및 미리 선택된 하위군의 HLA 아형 중 하나임이 결정되는 경우, 인간에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 미리 선택된 하위군의 HLA 아형은 HLA-A2, HLA-A3, 및 HLA-A24 중 하나 이상을 포함한다.
한 측면에서, 인간의 암 또는 감염증의 치료 방법으로서, 인간에게 재조합 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 인간에서 MUC1-C, 브라큐리, CEA, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 면역 반응의 생성 방법으로서, 인간에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 1회 이상 반복된다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 이전의 투여 단계 후 약 2, 3, 4, 5, 또는 6주 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 이전의 투여 단계 후 약 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 후에 반복된다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 2회 반복된다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, MUC1-C 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3주 간격으로 투여하는 단계; 및 2단계 동안, 인간에서 MUC1-C 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3개월 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, 브라큐리 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3주 간격으로 투여하는 단계; 및 2단계 동안, 인간에서 브라큐리 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3개월 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, MUC1-C 항원, 브라큐리 항원, 및 CEA 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3주 간격으로 투여하는 단계; 및 2단계 동안, 인간에서 2가지 이상의 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 3회, 약 3개월 간격으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2단계는 1단계 종료 후 약 3개월에 시작한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, 브라큐리 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 2단계 동안, 인간에서 브라큐리 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, MUC1-C 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 2단계 동안, 인간에서 MUC1-C 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계 동안, MUC1-C 항원, 브라큐리 항원, 및 CEA 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 2단계 동안, 인간에서 2가지 이상의 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 2가지 이상의 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, n은 1보다 크다. 일부 실시양태에서, n은 3이다. 일부 실시양태에서, m은 1보다 크다. 일부 실시양태에서, m은 3이다. 일부 실시양태에서, 1단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주이다. 일부 실시양태에서, 2단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개월이다. 일부 실시양태에서, 2단계는 1단계가 종료한 후 3-16주에 시작한다. 일부 실시양태에서, 1단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 적어도 18일 간격이다. 일부 실시양태에서, 1단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 약 21일 간격이다. 일부 실시양태에서, 1단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 최대 24일 간격이다. 일부 실시양태에서, 2단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 적어도 10주 간격이다. 일부 실시양태에서, 2단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 약 13주 간격이다. 일부 실시양태에서, 2단계에서, 복제 결합 아데노바이러스의 2회 투여는 최대 16주 간격이다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다.
한 측면에서, 치료 방법으로서, 치료 1단계 및 치료 2단계를 선택하는 단계; 1단계에서, 인간에서 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간에게 총 n회 투여하는 단계; 및 2단계에서, 인간에서 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간에게 총 m회 투여하는 단계를 포함하고; 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 1단계, 2단계, 또는 두 단계 모두에서 투여하는 것인 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료를 필요로 하는 피험체의 치료 방법으로서, (a) (i) MUC1-C 항원, (ii) 브라큐리 항원, 또는 (iii) MUC1-C 항원, 브라큐리 항원, 및 CEA 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 항원을 코딩하는 재조합 복제 결합 아데노바이러스 벡터; 및 (b) 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 피험체에게 투여함으로써 피험체에서 면역 반응을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)는 연속하여 투여된다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)는 1개월 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 면역 반응을 활성화 또는 강화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 면역 반응 억제제를 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문은 면역 반응을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3, GAL9, ADORA, CD276, VTCN1, IDO1, KIR3DL1, HAVCR2, VISTA, 및 CD244로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 면역 경로 관문 단백질 또는 이들의 단편을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1 단백질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 siRNA, 안티센스, 소분자, 모방체, 리간드의 재조합 형태, 수용체의 재조합 형태, 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25배 증가된다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터와 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간은 혈청형 HLA-A2, HLA-A3, 또는 HLA-A24의 인간 백혈구 항원을 발현한다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E4 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 유전자 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E4 유전자 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011, 2.0x1011, 3.0x1011, 3.5x1011, 4.0x1011, 4.5x1011, 4.8x1011, 4.9x1011, 4.95x1011, 또는 4.99x1011 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 최대 7.0x1011, 6.5x1011, 6.0x1011, 5.5x1011, 5.2x1011, 5.1x1011, 5.05x1011, 또는 5.01x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 1.0-7.0x1011 또는 1.0-5.5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 4.5-5.5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 4.8-5.2x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 4.9-5.1x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 4.95-5.05x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물, 제2 조성물, 또는 두 조성물 모두는 4.99-5.01 x 1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주이다. 일부 실시양태에서, 2단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개월이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 항체 반응으로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 세포 매개 면역(CMI)으로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 IFN-γ 분비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 항원 특이적 IL-2 분비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 ELISpot 분석법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 CMI는 106 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 또는 300개 IFN-γ 반점 형성 세포(SFC)보다 많다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 종양 세포주 또는 자가 종양으로부터의 동종이형 항원 발현 세포, CAP-1 펄스된 항원 제시 세포의 T 세포 용해에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스는 인간에서 수지상 세포를 감염시키고, 여기서 감염된 수지상 세포는 항원을 제시함으로써 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 피하(sc) 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간은 투여 단계 전에 50, 75, 100, 125, 150, 160, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300보다 큰 역수의 Ad5 중화 항체 역가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간은 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 4767보다 큰 역수의 Ad5 중화 항체 역가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간은 스테로이드, 코르티코스테로이드, 및 면역억제제 중 어느 하나에 의해 동시에 치료받고 있지 않다. 일부 실시양태에서, 인간은 자가 면역 질환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간은 염증성 장질환, 전신 홍반 루푸스, 강직성 척추염, 피부경화증, 다발성 경화증, 바이러스성 간염, 또는 HIV를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간은 감염증을 갖거나 미래에 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간은 자가면역 관련 갑상선 질환 또는 백반증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간은 증식성 질환 암을 가지거나 미래에 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간은 결장직장 선암종, 전이성 결장직장암, 진행된 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 발현 결장직장암, 유방암, 폐암, 방광암, 또는 췌장암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간은 적어도 1, 2, 또는 3개 부위의 전이성 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간은 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA를 과발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA를 과발현하는 세포는 비암세포에서 기준선 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 발현에 비해 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA를 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 과발현한다. 일부 실시양태에서, MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA를 과발현하는 세포는 암세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 피험체는 진단받은 질환 소인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 피험체는 안정 병변(stable disease)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 피험체는 질환에 대해 유전적 소인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 결장암, 유방암, 또는 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 글리슨 점수(Gleason score)가 6 이하이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 글리슨 점수가 6보다 크다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 26048-26177, 26063-26141, 1-103, 54-103, 32214-32315, 및 32214-32262로부터 선택된 서열 번호 3 내 영역과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 3에서 위치 1057 내지 3165의 영역과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 항원을 코딩하는 서열을 포함하며; MUC1-C 항원은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되고; 브라큐리 항원은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩되고; CEA 항원은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 인간에서 면역 반응을 유도하기 위한 키트로서, 부피가 0.8-1.2 mL 범위이고 적어도 1.0x1011 바이러스 입자를 포함하는 치료 용액을 포함하는 조성물로, 바이러스 입자는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 것인 조성물; 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물의 치료 용액을 포함하는 조성물 및; 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료 용액은 1.0-5.5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터는 형질감염된 세포에서 변형된 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA의 과발현을 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 MUC1-C 항원, 브라큐리 항원, CEA 항원, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원을 각각 포함하는 제1, 제2 및 제3 복제 결함 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터는 인간에서 MUC1-C, 브라큐리, 또는 CEA 발현 세포에 대해 특이적 면역 반응을 유도하는 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3, GAL9, ADORA, CD276, VTCN1, IDO1, KIR3DL1, HAVCR2, VISTA, 및 CD244로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 면역 경로 관문 단백질 또는 이들의 단편을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 siRNA, 안티센스, 소분자, 모방체, 리간드의 재조합 형태, 수용체의 재조합 형태, 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설명서는 증식성 질환 또는 암의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 설명서는 감염증의 치료를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 적어도 1.0x1011, 2.0x1011, 3.0x1011, 3.5x1011, 4.0x1011, 4.5x1011, 4.8x1011, 4.9x1011, 4.95x1011, 또는 4.99x1011 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 최대 7.0x1011, 6.5x1011, 6.0x1011, 5.5x1011, 5.2x1011, 5.1x1011, 5.05x1011, 또는 5.01x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 1.0-7.0x1011 또는 1.0-5.5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 4.5-5.5x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 4.8-5.2x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 4.9-5.1x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 4.95-5.05x1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 용액은 4.99-5.01 x 1011 바이러스 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 면역원성 구성요소를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 구성요소는 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 구성요소는 IL-7, IL-7을 코딩하는 핵산, IL-7과 실질적인 동일성을 갖는 단백질, 및 IL-7과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
참고의 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 포함된다고 구체적으로 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다.
[도 1]은 Ad5-눌(null)(공벡터)로 면역된 생쥐의 항체 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다. 생쥐는 Ad5-눌 바이러스 입자(VP)로 14일 간격으로 3회 면역시켰다. 각 면역화 후에 항-Ad 항체(중화 항체) 수준이 증가하였다.
[도 2]는 Ad5-눌로 면역된 생쥐의 중화 항체(NAb) 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다. 생쥐는 Ad5-눌 VP로 14일 간격으로 3회 면역시켰다. 각 면역화 후 중화 항체 수준이 감소하였다. 광학 밀도 판독 값은 생존 표적 세포의 존재를 나타낸다.
[도 3]은 Ad5-눌 벡터 플랫폼으로 주사 후 C57Bl/6 생쥐에서 NAb의 유도를 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad 입자로 반복 주사 후 생쥐에서 NAb의 수준증가가 유도되었다.
[도 4A]는 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 Ad5-면역 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IFNγ 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 군에서 유의하게 상승된 반응을 나타낸다.
[도 4B]는 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 Ad5-면역 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IL-2를 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 군에서 유의하게 상승된 반응을 나타낸다.
[도 5]는 대조군 생쥐 및 1x1010 Ad5 [E1-]-CEA VP 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP로 백신접종된 생쥐에서 혈청 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 6]은 MC38 CEA-발현 종양 세포로 주사된 후 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 백신으로 처리된(Vac) Ad5-면역 C57Bl/6 생쥐에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타내는 선 그래프를 예시한다. 종양 크기는 미처리 종양 보유 생쥐와 비교하여 제19-21일까지 유의하게 감소한다는 것을 나타낸다.
[도 7]은 7마리의 처리 및 7마리의 미처리 Ad5-면역 MC38 종양 보유 생쥐의 종양 중량을 나타내는 그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 처리된 생쥐에서 종양 중량의 유의한 (p=0.0124) 감소를 나타낸다.
[도 8]은 Gag에 대한 생쥐 단클론 항체를 이용한 면역블롯이며, Ad5 [E1-, E2b-]-Gag로 감염된 A549 세포에 의한 Gag 생산을 예시한다. A549 전세포 용해액을 Ad5 [E1-, E2b-]-gag 또는 Ad5-눌로 200의 감염 다중도(MOI)에서 44 h 감염시켰다. 위 밴드(55kDa)는 gag 전구체를 포함한다. 아래 밴드(41kDa)는 p17/p24 gag 복합체를 포함한다.
[도 9]는 더 큰 세포 매개 면역(CMI) 반응 유도시 다중 면역화의 효과를 예시하는 그래프이다. Ad5-미접촉(Naive) BALB/C 생쥐(n=5/군)는 1x1010 Ad5 [E1-]-눌 VP, Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP, Ad5 [E1-]-Gag VP, Ad5 [E1-, E2b-]-Gag VP, 또는 완충액 단독으로 1회 또는 3회, 14일 간격으로 면역시켰다. 비장 세포로부터 IFN-γ 분비는 최종 면역화 후 14일에 ELISpot 분석법으로 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 콘카나발린 A(Con A)에 노출시켰다.
[도 10A]는 야생형 Ad5에 미리 면역된 게먹이 원숭이(Cynomolgus Macaque)(n=3)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 ELISpot INF-γ 분석 결과를 예시한다. 상승된 수준의 INF-γ 유도(P<0.05)를 나타낸다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 10B]는 [도 10A]의 ELISpot IL-2 분석 결과를 예시한다.
[도 11]은 INF-γ를 분비하는 재조합 Ad5 CEA 발현 벡터로 백신접종된 생쥐의 반점 형성 세포(AFC) 수를 도시하는 그래프를 예시한다. Ad5 [E1-]-CEA로 백신접종된 생쥐의 SFC 감소와 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 백신접종된 생쥐의 SFC 감소를 나타낸다.
[도 12A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트(Cohort) 1 및 2에서 7명의 환자의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 플롯을 예시한다.
[도 12B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트 3 및 II 상에서 21명 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 12C]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트 5에서 6명 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 12D]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 34명 모든 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 13A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 3회 치료받은 28명 암 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 13B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 27명 결장직장암 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 14]는 치료받은 환자에서 CEA에 대한 CMI 반응을 예시한다. CMI(IFN-γ 분비)는 기준선에서(전) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 투여 후(후)에 평가하였다. 치료 후 환자에서 나타난 최고의 CMI 반응(시점과 무관하게)은 용량 반응을 나타냈다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량의 5x1011 VP를 받은 환자(코호트 5)에서 나타났다. CMI 반응은 코호트 3/II 상(p=0.0002; 만-위트니 검정(Mann-Whitney test)) 및 코호트 5(p=0.0317; 만-위트니 검정) 경우 그들의 기준선(전) 값과 비교하여 유의하게 상승되었다. 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag와의 반응성의 결여로 나타냈다. 양성 대조군 PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 15]는 치료받은 환자에서 CEA에 대한 CMI 반응을 예시한다. CMI(IFN-γ 분비)는 모두 4개-용량의 코호트에서 기준선(제0주)에서 및 최후 면역요법 후 3주(제9주)에 평가하였다. 용량 반응을 나타내며 최고의 CMI 수준은 최고의 용량을 받은 환자에서 일어났다. 최고 용량을 이용한 CMI 반응은 유의하게 상승되었다(P<0.02; 만-위트니 검정). 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag와의 반응성의 결여로 나타냈다. 양성 대조군 PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 16A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 Ad5 면역 반응을 예시한다. Ad5에 대한 Ad5 NAb 역가는 기준선(제0주)에서 및 3차 면역화 후 3주(제9주)에 환자에서 결정하였다. Ad5에 특이적인 환자로부터 IFN-γ를 분비하는 PBMC 수는 ELISpot에 의해 결정하였다. Ad5 NAb 역가는 제9주에 유의하게 상승하였다(p<0.0001; 만-위트니 검정).
[도 16B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 Ad5 면역 반응을 예시한다. CMI 반응은 기준선(제0주)에서 및 3차 면역화 후 3주(제9주)에 환자에서 결정하였다. Ad5에 특이적인 환자로부터 IFN-γ를 분비하는 PBMC 수는 ELISpot에 의해 결정하였다. Ad5 CMI 반응은 제9주에 유의하게 상승하였다(P < 0.01; 만-위트니 검정).
[도 17A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 CEA 특이적 면역 및 Ad5 면역과의 비교를 예시한다. 낮은 기존의 Ad5 면역(NAb<200)에 대해 아무것도 받지 않은 환자에서 PBMC의 IFN-γ 분비에 의해 측정된 바와 같이 1x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 받은 환자(n=19)에서 평균 CEA 특이적 면역 반응을 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료 개시 전에 높은 기존의 Ad5 면역(NAb≥200)을 갖는 환자의 CEA 특이적 면역 반응과 비교하여 나타낸다. 검정된 어느 시점에서도 두 군 사이에 유의한 차이는 없었다(p>0.4, 만-위트니 검정)
[도 17B]는 기존의 Ad5 NAb 활성과 최고 수준의 유도된 CEA CMI 반응 사이에 연관성의 플롯을 예시한다. r2 값(0.0155)은 기존의 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI ELISpot 반응 사이에 연관성이 없다는 것을 나타낸다.
[도 17C]는 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI 반응 사이에 연관성의 플롯을 예시한다. r2 값(0.0069)은 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI ELISpot 반응 사이에 연관성이 없다는 것을 나타낸다.
[도 18]은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 32명 전이성 결장직장암 환자(mCRC)에서 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역요법의 효과를 증명하는 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 19]는 mCRC 환자에서 기준선(면역되기 전) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 투여 후(면역된 후)에 CMI 반응(IFN-γ 분비)을 예시한다. 치료 후 환자에서 관찰된 최고의 CMI 반응(시점과 무관하게)은 용량 반응을 나타냈다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량을 받은 환자(코호트 5)에서 일어났으며 유의하게 상승되었다(p<0.02; 만-위트니 검정). 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag의 반응성의 결여로 나타낸다. 양성 대조군 경우, PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 20]은 제0, 3, 6, 및 9주에 평가된, 면역된 mCRC 환자에서 CMI 반응(ELISpot IFN-γ SFC)을 예시한다. CMI 반응은 면역화 과정에서 증가하였다.
[도 21]은 면역되기 전(제0주) 및 면역된 후(제6-9주) 치료에 대해 평가된 세포독성 T 세포(CTL: ctolytic T-cell) 매개된 세포독성 반응(ELISpot 그랜자임 B 분비하는 SFC)을 예시한다. 반응은 면역화 후에 증가하였다(P < 0.05, 윌콕슨 검정( Wilcoxon test)).
[도 22]는 ELISpot IFN-γ SFC에 의해 평가된 바와 같이 5명의 면역된 mCRC 환자의 추적 PBMC 시료에서 CMI 반응을 예시한다. CMI 반응은 제9주에 피크를 이루었으며 치료 정지 후 제26주까지 감소하였다.
[도 23]은 비장 세포로부터 IFN-γ 분비(IFN-γ SFC)에 대해 ELISpot 분석법으로 평가된 바와 같이 CEA, MUC1, 및 브라큐리에 대해 면역된 생쥐에서 CMI 반응을 예시한다. IFN-γ SFC는 다중 표적화 면역된 생쥐(CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리)에서 검출되었지만 Ad5-눌(공벡터)로 주사된 대조군 생쥐에서는 검출되지 않았다. ELISpot 분석법의 반응 특이성은 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드 항원에 대한 반응성의 결여로 확인하였다. 양성 대조군은 Con A에 노출된 세포를 포함하였다.
[도 24A]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하지만 Ad5-눌로 주사된 대조군에서는 발현하지 않는 다기능성 CD8α+ 비장 세포에 대한 유세포 분석 결과의 막대그래프를 예시한다. 반응의 특이성은 배지 단독 또는 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드에 대한 반응성의 결여로 확인하였다.
[도 24B]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하지만 Ad5-눌로 주사된 대조군에서는 발현하지 않는 다기능성 CD4+ 비장 세포에 대한 유세포 분석 결과의 막대그래프를 예시한다. 반응의 특이성은 배지 단독 또는 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드에 대한 반응성의 결여로 확인하였다.
[도 25A]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 유도되지만 대조군 생쥐에서는 유도되지 않는 CEA 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 반응의 통계적 유의성(p<0.0001)을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 25B]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 유도되지만 대조군 생쥐에서는 유도되지 않는 CEA 보체 의존성 세포성 세포독성(CDCC) 반응의 통계적 유의성(p<0.0001)을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 26A]는 MUC1 종양 세포를 발현하는 MC38 종양 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하고 제0, 7, 14일에 1x1010 Ad5-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C VP를 오른쪽 옆구리에 투여한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)로부터의 결과를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C로 처리된 생쥐는 대조군과 비교하여 제15 및 18일에 유의하게 (p<0.05) 더 작은 종양을 보였으며 유의하게 더 오래 생존하였다. 실험은 제36일에 종료하였다.
[도 26B]는 [도 26A]에 기재된 바와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C로 처리된 생쥐가 대조군과 비교하여 제15 및 18일에 유의하게 (p<0.05) 더 오래 생존했다는 것을 예시한다.
[도 27]은 브라큐리를 발현하는 MC38 종양 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하고 제5, 11, 및 17일에 1x1010 Ad5-눌 VP(n=4) 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP(n=5)를 오른쪽 옆구리에 투여한 C57Bl/6 생쥐로부터의 결과를 예시한다. 종양은 제15, 19, 및 22일에 처리된 생쥐에서 더 작았다.
[도 28]은 HPV-E6/E7 발현 TC-1 종양 세포를 이식하고(제0일) 제10, 17, 24일에 1x1010 Ad5-눌 VP + 100 ㎍ 대조군 IgG(복강 내), 1x1010 Ad5-눌 VP + 100 ㎍ 항-PD1, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 VP + 100 ㎍ 생쥐 IgG, 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 VP + 100 ㎍ 항-PD1을 이용한 면역요법으로 처리한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)에서 HPV 면역요법의 효과를 예시한다. 항-PD1을 포함 또는 미포함한 면역요법은 결과적으로 제23일까지 종양 성장의 유의한 억제를 일으켰다(p<0.05). 모든 대조군 생쥐는 종양 덩어리로 인해 제23일까지 희생되었다.
[도 29]는 [도 28]에서 항-PD1 주사를 이용한 면역요법으로 처리된 2마리 생쥐에서 종양 성장 및 퇴화에 대해 복합 다중 표적화 HPV 면역요법 효과를 예시한다. 종양 성장은 제20 및 27일에 각각 피크를 이루었으며, 그 이후로 퇴화하였다.
[도 30A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 감염된 인간 수지상 세포(DC: dendritic cell)에서 브라큐리 단백질의 발현을 예시한다. SW620 종양 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 브라큐리의 발현은 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 감염된 DC에서 강력하였다.
[도 30B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1로 감염된 인간 DC에서 MUC1 단백질의 발현을 예시한다. SW620 종양 세포는 양성 대조군으로 사용하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. MUC1 발현은 Ad5 [E1-, E2b-]-눌로 감염된 DC와 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 벡터로 감염된 인간 DC에서 관찰되었다.
[도 31A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP, 또는 Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물)로 3회, 2주 간격으로 백신접종된 C57Bl/6 생쥐(n = 5/군)의 비장 세포로부터 분비된 IFN-γ의 분석을 예시한다. 대조군은 3x1010 Ad5-눌 VP를 받았다. 비장 세포는 최종 백신접종 후 14일에 수집하여 ELISpot 분석법으로 IFN-γ 분비를 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다. 컬럼 사이의 유의한 차이(p<0.05)를 p-값으로 보고하였다. 유의하지 않음 = ns.
[도 31B]는 [도 31A]에 기재된 백신접종된 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IL-2의 분석을 예시한다. 비장 세포는 ELISpot 분석법으로 IL-2 분비를 평가하였다.
[도 32A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP 또는 Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물)로 3회, 2주 간격으로 백신접종된 C57Bl/6 생쥐(n=5/군)의 백신접종 후 CD8+ 및 다기능성 세포 집단의 분석 그래프를 예시한다. 대조군은 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. 비장 세포는 최종 백신접종 후 14일에 수집하여 FACS에 의해 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8α+ 세포를 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 32B]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 CD4+ 세포 및 다기능성 세포 집단의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 32C]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8α+ 세포의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 32D]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD4+ 세포의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 33A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물), 또는 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP로 3회 백신접종된 생쥐에서 CEA IgG 수준의 ELISA 분석을 예시한다.
[도 33B]는 [도 33A]에서 기재된 생쥐를 이용한 MC38-CEA2 세포에 대한 CDC 분석을 예시한다.
[도 34]는 1x106 MC-38-MUC1 세포 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP 또는 Tri-Ad5(1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP, 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP의 1:1:1 혼합물(총 3x1010 VP))를 왼쪽 옆구리에 피하 접종한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)에서 종양 부피에 대한 면역요법의 효과를 예시한다. 대조군 생쥐는 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. (*)는 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 처리된 생쥐가 대조군 생쥐보다 유의하게 더 작은 (p<0.05) 종양을 보였을 때 경과일수를 나타내고 (^)는 Tri-Ad5-처리된 생쥐가 대조군 생쥐보다 유의하게 더 작은 (p<0.05) 종양을 보였을 때 경과일수를 나타낸다. Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1과 Tri-Ad5-처리된 생쥐 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.1).
[도 35]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 감염된 A549 세포에서 CEA의 발현을 나타내는 면역블롯을 예시한다. (A) 음성 대조군. (B) 단백질 분자량 마커. (C) 음성. (D) CEA 기준 물질(30 ng). (E) Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 용해액(20 ㎕). (F) Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 용해액(20 ㎕). (G) 음성 A549 세포. 재조합 CEA는 양성 대조군으로 사용하였고 감염되지 않은 A549 세포는 음성 대조군으로 사용하였다.
[도 36]은 1x108, 1x109 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP의 용량으로 3회, 14일 간격으로 면역되고 최종 면역화 후 14일에 평가된 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 비장 세포의 ELISpot에 의해 측정된 CMI 용량 반응을 예시한다. CMI의 최대 유도는 1x1010 VP 용량으로 달성되었다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 37A]는 1x1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP로 3회, 2주 간격으로 면역된 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 면역화 후 CD8-α+/IFN-γ+ 비장 세포의 활성화를 예시한다. 대조군은 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. 최종 면역화 후 14일에 수집한 비장 세포는 유세포 분석으로 평가하였다. 양성 대조군 경우, 비장 세포를 PMA/이오노마이신에 노출시켰다.
[도 37B]는 [도 37A]에 기재된 바와 같이 생쥐의 면역화 후 CD8-α+/IFN-γ+/TNF-α+ 비장 세포의 활성화를 예시한다.
[도 38A]는 제0일에 2x105 비촉지성(non-palpable) HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제1, 8 및 15일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응(unpaired) t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 * (p<0.05) 및 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 38B]는 맨틀-콕스 검정(Mantel-Cox test)을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 38A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 39A]는 제0일에 2x105 작은 촉지성(palpable) HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제6, 13 및 20일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=4/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 39B]는 맨틀-콕스 검정을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 39A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 40A]는 제0일에 2x105 크게 확립된 HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제13, 20 및 27일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=4/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 40B]는 맨틀-콕스 검정을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 40A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 41A]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP + 100 ㎍의 이소형 대조군 쥐 IgG를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 종양 성장 속도론은 각 군에서 개별 생쥐를 나타낸다.
[도 41B]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP + 100 ㎍의 항-PD1 항체를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 41C]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP + 100 ㎍의 이소형 대조군 쥐 IgG를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 41D]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP + 100 ㎍ 항-PD1을 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 42]는 [도 41A-D]에서 생쥐들과 같이 처리된 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 생존 곡선을 예시한다. 실험은 종양 이식 후 제52일에 종료하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 대조군 항체로 처리된 생쥐는 대조군 생쥐(Ad5 [E1-, E2b-]-눌 및 대조군 항체 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 및 항-PD1 항체)의 두 군 모두에 비해 유의하게 (p < 0.008) 더 긴 생존을 나타냈다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 대조군 항체로 처리된 7마리 생쥐 중 2마리(29%)는 제52일에 생존하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체로 처리된 생쥐는 두 가지 군의 대조군 모두와 비교하여 유의하게 (p < 0.0006) 더 긴 생존을 나타냈다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체 처리된 7마리 생쥐 중 4마리(57%)는 제52일에 생존하였다.
[도 43A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7이 CD8+ 종양-침윤성 림프구(TIL)의 TC-1 종양으로의 동원을 촉진한다는 것을 예시한다. C57BL/6 생쥐(n=5/군)를 2x105 TC-1 종양 세포로 이식하였다. 이식 후 12일에 생쥐는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 공벡터 + 대조군 IgG, Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 항-PD1, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 대조군 IgG, 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1로 치료를 시작하였다. 백신은 매주 피하 투여하고 항-PD1 항체는 3-4일 마다 복강 내 주사를 통해 투여하고 종양은 제27일에 분석하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리는 Treg/CD8+ TIL의 비율을 유의하게 감소시킨다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실시하였으며 유의성은 ns (p>0.05), * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001), 또는 **** (p<0.0001)로 나타낸다.
[도 43B]는 [도 43A]의 Treg/CD8+ TIL에서 비율 감소가 Treg 수의 감소에 의해 유발되지 않는다는 것을 예시한다.
[도 43C]는 [도 43A]의 Treg/CD8+ TIL에서 비율 감소가 CD8+ TIL 수의 증가를 통해 유발된다는 것을 예시한다.
[도 44A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체 복합 요법이 염증유발 종양 미세환경을 촉진한다는 것을 예시한다. C57BL/6 생쥐(n=5/군)에 [도 43A-C]에서와 같이 종양을 이식하고, 처리하고, 종양을 분석하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 처리된 생쥐의 종양에서 PD1+ CD4+ 및 CD8+ TIL의 빈도가 증가한다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 PD1+ CD4+ 및 CD8+ TIL (A), LAG-3+ CD8+ TIL (B), 및 (C)의 빈도가 유의하게 더 낮다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실시하였으며 유의성은 ns (p>0.05), * (p<0.05), ** (p<0.01), 또는 *** (p<0.001)로 나타낸다.
[도 44B]에서 [도 44A]에서와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 LAG-3+ CD8+ TIL의 빈도가 유의하게 더 낮으며, 그 수준이 대조군 생쥐의 종양과 더 비슷하다는 것을 예시한다.
[도 44C]에서 [도 44A]에서와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 PDL1의 발현 수준이 유의하게 감소한다는 것을 예시한다.
[도 2]는 Ad5-눌로 면역된 생쥐의 중화 항체(NAb) 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다. 생쥐는 Ad5-눌 VP로 14일 간격으로 3회 면역시켰다. 각 면역화 후 중화 항체 수준이 감소하였다. 광학 밀도 판독 값은 생존 표적 세포의 존재를 나타낸다.
[도 3]은 Ad5-눌 벡터 플랫폼으로 주사 후 C57Bl/6 생쥐에서 NAb의 유도를 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad 입자로 반복 주사 후 생쥐에서 NAb의 수준증가가 유도되었다.
[도 4A]는 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 Ad5-면역 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IFNγ 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 군에서 유의하게 상승된 반응을 나타낸다.
[도 4B]는 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 Ad5-면역 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IL-2를 나타내는 막대그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 군에서 유의하게 상승된 반응을 나타낸다.
[도 5]는 대조군 생쥐 및 1x1010 Ad5 [E1-]-CEA VP 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP로 백신접종된 생쥐에서 혈청 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 수준을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 6]은 MC38 CEA-발현 종양 세포로 주사된 후 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 백신으로 처리된(Vac) Ad5-면역 C57Bl/6 생쥐에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타내는 선 그래프를 예시한다. 종양 크기는 미처리 종양 보유 생쥐와 비교하여 제19-21일까지 유의하게 감소한다는 것을 나타낸다.
[도 7]은 7마리의 처리 및 7마리의 미처리 Ad5-면역 MC38 종양 보유 생쥐의 종양 중량을 나타내는 그래프를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 처리된 생쥐에서 종양 중량의 유의한 (p=0.0124) 감소를 나타낸다.
[도 8]은 Gag에 대한 생쥐 단클론 항체를 이용한 면역블롯이며, Ad5 [E1-, E2b-]-Gag로 감염된 A549 세포에 의한 Gag 생산을 예시한다. A549 전세포 용해액을 Ad5 [E1-, E2b-]-gag 또는 Ad5-눌로 200의 감염 다중도(MOI)에서 44 h 감염시켰다. 위 밴드(55kDa)는 gag 전구체를 포함한다. 아래 밴드(41kDa)는 p17/p24 gag 복합체를 포함한다.
[도 9]는 더 큰 세포 매개 면역(CMI) 반응 유도시 다중 면역화의 효과를 예시하는 그래프이다. Ad5-미접촉(Naive) BALB/C 생쥐(n=5/군)는 1x1010 Ad5 [E1-]-눌 VP, Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP, Ad5 [E1-]-Gag VP, Ad5 [E1-, E2b-]-Gag VP, 또는 완충액 단독으로 1회 또는 3회, 14일 간격으로 면역시켰다. 비장 세포로부터 IFN-γ 분비는 최종 면역화 후 14일에 ELISpot 분석법으로 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 콘카나발린 A(Con A)에 노출시켰다.
[도 10A]는 야생형 Ad5에 미리 면역된 게먹이 원숭이(Cynomolgus Macaque)(n=3)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 ELISpot INF-γ 분석 결과를 예시한다. 상승된 수준의 INF-γ 유도(P<0.05)를 나타낸다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 10B]는 [도 10A]의 ELISpot IL-2 분석 결과를 예시한다.
[도 11]은 INF-γ를 분비하는 재조합 Ad5 CEA 발현 벡터로 백신접종된 생쥐의 반점 형성 세포(AFC) 수를 도시하는 그래프를 예시한다. Ad5 [E1-]-CEA로 백신접종된 생쥐의 SFC 감소와 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 백신접종된 생쥐의 SFC 감소를 나타낸다.
[도 12A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트(Cohort) 1 및 2에서 7명의 환자의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 플롯을 예시한다.
[도 12B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트 3 및 II 상에서 21명 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 12C]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 코호트 5에서 6명 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 12D]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 34명 모든 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 13A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 3회 치료받은 28명 암 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 13B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 27명 결장직장암 환자의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 14]는 치료받은 환자에서 CEA에 대한 CMI 반응을 예시한다. CMI(IFN-γ 분비)는 기준선에서(전) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 투여 후(후)에 평가하였다. 치료 후 환자에서 나타난 최고의 CMI 반응(시점과 무관하게)은 용량 반응을 나타냈다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량의 5x1011 VP를 받은 환자(코호트 5)에서 나타났다. CMI 반응은 코호트 3/II 상(p=0.0002; 만-위트니 검정(Mann-Whitney test)) 및 코호트 5(p=0.0317; 만-위트니 검정) 경우 그들의 기준선(전) 값과 비교하여 유의하게 상승되었다. 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag와의 반응성의 결여로 나타냈다. 양성 대조군 PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 15]는 치료받은 환자에서 CEA에 대한 CMI 반응을 예시한다. CMI(IFN-γ 분비)는 모두 4개-용량의 코호트에서 기준선(제0주)에서 및 최후 면역요법 후 3주(제9주)에 평가하였다. 용량 반응을 나타내며 최고의 CMI 수준은 최고의 용량을 받은 환자에서 일어났다. 최고 용량을 이용한 CMI 반응은 유의하게 상승되었다(P<0.02; 만-위트니 검정). 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag와의 반응성의 결여로 나타냈다. 양성 대조군 PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 16A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 Ad5 면역 반응을 예시한다. Ad5에 대한 Ad5 NAb 역가는 기준선(제0주)에서 및 3차 면역화 후 3주(제9주)에 환자에서 결정하였다. Ad5에 특이적인 환자로부터 IFN-γ를 분비하는 PBMC 수는 ELISpot에 의해 결정하였다. Ad5 NAb 역가는 제9주에 유의하게 상승하였다(p<0.0001; 만-위트니 검정).
[도 16B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 Ad5 면역 반응을 예시한다. CMI 반응은 기준선(제0주)에서 및 3차 면역화 후 3주(제9주)에 환자에서 결정하였다. Ad5에 특이적인 환자로부터 IFN-γ를 분비하는 PBMC 수는 ELISpot에 의해 결정하였다. Ad5 CMI 반응은 제9주에 유의하게 상승하였다(P < 0.01; 만-위트니 검정).
[도 17A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 백신으로 면역된 환자에서 CEA 특이적 면역 및 Ad5 면역과의 비교를 예시한다. 낮은 기존의 Ad5 면역(NAb<200)에 대해 아무것도 받지 않은 환자에서 PBMC의 IFN-γ 분비에 의해 측정된 바와 같이 1x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 받은 환자(n=19)에서 평균 CEA 특이적 면역 반응을 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료 개시 전에 높은 기존의 Ad5 면역(NAb≥200)을 갖는 환자의 CEA 특이적 면역 반응과 비교하여 나타낸다. 검정된 어느 시점에서도 두 군 사이에 유의한 차이는 없었다(p>0.4, 만-위트니 검정)
[도 17B]는 기존의 Ad5 NAb 활성과 최고 수준의 유도된 CEA CMI 반응 사이에 연관성의 플롯을 예시한다. r2 값(0.0155)은 기존의 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI ELISpot 반응 사이에 연관성이 없다는 것을 나타낸다.
[도 17C]는 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI 반응 사이에 연관성의 플롯을 예시한다. r2 값(0.0069)은 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 CEA CMI ELISpot 반응 사이에 연관성이 없다는 것을 나타낸다.
[도 18]은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 32명 전이성 결장직장암 환자(mCRC)에서 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역요법의 효과를 증명하는 카플란-마이어 생존 플롯을 예시한다.
[도 19]는 mCRC 환자에서 기준선(면역되기 전) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 투여 후(면역된 후)에 CMI 반응(IFN-γ 분비)을 예시한다. 치료 후 환자에서 관찰된 최고의 CMI 반응(시점과 무관하게)은 용량 반응을 나타냈다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량을 받은 환자(코호트 5)에서 일어났으며 유의하게 상승되었다(p<0.02; 만-위트니 검정). 반응 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag의 반응성의 결여로 나타낸다. 양성 대조군 경우, PBMC는 Con A에 노출시켰다.
[도 20]은 제0, 3, 6, 및 9주에 평가된, 면역된 mCRC 환자에서 CMI 반응(ELISpot IFN-γ SFC)을 예시한다. CMI 반응은 면역화 과정에서 증가하였다.
[도 21]은 면역되기 전(제0주) 및 면역된 후(제6-9주) 치료에 대해 평가된 세포독성 T 세포(CTL: ctolytic T-cell) 매개된 세포독성 반응(ELISpot 그랜자임 B 분비하는 SFC)을 예시한다. 반응은 면역화 후에 증가하였다(P < 0.05, 윌콕슨 검정( Wilcoxon test)).
[도 22]는 ELISpot IFN-γ SFC에 의해 평가된 바와 같이 5명의 면역된 mCRC 환자의 추적 PBMC 시료에서 CMI 반응을 예시한다. CMI 반응은 제9주에 피크를 이루었으며 치료 정지 후 제26주까지 감소하였다.
[도 23]은 비장 세포로부터 IFN-γ 분비(IFN-γ SFC)에 대해 ELISpot 분석법으로 평가된 바와 같이 CEA, MUC1, 및 브라큐리에 대해 면역된 생쥐에서 CMI 반응을 예시한다. IFN-γ SFC는 다중 표적화 면역된 생쥐(CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리)에서 검출되었지만 Ad5-눌(공벡터)로 주사된 대조군 생쥐에서는 검출되지 않았다. ELISpot 분석법의 반응 특이성은 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드 항원에 대한 반응성의 결여로 확인하였다. 양성 대조군은 Con A에 노출된 세포를 포함하였다.
[도 24A]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하지만 Ad5-눌로 주사된 대조군에서는 발현하지 않는 다기능성 CD8α+ 비장 세포에 대한 유세포 분석 결과의 막대그래프를 예시한다. 반응의 특이성은 배지 단독 또는 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드에 대한 반응성의 결여로 확인하였다.
[도 24B]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 IFN-γ 및 TNF-α를 발현하지만 Ad5-눌로 주사된 대조군에서는 발현하지 않는 다기능성 CD4+ 비장 세포에 대한 유세포 분석 결과의 막대그래프를 예시한다. 반응의 특이성은 배지 단독 또는 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드에 대한 반응성의 결여로 확인하였다.
[도 25A]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 유도되지만 대조군 생쥐에서는 유도되지 않는 CEA 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 반응의 통계적 유의성(p<0.0001)을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 25B]는 CEA(6D), mMUC1-C, 및 브라큐리로 면역된 생쥐에서 유도되지만 대조군 생쥐에서는 유도되지 않는 CEA 보체 의존성 세포성 세포독성(CDCC) 반응의 통계적 유의성(p<0.0001)을 나타내는 막대그래프를 예시한다.
[도 26A]는 MUC1 종양 세포를 발현하는 MC38 종양 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하고 제0, 7, 14일에 1x1010 Ad5-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C VP를 오른쪽 옆구리에 투여한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)로부터의 결과를 예시한다. Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C로 처리된 생쥐는 대조군과 비교하여 제15 및 18일에 유의하게 (p<0.05) 더 작은 종양을 보였으며 유의하게 더 오래 생존하였다. 실험은 제36일에 종료하였다.
[도 26B]는 [도 26A]에 기재된 바와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C로 처리된 생쥐가 대조군과 비교하여 제15 및 18일에 유의하게 (p<0.05) 더 오래 생존했다는 것을 예시한다.
[도 27]은 브라큐리를 발현하는 MC38 종양 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 접종하고 제5, 11, 및 17일에 1x1010 Ad5-눌 VP(n=4) 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP(n=5)를 오른쪽 옆구리에 투여한 C57Bl/6 생쥐로부터의 결과를 예시한다. 종양은 제15, 19, 및 22일에 처리된 생쥐에서 더 작았다.
[도 28]은 HPV-E6/E7 발현 TC-1 종양 세포를 이식하고(제0일) 제10, 17, 24일에 1x1010 Ad5-눌 VP + 100 ㎍ 대조군 IgG(복강 내), 1x1010 Ad5-눌 VP + 100 ㎍ 항-PD1, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 VP + 100 ㎍ 생쥐 IgG, 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 VP + 100 ㎍ 항-PD1을 이용한 면역요법으로 처리한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)에서 HPV 면역요법의 효과를 예시한다. 항-PD1을 포함 또는 미포함한 면역요법은 결과적으로 제23일까지 종양 성장의 유의한 억제를 일으켰다(p<0.05). 모든 대조군 생쥐는 종양 덩어리로 인해 제23일까지 희생되었다.
[도 29]는 [도 28]에서 항-PD1 주사를 이용한 면역요법으로 처리된 2마리 생쥐에서 종양 성장 및 퇴화에 대해 복합 다중 표적화 HPV 면역요법 효과를 예시한다. 종양 성장은 제20 및 27일에 각각 피크를 이루었으며, 그 이후로 퇴화하였다.
[도 30A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 감염된 인간 수지상 세포(DC: dendritic cell)에서 브라큐리 단백질의 발현을 예시한다. SW620 종양 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. 브라큐리의 발현은 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 감염된 DC에서 강력하였다.
[도 30B]는 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1로 감염된 인간 DC에서 MUC1 단백질의 발현을 예시한다. SW620 종양 세포는 양성 대조군으로 사용하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. MUC1 발현은 Ad5 [E1-, E2b-]-눌로 감염된 DC와 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 벡터로 감염된 인간 DC에서 관찰되었다.
[도 31A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP, 또는 Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물)로 3회, 2주 간격으로 백신접종된 C57Bl/6 생쥐(n = 5/군)의 비장 세포로부터 분비된 IFN-γ의 분석을 예시한다. 대조군은 3x1010 Ad5-눌 VP를 받았다. 비장 세포는 최종 백신접종 후 14일에 수집하여 ELISpot 분석법으로 IFN-γ 분비를 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다. 컬럼 사이의 유의한 차이(p<0.05)를 p-값으로 보고하였다. 유의하지 않음 = ns.
[도 31B]는 [도 31A]에 기재된 백신접종된 생쥐의 비장 세포로부터 분비된 IL-2의 분석을 예시한다. 비장 세포는 ELISpot 분석법으로 IL-2 분비를 평가하였다.
[도 32A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP 또는 Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물)로 3회, 2주 간격으로 백신접종된 C57Bl/6 생쥐(n=5/군)의 백신접종 후 CD8+ 및 다기능성 세포 집단의 분석 그래프를 예시한다. 대조군은 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. 비장 세포는 최종 백신접종 후 14일에 수집하여 FACS에 의해 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8α+ 세포를 평가하였다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 32B]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 CD4+ 세포 및 다기능성 세포 집단의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 32C]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8α+ 세포의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 32D]는 [도 32A]에 기재된 백신접종된 생쥐로부터 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD4+ 세포의 FACS 분석 그래프를 예시한다.
[도 33A]는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, Tri-Ad5(1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 및 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP의 1:1:1 혼합물), 또는 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP로 3회 백신접종된 생쥐에서 CEA IgG 수준의 ELISA 분석을 예시한다.
[도 33B]는 [도 33A]에서 기재된 생쥐를 이용한 MC38-CEA2 세포에 대한 CDC 분석을 예시한다.
[도 34]는 1x106 MC-38-MUC1 세포 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP 또는 Tri-Ad5(1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-CEA VP, 1x1010Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 VP, 및 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 VP의 1:1:1 혼합물(총 3x1010 VP))를 왼쪽 옆구리에 피하 접종한 C57Bl/6 생쥐(n=7/군)에서 종양 부피에 대한 면역요법의 효과를 예시한다. 대조군 생쥐는 3x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. (*)는 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 처리된 생쥐가 대조군 생쥐보다 유의하게 더 작은 (p<0.05) 종양을 보였을 때 경과일수를 나타내고 (^)는 Tri-Ad5-처리된 생쥐가 대조군 생쥐보다 유의하게 더 작은 (p<0.05) 종양을 보였을 때 경과일수를 나타낸다. Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1과 Tri-Ad5-처리된 생쥐 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.1).
[도 35]는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 감염된 A549 세포에서 CEA의 발현을 나타내는 면역블롯을 예시한다. (A) 음성 대조군. (B) 단백질 분자량 마커. (C) 음성. (D) CEA 기준 물질(30 ng). (E) Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 용해액(20 ㎕). (F) Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 용해액(20 ㎕). (G) 음성 A549 세포. 재조합 CEA는 양성 대조군으로 사용하였고 감염되지 않은 A549 세포는 음성 대조군으로 사용하였다.
[도 36]은 1x108, 1x109 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP의 용량으로 3회, 14일 간격으로 면역되고 최종 면역화 후 14일에 평가된 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 비장 세포의 ELISpot에 의해 측정된 CMI 용량 반응을 예시한다. CMI의 최대 유도는 1x1010 VP 용량으로 달성되었다. 양성 대조군 비장 세포는 Con A에 노출시켰다.
[도 37A]는 1x1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP로 3회, 2주 간격으로 면역된 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 면역화 후 CD8-α+/IFN-γ+ 비장 세포의 활성화를 예시한다. 대조군은 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP를 받았다. 최종 면역화 후 14일에 수집한 비장 세포는 유세포 분석으로 평가하였다. 양성 대조군 경우, 비장 세포를 PMA/이오노마이신에 노출시켰다.
[도 37B]는 [도 37A]에 기재된 바와 같이 생쥐의 면역화 후 CD8-α+/IFN-γ+/TNF-α+ 비장 세포의 활성화를 예시한다.
[도 38A]는 제0일에 2x105 비촉지성(non-palpable) HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제1, 8 및 15일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응(unpaired) t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 * (p<0.05) 및 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 38B]는 맨틀-콕스 검정(Mantel-Cox test)을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 38A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 39A]는 제0일에 2x105 작은 촉지성(palpable) HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제6, 13 및 20일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=4/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 39B]는 맨틀-콕스 검정을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 39A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 40A]는 제0일에 2x105 크게 확립된 HPV-E6/E7 TC-1 종양 세포를 이식하고 제13, 20 및 27일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP 또는 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP를 투여한 C57BL/6 생쥐(n=4/군)의 면역요법으로 인한 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실험 군과 벡터 대조군 군 사이에서 실시하였고 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 40B]는 맨틀-콕스 검정을 이용하여 플롯팅하고 비교한 [도 40A]에 기재된 생쥐의 생존 곡선을 예시한다. 유의성은 ** (p<0.01)로 나타낸다.
[도 41A]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP + 100 ㎍의 이소형 대조군 쥐 IgG를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다. 종양 크기를 결정하고 부피는 식 V = (a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 종양 성장 속도론은 각 군에서 개별 생쥐를 나타낸다.
[도 41B]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 VP + 100 ㎍의 항-PD1 항체를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 41C]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP + 100 ㎍의 이소형 대조군 쥐 IgG를 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 41D]는 제0일에 2x105 TC-1 종양 세포를 접종하고 제10, 17 및 24일에 1x1010 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 VP + 100 ㎍ 항-PD1을 이용한 치료법을 투여한 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 종양 크기의 변화를 예시한다.
[도 42]는 [도 41A-D]에서 생쥐들과 같이 처리된 C57BL/6 생쥐(n=7/군)의 생존 곡선을 예시한다. 실험은 종양 이식 후 제52일에 종료하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 대조군 항체로 처리된 생쥐는 대조군 생쥐(Ad5 [E1-, E2b-]-눌 및 대조군 항체 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 및 항-PD1 항체)의 두 군 모두에 비해 유의하게 (p < 0.008) 더 긴 생존을 나타냈다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 대조군 항체로 처리된 7마리 생쥐 중 2마리(29%)는 제52일에 생존하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체로 처리된 생쥐는 두 가지 군의 대조군 모두와 비교하여 유의하게 (p < 0.0006) 더 긴 생존을 나타냈다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체 처리된 7마리 생쥐 중 4마리(57%)는 제52일에 생존하였다.
[도 43A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7이 CD8+ 종양-침윤성 림프구(TIL)의 TC-1 종양으로의 동원을 촉진한다는 것을 예시한다. C57BL/6 생쥐(n=5/군)를 2x105 TC-1 종양 세포로 이식하였다. 이식 후 12일에 생쥐는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 공벡터 + 대조군 IgG, Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 항-PD1, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 대조군 IgG, 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1로 치료를 시작하였다. 백신은 매주 피하 투여하고 항-PD1 항체는 3-4일 마다 복강 내 주사를 통해 투여하고 종양은 제27일에 분석하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리는 Treg/CD8+ TIL의 비율을 유의하게 감소시킨다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실시하였으며 유의성은 ns (p>0.05), * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001), 또는 **** (p<0.0001)로 나타낸다.
[도 43B]는 [도 43A]의 Treg/CD8+ TIL에서 비율 감소가 Treg 수의 감소에 의해 유발되지 않는다는 것을 예시한다.
[도 43C]는 [도 43A]의 Treg/CD8+ TIL에서 비율 감소가 CD8+ TIL 수의 증가를 통해 유발된다는 것을 예시한다.
[도 44A]는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 항-PD1 항체 복합 요법이 염증유발 종양 미세환경을 촉진한다는 것을 예시한다. C57BL/6 생쥐(n=5/군)에 [도 43A-C]에서와 같이 종양을 이식하고, 처리하고, 종양을 분석하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 처리된 생쥐의 종양에서 PD1+ CD4+ 및 CD8+ TIL의 빈도가 증가한다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 PD1+ CD4+ 및 CD8+ TIL (A), LAG-3+ CD8+ TIL (B), 및 (C)의 빈도가 유의하게 더 낮다. 유의성 분석은 비대응 t-검정을 이용하여 실시하였으며 유의성은 ns (p>0.05), * (p<0.05), ** (p<0.01), 또는 *** (p<0.001)로 나타낸다.
[도 44B]에서 [도 44A]에서와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 LAG-3+ CD8+ TIL의 빈도가 유의하게 더 낮으며, 그 수준이 대조군 생쥐의 종양과 더 비슷하다는 것을 예시한다.
[도 44C]에서 [도 44A]에서와 같이 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 병용하여 처리된 생쥐의 종양은 PDL1의 발현 수준이 유의하게 감소한다는 것을 예시한다.
하기 부분은 본 발명의 다양한 측면을 더 상세하게 기재한다. 본 발명의 각 측면은 반대로 명백하게 명시되지 않는다면 본 발명의 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리하다고 명시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리하다고 명시된 임의의 다른 특징과 조합될 수 있다.
달리 명시되지 않는다면, 임의의 실시양태는 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있다. 본 발명의 다양한 측면은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편리성 및 간결성을 위한 것으로 이해해야 하며, 본 발명의 범위에 대해 변경될 수 없는 제약으로서 해석해서는 안 된다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 부분 범위뿐만 아니라 범위 내의 각각의 수치를 명백하게 적은 것처럼 구체적으로 개시하는 것으로 간주해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 예를 들어 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 부분 범위뿐만 아니라 그 범위 내 각각의 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주해야 한다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다. 범위가 존재할 때, 범위는 범위의 종점을 포함한다.
1세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여, 본 발명의 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 특정 실시양태는 DNA 폴리메라아제 유전자(pol)에서 추가적인 결실 및 전말단(pre-termianl) 단백질(pTP)의 결실을 포함한다. E2b 결실된 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터의 5 내지 6 kb 용량과 비교하여 최대 13 kb 유전자 운반 용량을 가져서, 임의의 다양한 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 위한 공간을 쉽게 제공한다. 또한, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터에 비해 부작용을 감소시켰다.
야생형 Ad에 대한 선천성 면역 반응은 복잡할 수 있으며, 아데노바이러스 벡터로부터 발현된 Ad 단백질이 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 구체적으로, E2b 결실된 벡터에서 전말단 단백질 및 DNA 폴리메라아제의 결실은 주사 후 최초 24 내지 72 h 동안 염증을 감소시키는 것으로 보이지만, 1세대 아데노바이러스 벡터는 이 기간에 염증을 자극한다. 또한, E2b 결실에 의해 생성된 추가의 복제 차단이 Ad 후기 유전자의 발현을 E1, E3 결실 단독에 의해 제공되는 것을 훨씬 넘어서 10,000배 감소를 일으킨다는 것이 보고되었다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의해 생산된 Ad 단백질 수준의 감소는 Ad 면역되거나 노출된 개체에서 플랫폼의 반복 사용을 방해하는 반응인 Ad 항원에 대해 경쟁의 바람직하지 않은 면역 반응의 가능성을 효과적으로 감소시킨다. 2세대 E2b 결실된 벡터에 의한 염증 반응의 유도의 감소는 결과적으로 항원 제시 세포(즉, 수지상 세포)의 감염 과정에서 벡터가 바람직한 백신 항원을 발현할 가능성을 증가시키고, 항원 경쟁에 대한 가능성을 감소시키고, 결과적으로 1세대 아데노바이러스 벡터를 이용한 동일한 시도에 비해 바람직한 항원에 대한 백신의 더 큰 면역화를 가져온다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터를 이용한 이전에 기재된 백신 후보에 비해 더 안전하고, 더 효과적이고, 더 많은 용도의 개선된 Ad 기반 백신 후보를 제공한다. 따라서, 1세대, E1-결실된 아데노바이러스 아형 5(Ad5)-기반 벡터는, 암 백신으로서 사용하기 위한 유망한 플랫폼이긴 하지만, 자연 발생하거나 유도된 Ad-특이적 중화 항체에 의한 활성에 방해받는다. 이론에 얽매이지 않더라도, E1, 및 DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질을 코딩하는 E2b 영역이 결실된 Ad-기반 벡터(Ad5 [E1-, E2b-])는, 예를 들어 감소된 후기 바이러스 단백질 발현에 의해, 면역학적 제거를 피하고 Ad 면역 숙주에서 코딩되는 종양 항원 전이유전자에 대해 더 강한 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 표적 항원, 특히 감염증 또는 증식성 세포 질환, 예를 들어 암과 관련되거나 연관된 항원에 대해 면역 반응을 생성하기 위한 방법 및 조성물(예를 들어, 바이러스 벡터)에 관한 것이다. 본 발명은 표적 항원, 특히, 세포 증식 질환 예를 들어 암과 관련된 항원들에 대해 개체에서 면역 반응을 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 여러 가지 측면에서, 본원에서 기재된 조성물 및 방법은 표적 항원 또는 적어도 하나의 표적 항원을 포함하는 표적 항원 시그니쳐를 발현 및/또는 제시하는 세포에 대해 개체에서 면역 반응을 생성하는 것에 관한이다. 본 발명은 PD1 관문 차단과 병용되는 HPV 유전자 E6 및 E7에 대해 면역시키기 위한 바이러스 유전자 전달 플랫폼을 이용한 인간 유두종 바이러스(HPV)에 대한 면역요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물 및 방법은 면역 경로 관문 조절 인자와 병용된 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신을 이용한다.
조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 및/또는 제시되는 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 암 배아 항원(CEA), 예를 들어 세포에 의해 발현 또는 제시되는 CEA에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 또는 제시되는 CEA(6D)에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 및/또는 제시되는 뮤신 1(MUC1)에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 및/또는 제시되는 MUC1c에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 및/또는 제시되는 브라큐리(T 단백질(T))에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다.
조성물 및 방법을 이용하여 세포에 의해 발현 및/또는 제시되는 다중 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 MUC1c, T, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 T 및 CEA에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 MUC1c 및 CEA에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 MUC1 및 T에 대해 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 조성물 및 방법을 이용하여 MUC1c, T, 및 CEA에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다.
CEA, MUC1c, 또는 T의 변형된 형태는 CEA, MUC1c, 또는 T, 또는 CEA, MUC1c, 또는 T를 발현 및/또는 제시하는 세포에 대해 면역 반응을 상승시키는 것에 관한 백신에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 항원 표적 단위체에 대해 복합 백신접종이 달성될 수 있도록 개선된 Ad 기반 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 개선된 Ad 기반 백신은 표적 항원, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편, 예를 들어 Ad5 [E1-,E2b-]-CEA(6D)를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스를 포함한다. CEA, MUC1c, 또는 T와 같은 표적 항원의 변이체 또는 단편은 면역원 가능성을 포함한 다양한 인자를 기준으로 선택될 수 있다. 돌연변이체 CEA, CEA(6D)는 CEA(WT)에 비해 면역 반응을 상승시키는 그의 증가된 능력을 이용할 수 있다. 중요하게는, 백신접종은 Ad에 대한 기존의 면역의 존재하에서 실시되거나 본 발명의 Ad 벡터 또는 다른 Ad 벡터로 이전에 여러 번 면역된 피험체에 투여될 수 있다. Ad 벡터는 하나 이상의 표적 항원에 대한 항체의 생산 및 CMI 반응을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, CEA, MUC1c, 또는 T와 같은 관심 항원에 대해 면역 반응을 유도하기 위해서 피험체에 여러 번 투여될 수 있다.
하기 부분은 본 발명의 다양한 측면을 더 상세하게 기재한다. 본 발명의 각 측면은 반대로 명백하게 명시되지 않는다면 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리하다고 명시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리하다고 명시된 임의의 다른 특징과 조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는다면, 관사 "하나(a)"는 그 외 명백하게 제공되지 않는다면 하나 이상을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는다면, "포함한다(contain, include)", "포함하는(containing, including)" 등과 같은 용어는 "포함하는(comprising)"을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는다면, 용어 "또는"은 접속사 또는 이접적 접속사일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는다면, 임의의 실시양태는 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있다.
"아데노바이러스"(Ad)는 아데노비리데(Adenoviridae) 과의 비외피 DNA 바이러스를 언급한다. 이들 바이러스는 인간, 새, 소, 돼지 및 개 종에서 발견될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 E2b 결실된 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 다른 결실을 포함하는 벡터의 기초로서 아데노비리데 과(예를 들어, 아비아데노바이러스(Aviadenovirus), 매스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 아트아데노바이러스(Atadenovirus) 및 시아데노바이러스(Siadenovirus)의 4가지 속 중 어느 하나의 임의의 Ad의 사용을 고려한다. 또한, 여러 가지 혈청형이 각각의 종에서 발견된다. Ad는 또한 유전자 돌연변이, 결실 또는 전위를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 이들 바이러스 혈청형의 유전적 유도체와 관련된다.
"도움 아데노바이러스" 또는 "도움 바이러스"는 특정 숙주 세포가 할 수 없는(숙주는 E1 단백질과 같은 Ad 유전자 산물을 제공할 수 있다) 바이러스 기능을 제공할 수 있는 Ad를 언급한다. 이 바이러스를 사용하여 제2 바이러스 또는 도움 의존적 바이러스(예를 들어, 제거된(gutted 또는 gutless) 바이러스, 또는 E2b 또는 본원에 기재된 다른 영역과 같은 특정 영역이 결실된 바이러스)에 결여된 기능(예를 들어, 단백질)을 트랜스로(in trans) 제공한다; 제1 복제-불가능 바이러스는 제2 도움 의존적 바이러스를 "도움"으로써 세포에서 제2 바이러스 게놈의 생산을 허용한다고 한다.
"아데노바이러스 5 눌(Ad5-눌)"은 발현을 위한 임의의 이종의 핵산 서열을 포함하지 않는 비복제 Ad를 언급한다.
"1세대 아데노바이러스"는 초기 영역 1(E1)이 결실된 Ad를 언급한다. 또 다른 경우에, 초기 영역 3(E3)도 결실될 수 있다.
"제거된(Gutted 또는 gutless)"은 모든 바이러스 코딩 영역이 제거된 Ad 벡터를 언급한다.
"형질감염"은 외래 핵산의 진핵 세포로의 도입을 언급한다. 형질감염의 대표적인 방법은 인산칼슘-DNA 공동 침전, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 폴리브렌 매개된 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙틴, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총법을 포함한다.
"안정한 형질감염" 또는 "안정하게 형질감염된"은 외래 핵산, DNA 또는 RNA의 형질감염된 세포의 게놈으로 도입 및 통합을 언급한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 외래 DNA가 게놈 DNA로 안정적으로 통합된 세포를 언급한다.
"리포터 유전자"는 리포터 분자(예를 들어, 효소)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "리포터 분자"는 효소 기반 검출 분석법(예를 들어, ELISA, 조직화학적 분석법), 형광, 방사성, 및 발광 시스템을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 다양한 검출 시스템으로 검출 가능하다. 이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다아제 유전자, 형광 단백질(GFP), 인간 태반 알칼리 포스파타아제 유전자, 및 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자; 및 기타 리포터 유전자가 이용될 수 있다.
"이종 서열"은 결찰되거나 결찰되도록 조작된 뉴클레오티드 서열, 자연에서 결찰되지 않거나 자연에서 상이한 위치에서 결찰된 핵산 서열을 언급한다. 이종 핵산은 자연에 존재하는 뉴클레오티드 서열 또는 자연에 존재하는 서열에 비해 일부 변형을 포함할 수 있다.
"전이유전자"는 피험체의 세포 또는 게놈에 도입되는, 천연 또는 이종 핵산 서열이거나 융합된 동종 또는 이종의 핵산 서열인 임의의 유전자 코딩 영역을 언급한다. 전이유전자는 전이유전자를 피험체의 세포에 도입하기 위해 사용되는 임의의 바이러스 벡터 상에서 운반될 수 있다.
"2세대 아데노바이러스"는 바이러스로부터 결실(제거)된 E1, E2, E3, 특정 실시양태에서, E4 DNA 유전자 서열의 전체 또는 부분을 갖는 Ad를 언급한다.
"피험체"는 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 붉은털 원숭이(rhesus) 또는 다른 유형의 마카크), 생쥐, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 쥐 및 가금을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 동물을 언급한다.
"면역원성 단편"은 결과적으로 면역 반응, 특히 단편에 대한 면역 반응을 생성하는, B 세포 및/또는 T 세포 표면 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는(즉 특이적으로 결합되는) 폴리펩티드의 단편을 언급한다.
"표적 항원" 또는 "표적 단백질"은 면역 반응을 지시하는 분자, 예를 들어 단백질을 언급한다.
"E2b 결실된"은 적어도 하나의 E2b 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방해하는 방식으로 돌연변이된 DNA 서열을 언급한다. 따라서, 특정 실시양태에서, "E2b 결실된"은 Ad 게놈으로부터 결실(제거)된 특정 DNA 서열과 관련하여 사용된다. E2b 결실된 또는 "E2b 영역 내에 결실을 포함하는"은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 언급한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 염기 쌍이 결실되고, 또 다른 실시양태에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개 염기쌍이 결실된다. 또 다른 실시양태에서, 결실은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300개 이상의 염기쌍이다. E2b 결실은 적어도 하나의 E2 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방해하는 결실일 수 있고, 따라서, E2b-특이적 단백질의 코딩 부분의 엑손 내에 결실뿐만 아니라 프로모터 및 선도서열 내에 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E2b 결실은 E2b 영역의 DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질 중 하나 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능을 방해하는 결실이다. 또 다른 실시양태에서, "E2b 결실된"은 하나 이상의 코딩된 단백질이 비기능적이 되도록 Ad 게놈의 상기 영역의 DNA 서열에 하나 이상의 점 돌연변이를 언급한다. 이러한 돌연변이는 결과적으로 비기능적 단백질이 되게 하는 아미노산 서열 내 변화를 이끄는 상이한 잔기로 치환된 잔기를 포함한다.
"E1 결실된"은 적어도 하나의 E1 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방해하는 방식으로 돌연변이된 DNA 서열을 언급한다. 따라서, 특정 실시양태에서, "E1 결실된"은 Ad 게놈으로부터 결실(제거)된 특정 DNA 서열과 관련하여 사용된다. E1 결실된 또는 "E1 영역 내에 결실을 포함하는"은 Ad 게놈의 E1 영역 내에 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 언급한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 염기 쌍이 결실되고, 또 다른 실시양태에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개 염기쌍이 결실된다. 또 다른 실시양태에서, 결실은 Ad 게놈의 E1 영역 내에 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300개 이상의 염기쌍이다. E1 결실은 적어도 하나의 E1 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방해하는 결실일 수 있고, 따라서, E1-특이적 단백질의 코딩 부분의 엑손 내에 결실뿐만 아니라 프로모터 및 선도서열 내에 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1 결실은 E1 영역의 트랜스-작용 전사 조절 인자 중 하나 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능을 방해하는 결실이다. 또 다른 실시양태에서, "E1 결실된"은 하나 이상의 코딩된 단백질이 비기능적이 되도록 Ad 게놈의 상기 영역의 DNA 서열에 하나 이상의 점 돌연변이를 언급한다. 이러한 돌연변이는 결과적으로 비기능적 단백질이 되게 하는 아미노산 서열 내 변화를 이끄는 상이한 잔기로 치환된 잔기를 포함한다.
"면역 반응의 생성" 또는 "면역 반응의 유도"는 하나 이상의 면역 세포(T 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 호중구 등)의 수 또는 하나 이상의 상기 면역 세포의 활성(CTL 활성, HTL 활성, 사이토카인 분비, 사이토카인 분비의 프로파일 변화 등)의 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어, 증가 또는 감소를 언급한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 본질적으로 호환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(예를 들어, 게놈, cDNA, 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하고 DNA 분자에 일대일 방식으로 대응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가의 코딩 또는 비코딩 서열은, 반드시는 아니지만, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있고, 폴리뉴클레오티드는, 반드시는 아니지만, 다른 분자에 연결되고/거나 물질을 지지할 수 있다. 본원에서 사용되는 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 다른 코딩 서열로부터 실질적으로 떨어져 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 단리된 DNA 분자는 많은 부분의 연관되지 않은 코딩 DNA, 예를 들어 큰 염색체 단편 또는 기타 기능적 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 영역을 포함하지 않는다. 이는 본래 단리된 바와 같은 DNA 분자를 언급하고, 나중에 실험실에서 재조합적으로 분절에 첨가된 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.
당업자가 이해하듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열, 게놈 외 및 플라스미드-코딩되는 서열, 및 본원에 기재된 표적 항원, 항원의 단편, 펩티드 등을 발현을 발현하거나 발현하도록 조정될 수 있는 더 작게 조작된 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 분절은 천연적으로 단리되거나 인간의 손을 거쳐 인공적으로 변형될 수 있다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 에피토프의 면역원성 또는 이종의 표적 단백질의 면역원성이 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 비해 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 것이다. 일부 경우에, 하나 이상의 치환 첨가, 결실 및/또는 삽입은 결과적으로 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 에피토프의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 변이체는, 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들어, 에피토프)의 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 경향이 천연 폴리펩티드에 비해 실질적으로 감소되지 않는, 표적 항원의 변이체, 또는 이의 단편(예를 들어, 에피토프)을 코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는, 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편의 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 경향이 천연 폴리펩티드에 비해 실질적으로 증가되지 않는 표적 항원의 변이체, 또는 이의 단편을 코딩할 수 있다.
용어 "변이체"는 또한 이종 발생 기원의 상동 유전자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 실시양태에서, 표적 항원의 변이체 또는 단편은 이들이 하나 이상의 감소된 생물학적 활성을 갖도록 변형된다. 예를 들어, 발암성 단백질 표적 항원은 단백질의 발암성 활성을 감소 또는 제거하도록 변형될 수 있거나, 바이러스 단백질은 하나 이상의 활성 또는 바이러스 단백질을 감소 또는 제거하도록 변형될 수 있다. 변형된 CEA 단백질의 예는 결과적으로 변이체 단백질이 증가된 면역원성을 갖게 하는 N610D 돌연변이를 갖는 CEA이다.
폴리뉴클레오티드 서열를 비교할 때, 하기에 기재된 바와 같이 최대 일치에 대해 정렬될 때 두 서열 내 뉴클레오티드 서열이 같다면 두 서열은 "동일하다". 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 비교창에 대해 서열을 비교하여 서열 유사성을 갖는 국소 영역을 확인하고 비교하여 실시된다. 본원에서 사용되는 "비교창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 한 서열이 인접한 위치의 동일한 개수의 기준 서열과 비교될 수 있는 적어도 약 20개 인접한 위치, 대개 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 분절을 언급한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 기본 매개변수를 이용하는 생물정보학 소프트웨어의 레이저진 스위트(Lasergene suite) 내 메가라인(Megalign) 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌(Smith and Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981))의 국소 동일성 알고리즘에 의해, 문헌(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988))의 유사성 조사 방법에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터화된 도구(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 검사에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해, 예를 들어 본원에 기재된 매개 변수를 이용하여 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보센터를 통해 공개적으로 이용 가능한다. 한 실례가 되는 예로, 뉴클레오티드 서열일 경우, 매개변수 M(일치하는 잔기 쌍일 경우 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기일 경우 벌점; 항상 <0)를 이용하여 누적 점수를 계산할 수 있다. 각 방향으로 단어 일치(word hit)의 확장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성된 값으로부터 X 양만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음성 점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 될 때; 또는 어느 한 서열의 말단이 도달될 때에 정지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램은 기본으로 11의 단어 길이(W), 및 10의 기댓값(E)을 사용하고, BLOSUM62 점수 매트릭스 정렬은 50의 (B), 10의 기댓값(E), M=5, N=-4 및 양가닥 비교를 사용한다.
"서열 동일성의 퍼센트"는 적어도 20개 위치의 비교 창에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정될 수 있다. 여기서 비교 창 내 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 대개 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 결정하여 일치된 위치의 개수를 얻는 단계, 일치된 위치의 개수를 기준 서열 내 총 위치의 개수로 나누는 단계 및 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트 얻는 단계에 의해 계산된다.
유전자 코드의 축퇴(degeneracy)의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같이 특정 관심 항원, 또는 이의 단편을 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 보유한다. 그렇긴 하지만, 코돈 사용빈도의 차이로 인해 달라질 수 있는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의해 특히 고려된다. 게다가, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범위 내에 있다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은, 반드시는 아니지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기술(예를 들어 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인될 수 있다.
조성물
면역요법 및 백신을 위한 바이러스 벡터
재조합 바이러스 벡터를 사용하여 유전자 또는 항원(예를 들어, TAA 및/또는 IDAA)를 코딩하는 단백질을 발현할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터 기반 백신 및 면역요법의 장점은 고효율 유전자 형질도입, 유전자의 표적 세포로의 매우 특이적 전달, 강한 면역 반응의 유도, 세포 면역의 증가를 포함한다. 본 개시는 바이러스 게놈의 결정적인 영역의 결실 또는 삽입을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시에 의해 제공되는 바이러스 벡터는 면역 반응을 생성하는 것이 바람직한 하나 이상의 관심의 표적 항원, 또는 이의 변이체, 단편 또는 융합체를 코딩하는 이종의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 프로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 자가상보성 아데노 관련 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 또는 센다이 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 복제 가능(replication competent)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 복제 결함 바이러스 벡터일 경우, 바이러스 게놈은 추가 라운드의 복제 및 패키징에 필수적인 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실될 수 있다. 이들 바이러스는 이들의 표적 세포를 감염시키고 이들의 바이러스 탑재를 전달할 수 있지만, 그 후 세포 용해 및 사멸을 유발하는 전형적인 용해 경로를 지속하지 못한다. 바이러스 벡터에 따라, 복제 결함 바이러스 벡터 내에 허용 가능한 DNA 또는 cDNA 삽입체의 통상적인 최대 길이는 약 8-10 킬로베이스(kB)일 수 있다.
레트로바이러스, 예를 들어 역전사효소를 포함하는 외피보유 단일 가닥 RNA 바이러스를 사용하여 항원을 발현할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 쥣과 또는 조류 기원일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) 유래일 수 있다. 유전자 발현을 위해 게놈 통합을 요구하는 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 장기간 유전자 발현을 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 대략 7-11 kb의 게놈 크기를 가질 수 있고 벡터는 7-8 kb 길이의 외래 DNA 삽입체를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 낮은 면역원성을 나타내는데 사용될 수 있고 대부분의 환자는 레트로바이러스 벡터에 기존의 면역을 나타내지 않는다. 레트로바이러스 벡터는 분열 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시키지 않는데 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 항원을 발현하는데 사용되어 왔다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 서브클래스를 구성한다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 분열 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 및 분열 세포 두 가지 모두를 감염시키는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 일반적으로 레트로바이러스보다 더 넓은 친화성을 나타낸다. 여러 단백질, 예를 들어 tat 및 rev는 렌티바이러스의 복제를 조절한다. 이들 조절 단백질은 전형적으로 레트로바이러스에 존재하지 않는다. HIV는 전이유전자 전달 벡터로 조작될 수 있는 대표적인 렌티바이러스이다. 렌티바이러스 벡터의 장점은 레트로바이러스 벡터의 장점과 유사하다. 렌티바이러스는 잠재적으로 종양 형성을 유발할 수 있지만, 렌티바이러스의 통합 부위가 세포 프로모터를 보유하는 부위와 떨어져 있기 때문에 레트로바이러스 벡터보다 위험이 더 낮다. HIV-기반 벡터는 예를 들어, 벡터 생산 과정에서 필요하지 않은 HIV 바이러스 외피 및 일부 조절 유전자를 결실시켜, 생성될 수 있다. 부모 외피 대신에, 여러 키메라 또는 변형된 외피 벡터가 생성되는데, 그 이유는 이 외피가 세포 및 조직 특이성을 결정하기 때문이다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 벡터는 항원을 발현하는데 사용되어 왔으며 헤르페스바이러스의 일원이다. 종-특이적 CMV가 사용될 수 있다(예를 들어, 인간 CMV(HCMV), 예를 들어, 인간 헤르페스바이러스 5형). HCMV는 캡시드로 둘러싸인 235 kb 이중 가닥 선형 DNA 게놈을 포함한다. 외피는 세포 수용체에 결합하는 당단백질 gB 및 gH를 포함한다.
센다이 바이러스(SeV) 벡터는 항원을 발현하는데 사용되어 왔다. SeV는 파라믹소바이러스(Paramixovirus) 과의 외피보유, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. SeV 게놈은 6개 단백질 및 세포 진입을 매개하고 이의 친화성을 결정하는 2개의 외피 당단백질, HN 및 F 단백질을 코딩한다. F 단백질이 결여된 SeV 벡터는 복제 결함 바이러스로서 사용되어 벡터의 안정성을 개선할 수 있다. 패키징 세포에서 생산된 SeV 벡터를 사용하여 F 단백질을 발현할 수 있다. F 유전자-결실되고 전이유전자-삽입된 게놈은 패키징 세포에 형질감염될 수 있다. SeV는 RNA 의존성 RNA 폴리메라아제를 포함하고 바이러스 게놈은 세포질에 배치된다. 이는 신속한 유전자 발현이 감염 후 곧 발생한다는 것과 SeV의 유전자 독성의 장점을 보장한다. SeV 벡터는 매우 효율적인 유전자 전달을 나타내는데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 분열 및 비분열 세포 두 가지 모두를 형질도입하는데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 비분열 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 분열 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. SeV 벡터는 예를 들어, 인간 기도 상피 세포를 효율적으로 형질도입하는데 사용될 수 있다. SeV 벡터는, 예를 들어, 점막(예를 들어, 경구 및 비강) 경로에 의해 투여될 수 있다. 비강 내 투여를 이용하여 근육 내 투여와 비교하여 가능하게는 SeV에 대한 기존의 면역의 영향을 감소시킬 수 있다. 다른 바이러스 벡터와 비교하여, 그의 전이유전자 용량(3.4 kb)은 낮다. SeV는 인간 파라인플루엔자 1형(hPIV-1) 바이러스와 높은 상동성을 보인다; 따라서, hPIV-1에 대한 기존의 면역은 SeV의 사용에 불리할 수 있다.
인간 유두종 바이러스(HPV) 벡터는 항원을 발현하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 게놈 내 발암유전자를, 예를 들어 HPV 바이러스 게놈의 결정적인 영역의 결실 또는 삽입에 의해서, 변형시킴으로써, 재조합 벡터는 감염의 예측 가능성을 증가시키고 원하지 않는 부작용을 감소시키도록 조작될 수 있다. 대표적인 HPV 벡터는 아데노바이러스 벡터와의 융합 벡터이다. 대표적인 HPV 벡터는 변형된 비-발암성의 융합된 HPV-E6/E7을 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 바이러스 벡터이다.
아데노바이러스
벡터
일반적으로, 아데노바이러스는 넓은 친화성을 가질 수 있고, 다양한 분열 및 비분열 세포 유형을 감염시킬수 있고 포유동물 체내에서 전신적으로뿐만 아니라 선택성이 더 큰 점막 표면을 통해 사용될 수 있기 때문에 임상에서 주목받고 있다. 게다가, 그들의 상대적인 열 안정성은 그들의 임상 사용을 더 용이하게 한다. 아데노바이러스는 선형의 이중 가닥 게놈을 포함하는 정이십면체, 외피 비보유 캡시드를 특징으로 하는 DNA 바이러스 과이다. 일반적으로, 아데노바이러스는 근사치로 ~30-35 킬로베이스 크기의 이중 가닥 DNA 게놈을 포함하는 외피 비보유 바이러스로서 발견된다. 인간 Ad 중에는, 신생물 질환과 관련된 것이 전혀 없고, 단지 면역 적격 개체에서 비교적 약한, 자가 회복(self-limiting) 질병을 유발한다. 바이러스에 의해 발현되는 첫 번째 유전자는 E1 유전자로, 야생형 게놈에 존재하는 다른 Ad5 유전자 프로모터로부터 고수준의 유전자 발현을 개시하는 작용을 한다. 자손 비리온의 바이러스 DNA 복제 및 조립은 감염된 세포의 핵 안에서 일어나고, 전체 생활 주기는 세포당 대략 104 비리온의 생산량으로 약 36 hr 걸린다. 야생형 Ad5 게놈은 대략 36 kb이고, 유전자가 DNA 복제 전후에 발현되는 지의 여부에 따라 초기 및 후기 바이러스 기능으로 나뉘는 유전자를 코딩한다. 초기/후기 식별은 거의 절대적인데, 이전에 Ad5에 감염된 세포의 중복 감염(super-infection)은 결과적으로 중복 감염시키는 바이러스가 자신의 게놈을 복제하고 나서야 그로부터 후기 유전자 발현을 일으킨다는 것이 증명되었기 때문이다. 이론에 얽매이지 않더라도, 이는 복제된 게놈이 캡슐화되어 존재할 때까지 후기 유전자 발현(주로 Ad5 캡시드 단백질)을 방지하는 Ad5 주요 후기 프로모터(MLP)의 시스-활성화에 의존적인 복제에 기인하는 것 같다. 본 발명의 조성물 및 방법은 진보된 세대의 Ad 벡터/백신 개발에서 특징을 이용한다. 아데노바이러스의 선형 게놈은 일반적으로 DNA 복제(ITR)의 2개의 기점이 측면에 배치되어 있으며 RNA 폴리메라아제 II-매개 전사를 위한 8개 단위를 갖는다. 게놈은 5개의 초기 단위 E1A, E1B, E2, E3, E4, 및 E5, 바이러스 복제 개시 후 지연되어 발현되는 2개의 단위(IX 및 IVa2), 및 L1-L5로 세분되는 하나의 후기 단위(L)를 포함한다. 일부 아데노바이러스는 바이러스 관련(VA) RNA로 불리는 1 또는 2종의 RNA를 추가로 코딩할 수 있다.
인간 환자에서 선천 및 획득 면역 반응을 유도하는 아데노바이러스가 제공된다. 바이러스 게놈의 결정적인 영역의 결실 또는 삽입에 의해서, 재조합 벡터의 예측 가능성을 증가시키고 원하지 않는 부작용을 감소시키도록 조작된 재조합 벡터가 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명은 E1A, E1B, E2, E3, E4, E5, IX, IVa2, L1, L2, L3, L4, 및 L5, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈 결실 또는 삽입을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 개시는 변경된 캡시드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일반적으로 아데노바이러스의 캡시드는 주로 20개의 삼각 면의 정이십면체를 포함하고, 각 정이십면체는 12 카피의 헥손 삼량체를 포함한다. 게다가, 다른 여러 추가의 소수의 캡시드 단백질, IIIa, VI, VIII, 및 IX가 존재한다.
본 개시는 하나 이상의 변경된 섬유 단백질을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일반적으로, 또한 삼량체를 형성하는 섬유 단백질은 5중체의 펜톤 염기 안에 12개의 꼭짓점에 삽입된다. 섬유는 가는 N-말단 꼬리, 줄기(shaft), 및 혹(knob) 도메인을 포함할 수 있다. 줄기는 가변 개수의 β-가닥 반복체를 포함할 수 있다. 혹은 하나 이상의 루프 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J를 포함할 수 있다. 섬유 혹 루프는 세포 수용체에 결합할 수 있다. 본 개시는 암 및 감염증 치료를 위한 백신 시스템에 사용되는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 개시의 본 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 아데노바이러스는 인간 하위군 A, B1, B2, C, D, E 및 F 또는 본원에서 제공된 이들의 결정적인 게놈 영역을 포함한 종-특이적 아데노바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 하위군은 면역학적으로 상이한 혈청형으로 더 분류될 수 있다. 또한, 본 개시의 본 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 적합한 아데노바이러스는 종-특이적 아데노바이러스 또는 영장류, 소, 가금, 파충류, 또는 개구리로부터 확인된 이들의 결정적인 게놈 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 아데노바이러스 혈청형은 특징적인 기관(organ)을 우선적으로 표적화한다. 혈청형 예를 들어 AdHu1, AdHu2, 및 AdHu5(아속 C)는 일반적으로 상기도 감염을 일으키지만, 아속 A 및 F는 위장기관에 영향을 준다. 본 개시는 기관 특이적 암 또는 기관 특이적 감염증의 치료를 위해 특징적인 기관을 우선적으로 표적화하는데 사용되는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일부 적용에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 포유동물 내 특정 기관에 대한 친화성을 감소시키도록 변경된다. 일부 적용에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 포유동물에서 특정 기관에 대한 친화성을 증가시키도록 변경된다.
아데노바이러스의 친화성은 숙주 세포 수용체에 부착하는 그들의 능력에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포 부착 과정은 숙주 세포 표면 분자에 섬유의 말단 혹 도메인의 초기 결합 후 펜톤 염기 내의 RGD 모티프의 αV 인테그린과의 결합을 수반할 수 있다. 본 개시는 숙주의 특정 세포 유형을 감염시키도록 유전자 조작될 수 있어 변경된 친화도를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시는 세포 특이적 암 또는 세포 특이적 감염증의 치료를 위해 변경된 친화성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시는 하나 이상의 아데노바이러스의 하위군 A, B, C, D, 또는 F, 또는 이들의 조합으로부터 변경된 섬유 혹을 갖거나 RGD 서열이 삽입된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 혹을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 결과적으로 하나 이상의 특정 세포 유형에 대해 감소된 친화성을 갖는 벡터가 된다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 혹을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 결과적으로 하나 이상의 특정 세포 유형에 대해 향상된 친화성을 갖는 벡터가 된다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 혹을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 결과적으로 감소된 산물-특이적 B 또는 T-세포 반응을 보이는 벡터가 된다. 일부 적용에서, 변경된 섬유 혹을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 결과적으로 향상된 산물-특이적 B 또는 T-세포 반응을 보이는 벡터가 된다.
본 개시는 바이러스-중화 항체의 효과를 피하거나 숙주 세포로의 형질도입을 향상시키는 다른 분자로 코팅된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시는 숙주 세포 수용체에 벡터의 부착을 돕는 어댑터 분자로 코팅된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 예로써, 아데노바이러스 벡터는 콕사키 Ad 수용체(CAR)를 CD40L과 연결하는 어댑터 분자로 코팅되어 결과적으로 수지상 세포의 형질도입을 증가시킴으로써 피험체에서 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 다른 표적 세포 유형에의 부착을 향상시키기 위해 유사하게 조작된 다른 아데노바이러스 벡터도 본 개시에 포함된다.
Ad5
벡터
인간 및 동물 연구는 Ad5에 대한 기존의 면역이 상용의 Ad 기반 백신에 대한 억제요인일 수 있다는 것을 증명하였다. 대다수의 인간은 인간 백신에 가장 널리 사용된 아형인 Ad5에 대한 항체를 가지며 연구된 인간의 2/3는 Ad5에 대한 림프구 증식 반응을 보였다. 이런 기존의 면역은 전형적인 Ad5 백신을 이용하는 면역화 또는 재면역화를 억제할 수 있으며, 나중에 Ad5 벡터를 이용한 제2 항원에 대한 백신의 면역화를 불가능하게 할 수 있다. 기존의 항-벡터 면역의 문제를 극복하는 것은 집중적인 연구 주제가 되어 왔다. 대안의 인간(비-Ad5 기반) Ad5 아형 또는 심지어 비-인간 형태의 Ad5를 이용한 연구를 조사하였다. 이들 연구가 초기 면역화에 성공하더라도, 후속적인 백선접종은 신규 Ad5 아형에 대한 면역 반응으로 인해 문제가될 수 있다. Ad5 면역화 장애를 피하고, 제한된 효능의 1세대 Ad5 [E1-] 벡터를 개선하여 최적의 면역 반응을 유도하기 위해서, 본 발명의 여러 실시양태는 차세대 Ad 벡터 기반 백신 플랫폼에 관한 것이다.
1세대, 또는 E1-결실된 아데노바이러스 벡터 Ad5 [E1-]는 전이유전자가 유전자의 E1 영역만을 대체하도록 제작된다. 전형적으로, 야생형 Ad5 게놈의 약 90%가 벡터 내에 유지된다. Ad5 [E1-] 벡터는 감소된 복제 능력을 가지며 Ad5 E1 유전자를 발현하지 않는 세포의 감염 후 감염성 바이러스를 생산할 수 없다. 재조합 Ad5 [E1-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터 복제 및 패키징을 허용하는 인간 세포(예를 들어, 293 세포)에서 증식된다. Ad5 [E1-] 벡터는 많은 긍정적인 특성을 갖는다; 가장 중요한 한 가지는 스케일 업 및 cGMP 생산에 그들의 상대적인 편리성이다. 현재, 220명이 훨씬 넘는 인간 임상 시험은 바이러스를 sc, im, 또는 iv로 제공받은 2 천명 이상의 피험체에서 Ad5 [E1-] 벡터를 이용한다. 추가적으로, Ad5 벡터는 통합되지 않는다; 그들의 게놈은 에피솜으로 남아 있다. 일반적으로, 숙주 게놈으로 통합되지 않는 벡터일 경우, 삽입 돌연변이 생성 및/또는 생식세포 전달의 위험이, 있다 하더라도, 매우 낮다. 종래의 Ad5 [E1-] 벡터는 7 kb에 근접한 운반 용량을 갖는다.
E1, 및 DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질을 코딩하는 E2b 영역이 결실된 Ad5-기반 벡터(Ad5 [E1-, E2b-])는, 감소된 후기 바이러스 단백질 발현에 의해, Ad-면역 숙주에서 면역학적 제거를 피하고 코딩된 종양 항원 전이 유전자에 대해 더 강력한 면역 반응을 유도할 기회를 제공한다. 신규 Ad5 플랫폼은 DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질 유전자를 제거하여 E2b 영역 내 추가의 결실을 가진다. Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼은 많은 가능한 유전자의 포함을 허용하기에 충분한 확장된 클로닝 용량을 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터의 7kb 용량과 비교하여 최대 약 12 kb 유전자 운반 용량을 가져, 필요한 경우 다수의 유전자를 위한 공간을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 kb 이상의 삽입체가 Ad5 벡터, 예를 들어 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 도입된다. E2b 영역의 결실은 본 발명의 Ad5 벡터에 유리한 면역 특성을 제공하여 Ad 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서 대개 전이유전자 항원을 표적화하는 강력한 면역 반응을 유발한다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad 면역이 존재할 때에도 강한 CMI뿐만 아니라 벡터 발현된 백신 항원에 대한 항체를 유도한다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 또한 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 부작용, 특히 간독성 및 조직 손상의 출현을 감소시켰다. 이들 Ad5 벡터의 중요한 측면은 Ad 후기 유전자의 발현이 크게 감소된다는 것이다. 예를 들어, Ad5 [E1-] 벡터 경우 캡시드 섬유 단백질의 생산은 생체 내에서 확인될 수 있지만, 섬유 발현은 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 백신으로부터 제거되었다. 야생형 Ad에 대한 선천성 면역 반응은 복잡하다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로부터 결실된 단백질이 일반적으로 중요한 역할을 한다. 특히, 전말단 단백질 또는 DNA 폴리메라아제가 결실된 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 주사 후 처음 24 내지 72 hr 동안 염증 감소를 나타낸다. 여러 실시양태에서, Ad5 유전자 발현이 결여되면 감염된 세포는 항-Ad 활성을 보이지 않게 되고 감염된 세포가 전이유전자를 연장된 기간 발현하도록 하고, 이는 표적에 대한 면역으로 발전된다.
본 발명의 여러 실시양태는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 수지상 세포를 형질도입하는 능력을 감소시키는 단계, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 염증 반응의 감소 및 그 결과 기존의 Ad 면역의 회피를 이용하여 백신 내 항원 특이적 면역 반응을 개선하는 단계를 고려한다.
복제 결함
Ad5
벡터
항-Ad 면역을 극복하려는 시도는 대안적인 Ad 혈청형 및/또는 Ad5 바이러스 캡시드 단백질 내 대체의 사용을 포함하였으며, 각각은 성공이 제한되었으며 생성된 백신의 생체 내 분포(biodistribution)를 유의하게 변경할 가능성을 갖는다. 그러므로 기존의 Ad 면역의 표적으로 알려진 단백질인 E1 결실된 Ad5 벡터로부터 바이러스 단백질의 발현을 더 감소시켜 완전히 새로운 접근법을 시도하였다. 구체적으로, 초기 1(E1) 유전자 영역 내 결실 및 초기 2b(E2b) 유전자 영역 내 추가의 결실을 가진 신규 재조합 Ad5 플랫폼(Ad5 [E1-, E2b-])이 개시되었다. E2b 영역(DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질을 코딩하는)의 결실은 결과적으로 바이러스 DNA 복제 및 후기 바이러스 단백질 발현을 감소시킨다. 본 벡터 플랫폼을 사용하여 암 및 감염증의 동물 모델에서 CMI 반응을 유도할 수 있으며, 더 중요하게는, 본 재조합 Ad5 유전자 전달 플랫폼은 Ad5 면역의 장벽을 극복하고 기존의 및/또는 벡터-유도된 Ad 면역의 환경에 사용되어서 백신의 다중 동종 투여를 가능하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5의 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩티드는 돌연변이체, 천연 변이체, 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 야생형 면역원성 폴리펩티드 또는 이의 단편과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 야생형 폴리펩티드의 서브유닛을 코딩하는 변형된 서열을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 일부 실시양태에서, 서열 번호 3과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하는 아데노바이러스-유래 벡터에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 경우에 따라 복제 결함 아데노바이러스와 관련한, 아데노바이러스-유래 벡터는 서열 번호 3 또는 대체 코돈 치환에 의해 서열 번호 3으로부터 생성된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 여러 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스-유래 벡터는 E2b 영역 내, 및 경우에 따라, E1 영역 내 결실을 가지며, 결실은 본원에서 기재된 면역요법에서 벡터의 사용에 다양한 장점을 제공한다.
아데노바이러스 게놈 내 특정 영역은 필수적인 기능을 하며 본 발명의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 제작할 때 실질적으로 보존되어야 할 필요가 있을 수 있다. 이들 영역은 문헌[Lauer et al., J. Gen. Virol., 85, 2615-25 (2004), Leza et al., J. Virol., p. 3003-13 (1988), 및 Miralles et al., J. Bio Chem., Vol. 264, No. 18, p. 10763-72 (1983)]에서 추가로 기재되며, 이들 문헌은 그 전문으로 참고로 포함된다. 서열 번호 3의 일부분, 예를 들어 서열 번호 3의 적어도 약 100, 250, 500, 1000개 이상의 염기를 포함하는 일부분과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하는 재조합 핵산 벡터는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 미국 특허 제6,063,622호; 제6,451,596호; 제6,057,158호; 제6,083,750호; 및 제8,298,549호에 기재된 것들의 사용을 고려하며 상기 특허는 각각 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다. 많은 경우에 E2b 영역 내 결실을 가진 벡터는 바이러스 단백질 발현을 불구로 만들고/거나 복제 가능 Ad(RCA)의 생성 빈도를 감소시킨다. 이들 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식은 결실된 E2b 유전자 산물을 발현하는 세포주를 이용하여 수행될 수 있다. 이 같은 패키징 세포주는 본원에서 제공된다; 예를 들어, HEK-2p3 세포주로부터 유래한 E.C7(공식적으로 C-7로 불림).
게다가, E2b 유전자 산물, DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질은 E.C7, 또는 유사 세포에서 E1 유전자 산물과 함께 구성적으로 발현될 수 있다. Ad 게놈으로부터 생산 세포주로의 유전자 분절의 전달은 즉각적인 이점을 갖는다: (1) 운반 용량의 증가; 및, (2) 전형적으로 RCA를 생성하는 두 가지 이상의 독립적인 재조합 단계를 요구하는, RCA 생성 가능성의 감소. 본 발명에서 사용되는 E1, Ad DNA 폴리메라아제 및/또는 전말단 단백질 발현 세포주는 오염이 되는 도움 바이러스를 필요로 하지 않으면서 13 kb에 근접한 운반 용량을 갖는 아데노바이러스 벡터의 증식을 가능하게 할 수 있다. 또한, 바이러스 생활 주기에 중요한 유전자가 결실될 때(예를 들어, E2b 유전자), 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제하거나 발현하는 Ad의 추가적인 장애가 일어난다. 이는 감염된 세포의 면역 인식을 감소시키고 외래 전이유전자 발현 기간을 연장할 수 있다.
E1, DNA 폴리메라아제, 및 전말단 단백질이 결실된 벡터는 전형적으로 E1 및 E2b 영역으로부터 각각의 단백질을 발현할 수 없다. 게다가, 이들은 대부분의 바이러스 구조 단백질의 발현의 결여를 나타낼 수 있다. 예를 들어, Ad의 주요 후기 프로모터(MLP)는 후기 구조 단백질 L1 내지 L5의 전사를 담당한다. MLP는 Ad 게놈 복제 전에 최소한의 활성을 가지지만, 독성이 큰 후기 유전자는 주로 바이러스 게놈 복제가 일어난 후에만 mLP로부터 전사되고 번역된다. 후기 유전자 전사의 이러한 시스-의존적 활성화는 폴리오마 및 SV-40의 성장에서와 같이 일반적으로 DNA 바이러스의 특징이다. DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질은 Ad 복제에 중요하다(E4 또는 단백질 IX 단백질과는 달리). 이들의 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현, 및 APC와 같은 세포에서 그 발현의 독성 효과에 매우 불리할 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역, 및 경우에 따라 E1 영역 내 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 Ad 게놈의 다른 영역은 전혀 결실되지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실 및 E1 및 E3 영역 내 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 영역은 전혀 결실되지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실 및 E1, E3 내 결실 및 E4의 부분 또는 완전 제거를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실 및 E1 및/또는 E4 영역 내 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈 내 E2a, E2b 및/또는 E4 영역 내 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역의 DNA 폴리메라아제 기능이 결실될 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역의 전말단 단백질 기능이 결실될 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1, DNA 폴리메라아제 및/또는 전말단 단백질 기능이 결실될 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 영역 및/또는 E2b 영역의 적어도 일부를 가질 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 제거된(gutted) 아데노바이러스 벡터가 아니다. 이와 관련하여, 벡터는 E2b 영역의 DNA 폴리메라아제 및 전말단 단백질 기능 두 가지 모두가 결실될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노 바이러스의 E1, E2b 및/또는 100K 영역 내 결실을 가질 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 E1, E2b 및/또는 프로테아제 기능이 결실된 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 벡터는 다른 결실을 가지지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 E1 및/또는 E2b 영역이 결실될 수 있지만, 섬유 유전자는 돌연변이 또는 다른 변경에 의해 변형된다(예를 들어, Ad 친화성을 바꾸기 위해). E3 또는 E4 영역의 유전자 제거가 언급된 임의의 아데노바이러스 벡터에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터는 제거된(gutted) 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
Ad 게놈의 다른 영역이 결실될 수 있다. Ad 게놈의 특정 영역 내 "결실"은 그 영역에 의해 코딩되는 적어도 하나의 유전자 산물의 발현 및/또는 기능(예를 들어, DNA 폴리메라아제 또는 전말단 단백질 기능의 E2b 기능)을 방지하는 방식으로 돌연변이 되거나 제거되는 특정 DNA 서열을 언급한다. 결실은 단백질의 일부분을 코딩하는 엑손 내에 결실뿐만 아니라 프로모터 및 선도서열 내 결실을 포함한다. 특정 영역 내 결실은 Ad 게놈의 그 영역 내에 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 언급한다. 하나 이상의 염기쌍이 결실될 수 있다. 예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개 염기쌍이 특정 영역으로부터 결실될 수 있다. 결실은 Ad 게놈의 특정 영역 내에 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300개 이상의 염기쌍일 수 있다. 이들 결실은 그 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방지할 수 있다. 예를 들어, Ad 게놈의 특정 영역은 하나 이상의 코딩된 단백질이 비기능적이 되도록 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 결과적으로 비기능적 단백질을 생성하는 아미노산 서열 내 변화를 일으키는 상이한 잔기로 치환된 잔기를 포함할 수 있다. Ad 게놈 내 대표적인 결실 또는 돌연변이는 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, TP, POL, IV, 및 VA 영역 중 하나 이상을 포함한다. 결실된 아데노바이러스 벡터는 예를 들어 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 Ad 벡터는 E2b 유전자 산물 및 결실될 수 있는 임의의 필수 유전자의 산물을 구성적으로 발현하는 적합한 패키징 세포주를 이용하여 높은 역가로 성공적으로 배양될 수 있다. E1 및 DNA 폴리메라아제 단백질뿐만 아니라, Ad-전말단 단백질을 구성적으로 발현하는 HEK-293-유래 세포가 사용될 수 있다. E.C7 세포가, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터의 높은 역가 저장액을 배양하기 위해, 사용될 수 있다.
자가 증식하는 아데노바이러스 벡터의 중요한 유전자를 결실시키기 위해, 표적화된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 우선 HEK-293 세포, 또는 유사한 세포에서 E1 단백질과 함께 동시 발현될 수 있다. 예를 들어, 구성적으로 동시 발현될 때 비독성인 이들 단백질(또는 유도성으로 발현되는 독성 단백질)은 선택적으로 이용될 수 있다. HEK-293 세포에서 E1 및 E4 유전자의 동시 발현이 가능하다(예를 들어, 구성적이지 않은 유도성 프로포터를 이용하여). E1 및 단백질 IX 유전자, 비리온 구조 단백질이 동시 발현될 수 있다. 게다가 E1, E4, 및 단백질 IX 유전자의 동시 발현이 또한 가능하다. E1 및 100K 유전자는 E1 및 프로테아제 유전자가 발현될 수 있는 것과 같이 트랜스-상보하는 세포주에서 발현될 수 있다.
높은 역가의 E2b 결실된 Ad 입자를 배양하는데 사용하기 위해 E1 및 E2b 유전자 산물을 동시 발현하는 세포주가 사용될 수 있다. 유용한 세포주는 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리메라아제 및/또는 대략 90 kDa 전말단 단백질을 구성적으로 발현한다. E1, DNA 폴리메라아제, 및 전말단 단백질을 독성 없이 높은 수준으로 구성적으로 동시 발현하는 세포주(예를 들어. E.C7)는 복합 백신접종에 사용하기 위한 Ad를 증폭하는데 사용하기에 바람직하다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리메라아제, 및 전말단 단백질이 결실된 아데노바이러스 벡터의 증식을 허용한다.
본 발명의 재조합 Ad는, 예를 들어, 적합한 MOI(예를 들어, 5)의 Ad 벡터 바이러스 저장액으로 감염되고 37℃에서 40-96 h 인큐베이션된 E.C7 세포를 포함하는 조직 배양 플레이트를 이용하여 증식될 수 있다. 감염된 세포를 수거하고 10 mM 트리스(Tris)-Cl(pH 8.0)에 재현탁하고 초음파 처리할 수 있으며, 바이러스를 2회의 염화세슘 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다. 바이러스 함유 밴드를 컬럼에서 탈염시킬 수 있고, 수크로오스 또는 글리세롤을 첨가할 수 있고, 분액을 -80℃에 저장할 수 있다. 바이러스를 그의 안정성을 향상시키도록 고안된 용액, 예를 들어 A195에 넣을 수 있다. 저장액의 역가를 측정할 수 있다(예를 들어, 용해 후 바이러스의 분액의 광학 밀도를 260 nm에서 측정하여). 전체 재조합 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 선형 또는 원형의 플라스미드 DNA를 E.C7, 또는 유사한 세포에 형질감염시키고, 바이러스 생산의 증거가 존재할 때까지(예를 들어. 세포변성(cytopathic) 효과) 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 세포로부터 조정된 배지를 사용하여 더 많은 세포를 감염시켜 정제 전에 생산되는 바이러스 양을 증폭시킬 수 있다. 정제는, 예를 들어, 2회의 염화세슘 밀도 원심분리 또는 선택적인 여과에 의해 달성될 수 있다. 바이러스는 시판되는 제품 또는 통상적인 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 감염되는 세포가 특정 개수의 바이러스와 부딪히도록 보장하기에 충분한 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 여러 실시양태에서, 본 발명은 재조합 Ad의 저장액, 예를 들어 재조합 Ad의 RCA 무함유 저장액을 제공한다. 바이러스 저장액은 대개 이들을 제조하기 위해 사용되는 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 세포주에 따라 역가가 상당히 달라질 수 있다. 바이러스 저장액은 적어도 약 106, 107, 또는 108 pfu/mL 이상, 예를 들어 적어도 약 109, 1010, 1011, 또는 1012 pfu/mL의 역가를 가질 수 있다. 재조합 바이러스 및 패키징 세포주의 특성에 따라, 본 발명의 바이러스 저장액은 심지어 약 1013 입자/ml 이상의 역가를 가질 수 있다.
복제 결함 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 서열 번호 3)는 적합한 위치에 표적 항원, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 서열 번호 3)는 CEA 또는 변이체 CEA를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 번호 1)을 대체하는 위치에 본원에 기재된 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 변이체 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 서열 번호 3)는 CEA 또는 변이체 CEA를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 번호 2)을 대체하는 위치에 본원에 기재된 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 서열 번호 3)는 MUC1 또는 변이체 MUC1을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 9)을 대체하는 위치에 본원에 기재된 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 서열 번호 3)는 T 또는 변이체 T(예를 들어, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8)를 코딩하는 핵산 서열을 대체하는 위치에 본원에 기재된 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
항원 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및
변이체
본 개시는 또한 본원에서 하나 이상의 관심의 표적 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로도 언급되는 핵산 서열을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 본원에서 추가로 기재되는 임의의 공급원으로부터 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염되는 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 표적 항원 폴리펩티드를 발현하기 위해서, 폴리펩티드, 또는 기능적 등가물을 코딩하는 뉴클레오티드는 적합한 Ad 벡터에 (예를 들어, 재조합 기술을 이용하여) 삽입될 수 있다. 적합한 아데노바이러스 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필수적인 인자 및 임의의 바람직한 링커를 포함할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 관심의 폴리펩티드 및 적합한 전사 및 번역 조절 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 상기 아데노바이러스를 제작할 수 있다. 이들 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 본 발명의 표적 항원 폴리펩티드/단백질/에피토프 또는 이의 일부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 상기 서열의 변이체, 단편, 또는 유도체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 항원 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 서열 또는 변이체와 실질적으로 다르지만 유사한 단백질 항원을 코딩할 수 있는, 특정 세포 유형에서 발현을 위해 최적화된 신규 유전자 서열을 나타낸다.
다른 관련된 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 단백질(예를 들어, 관심의 표적 항원)을 코딩하는 천연 서열에 실질적인 동일성을 가지며, 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 것들이다(예를 들어, 표준 매개변수를 이용하는 BLAST 분석). 이들 값은 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치설정 등을 고려하여 두 개의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해 적합하게 조정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 서열과 비교하여 예를 들어 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드(예를 들어, 표적 단백질 항원)을 코딩하는 인접한 뉴클레오티드를 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개 이상 및 그 사이의 모든 중간 길이를 포함할 수 있다. 본 문맥에서 "중간 길이"는 제시된 값 사이의 임의의 길이, 예를 들어 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23, 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등을 200-500; 500-1,000 등에 걸친 모든 정수를 포함하여 언급한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드, 예를 들어 에피토프 또는 이종의 표적 단백질을 코딩하는 천열 서열에서 발견되지 않은 추가의 뉴클레오티드에 의해 한쪽 또는 양쪽 말단에서 연장될 수 있다. 이 추가의 서열은 개시된 서열의 어느 한쪽 말단 또는 개시된 서열의 양쪽 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
코딩 서열 자체의 길이에 상관없이, 폴리뉴클레오티드는 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터, 발현 조절 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가의 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 조합될 수 있으며, 그들의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 전체 길이가 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해서 제한되는 거의 모든 길이의 핵산 단편이 이용될 수 있다고 생각된다. 총 길이가 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개의 염기쌍 길이 등(모든 중간 길이 포함)인 예시적인 폴리뉴클레오티드 분절이 본 발명을 많이 수행하는데 유용하다고 생각된다.
돌연변이 유발 접근법, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용하여 표적 항원 서열을 제조할 수 있다. 폴리펩티드 서열 내 특정 변형은 이들을 코딩하는 기본적인 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발법을 통해 만들어질 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법은 바람직한 돌연변이의 DNA 서열뿐만 아니라 결실 연결지점을 가로질러 양쪽에 안정한 이중체를 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공하는 충분한 개수의 인접한 뉴클레오티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이체를 만들 수 있다. 예를 들어, 변경되는 서열의 연결지점의 양쪽에 약 5 내지 약 10개 잔기를 가진 약 14 내지 약 25 뉴클레오티드 정도 길이를 포함하는 프라이머가 이용될 수 있다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드의 특성을 개선, 변경, 증가, 변형, 또는 그 외 변화시키고/거나 코딩되는 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 1차 서열을 변경하기 위해서 선택된 폴리뉴클레오티드 내에 만들어질 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발법은 코딩되는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 예를 들어 폴리펩티드 내에 포함된 에피토프의 면역원성 또는 표적 항원의 발암성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성을 검사하는 분석법은 T 세포 세포독성 분석법(CTL/크롬 방출 분석법), T 세포 증식 분석법, 세포 내 사이토카인 염색, ELISA, ELISpot 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 펩티드의 서열 변이체 및 이들을 코딩하는 DNA 서열을 얻는 다른 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 바라는 펩티드 서열을 코딩하는 재조합 벡터에 돌연변이 유발제, 예를 들어 히드록실아민을 처리하여 서열 변이체를 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분절 또는 단편은 예를 들어 화학적 방법에 의해 단편을 직접 합성하여 쉽게 제조될 수 있다. 단편은 선택된 서열을 재조합 생산을 위한 재조합 벡터에 도입하여 PCR과 같은 핵산 재생산 기술을 적용하여 얻을 수 있다.
다양한 벡터/숙주 시스템이 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 생산하는데 이용될 수 있다. 대표적인 시스템은 미생물, 예를 들어 재조합 박테리오파아지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 세균; 효모 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV(cauliflower mosaic virus); 담배 모자이크 바이러스, TMV(tobacco mosaic virus)) 또는 세균 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함한다.
Ad 벡터 내 존재하는 조절 인자 또는 조절 서열은 벡터-인핸서, 프로모터, 및 5' 및 3' 비번역 영역의 비번역 영역의 것들을 포함할 수 있다. 이러한 인자는 그들의 세기 및 특이성에 달라질 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성 및 유도성 프로모터를 포함한 임의의 개수의 적합한 전사 및 번역 인자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 세부분으로 이루어진 선도서열로 이루어진 Ad 전사/번역 복합체로 결찰될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 내 삽입을 이용하여 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존 바이러스를 얻을 수 있다. 또한, 전사 인핸서, 예를 들어 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서는 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
또한, 특정 개시 서열을 사용하여 관심 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 더 효율적인 번역을 달성할 수 있다(예를 들어, ATG 개시 코돈 및 인접한 서열). 외인성 번역 인자 및 개시 코돈은 다양한 기원을 가질 수 있으며, 천연 및 합성적일 수 있다. 발현의 효율은 사용되는 특정 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함하여 상승될 수 있다. 또한, 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 효율적인 번역을 달성하기 위해 전사 또는 번역에 특이적 종결 서열이 포함될 수 있다.
폴리뉴클레오티드-코딩된 산물(예를 들어, 표적 항원)의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 이용될 수 있다(예를 들어, 산물에 특이적인 단클론 또는 다클론 항체를 이용하여). 예에는 효소면역 측정법(ELISA), 방사면역 측정법(RIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)이 포함된다. 주어진 폴리펩티드 상 두 가지의 비간섭 에피토프에 반응성인 단클론 항체를 이용하는 2개 부위, 단클론 기반 면역분석법이 일부 적용에는 바람직할 수 있으나, 경쟁 결합 분석법도 이용될 수 있다.
Ad 벡터는 검출되거나 선별될 수 있는 산물, 예를 들어 산물이 예를 들어 형광, 발색 또는 형광 기질에 대한 효소 활성 등에 의해 검출될 수 있거나, 배양 조건에 의해 선별될 수 있는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 대표적인 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(GFP), β-갈락토시다아제, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제, 분비되는 알칼리 포스파타아제(SEAP), 및 인간 성장 호르몬(HGH)을 포함한다. 대표적인 선별 가능한 마커는 약물 내성, 예를 들어 네오마이신(G418), 히그로마이신 등을 포함한다.
Ad 벡터는 또한 프로모터 또는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터의 선택은 부분적으로 표적화 세포 유형 및 바라는 조절 정도 또는 유형에 따라 결정될 것이다. 본 발명의 맥락 내에서 적합한 프로모터는 구성, 유도성, 조직 특이적, 세포 유형 특이적, 시간 특이적, 또는 사건 특이적 프로모터를 제한 없이 포함한다. 구성 또는 비특이적 프로모터의 예는 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV 초기 유전자 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 및 아데노바이러스 프로모터를 포함한다. 바이러스 프로모터 외에, 세포 프로모터가 본 발명의 맥락 내에서 다루기 쉽다. 특히, 소위 항존 유전자를 위한 세포 프로모터가 유용하다(예를 들어, β-액틴). 바이러스 프로모터는 일반적으로 세포 프로모터보다 강력한 프로모터이다. 유도성 프로모터도 사용될 수 있다. 이들 프로모터는 덱사메타손에 의해 유도성인 MMTV LTR, 중금속에 의해 유도성인 메탈로티오네인, 및 cAMP에 의해 유도성인 cAMP 반응 인자를 가진 프로모터, 열 충격 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터를 이용하여, 핵산은 세포로 전달될 수 있고, 유도물질이 첨가될 때까지 휴지상태를 유지할 것이다. 이는 관심 단백질을 생산하는 시기가 되면 추가적인 조절을 허용한다. 사건-유형 특이적 프로모터(예를 들어, HIV LTR)가 사용될 수 있으며, 이는 사건, 예를 들어 종양 형성 또는 바이러스 감염이 발생할 때에만 활성을 가지며 상승 조절된다. HIV LTR 프로모터는 바이러스 감염 시 발생하는 tat 유전자 산물이 존재하지 않는다면 불활성이다. 일부 사건 유형 프로모터는 또한 조직 특이적이다. 바람직한 사건 유형 특이적 프로모터는 바이러스 감염 시 활성화되는 프로모터를 포함한다.
프로모터의 예는 α-태아단백질, α-액틴, myo D, 암배아 항원, VEGF-수용체; FGF 수용체; TEK 또는 tie 2; tie; 유로키나아제 수용체; E- 및 P-셀렉틴; VCAM-1; 엔도글린; 엔도시알린; αV-β3 인테그린; 엔도텔린-1; ICAM-3; E9 항원; 폰 빌레브란트 인자; CD44; CD40; 혈관 내피 카데린; notch 4, 고분자량 흑색종-관련 항원; 전립선 특이적 항원-1, 프로베이신, FGF 수용체, VEGF 수용체, erb B2; erb B3; erb B4; MUC-1; HSP-27; int-1; int-2, CEA, HBEGF 수용체; EGF 수용체; 티로시나아제, MAGE, IL-2 수용체; 전립선 산 포스파타아제, 프로베이신, 전립선 특이적 막 항원, α-크리스탈린, PDGF 수용체, 인테그린 수용체, α-액틴, SM1 및 SM2 미오신 중쇄, 칼포닌-h1, SM22 α-안지오텐신 수용체, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및 CD4를 위한 프로모터를 포함한다.
리프레서 서열, 음성 조절 인자, 또는 조직-특이적 사일런서(silencer)는 폴리뉴클레오티드의 비특이적 발현을 감소시키기 위해 삽입될 수 있다. 다수의 리프레서 인자가 프로모터 영역에 삽입될 수 있다. 전사의 억제는 리프레서 인자의 방향 또는 프로모터로부터의 거리와 무관하다. 리프레서 서열의 한 가지 유형은 절연 인자(insulator) 서열이다. 이러한 서열은 전사를 억제하고 배경 전사를 없앨 수 있다. 음성 조절 인자는 다수의 다양한 유전자의 프로모터 영역에 위치할 수 있다. 난백 알부민 유전자의 프로모터 영역 내 NSE가 기능을 하는 것과 같이, 리프레서 인자는 스테로이드와 같은 인자가 없을 때 전사의 리프레서로서 기능을 할 수 있다. 이들 음성 조절 인자는 수란관으로부터의 특이적 단백질 복합체에 결합할 수 있으며, 이들 모두는 스테로이드에 민감하지 않다. 3가지 상이한 인자가 난백 알부민 유전자의 프로모터에 위치한다. 이들 인자의 일부분에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 TK 리포터의 바이러스 전사를 억제할 수 있다. 사일런서 인자 중 하나는 다른 유전자 내 사일런서와 서열 동일성을 공유한다(TCTCTCCNA (서열 번호 11)).
바람직한 표적 항원의 발현을 증가시키는 인자는 본원에 기재된 Ad 벡터의 핵산 서열에 편입될 수 있다. 대표적인 인자는 내부 리보솜 결합 부위(IRES)를 포함한다. IRES는 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 다른 서열은 발현을 상승시킬 수 있다. 일부 유전자 경우, 특히 5' 말단에서 서열은 전사 및/또는 번역을 억제할 수 있다. 이들 서열은 대개 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팔린드롬(palindrome)이다. 일부 경우에, 전달되는 핵산 내 상기 서열은 결실된다. 전사체 또는 번역된 산물의 발현 수준은 서열이 발현에 영향을 주는지를 확인하고 알아 내기 위해 분석될 수 있다. 전사체 수준은 노던 블롯 혼성화, RN아제 프로브 보호 등을 포함한 임의의 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다. 단백질 수준은 ELISA를 포함한 임의의 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
항원 특이적 면역요법 및 백신
본 개시는 본원에 제공된 상기 벡터 및 기타 벡터를 이용하여 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA에 대한 단일 항원 또는 복합 항원 면역화를 제공한다. 본 개시는 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA에 대한 치료 백신을 제공한다. 본 개시는 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA에 대한 예방 백신을 제공한다. 게다가, 여러 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법은 임상 반응, 예를 들어 변경된 질환 진행 또는 기대 수명을 일으킬 수 있다.
다양한 항원을 코딩하는 Ad5 [E1-] 벡터를 사용하여 높은 역가의 벡터에 생체 외 노출된 DC의 95%를 효율적으로 형질도입시킬 수 있다. 중요하게는, 본 발명자들은 벡터를 이용하여 감염 다중도(MOI) 증가와 함께 DC 내 외래 유전자 발현 수준이 증가하는 것을 발견하였다. Ad5 [E1-] 벡터로 감염된 DC는 항원 특이적 CTL 반응을 유도하는 경향을 가진 다양한 항원(종양 항원 MART-1, MAGE-A4, DF3/MUC1, p53, hugp100 흑색종 항원, 폴리오마 바이러스 중간-T 항원을 포함)을 코딩하고, 항원 제시 능력을 향상시키고/거나, 혼합된 림프구 반응에서 T 세포 증식을 개시하는 능력을 개선할 수 있다. 종양 특이적 항원을 코딩하는 Ad5 벡터에 의해 이전에 형질도입된 수지상 세포(DC)로 동물의 면역화를 이용하여 각각의 항원을 발현하는 종양 세포로 공격받을 때 동물을 위해 상당한 수준의 보호를 유도할 수 있다. 흥미롭게도, IL-7을 코딩하는 Ad의 종양 내 주사는 항종양 면역 유도시 IL-7 코딩 Ad5 벡터로 형질도입된 DC의 주사보다 효과가 떨어진다. Ad5 벡터에 의한 DC의 생체 외 형질도입은 본 개시에 의해 고려된다. 생체 외 DC 형질도입 전략은 수용 숙주 내성을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, CTLA4Ig의 DC로의 Ad5 매개된 전달은 T 세포 상에 존재하는 CD28 분자와 DC CD80의 상호작용을 차단할 수 있다.
DC와의 Ad5 벡터 캡시드 상호작용은 여러 유익한 반응을 유발할 수 있고, 이는 Ad5 벡터에 의해 코딩되는 항원을 제시하는 DC의 경향을 상승시킬 수 있다. 예를 들어, 미성숙 DC는, 항원 포착에 특화되지만, T 세포 활성화의 상대적으로 비효율적인 이펙터이다. DC 성숙은 T 세포 면역을 유도하는 DC의 능력의 상승과 동시에 일어난다. 일부 경우에, 본 발명의 조성물 및 방법은 Ad5 감염을 이용하여 결과적으로 DC 성숙의 직접적인 유도를 일으킨다. 생쥐의 미성숙 골수 유래된 DC의 Ad 벡터 감염은 DC 성숙과 정상적으로 연관된 세포 표면 마커(MHC I 및 II, CD40, CD80, CD86, 및 ICAM-1)를 상승 조절할 뿐 아니라, 골수 DC 성숙시 하향 조절되는 인테그린인 CD11c을 하향 조절할 수 있다. 일부 경우에, Ad 벡터 감염은 DC 성숙의 마커인 DC에 의한 IL-12 생산을 유발한다. 이론에 얽매이지 않더라고, 이러한 현상은 아마도 Ad5 유발된 NF-αB 경로의 활성화에 기인할 수 있다. 성숙 DC는 Ad 벡터에 의해 효율적으로 형질도입될 수 있고, 성숙 CD83+ 인간 DC(말초 혈관 단핵구로부터 유래)에 의해 증명된 바와 같이, 낮은 MOI에서 미접촉 T 세포의 증식을 자극하는 이들의 기능적 가능성을 잃지 않는다. 그러나 성숙 DC는 또한 미성숙한 것보다 더 낮은 감염 가능성을 보일 수 있다. 캡시드 단백질의 변형은, 예를 들어 정상의 CAR 수용체 감염 기전을 이용하기보다는 바이러스 벡터 수용체로서 CD40L 수용체를 이용하여, Ad 벡터에 의한 DC의 감염을 최적화할 뿐 아니라 기능적 성숙을 향상시키는 전략으로 이용될 수 있다.
여러 실시양태에서, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터(들) MUC1, T 및 CEA 백신을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안정성의 범위 내에서 증가된 전체 생존(OS)의 효과를 갖는다. 여러 실시양태에서 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터(들) MUC1c, T 및 CEA 백신을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안정성의 범위 내에서 증가된 전체 생존(OS)의 효과를 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터(들) MUC1n, T 및 CEA 백신을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 기술적 안정성의 범위 내에서 증가된 전체 생존(OS)의 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원 표적은 양성 종양과 관련된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 항원은 전암성 종양과 관련된다.
일부 실시양태에서, 표적화된 항원은 암종, 상피내암종, 전이성 종양, 신경모세포종, 육종, 근육종, 평활근 육종, 망막모세포종, 간세포암, 횡문 근육종, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 또는 골육종과 관련된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 항원은 특정 유형의 암, 예를 들어 신경계암, 뇌암, 갑상선암, 두경부암, 흑색종, 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 호지킨병, 유방암, 방광암, 전립선암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 신세포 암종, 췌장암, 식도암, 폐암, 중피종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 생식세포 종양, 고환암, 위암, 또는 기타 암, 또는 이들의 임의의 임상적(예를 들어. TNM, 조직병리학적, 병기 또는 등급 결정 시스템 또는 이들의 조합) 또는 분자적 아형과 관련된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 항원은 암의 특정 임상적 또는 분자적 아형과 관련된다. 예로써, 유방암은 루미날(Luminal) A, 루미날 B, 삼중 음성/기저상(basal-like), 및 HER2 형을 포함하여 적어도 4가지 분자적 아형으로 분류될 수 있다. 예로써, 전립선암은 TNM, 글리슨 점수, 또는 PSA 단백질의 분자 발현으로 세분될 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 관심의 표적 단백질 또는 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이와 관련하여, 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 상이한 관심의 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 표적 항원은 전장의 단백질일 수 있거나, 이의 단편(예를 들어, 에피토프)일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 하나의 관심의 표적 단백질의 다수의 단편 또는 에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있거나 다수의 상이한 관심의 표적 단백질의 하나 이상의 단편 또는 에피토프를 포함할 수 있다. 표적 항원은 면역 반응을 생성하는 것이 바람직한 임의의 물질을 포함할 수 있지만, 일반적으로 표적 항원은 단백질이다. 표적 항원은 전장의 단백질, 단백질의 서브유닛, 단백질의 이소형, 또는 면역 반응을 유도하는 이의 단편(즉, 면역원성 단편)을 포함할 수 있다. 표적 항원 또는 이의 단편은, 예를 들어 표적 항원의 하나 이상의 생물학적 활성을 감소시키도록, 또는 이의 면역원성을 향상시키도록, 변형될 수 있다. 표적 항원 또는 표적 단백질은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, CEA, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역원성 단편은 MHC I형 또는 II형 분자에 결합한다. 면역원성 단편은, 그 결합이 당 업계에 공지된 임의의 분석법을 이용하여 검출 가능하다면, MHC I형 또는 II형 분자에 "결합"할 수 있다. 예를 들어, MHC I형에 결합하는 폴리펩티드의 능력은 125I 표지된 β-2-마이크로글로불린(β-2m)의 MHC I형/β2m/펩티드 이종 삼량체 복합체로의 편입을 촉진하는 능력을 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 별법으로, 당 업계에 공지된 기능적 펩티드 경쟁 분석법이 이용될 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성 단편은 일반적으로 잘 알려진 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 면역원성 단편을 확인하기 위한 대표적인 기술은 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 표적 폴리펩티드의 면역원성 단편은 전장의 표적 폴리펩티드의 반응성보다 실질적으로 낮지 않은 수준으로 이 같은 항혈청 및/또는 T 세포와 반응하는 단편이다(예를 들어, ELISA 및/또는 T 세포 반응성 분석법에서). 다시 말해서, 면역원성 단편은 전장의 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 이보다 큰 수준으로 상기 분석법 내에서 반응할 수 있다. 상기 스크리닝은 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 실시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 하나 이상의 단백질, 이의 변이체, 이의 융합체, 또는 면역 반응을 조절할 수 있는 이의 단편을 코딩하는 이종의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는, 수동 면역요법을 허용하는, 특정 항원, 예를 들어 탄저병 보호 항원에 대해 하나 이상의 항체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 치료 효과(예를 들어, 항-바이러스, 항-세균, 항-기생충, 또는 항-종양 기능)를 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 이종의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 이종의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종의 핵산 서열은 CEA, MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 이들의 변이체, 일부분, 또는 이들의 임의의 조합이다.
표적 항원은 다양한 종양 단백질로부터 유래한 항원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 단백질의 일부분 또는 변이체는 표적 항원으로서 이용된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원으로 이용되는 종양 단백질의 일부분 또는 변이체는 종양 단백질 또는 상기를 포함하는 세포에 대해 면역 반응을 일으키는 변형된, 예를 들어 증가된, 능력을 보인다. 본 발명의 백신은 항원에 대해 백신접종을 할 수 있다. 백신은 또한 에피토프를 표적화할 수 있다. 항원은 종양 세포 항원일 수 있다. 에피토프는 종양 세포 에피토프일 수 있다. 이러한 종양 세포 에피토프는 광범위한 종양 항원, 예를 들어 돌연변이로 인한 종양의 항원, 공유된 종양 특이적 항원, 분화 항원, 종양에서 과발현된 항원으로부터 유래할 수 있다. 종양 관련 항원(TAA)은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있다; 이들은 돌연변이되거나, 끝이 절단되거나, 미스폴딩될 수 있거나, 또는 그외 숙주에 의해 정상적으로 발현되는 분자의 비정상적인 발현일 수 있다; 이들은 정상적으로 발현되지만 비정상적으로 고수준으로 발현되는 분자와 동일할 수 있다; 또는 이들은 비정상인 맥락 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양 관련 항원은, 예를 들어, 단백질 또는 단백질 단편, 복합 탄수화물, 강글리오시드, 합텐, 핵산, 기타 생물 분자, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 유용한 예시적인 종양 단백질은 WT1, HPV E6, HPV E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her2/neu, BRCA1, 브라큐리, 브라큐리(TIVS7-2, 다형태), 브라큐리(IVS7 T/C 다형태), T 브라큐리, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1(VNTR 다형태), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, β-카테닌/m, 카스파아제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 및 TEL/AML1 중 임의의 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 WT1, HPV E6, HPV E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her2/neu, BRCA1, 브라큐리, 브라큐리(TIVS7-2, 다형태), 브라큐리(IVS7 T/C 다형태), T 브라큐리, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1(VNTR 다형태), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, β-카테닌/m, 카스파아제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 및 TEL/AML1로부터 선택된 변형된 폴리펩티드로서, 폴리펩티드 또는 이의 단편은 기재된 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 것인 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 표적 항원 서열을 포함한다.
본 발명에 유용한 예시적인 종양 단백질은 CEA, 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu), 인간 상피 성장 인자 수용체 3(HER3), 인간 유두종바이러스(HPV), MUC1, 전립선-특이적 항원(PSA), 알파-액티닌-4, ARTC1, CAR-ABL 융합 단백질(b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDKN2A, COA-1, dek-can 융합 단백질, EFTUD2, 연장 인자 2, ETV6-AML1 융합 단백질, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, LDLR-푸코실트랜스퍼라아제 융합 단백질, HLA-A2d, HLA-Al ld, hsp70-2, KIAAO205, MART2, ME1, MUM-1f, MUM-2, MUM-3, neo-PAP, 미오신 I형, NFYC, OGT, OS-9, p53, pml-RAR알파 융합 단백질, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSX1- 또는 -SSX2 융합 단백질, TGF-베타RII, 삼탄당인산 이소머라아제, BAGE-1, GnTVf, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A9, MAGE-C2, 뮤신k, NA-88, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, Sp17, SSX-2, SSX-4, TAG-1, TAG-2, TRAG-3, TRP2-INT2g, XAGE-1b, gp100/Pmel17, 칼리크레인 4, 맘마글로빈-A, 멜란-A/MART-1, NY-BR-1, OA1, PSA, RAB38/NY-MEL-1, TRP-1/gp75, TRP-2, 티로시나아제, 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, BCLX(L), BCMA, BING-4, CPSF, 사이클린 D1, DKK1, ENAH(hMena), EP-CAM, EphA3, EZH2, FGF5, G250/MN/CAIX, HER-2/neu, IL13R알파2, 장 카복실 에스테라아제, 알파 태아단백질, M-CSFT, MCSP, mdm-2, MMP-2, MUC1, p53, PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RGS5, RNF43, RU2AS, 세크레닌 1, SOX10, STEAP1, 서바이빈, 텔로머라아제, 및/또는 VEGF 중 임의의 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
종양 관련 항원은 인간 악성 종양과 관련된 감염원으로부터의 항원일 수 있다. 인간 악성 종양과 관련된 감염원의 예는 엡스타인 바 바이러스, 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori), 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 인간 헤르페스바이러스-8, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 간질증, 및 스키스토소마 헤마토비움(Schistosoma haematobium)을 포함한다.
CEA
항원 표적
CEA는 거의 모든 결장직장암 및 췌장암에서 과발현되고, 일부 폐암 및 유방암, 및 수질 갑상선암과 같은 드문 암에서도 과발현되지만 위장 상피에서 저수준의 발현을 제외하고 기타 신체의 세포에서는 발현되지 않기 때문에 이는 면역요법에 주목받는 표적 항원을 대표한다. CEA는 T 세포에 의해 MHC 제한된 방식으로 인식될 수 있는 에피토프를 포함한다.
본 발명자들은 기존의 또는 유도된 Ad5-중화 항체가 존재하는데에도 종양 항원 CEA를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 다중 동종 면역화가 생쥐에서 항종양 활성을 가진 CEA 특이적 세포 매개 면역(CMI) 반응을 유도하였다는 것을 발견하였다. 본 I/II 상 연구에서, 진행된 결장직장암 환자의 코호트를 증가하는 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 면역시켰다. 다수의 환자(61.3%)에서 기존의 Ad5 면역이 존재하는데에도 CEA 특이적 CMI 반응이 관찰되었다. 중요하게는, 최소한의 독성이 있었으며, 전체 환자 생존율(12개월에 48%)은 기존의 Ad5 중화 항체 역가와 무관하게 유사하였다. 결과는 암 환자에서, 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 유전자 전달 플랫폼이 자연적으로 획득된 및 면역-유도된 A5 특이적 면역 두 가지 모두의 환경에서 종양 항원 CEA에 대해 유의한 CMI 반응을 생성한다는 것을 증명해 준다.
CEA 항원 특이적 CMI는, 예를 들어, 106 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000개 이상의 IFN-γ 반점 형성 세포(SFC)보다 더 많을 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 인간 피험체에서 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 12000, 15000개 이상보다 큰 기존의 역수의 Ad5 중화 항체 역가로 상승한다. 면역 반응은 본원에서 기재된 바와 같이 세포 매개 면역 및/또는 체액성 면역을 포함할 수 있다. 면역 반응은 본원에 기재된 바와 같이 그리고 당 업자에게 이용 가능한 정도까지, 세포 내 사이토카인 염색(ICS), ELISpot, 증식 분석법, 크롬 방출 또는 등가 분석법을 포함한 세포독성 T 세포 분석법, 및 다수의 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 또는 RT-PCR 기반 분석법을 이용하는 유전자 발현 분석뿐 아니라 면역 반응을 측정하기 위해 당 업계에 공지된 임의의 기타 적합한 분석법 중 하나 이상에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 폴리펩티드의 야생형 서브유닛과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 서브유닛을 코딩하는 변형된 서열을 포함한다.
면역원성 폴리펩티드는 돌연변이체 CEA 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드는 위치 610에서 Asn->Asp 치환을 갖는 돌연변이체 CEA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 1의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 1 또는 대체 코돈 치환에 의해 서열 번호 1로부터 생성된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 CEA 서열과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 점 돌연변이, 예를 들어 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열 또는 서열 번호 2의 변형된 형태, 예를 들어 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 점 돌연변이, 예를 들어 아미노산 치환 또는 결실을 포함한 변형된 형태를 포함한다.
CEA 유전자 패밀리의 일원은 서열 유사성, 발생학적 발현 양상 및 이들의 생물학적 기능을 기준으로 하여 3개의 하위군으로 세분된다: 12개 유전자를 포함하는 CEA-관련 세포 부착 분자(CEACAM) 하위군(CEACAM1, CEACAM3 - CEACAM8, CEACAM16 및 CEACAM18-CEACAM21), 11개의 밀접하게 관련된 유전자를 포함하는 임신 특이적 당단백질(PSG) 하위군(PSG1 - PSG11) 및 11개 위유전자(pseudogene)의 하위군(CEACAMP1 -CEACAMP11). CEACAM 하위군의 대부분의 일원은 면역글로불린 가변 도메인과 구조적 상동성을 갖는 단일 N-말단 V-세트 도메인으로 구성된 세포외 Ig-유사 도메인, 이어서 변화하는 개수의 A 또는 B 아형의 C2-세트 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인으로 이루어진 유사한 구조를 갖는다. 이들의 구조의 조직에 있어 약간의 예외를 나타내는 CEACAM 하위군의 두 가지 일원(CEACAM16 및 CEACAM20)이 존재한다. CEACAM16은 그의 N 및 C 말단에 2개의 Ig-유사 V-형 도메인을 포함하고, CEACAM20은 끝이 절단된 Ig-유사 V-1형 도메인을 포함한다. CEACAM 분자는 그들의 막횡단 도메인를 통해 세포 표면에 고정되거나(CEACAM5 내지 CEACAM8), 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 지질 모이어티에 직접적으로 연결될 수 있다(CEACAM5, CEACAM18 내지 CEACAM21).
CEA 패밀리 일원은 다양한 세포 유형에서 발현되고 광범위한 생물학적 기능을 갖는다. CEACAM은 대부분의 상피 세포에서 두드러지게 발견되고 다양한 백혈구에 존재한다. 인간에서, CEA 패밀리의 원형인 CEACAM1은 상피 및 내피세포의 정단면에서뿐 아니라 림프계 및 골수계 세포에서 발현된다. CEACAM1은 혈액 친화성(CEACAM1 내지 CEACAM1)뿐 아니라 이주성(heterothallic)(예를 들어, CEACAM1 내지 CEACAM5) 상호작용을 통해 세포-세포 부착을 매개한다. 게다가, CEACAM1은 많은 다른 생물학적 과정, 예를 들어 혈관형성, 세포 이동, 및 면역 기능에 관련된다. CEACAM3 및 CEACAM4 발현은 대개 과립구에 제한적이고, 이들은 나이세리아(Neisseria ), 모락셀라(Moraxella ), 및 헤모필루스(Haemophilus) 종을 포함한 여러 세균성 병원균의 흡수 및 파괴를 전달할 수 있다.
따라서, 여러 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20, CEACAM21, PSG1, PSG2, PSG3, PSG4, PSG5, PSG6, PSG7, PSG8, PSG9, 및 PSG11로 이루어진 군으로부터 선택된 CEA에 대한 면역 반응을 상승시키는 것에 관한 것이다. 면역 반응은 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 하나 이상의 CEA를 발현하거나 과발현하는 세포, 예를 들어. 암세포에 대해 상승할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 같은 암세포에서 하나 이상의 CEA의 발현은 비암세포와 비교하여 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 이상이 넘는다.
뮤신
패밀리
항원 표적
인간 뮤신 패밀리(MUC1 내지 MUC21)는 체내의 상피 표면에 점액질의 보호 장벽을 형성하는데 중요한 역할을 하는 분비형 및 막횡단 뮤신을 포함한다. 호흡, 위장관에 막을 형성하고 중요한 기관, 예를 들어 유선, 간, 위, 췌장, 및 신장에서 관에 막을 형성하는 상피를 보호하는데 기능을 한다.
MUC1(CD227)은 대부분의 인간 암종 및 여러 혈액 악성종양에서 과발현되는 TAA이다. MUC1(GenBank: X80761.1, NCBI: NM_001204285.1)은 인간 질환과 관련된다고 알려진 많은 중요한 세포 경로를 활성화한다. MUC1은 여러 인간 암에서 보편적으로 과발현되는 2개의 서브유닛에 의해 형성되는 이종 이량체 단백질이다. MUC1은 자가단백질분해를 거쳐 두 개의 서브유닛 MUC1n 및 MUC1c을 생성하고, 이들은 차례로 안정한 비공유 이종 이량체를 형성한다.
MUC1 C-말단 서브유닛(MUC1c)은 58 aa 세포 외 도메인(ED), 28 aa 막횡단 도메인(TM) 및 72 aa 세포질 도메인(CD)을 포함할 수 있다. MUC1c은 또한 MUC1의 이량체화를 허용할 수 있는 "CQC" 모티프를 포함할 수 있고 이는 또한 세포에 발암성 기능을 부여할 수 있다. 일부 경우에, MUC1은 MUC1c에 의한 세포 신호전달의 유도를 통해 부분적으로 발암성 기능을 할 수 있다. MUC1c는 EGFR, ErbB2 및 기타 수용체 티로신 키나아제와 상호작용하여 PI3K->AKT 및 MEK→>ERK 세포 경로의 활성화에 기여할 수 있다. 핵에서, MUC1c는 Wnt/β-카테닌, STAT 및 NF-κB RelA 세포 경로를 활성화한다. 일부 경우에, MUC1은 MUC1n에 의한 세포 신호전달의 유도를 통해 발암성 기능을 부여할 수 있다. MUC1 N-말단 서브유닛(MUC1n)은 글리코실화될 수 있는 가변 개수의 20개 아미노산 직렬 반복체를 포함할 수 있다. MUC1은 정상적으로 선상피 세포의 표면에서 발현되고 암종에서 과발현되고 비정상적으로 글리코실화된다. MUC1은 종양 면역요법을 위한 표적으로 이용될 수 있는 TAA이다. 면역치료 백신에 있어 MUC1의 용도를 평가하기 위해 여러 임상 시험을 수행하였고 실시하고 있다. 중요하게는, 이들 시험은 MUC1 표적화를 이용한 면역요법이 안전하며 생존 이점을 제공할 수 있다는 것을 보여준다.
그러나 임상 시험은 또한 MUC1이 상대적으로 불량한 면역원이라는 것을 보였다. 이를 극복하기 위해서, 발명자들은 MUC1 발암 단백질(MUC1-C 또는 MUC1c)의 C 말단 영역 내 T 림프구 면역 인핸서 펩티드 서열을 확인하였다. 천연 펩티드 서열과 비교하여 이들의 변형된 MUC1-C 내 작용제는 (a) 더 낮은 펩티드 농도에서 HLA-A2에 결합하였고, (b) HLA-A2에 대해 더 높은 결합 활성을 증명하였으며, (c) 항원 제시 세포와 함께 사용될 때, 천연 펩티드와 사용될 때보다 T 세포에 의해 더 많은 IFN-γ 생산을 유도하였으며, (d) 암환자로부터 MUC1-특이적 인간 T 세포주를 더 효율적으로 생성할 수 있었다. 중요하게는, 작용제 에피토프를 이용하여 생성된 T 세포주는 천연 에피토프로 펄스된 표적의 용해에 대해, 그리고 MUC1을 발현하는 HLA-A2 인간 종양 세포의 용해에서, 천연 에피토프로 생산된 것들보다 더 효율적이었다. 추가적으로, 발명자들은 MUC1-C의 추가의 CD8+ 세포독성 T 림프구 면역 인핸서 작용제 서열 에피토프를 확인하였다.
본 개시는 면역 인핸서 능력이 변형된 강력한 MUC-1C(mMUC1-C 또는 MUC1-C 또는 MUC1c)를 제공한다. 본 개시는 재조합 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼에 편입된 면역 인핸서 능력이 변형되어 신규의 더 강력한 면역치료 백신을 생산하는 강력한 MUC1-C를 제공한다. 예를 들어, 면역치료 백신은 MUC1을 발현하는 암 또는 감염증을 치료하기 위한 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C일 수 있다.
번역 후 변형은 체내 및 인간 질환에서 단백질 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 상기에 논의된 단백질 분해 절단 외에도, MUC1은 특정 아미노산 잔기에서 여러 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 팔미토일화, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. MUC1의 글리코실화, 시알릴화, 인산화, 또는 팔미토일화 변형을 표적화하는 면역요법을 본원에서 제공한다.
MUC1은 높은 수준으로 글리코실화될 수 있다(각 직렬 반복체 내 세린 및 트레오닌 잔기에 모노- 내지 펜타-글리코실화 범위로 변화하는 정도의 N- 및 O-결합된 탄수화물 및 시알산). 유방 암종에서 3,4-결합된 GlcNAc로 다르게 O-글리코실화된다. N-글리코실화는 분비형 MUC1/SEC에서 고-만노오스, 산성 복합체형 및 혼성 글리칸, 및 막횡단형 MUC1/TM.4에서 중성 복합체형으로 이루어진다. 본 개시는 MUC1의 다르게 O-글리코실화된 형태를 표적화하는 면역요법을 제공한다.
또한, MUC1은 시알릴화될 수 있다. 신장암 및 유방암 세포로부터 막에서 떨어져 나온 당단백질은 우선적으로 시알릴화된 코어 1 구조를 가지지만, 동일한 조직으로부터 분비된 형태는 주로 코어 2 구조를 갖는다. O-글리코실화 함량은 우세한 말단 푸코오스 및 갈락토오스, 2- 및 3-결합된 갈락토오스, 3- 및 3,6-결합된 GalNAc-ol 및 4-결합된 GlcNAc를 가진 이들 두 조직 모두에서 중복된다. 본 개시는 MUC1의 여러 시알릴화 형태를 표적화하는 면역요법을 제공한다. CQC 모티프 내 시스테인 잔기에 이중 팔미토일화는 엔도솜에서 원형질막으로 재사용하는데 필요하다. 본 개시는 여러 MUC1의 팔미토일화 형태를 표적화하는 면역요법을 제공한다.
인산화는 MUC1이 인간 건강에 중요한 특정 세포 신호전달 반응을 유도하는 능력에 영향을 줄 수 있다. 본 개시는 MUC1의 여러 인산화 형태를 표적화하는 면역요법을 제공한다. 예를 들어, MUC1은 C-말단 도메인 내 티로신 및 세린 잔기에서 인산화될 수 있다. C-말단 도메인 내 티로신에서 인산화는 MUC1 및 β-카테닌의 핵의 국소화를 증가시킬 수 있다. PKC 델타에 의한 인산화는 β-카테닌/CTNNB1에 대한 MUC1의 결합을 유도하고 β-카테닌/E-카데린 복합체의 형성을 감소시킬 수 있다. MUC1의 Src-매개된 인산화는 GSK3B와의 상호작용을 억제할 수 있다. Tyr-1229에서 MUC1의 Src- 및 EGFR-매개된 인산화는 β-카테닌/CTNNB1에 대한 결합을 증가시킬 수 있다. Ser-1227에서 MUC1의 GSK3B-매개된 인산화는 상기 상호작용을 감소시킬 수 있지만 β-카데린/E-카데린 복합체의 형성을 되돌린다. MUC1의 PDGFR-매개된 인산화는 MUC1CT 및 CTNNB1의 핵에 공동 국소화를 증가시킬 수 있다. 본 개시는 MUC1, MUC1c 및 MUC1n의 세포 신호전달 능력을 조절하는 것으로 알려진 이의 상이한 인산화 형태를 표적화하는 면역요법을 제공한다.
본 개시는 MUC1c 세포질 도메인 및 세포 내 그의 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 MUC1c에서 CQC 모티프를 조절하는 단계를 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 MUC1c의 세포 외 도메인(ED), 막횡단 도메인(TM), 세포질 도메인(CD), 또는 이들의 조합을 조절하는 단계를 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 EGFR, ErbB2 또는 다른 수용체 티로신 키나아제를 통해 세포 신호전달을 유도하는 MUC1c의 능력을 조절하는 단계를 포함하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 PI3K>AKT, MEK→>ERK, Wnt/β-카테닌, STAT, NF-αB RelA 세포 경로, 또는 이들의 조합을 유도하는 MUC1c의 능력을 조절하는 단계를 포함하는 면역요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, MUC1c 면역요법은 CEA를 더 포함할 수 있다.
본 개시는 또한 MUC1n 및 그의 세포 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 또한 MUC1n의 직렬 반복체, MUC1n의 직렬 반복체 상 글리코실화 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 면역요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, MUC1n 면역요법은 CFA를 더 포함한다.
본 개시는 또한 MUC1n, MUC1c, CEA, 또는 이들의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 본 개시는 MUC1c 및 CEA를 포함하는 백신을 제공한다. 본 개시는 또한 MUC1n 및 CEA를 표적화하는 백신을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 조합은 본원에서 제공되는 한 벡터 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항원 조합은 본원에서 제공된 분리된 벡터 내에 포함된다.
본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5의 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩티드는 MUC1의 이소형 또는 이의 서브유닛 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 5의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 6에 의해 확인되는 하기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 9에 의해 확인되는 하기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 9 또는 대체 코돈 치환에 의해 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 9로부터 생성된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 MUC1 서열과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 점 돌연변이, 예를 들어 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
브라큐리 항원 표적
본 개시는 또한 브라큐리에 대해 하나 이상의 항원을 포함하는 면역요법을 제공한다. 브라큐리(인간에서 "T" 단백질로도 알려짐)는, 대부분의 정상의 중배엽의 형성 및 분화에서, 초기 발생 과정에 중요한 역할을 하는 전사 인자의 T-박스 패밀리의 일원이며 T 도메인으로 지정된 매우 보존된 DNA 결합 도메인을 특징으로 한다. 상피 간엽 이행(EMT)은 1차 종양의 브라큐리가 중요한 역할을 하는 전이 단계로의 진행 과정에서 중요한 단계이다. 인간 암종 세포에서 브라큐리의 발현은 간엽 마커의 상승 조절, 상피 마커의 하향 조절, 및 세포 이동 및 침습의 증가를 포함한 EMT의 특징적인 변화를 유도한다. 반대로, 브라큐리의 억제는 결과적으로 간엽 마커의 하향 조절, 및 세포 이동 및 침습의 소실, 및 인간 종양 세포가 전이를 형성하는 능력의 감소를 일으켰다. 브라큐리는 상피 간엽 이행을 매개하는 기능을 할 수 있고 침습을 촉진한다.
본 개시는 또한 암과 같은 세포 증식 질환에서 상피 간엽 이행 기능에 대한 브라큐리 효과를 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 또한 암과 같은 세포 증식 질환에서 침습을 촉진하는 브라큐리의 능력을 조절하는 면역요법을 제공한다. 본 개시는 또한 브라큐리의 T-박스 도메인의 DNA 결합 기능을 조절하는 면역요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 브라큐리 면역요법은 CEA 또는 MUC1, MUC1c 또는 MUC1n에 대해 하나 이상의 항원을 더 포함할 수 있다.
브라큐리 발현은 대부분의 정상 인간 조직에서 거의 검출되지 않고 인간 종양에 매우 제한되며 대개 과발현되어 면역요법을 위한 주목받는 표적 항원이 된다. 인간에서, 브라큐리는 T 유전자(GenBank: AJ001699.1, NCBI: NM_003181.3)에 의해 코딩된다. 인간에서 발견되는 선택적인 스플라이싱에 의해 생산되는 적어도 두 가지 상이한 이소형이 존재한다. 각 이소형은 많은 천연 변이체를 갖는다.
브라큐리는 면역원성을 가지며 시험관 내에서 증폭된 브라큐리-특이적 CD8+ T-세포는 브라큐리를 발현하는 종양 세포를 용해시킬 수 있다. 브라큐리의 이러한 특징은 이를 면역요법에서 주목받는 TAA로 만든다. 브라큐리 단백질은 T-박스 전사 인자이다. 이는 T-박스라고 불리는 그의 N-말단 내 영역을 통해 가까운 팔린드롬 서열 "TCACACCT"인 특정 DNA 인자에 결합하여 상기 부위에 결합될 때 유전자 전사를 활성화할 수 있다.
본 개시는 또한 브라큐리, CEA, 또는 이들의 조합을 포함하는 백신을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 조합은 본원에서 제공되는 한 벡터 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항원 조합은 본원에서 제공된 분리된 벡터 내에 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 혈청형 5의 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩티드는 브라큐리의 이소형 또는 이의 서브유닛 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 7에 의해 확인되는 하기 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 8의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 번호 7, 서열 번호 8, 또는 대체 코돈 치환에 의해 서열 번호 7, 서열 번호 8로부터 생성된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 면역원성 폴리펩티드는 야생형 인간 브라큐리 서열과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 점 돌연변이, 예를 들어 단일 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
감염증 관련 항원 표적
본 개시의 표적 항원은 임의의 다양한 감염원, 예를 들어 기생충, 세균, 바이러스, 프라이온 등으로부터 유래한 항원을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 감염원은 숙주를 감염시킬 수 있는 임의의 살아있는 생물체를 언급할 수 있다. 감염원은 예를 들어, 세균, 임의의 다양한 바이러스, 예를 들어, 단일 가닥 RNA 바이러스, 단일 가닥 DNA 바이러스, 진균, 기생충, 및 원생동물을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 감염증 관련 표적 항원의 예는 하기로부터 유래할 수 있다: 악티노바실루스(Actinobacillus) 종, 악티노마이세스(Actinomyces) 종, 아데노바이러스(1, 2, 3, 4, 5 및 7형), 아데노바이러스(40 및 41형), 아에로코커스(Aerococcus) 종, 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 안시클로스토마 두오데날(Ancylostoma duodenale), 안지오스트롱질루스 칸토넨시스(Angiostrongylus cantonensis), 아스카리스 럼브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 아스카리스(Ascaris) 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 바베시아(Babesia) 종, 비. 미크로티(B. microti), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 박테로이데스(Bacteroides) 종, 발란티듐 콜라이(Balantidium coli), 바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 블루텅(Bluetongue) 바이러스, 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 보렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 그라니이(Borrelia garinii), 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis), 브루셀라(Brucella) 종(비. 아보르투스(B. abortus), 비. 카니스(B. canis), 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 수이스(B. suis)), 브루기아(Brugia) 종, 부르크홀데리아(슈도모나스) 말레이((Burkholderia(Pseudomonas) mallei), 부르크홀데리아(슈도모나스) 슈도말레이(Burkholderia ( Pseudomonas ) pseudomallei), 캘리포니아 혈청군, 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus) 아종 페투스(Fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 씨. 콜라이(C. coli), 씨. 페투스(C. fetus) 아종 제주니(Jejuni), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 종, 치쿤군야(Chikungunya) 바이러스, 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 시트로박터(Citrobacter) 종, 클로노르치스 시넨시스(Clonorchis sinensis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) 클로스트리듐 종(상기에 열거된 종을 제외함), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 콜로라도 진드기열 바이러스, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 콕사키바이러스(Coxasackievirus), 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob agent), 쿠루(Kuru agent), 크림-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 파붐(Cryptosporidium parvum), 사이토메갈로바이러스, 시클로스포라 카야타네시스(Cyclospora cayatanesis), 뎅기(Dengue) 바이러스(1, 2, 3, 4), 디프테로이드(Diphtheroid), 동부(서부) 말 뇌염 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 에키노코커스 그래뉼로수스(Echinococcus granulosus), 에키노코커스 멀티로큘라리스(Echinococcus multilocularis), 에코바이러스(Echovirus), 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 엔테로박터(Enterobacter) 종, 엔테로바이러스(Enterovirus) 70, 에피더모피톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum), 엘리키아(Ehrlichia) 종, 엘리키아 세네추(Ehrlichia sennetsu), 마이크로스포룸(Microsporum) 종, 트리코피톤(Trichophyton) 종, 엡스타인 바 바이러스, 장출혈성 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 장침입성 에쉐리키아 콜라이, 장병원성 에쉐리키아 콜라이, 장독소형 에쉐리키아 콜라이, 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 프라시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테륨(Fusobacterium) 종, 게멜라 헤몰리산스(Gemella haemolysans), 람블편모충(Giardia lamblia), 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 헤모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus Influenzae)(b군), 한타바이러스, 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 간염 D 바이러스, 간염 E 바이러스, 단순포진(Herpes simplex) 바이러스, 헤르페스바이러스 시미에(Herpesvirus simiae), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 인간 코로나바이러스(coronavirus), 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종바이러스, 인간 로타바이러스(rotavirus), 인간 T 림프구 친화성 바이러스, H5N1을 포함한 인플루엔자(Influenza) 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스/마추포(Machupo) 바이러스, 클레부지엘라(Klebsiella) 종, 카야사나 삼림병(Kyasanur Forest disease) 바이러스, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 라사(Lassa) 바이러스, 리지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 큰 리슈만 편모충(Leishmania major), 소아리슈만편모충(Leishmania infantum), 리슈마니아(Leishmania) 종, 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락 수막염 바이러스, 마추포 바이러스, 마르부르크(Marburg) 바이러스, 홍역 바이러스, 미크로코커스(Micrococcus) 종, 모락셀라 종, 마이코박테리움(Mycobacterium) 종(엠. 보비스(M. bovis), 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 레프레(M. leprae) 이외), 마이코박테리움 튜버큘로시스, 엠. 보비스, 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 엠. 오랄(M. orale), 엠. 살리바륨(M. salivarium), 엠. 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라스마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae), 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri), 네카토르 아메리카누스(Necator americanus), 나이세리아 고노로이에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 종(엔. 고노로이에 및 엔. 메닝기티디스 이외), 노카르디아(Nocardia) 종, 노워크(Norwalk) 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 온코세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus), 오피스토르치스(Opisthorchis) 종, 파보바이러스(Parvovirus) B19, 파스퇴렐라(Pasteurella) 종, 펩토코커스(Peptococcus) 종, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 종, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 종, 플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides), 포와산(Powassan) 뇌염 바이러스, 프로테우스(Proteus) 종, 슈도모나스 종(피. 말레이, 피. 슈모도말레이 이외), 광견병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 리노바이러스(Rhinovirus), 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 프로바체키(Rickettsia prowazekii), 알. 캐나(R. Canada), 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii), 리프트 계곡(Rift Valley) 바이러스, 로스강(Ross river) 바이러스/오니옹-니옹(O'Nyong - Nyong) 바이러스, 풍진(Rubella) 바이러스, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살로넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 종(상기에 열거된 종은 제외함), 스키스토소마(Schistosoma) 종, 스크레피(Scrapie agent), 세라티아(Serratia) 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 스포로트릭스 셴키(Sporothrix schenckii), 세인트 루이스(St. Louis) 뇌염 바이러스, 머레이 계곡(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스( Streptobacillus moniliformis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 파이로제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 태니아 사지나타(Taenia saginata), 태니아 솔리움(Taenia solium), 톡소카라 카니스(Toxocara canis), 티. 카티(T. cati), 티. 크루지(T. cruzi), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트리키넬라(Trichinella) 종, 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 트리쿠리스 트리키우라(Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 우레아플라즈마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 바리셀라 조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스(EEEV), 중증 급성 호흡 증후군 바이러스(SARS), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 수포성 구내염 바이러스, 비브리오 콜레라 1형(Vibrio cholerae , serovar 01), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 부케레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 황열 바이러스, 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에르시니아 슈도튜버큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 및 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis). 표적 항원은 임의의 감염성 생물체에 의해 생산된 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
많은 바이러스가 필로바이러스(filovirus)(예를 들어, 에볼라, 마르부르크, 및 레스톤(Reston)), 아레나바이러스(arenavirus)(예를 들어. 라사, 주닌, 및 마추포), 및 분야바이러스(bunyavirus)를 포함하는 바이러스 출혈열과 관련된다. 또한, 예를 들어, 리프트 계곡 열 바이러스를 포함하는 플레보바이러스(phlebovirus)는 바이러스 출혈열의 원인 물질로서 확인되었다. 출혈열 및 관련 염증의 원인 물질은 또한 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 특히 호흡기 세포융합 바이러스를 포함할 수 있다. 게다가, 인간에서 출혈열을 일으키는 기타 바이러스는 하기 바이러스 군에 속하는 것으로 확인되었다: 토가바이러스(togavirus)(치쿤군야), 플라비바이러스(flavivirus)(뎅기, 황열, 카야사나 삼림병, 옴스크 출혈열), 나이로바이러스(nairovirus)(크림-콩고 출열열) 및 한타바이러스(hantavirus)(신장병증 유행병인 출혈열 신증후군). 게다가, 신 놈브레(Sin Nombre) 바이러스는 미국 남서부에서 한타바이러스 폐증후군의 1993년 발생의 원인 물질로서 확인되었다.
표적 항원은 바이러스 코트 단백질, 즉, 인플루엔자 뉴라미니다아제 및 헤마글루티닌, HIV gp160 또는 이들의 유도체, HIV Gag, HIV Nef, HIV Pol, SARS 코트 단백질, 헤르페스 비리온 단백질, WNV 단백질 등을 포함할 수 있다. 표적 항원은 또한 폐렴구균 PsaA, PspA, LytA, 나이세리아 고노로이에와 같은 세균 병원균의 표면 또는 독력 관련 단백질, 외막 단백질 또는 표면 프로테아제를 포함하는 세균 표면 단백질을 포함할 수 있다.
HPV
항원 표적
표적 항원은 또한 인간 유두종바이러스(HPV), 예를 들어 발암 단백질 E6 및 E7과 관련된 단백질, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발암 단백질은 비-발암성 변이체 또는 야생형 단백질에 비해 발암성이 감소된 변이체를 생산하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 종양 서프레서(suppressor) 단백질(예를 들어, p53 및 pRb)에 결합을 담당하는 펩티드의 일부분은 종양 서프레서 단백질과 더 이상 상호작용하지 않도록 결실되거나 변형될 수 있다. 또 다른 예로써, Her2/neu와 같이 키나아제인 발암 단백질은, 예를 들어, 점돌연변이에 의해, 키나아제가 불활성화될 수 있다. 일부 경우에, 2가지 이상의 표적 항원을 면역화 과정에 사용할 수 있다. 예를 들어, E6 및 E7 항원은 융합 단백질에 조합될 수 있거나, 변형된 또는 비변형된 E6 및 E7 표적 항원을 코딩하는 이종 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 벡터가 함께 사용된다. 예를 들어, Ad5-E6 벡터는 Ad5-E7 벡터와 함께 투여될 수 있다. 상기 예에서, Ad5-E6 벡터 및 Ad5-E7 벡터는 동시에 투여될 수 있거나 이들은 순차적으로 투여될 수 있다.
고위험도 인간 유두종 바이러스(HPV), 예를 들어 HPV 16형은 HPV-관련된 두경부 편평 세포 암종 중 90% 이상 및 자궁경부암의 병인과 관련된다. 예방 백신, 예를 들어 인간 유두종바이러스 2가[16 및 18형] 백신 및 재조합의 인간 유두종바이러스 4가[6, 11, 16, 및 18형] 백신은 바이러스로 감염을 예방함으로써 HPV 관련된 암에 대한 1차 방어가 될 수 있지만 보고는 이들이 확립된 질환의 활성의 면역요법에 효과적이지는 않다고 보여준다. HPV 초기 6(E6) 및 초기 7(E7) 유전자는 HPV-유도된 암에서 고수준으로 발현되고 1차 인간 상피 세포의 불멸화에 관련된다. 따라서, 이들 바이러스 항원은 많은 다른 종양 관련 항원과 다르게 "비자가성"이어서 자가 면역을 유도할 가능성을 갖지 않기 때문에 이들은 종양 특이적 면역요법에 이상적인 표적이 된다.
세포 예정사-리간드 1(PD1) 차단과 병용된 HPV 16 유전자 E6 및 E7(Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7)에 대해 면역시키는 바이러스 유전자 전달 플랫폼을 이용하는 인간 유두종 바이러스(HPV)에 대한 면역요법을 본원에서 개시한다. 또한, HPV 16형 E6 및 E7의 변형된 유전자를 포함하는 유전자 전달 비히클(Ad5 [E1-, E2b-])로 구성된 면역치료제를 본원에서 개시한다. HPV E6 및 E7 유전자는 HPV 유도된 종양에 대해 면역 반응을 생성하는데 필요한 항원성을 유지하면서 이들을 비발암성으로 만들도록 변형될 수 있다. 변형된 유전자는 p53, pRb, 및 PTPN13을 분해하는 능력이 결여될 수 있다. 변형된 유전자는 백신(Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7)에 편입될 수 있다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신은 HIV-특이적 세포 매개 면역(CMI) 반응을 유도하는 능력을 보유할 수 있으며 표준 임상 요법과 상승작용을 하여 HPV-E6/E7 발현 종양의 면역 매개된 제거를 향상시킬 수 있다.
활성화와 억제 신호 사이의 균형은 T 림프구와 종양 세포 사이의 상호작용을 조절하며, 여기서 T 세포 반응은 T 세포 수용체(TCR)에 의한 항원 인식을 통해 개시된다. 일부 경우에, HPV-E6/E7 발현 종양을 보유하는 생쥐에서 화학요법/방사선 치료가 병용될 때, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법 치료는 결과적으로 화학치료/방사선만을 받은 피험체에 비해 전체 생존이 유의하게 개선될 수 있다.
개별 맞춤 종양 관련 항원
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용되는 종양 관련 항원은 증식성 질환 또는 암을 가진 개체로부터 직접적으로 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 양성 종양, 전이성 종양, 암종, 또는 육종 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개별 맞춤 종양 항원은 환자로부터 특성화되고 나아가 전체, 부분 또는 변이체로서 표적 항원으로 이용되는 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 개체로부터 종양 표적 항원을 확인하기 위하여 다양한 공지된 기술을 이용하여 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 환자로부터 종양 생검을 얻어, 종양 세포로부터 RNA를 단리하고 유전자 칩(예를 들어 아피메트릭스(Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재))을 이용하여 스크리닝하여 종양 항원을 확인한다. 종양 표적 항원이 확인되면, 이를 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 클로닝하고, 발현하고 정제할 수 있다.
그 후 상기 표적 항원은 하나 이상의 에피토프에 연결되거나 본원에 기재된 카세트 또는 바이러스 벡터에 편입되거나 연결되어 종양으로부터 단리된 표적 분자에 대한 면역 반응을 변경하기 위해서 환자에 투여될 수 있다. 상기 방법에서, "개별 맞춤" 면역요법 및 백신은 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 암이 유전적이여 물려받을 경우, 예를 들어 환자가 BRAC1 또는 BRAC2 돌연변이를 갖는지 확인하고, 백신은 예방적으로 사용될 수 있다, 암이 특발성일 경우, 면역요법은 종양의 크기를 감소시키고, 전체를 향상시키고 피험체에서 암의 재발을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
복합 면역요법 및 백신
본 개시는 암 및 감염증의 치료를 위한 복합 면역요법 및 백신 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에서 제공된 복합 면역요법 및 백신은 암의 발생과 관련된 항원, 예를 들어 종양 관련 항원(TAA) 또는 특정 감염증에 관련된다고 알려진 항원, 예를 들어 감염증 관련 항원(IDAA)에 대한 다중 표적화 면역치료 접근법을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에서 제공된 복합 면역요법 및 백신은 암 또는 감염증 발생과 관련된 항원에 대한 다중 표적화 항원 시그니쳐 면역치료 접근법을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 여러 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같이, 질환의 면역화를 위한 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 및/또는 CEA의 변이체를 발현하는 바이러스 기반 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 및/또는 CEA에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있다.
일부 측면에서, 벡터는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 적어도 3개의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 3개 초과의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신 제제는 1:1 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:2 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:3 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:4 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:5 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:6 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:7 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:8 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:9 비율의 벡터 대 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 1:10 비율의 벡터 대 항원을 포함한다.
일부 측면에서, 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 하나의 단일 항원을 각각 포함하는 적어도 2개의 벡터를 포함한다. 일부 측면에서 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 하나의 단일 항원 표적을 각각 포함하는 적어도 3개의 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 하나의 단일 항원을 각각 포함하는 3개 초과의 벡터를 포함한다.
일부 측면에서, 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 2개의 벡터를 포함하고, 적어도 2개의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 적어도 2개의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 3개의 벡터를 포함하고, 적어도 3개의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 적어도 3개의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 백신은 복합 백신으로, 백신은 3개 이상의 벡터를 포함하고, 3개 이상의 벡터 중 제1 벡터는 적어도 하나의 단일 항원을 포함하고 3개 이상의 벡터 중 제2 벡터는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 측면에서 백신은 복합 백신으로, 백신은 적어도 2개의 항원을 각각 포함하는 3개 초과의 벡터를 포함한다.
상이한 항원의 혼합물이 동시에 투여되거나 개체에서 동일하거나 상이한 벡터로부터 발현될 때, 이들은 서로 경쟁할 수 있다. 결과적으로 복합 면역요법 또는 백신에서 상이한 농도 및 비율의 발현된 항원을 포함하는 제제는 투여 후 효과적이고 지속되는 면역 반응이 일어나는 것을 보장하기 위해 평가하고 개체 또는 개체 군에 조정되어야 한다.
다수의 항원을 포함하는 조성물은 다양한 비율로 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 벡터를 갖는 제제는 다양한 비율을 가질 수 있다. 예를 들어, 면역요법 또는 백신은 2개의 상이한 벡터를 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1 :7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 2:6, 2:7, 2:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 3:1, 3:3, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 4:1, 4:3, 4:5, 4:6, 4:7, 4:8, 5:1, 5:3, 5:4, 5:6, 5:7, 5:8, 6:1, 6:3, 6:4, 6:5, 6:7, 6:8, 7:1, 7:3, 7:4, 7:5, 7:6, 7:8, 8:1, 8:3, 8:4, 8:5, 8:6, 또는 8:7의 화학량론으로 가질 수 있다. 예를 들어, 면역요법 또는 백신은 3개의 상이한 벡터를 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 2:1:1, 2:3:1, 2:4:1, 2:5:1, 2:6:1, 2:7:1, 2:8:1, 3:1, 3:3:1, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 3:1:1, 3:3:1, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 4:1:1, 4:3:1, 4:4:1, 4:5:1, 4:6:1, 4:7:1, 4:8:1, 5:1:1, 5:3:1, 5:4:1, 5:5:1, 5:6:1, 5:7:1, 5:8:1, 6:1:1, 6:3:1, 6:4:1, 6:5:1, 6:6:1, 6:7:1, 6:8:1, 7:1:1, 7:3:1, 7:4:1, 7:5:1, 7:6:1, 7:7:1, 7:8:1, 8:1:1, 8:3:1, 8:4:1, 8:5:1, 8:6:1, 8:7:1, 8:8:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 2:1:2, 2:3:2, 2:4:2, 2:5:2, 2:6:2, 2:7:2, 2:8:2, 3:1:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 3:1:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 4:1:2, 4:3:2, 4:4:2, 4:5:2, 4:6:2, 4:7:2, 4:8:2, 5:1:2, 5:3:2, 5:4:2, 5:5:2, 5:6:2, 5:7:2, 5:8:2, 6:1:2, 6:3:2, 6:4:2, 6:5:2, 6:6:2, 6:7:2, 6:8:2, 7:1:2, 7:3:2, 7:4:2, 7:5:2, 7:6:2, 7:7:2, 7:8:2, 8:1:2, 8:3:2, 8:4:2, 8:5:2, 8:6:2, 8:7:2, 8:8:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:7:3, 1:8:3, 2:1:3, 2:3:3, 2:4:3, 2:5:3, 2:6:3, 2:7:3, 2:8:3, 3:1:3, 3:3:3, 3:4:3, 3:5:3, 3:6:3, 3:7:3, 3:8:3, 3:1:3, 3:3:3, 3:4:3, 3:5:3, 3:6:3, 3:7:3, 3:8:3, 4:1:3, 4:3:3, 4:4:3, 4:5:3, 4:6:3, 4:7:3, 4:8:3, 5:1:3, 5:3:3, 5:4:3, 5:5:3, 5:6:3, 5:7:3, 5:8:3, 6:1:3, 6:3:3, 6:4:3, 6:5:3, 6:6:3, 6:7:3, 6:8:3, 7:1:3, 7:3:3, 7:4:3, 7:5:3, 7:6:3, 7:7:3, 7:8:3, 8:1:3, 8:3:3, 8:4:3, 8:5:3, 8:6:3, 8:7:3, 8:8:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 2:1:4, 2:3:4, 2:4:4, 2:5:4, 2:6:4, 2:7:4, 2:8:4, 3:1:4, 3:3:4, 3:4:4, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 3:1:4, 3:3:4, 3:4:4, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 4:1:4, 4:3:4, 4:4:4, 4:5:4, 4:6:4, 4:7:4, 4:8:4, 5:1:4, 5:3:4, 5:4:4, 5:5:4, 5:6:4, 5:7:4, 5:8:4, 6:1:4, 6:3:4, 6:4:4, 6:5:4, 6:6:4, 6:7:4, 6:8:4, 7:1:4, 7:3:4, 7:4:4, 7:5:4, 7:6:4, 7:7:4, 7:8:4, 8:1:4, 8:3:4, 8:4:3, 8:5:4, 8:6:4, 8:7:4, 8:8:4, 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 2:1:5, 2:3:5, 2:4:5, 2:5:5, 2:6:5, 2:7:5, 2:8:5, 3:1:5, 3:3:5, 3:4:5, 3:5:5, 3:6:5, 3:7:5, 3:8:5, 3:1:5, 3:3:5, 3:4:5, 3:5:5, 3:6:5, 3:7:5, 3:8:5, 4:1:5, 4:3:5, 4:4:5, 4:5:5, 4:6:5, 4:7:5, 4:8:5, 5:1:5, 5:3:5, 5:4:5, 5:5:5, 5:6:5, 5:7:5, 5:8:5, 6:1:5, 6:3:5, 6:4:5, 6:5:5, 6:6:5, 6:7:5, 6:8:5, 7:1:5, 7:3:5, 7:4:5, 7:5:5, 7:6:5, 7:7:5, 7:8:5, 8:1:5, 8:3:5, 8:4:5, 8:5:5, 8:6:5, 8:7:5, 8:8:5, 1:1:6, 1:2:6, 1:3:6, 1:4:6, 1:5:6, 1:6:6, 1:7:6, 1:8:6, 2:1:6, 2:3:6, 2:4:6, 2:5:6, 2:6:6, 2:7:6, 2:8:6, 3:1:6, 3:3:6, 3:4:6, 3:5:6, 3:6:6, 3:7:6, 3:8:6, 3:1:6, 3:3:6, 3:4:6, 3:5:6, 3:6:6, 3:7:6, 3:8:6, 4:1:6, 4:3:6, 4:4:6, 4:5:6, 4:6:6, 4:7:6, 4:8:6, 5:1:6, 5:3:6, 5:4:6, 5:5:6, 5:6:6, 5:7:6, 5:8:6, 6:1:6, 6:3:6, 6:4:6, 6:5:6, 6:6:6, 6:7:6, 6:8:6, 7:1:6, 7:3:6, 7:4:6, 7:5:6, 7:6:6, 7:7:6, 7:8:6, 8:1:6, 8:3:6, 8:4:6, 8:5:6, 8:6:5, 8:7:6, 8:8:6, 1:1:7, 1:2:7, 1:3:7, 1:4:7, 1:5:7, 1:6:7, 1:7:7, 1:8:7, 2:1:7, 2:3:7, 2:4:7, 2:5:7, 2:6:7, 2:7:7, 2:8:7, 3:1:7, 3:3:7, 3:4:7, 3:5:7, 3:6:7, 3:7:7, 3:8:7, 3:1:7, 3:3:7, 3:4:7, 3:5:7, 3:6:7, 3:7:7, 3:8:7, 4:1:7, 4:3:7, 4:4:7, 4:5:7, 4:6:7, 4:7:7, 4:8:7, 5:1:7, 5:3:7, 5:4:7, 5:5:7, 5:6:7, 5:7:7, 5:8:7, 6:1:7, 6:3:7, 6:4:7, 6:5:7, 6:6:7, 6:7:7, 6:8:7, 7:1:7, 7:3:7, 7:4:7, 7:5:7, 7:6:7, 7:7:7, 7:8:7, 8:1:7, 8:3:7, 8:4:7, 8:5:7, 8:6:5, 8:7:7, 또는 8:8:7의 화학량론으로 가질 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시는 TAA에 대한 다중 표적화 면역치료제를 포함하는 복합 면역요법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시는 IDAA에 대한 다중 표적화 면역치료제를 포함하는 복합 면역요법을 제공한다.
본 개시는 변형된 CEA, MUC1c, 및/또는 브라큐리를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2, 적어도 3, 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원을 포함하는 복합 면역요법 또는 백신을 제공한다. 예를 들어, 복합 면역요법 또는 백신은 변형된 CEA, MUC1c, 및/또는 브라큐리를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2, 적어도 3, 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원을 포함할 수 있으며, 여기서, 변형된 CEA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고; 변형된 MUC1c는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고; 변형된 브라큐리는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CEA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고 위치 610에서 Asn->Asp 치환을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시는 TAA에 대한 다중 표적화 면역치료제 및 면역 억제 경로의 적어도 하나의 면역 관문 단백질을 표적화하는 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 포함하는 복합 면역요법을 제공한다. 일부 측면에서 본 개시는 IDAA에 대한 다중 표적화 면역치료제 및 면역 억제 경로의 적어도 하나의 면역 관문 단백질을 표적화하는 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 분자 조성물을 포함하는 복합 면역요법을 제공한다. 본 개시는 변형된 CEA, MUC1c, 및/또는 브라큐리를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2, 적어도 3, 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원, 및 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 적어도 하나의 분자 조성물을 포함하는 복합 면역요법 또는 백신을 제공한다. 예를 들어, 복합 면역요법 또는 백신은 변형된 CEA, MUC1c, 및/또는 브라큐리를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 2, 적어도 3, 또는 3개 초과의 상이한 표적 항원을 포함할 수 있으며, 여기서 변형된 CEA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고; 변형된 MUC1c는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고; 변형된 브라큐리는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%, 99.5%, 99.9%의 동일성 값을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CEA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%의 동일성 값을 갖는 서열을 포함하고 위치 610에서 Asn->Asp 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 CTLA4를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PDL1을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 LAG3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 B7-H3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 B7-H4를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 TIM3을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 경로 관문 조절 인자는 PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TCR, LAG3, CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3(즉, HAVcr2), GAL9, 및 A2aR에 대한 단클론 또는 다클론 항체이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산 벡터 중 적어도 하나는 제1 동일성 값을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 5 벡터를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 내 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1 영역 내 결실을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 100%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 99%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 100%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서, 제1 동일성 값은 100%이다.
일부 실시양태에서, 재조합 핵산 벡터 중 적어도 하나는 서열 번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 벡터는 서열 번호 3 내 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하며, 상기 영역은 26048-26177, 26063-26141, 1-103, 54-103, 32214-32315, 및 32214-32262로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 벡터는 서열 번호 3 내 1057 내지 3165의 영역에 의해 코딩되는 펩티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 코딩하는 영역을 더 포함한다.
면역학적 융합 파트너 항원 표적
본 발명의 바이러스 벡터는 또한 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 단백질을 포함하는 바이러스 벡터로 면역화 후 생산되는 단백질은 관심의 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질에 융합된 관심의 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종, 예를 들어 마이코박테리움 튜버큘로시스 유래 Ra12 단편으로부터 유래한다. 이종의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 향상시키는데에 Ra12 조성물 및 이들의 사용 방법은 미국 특허 출원 제60/158,585호 및 미국 특허 제7,009,042호에 기재되어 있으며, 이들은 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다. 간략하게, Ra12는 마이코박테리움 튜버큘로시스 MTB32A 핵산의 부분 서열인 폴리뉴클레오티드 영역을 언급한다. MTB32A는 엠. 튜버큘로시스의 독성 및 비독성 균주 내 유전자에 의해 코딩되는 32 kDa의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 개시되었다(예를 들어, 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된 미국 특허 출원 제60/158,585호; 문헌(Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999))을 참조한다). MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 고수준을 발현되어 정제 과정을 통해 가용성 폴리펩티드로 남는다. 게다가, Ra12는 그가 융합되는 이종의 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 상승시킬 수 있다. 한 Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14 kDa의 C-말단 단편을 포함한다. 다른 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 Ra12 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 적어도 약 15, 30, 60, 100, 200, 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 천연 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 비해 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 변이체는 천연 Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 80%, 또는 90% 이상의 동일성 가질 수 있다.
면역학적 융합 파트너는 그람 음성 세균 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 D 유도체는 단백질의 대략 처음 1/3(예를 들어, 처음 N-말단 100-110 아미노산)을 포함한다. 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 지질 단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 N-말단에 포함되어 추가의 외인성 T 세포 에피토프를 가진 폴리펩티드를 제공하여 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킬 수 있고 발현 인핸서로서 기능을 할 수 있다. 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 항원의 최적의 제시를 보장할 수 있다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질, NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 전형적으로, T-도움 에피토프를 포함하는 상이한 단편이 사용될 수 있지만 N-말단 81개 아미노산이 사용된다.
면역학적 융합 파트너는 LYTA로 공지된 단백질, 또는 이의 일부분(바람직하게는 C-말단 부분)일 수 있다. LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니에로부터 유래하며, 아미다아제 LYTA(LytA 유전자에 의해 코딩됨)로 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성한다. LYTA는 펩티도글리칸 골격에 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자기용균효소이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화도를 책임진다. 이 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA를 발현하는 플라스미드의 개발에 이용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 포함하는 혼성 단백질의 정제가 이용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, LYTA의 반복 부분이 융합 폴리펩티드에 편입될 수 있다. 반복 부분은, 예를 들어, 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 확인될 수 있다. 한 특정 반복 부분은 잔기 188-305를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 하나 이상의 면역원성 구성요소를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13을 코딩하는 핵산, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13과 실질적인 동일성을 갖는 단백질, 및 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 구성요소에 융합되거나 연결된다. 일부 실시양태에서, 항원 표적은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 면역원성 구성요소를 가진 세포에서 동시 발현된다.
면역 경로 관문 조절 인자
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 면역 관문 조절 인자와 함께 투여된다. 활성화 및 억제 신호 사이의 균형은 T 림프구와 질환 세포 사이의 상호작용을 조절하고, 여기서 T 세포 반응은 T 세포 수용체(TCR)에 의한 항원 인식을 통해 개시된다. 억제 경로 및 신호는 면역 관문으로 언급된다. 정상적인 환경에서, 면역 관문은 자가 면역의 조절 및 방지에 중요한 역할을 하고 또한 병원성 감염에 반응하여 조직 손상으로부터 보호한다.
본 개시는 암 및 감염증의 치료를 위해 면역 관문 억제 경로를 조절하기 위한 바이러스 벡터 기반 백신 및 조성물을 포함하는 복합 면역요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소이다. 일부 실시양태에서, 조절은 유전자 또는 단백질의 패밀리에 영향을 준다.
일반적으로, 면역 억제 경로는 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시된다. 현재, 질환에서 질환이 피험체에서 면역 내성을 유도하기 위한 기전으로서 면역 관문 경로를 끌어들일 수 있다는 것은 명백하다.
주어진 질환에 의해 피험체에서 면역 내성 또는 면역 억제 경로의 유도는 하나 이상의 면역 억제 경로를 조절하는 것으로 알려진 siRNA, 안티센스, 소분자, 모방체, 리간드 또는 수용체 또는 단백질의 재조합 형태, 또는 항체(Ig 융합 단백질일 수 있음)와 같은 분자 조성물에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, 면역 관문 단백질, 예를 들어 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA4) 및 세포 예정사 단백질 1(PD1)의 차단제를 이용한 예비 임상 소견은 항종양 면역을 향상시키기 위한 가능성을 보였다.
질환 세포는 다수의 억제 리간드를 발현할 수 있고, 질환 침윤 림프구는 다수의 억제 수용체를 발현할 수 있기 때문에, 면역 관문 단백질의 이중 또는 삼중 차단은 항-질환 면역을 향상시킬 수 있다. 본원에서 제공된 복합 면역요법은 하기 면역 관문 단백질 중 하나 이상의 분자 조성물을 포함할 수 있다: PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3(CD276으로도 공지됨), B7-H4(B7-S1, B7x 및 VCTN1로도 공지됨), BTLA(CD272로도 공지됨), HVEM, KIR, TCR, LAG3(CD223으로도 공지됨), CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3(HAVcr2로도 공지됨), GAL9, 및 A2aR. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 siRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 소분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 리간드의 재조합 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 수용체의 재조합 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 조성물은 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 요법은 하나 이상의 분자 조성물 및/또는 하나 이상의 유형의 분자 조성물을 포함한다. 당 업자들이 이해하듯이, 면역 관문 억제 경로의 앞으로 발견되는 단백질이 또한 본 개시에 의해 포함될 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 CTLA4의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 PD1의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 PDL1의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 LAG3의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 B7-H3의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 B7-H4의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합 면역요법은 TIM3의 조절을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절은 발현의 증가 또는 상승이다. 다른 실시양태에서, 조절은 발현의 감소 또는 부재이다.
2가지 대표적인 면역 관문 억제제는 세포독성 T 림프구 관련 항원-4(CTLA-4) 및 세포 예정사 단백질-1(PD1)을 포함한다. CTLA-4는 이들이 T 세포 활성화의 초기 단계를 조절하는 T 세포에서 독점적으로 발현될 수 있다. CTLA-4는 결과적으로 T 세포 활성을 억제하는 신호전달을 일으킬 수 있는 공동 자극 T 세포 수용체 CD28과 상호작용한다. 일단 TCR 항원 인식이 일어나면, CD28 신호전달은 TCR 신호전달을 상승시킬 수 있고, 일부 경우에, 활성화된 T 세포 및 CTLA-4의 유발은 CD28의 신호전달 활성을 억제한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 항-CTLA-4 단클론 항체와 병용하여 본원에서 제공된 면역요법을 제공한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 CTLA-4 분자 조성물과 병용하여 본원에 제공된 면역요법을 제공한다.
세포 예정사 단백질 리간드-1(PDL1)은 B7 패밀리의 일원이고 다양한 조직 및 세포 유형에 분포된다. PDL1은 T 세포 활성화 및 CTL 매개된 용해를 억제하는 PD1과 상호작용할 수 있다. PDL1의 상당한 발현이 다양한 인간 종양에서 증명되었으며 PDL1 발현은 종양이 숙주 항종양 면역 반응을 회피하는 중요한 기전 중 하나이다. 세포 예정사 리간드 1(PDL1) 및 세포 예정사 단백질-1(PD1)은 면역 관문으로서 상호작용한다. 이 상호작용은 결과적으로 항-종양 면역 반응 및 후속 종양 진행을 약화시키는 주요 내성 기전일 수 있다. PD1은 활성화된 T 세포에 존재하고, PD1의 주요 리간드인 PDL1은 대개 종양 세포 및 항원 제시 세포(APC)뿐 아니라 B 세포를 포함한 다른 세포 상에서 발현된다. PDL1의 상당한 발현이 HPV-관련 두경부암을 포함한 여러 인간 종양에서 증명되었다. PDL1은 T 세포 활성화 및 세포독성 T 림프구(CTL) 매개된 용해를 억제하는 T 세포 상 PD1과 상호작용한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 항-PD1 또는 항-PDL1 단클론과 병용하여 본원에서 제공된 면역요법을 제공한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 PD1 또는 항-PDL1 분자 조성물과 병용하여 본원에서 제공된 면역요법을 제공한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 항-CTLA-4 및 항-PD1 단클론 항체와 병용하여 본원에 제공된 면역요법을 제공한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 항-CTLA-4 및 PDL1 단클론 항체와 병용하여 본원에 제공된 면역요법을 제공한다. 본 개시는 증식성 질환 및 암의 치료를 위해 항-CTLA-4, 항-PD1, PDL1 단클론 항체, 또는 이들의 조합과 병용하여 본원에 제공된 면역요법을 제공한다.
항-종양 효과를 증가시킬 수 있는 PD1 차단과 병용되는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역화를 본원에서 제공한다. 본 발명자들은 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신에 의해 유도된 CMI 반응을 특성화하고 작게 확립된 종양 vs 크게 확립된 종양의 치료 가능성을 평가하기 위해 항종양 반응의 속도론을 밝힌다.
면역 관문 분자는 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 면역 관문 분자는 면역 반응을 하향 조절하거나 억제하는 "브레이크"로서 효과적으로 역할을 할 수 있다. 면역 관문 분자는 면역 세포를 직접 억제하는 세포 예정사 1(PD1, PDCD1 또는 CD279로도 공지됨, 허가번호: NM_005018), 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨, 젠뱅크(GenBank) 허가번호 AF414120.1), LAG3(CD223으로도 공지됨, 허가번호: NM_002286.5), Tim3(HAVCR2로도 공지됨, 젠뱅크 허가번호: JX049979.1), BTLA(CD272로도 공지됨, 허가번호: NM_181780.3), BY55(CD160으로도 공지됨, 젠뱅크 허가번호: CR541888.1), TIGIT(IVSTM3으로도 공지됨, 허가번호: NM_173799), LAIR1(CD305로도 공지됨, 젠뱅크 허가번호: CR542051.1), SIGLECIO(젠뱅크 허가번호: AY358337.1), 2B4(CD244로도 공지됨, 허가번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIFl, ILIORA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, PD1은 본 발명의 아데노바이러스 백신과 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 병용될 수 있다. 표 1은, 총 망라한 것을 아니지만, 본 발명의 아데노바이러스 백신의 효율을 개선하도록 불활성화될 수 있는 대표적인 면역 관문 유전자를 나타낸다. 면역 관문 유전자는 표 1에 열거된 이 같은 유전자 및 공동 억제 수용체 기능, 세포 사멸, 사이토카인 신호전달, 아르기닌 트립토판 고갈, TCR 신호전달, 유도된 T-reg 억제, 전사 인자 조절 기능소실(exhaustion) 또는 무반응(anergy), 및 저산소증 매개된 내성과 관련된 다른 것으로부터 선택될 수 있다.
[표 1]
아데노바이러스 기반 백신 및 면역 경로 관문 조절 인자의 병용은 결과적으로 어느 하나의 제제 단독과 비교하여 치료받은 환자에서 암의 재발을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 백신 및 면역 경로 관문 조절 인자의 병용은 결과적으로 어느 하나의 제제 단독과 비교하여 치료받은 환자에서 전이 또는 미세 전이의 존재 또는 출연을 감소시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아데노바이러스 기반 백신 및 면역 경로 관문 조절 인자의 병용은 결과적으로 어느 하나의 제제 단독과 비교하여 치료받은 환자의 전체 생존을 개선할 수 있다. 일부 경우에, 아데노바이러스 기반 백신 및 면역 경로 관문 조절 인자의 병용은 어느 하나의 제제 단독과 비교하여 환자에서 종양 특이적 T 세포 반응의 빈도 또는 세가를 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 아데노바이러스 벡터 기반 백신의 성능을 개선하기 위한 면역 관문 억제의 용도를 개시한다. 면역 관문 억제는 백신 투여시 투여될 수 있다. 면역 관문 억제는 또한 백신 투여 후에 투여될 수 있다. 면역 관문 억제는 아데노바이러스 백신 투여와 동시에 일어날 수 있다. 면역 관문 억제는 백신접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60분에 일어날 수 있다. 면역 관문 억제는 또한 백신 접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간에 일어날 수 있다. 일부 경우에, 면역 억제는 백신 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 일어날 수 있다. 면역 관문 억제는 백신 투여 전 또는 후에 어느 때에든 일어날 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원 및 면역 경로 관문 조절 인자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 면역 관문, 예를 들어 PD1, 및 피험체의 세포에 이의 천연 결합 파트너(들)의 하향 조절이 유익한 병태를 가진 피험체를 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다.
면역 경로 관문 조절 인자는 임의의 항원을 포함하는 아데노바이러스 백신과 병용될 수 있다. 예를 들어, 항원은 MUC1c, HER3, 브라큐리, HER2NEU, CEA, 또는 PSA일 수 있다. 면역 경로 관문 조절 인자는 백신과 병용될 때 상승효과를 가져올 수 있다. 면역 경로 관문 조절 인자는 또한 백신과 병용될 때 상가효과를 보일 수 있다.
제제
본 발명은 임의의 경로에 의해 단독 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 투여될 수 있는 백신접종 레지멘을 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 상기 투여는 단일 및 다중 투여량으로 수행될 수 있다. 더 구체적으로, 약학 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 여러 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 상기 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 여러 비독성 유기 용매 등을 포함한다. 게다가, 이러한 경구 약학 제제는 상기 목적에 통상적으로 이용되는 여러 제제에 의해 적합하게 단맛이 더해지고/거나 향미가 더해질 수 있다. 지금까지 기재된 조성물은 약제로 제제화되어 질환, 예를 들어 암으로 진단받은, 치료를 필요로 하는 인간 또는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다.
투여를 위해, 바이러스 벡터 저장액은 적합한 완충액, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 등과 조합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적합한 개수의 바이러스 벡터 입자(VP)는 적합한 완충액, 예를 들어 멸균 PBS 또는 식염수 중에 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 개시된 특정 실시양태의 바이러스 벡터 조성물은 피하, 비경구, 정맥 내, 근육 내, 또는 복강 내 투여를 위한 특정 제제로 제공된다. 특정 실시양태에서, 유리 염기 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액 내 제제는 계면활성제, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스와 적합한 혼합된 물에 제조될 수 있다. 또한, 분산액이 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 스쿠알렌 기반 에멀젼, 스쿠알렌 기반 수중유 에멀전, 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 비수성 에멀젼, 파라핀유중수 에멀젼, 및 이들의 혼합물 중에, 그리고 오일 중에 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 연하 또는 좌약에 의한 환제 형태 투여를 위한 특정 제제로 제공될 수 있다.
주사 가능한 용도에 적합한 예시적인 약제 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,466,468호를 참조한다). 용이한 주사능이 존재하는 정도까지의 유체 형태가 바람직할 수 있다. 제조 및 저장 조건하에서 안정한 형태는 본 발명의 범위 내에 있다. 여러 실시양태에서, 형태는 미생물, 예를 들어 세균, 곰팡이 및 진균의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액일 경우 요구되는 입자의 크기의 유지에 의해, 그리고/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 여러 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 및 티머로살에 의해 가능해질 수 있다. 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 지속되는 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용하여 유발할 수 있다.
한 실시양태에서, 수용액으로 비경구 투여 경우, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충될 수 있고 액체 희석제가 충분한 염류 또는 글루코오스로 우선 등장으로 만들어질 수 있다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시를 고려하여 당 업자에게 잘 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1mL의 NaCl 등장액에 용해되고 1000 mL의 대량 피하주사액에 첨가되거나 주입이 제안된 부위에서 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition), 페이지 1035-1038 및 1570-1580을 참조한다). 치료받는 피험체의 병태에 따라 투여량에 약간의 변화가 일어날 수 있다.
제제의 담체는 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함할 수 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 부적합하지만 않는다면, 치료 조성물에서 이의 사용을 고려한다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 하나 이상의 면역자극제, 예를 들어 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 면역자극제는 본질적으로 항원에 대해 면역 반응(항체 및/또는 세포 매개)을 상승시키거나 강화하는 임의의 물질을 언급한다. 면역자극제의 하나의 유형은 애주번트를 포함한다. 많은 애주번트는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 설계된 물질, 예를 들어 수산화알루미늄 또는 광물유, 및 면역 반응의 자극제, 예를 들어 지질 A, 보르데텔라 페르투씨스 또는 마이코박테리움 튜버큘로시스에서 유래한 단백질을 포함한다. 특정 애주번트, 예를 들어 프로인트(Freund) 불완전 애주번트 및 완전 애주번트(Difco Laboratories); 머크(Merck) 애주번트 65(Merck and Company, Inc.) AS-2(SmithKline Beecham); 알루미늄 염 예를 들어 수산화알루미늄 겔(명반) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온 또는 음이온으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(Quil) A로서 구입 가능하다. 사이토카인, 예를 들어 GM-CSF, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및/또는 IL-13, 및 성장 인자와 같은 기타가 또한 애주번트로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 애주번트 조성물은 주로 Th1 형의 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다. 고수준의 Th1-형 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)는 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 유리하게 하는 경향을 보인다. 대조적으로, 고수준의 Th2-형 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 유리하게 하는 경향을 보인다. 본원에서 제공된 백신의 적용 후, 환자는 Th1- 및/또는 Th2-형 반응을 포함하는 면역 반응을 지원할 수 있다. 반응이 주로 Th1-형인 특정 실시양태에서, Th1-형 사이토카인의 수준은 Th2-형 사이토카인의 수준보다 훨씬 높은 정도까지 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 분석법을 이용하여 쉽게 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 여러 실시양태는 복제 결함 바이러스 벡터 치료와 동시에 제공되는 사이토카인, 예를 들어. IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및/또는 IL-13을 이용하여 표적 항원, 예를 들어 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA에 대해 면역 반응을 상승시키는 요법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인을 코딩하는 핵산은 본원에 기재된 복제 결합 바이러스와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 투여는 바이러스 벡터 투여 전 또는 후에 실시된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원, 예를 들어 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 및/또는 CEA에 대해 면역 반응을 상승시킬 수 있는 복제 결함 바이러스 벡터는 사이토카인을 코딩하는 서열을 더 포함한다.
주로 Th1-형 반응을 유발하기 위한 특정 예시적인 애주번트는 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 예를 들어 3-de-O-아실화 모노포스포릴 지질의 알루미늄 염과 의 조합을 포함한다. MPL® 애주번트가 시판되고 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조). CpG-함유 올리고뉴클레오티드(CpG 디뉴클레오티드가 비메틸화된)는 또한 주로 Th1 반응을 유도한다(예를 들어, WO 96/02555호, WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호 참조). 또한, 면역자극성 DNA 서열이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 또 다른 애주번트는 사포닌, 예를 들어 퀼 A, 또는 QS21 및 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)를 포함한 이의 유도체, 에쉰(Escin); 디기토닌(Digitonin); 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 체노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 기타 제제는 본 발명의 애주번트 조합물 내에 하나 이상의 사포닌, 예를 들어, QS21, QS7, 퀼 A, β-에쉰, 또는 디기토닌을 포함하는 군 중 적어도 두 가지의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 비강 내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 내 미세입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 이용한 약물의 전달이 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,725,871호 참조). 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태의 예시적인 경점막 약물 전달이 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,780,045호 참조).
리포솜, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포 등이 본 발명의 조성물의 적합한 숙주 세포/생물체 내로의 도입에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노스피어, 또는 나노입자 등에 캡슐화된 전달용으로 제제화될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 리포솜은 유전자, 여러 약물, 방사선치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 이펙터 등을 다양한 배양 세포주 및 동물에 효과적으로 도입하는데 이용될 수 있다. 게다가, 리포솜의 사용은 전신 전달 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 관련되지 않은 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 수성 매질 내에 분산된 인지질로부터 형성되고 자발적으로 다층판 동심의 이중 층 소포(즉, 다층판 소포(MLV))를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 약학적으로 허용 가능한 나노캡슐 제제를 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생산 가능한 방법으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포 내 중합체의 과잉으로 인한 부작용을 피하기 위해서, 이러한 초미세 입자(대략 0.1 μm 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계될 수 있다.
지금까지 기재된 조성물은 화학치료제(예를 들어, 암 치료에 유용한 화학 화합물)을 포함하거나 함께 투여될 수 있다. 개시된 T 세포와 병용하여 사용될 수 있는 암 화학치료제는 체세포 분열 억제제(빈카 알칼로이드), 예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈(Navelbine)™(비노렐빈,5'-노르안히드로블라스틴); 토포이소머라아제 I 억제제, 예를 들어 캄토테신 화합물(예를 들어, 캄토사르(Camptosar)™(이리노테칸 HCL), 히토캄틴(Hycamtin)™(토포테칸 HCL) 및 캄토테신으로부터 유도된 기타 화합물 및 이의 유사체); 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포시드, 테니포시드 및 미토포도지드; 알킬화제 예를 들어 시스플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진; 항대사물질 예를 들어 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프림, 및 프로카바진; 항생제, 예를 들어 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신; 항-종양 항체; 다카바진; 아자시티딘; 암사크린; 멜팔란; 이포스파미드; 및 미톡산트론을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 개시된 조성물은 세포독성제/항신생물제 및 항혈관형성제를 포함한 기타 항종양제와 병용하여 투여될 수 있다. 세포독성/항신생물제는 암세포를 공격하고 사멸시키는 제제로서 정의될 수 있다. 일부 세포독성/항신생물제는 종양 세포 내 유전 물질을 알킬화하는 알킬화제, 예를 들어, 시스-플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진일 수 있다. 기타 세포독성/항신생물제는 종양 세포의 항대사물질, 예를 들어, 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프림, 및 프로카바진일 수 있다. 기타 세포독성/항신생물제는 항생제, 예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대해 시판되는 여러 가지 리포솜 제제가 존재한다. 또 다른 세포독성/항신생물제는 체세포 분열 억제제(빈카 알칼로이드)일 수 있다. 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드를 포함한다. 여러 가지 종류의 세포독성/항신생물제는 택솔 및 이의 유도체, L-아스파라기나아제, 항-종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미톡산트론, 및 빈데신을 포함한다.
또한, 항혈관형성제가 사용될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 항혈관형성제는 인간화 및 키메라 항체, 항-VEGF 앱타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한 항-VEGF 항체를 포함한다. 혈관형성의 다른 억제제는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1(α 및 β를 포함), 인터류킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테이나아제-1 및 -2의 조직 억제제(TIMP-1 및 -2)를 포함한다. 토포이소머라아제, 예를 들어 항혈관형성 활성을 가진 토포이소머라아제 II 억제제인 라족산을 포함한 소분자가 또한 사용될 수 있다.
개시된 발명과 병용하여 사용될 수 있는 기타 항암제는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 히드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나아제; 아스펄린; 아바스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비산트렌 히드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나 소듐; 브로피리민; 부설판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카베티머; 카보플라틴; 카무스틴; 카루비신 히드로클로라이드; 카젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 히드로클로라이드; 데시타빈; 독소마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로니틴 히드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 히드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 히드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 히드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 젬시타빈 히드로클로라이드; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II, 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-I a; 인터페론 감마-I b; 이프로플라틴; 이리노테칸 히드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 히드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 히드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 히드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 히드로클로라이드; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카바진 히드로클로라이드; 퓨로마이신; 퓨로마이신 히드로클로라이드; 피라조퓨린; 리보프린; 로글레티미드; 사핑골; 사핑골 히드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 히드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 히드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈레루로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 히드로클로라이드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기타 항암제는 20-에피-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-등쪽화 형태형성 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네온플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아포프토시스 유전자 조절인자; 아포프토시스 조절인자; 아푸린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 디아미나아제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클래마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비사지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카복사미드-아미노-트리아졸; 카복시아미도트리아졸; 카레스트(CaRest) M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카젤레신; 카제인 키나아제 억제제(ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나제닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜탄트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥토스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 디히드로디뎀닌 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로택솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 듀오카마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 히드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나아제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세타미드; 하이퍼리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩티드; 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 작용제; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로프락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당류 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 용해 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 매트리리신 억제제; 기질 메탈로프로테이나아제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나아제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매치 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유모세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론 항체, 인간 융모 생식선 자극 호르몬; 모노포스포릴 지질 A+마이코박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 서프레서 1-기반 요법; 머스타드 항암제; 마이카페록시드 B; 마이코박테리움 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다아제; 닐루타미드; 니사마이신; 일산화질소 조절인자; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토카인 유도물질; 오마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤리프틴; 페가스파가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타아제 억제제; 피시바닐; 필로카핀 히드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화인자 억제제; 백금 착체; 백금 화합물; 백금-트리아민 착체; 포피머 소듐; 포피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 억제제; 단백질 A-기반 면역 조절인자; 단백질 키나아제 C 억제제; 단백질 키나아제 C 억제제, 미세조류; 단백질 티로신 포스파타아제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파네실 단백질 트랜스퍼라아제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 레텔리프틴 탈메틸화; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로머티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핑골; 사인토핀; SarCNU; 사코피톨 A; 사그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 노화 유래 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호전달 억제제; 신호전달 조절인자; 단쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소너민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기세포 억제제; 줄기세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 설피노신; 과활성 혈관작용 장 펩티드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오디드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라아제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 비클로라이드; 토프센틴; 토레미펜; 다기능 줄기세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나아제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 비뇨생식동 유래 성장 억제 인자; 유로키나아제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레졸; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코브; 및 지노스타틴 스티말라머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 항암제는 5-플루오로우라실, 택솔, 또는 류코보린이다.
방법
본 발명의 조성물 및 방법은, 여러 실시양태에서, 인간 세포용해성 T-세포(CTL), 예를 들어 선택된 MHC 분자, 예를 들어. HLA- A2, A3, 및 A24에 결합하는 MUC1, T, 또는 CEA 에피토프를 인식하는 것들을 이용한다. MHC 분자의 특정 혈청형, 예를 들어 HLA-A2, A3 및 A24를 발현하는 개체는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 요법에 선택될 수 있다. 예를 들어, MHC 분자의 특정 혈청형, 예를 들어. HLA- A2, A3, 및 A24를 발현하는 개체는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 이용하여, MUC1, T, 또는 CEA에 대한 면역 반응을 상승시키는 단계를 포함하는 요법에 선택될 수 있다.
여러 실시양태에서, 이들 T-세포는 말초 혈액 단핵 세포를 자극하는 관심의 에피토프로 펄스된 항원 제시 세포를 이용하여 시험관 내 배양에 의해 생성될 수 있다. 게다가, T-세포주는 또한 MUC1, T, 또는 CEA 라텍스 비드, MUC1, T, 또는 CEA 단백질-펄스된 플라스틱 부착 말초 혈액 단핵 세포, 또는 MUC1, T, 또는 CEA RNA로 감작된 DC로 자극 후 생성될 수 있다. T-세포는 또한 MUC1, T, 또는 CEA 면역원을 코딩하는 백신 벡터로 면역된 환자로부터 생성될 수 있다. MUC1, T, 또는 CEA로부터 HLA A2-제시된 펩티드는 또한 1차 위장관 종양에서 발견될 수 있다. 여러 실시양태에서, 본 발명은 MUC1, T, 또는 CEA의 HLA A2 제한된 에피토프, CAP-1, 백신-MUC1, T, 또는 CEA로 면역된 암 환자의 CTL을 자극할 수 있는 9개의 아미노산 서열(YLSGANLNL; 서열 번호 4)에 관한 것이다. Cap-1(6D)(YLSGADLNL; 서열 번호 10)은 CAP-1의 펩티드 유사체이다. 이의 서열은 불규칙한(heteroclitic)(비고정 위치) 돌연변이를 포함하여, 결과적으로 Asn에서 Asp로 아미노산 변화를 일으켜, T 세포 수용체에 의한 인식을 향상시킨다. Asn에서 Asp로의 돌연변이는 HLA A2에 펩티드의 결합에 변화를 전혀 주지 않는 것으로 보인다. 비돌연변이 CAP-1 에피토프와 비교하여, Cap-1(6D)은 CTL의 감작을 100 내지 1,000배 향상시킬 수 있다. CTL주는 Cap-1(6D) 펩티드에 시험관 내 감작에 의해 건강한 지원자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 유발될 수 있지만, CAP-1 펩티드에는 유의하게 유발될 수 없다. 이들 세포주는 내인성 CEA를 발현하는 인간 종양 세포를 용해시킬 수 있다. 따라서, CAP-1 또는 CAP-1(6D)을 포함하는 폴리펩티드 서열, 상기 서열을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 범위 내에 있다.
치료 방법
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 본원에 기재된 하나 이상의 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하기 위한 다수의 백신 구조에 사용될 수 있다. 본 발명은 임의의 표적 항원, 예를 들어 본원에서 그 밖의 부분에 기재된 것들에 대해 면역 반응을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 아데노바이러스 벡터는 이들이 Ad에 대한 기존의 면역을 가진 피험체에서 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있고, 이전 세대의 아데노바이러스 벡터를 이용해서는 가능하지 않았던 레지멘인 아데노바이러스 벡터를 이용한 여러 라운드의 면역화를 포함하는 백신접종 레지멘에 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견 때문에 특히 중요하다.
일반적으로, 면역 반응의 생성은 체액성 반응 및/또는 세포 매개 반응의 유도를 포함한다. 관심의 표적 항원에 대해 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 면역 반응의 생성은 면역계의 특정 세포의 활성 및/또는 수의 감소 또는 특정 사이토카인 또는 기타 이펙터 분자의 수준 및/또는 활성의 감소를 수반할 수 있다. 면역 반응(예를 들어, 세포 수, 사이토카인 발현, 세포 활성)에서 변화를 검출하기 위한 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있으며 본 발명의 맥락에서 유용하다. 본 맥락에서 유용한 예시적인 방법은 세포 내 사이토카인 염색법(ICS), ELISpot, 증식 분석법, 크롬 방출 또는 등가의 분석법을 포함한 세포독성 T 세포 분석법, 및 다수의 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 또는 RT-PCR 기반 분석법을 이용한 유전자 발현 분석을 포함한다.
면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여받은 피험체에서 1.5 내지 5배의 표적 항원 특이적 CTL 활성의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여받은 피험체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 표적 특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다.
면역 반응의 생성은 적합한 대조군과 비교하여 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여받은 피험체에서 1.5 내지 5배의 표적 항원 특이적 HTL 활성, 예를 들어 도움 T 세포의 증식의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 표적 특이적 HTL 활성의 증가를 포함한다. 이와 관련하여, HTL 활성은 상기에 기재된 바와 같은 증가, 또는 특정 사이토카인, 예를 들어 인터페론-γ(IFN-γ), 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 기타 사이토카인의 생산의 감소를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 면역 반응의 생성은 Th2 형 반응에서 Th1 형 반응으로 이동, 또는 특정 실시양태에서, Th1 형 반응에서 Th2 형 반응으로 이동을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역 반응의 생성은 주로 Th1 또는 Th2 형 반응의 자극을 포함할 수 있다.
면역 반응의 생성은 적합한 대조군과 비교하여 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 투여받은 피험체에서 1.5 내지 5배의 표적 특이적 항체 생산의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터를 투여받은 피험체에서 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상의 표적 특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
따라서, 본 발명은 관심의 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 개체에게
a) E2b 영역 내 결실을 가지는 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및
b) 표적 항원을 코딩하는 핵산
을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 아데노바이러스 벡터를 개체에게 한 번 이상 재투여하는 단계를 포함함으로써 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 투여된 벡터가 제거된 벡터가 아닌 것인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Ad에 대한 기존의 면역을 갖는 개체에서 관심의 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 개체에게
a) E2b 영역 내 결실을 가지는 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및
b) 표적 항원을 코딩하는 핵산
을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 아데노바이러스 벡터를 개체에게 한 번 이상 재투여하는 단계를 포함함으로써 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
Ad에 대한 기존의 면역과 관련하여, 이는 Ad 항체의 존재에 대해 검사하기 위한 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 항체 기반 분석법을 이용하여 결정될 수 있다. 게다가, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 먼저 개체가 Ad에 대해 면역을 가지는지를 결정하는 단계, 그 후 본원에 기재된 본 발명의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 개체에서 하나 이상의 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 개체에게
E2b 영역 내 결실을 가지는 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및
적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산
을 포함하는 제1 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 개체에게
E2b 영역 내 결실을 가지는 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 및
적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산
을 포함하는 제2 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 제2 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원은 제1 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원과 동일하거나 상이한 것인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
따라서, 본 발명은 동일한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 이용한 다중 면역화 또는 상이한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 이용한 다중 면역화를 고려한다. 각 경우에, 아데노바이러스 벡터는 본원에 그 밖의 부분에 기재된 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 하나의 표적 항원을 코딩하는 E2b 결실된 아데노바이러스를 이용한 다중 면역화, 및 동일한 아데노바이러스 벡터의 여러 번 재투여, 이로써 표적 항원에 대한 면역반응의 유도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제1 아데노바이러스 벡터를 이용한 면역화, 그 후 제1 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 항원과 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제2 아데노바이러스 벡터를 이용한 면역화를 포함한다. 이와 관련하여, 코딩된 표적 항원 중 하나는 상이할 수 있거나, 코딩된 항원 모두는 상이할 수 있거나, 일부는 동일할 수 있고 일부는 상이할 수 있다. 게다가, 특정 실시양태에서, 방법은 제1 아데노바이러스 벡터를 여러 번 투여하는 단계 및 제2 아데노바이러스를 여러 번 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여방법은 제1 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상 투여하는 단계, 및 제2 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상 투여하는 단계를 포함한다. 투여 순서는 제1 아데노바이러스를 한번 또는 여러 번을 계속하여 투여하는 단계, 이어서 제2 아데노바이러스 벡터를 한번 또는 여러 번 계속하여 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터의 투여를 각각 1회 투여, 각각 2회 투여, 각각 3회 투여 등으로 교대로 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터는 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA, 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 포함한다.
숙련자가 쉽게 이해하듯이, 2가지 이상의 아데노바이러스 벡터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 이상의 상이한 아데노바이러스 벡터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 한 번에 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 관심의 다중 표적 항원에 대한 면역 반응은 각각 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 다수의 상이한 아데노바이러스 벡터를 동시에 투여하여 생성될 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 암, 예를 들어 암종 또는 육종(예를 들어, 고형 종양, 림프종 및 백혈병)에 대해 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 암, 예를 들어 신경계암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 신장암, 신세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 고환암, 위암, 다발성 골수종, 간세포암, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 기타 암에 대해 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 임의의 감염증 또는 암의 증상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 치료 방법은 본원에 기재된 감염증 또는 암에 걸리거나 걸릴 위험에 있는 개체에게 아데노바이러스 벡터를 1회 이상 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 감염증 또는 암의 발생의 위험에 있는 개체에서 상기 질환에 대한 백신접종 방법을 제공한다. 위험에 있는 개체는 언젠가 감염원에 노출될 수 있거나 이전에 감염에 노출되었지만 아직 감염 증상을 갖지 않는 개체 또는 암 발생에 대한 유전적 소인을 가지거나 감염원에 특히 민감한 개체일 수 있다. 본원에 기재된 감염증 또는 암에 걸린 개체가 표적 항원을 발현 및/또는 제시하는지를 결정할 수 있으며, 이는 본원에서 요법을 안내하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 예가 표적 항원을 발현 및/또는 제시하는지 확인할 수 있고 계속하여 표적 항원, 이의 변이체, 단편 또는 변이체 단편을 코딩하는 아데노바이러스 벡터가 투여될 수 있다.
본 발명은 표적 항원, 또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편을 코딩하는 핵산의 생체 내 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 용도를 고려한다. 피험체에 주사되면, 핵산 서열은 발현되고 결과적으로 서열에 의해 코딩되는 항원에 대해 면역 반응을 일으킨다. 아데노바이러스 벡터 백신은 본원에 그 밖의 부분에 기재된 면역 반응을 유발하기 위해 선택된 경로 또는 투여 경로에서 효과적인 아데노바이러스 벡터의 양인 "유효량"으로 투여될 수 있다. 유효량은 표적 감염원 또는 암에 대해 숙주의 보호 또는 치료를 가능하게 하는데 효과적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 각 백신 용량 내 벡터 양은 전형적인 백신과 일반적으로 관련된 유의한 부작용 없이 면역, 면역보호 또는 기타 면역치료 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 백신접종되면, 피험체는 백신 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터될 수 있다. 백신접종의 효능의 모니터링은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액 또는 액체 시료를 분석하여 항체 수준을 검출할 수 있다. 다른 실시양태에서, ELISpot 분석을 수행하여 순환하는 혈액 세포 또는 림프계 조직 세포로부터 세포 매개 면역 반응을 검출할 수 있다.
본원에 기재된 치료 조성물의 투여 경로 및 빈도뿐 아니라 투여량은 개체마다, 질환마다 달라질 수 있고, 표준 기술을 이용하여 쉽게 확립될 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물 및 백신은 주사(피 내, 근육 내, 정맥 내 또는 피하)에 의해, 비강 내(예를 들어, 흡인에 의해), 환제 형태(예를 들어, 연하, 질 또는 직장 전달을 위한 좌약)로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1 내지 10회 용량이 52주 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 6회 용량이 1개월 간격으로 투여될 수 있고, 추가의 부스터 백신접종은 그 후 정기적으로 제공될 수 있다. 또 다른 프로토콜이 개별 환자에 적합할 수 있다. 이와 같이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상의 용량이 1년 기간에 걸쳐 또는 이보다 단기간 또는 장기간, 예를 들어 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100주 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주 간격 또는 더 긴 간격으로 투여될 수 있다.
백신은 약 4시간 미만의 기간에 걸쳐, 더 바람직하게는 약 3시간 미만의 기간에 걸쳐 주입될 수 있다. 예를 들어, 처음 25-50 mg은 30분 내에, 바람직하게는 심지어 15분 내에 주입되고 나머지는 다음 2-3시간에 걸쳐 주입될 수 있다. 더 일반적으로, 투여되는 백신 구조물의 투여량은 매 2 또는 3주 1회 투여량으로 적어도 총 3회 투여량으로 반복하여 투여될 수 있다. 또는, 구조물은 4-6주 동안 매주 2회 투여될 수 있다. 투여 일정은 경우에 따라 다른 간격으로 반복될 수 있고 투여량은 용량 및 일정을 적합하게 조정하면서 다양한 비경구 경로를 통해 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 다수의 적절한 치료 방식과 함께(예를 들어, 전에, 동시에, 또는 후에) 환자에게 투여될 수 있다.
적합한 용량은 상기에 기재된 바와 같이 투여될 때, 본원에서 그 밖의 부분에 기재된 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터 양이다. 특정 실시양태에서, 면역 반응은 기저(즉, 비처리된) 수준보다 적어도 10-50% 크다. 특정 실시양태에서, 면역 반응은 기저 수준보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 이상이다. 이러한 반응은 환자에서 표적 항원(들) 항체를 측정함으로써, 또는 환자 종양 또는 시험관 내에서 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 세포 용해성 이펙터 세포의 백신 의존성 생성에 의해, 또는 면역 반응을 모니터하기 위한 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 모니터될 수 있다. 상기 백신은 또한 비백신접종된 환자와 비교하여 백신접종된 환자에서 의심되는 질환의 개선된 임상 결과를 가져오는 면역 반응을 유발할 수 있어야 한다. 일부 실시양태에서, 개선된 임상 결과는 질환의 치료, 질환 증상의 감소, 질환 진행의 변화, 또는 생명 연장을 포함한다.
일반적으로, 적합한 투여량 및 치료 레지멘은 치료 및/또는 예방 이점을 제공하기에 충분한 양의 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 상기 반응은 비치료 환자와 비교하여 치료 환차에서 치료되는 특정 질병에 대해 개선된 임상 결과를 확립함으로써 모니터될 수 있다. 모니터링 테이터는 시간 경과에 따라 평가될 수 있다. 시간 경과에 따른 질환의 진행은 변화될 수 있다. 이러한 임상 결과의 개선은 치료 의사에 의해 쉽게 인식될 것이다. 표적 단백질에 대한 기존의 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 연관성이 있을 수 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 분석법을 이용하여 평가될 수 있으며, 이들은 치료 전후에 환자로부터 얻은 시료를 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 한 가지 장점은, 특히 Ad에 대한 기존의 면역을 가진 개체에서, 동일하거나 상이한 아데노바이러스 벡터로 다중 백신접종을 투여하는 능력이지만, 본 발명의 아데노바이러스 백신은 또한 초회 감작 및 부스트 레지멘의 일부로서 투여될 수 있다. 혼합된 양식의 초회 감작 및 부스터 접종 계획은 결과적으로 상승된 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 플라스미드 백신을 적어도 1회 투여하여, 예정된 간격의 시간을 경과시킨 후, 아데노바이러스 벡터를 투여하여 부스트함으로써, 플라스미드 백신, 예를 들어 관심의 표적 항원을 포함하는 플라스미드 벡터로 피험체를 초회 감작시키는 방법이다. 다중의 초회 감작, 예를 들어, 1-4회가 이용될 수 있지만, 더 많이 사용될 수 있다. 초회 감작과 부스트 사이의 시간 간격은 전형적으로 약 4개월 내지 1년까지 달라질 수 있지만 다른 기간이 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 피험체는 플라스미드 백신으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 초회 감작된 후 아데노바이러스 벡터로 4개월 후에 부스트될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 조성물은 개체에 투여될 수 있다. "개체"는 "피험체" 또는 "환자"와 호환적으로 사용될 수 있다. 개체는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 동물, 예를 들어 비인간 영장류, 설치류, 토끼, 쥐, 생쥐, 말, 당나귀, 염소, 고양이, 개, 소, 돼지, 또는 양일 수 있다. 실시양태에서, 개체는 인간이다. 실시양태에서, 개체는 태아, 배아, 또는 소아이다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 조성물은 생체 외에서 세포에 투여된다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 조성물은 질환 또는 장애의 치료 방법으로서 개체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 개체는 유전질환을 갖는다. 일부 경우에, 개체는 질환, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 질환을 가질 위험에 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 불충분한 양의 단백질 또는 불충분한 활성의 단백질에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험에 있다. 개체가 질환 또는 장애를 가질 "증가된 위험"에 있을 경우, 방법은 방지 또는 예방 치료를 수반한다. 예를 들어, 개체는 질환의 가족력으로 인해 이러한 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험에 있을 수 있다. 전형적으로, 이러한 질환 또는 장애를 가질 증가된 위험에 있는 개체는 예방 치료가 유익하다(예를 들어, 질환 또는 장애의 개시 또는 진행을 예방 또는 지연시킴으로써).
일부 경우에, 피험체는 질환을 갖지 않는다. 일부 경우에, 본 발명의 치료법은 질환 개시 전에 투여된다. 피험체는 미확인된 질환을 가질 수 있다. 피험체는 낮은 질환 부담을 가질 수 있다. 또한, 피험체는 높은 질환 부담을 가질 수 있다. 특정 경우에, 피험체는 채점 등급에 따라 본 발명의 치료법을 투여받을 수 있다. 채점 등급은 글리슨 분류일 수 있다. 글리슨 분류는 상이한 종양 조직이 정상 전립선 조직으로부터 어떻게 유래하는지를 반영한다. 이는 1 내지 5의 등급을 사용한다. 임상의는 암세포의 양상 및 성장을 기초로 하여 암에 번호를 매긴다. 번호가 낮을수록 암세포는 더 정상으로 보이고 등급이 더 낮다. 번호가 높을수록, 암세포는 덜 정상으로 보이고 등급이 더 높다. 특정 경우에, 치료법은 낮은 글리슨 점수를 가진 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 3 이하의 글리슨 점수를 가진 환자는 본 발명의 치료법을 투여받을 수 있다.
본 발명의 여러 실시양태는 선택된 환자 집단에서 하나 이상의 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA 항원에 대해 면역 반응을 상승시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 암종 또는 육종 예를 들어 신경계암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 신장암, 신세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 고환암, 위암, 다발성 골수종, 간세포암, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 암 환자를 표적화할 수 있거나, 기타 암들이 요법을 위해 표적화될 수 있다. 일부 경우에, 표적화된 환자 집단은 결장직장 선암종, 전이성 결장직장암, 진행된 MUC1, MCUC1c, MUC1n, T 또는 CEA 발현 결장직장암, 두경부암, 간암, 유방암, 폐암, 방광암, 또는 췌장암을 가진 개체에 제한될 수 있다. 선택된 암, 예를 들어 결장직장 선암종의 조직학적으로 확인된 진단이 이용될 수 있다. 특정 질환 단계 또는 진행이 선택될 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 전이성, 재발성, III 단계, 또는 IV 단계 암을 가진 환자가 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법에 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 플루오로피리미딘, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 베바시주맙, 세툭시맙, 또는 파니투무맙을 포함하는 요법을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 기타 요법을 받도록 경우에 따라 이를 통해 진행하도록 요구될 수 있다. 일부 경우에, 개체가 상기 요법을 받아들이기를 거부하면 환자는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법에 적격인 풀에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 받는 개체는 적어도, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 21, 또는 24개월의 예상 기대 수명을 가질 것이 요구될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 받은 환자 풀은 나이가 제한될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 50, 60세 이상인 개체가 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법에 적격일 수 있다. 또 다른 예로, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 35, 30, 25, 20세 미만인 개체는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법에 적격일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 받는 환자는 적합한 혈액학적 기능, 예를 들어 마이크로리터당 적어도 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 이상의 WBC 계수, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 g/dL 이상의 헤모글로빈 수준, 마이크로리터당 적어도 50,000; 60,000; 70,000; 75,000; 90,000; 100,000; 110,000; 120,000; 130,000; 140,000; 150,000 이상의 혈소판 계수 중 하나 이상을 갖고; 0.8, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0 이상보다 낮거나 같은 PT-INR 값, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 X ULN 이상보다 낮거나 같은 PTT 값을 갖는 개체에 제한된다. 여러 실시양태에서, 혈액학적 기능 지표 한계는 상이한 성별 및 나이 군, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80 또는 80세 초과에 대해 다르게 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 받는 환자는 적합한 신장 및/또는 간 기능을 가진 개체, 예를 들어 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 이상보다 작거나 같은 혈청 크레아티닌 수준, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 이상의 빌리루빈 수준, 한편 길베르(Gilbert) 증후군 경우 더 높은 한계를 허용하여, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 또는 2.4 이하 mg/dL, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 이상 x 정상의 상한(ULN)보다 낮거나 같은 ALT 및 AST 값 중 하나 이상을 가진 개체에 제한된다. 여러 실시양태에서, 신장 또는 간 기능 지표 한계는 상이한 성별 및 나이 군, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80 또는 80세 초과에 대해 다르게 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법의 후보자인 개체의 K-ras 돌연변이 상태가 결정될 수 있다. 미리 선별된 K-ras 돌연변이 상태를 가진 개체는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법에 적격인 환자 풀에 포함될 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 받는 환자는 동시의 세포독성 화학요법 또는 방사선 요법, 뇌 전이의 이력, 또는 현재 뇌 전이, 자가면역 질환, 예를 들어 염증성 장질환, 전신 홍반 루푸스, 강직성 척추염, 피부경화증, 다발성 경화증, 갑상선 질환 및 백반증에 제한되지 않는 자가면역 질환의 이력, 심각한 병발성의 만성 또는 급성 질병, 예를 들어 심장병(NYHA III 또는 IV형), 또는 간질환, 프로토콜에 따른 가능한 준수에 대한 의학적 또는 심리학적 장애; 비-흑색종 피부암, 자궁경부 상피내암, 제어된 표재성 방광암, 또는 치료된 기타 상피내암 이외의 병발성(또는 최후 5년 내에) 제2 악성 종양; 요로 감염, HIV(예를 들어, ELISA에 의해 결정되고 웨스턴 블롯에 의해 확인됨), 및 만성 간염을 포함한 활성의 급성 또는 만성 감염; 또는 동시 스테로이드 요법(또는 기타 면역억제제, 예를 들어 아자티오프린 또는 시클로스포린 A)을 갖지 않는 개체에 제한된다. 일부 경우에, 임의의 스테로이드 요법(화학요법 또는 대비 증강 연구를 위한 예비투약으로서 사용되는 것은 제외)을 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 중단한 환자는 본 발명의 방법 및 조성을 이용한 요법에 적격인 개체 풀에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 요법을 받는 환자는 갑상선 질환 및 백반증을 갖는 개체를 포함한다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 요법을 위한 개체 또는 후보 개체의 시료, 예를 들어 혈청 또는 소변 시료를 수집할 수 있다. 시료는 요법 전, 중 및/또는 후, 예를 들어 요법 개시 전 2, 4, 6, 8, 10주 내에, 요법 개시로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 또는 12주 내에, 요법 개시 전 2, 4, 6, 8, 10주 내에, 요법 개시로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 내에, 요법 중 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 제9주, 또는 12주 간격으로, 요법 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 간격으로, 요법 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 이상 내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상의 기간 동안 수집될 수 있다. 시료는 본원에 개시된 혈액학적, 신장, 또는 간 기능 지표, 및 당 업계에 알려진 적합한 다른 것들, 예를 들어 가임기 여성일 경우 β-HCG에 대해 검사될 수 있다. 그와 관련하여, 차이가 있는 세포 혈액 계수, PT, INR 및 PTT를 포함한 혈액학적 생화학적 검사; Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아티닌, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타아제, AST, ALT, 및 글루코스 측정 검사가 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, HIV 항체, 간염 BsAg, 또는 간염 C 항체의 존재 또는 양은 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 위한 개체 또는 후보 개체의 시료에서 결정된다. 생물학적 마커, 예를 들어 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA에 대한 항체 또는 Ad5 벡터에 대한 중화 항체는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 위한 개체 또는 후보 개체의 시료, 예를 들어 혈청에서 검사될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 시료, 예를 들어 혈액 시료는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 위한 개체 또는 후보 개체로부터 수집하거나 기록 보관한다. 수집된 시료는 면역학적 평가를 위해 분석될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법을 위한 개체 또는 후보 개체는 영상화 연구로, 예를 들어 가슴, 복부, 또는 골반의 CT 스캔 또는 MRI를 이용하여 평가될 수 있다. 영상화 연구는 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법 전, 중, 또는 후에, 요법 중 및/또는 후에, 예를 들어, 요법 개시 전 2, 4, 6, 8, 10주 내에, 요법 개시로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 또는 12주 내에, 요법 개시 전 2, 4, 6, 8, 10주 내에, 요법 개시로부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 제9주, 또는 12주 내에, 요법 중에 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 간격으로, 용법 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 간격으로, 요법 후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 이상 내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상의 기간 동안 실시될 수 있다.
투여량 및 투여
본 발명의 조성물 및 방법은 요법 과정에서 다양한 투여량 및 투여 레지멘을 고려한다. 환자는 하나 이상의 복제 결함 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 표적 항원에 대해 개체에서 면역 반응을 상승시킬 수 있는 Ad5 [E1-, E2B-]-CEA(6D), Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1c, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1n, Ad5 [E1-, E2b-]-T를 받을 수 있다. 여러 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스는 이러한 면역 반응을 일으키키에 적합한 용량으로 투여된다. 일부 경우에, 복제 결함 아데노바이러스는 면역화당 109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3 x1012 이상 바이러스 입자(VP)와 같거나 큰 용량으로 투여된다. 일부 경우에, 복제 결함 아데노바이러스는 면역화당 1x109, 2 x109, 3 x109, 4 x109, 5 x109, 6 x109, 7 x109, 8 x109, 9 x109, 1x1010, 2 x1010, 3 x1010, 4 x1010, 5 x1010, 6 x1010, 7 x1010, 8 x1010, 9 x1010, 1 x1011, 2 x1011, 3 x1011, 4 x1011, 5x1011, 6 x1011, 7 x1011, 8 x1011, 9 x1011, 1x1012, 1.5 x1012, 2 x1012, 3 x1012 이상의 바이러스 입자와 같거나 미만인 용량으로 투여된다. 여러 실시양태에서, 본원에서 기재된 바람직한 용량은 제제 완충액의 적합한 부피, 예를 들어 약 0.1-10 mL, 0.2-8mL, 0.3-7mL, 0.4-6 mL, 0.5-5 mL, 0.6-4 mL, 0.7-3 mL, 0.8-2 mL, 0.9-1.5 mL, 0.95-1.2 mL, 또는 1.0-1.1 mL의 부피로 투여된다. 당 업자는 부피가 임의의 상기 값에 의해 경계가 정해지는 임의의 범위(예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 1.1 mL) 내에 해당할 수 있다는 것을 이해한다. 바이러스 입자의 투여는 전달에 적합한 다양한 경로를 통할 수 있으며, 예를 들어 이는 주사에 의해서(예를 들어, 피 내, 근육 내, 정맥 내 또는 피하), 비강 내(예를 들어, 흡인에 의해), 환제 형태(예를 들어, 연하, 질 또는 직장 전달을 위한 좌약)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 피하 전달이 바람직할 수 있으며 수지상 세포에 더 많은 접근을 제공할 수 있다.
개체에게 바이러스 입자의 투여는 반복될 수 있다. 바이러스 입자의 반복 전달은 일정을 따를 수 있거나, 별법으로 요구되는 기준에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원, 예를 들어 MUC1, T 및/또는 CEA에 대한 개체의 면역을 검사하고 필요에 따라 추가의 전달을 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달을 위한 일정은 규칙적인 간격으로 바이러스 입자의 투여를 포함한다. 일정이 있는 기간 및/또는 투여 전에 평가된 요구 기반 투여의 기간 중 하나 이상의 공동 전달 레지멘이 설계될 수 있다. 예를 들어, 요법 레지멘은 3주마다 1회 투여, 예를 들어 피하 투여 후 사망을 포함한 어떤 이유로든 요법으로부터 제외될 때까지 3개월마다 추가의 면역요법 치료를 포함할 수 있다. 또 다른 예의 레지멘은 3주마다 3회 투여 후 또 다른 세트의 3개월 마다 3회 면역요법 치료를 포함한다. 또 다른 예의 레지멘은 제1 빈도로 제1 횟수의 투여로 제1기간, 제2 빈도로 제2 횟수의 투여로 제2기간, 제3 빈도로 제3 횟수로 제3기간 투여 등, 및 경우에 따라 요구되는 기준에 따라 미결정된 횟수의 투여로 하나 이상의 기간을 포함한다. 각 기간에 투여 횟수는 독립적으로 선택될 수 있고 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상일 수 있다. 또한, 각 기간에 투여 빈도는 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 대략 매일, 2일마다, 3일마다, 주 2회, 주 1회, 2주 1회, 3주마다, 매달, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 1년에 1회 등일 수 있다. 요법은 총 기간이 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36개월 이상 걸릴 수 있다. 면역화 사이의 예정된 간격은 면역화 사이의 간격이 간격의 최대 1/5, 1/4, 1/3, 또는 1/2까지 변경되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 3주 간격 일정일 경우, 면역화는 20 내지 28일 사이에 반복될 수 있다(3주 -1일 내지 3주 +7일). 처음 3회 면역화일 경우, 제2 및/또는 제3 면역화가 지연된다면, 후속 면역화는 면역화 사이의 최소량의 완충제를 허용하여 이동될 수 있다. 예를 들어, 3주 간격 일정일 경우, 면역화가 지연되는 경우, 후속 면역화는 이전 면역화 후 17, 18, 19, 또는 20일보다 일찍 일어나지 않도록 일정을 정할 수 있다.
본 발명의 조성물, 예를 들어 Ad Ad5 [E1-, E2B-]-CEA(6D), Ad5 [E1-, E2B-]-MUC1, Ad5 [E1-, E2B-]-MUC1c, Ad5 [E1-, E2B-]-MUC1n, Ad5 [E1-, E2B-]-T 바이러스 입자는 여러 상태로, 예를 들어, 실온에서, 얼음에, 또는 냉동되어 제공될 수 있다. 조성물은 적합한 크기의 용기, 예를 들어 2 mL의 바이알에 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 1.0 mL의 추출 가능한 백신을 포함하는 12 ml 바이알은 5x1011 총 바이러스 입자/mL를 포함한다. 온도 및 습도를 포함한 저장 조건은 달라질 수 있다. 예를 들어, 요법에 사용하기 위한 조성물은 실온에서, 4℃, -20℃, 또는 그 이하에 저장될 수 있다.
여러 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료받는 개체에서 일반적인 평가가 실시된다. 하나 이상의 임의의 검사는 필요에 따라, 또는 일정을 기반으로, 예를 들어 제0, 3, 6주 등에 실시될 수 있다. 다양한 세트의 검사가 면역화와 동시에 vs. 면역화 없는 시점에 실시될 수 있다.
일반적인 평가는 병력, ECOG 활동도 점수(Performancne Score), 카노프스키 수행 상태(Karnofsky performance status), 및 담당의에 의한 체중을 포함한 전체 신체 검사중 하나 이상을 포함할 수 있다. 최후 방문 이후 환자가 받고 있거나 받은 모든 기타 치료, 의약, 생물제제 또는 혈액 제제가 기록될 수 있다. 환자는 어떤 부작용을 모니터하기 위해서 백신을 받은 후 적합한 기간, 예를 들어 대략 30분간 병원에서 지켜볼 수 있다. 백신의 각 투여 후에 국소 및 전신 반응원성은 선택된 시간 동안, 예를 들어 3일간(면역화 당일 및 그 후 2일에) 매일 평가될 수 있다. 일기 카드를 이용하여 증상을 보고할 수 있고 자를 이용하여 국소 반응원성을 측정할 수 있다. 면역화 주사 부위가 평가될 수 있다. 가슴, 복부, 및 골반의 CT 스캔 또는 MRI가 실시될 수 있다.
여러 실시양태에서, 혈액학적 및 생화학적 평가가 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료받는 개체에서 실시된다. 하나 이상의 임의의 검사는 필요에 따라 또는 일정을 기반으로, 예를 들어 제0, 3, 6주 등에 실시될 수 있다. 다양한 세트의 검사는 면역화와 동시에 vs. 면역화 없는 시점에 실시될 수 있다. 혈액학적 및 생화학적 평가는 화학 및 혈액학에 대한 혈액 검사, 차이가 있는 CBC(cell blood counting), Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아티닌, Ca, 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리 포스파타아제, AST, ALT, 글루코오스, 및 ANA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 생물학적 마커는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료받는 개체에서 평가된다. 하나 이상의 임의의 검사는 필요에 따라 또는 일정을 기반으로, 예를 들어 제0, 3, 6주 등에 실시될 수 있다. 다양한 세트의 검사는 면역화와 동시에 vs. 면역화 없는 시점에 실시될 수 있다.
생물학적 마커 평가는 적절한 부피의 혈청 시료로부터 MUC1, MUC1c, MUC1n, CEA 또는 Ad5 벡터에 대한 항체를 측정하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 예를 들어 약 5ml 생물지표(예를 들어, CEA 또는 CA15-3)가 결정되고 이용 가능한 경우 검토될 수 있다.
여러 실시양태에서, 면역학적 평가는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료받는 개체에 실시된다. 하나 이상의 임의의 검사는 필요에 따라 또는 일정을 기반으로, 예를 들어 제0, 3, 6주 등에 실시될 수 있다. 다양한 세트의 검사는 면역화와 동시에 vs. 면역화 없는 시점에 실시될 수 있다.
말초 혈액, 예를 들어 약 90mL를 각 면역화 전, 적어도 일부 면역화 후에 얻어 연구 과정에서 및/또는 특정 횟수의 면역화 후에 특정 시간에 면역 반응에 효과가 있지를 결정할 수 있다. 면역학적 평가는 ELISpot, 증식 분석법, 다중 매개변수의 유세포 분석, 및 세포독성 분석을 이용하여 MUC1, MUC1c, MUC1n, T 또는 CEA에 대한 T 세포 반응에 대해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 평가하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 채혈된 각 혈액으로부터의 혈청을 보관하고 보내 결정한다.
여러 실시양태에서, 종양 평가는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료받는 개체에 실시된다. 하나 이상의 임의의 검사는 필요에 따라 또는 일정을 기반으로, 예를 들어 치료 전에, 제0, 3, 6주 등에 실시될 수 있다. 다양한 세트의 검사는 면역화와 동시에 vs. 면역화 없는 시점에 실시될 수 있다. 종양 평가는 치료 전에, 적어도 일부 면역화 후에, 및 최초 치료의 선택된 횟수, 예를 들어 2, 3, 또는 4회의 완료 후 대략 3개월 마다 및 예를 들어 치료로부터 제외될 때까지 실시된 가슴, 복부, 또는 골반의 CT 또는 MRI 스캔 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 표적 항원, 예를 들어 CEA에 대한 면역 반응은 면역 반응에 대해 하나 이상의 적합한 검사, 예를 들어 ELISpot, 사이토카인 유세포 분석법, 또는 항체 반응을 이용하여 개체의 시료, 예를 들어 개체의 말초 혈액 시료로부터 평가될 수 있다. 양성 면역 반응은 T 세포 반응을 측정하여 결정될 수 있다. 항원을 가진 6개의 웰에 배경에 대해 조정된 반점의 평균 개수가 6개의 대조군 웰 내 반점의 개수보다 10을 초과하고 항원을 포함하는 6개의 웰 및 6개의 대조군 웰의 단일 값들 사이의 차이가 스튜던트 t-검정을 이용하여 p≤0.05의 수준에서 통계적으로 유의할 경우 T 세포 반응은 양성으로 간주될 수 있다. 면역원성 분석은 각 면역화에 앞서 치료 기간의 예정된 시점에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 치료의 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 30, 36, 또는 48주 주위에 면역원성 분석을 위한 시점은 이때 예정된 면역화가 없더라도 예정될 수 있다. 일부 경우에, 개체는 면역화의 적어도 최소 횟수, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회 이상 면역화를 받을 경우 면역 반응에 대해 평가 가능하다고 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 진행 또는 임상 반응 결정은 측정 가능한/평가 가능한 질환의 환자 중에서 RECIST 1.1 기준에 따라 내려진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법은 요법을 받은 개체에서 완전 반응(CR): 표적 병변에 대해 모든 표적 병변의 사라짐 또는 모든 비표적 병변의 사라짐 및 비표적 병변에 대해 종양 마커 수준의 정상화)에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법은 요법을 받은 개체에서 부분 반응(PR); 표적 병변에 대해 기준선 합계 LD를 기준으로 삼아 표적 병변의 LD의 합계에서 적어도 30% 감소)에 영향을 준다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법은 요법을 받은 개체에서 안정 병변(SD(stable disease); 표적 병변에 치료가 시작된 이후로 최소 합계 LD를 기준으로 삼아, PR을 정량하기에 충분한 축소도 없고 PD를 정량하기에 충분한 증가도 없음)에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법은 요법을 받은 개체에서 불완전 반응/안정 병변(SD; 하나 이상의 비표적 병변(들)의 지속 또는/및 비표적 병변에 대해 정상 한계보다 높은 종양 마커 수준의 유지)에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용한 요법은 요법을 받은 개체에서 진행 병변(PD; 치료 시작한 이후로 기록된 최소 합계 LD를 기준으로 삼아, 표적 병변의 LD의 합계에서 적어도 20% 증가 또는 표적 병변에 대해 하나 이상의 신규 병변의 출현 또는 하나 이상의 비표적 병변(들)의 지속 또는/및 비표적 병변에 대해 정상 한계보다 높은 종양 마커 수준의 유지)에 영향을 준다.
키트
조성물, 면역요법 또는 백신은 키트 형식으로 제공될 수 있다. 본 개시의 키트는 치료 레지멘 정보를 포함하는 투여량 및/또는 투여에 관한 설명서를 더 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 복합 다중 표적화 암 면역요법을 제공하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 감염증의 복합 다중 표적화 치료를 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 키트 구성요소를 투여하는데 유용한 구성요소 및 구성요소의 제조 방법에 대한 설명서를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 적절한 실험실 검사를 이용하여 치료 전후에 환자의 모니터링을 수행하거나, 결과 및 환자 데이터를 의료진과 소통하기 위한 소프트웨어를 더 포함할 수 있다.
키트를 구성하는 구성요소는 건조 또는 액상 형태일 수 있다. 이들이 건조 형태일 경우, 키트는 건조 재료를 용해시키기 위한 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 액체 또는 건조 형태의 전달 인자를 포함할 수 있다. 전달 인자가 건조 형태일 경우, 키트는 전달 인자를 용해시키기 위한 용액을 포함할 것이다. 키트는 또한 구성요소를 혼합하고 제조하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 예를 들어 바늘, 관, 도포기, 흡입제, 주사기, 피펫, 집게, 계량스푼, 눈 점적기 또는 임의의 이 같이 의료상 인정되는 전달 비히클과 같은 투여를 지원하는 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 또는 약물 전달 시스템은 또한 통상적으로 상업적인 판매 및 배포를 위해 본 개시의 조성물을 완전히 밀폐하여 담기 위한 수단을 포함할 것이다.
실시예
펩티드 및
벡터
하기 HLA-A2 및 HLA-A24 결합 펩티드를 본 실시예 및 기타 실시예에 사용하였다: (a) HLA-A2 결합 CEA 작용제 펩티드 CAP1-6D(YLSGADLNL(서열 번호 10)), (b) HLA-A2 MUC1 작용제 펩티드 P93L(ALWGQDVTSV(서열 번호 12)), (c) HLA-A24 결합 MUC1 작용제 펩티드 C6A (KYHPMSEYAL(서열 번호 13)), 및 (d) HLA-A2 결합 브라큐리 작용제 펩티드(WLLPGTSTV(서열 번호 14)). 모든 펩티드는 95%보다 더 순수하였다.
Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 및 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1을 제작하고 생산하였다. 간략하게, 전이유전자를 상동 재조합 기반 접근법을 이용하여 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 E1 영역에 서브클로닝하였다. 복제 결함 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식하고, CsCl2 정제하고, 역가를 측정하였다. 바이러스 감염 역가는 E.C7 세포 단층에서 플라크 형성 단위(PFU)로서 결정하였다. VP 농도는 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 의해 파괴하고 260 nm 및 280 nm에서 분광 광도법에 의해 결정하였다. 또한, CEA 전이유전자는 높은 면역원성 에피토프 CAP1-6D를 포함하는 변형된 CEA를 포함하였다.
인간 브라큐리 단백질(T, NM_003181.3)을 코딩하는 서열은 인핸서 T 세포 HLA-A2 에피토프(WLLPGTSTV(서열 번호 14))를 도입하고 DNA 결합과 관련된 25개 아미노산 단편을 제거하여 변형하였다. 계속하여 생성된 구조물을 Ad5 벡터에 서브클로닝하여 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 구조물을 생성하였다.
MUC1 분자는 2개의 영역으로 이루어졌다: MUC1의 큰 세포 외 도메인인 N-말단(MUC1-n), 및 3개의 영역, 작은 세포 외 도메인, 단일 막횡단 도메인, 및 세포질 꼬리를 가진 C-말단(MUC1-c). 세포질 꼬리는 신호전달 단백질과의 상호작용을 위한 부위를 포함하였으며 발암유전자 및 암 운동성, 침투성 및 전이의 유발자로서 역할을 한다. Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1을 제작하기 위해, 8개의 작용제 에피토프를 포함하는 전체 MUC1 전이유전자를 Ad5 벡터에 서브클로닝하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 벡터에 포함된 작용제 에피토프는 HLA-A2(N-말단 내 에피토프 P93L, VNTR 영역 내 V1A 및 V2A, 및 C-말단 내 C1A, C2A 및 C3A), HLA-A3(에피토프 C5A), 및 HLA-A24(C-말단 내 에피토프 C6A)에 결합한다. Tri-Ad5 백신은 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 및 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1을 1:1:1(총 3x1010 VP)의 비율로 합하여 생산하였다
실시예
1:
Ad5
눌
아데노바이러스
벡터의
다중
주사는 항-
아데노바이러스
항체를 생산한다
본 실시예는 Ad5-눌의 다중 주사가 결과적으로 주사된 피험체에서 항-아데노바이러스 항체의 생산을 일으킨다는 것을 보여준다.
임의의 이종 핵산 서열을 포함하지 않는 Ad5-눌 아데노바이러스 벡터가 생쥐에서 중화 면역 반응을 생성하였다는 것을 증명하였다. 한 실험에서, 5-7주령 암컷 Balb/c 생쥐를 Ad5눌 바이러스 입자로 14일 간격으로 면역시켰다. 항-아데노바이러스 항체의 존재를 결정하기 위해서, 효소면역측정법(ELISA)을 이용하였다. 이 ELISA를 위해서, 109 바이러스 입자를 100 ㎕의 0.05M 탄산/중탄산 완충액, pH 9.6 중에 마이크로타이터 웰 위에 덮고 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 표준 면역글로불린 G(IgG) 기준 곡선을 위해, 200 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 및 0 ng의 정제된 생쥐 IgG를 상기에 기재된 바와 같이 마이크로타이터 웰에 덮었다. 인큐베이션 후에, 모든 웰을 인산 완충 식염수(PBS), pH 7.4 중 1% 소 혈청 알부민(BSA) 250 ㎕로 3회 세척하였다. 세척 후, 250 ㎕의 BSA/PBS를 전체에 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션 하여 비결합 부위를 차단하였다. 인큐베이션 후에, 모든 웰을 250 ㎕의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후에, BSA/PBS 중의 1/100 혈청 희석액 200 ㎕를 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 양성 대조군 경우, BSA/PBS 중 1/10000 희석액의 항-아데노바이러스 항혈청 200 ㎕를 웰에 첨가하였다. 대조군 웰은 BSA/PBS만을 포함하였다. 인큐베이션 후에, 모든 웰을 250 ㎕의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후에, BSA/PBS 중 1/10000 희석액의 페록시다아제에 접합된 γ쇄 특이적 염소 항-생쥐 IgG(Sigma Chemicals) 200 ㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 모든 웰을 250 ㎕의 BSA/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후에, 200 ㎕의 현상시약(0.06% 과산화수소를 함유하는 0.2M 인산칼륨 완충액, pH 5.0 중 0.5 mg/mL 1,2-페닐렌-디아민)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30-40분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 발색 반응은 각 웰에 50 ㎕ 5N HCl을 첨가하여 정지시켰다. 그 후 모든 웰을 마이크로웰 플레이트 판독기 492 nm에서 판독하였다. 판독 값을 얻은 후, 미지의 시료의 광학 밀도 판독 값을 표준 IgG 곡선과 상호 연관시켜 웰당 결합된 ng의 IgG를 얻었다. 이는 INSTAT 통계학 패키지를 이용하여 실시하였다.
CEA에
대한 항체를 검출하는 ELISA
ELISA 플레이트를 0.05 M 탄산-중탄산 완충액 pH 9.6 중 100 ng의 인간 CEA(Sigma-Aldrich)로 코팅하고 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 1% 트윈-20(PBS-T)을 함유하는 인산 완충 식염수로 3회 세척한 후 1% BSA를 함유하는 PBS로 실온에서 60분간 차단하였다. 추가 3회 세척 후, PBS-T 중에 1/50으로 희석된 혈청을 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 1:5000 희석된 페록시다아제 표지된 염소 항-생쥐 면역글로불린(Ig) G(γ쇄 특이적)(Sigma-Aldrich) 항체를 세척 후 웰에 첨가하고 플레이트를 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고 1,2-페닐렌-디아민 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 반응은 10% 인산을 첨가하여 정지시켰다. 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 190 ELISA 판독기에서 492 nm에서 측정하였다. 웰당 CEA에 결합된 IgG의 ng 당량을 정제된 생쥐 IgG를 이용하여 생성된 표준 곡선을 기준으로 하여 얻고 CEA ELISA와 동시에 현상하였다. 결과를 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 6.3 소프트웨어를 이용하여 분석하고 정량하였다.
1010 Ad-5-눌로 1차 주사 후 2주에 생쥐에서 유의한 수준(P<0.001)의 항-아데노바이러스 IgG 항체를 검출하였다(도 1). 1010 아데노바이러스로 2차 주사 2주 후에 유의하게 더 높은 수준(P<0.001)이 관찰되었다. 유의하게 더 높은 (P<0.001) 수준의 항체는 1010 Ad5-눌로 3차 주사 후 2주에 계속하여 관찰되었다. 각 값은 각 군의 5마리 생쥐에서 수집된 혈청으로부터 3회 중복 결정 값의 평균을 나타낸다. Ad5-눌의 다중 주사는 결과적으로 피험체에서 항-아데노바이러스 항체의 생산을 일으켰다.
Ad에 대한 중화 항체의 존재를 결정하기 위해서, 하기 분석을 이용하였다. HEK-293T-세포주를 마이크로웰 조직 배양 플레이트에 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM(DMEM/FCS)으로 이루어진 배양 배지 200 ㎕ 중에 웰당 2x103 세포의 세포 농도로 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. 인큐베이션 후에, 100 ㎕의 배양 배지를 3회 중복 웰에서 꺼내어 바이러스 입자(VP)를 함유하는 DMEM/FCS 20 ㎕와 혼합하였다. 혼합 후, 120 ㎕ 혼합물을 각각의 마이크로웰에 다시 첨가하였다. 또 다른 세트의 3회 중복 웰에서, 100 ㎕의 배양 배지를 꺼내어 실온에서 1시간 VP와 미리 인큐베이션된 열 불활성화된(56℃, 1h) Ad 면역 생쥐 혈청 20 ㎕와 혼합하였다. 혼합 후, 120 ㎕ 혼합물을 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 3회 중복 세포 대조군 웰에서, 20 ㎕의 DMEM/FCS를 전체 배양 배지 부피를 위해 대조군에 첨가하였다. 3회 중복 배지 단독 대조군 웰은 220 ㎕의 DMEM/FCS를 포함하였다. 조직 배양 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 추가 3일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 40 ㎕의 프로메가(PROMEGA) 세포 생존능 시약(오웬(Owen) 시약)을 모든 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 75분간 인큐베이션하였다. 본 분석에서, 오웬 시약(MTS 테트라졸륨 화합물)은 생존 세포에 의해 조직 배양 배지에서 가용성인 발색 포르마잔 산물로 생물 환원된다. 490 nm에서 흡광도로 측정되는 포르마잔 산물의 양은 배앙물 내 생존 세포 수에 정비례한다. 인큐베이션 후에, 150 ㎕를 각 웰에서 꺼내 광학 밀도 판독을 위한 또 다른 마이크로웰로 옮겼다. 계속하여 마이크로웰 플레이트 판독기를 이용하여 492 nm에서 광학 밀도 판독 값을 얻었다.
Ad에 대한 중화 항체의 존재를 검출하기 위해서, 5마리 생쥐 군 각각에 1010 Ad5-눌로 2주 간격으로 1회, 2회, 또는 3회 주사하였다. 바이러스의 최종 주사 후 2주에, 생쥐에서 채혈하여, 수집하고, 열 불활성화된 혈청과 함께 또는 없이 인큐베이션된 4x107 VP를 이용하여 상기에 기재된 바와 같이 중화 항체에 대해 평가하였다. 단독 배양된 세포는 대조군으로 역할을 하였다. 정상 생쥐 및 Ad5눌로 1회 주사된 생쥐는 유의한 수준의 중화 항체를 나타내지 않았다(도 2). Ad로 2회 주사된 생쥐는 바이러스 단독과 인큐베이션된 세포와 비교하여 유의한 (P<0.05) 수준의 중화 항체를 보였다. 또한, Ad5-눌로 3회 주사된 생쥐는 바이러스 단독과 인큐베이션된 세포와 비교하여 유의한 (P<0.01) 수준의 중화 항체를 나타냈다.
실시예
2:
Ad5
[E1-]-
CEA
벡터 백신은
Ad5
면역 생쥐에서
재면역화
시
CEA
특이적 면역 반응을
유도한다
본 실시예는 생쥐에서 기존의 Ad5 면역이 존재하는 경우 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼이 종양 관련 항원(TAA) 암 배아 항원(CEA)에 대해 CMI 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
Ad5
CEA
벡터의 특성화
2개의 Ad5-CEA 벡터 플랫폼의 CEA 유전자 발현을 확인하기 위해 초기 연구를 수행하였다. CEA 항원이 백신 벡터 플랫폼으로 형질감염된 세포에서 발현될 수 있다는 것을 처음 밝혔다. A549 세포를 ATCC로부터 얻어 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 형질감염시켰다. 웨스턴 블롯 분석은 벡터 플랫폼으로 형질감염된 세포가 CEA 항원을 발현한다는 것을 밝혔다(도 35).
방법
A549 세포에 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA를 555 VP/세포의 MOI로 접종하였다. 세포는 3555 VP/세포의 MOI로 37℃, 5% CO2에서 48시간 인큐베이션하였다. 48시간 후에 세포를 수거하고 PBS로 세척하고 3회 냉동/해동하였다. 전세포 용해액을 70℃에서 10분간 가열한 후 겔에 로딩하였다. 재조합 CEA 대조군은 레인당 30ng을 로딩하고 제조된 용해액은 레인당 20 ㎕를 로딩하였다. 시료 로딩 완충액을 추가의 음성 대조군으로 포함하였고 양성 대조군은 매직 마크 CP 웨스턴(Magic Mark CP Western) 마커 및 재조합 CEA였다. 겔을 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고 수퍼블록(SuperBlock) 차단 용액으로 60분간 차단하였다. 막을 생쥐 단클론 항-CEA 1차 항체(1:1000) 및 2차 항-생쥐 HRP(1:2500) 접합된 항체로 프로브하였다. 막을 3회 세척한 후 수퍼시그널(SuperSignal) 화학발광 시약과 인큐베이션하고 X-선 필름을 막에 노출한 후 현상하여 밴드 형성을 가시화하였다.
생쥐에서
Ad5
면역의 유도
유도될 수 있는 Ad5 면역의 수준을 평가하기 위해서, Ad5 미접촉 C57Bl/6 생쥐 군에 Ad5 벡터 플랫폼(VP)으로 피하 주사하였다. 28 내지 42일 후에, 혈청 시료를 수집하고 종점 Ad5 NAb 역가에 대해 평가하였다. [도 3]에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군 생쥐에서 검출 불가능한 Ad5 NAb 역가(종점 Ad5 NAb 역가 < 1/25)가 관찰되었다. Ad5 NAb(1/25 내지 1/50의 종점 역가)는 1회 주사 후에 검출 가능했지만 1010 Ad5의 3회 주사 후 극적으로 증가하였다. 따라서, 추가의 Ad5 면역 연구에서, 생쥐에 1010 Ad5 VP로 2회 주사하여 동물이 Ad5 면역이 되도록 하였다.
Ad5
[E1-]-
CEA
또는
Ad5
[E1-,
E2b
-]-
CEA로
Ad5
면역 생쥐의 면역화
Ad5 면역 생쥐에서 Ad5 [E1-]-CEA 및 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 백신의 면역화 유도 가능성을 결정하고 비교하기 위하여 본 실험을 설계하였다. 4 내지 8주령 암컷 C57Bl/6 생쥐 군을 1010 Ad5-눌 VP로 2주 간격으로 2회 면역시켰다. 최종 Ad5-눌 면역화 후 2주에, 생쥐를 1010 VP의 Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 1주 간격으로 3회 면역시켰다. 최종 면역화 후 2주에, 생쥐를 안락사시키고 분석을 위해 이들의 비장 및 혈청을 수거하였다.
CMI 반응은 완전한 CEA 항원에 노출된 비장 세포에 실시된 ELISpot 분석법으로 평가하였다. Ad5 [E1-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 피하 면역된 Ad5 면역 C57Bl/6 생쥐의 비장 세포를 수거하고 상기에 기재된 바와 같이 IFN-γ 및 IL-2 분비 세포 수에 대해 평가하였다. 면역된 Ad5 [E1-]-CEA 생쥐와 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 생쥐로부터 분석된 비장에서 IFN-γ 및 IL-2 분비 세포 둘 다의 수가 유의하게 상승한 것을 확인하였다([도 4A] 및 [도 4B]). 특이성 연구는 Ad5 CEA 벡터를 이용한 면역화가 특이적 CEA 관련된 CMI 반응을 유도하였지만 다른 무관한 항원 예를 들어 HIV-gag 단백질 또는 β-갈락토시다아제에 대해 반응을 유도하지 못하였다는 것을 보였다. 상기 결과는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA를 이용한 Ad5 면역 생쥐의 면역화는 유의하게 더 큰 CMI 반응을 유도하였다는 것을 보여준다.
면역된 생쥐에서 간의 부작용의 결여
상기에 기재된 바와 같이 Ad5 [E1-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 Ad5 면역 암컷 C57Bl/6 생쥐의 혈청에 독성 연구를 수행하였다. 완충액 단독으로 주사된 Ad5 미접촉 또는 Ad5 면역 생쥐는 대조군으로 역할을 하였다. 3차 면역화 후 3일에, 치료로 인한 간 독성을 결정하기 위해서 혈액 시료에서 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 수준을 평가하였다. AST 수준은 두 벡터로 면역화 후 대조군에 비해 상승하지 않았다(도 5). 또한, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 수준을 평가하여 유사한 결과를 관찰하였다.
Ad5
면역 종양 보유 생쥐에서
Ad5
[E1-,
E2b
-]-
CEA
면역요법
상기에서 관찰된 성공적인 면역학적 결과를 기초로 하여, 생쥐에서 MC38 종양이 확립된 후 치료되는 연구를 하기에 기재된 바와 같이 실시하였다. 본 연구를 위해, CEA 발현 MC38 쥣과 세포주를 사용하였다. 본 세포주는 인간 CEA를 발현하도록 유전적으로 변형되었으며 C57Bl/6 생쥐에 이식될 수 있다. 종양 확립 후, 생쥐를 신규 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 벡터 플랫폼으로 처리하였다. Ad5 면역 종양 보유 생쥐가 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 벡터로 치료될 수 있는지를 결정하기 위해서, C57Bl/6 생쥐에 1010 Ad5 [E1-]-눌 VP를 14일 간격으로 2회 피하주사하여 생쥐가 Ad5 면역이 되게 하였다. 최종 주사 후 2주에, 2개 군의 7마리 C57Bl/6 생쥐에 106 CEA 발현 MC38 종양 세포를 피하 주사하였다. 7일 후에, 종양이 촉지될 때, 한 개 군의 생쥐를 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 제7, 13 및 19일에 말단 피하 주사로 처리하였다. 한 개 군의 7마리 주사 완충액만 처리된 C57Bl/6 생쥐는 비처리된 대조군으로 역할을 하였다. 모든 생쥐는 21일 기간에 걸쳐 종양 크기에 대해 모니터하고 종양 부피를 이전에 기재된 바와 같이 결정하였다.
제19일까지의 종양 성장은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 처리된 생쥐에서 유의하게 감소하였고 그렇게 유지하였다(도 6). 연구 종료시(제22일), 생쥐를 희생시키고 종양을 절개하여 중량을 쟀다. 종양 측정값을 얻어 부피를 결정하였다. 프리즘(PRISM) 소프트웨어를 이용한 본페로니(Bonferroni) 사후시험 분석을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 처리된 생쥐에서 종양은 비처리 대조군보다 중량이 유의하게 (P<0.05) 더 작았다(도 7).
연구 종료시, 생쥐로부터 비장을 수집하고 CEA 특이적 CMI 반응은 ELISpot 분석법으로 결정하였다. CEA 특이적 IFN-γ 분비 반응은 MC-38 종양 세포를 단독으로 받은 생쥐에서보다 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA로 면역된 생쥐에서 유의하게 더 높았다. 상기 결과는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 백신을 이용하여 Ad5 면역된 생쥐에서 CEA 발현 종양의 처리가 종양 성장 진행을 유의하게 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
3: 감염 후 A549 세포에서
CEA
발현에 대한 정량 ELISA
본 실시예는 인간 암성 폐 세포주, A-549를 형질도입하기 위해 Ad5 [E1-, E2b-] CEA 벡터를 이용한 용량 반응 평가를 보여준다. 결과는 CEA 항원이 용량 의존적인 방식으로 발현될 수 있다는 것을 보여준다.
실험 설계
분석 제1일에, BD 팔콘(Falcon) 조직 배양 96웰 플레이트에 앞서 3일 계대된 A549 세포(lot# 30Jul02, 계대 p+23)(7.7x103 세포/웰)를 접종하고 5±2% CO2 대기의 37±2℃ 인큐베이터에 하룻밤 두었다.
다음날, 시험물의 연속 희색액을 제조하고 중복 웰에 1.56x103 내지 2.5x104 바이러스 입자/웰 범위의 수준으로 접종하였다. 비처리된 A549 세포는 모의 시료로서 역할을 하도록 사용하였다. 분석 제4일에, ELISA 분석을 위해 웰에 10% 트리톤(Triton) X-100 용액을 처리하여 CEA 농도를 측정하였다. ELISA를 위해, 마이크로타이터 플레이트를 항-CEA 캡쳐 항체(앱캠(abcam) 암 배아 항원 CEA 항체 [(NCRC16(AKA161))])로 하룻밤 코팅하였다. 웰을 세척하여 미결합 반응물질을 제거하고, 플레이트는 표준 곡선 범위 내에 해당하는 1% 트윈 20을 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)로 차단하였다. 차단 기간 후에, 웰을 세척하고 시료, 대조군, 및 표준을 지정된 3중 복제 웰에서 인큐베이션하였다. 미결합 반응물질을 세척하여 제거하고, CEA 검출 항체에 대한 토끼 단클론 항체를 첨가하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 세척하고 페록시다아제 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 인큐베이션하였다. 기질은 효소 존재하에서 발색 산물을 형성하였고, 반응은 1M 인산용액으로 정지시키고, 흡광도는 보정된 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다. 알고 있는 농도의 CEA를 포함하는 표준으로부터 보정 곡선을 생성하고 곡선을 이용하여 시료 내 CEA 농도를 결정하였다. 희석 및 감염 다중도(MOI)에 대해 조정한 후 바이러스 입자당 생산된 CEA 양을 ELISA에 의해 측정된 CEA 농도로부터 계산하였다. 배지에 존재하는 배경 수준을 보정하기 위해 배양 배지 단독에 대해 유사한 방법으로 결정된 값을 차감하였다. 시료 분석은 표 2에 나타낸다.
[표 2]
실시예
4: 면역화 안정성 데이터의 일정, 용량, 경로
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼이 형질감염된 세포 상에서 항원 단백질을 발현할 수 있는지를 평가하고 확인하기 위해 초기 전임상 연구를 수행하였다. A-549 세포를 백신 플랫폼으로 형질감염시키고 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다(도 8). 항원 단백질 예를 들어 HIV-gag, HIV-pol, 또는 HIV-nef는 이들이 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼으로 형질감염될 때 세포에서 발현된다는 것을 확인하였다.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼을 이용하여 용량 반응 평가를 실시하여, 쥣과 모델에서 전이유전자에 대해 바람직한 CMI 반응을 일으키는 용량이라는 것을 증명하였다. CMI 반응은 생쥐의 비장으로부터 인터페론-γ(IFN-γ) 및 IL-2 분비 세포(비장 세포)를 검출하는 ELISpot 분석법을 이용하여 평가하였다. 게다가, 쥣과 및 비인간 영장류(NHP) 모델에서, 1010 VP를 이용하여 각각 2주 내지 4주 간격으로 3회 면역화가 결과적으로 바람직한 CMI 반응을 일으켰다. 생쥐에서, 단지 1회 면역화에 비해 다중 면역화 후 더 큰 정도의 CMI 반응이 관찰되었다(도 9).
NHP 모델에서, 동물에 야생형 Ad5 바이러스를 주사하여 Ad5 면역이 되게 하였다. Ad5 중화 항체 역가가 동물을 Ad5에 대해 면역시킨다고 확인된 1:50 이상에 도달할 때, 이들을 1x1010 VP의 용량의 Ad5-[E1-, E2b-]-gag로 30일 간격으로 3회 피 내로 면역시켰다. 최종 백신접종 후 32일 및 1차 면역화(야생형 Ad5) 후 124일에, NAb 역가는 1:1000 이상이었다. 면역화 후, 동물의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IFN-γ 및 IL-2 분비 세포에 대해 평가하였을 때 강력한 CMI 반응이 존재한다는 것을 확인하였다(도 10).
상기 나타낸 3가지 NHP 모델에서 초기 백신 실험에서 실시한 예비면역학 연구 이외에, Ad5 [E1-, E2b-]-HIV gag로 백신접종된 동일한 NHP에 독성 연구를 또한 실시하였다. 연구 기간에 동물 체온 및 중량을 평가하였다. 동물들은 연구기간에 성장하면서 중량이 늘었다. 연구 기간에 체온 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 백신접종된 NHP에서 혈액학 연구를 수행하였다. 2차 백신접종 후 2주에 백혈구 계수에서 약간의 증가가 있는 것으로 보였으며 그 이후 정상화되었다.
값의 변동 이외에, 연구 과정에서 혈액학 수치에서 다른 차이는 없는 것으로 보였다. 또한, 연구 과정에서 NHP에서 화학 수치를 측정하였다. 알칼리 포스파타아제 수준은 연구 과정에서 약간 감소하였지만 정상 범위를 유지하였다. 알부민 수준은 연구 과정에서 약간 감소하였지만 정상을 유지하였다. 연구 과정에서 혈액 화학에서 다른 차이는 관찰되지 않았다. 본 임상 연구에서 면역화 경로는 많은 수의 DC가 피부 내에 존재하기 때문에 선택된다.
CEA 및 다른 전이유전자를 이용하는 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼을 사용하여 바람직한 수준의 CMI 반응을 유도하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 벡터 플랫폼을 이용하여, 비-Ad5 면역 및 Ad5에 이미 면역된 생쥐 둘 다에 백신을 3회 주사하였다. 면역화 후, 생쥐의 비장 세포를 IFN-γ 분비 세포에 대한 ELISpot으로 평가하였다. 면역화 후 상승된 CMI 반응이 관찰되었으며 CMI 반응의 수준은 비-Ad5 면역 및 Ad5에 이미 면역된 생쥐 둘 다에서 유사하였다(도 11). 상기 결과는 기존의 Ad5 면역이 존재하는데에도 강력한 CMI 반응이 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 주사 피하 전달법에 의해 3주 간격의 3회 면역화를 이용하는 III 상 임상 연구를 설계하였다.
투여의 일정, 용량, 경로의 이론적 근거
임상 연구 설계는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼을 이용한 동물 및 인간에서 전임상 및 임상 연구로부터 나왔다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼을 이용한 용량 반응 평가를 실시하여 결과적으로 쥣과 모델에서 전이유전자 산물에 대해 바람직한 CMI 반응을 일으키는 용량이 1010 VP라는 것을 증명하였다. 게다가, 쥣과 및 비인간 영장류(NHP) 모델에서, 1010 VP를 이용한 각각 2 내지 4주 간격의 3회 면역화는 결과적으로 바람직한 CMI를 일으켰다. 면역화 경로는 많은 수의 수지상 세포(DC)가 피부 내에 존재하기 때문에 선택된다. 이러한 전제를 이용하여, 피하 주사 프로토콜을 이용하여 다수의 쥣과 및 NHP 연구를 수행하였다. CEA 및 다른 전이유전자를 이용하는 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼을 사용하여 바람직한 수준의 순환하는 CMI를 유도하였다. 사망을 포함한 어떤 이유로 인해 연구로부터 제외될 때까지 3개월마다 면역요법 치료를 지속하는 피하(SQ) 주사 전달법에 의해 3주 간격의 3회 면역화를 이용하여 III 상 임상 연구를 따랐다.
요약
CAP1(6D) 돌연변이를 가진 변형된 CEA를 포함하는 cDNA 서열을 생산하였다. E.C7 세포주를 이용하여 임상 등급의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 제작하여 제조하였다. 총 34명 환자(32명의 결장직장암 환자, 1명의 방광암 환자, 및 1명의 폐암 환자)는 IND14325 하에 I/II 상 임상 연구를 시작하였다. 대부분은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 모두 3회의 예정된 면역요법 치료를 받았다. 5명의 환자는 상당한 질환 진행으로 일찍 면역요법을 멈추었다. 기준선에서와 치료가 완료된 후에 얻은 CT 또는 MRI 스캔을 이용한 RECIST 1.0 기준을 완성하였다. 독성은 미국 국립 암연구소(NCI) 이상반응 표준 용어 기준(CTCAE) 버전 4.0에 따라 평가하였다. 기준선과 면역요법의 개시 후 9주 사이에서 말초 혈액 CEA 수준, 혈청학, 혈청 화학, 및 항핵 항체 역가를 비교하였다. 생존은 1차 면역화한 날로부터 어떤 원인으로 인한 사망시까지 측정하였다.
총 94회 치료법을 환자에 투여하였다. 어떤 치료 용량 수준에서 치료 중단을 일으키는 독성 또는 심각한 이상 반응(SAE)을 제한하는 용량은 없었다. 혈액의 혈액학 수치에서 단지 한 번의 유의한 변화가 있었다. 한 군으로, 호염기구 계수가 제9주, 치료 종료 후 3주에 유의하게 더 낮았다. 그러나 이 값은 호염기구 계수의 정상 범위를 유지하였고, 종합적으로 유의한 생물학적 효과는 없는 것으로 보였다. 7.4개월의 중앙값 추적으로, 한 군(코호트 1, 2, 3/II 상, 및 코호트 5)으로서 전체 34명 환자가 41.4%의 12개월 생존 비율을 경험하였다. 연구를 시작한 34명 환자 중에서, 28명 환자가 3회의 면역요법 치료를 받았고 55%의 12개월 생존 비율을 경험하였다. 결장직장 선암종 환자 경우, 27명 환자가 3회의 면역요법 치료를 받았고 53%의 12개월 생존 비율을 경험하였다. 최고 용량인 5x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 받은 환자에서 최고의 세포 매개 면역(CMI) 반응이 일어났다는 것과 함께 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)의 수준증가에 따른 용량 반응이 관찰되었다. 최고의 CEA 특이적 CMI 반응을 기존의 또는 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 비교할 때, CEA 특이적 CMI의 수준과 Ad5 중화 항체(NAb) 수준 사이에 연관성은 없었다. 상기 임상 시험 데이터로 본 발명자들은 임상 종점으로서 전체 생존을 이용하여 전이성 결장직장 선암종의 치료를 위한 무작위 배정된 III 상 시험으로 진행하기에 충분한 데이터가 된다고 생각하게 되었다.
프로토콜 개요 및 환자 치료.
FDA-승인된 시험용 신약 면제(Investigational New Drug Exemption) 하에 임상 연구를 수행하고 "Clinicaltrials.gov"에 등록하였다. 참가자는 듀크 대학교 의료 센터(Duke University Medical Center (노스캐롤라이나주 소재)) 및 종양 내과 협회(Medical Oncology Associates (워싱턴주 소재))에서 모집하였다. 환자는 각각의 연구심의기구 (IRB)에 승인받은 사전 동의를 제공하였다. 자격 요건은 CEA를 발현하는 전이성 암 및 적절한 혈액학적, 신장 및 간 기능을 포함하였다. 시험 참가자는 가능한 전체 생존 이점을 갖는다고 공지된 표준 요법으로 치료받거나 상기 요법을 거절하도록 요구받았다. 배제 기준은 이전 4주 내에 화학요법 또는 방사선 치료; 자가 면역 질환, 바이러스성 감염, HIV, 또는 면역억제제 사용의 이력을 포함하였다. 등록 전 적어도 3개월간 베바시주맙 또는 세툭시맙을 받은 환자는 본 항체를 계속 받도록 허용하였다. 이전 CEA 면역요법은 허용하였다. 연구는 등급 3 또는 4의 주요 기관(organ) 독성으로 정의된 용량 제한적인 독성(DLT)을 갖는 표준 3 + 3 용량 증량 전략을 이용하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 용량은 다음과 같이 환자에 전달하였다: 코호트 1: 0.5 mL중 1x109 VP의 용량으로 동일한 허벅지 피하(SQ)에 3주마다 3회 면역화.; 코호트 2: 0.5 mL중 1X1010 VP의 용량으로 SQ에 3주마다 3회 치료; 코호트 3: 0.5 mL 중 1x1011 용량으로 SQ에 3주마다 3회 치료. 1x1011 VP의 용량이 안전하다고 확립된 후, 추가 12명 환자는 상기 용량 및 일정으로 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 받았다(II 상 코호트). II 상 코호트를 완료한 후, 추가의 여섯(6) 명 환자의 코호트(코호트 5)는 2.5 mL 중 5x1011 VP의 용량으로 SQ에 3주마다 3회 치료를 받고 최고 달성 가능한 용량의 안정성을 결정하였다. 면역화 바로 직전, 제0, 3, 6주 및 최종 치료 후 3주에 환자로부터 PMBC를 수집하였다. PBMC는 ELISpot 분석을 수행할 때까지 액체 질소에 냉동하였다. 코호트 5에서, 신선 PBMC는 다기능성 CD8+ T 림프구의 예비 유세포 분석법으로 분석하였다.
임상 활성의 평가
임상 활성은 기준선에서와 치료가 완료된 후에 얻은 컴퓨터 단층촬영(CT) 또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 이용하여 고형 종양의 반응 평가기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST 1.0 기준)에 따라 평가하였다. 독성은 미국 국립 암연구소 이상반응 표준 용어 기준(CTCAE) 버전 4에 따라 평가하였다. 기준선과 최종 치료 후 3주에 말초 혈액 CEA 수준, 혈청학, 혈청 화학, 및 항핵 항체 역가를 비교하였다. 생존은 1차 면역화한 날로부터 어떤 원인으로 인한 사망시까지 측정하였다.
ELISpot
분석법에 의한
CMI
반응의 분석
IFN-γ 분비 림프구에 대해 ELISpot 분석을 수행하였다. 간략하게, 개별 환자 시료로부터 단리된 PBMC(2x105 세포/웰)는 CEA 펩티드 풀(6D 변형을 가진 전장 CEA를 포함하는 11aa 중복된 15 mer: 0.1 ㎍/웰)과 36-40h 인큐베이션하여 IFN-γ 생산 T 세포를 자극하였다. Ad5에 대한 CMI 반응은 환자 PBMC를 Ad-눌(공벡터)에 노출시킨 후 결정하였다. 0.25 ㎍/웰 농도의 콘카나발린 A(Con A)로 자극된 세포는 양성 대조군으로 역할을 하였다. 발색 반점 형성 세포(SFC)를 이뮤노스팟(Immunospot) ELISpot 플레이트 판독기를 이용하여 계수하고 음성 대조군을 차감한 후 106 세포당 50 SFC가 검출되고 SFC가 음성 대조군 웰의 SFC보다 ≥2배 더 높을 경우 반응을 양성으로 간주하였다.
Ad5
중화 항체(
NAb
)
역가의
결정.
종점 Ad5 NAb 역가를 결정하였다. 간략하게, 100 ㎕의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에 열 불활성화된 시험 혈청의 희석액을 4x107 VP의 Ad5 [E1-]-눌과 혼합하고 실온에서 60분간 인큐베이션하였다. 시료는 10% 열 불활성화된 소 혈청 함유 DEME 중에 2x103 세포/웰로 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양된 HEK293 세포를 포함하는 마이크로웰에 첨가하였다. 혼합물은 37℃, 5% CO2에서 추가 72시간 인큐베이션하였다. MTS 테트라졸륨 생물환원 분석을 이용하여 세포 사멸 및 종점 Ad5 NAb 역가를 측정하였다. 1:25 미만 값을 갖는 종점 역가를 0의 값에 지정하였다.
통계.
면역 반응을 비교하는 통계 분석은 만-위트니 검정(PRISM, Graph Pad)을 이용하여 실시하였다. 생존 비교는 카플란-마이어 플롯(PRISM, Graph Pad)을 이용하여 실시하였다. Ad5 NAb 역가 및 CEA-특이적 CMI는 연속 변수로서 분석하였다. CEA-특이적 CMI에서 변화와 Ad5 NAb 역가의 연관성은 스피어만(Spearman) 상관계수로 검정하였다. 생존과 Ad5 NAb 역가의 연관성은 비례 위험 모형의 월드(Wald) 검정으로 검정하였다. 모든 검정은 0.05의 양측 α를 이용하였다.
인구통계자료: 모든 환자.
중앙값 3회(범위: 2->5)의 이전 화학치료 레지멘에 실패하고, 중앙값 90%(범위 70%-100%)의 수행 상태를 보이고, 중앙값 3개 부위(범위 1-5)의 전이성 질환을 갖는, 중앙값 58세(범위 38-77), 32명의 전이성 결장직장암 환자, 1명의 폐암 환자 및 1명의 방광암 환자가 등록하였다(표 2). 대부분의 환자가 모두 3회 면역화를 받을 수 있었다. 5명의 환자는 심각한 질환 진행으로 인해 모두 3회 면역화가 완료되기 전에 면역화를 정지하였다. 환자 인구통계자료는 표 3에 나타낸다.
[표 3]
인구통계자료: 결장직장 선암종 환자
중앙값 3회(범위: 2->5)의 이전 화학치료 레지멘에 실패하고, 중앙값 90%(범위 70%-100%)의 수행 상태를 보이고, 중앙값 3개 부위(범위 1-5)의 전이성 질환을 갖는, 중앙값 57.5세(범위 38-77)의 32명의 전이성 결장직장암 환자가 등록하였다(표 2). 대부분의 환자가 모두 3회 면역화를 받을 수 있었다. 4명의 환자는 심각한 질환 진행으로 인해 일찍 면역화를 정지하였다. 결장직장 선암종 환자 인구통계자료는 화학요법-난치성 결장직장암 환자의 이미 공개된 연구에 비해 우수하였다.
부작용
총 94회 면역 치료를 모든 환자에게 투여하였다. 어떤 백신 용량 수준에서도 치료 중단을 일으키는 용량 제한적 독성 및 심각한 이상 반응은 없었다. 가장 보편적인 독성(표 3)은 자가 회복되는(self limited) 주사 부위 반응이었다. 낮은 빈도로 발생한 다른 반응은 열, 플루 유사 증상, 식욕부진, 오한, 구역, 및 두통을 포함한다. 이들 증상은 또한 자가 회복 증상이며 아세토아미노펜과 같은 증상관련 조치 이외의 개입을 요구하지 않았다.
치료 전후에 혈액학, 화학, 및 ANA 값의 요약
Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 주사의 생물학적 결과는 증례 기록지(CRF)에 개별 환자의 혈액의 혈액학, 화학, 및 항핵항체(ANA) 값을 기록하여 모니터하였다. 시험을 시작한 총 34명의 환자 중에서, 28명이 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 모두 3회 치료를 받았다. 모두 3회 치료를 받은 28명의 환자 경우, 제0주(최초 치료 전) 혈액의 혈액학, 화학, 및 ANA 값을 제9주(3차 치료 후 3주)에 얻은 값과 비교하였다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료 후 화학 또는 ANA 값에는 유의한 변화가 없었다. 혈액의 혈액학 값에서 단지 하나의 유의한 변화가 있었다. 호염기구 계수는 치료 후 제9주에 유의하게(P=0.0403) 더 낮았다. 그러나 이 값은 호염기구의 정상 범위를 유지하였고, 종합적으로 유의한 생물학적 효과가 없었다.
임상 결과
기준선과 제9주에서 CEA 수준을 환자에서 평가하였다. 기준선 및 추적시 이용 가능한 CEA 수준을 가진 환자들 중에서, 3명(환자 010, 020, 및 024)은 면역화 기간 종료 시 CEA 수준이 증가하지 않았지만, 나머지 환자들은 CEA 수준증가를 보였다. 안정 변병을 가진 3명의 환자는 9주 연구 기간에 그렇게 유지하였다. 나머지 모든 환자는 약간의 수준의 진행 변병을 경험하였다(표 2). 코호트 1 및 2의 7명의 환자 중 5명이 사망하였고 2명의 환자가 면역화 개시 후 12개월에 생존하였다. 코호트 3 및 II 상의 21명의 환자 중, 10명이 사망하였고 나머지 모든 11명의 환자는 각각 12개월에 생존하였다. 코호트 5의 6명의 환자 중 3명은 사망하였고 3명의 환자는 각각 6, 7, 및 8개월에 생존하였다.
연구에 등록한 34명의 환자 중, 2명의 환자는 1회 치료를 받았고, 4명의 환자는 2회 면역화 치료를 받았고, 나머지 28명의 환자는 모두 3회 면역화 치료를 받았다. 모든 환자를 생존에 대해 추적하고 카플란-마이어 플롯 및 생존 비율을 실시하였다(PRISM 소프트웨어). 환자 사망은 사회보장 사망지표(SSDI) 데이터베이스 및 임상 차트로부터 수집된 정보에 의해 결정하였다.
코호트 1 및 2의 7명의 환자는 29%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 12A). 코호트 1 및 2의 환자 중에, 환자 004는 11개월 생존하였고 베바시주맙, 폴폭스, 및 젤로다로 추가의 면역화 후 치료를 받았다. 환자 003은 9개월 생존하였고 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역화 후 방사선 치료를 받았다. 12+개월에 생존한 환자 0005는 방사선 치료를 받고 면역화 후 또 다른 임상 시험을 시작하였고, 환자 010은 12개월까지 생존하였고 면역화 후 2회의 임상 시험에 들어갔다. 환자 002, 007, 및 008은 면역화 후 추가의 치료를 받지 않았으며, 각각 3, 1, 및 12+ 개월 생존하였다.
코호트 3 및 II 상의 21명 환자는 48%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 12B). 코호트 3 및 II 상의 환자 중에서, 1명의 환자(017)는 면역화 과정에서 세툭시맙을 병용하였다. 환자 020 및 021은 면역화 과정에서 베바시주맙을 병용하였다. 12개월 넘게 생존한 환자 011은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역화 후에 방사선 치료를 받았다. 환자 012 및 016은 각각 12개월 및 6개월 넘게 생존하였고, 면역화 후 추가의 화학요법 치료를 받았다. 환자 013은 4개월 생존하였고 면역화 후 넥사바로 치료받았다. 환자 015는 10개월 생존하였고 세툭시맙으로 후속 치료를 받았다. 환자 019는 12개월 넘게 생존하였고 프로토콜 면역화 후 베바시주맙 및 셀리리(xeliri)로 치료받았다. 환자 020은 12개월 넘게 생존하였고 면역화 후 베바시주맙으로 치료받았다. 환자 021은 12개월 넘게 생존하였고 베바시주맙과 젤로다로 후속 치료를 받았다. 환자 500은 12개월 넘게 생존하였고 세툭시맙 및 젤로다로 치료받고 면역화 후 임상 시험에 들어갔다. 환자 501은 12개월 넘게 생존하였고 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역화 후 세툭시맙과 이리노테칸으로 치료 받았다. 환자 508은 12개월 넘게 생존하였다; 그러나 이 환자의 특징에 대한 추가 데이터를 얻을 수 없었다. 환자 017, 023, 024, 025, 026, 502, 504, 506, 및 507은 면역화 후 추가의 치료를 받지 않았고 각각 3, 4, 12+, 7, 4, 3, 12+, 3, 및 12+개월 생존하였다(+는 작성 당시에도 여전히 생존한다는 것을 의미한다).
코호트 5의 6명의 환자는 50%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 12C). 상기 코호트의 환자 중에서, 1명의 환자(030)는 현재 8개월 생존하며 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 면역화 후 파조파닙과 스레숄드(threshold) 302 화학요법으로 치료받았다. 환자 031은 현재 7개월 생존하며 면역화 후 추가의 치료를 받지 않았다. 환자 032는 파니투무맙을 병용하였고, 6개월 생존하였고, 면역화 후 폴폭스로 치료 받았다. 환자 033은 파니투무맙을 병용하였고, 면역화 후, 추가 요법 없이 5개월 생존하였다. 환자 034는 현재 6+개월 생존하며, 면역화 후 방사선 및 젤로다 치료를 받았다. 환자 035는 2회 치료를 받았고 2개월 생존하였다.
중앙값 7.4개월 생존한 한 군(코호트 1, 2, 3/II 상, 및 코호트 5)으로서 모두 34명의 환자는 41%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 12D). 연구를 시작한 34명의 환자 중, 28명의 환자는 3회 면역화 치료를 받았고 중앙값 생존 10.625개월이며 55%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 13A). 결장직장 선암종 환자 경우, 27명 환자는 3회 면역화 치료를 받았고 중앙값 생존 10개월이며 53%의 12개월 생존 비율을 경험하였다(도 13B).
치료받은 전이성 결장직장암 환자에서 면역 매개변수의 평가
2번째 목적은 산물을 이용한 면역화 치료 후 CEA 특이적 면역 반응을 평가하는 것이었다.
수지상 세포는 이필리무맙과 병용하여 PSA-TRICOM 백신을 이용하는 임상 시험에 등록한 전립선암 환자(HLA-A2+ 및 -A24+)의 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)로부터 생성하였다; 백신접종 후 상기 환자의 PBMC를 이용하여, CEA, MUC1, 및 브라큐리에 특이적인 각각의 T-세포주를 확립할 수 없었다. 간략하게, PBMC는 림프구 분리 매질 구배를 이용하여 단리하고 AIM-V 배지(2x107 세포)에 재현탁하고 6-웰 플레이트에 부착하도록 2시간 두었다. 부착 세포를 100ng/ml의 재조합 인간(rh) GM-CSF 및 20ng/ml의 rhIL-4를 함유하는 AIM-V 배지에서 5일간 배양하였다. 배양 배지를 3일마다 재공급하였다.
ELISA에 의해 결정되는 바와 같이, CEA에 대한 항체 활성이 없다는 것이 확인되었다. 코호트 1, 코호트 2, 코호트 3/II 상, 및 코호트 5에서 치료받은 결장직장암 환자에서 CMI 반응을 평가하였다. PBMC는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 치료 전에, 모든 치료 후, 게다가 최종 치료 후 3주에 환자로부터 단리하였다. CEA 특이적 ELISpot 분석을 PBMC에 실시하여 시험관 내에서 CEA 펩티드에 노출 후 인터페론 γ(IFN-γ) 분비 림프구의 수를 결정하였다. 코호트 1, 코호트 2, 코호트 3/II 상, 및 코호트 5에서 치료받은 환자에서 면역 과정에서 최고의 CMI 반응을 시점과 무관하게(제3, 6, 또는 9주) 결정하였다. 상기 분석은 산물의 수준증가에 대한 용량 반응을 밝혔다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량의 5x1011 VP(코호트 5)를 받은 환자에서 일어났다(도14).
CEA에
대해 유도된
CMI
반응의 결정.
각 면역화 전과 최종 면역화 완료 후에 얻은 동결건조된 PBMC 시료에 ELISpot 분석을 수행하여 CEA-특이적 CMI 반응을 평가하였다. 최고 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 받은 환자에서 일어난 최고 크기의 CEA-특이적 CMI 반응으로 용량 반응 효과가 관찰되었다(도 14). 받은 용량 가운데, 코호트 1에서 0/3(0%) 환자가 양성 CEA에 대한 CMI 반응을 나타냈고, 코호트 2에서 1/4(25%) 환자가 양성 CEA에 대한 CMI 반응을 나타냈고, 코호트 3/II 상에서 10/19(53%) 환자가 양성 CEA에 대한 CMI 반응을 나타냈고, 코호트 5에서 4/6(67%) 환자가 양성 CEA에 대한 CMI 반응을 나타냈다. CEA-특이적 CMI의 유도의 시간 경과(도 15)는 최종 투여 전에 CEA CMI 크기에 플래토가 존재할 수 있다는 것을 증명하였다. 동일한 용량을 받은 최대 환자 군(코호트 3 + II 상)에서, 평균 94 SFC/106 PBMC로 6주 평가 시 평균 CEA에 대한 CMI 반응에서 기준선보다 유의한 증가(P<0.05, 만-위트니 검정)가 관찰되었으며, 이는 9주 평가까지 더 증가하였다(도 15). 1명의 환자(환자 번호 13)은 기준선 CEA-특이적 면역 반응이 매우 상승하였으며(1100 SFC) 제6주에 CMI가 상승하였지만(2305 SFC) 9주 평가에 복귀하지 않아 CEA CMI 분석에 포함되지 않았다.
또한, Ad5에 대한 Ad5 NAb 및 CMI를 측정하였으며 CEA-특이적 CMI와 관련시켰다. 각 환자는 이들의 혈청 및 PBMC 시료를 기준선(치료 전) 및 3회 치료 완료 후 제9주에 검사받았다. 본 연구에서 검사된 31명의 결장직장암 환자 중 19명(61%)은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료 개시 전에 혈청 시료 내 Ad5 중화 활성을 보였다. 모든 환자중에서 얻은 치료 전 평균 Ad5 NAb 역가는 1:189 ±1:71 SEM(기하 평균 1:21)였고 혈청 양성 환자 중에서 치료 전 평균 Ad5 NAb 역가는 1:308 ± 1:108(기하 평균 1:146)였다. 3회 면역화를 받은 환자의 혈청 시료의 분석은 이들 각각의 기준선과 비교할 때 제9주까지 유의하게 증가한 Ad5 NAb 역가를 나타냈다(P<0.0001, 만-위트니 검정)(평균 1:4767±1:1225 SEM(기하 평균 1:1541)(도 16). Ad5에 대한 CMI 반응에 대해 PBMC의 분석은 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 면역화 후 Ad5에 대한 CMI 반응에 유의한 증가를 보였다(P<0.01, 만-위트니 검정)(도 16).
높은 기준선 Ad5 면역(Ad5 NAb>200)을 가진 환자에 비해 낮은 기준선의 기존의 Ad5 면역(Ad5 NAb ≥200)을 가진 환자로부터 제9주 CEA에 대한 CMI 반응의 비교는 면역 반응에 유의한 차이가 없다는 것을 보였다(P>0.4, 만 위트니 검정)(도 17). 게다가, 최고의 CEA 특이적 CMI 반응을 기존의 또는 벡터 유도된 Ad5 NAb 활성과 비교할 때, CEA CMI와 Ad5 NAb 활성의 수준 사이에 연관성이 없었다(도 17). 상기 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 이용한 면역화가 자기 내성을 극복할 수 있을 뿐 아니라 기존의 및/또는 면역화 유도된 Ad5 면역이 존재하는데도 결장직장암 환자에서 CEA 특이적 면역 반응을 유도할 수 있었다는 것을 나타낸다. 전체적으로 상기 임상 시험 데이터는 1차 종점으로서 전체 생존을 이용하는 III 상 임상 시험으로의 진행을 지지한다.
부작용, 혈액학, 화학, 및 ANA 값
상기 I/II 상 시험에서, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)가 대규모로 제조하고, 또한 종래의 피하 주사 기술에 의해 용이하게 반복적으로 투여하기에 적합하다는 것을 증명하였다. 가장 보편적인 부작용은 주사 부위 반응, 및 열, 오한, 두통, 및 구역으로 이루어진 플루 유사 증상이었다. 혈액의 혈액학 또는 혈청 화학에 영향을 주지 않았으며, 종합적으로, 치료는 내약성이 우수하였다. 구체적으로, SAE가 전혀 확인되지 않았으며, 이상 반응으로 인해 치료가 전혀 중단되지 않았으며, 이는 상기 임상 적용에서 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)의 사용의 용량 한계에 직면하지 않았다는 것을 나타낸다.
상기 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료받은 진행성 결장직장암 환자가 심각한 부작용을 보이지 않으며 이들이 Ad5에 대한 기존의 면역을 가지는 경우에도 생명 연장을 경험할 수 있다는 것을 시사한다. 본 시험의 결과는 대규모, 무작위 배정, 단일 제제 시험으로 진행하기에 충분히 고무적이었다. 일부 환자가 용량의존적인 CMI 증가를 경험하였다는 관찰결과는 이것이 그들의 임상 결과에 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
[표 4] 이상반응
[표 5] 혈액학, 화학, 및 ANA 값
고찰
아데노바이러스 벡터는 일반적으로 이들이 특히 전이유전자 산물에 대해 강력한 후천 면역 반응을 유도하는 경향을 보이기 때문에 암 치료 백신으로 사용하기 위한 상당한 가능성을 갖는다. 그러나 동종 초회 감작/부스트 레지멘에 사용되는 재조합 1세대 Ad5 [E1-] 벡터는 기존의 Ad5 면역 및 벡터 유도된 면역의 존재로 인해 이들의 가능한 효능이 크게 제한받았다. 특히, Ad5에 대한 면역은 초창기 세대의 Ad5 [E1-] 기반 플랫폼에 편입된 TAA에 대한 면역 반응을 경감시킨다. 본 연구에 이용된 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼은 기존의 Ad5 면역의 표적인 항원의 제시를 피함으로써 동종 초회 감작/부스트 레지멘에 편의를 도모하고자 의도되었다. CEA는 국립 암연구소에 의해 최우선 암 항원 중 하나로서 확인되었기 때문에, 이 TAA는 암 치료 백신으로서 사용하기 위한 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼에 편입되는 전이유전자로서 연구되었다. 성인에서 CEA 발현은 보통은 위장관 상피에서 낮은 수준에 제한되지만 CEA는 결장 및 직장의 선암종 및 많은 유방암, 폐암 및 췌장암에서 과발현된다. 야생형 CAP1 에피토프와 비교하여, CAP1(6D)은 CTL의 감작을 상승시킬 수 있고 최근 CEA 기반 백신 구조물에 포함되었기 때문에 CEA의 HLA A2 제한된 CAP1(6D) 변형을 선택하였다. HLA 제한되지 않는 전장의 CEA가 사용되었기 때문에 HLA 유형에 대해 검사하지 않았지만, A*0201은 백인에서 가장 빈번하게 관찰되는 대립유전자이고(대립유전자 빈도 0.2717) 다른 집단에서 보편적이다. 그러나 HLA 유형에 대해 환자를 검사하고 HLA 유형과 임상 및/또는 CMI 반응 사이의 관계를 이용하는 것이 가능하다.
TAA CEA, (Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D))를 발현하는, 단일 용량 수준(1x1010 VP)의 상기 부류의 Ad5 백신의 3회 투여를 이용한 다중 피하 면역화를 CEA 발현 암의 전임상 쥣과 모델에서 시험하였다. 기존의 Ad5 면역을 가진 생쥐에서, 강력한 CEA에 대한 CMI 반응의 유도가 결과적으로 항-종양 활성을 일으킨다는 것을 증명하였고 이들 CMI 및 항-종양 반응이 현 세대 Ad5 [E1-] 기반 벡터 백신에 의해 유도된 반응보다 유의하게 더 크다는 것이 주목되었다. 추가의 동물 모델(암과 감염증 둘 다 표적화된)에서 신규 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼 기반 백신을 이용한 다중 피하 면역화가 현 세대의 Ad5 [E1-] 기반 백신의 CMI 반응보다 우수한 CMI 반응을 유도하며, Ad5 면역의 장벽을 극복할 수 있고, 강력한 CMI 반응의 생성을 요구하는 다중 면역화 레지멘에 이용될 수 있다는 것을 증명하였다. 최고 용량의 벡터를 받은 환자에서 최대 크기의 CEA에 대한 CMI 반응이 일어났다. CEA에 대한 CMI 반응은 기존의 및/또는 벡터 유도된 Ad5 면역이 존재하는데에도 용량에 반응하는 방식으로 유도되었다. ELISA 기술을 이용하여 백신접종 전 또는 후에 둘 다 CEA에 대한 항체 반응이 관찰되지 않았다. 백신에 의해 유도된 T 세포의 더 큰 기능성의 표시인, 면역화 후 다기능성 CD8+ T-세포 집단(활성화 시 하나 초과의 사이토카인을 분비하는 것)이 또한 관찰되었다. 상기 데이터는 진행된 결장직장 선암종 환자 및 많은 기타 백신으로 다루기 쉬운 질환 또는 적용에서 CEA에 대한 CMI 반응을 유도하고 증가시키기 위해 고안된 동종 초회 감작/부스트 레지멘에서 Ad5 [E1, E2b-]-CEA(6D) 벡터의 용도를 지지한다.
초기 1(E1) 유전자 영역 내 결실을 포함하는 초창기 세대의 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여, 초기 2b(E2b) 유전자 영역 내 추가의 결실을 가진 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 플랫폼은 벡터에서 지시된 염증 반응의 유의한 감소를 보여준다. 이는 결과적으로 더 긴 전이유전자 발현 및 그 외 유도된 염증 반응으로 인해 일어나는 전이유전자 발현 세포(예를 들어, 항원 제시 세포)의 제거의 감소를 일으킬 수 있다. Ad5 후기 유전자 항원 발현이 초창기 세대의 Ad5 플랫폼과 비교하여 유의하게 감소하기 때문에, 이는 Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼이 Ad5 면역 매개된 중화 활성을 상당히 더 긴 기간 동안 피하도록 할 수 있어, 결과적으로 더 우수한 수명 및 TAA 발현의 증폭을 일으킬 수 있었다. 게다가, E2b 유전자 산물인 폴리메라아제는 Ad5 감염에 대한 인간 세포 기억 면역 반응의 표적이고 백신에서 이것을 제거하면 기존의 Ad5 면역의 환경에서 백신의 능력을 발전시킬 수 있었다. 이론에 얽매이지 않더라도, 이러한 환경에서 벡터에 의해 연장되고/되거나 더 큰 발현은 결과적으로 표적 항원에 대해 더 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있었다. 그러나 이러한 벡터 형태는 기존의 면역의 회피보다는 이러한 벡터의 효능에 영향을 주는 더 우수한 전이유전자 발현, 상이한 생물분포, 또는 상이한 선천/후천 면역 효과를 일으키는 것이 가능하다.
본 연구에서 치료받은 환자가 유리한 생존 확률을 보인다는 결과는 흥미롭다. 종합적으로, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 2회 이상 치료받은 모두 25명의 환자는 48%의 12개월 생존 확률을 나타냈으며 이는 유의한 수준의 기존의 Ad5 중화 항체 역가가 존재하는데에도 달성되었다. 이론에 얽매이지 않더라도, 환자의 면역계를 끌어들임으로써, 활성 면역치료제, 예를 들어 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)는 장기간에 걸쳐 지속적인 면역학적 항-종양 반응을 유도할 수 있고, 이는 결과적으로 표준 반응 평가에 의해 측정되지 않은 종양의 신속한 성장 속도 또는 확산의 특정 측면에서 "감속" 또는 "변경"을 일으킬 수 있다. 실제로, 확립된 CEA 발현 종양을 보유하는 Ad 면역 생쥐에서 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 치료 후 더 느린 종양 진행이 관찰되었다. 게다가, 전체 생존이 임의의 가능한 암(면역) 요법의 임상 효능의 결정을 위한 유일한 정확한 매개변수일 수 있다는 것이 주목되었다.
실시예
5: 전이성
대장임에서
CEA(6D)의
면역 치료제의 임상 연구
Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)를 이용한 mCRC에서 I/II 상 임상 시험: 이 첫 번째 인간 I/II 상 투여시험에서 목표는 안전성을 평가하고, mCRC 환자에서 CEA-특이적 면역 반응을 평가하고, 전체 생존에 대한 데이터를 얻는 것이다. FDA-승인된 IND14325 하에 시험을 수행하고 "Clinicaltrials.gov"에 등록하였다(NCT01147965). Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 용량을 다음과 같이 3주마다 3회 치료를 피하(sc)로 투여하였다: 코호트 1(3명 환자)는 각 치료에 109 VP를 받았고; 코호트 2(3명 환자)는 1010 VP를 받았고; 코호트 3/4(21명 환자)는 1011 VP를 받았고; 코호트 5(5명 환자)는 5x1011 VP를 받았다.
환자 인구통계자료:
CEA 발현 암을 가진 32명 mCRC 환자가 본 연구에 등록되었다. 등록된 32명 mCRC 환자는 중앙값 58세(범위 38-77)이고, 중앙값 3회(범위: 2->5)의 이전 화학치료 레지멘을 실패하고, 중앙값 90%(범위 70%-100%)의 수행 상태를 보이고, 중앙값 3개 부위(범위 1-5)의 전이성 질환을 보였다. 대부분의 환자가 모두 3회 면역화를 받았다. 면역을 정지한 환자는 심각한 질환 진행으로 인해 그렇게 하였다. mCRC 인구통계자료는 화학요법-난치성 mCRC를 이용한 이미 공개된 연구에 비해 우수하였다.
부작용:
어떤 용량 수준에서도 치료 중단을 일으키는 용량 제한적 독성 및 심각한 이상 반응은 없었다. 가장 보편적인 독성은 자가 회복되는 주사 부위 반응이었다. 제0주(1차 치료 전)에 혈액의 혈액학, 화학, 및 항핵항체(ANA) 값을 제9주에 얻은 값과 비교하였다. 화학, 혈액학, 또는 ANA 값에서 생물학적으로 관련된 변화는 없었다.
임상 결과:
환자는 면역 요법 전 30일 동안에 항암 치료를 중단시켰다. Kras 야생형 및 돌연변이된 환자 둘 다 등록하였다.
mCRC 환자를 장기간 생존을 추적하여 카플라-마이어 생존 플롯을 작성하였다(PRISM 소프트웨어). 사회보장 사망지표 데이터베이스 및 임상 차트로부터 반응을 결정하였다. 중앙값 전체 생존은 11개월이었고 전체 생존은 18개월에 30%이고 29개월에 20%였다(도 18).
면역 반응:
두 번째 목적은 면역요법 중에 CEA-특이적 면역 반응을 평가하는 것이었다. 또한, mCRC 환자가 치료받은 가장 많은 수의 환자를 나타냈기 때문에, 이들에 대해 면역원성 연구를 수행하였다. ELISA에 의해 결정된 바와 같이 혈청 시료에서 CEA에 대한 항체 활성은 검출되지 않았다.
모든 코호트에서 치료받은 mCRC 환자의 CMI 반응을 평가하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 각 면역요법 치료 전후, 및 최종 치료 후 3주에 환자로부터 단리하였다. CEA-특이적 ELISpot 분석은 앞서 기재된 바와 같이 PBMC에 실시하여 CEA 펩티드에 노출 후 IFN-γ-분비 세포(SFC) 수를 결정하였다. 면역화 과정에서 최고의 CMI 반응은 시점과 무관하게(제3, 6, 또는 9주) 결정하였다. 본 분석은 백신 수준의 증가와 용량 반응과의 관계를 밝혔다(도 19); 최고의 CMI 수준은 최고 용량의 5x1011 VP(코호트 5)를 받은 환자에 일어났으며, 대부분(61%)의 환자에서 기존의 Ad5 면역이 존재하는데에도 반응이 관찰되었다. 시간 경과에 따라 일련의 PBMC 시료의 분석은 CEA에 대한 CMI 반응이 3회 면역화 과정에 걸쳐 유도되고 증가하였다는 것을 나타냈다(도 20).
간략하게, CMI(IFN-γ 분비)는 기준선에서(전)와 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)의 투여 후(후)에 평가하였다. 치료 후 환자에서 관찰된 최고의 CMI 반응(시점과 무관하게)은 용량 반응을 나타냈다. 최고의 CMI 수준은 최고 용량을 받은 환자(코호트 5)에서 일어났으며 유의하게 상승하였다(P<0.02; 만-위트니 검정). 반응의 특이성은 무관한 항원 β-갈락토시다아제 및 HIV-gag와의 반응성의 결여로 증명하였다. 양성 대조군 경우, PBMC는 코카나발린 A에 노출시켰다. 값 = 평균 ± SEM (도 19).
간략하게, 면역된 mCRC 환자에서 CMI(ELISpot IFN-γ SFC) 반응은 제0, 3, 6, 및 9주에 평가하였다. 면역화 과정에서 CMI 반응의 증가에 주목한다. 값 = 평균 ± SEM (도 20).
유세포
분석을 이용한 치료받은
mCRC
환자에 대한 추가적인 면역 분석
CEA 펩티드에 노출 후 높은 CMI 활성(>1000 ELISpot IFN-γ SFC)을 가진 환자의 PBMC를 검사하는 유세포 분석은 다기능 세포가 존재한다는 것을 증명해주는 CD8+/IFN-γ+ 세포(3.5%), CD8+/IFN-γ+/TNF-α+ 세포(1.0%), CD4+/IFN-γ+ 세포(0.4%), 및 CD4+/IFN-γ+/TNF-α+ 세포(0.2%)를 밝혔다.
환자 PBMC 시료는 또한 유세포 분석에 의해 HLA-A2에 양성적으로 검사되었으며, 검사된 시료 중 63%는 HLA-A2 양성이었다. 환자마다 달성된 최고의 CMI 반응 수준을 HLA-A2의 존재와 관련하여 평가할 때, HLA-A2+와 HLA-A2- 환자 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(264.6±119.0 IFN-γ SFC vs 165.6±108.1 IFN-γ SFC).
세포용해성 T 림프구(CTL) 반응의 유도를 평가하기 위해서, 그랜자임 B 활성에 대한 ELISpot 분석을 수행하였다. 그랜자임 B는 과립 매개된 경로를 통해 표적 세포 사멸의 주요 매개물질이고 이펙터-표적 상호작용 시 세포용해성 림프구에 의한 그랜자임의 방출은 CTL의 지표가 된다. 그랜자임 B ELISpot 분석법은 상당히 더 민감하고 세포독성 이펙터 세포 빈도의 평가를 제공하기 때문에 이는 51Cr-방출 분석법에 비해 우수한 대안이 된다.
PBMC에서 그랜자임 B 활성 증가가 면역화 후에 관찰되었다(도 16). 중요하게는, 5명의 mCRC 환자의 PBMC 시료에 대해 연장된 추적 조사에서, CMI 반응이 면역화가 중지된 후 감소한다는 것이 관찰되었으며(도 22), 이는 추가의 "부스터" 면역화가 유도된 CEA에 대한 CMI 활성을 유지하는데 필요할 수 있다는 것을 나타낸다.
간략하게, CTL 반응(ELISpot 그랜자임 B 분비 SFC)은 치료 전(제0주)과 후 (제6-9주)에 평가하였다. 반응은 면역화 후에 증가하였다(P < 0.05 i). 값 = 평균 ± SEM (도 21).
간략하게, 5명의 환자의 PBMC 시료를 ELISpot IFN-γ SFC에 의해 평가하였다. CMI 반응은 제9주에 피크를 이루었으며 치료가 정지된 후 제26주까지 감소하였다(도 22).
상기 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D)로 다중의 동종 면역화가 기존의 Ad5 중화 활성에도 환자에서 CEA-특이적 CMI 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 데이터는 중요하게는 최소 독성이 존재하였고 유리한 전체 생존 프로파일이 관찰되었다는 것을 나타낸다. 최종적으로, 결과는 신규 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 유전자 전달/발현 플랫폼이 TAA에 대한 내성을 극복하고 자연적으로 획득된 Ad5-특이적 면역의 환경에서 CEA에 대한 유의한 CMI 반응을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
6: 임상 등급의 다중
표적화
백신의 GLP 생산
본 실시예는 우수 실험실 운영(GLP) 기준을 이용하여 임상 등급의 다중 표적 백신의 생산을 보여준다. 앞서, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 산물은 우수 제조 운영 기준에 따라 GLP 조건 하에서 5 L 세포 생물반응기를 이용하여 생산하였다. 본 실시예는 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 산물이 유사한 접근법을 이용하여 5 L 세포 생물반응기에서 생산될 수 있다는 것을 보여준다.
간략하게, E.C7 제조 세포주의 바이알을 해동시켜, T225 플라스크로 옮기고, 10% FBS/4 mM L-글루타민을 함유하는 DMEM 중에 37℃, 5% CO2에서 초기 배양할 것이다. 증식 후, 10-층 셀스택스(CellSTACKS)(CS-10)를 이용하여 E.C7 세포를 증식하고 프리스타일(FreeStyle) 혈청-무첨가 배지(SFM)로 옮길 것이다. E.C7 세포를 세포 생물 반응기에서 SFM 중에 37℃, 5% CO2에서 24시간 목표 밀도 5x105 세포/mL까지 배양할 것이다. 그 후 E.C7 세포를 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 각각 감염시키고, 48시간 배양할 것이다.
IND14325 하에서 임상 등급 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 산물을 제조하는데 사용되는 바와 동일한 방법으로 중류(Mid-Stream) 공정을 실시할 것이다. 수거 전 30분에, 벤조나아제 뉴클레아제를 배양물에 첨가하여 농축을 위해 더 우수한 세포 펠렛 형성을 촉진할 것이다. 원심분리에 의해 펠렛을 형성한 후, 상등액을 버리고 펠렛을 1% 폴리소르베이트-20을 함유하는 용해 완충액에 실온에서 90분간 재현탁할 것이다. 그 후 용해액을 벤조나아제로 처리하고 5M NaCl을 첨가하여 반응을 켄칭할 것이다. 슬러리를 원심분리하고 펠렛을 버릴 것이다. 용해액을 여과하여 맑게 하고 2-컬럼 이온 교환 절차를 거칠 것이다.
백신 산물을 정제하기 위해, 2-컬럼 음이온 교환 절차를 실시할 것이다. 제1 컬럼을 Q 세파로스(Sepharose) XL 수지로 채우고, 살균하고, 로딩 완충액으로 평형화할 것이다. 맑게 된 용해액을 컬럼에 로딩하고 로딩 완충액으로 세척할 것이다. 백신 산물을 용리하고 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리를 포함하는 주요 용리 피크(용리액)는 다음 단계로 옮길 것이다. 제2 컬럼을 소스(Source) 15Q 수지로 채우고, 살균하고, 로딩 완충액으로 평형화할 것이다. 제1 음이온 교환 컬럼의 용리액을 제2 컬럼에 로딩하고 백신 산물을 100% 완충액 A(20 mM 트리스, 1 mM MgCl2, pH 8.0)에서 시작하여 50% 완충액 B(20 mM 트리스, 1 mM MgCl2, 2M NaCl, pH 8.0)로 이동하는 구배로 용리할 것이다. Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리를 포함하는 용리 피크를 수집하고 2-8℃에서 보관할 것이다. 피크 용리 분획을 농축을 위한 접선 유동 여과(TFF) 시스템 및 제제 완충액(20 mM 트리스, 25 mM NaCl, 2.5%(v/v) 글리세롤, pH 8.0)에 대한 투석 여과를 통하여 처리할 것이다. 처리 후, 최종 백신 산물은 멸균 여과하여 분액으로 나누고 ≤ -60℃에서 보관할 것이다. 전형적으로 100% 순도에 근접하는 매우 정제된 산물이 생산되며 이들 산물에 대해 유사한 결과가 예측된다.
생산된 VP 산물의 농도 및 총수는 분광광도법으로 결정할 것이다. 산물 순도는 HPLC로 평가한다. 감염 활성은 키트를 이용하여 감염성 입자에 대해 Ad5 헥손 염색 분석법을 실시하여 결정한다.
mMUC1-C 또는 브라큐리 발현을 확인하기 위해서 벡터로 형질감염된 A549 세포의 용해액을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시할 것이다. 최종 백신 산물이 마이코플라스마가 없고, 미생물 생균수를 갖지 않으며, mL당 2.5 미만의 내독소 단위(EU)의 내독소 수준을 나타낸다는 것을 결정하기 위해서 품질 관리 검사를 실시할 것이다. 면역원성을 확인하기 위하여, 각 벡터를 하기에 기재된 바와 같이 생쥐에서 시험할 것이다(실시예 7).
실시예
7:
디중
표적화
CEA
,
MUC1
, T 바이러스 벡터의 면역원성
본 실시예는 CEA, MUC1 및 T(브라큐리)에 대한 다중 표적화 백신을 이용한 면역원성 결과를 보여준다. 각 바이러스 벡터 산물은 순도, 감염도, 및 항원 발현에 대해 본원에서 기재된 바와 같이 시험하였으며 각각은 기준을 통과하였다.
백신접종 및 비장 세포 제조
암컷 C57BL/6 생쥐(n=5)에 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 또는 1010 VP의 모두 3가지 바이러스의 1:1:1 비율의 조합(Tri-Ad5)으로 피하 주사하였다. 대조군 생쥐에 3 x 1010 VP의 Ad-눌(전이유전자 삽입체 없음)로 주사하였다. 용량은 25 ㎕의 주사 완충액(3% 수크로오스 포함 20mM HEPES)로 투여하고 생쥐에 14일 간격으로 3회 백신접종하였다. 최종 주사 후 14일에 비장 및 혈청을 수집하였다. 혈청은 -20℃에서 냉동하였다. 70 μM 나이론 세포 여과기(BD Falcon, 캘리포니아주 산 호세 소재)를 통과하여 비장을 서서히 밀어넣어 비장 세포 현탁액을 생성하였다. 적혈구는 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 첨가하여 제거하였고 비장 세포는 2회 세척하고 R10(L- 글루타민(2 mM), HEPES(20 mM), 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPM1640)에 재현탁하였다. 비장 세포는 ELISPOT 및 유세포 분석에 의해 사이토카인 생산에 대해 분석하였다.
면역원성 연구:
이전 연구는 다중 표적화 백신 혼합물에 의해 생성된 유도된 면역을 평가한다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로 면역화는 용량 의존적이고 통상적으로 용량당 1x1010 VP를 사용하였다. C57Bl/6 생쥐의 군(N=5)을 사용하였다.
이는 C57Bl/6 생쥐에 3x1010 바이러스 입자(VP) Ad5 [E1-, E2b-]-눌(공벡터 대조군), 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D), Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C, 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리의 1:1:1 혼합물을 포함하는 3x1010 VP를 포함하는 Tri-면역화로 2주 간격으로 3회 피하 주사하였던 연구이다.
(8-12,14)에 기재된 바와 같이 CEA, MUC1, 또는 브라큐리 펩티드 풀에 각각 노출 후 IFN-γ 분비 세포(SFC)에 대해 ELISpot 분석법을 이용하여 최종 면역화 접종 후 2주에 CMI 활성을 결정하였다.
면역된 생쥐에서 유의한 CMI 반응이 확인되었다(도 23). CEA 펩티드에 노출 후 비장 세포에서 세포 내 사이토카인 염색을 이용한 유세포 분석을 수행하여 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 양을 평가하였다.
간략하게, IFN-γ 분비 비장 세포(SFC)에 대한 ELISpot에 의해 평가된 CEA, MUC1, 및 브라큐리에 대한 CMI 반응은 다중 표적화 면역된 생쥐에서 검출되었으나 대조군 생쥐(Ad5-눌 공벡터로 주사된)에서는 검출되지 않았다. ELISpot 분석 반응의 특이성은 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드 항원의 반응성의 부재로 확인하였다. 양성 대조군은 콘카나발린 A(ConA, 데이터 미제시)에 노출된 세포를 포함하였다. 값 = 평균 ± SEM (도 23).
ELISpot
분석법
브라큐리-, CEA- 및 MUC1-특이적 IFN-γ- 또는 IL-2-분비 T 세포를 상기에 기재된 바와 같이 새로 단리된 생쥐 비장 세포로부터 ELISpot 분석법에 의해 결정하였다. 간략하게, 2 x105 비장 세포를 브라큐리 또는 CEA, 또는 MUC1로부터 유래한 단일 풀 내 0.2 ㎍/웰의 중복 15-mer 펩티드로 자극하였다. 양성 대조군으로서 세포를 웰당 0.0625 ㎍의 농도의 ConA로 자극하고 SIV-Nef 및 SIV-Vif로부터 유래한 중복 15-mer 전체 펩티드를 무관한 펩티드 대조군으로서 사용하였다. SFC의 수는 이뮤노스팟 ELISpot 플레이트 판독기를 이용하여 결정하고 결과는 106 비장 세포당 SFC의 수로 기록하였다.
TNF-α 및 IFN-γ 발현 다기능성 CD4+ 및 CD8+ 세포는 면역된 비장 세포에서는 검출되었으나 대조군 비장 세포에서는 검출되지 않았다(도 24). 또한, 정제된 CEA 단백질을 이용한 앞서 기재된 정량 ELISA 분석법을 이용하여 유도된 CEA 항체를 검출하기 위하여 혈청에 검사를 실시하였다. IFN-γ 및 TNF-α를 발현하는 다기능성 CD8+(위) 및 CD4+(아래) 세포는 다중 표적화 백신(오른쪽)으로 면역된 생쥐(오른쪽)에서 검출되었고 Ad5-눌로 주사된 대조군 생쥐(왼쪽)에서는 검출되지 않았다. 반응의 특이성은 배지 단독 또는 무관한 SIV-nef 또는 SIV-vif 펩티드에 대한 반응성의 결여로 확인하였다. 값 = 평균 ± SEM (도 24).
CEA에 대한 유의한 항체 반응은 면역된 생쥐에서는 검출되었으나 대조군 생쥐에서는 검출되지 않았다(도 8). 보체 의존성 세포 세포독성(CDCC)의 수준을 결정하기 위해서, 쥣과 MC38-CEA 표적 세포를 이용하여 CDCC 검사를 실시하였다. 유의한 CDCC 활성은 면역 생쥐의 혈청에서는 검출되었지만 대조군 생쥐(Ad5-눌로 주사된)에서는 검출되지 않았다(도 25). 유의한 (P<0.0001) CEA 항체(왼쪽) 및 CDCC(오른쪽) 반응은 다중 표적화 백신으로 면역된 생쥐에서 유도되었으나 대조군 생쥐에서 유도되지 않았다. 값 = 평균 ± SEM(도 25).
세포 내 사이토카인 자극
비장 세포를 상기에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 96웰 U-바닥 플레이트에 웰당 1x106 생존 비장 세포를 이용하여 자극 분석을 수행하였다. 브라큐리, CEA 및 MUC1의 전체 코딩 서열을 포함하는 중복 펩티드 풀을 11개 아미노산 중복을 갖는 15-mer로서 합성하고 동결건조된 펩티드 풀을 DMSO에 용해시켰다. SIV-Vif 및 SIV-Nef에 상응하는 유사하게 제작된 펩티드 풀은 표적 이탈(off-target) 대조군으로 역할을 하였다. R10 배지(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 및 항생제) 내 비장 세포는 2 ㎍/mL/펩티드의 펩티드 풀을 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 6시간 자극하면서, 단백질 운반 억제제(GolgiStop, BD)를 인큐베이션에 2시간 첨가하였다. 그 후 자극된 비장 세포를 림프구 표면 마커 CD8α 및 CD4에 대해 염색하고, 고정하고, 투과성으로 만든 후, IFN-γ 및 TNFα의 세포 내 축적에 대해 염색하였다. 생쥐 CD8α, CD4, IFN-γ, 및 TNFα에 대한 항체를 사용하여 항-CD16/CD32의 존재하에서 염색을 실시하였다. 유세포 분석을 수행하고 BD 어큐리(Accuri) C6 소프트웨어에서 분석하였다.
보체
의존성 세포독성 분석(
CDC
)
MC38-CEA2 종양 세포는 96웰 조직 배양 마이크로플레이트에서 웰당 2x104 세포의 밀도로 하룻밤 배양하였다. 모은 열 불활성화된 생쥐 혈청을 1:50 희석하여 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후, 보체 공급원으로 토끼 혈청을 1:50 희석하여 첨가하고 세포를 37℃에서 추가 2.5시간 인큐베이션하였다. 세포 배양 상등액을 프로메가 사이토톡스(Promega Cytotox) 96 비방사성 세포독성 분석을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 분석하였다. MC38-CEA2 세포의 퍼센트 용해율은 식 % 용해율 = (실험 - 표적 자발적) / (표적 최대 - 표적 자발적) x 100%로 계산하였다.
항종양 면역요법 연구:
각각 확립된 CEA, MUC1, 또는 브라큐리 발현 종양을 갖는 생쥐의 면역요법 연구에서 Ad5 [E1-, E2b-]-기반 Tri-백신의 항종양 능력을 검사하기 위해 연구를 수행하였다. 본 연구에서 Ad5 [E1-, E2b-]-기반 Tri-백신의 각각의 구성요소의 항종양 활성을 평가하였다.
C57Bl/6 생쥐 군(n=7)의 오른쪽 옆구리에 5x105 CEA, MUC1, 및/또는 브라큐리 발현 쥣과 종양 세포를 피하 주사하였다. 촉지성 종양을 확인한 후, 생쥐에 각각 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-눌(전이유전자 없음, 예를 들어, 공벡터), Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D), Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C, 및/또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 각각 3회 피하 주사로 처리하였다. 종양 부피를 계산하고 종양 성장 곡선을 작성하였다. 치료의 통계학적 평가에 군당 7-10마리 생쥐가 충분하다.
생체 내 종양 치료 연구에서, 8-10주령 암컷 C57BL/6 생쥐의 왼쪽 옆구리에 106 MC38-MUC1 세포를 이식하였다. 생쥐에 1010 VP 아데노-MUC1 또는 Tri-Ad5로 7일 간격으로 3회 처리하였다. 대조군 생쥐에 3 x 1010 VP의 아데노-눌을 주사하였다. 종양 성장은 2개의 서로 다른 크기(a, b)를 측정하고 부피를 식 V=(a x b)2/2에 따라 계산하여 평가하였다. 식에서, 더 짧은 크기가 "a"였다. 종양이 1500 m3에 도달하거나 심각하게 궤양이 생길 때 종양 연구를 종료하였다.
면역요법에 의해 처리된 MUC1 발현 종양 보유 생쥐에서 유의한 항-종양 활성 및 생존 증가가 있었다(도 26). 중요하게는, 유세포 분석법을 이용하여 MC38-MUC1 세포주가 PDL1을 발현하고 이들의 존재에도 항-종양 활성이 달성되었다는 것을 결정하였다. C57Bl/6 생쥐(n=7/군)의 왼쪽 옆구리에 MC38-MUC1 발현 종양 세포를 피하 접종하고 제0, 7, 14일에 1010 VP의 Ad5-눌(공벡터) 또는 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C을 오른쪽 옆구리에 투여하였다.
Ad5 [E1-, E2b-]-mMUC1-C로 처리된 생쥐는 대조군(위)와 비교하여 제15 및 18일에 유의하게(P <0.05) 더 작은 종양과 유의하게 더 긴 생존(아래)을 보였다. 값 = 평균 ± SEM. 실험은 제36일에 종료하였다(도 26).
Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리를 이용한 생쥐의 면역요법은 결과적으로 종양을 감소시켰다(도 27). 간략하게, C57Bl/6 생쥐의 왼쪽 옆구리에 MC38-브라큐리 발현 종양 세포를 피하 접종하고 제5, 11, 및 17일에 오른쪽 옆구리에 1010 VP의 Ad5-눌(공벡터)(N=4) 또는 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리(N=5)를 투여하였다. 종양은 제15, 19, 및 22일에 처리된 생쥐에서 더 작았다. 값 = 평균 ± SEM (도 27).
더 많은 수의 생쥐를 처리하여 유의한 항-종양 활성을 보이고, 면역 경로 관문 조절 인자, 예를 들어 항-관문 억제제 항체와 면역요법을 병용하여 항종양 활성이 향상되는지를 결정할 것이다.
실시예
8: 재조합 바이러스 벡터에 의한 인간 T 세포 활성화의 시험관 내 확인
종양 세포 배양
인간 결장 암종 SW620(HLA-A2+, HLA-A24+, 브라큐리+, MUC1+, CEA+) 및 췌장 암종 ASPC-1(HLA-A1+, HLA-A26+, MUC1+) 세포주를 사용하였다. 세포 배양물은 마이코플라스마가 없었으며 완전 배지(10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640) 중에 유지시켰다.
사이토카인의 검출
IL-2-미포함 배지 중에서 아데노바이러스 벡터로 감염된 DC 또는 펩티드-펄스된 DC로 24시간 자극된 T 세포의 상등액을 ELISA 키트를 이용하여 IFN-γ의 분비에 대해 평가하였다. 본 분석에 사용된 항원 특이적 T-세포주는 이전에 보고하였다: (a) HLA-A2 CEA-특이적 CTL, (b) HLA-A2 MUC1-특이적 CTL, (c) HLA-A24 MUC1-특이적 CTL, 및 (d) HLA-A2 브라큐리-특이적 CTL.
세포독성 분석
간략하게, 표적 세포는 50 μCi의 산화인듐(111In)으로 37℃에서 20분간 표지하고 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트에서 웰당 3,000 세포로 사용하였다. T 세포를 다양한 비율로 첨가하고 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 감마 계수를 위해 상등액을 수거하였다. 3중 중복으로 측정을 수행하고 SD를 계산하였다. 자발적인 방출은 표적 세포를 단독 배지와 인큐베이션하여 결정하고 완전 용해는 0.25% 트리톤 X-100과 인큐베이션하여 결정하였다. 특이적 용해는 하기 식을 이용하여 계산하였다: 용해율(%) = [관찰된 방출(CPM) - 자발적 방출(CPM)] / [완전 방출(CPM)- 자발적 방출(CPM)] x 100.
Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D), 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 벡터를 이용하여 수지상 세포(DC) 기능 및 항원 특이적 T 세포 활성화를 평가하기 위해서 시험관 내 연구를 수행하였다. 간략하게, 인간 DC는 IL-2 및 GM-CSF 포함 배지에서 6-7일간 배양하였다. AIM-V 배지에서 배양된 DC는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D), 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리, 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌(공벡터)로 감염시키고 2일간 인큐베이션하였다. 비감염된 DC는 대조군으로 사용하였다.
그 후 인간 DC 세포는 평균 형광 세기로 측정되는 CD80(DC 성숙에 대한 마커), CD83(DC 성숙에 대한 마커), CD86(DC 마커) 및 DR(DC 마커)의 발현에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, Ad5 [E1-, E2b-]-기반 벡터를 이용한 DC의 감염은 인간 DC의 활성화 및 성숙을 유도하였다.
[표 6]
1 mL의 AIM-V 배지 중 수지상 세포(2x105)는 6-웰 플레이트에서 명시된 감염 다중도(10,000 또는 20,000의 MOI)의 아데노바이러스 벡터(Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리, 및 Ad5 [E1-, E2b-]-눌)로 1시간 감염시켰다. 그 후 AIM-V 배지(4 mL)를 각 웰에 첨가하고 추가 2일간 인큐베이션하였다. 전이유전자 발현의 효능을 분석하기 위해서, DC를 수거하고 유세포 분석법 및 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 표현형 분석을 위해, BV421-접합된 항-CD80, PerCP Cy5.5-접합된 항-CD83, APC-Cy7-접합된 항-HLA-DR, PE-접합된 항-CD86, 및 FITC-접합된 항-CEA을 이용하여 DC를 CD80, CD83, CD86, CEA, 및 HLA-DR의 발현에 대해 염색하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, Ad5 벡터는 인간 DC의 성숙 및 활성화를 유도하였다. 인간 수지상 세포(DC)의 감염을 위해 명시된 아데노바이러스 벡터를 10,000 또는 20,000 감염 다중도(MOI)의 농도로 사용하였다. CD80, CD83, CD86 및 HLA-DR의 발현은 유세포 분석법으로 분석하였다. 결과는 양성 세포의 %로 나타냈다(평균 형광 세기).
[표 7]
감염된 인간 DC가 인간 항원 특이적 T-세포주를 자극하여 IFN-γ를 분비할 수 있는지를 결정하기 위해서, 감염된 DC를 항원 특이적 T-세포주와 인큐베이션하고 IFN-γ 분비 활성에 대해 시험하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리로 감염된 각각의 HLA-A2+ DC와 인큐베이션된 CEA 또는 브라큐리 항원 특이적 HLA-A2+ T-세포주만이 자극되어 IFN-γ를 분비하였다. IFN-γ 분비는 대조군에서 검출되지 않았다. Ad5 [E1-, E2b-]-기반 벡터로 HLA-A2+ DC의 감염은 항원 특이적 T-세포를 활성화하여 IFN-γ를 생산할 수 있다.
[표 8]
HLA-A2+ DC는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리의 혼합물로 감염시켰다. 자가 PBMC를 이용하여 특이적 세포독성 HLA-A2+ T-림프구(CTL)를 생성하는데 감염된 DC를 사용하였다. 자가 DC는 3회의 시험관 내 자극(IVS)을 위한 APC로 사용하였다. CEA 또는 브라큐리로 펄스된 자가 B 세포를 사용하여 3회 IVS 후에 항원 특이적 CTL을 재자극하였다. 이펙터 T 세포 대 표적 종양 세포 비율은 30:1이었고 퍼센트 세포용해성 활성을 결정하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이, Ad5 [E1-, E2b-]-CEA(6D) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리의 혼합물을 이용한 HLA-A2+ DC의 감염은 항원 특이적 세포용해성 T-세포를 생성할 수 있었다. 세포용해성 활성은 HLA-A2 의존적 방식으로 검출하였다
[표 9]
감염된 인간 DC가 인간 항원 특이적 T-세포주를 자극하여 표적 종양 세포를 용해시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 인간 DC(IL-4 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)에서 6일 배양물, 0.5 mL의 AIM-V 중 2x104 세포/웰)을 20,000 감염 다중도(MOI)의 명시된 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 48시간 후에, DC를 세척하고 인간 항원 특이적 T 세포의 자극에 사용하였다. 결과는 1x105 T 세포/ml당 pg/ml의 IFN-γ로 나타냈다. 표 10은 CEA, MUC1, 또는 브라큐리를 코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용한 인간 DC의 감염이 항원 특이적 T-세포주를 활성화할 수 있다는 것을 증명해준다. 굵은 체의 숫자는 비감염된 DC를 가진 상응하는 웰과 비교하여 IFN-γ 분비의 유의한 상승을 나타낸다.
[표 10]
HLA-A2 및 -A24 공여자의 인간 DC(IL-4 및 GM-CSF에서 6일 배양물)를 0.5 mL의 AIM-V 중 2 x 104 /웰(24웰 플레이트)의 Tri-Ad5 벡터로 감염시켰다. Tri-Ad5 벡터는 20,000 MOI로 1시간 사용한 후 1.5 mL의 AIM-V를 각 웰에 첨가하였다. 감염된 DC는 48시간 인큐베이션한 후 인간 항원 특이적 T 세포의 자극에 사용하였다. 결과는 1x105 T 세포/ml당 pg/ml의 IFN-γ로 나타냈다. 굵은 체의 숫자는 비감염 DC를 가진 상응하는 웰과 비교하여 IFN-γ 분비의 유의한 상승을 나타낸다.
CEA-, MUC1- 및 브라큐리-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)을 생성하였다. 수지상 세포(1 mL의 AIM-V 중에 1-2x105/웰)를 20,000 MOI의 Tri-Ad5로 상기에 기재된 바와 같이 감염시켰다. 감염된 DC는 자가 비부착 세포의 자극을 위한 APC로서 10:1의 이펙터-APC 비율로 사용하였다. 배양물을 5% CO2를 함유하는 가습 대기 중에 37℃에서 3일간 인큐베이션하였다. 그 후 배양물에 rhIL-2를 7일간 보충하였다; IL-2 함유 배지를 3일 마다 보충하였다. 10일 자극이 1회 시험관 내 자극(IVS) 주기를 구성하였다. 자가 벡터-감염된 DC는 3회 IVS를 위한 APC로 사용하였다. 자가 펩티드-펄스된 B 세포를 사용하여 3회 IVS 후에 항원 특이적 CTL을 재자극하였다. T-세포주는 IL-7 및 IL-15(10 ng/ml)를 함유하는 배지에 유지시켰다.
전립선암 환자의 인간 DC(IL-4 및 GM-CSF에서 6일 배양; 0.5 mL의 AIM-V 중에 2x104 세포/웰)는 20,000 MOI의 Tri-Ad5로 감염시켰다. 48시간 후에, 감염된 DC를 세척하고 이펙터로서 자가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용하여 특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 생성하기 위해 사용하였다. 3주기의 시험관 내 자극 후에, 자가 펩티드-펄스된 B 세포를 항원 제시 세포로 사용하였다. 결과는 pg/ml의 IFN-γ로 나타냈다. [-- 는 분석이 실시되지 않았다는 것을 나타낸다]. 표 11에 나타낸 바와 같이, 인간 수지상 세포의 감염은 브라큐리, MUC1 및 CEA에 대한 항원 특이적 T 세포를 생성하고 펩티드로 펄스된 자가 B세포로 자극될 때 IFN-γ를 생산할 수 있다.
[표 11]
CEA-, MUC1- 및 브라큐리-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 생성하였다. 수지상 세포(1 mL의 AIM-V 중에 1-2x105/웰)는 20,000 MOI의 Tri-Ad5로 상기에 기재된 바와 같이 감염시켰다. 감염된 DC는 자가 비부착 세포의 자극을 위한 APC로서 10:1의 이펙터-APC 비율로 사용하였다. 배양물을 5% CO2를 함유하는 가습 대기 중에 37℃에서 3일간 인큐베이션하였다. 그 후 배양물에 rhIL-2를 7일간 보충하였다; IL-2 함유 배지를 3일 마다 보충하였다. 10일 자극이 1회 시험관 내 자극(IVS) 주기를 구성하였다. 자가 벡터-감염된 DC는 3회 IVS를 위한 APC로서 사용하였다. 자가 펩티드-펄스된 B 세포를 사용하여 3회 IVS 후에 항원 특이적 CTL을 재자극하였다. T-세포주는 IL-7 및 IL-15(10 ng/ml)를 함유하는 배지에 유지시켰다.
HLA-A2 및 -A24 공여자의 인간 DC(IL-4 및 GM-CSF에서 6일 배양)는 0.5 mL의 AIM-V 중에 2x104 세포/웰(24웰 플레이트)의 Tri-Ad5로 감염시켰다. Tri-Ad5 벡터는 20,000 MOI로 1시간 사용한 후 1.5 mL의 AIM-V를 각 웰에 첨가하였다. 감염된 DC를 48시간 인큐베이션한 후 세척하고 인간 항원 특이적 T 세포의 자극에 사용하였다. 결과는 1 x 105 T 세포/ml당 pg의 IFN-γ로 나타낸다. 전이유전자를 코딩하는 Tri-Ad5 벡터를 이용한 인간 수지상 세포의 감염은 항원 특이적 T 세포주를 활성화하여 IFN-γ를 생산할 수 있다. 표 12에 나타낸 바와 같이, Tri-Ad5를 이용한 인간 수지상 세포의 감염은 브라큐리, MUC1 및 CEA에 대한 항원 특이적 T 세포를 생성하고 상응하는 펩티드로 펄스된 자가 B 세포로 자극될 때 IFN-γ를 생산할 수 있다. 굵은 체의 숫자는 비감염 EC를 가진 상응하는 웰과 비교하여 IFN-γ 분비의 유의한 상승을 나타낸다.
[표 12]
상기 연구는 Ad5 [E1-, E2b-]-기반 벡터가 시험관 내에서 인간 DC의 성숙을 유도할 수 있고, 감염된 DC가 항원 특이적 인간 T-세포를 자극할 수 있고, 감염된 DC가 항원 특이적 인간 CTL을 생성할 수 있다는 것을 보여준다. 여기서 보고된 연구에서, 상이한 TAA를 발현하는 3가지 Ad5 벡터의 혼합물로 이루어진 다중-TAA 표적화 면역요법(Tri-Ad5)은 단지 약간의 차이를 가지면서 각각의 아데노바이러스 벡터를 단독으로 사용할 때만큼 인간 T 세포의 활성화에 효율적이다. 9개의 상이한 생체 내 매개변수를 Tri-Ad5로 백신접종과 비교하여 생쥐에 각각의 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA, Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1, 및 Ad5 [E1-, E2b-]-브라큐리 벡터로 개별적으로 백신접종하여 측정하였다. 실시된 21회 분석 중에서, 관찰된 통계학적 차이는 (a) MUC1-특이적 비장 세포 및 CD8+ IFN-생산 및 다기능성 CD8+ T 세포의 수의 상승, 및 (b) Tri-Ad5 백신접종된 생쥐에서보다 한 벡터로 백신접종된 생쥐에서 더 많은 CEA-특이적 CD8+ IFN-생산 T 세포였다. 한편, Tri-Ad5로 백신접종된 생쥐는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA 백신접종된 생쥐보다 더 많은 CEA-특이적 IL-2-생산 세포를 생산하였다. 다른 16/21 분석에서, 그러나, 하기의 항원 특이적 활성화에 관하여 개별 벡터 사용 vs Tri-Ad5의 사용 사이의 결과에서 통계학적 차이는 없었다: (a) IFN-γ 및 IL-2 생산에 대한 비장 세포, (b) IFN-γ 생산에 대한 CD8+ T 세포, (c) IFN-γ 생산을 위한 CD4+ T 세포, (d) IFN-γ 및 TNF-α 생산을 위한 다기능성 CD8+ T 세포, (e) IFN-γ 및 TNF-α 생산을 위한 다기능성 CD4+ T 세포, 및 (f) 항원 특이적 항체의 생산. 단일 벡터 (Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1) vs Tri-Ad5 백신을 이용하여 항종양 활성에는 차이가 없었다; 두 백신 모두 종양을 제거하지 못하였지만, 두 백신 모두 종양 성장 속도를 유사한 방식으로 감소시켰다. Tri-Ad5는 일부 분석에서 T 세포 활성화에서 그만큼 효율적이지 않았지만, Tri-Ad5 플랫폼이 인간 고형 종양에 존재하는 TAA의 이종성을 극복할 수 있는 가능한 능력이 일부 분석에서 Tri-Ad5 vs 개별 벡터의 T 세포 활성화의 효능에서 비교적 약간의 차이보다 훨씬 중요하다.
CEA, MUC1 및 브라큐리는 모두 인간 TAA이고 쥣과 고형 종양에서 발현되지 않는다. 게다가, 인간 고형 종양은 다양한 TAA의 발현과 관련하여 매우 이종적이다. Tri-Ad5 vs. 각 벡터 단독의 백신접종의 효과를 정의하기 위해서 모두 3개의 전이유전자로 쥣과 종양 세포주를 형질감염시키는 것은 매우 어렵다. MUC1을 발현하는 쥣과 종양의 표적화가 선택된 것은 단일 Ad5 [E1-, E2b-]-MUC1 벡터가 Tri-Ad5에 비교된 CEA 및 브라큐리 벡터보다 Tri-Ad5에 비교된 일부 쥣과 T 세포 분석에서 더 강력하였기 때문이다. 따라서, 이는 단일 벡터 플랫폼과 Tri-Ad5 플랫폼과 비교하는 것이 가장 엄격한 모델인 것으로 보였다. 본원에서 보고된 연구는 Tri-Ad5 레지멘에서 다양한 범위의 TAA 전이유전자를 표적화하는 상기 신규 아데노바이러스 백신 전달 플랫폼(Ad5 [E1-, E2b-])을 이용하여 백신 면역요법으로서 가능한 임상 연구의 이론적 근거 또는 다른 치료제와 병용 사용을 제공하도록 설계되었다.
관문 억제제 항체는 흑색종 및 편평 비-소세포 폐암에서 임상 활성의 증거를 보였지만, 다른 암 유형에서 임상 이점은 소수의 환자에서 관찰되었다. 일부 종양 유형, 예를 들어 결장직장암 및 전립선암 경우, 항-PDL1/PD1 관문 억제제는 임상 활성을 거의 보이지 않았다. 일부 환자에서 PDL1/PD1 치료 활성의 결여에 대해 제시된 한 가지 가설은 종양에서 T 세포의 침윤물의 결여이다. 결과적으로, 종양에서 TAA를 표적화하는 백신이 결과적으로 종양 미세 환경에서 항원 특이적 T 세포가 존재하도록 한다면, 백신접종과 병용하여 또는 그 후에 이용되는 면역 경로 관문 조절 인자는 임상 효과를 이끄는 종양 침윤성 무반응(anergized) T 세포의 "브레이크를 방출"할 수 있을 것이다.
실시예
9:
HPV를
위한 면역요법
본 실시예는 본원에서 제공된 복합 요법이 HPV 초기 6(E6) 및 초기7(E7) 발암유전자를 발현하는 HPV 관련 암의 종양 및 쥣과 모델을 감소시킨다는 것을 보여준다. 간략하게, 종양 보유 HPV 쥣과 모델 생쥐를 변형된 비-발암성의 융합된 HPV-E6/E7 유전자를 포함하는 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 백신으로 처리하고 종양 보유 생쥐를 치료하였다. 생쥐에서 종양을 유도하는데 사용된 TC-1 쥣과 종양 세포주는 HPV-E6/E7 및 PDL1을 발현하였다.
유세포 분석을 이용하여 HPV 종양 보유 생쥐에서 종양을 조사하고 여러 종양 침윤 림프구의 존재량을 계산하였다. 종양에서 TIL은 하기 세포 유형 및 존재량의 수준을 갖는다고 관찰되었다: 골수 유래 서프레서 세포(MDSC)(7.5% ± 2.4 SD), FoxP3 발현 T 조절(Treg) 림프구(7.1% ± 2.5), PD1 발현 CD8α+ 림프구(25.5% ±16.4), 및 LAG-3 발현 CD8α+ 림프구(4.1% ± 2.3). 상기 TIL의 프로파일은 억제 면역 경로가 종양에 존재한다는 것을 나타낸다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 면역요법에 면역 관문 억제제 항체, 예를 들어 항-PD1 항체의 첨가는 결과적으로 더 큰 항종양 반응을 일으켰다(도 28). 추가적으로, 이 군에서 2마리의 생쥐가 본질적으로 완전한 종양 퇴화를 보였다는 것이 관찰되었다(도 29). 간략하게, C57Bl/6 생쥐(n=7/군)을 HPV-E6/E7 발현 TC-1 종양 세포로 이식하고(제0일) 제10, 17, 24일에 1010 VP의 Ad5-눌(공벡터) + 100 ㎍ 대조군 IgG(복강내), 1010 VP의 Ad5-눌(공벡터) + 100 ㎍ 항-PD1, 1010 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 + 100 ㎍ 생쥐 IgG, 또는 1010 VP 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-HPV-E6/E7 + 100 ㎍ 항-PD1을 이용한 면역요법에 의해 처리하였다. 항-PDL1 포함 또는 미포함 면역요법은 결과적으로 제23일까지 종양 성장의 유의한 억제를 가져왔다(P<0.05). 모든 대조군 생쥐는 종양 덩어리로 인해 제23일까지 희생되었다. 값 = 평균 ± SEM (도 28).
항-PD1 주사를 이용한 면역요법에 의해 처리된 2마리 생쥐에서 종양 성장 및 퇴화를 분석하였다(도 29). 종양 성장은 각각 제20 & 27일에 피크를 이루고, 그 이후로 퇴화하였다. 본 연구는 다중 표적화 백신의 사용과 병용되는 관문 억제제 약물의 병용은 항종양 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 증명해준다.
세포 예정사 리간드 1(PD1) 차단과 병용된 HPV 16 유전자 E6 및 E7에 대해 면역시키는 바이러스 유전자 전달 플랫폼(Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7)을 이용한 인간 유두종 바이러스(HPV)에 대한 면역요법이 백신 단독에 비해 치료 효과를 증가시키는지를 결정하기 위해 이를 조사하였다. 단일 제제로서 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7은 HPV-E6/E7 세포 매개 면역을 유도하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법은 결과적으로 작은 종양의 제거 및 더 크게 확립된 종양을 갖는 생쥐에서 전제 생존 이점을 가져왔다. 면역요법이 면역 관문 차단과 병용될 때, 큰 종양에 대한 항종양 활성 수준의 증가가 관찰되었다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리된 생쥐에서 종양 미세환경의 분석은 CD8+ 종양 침윤 림프구(TIL) 상승을 나타냈다; 그러나 종양 세포에서 억제 기전, 예를 들어 세포 예정사 리간드 1(PDL1) 발현의 유도 및 PD1+ TIL의 증가가 관찰되었다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역요법이 항-PD1 항체와 병용될 때, CD8+ TIL이 동일한 수준으로 관찰되었지만 종양 세포에서 종양 PDL1 발현의 감소 및 PD1+ TIL의 감소는 병용 요법이 종양 제거 상태를 유리하게 하는 기전 및 앞으로의 임상 시험에서 면역 경로 관문 조절 인자와 항원 특이적 백신을 짝짓기 위한 이론적 근거를 제공한다.
본원에서, PD1 차단과 병용된 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역화를 항-종양 효과의 증가에 대해 조사하였다. 또한, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신에 의해 유도된 CMI 반응을 특성화하고 작은 종양 vs 크게 확립된 종양을 치료하는 치료 가능성을 평가하기 위하여 항종양 반응의 속도론을 결정하였다. 가능한 작용 기전을 조사하기 위해서, 종양의 실질 내에서 이펙터 T 세포와 서프레서 T 세포의 수준 사이의 관계를 평가하고 림프구 집단 및 관찰된 항종양 반응에 역할을 할 수 있는 공동 억제 분자의 발현을 특성화하였다.
바이러스 제작
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 제작하고 생산하였다. 간략하게, 전이유전자를 상동 재조합 기반 접근법을 이용하여 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 서브클로닝하고 복제 결함 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식하고, CsCl2 정제하고, 역가를 측정하였다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단층에서 플라크 형성 단위(PFU)로 결정하였다. 바이러스 입자(VP) 농도를 소듐 도데실 설페이트(SDS) 파괴 및 260 nm 및 280 nm에서 분광 광도법에 의해 결정하였다. 벡터 대조군으로서, 전이유전자 삽입체가 없는 Ad5 플랫폼 골격인 Ad5 [E1-, E2b-]-눌을 이용하였다.
면역화 및 비장 세포 제조
암컷 C57BL/6 생쥐(n=5/군)에 변화하는 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌을 피하(SQ)에 주사하였다. 용량은 25㎕ 주사 완충액(3% 수크로오스 포함 20mM HEPES)으로 투여하고 생쥐는 14일 간격으로 3회 면역시켰다. 최종 주사 후 14일에, 비장 및 혈청을 수집하였다. 생쥐의 혈청은 평가할 때까지 -20℃에서 냉동하였다. 비장 세포의 현탁액은 비장 피막을 파괴하고 70 μm 나일론 세포 여과기를 통과하여 내용물을 서서히 밀어 넣어 생성하였다. 적혈구는 적혈구 용해 완충액을 첨가하여 용해시키고, 용해 후 비장 세포는 R10(L-글루타민(2mM), HEPES(20mM)(Corning, 뉴욕주 코닝 소재), 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL), 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPM1640)에서에 2회 세척하였다. 비장 세포는 ELISpot 및 유세포 분석에 의해 사이토카인 생산에 대해 분석하였다.
효소결합 면역흡착 반점 분석법(
ELISpot
)
HPV E6 및 E7 특이적 인터페론-γ(IFN-γ) 분비 T 세포를 상기에 기재한 바와 같이 제조된 새로 단리된 생쥐 비장 세포를 이용하여 ELISpot 분석법에 의해 결정하였다. ELISpot 분석을 수행하였다. HPV E6 및 E7의 전체 코딩 서열을 포함하는 중복 펩티드의 풀을 11개 아미노산 중복을 가진 15-mer로서 합성하였다(그리고 동결건조된 펩티드 풀을 DMSO 중에 용해하였다). 비장 세포(2x105 세포)는 E6 또는 E7로부터 유래한 풀의 2 μg/mL/펩티드의 중복 15-mer 펩티드로 자극하였다. 세포는 양성 대조군으로서 웰당 0.06 μg 농도의 콘카나발린 A(Con A)로 자극하였다. SIV-Nef(AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH)로부터 유래한 중복 15-mer 완전 펩티드 풀은 무관한 펩티드 대조군으로서 사용하였다. 반점 형성 세포(SFC) 수를 이뮤노스팟 ELISpot 플레이트 판독기를 이용하여 결정하였다(그리고 결과는 106 비장 세포당 SFC의 수로 보고하였다)
세포 내 사이토카인 자극
비장 세포는 상기 ELISpot 분석법에 대해 기재된 바와 같이 제조하였다. 96-웰 U 바닥 플레이트에 웰당 106 생존 비장 세포를 이용하여 자극 분석을 수행하였다. R10 배지 중에 비장 세포는 2μg/mL/펩티드의 HPV E6, HPV E7, 또는 SIV-Nef 펩티드 풀을 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 6시간 자극하면서, 인큐베이션 개시 후 2시간에 단백질 운반 억제제(GolgiStop, BD)를 첨가하였다. 그 후 자극된 비장 세포는 림프구 표면 마커 CD8α 및 CD4에 대해 염색하고, 파라포름알데히드로 고정하고, 투과성으로 만들고, IFN-γ 및 TNF-α의 세포 내 축적에 대해 염색하였다. 생쥐 CD8α(클론 53-6.7), CD4(클론 RM4-5), IFN-γ(클론 XMG1.2), 및 TNF-α(클론 MP6-XT22)에 대한 형광 접합된 항체는 BD에서 구입하여 항-CD16/CD32(클론 2.4G2)의 존재하에 염색을 수행하였다. 어큐리 C6 유세포 분석기(BD)를 이용하여 유세포 분석을 수행하고 BD 어큐리 C6 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
종양 면역요법
생체 내 종양 면역요법 연구를 위해, 8-10주령 암컷 C57BL/6 생쥐의 왼쪽 옆구리에 2x105 TC-1 HPV-E6/E7 발현 종양 세포를 SQ 이식하였다. 생쥐에 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 SQ 주사로 7일 간격으로 3회 처리하였다. 대조군 생쥐에 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌을 동일한 프로토콜 하에 주사하였다. 병용 연구에서, 생쥐에게 100 μg의 쥐 항-PD1(클론 RMP1-14) 또는 이소형 쥐 대조군 항체(클론 2A3)을 면역화와 동시에 IP로 제공하였다. 쥐 항-PD1 항체 및 쥐 IgG2a 이소형 대조군 항체는 바이오엑셀(BioXcell)로부터 구입하였다. 종양 크기는 2개의 서로 다른 크기(a, b)를 측정하고 부피는 식 V=(a2 x b)/2에 따라 계산하였다. 식에서 a가 더 짧은 크기였다. 종양이 1500 m3에 도달하거나 심각하게 궤양이 생길 때 동물을 안락사시켰다.
유세포
분석에 의한 종양 침윤 세포(
TIL
)의 분석
4개 군의 8-10주령 암컷 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 왼쪽 옆구리에 2x105 TC-1 종양 세포를 제0일에 SQ 이식하였다. 이들 군 중 2개 군은 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌 벡터 대조군으로 SQ 면역시키고 나머지 2개 군은 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신으로 SQ 면역시켰다. 상기 면역화는 제12일에 시작하여 7일 간격으로 2회 투여하였다. 면역화 이외에, 제12 및 16일에 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 1개 군 및 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 1개 군의 생쥐에 100μg 쥐 항-PD1(클론 RMP1-14)을 SQ로 투여하고, 제19 및 23일에 100μg 햄스터 항-PD1(클론 J43)을 투여하여 유효량의 항-PD1을 증가시켰다. 상기 면역 경로 관문 조절 인자를 이용한 치료를 대조하기 위해, 같은 날에 나머지 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 군의 생쥐에게 관련 쥐 및 햄스터 대조군 IgG 항체를 투여하였다. 햄스터 항-PD1 항체 및 이소형 대조군은 바이오엑셀로부터 구입하였다. 제27일에, 종양을 측정하고, 절개하고, 중량을 측정하였다. 종양을 갈아 행크스 균형 염용액(HBSS) 중에 콜라게나아제 IV(1mg/ml), 히알루로니다아제(100μg/ml), 및 DN아제 IV(200U/ml)의 혼합물로 실온에서 30분간 80 rpm에서 회전시키면서 분해하였다. 효소는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 분해 후, 종양 현탁액을 70 μm 나일론 세포 여과기에 놓고 원심분리하였다. 적혈구는 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 제거하였고 용해 후 종양 현탁액은 1%(w/v) 소 혈청 알부민을 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)에서 2회 세척하고 염색을 위한 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 완충액(PBS pH 7.2, 1% 소 태아 혈청, 및 2 mM EDTA) 중에 재현탁하였다. CD45(30-F11), CD4(RM4-5), 및 PDL1(MIH5)에 대한 형광 접합된 항체는 BD로부터 구입하였다. CD8β(H35-17.2), CD25(PC61.5), FoxP3(FJK-16s), PD1(RMP1-30), LAG-3(C9B7W), 및 CTLA4(UC10-4B9)에 대한 형광 접합된 항체는 모두 이바이오사이언스(eBioscience)로부터 구입하였다. 표면 염색은 항-CD16/CD32(클론 2.4G2)를 함유하는 100 ㎕ FACS 완충액 중에 4℃에서 30분간 실시하였다. 염색된 세포는 FACS 완충액에서 세척하고, 파라포름알데히드로 고정하고, (필요한 경우) 투과성화 완충액(eBioscience) 중에서 투과성으로 만든 후 항-CD16/CD32(클론 2.4G2)를 함유하는 100 ㎕ 투과성화 완충액 중에 형광 접합된 항-FoxP3 또는 항-CTLA4로 4℃에서 60분간 염색하였다. 세포를 투과성화 완충액으로 세척하고, 다시 FACS 완충액으로 세척하고, 고정된 부피의 각 시료를 BD 어큐리 C6 유세포 분석기를 이용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 종양 세포는 작고 큰 세포를 포함하는 산란 통로에서 CD 45-- 반응으로 정의하였다. CD4+ TIL은 림프구 산란 통로에서 CD45+/CD4+ 반응으로 정의하였다. CD8+ TIL은 림프구 산란 통로에서 CD45+/CD8β+ 반응으로 정의하였다. 조절 T 세포(Tregs)는 림프구 산란 통로에서 CD45+/CD4+/CD25+/FoxP3+ 반응으로 정의하였다. 이펙터 CD4+ T 세포는 림프구 산란 통로에서 CD45+/CD4+/CD25--/FoxP3-- 반응으로 정의하였다. FoxP3, PDL1, PD1, LAG-3, 및 CTLA4의 양성 발현을 결정하기 위해 이소형이 일치하는 대조군 항체를 사용하였다. 어큐리 C6 유세포 분석기(BD)를 이용하여 유세포 분석을 수행하고 BD 어큐리 C6 소프트웨어에서 분석하였다.
Ad5
[E1-,
E2b
-]-E6/E7에 의해 유도된
HPV
-E6/E7 특이적 세포 매개 면역 반응
생쥐에서 CMI 반응의 유도에 대해 증가하는 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역화의 효과를 결정하기 위해서 연구를 수행하였다. C57BL/6 생쥐(n=5/군) 군을 108, 109, 또는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 14일 간격으로 3회 SQ 면역시켰다. 대조군 생쥐는 108 VP, 109 VP, 또는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌(공벡터 대조군)을 받았다. 최종 면역화 후 2주에, 비장 세포 CMI 반응은 IFN-γ 분비 세포에 대해 ELISpot 분석에 의해 평가하였다. 용량 효과가 관찰되었으며 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 면역화에 의해 최고의 CMI 반응 수준을 얻었다. Ad5 [E1-, E2b-]-눌로 주사된 대조군 생쥐에서는 반응이 검출되지 않았다.
또한, 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 면역된 생쥐에서 CD8α+ 및 CD4+ 비장 세포 집단 모두에서 IFN-γ 및 TNF-α의 세포 내 축적을 결정하였다. 중복 펩티드 풀로 자극 후 세포 내 사이토카인 염색(ICS)은 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 면역된 모든 생쥐로부터 단리된 CD8α+ 림프구에서 E6 및 E7 항원 특이적 IFN-γ 축적을 나타냈다. 또한, 펩티드-자극된 비장 세포는 TNF-α의 세포 내 축적에 대해 염색되었고, E6 및 E7 모두에 특이적인 다기능성(IFN-γ+/TNF-α+) CD8α+ 비장 세포의 유의한 집단을 확인할 수 있었다.
HPV
-E6/E7 발현 종양의 치료
HPV-E6/E7 TC-1 종양을 보유하는 생쥐에서 면역요법 치료의 항종양 효과를 조사하였다. 이들 종양 세포는 유세포 분석법에 의해 평가된 바와 같이 PDL1을 발현하였다. PE-접합된 항-PDL1로 표지될 때, TC-1 세포는 537의 중앙값 형광 세기(MFI)를 보인 반면 PE-접합된 이소형 대조군 항체로 표지된 세포는 184의 MFI를 보였으며, 이는 TC-1 세포의 표면에 면역 억제의 PDL1의 존재를 증명해준다(자료 미제시). 2개 군의 C57BL/6 생쥐(n=5/군)의 오른쪽 늑골 하 부분에 2x105 TC-1 종양 세포를 제0일에 SQ 접종하였다. 제1, 8, 및 14일에, 생쥐는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌(벡터 대조군) 또는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7의 SQ 주사로 처리하였다. 모든 생쥐는 종양 크기에 대해 모니터하고 종양 부피를 계산하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7로 면역된 생쥐는 제12일에 시작하여 대조군 생쥐보다 유의하게 더 작은 종양을 보였으며(p<0.01) 5마리 중 3마리 생쥐가 완전 종양 퇴화를 보이는 것을 포함하여 나머지 실험에 대해 유의하게 더 작게 유지하였다(p<0.02). 벡터 대조군 처리된 군의 생쥐에서 종양은 제26일에 시작하여 안락사를 위한 역치에 도달하기 시작하여 이 군의 모든 생쥐는 제33일까지 안락사시켰지만, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리된 군의 생쥐는 제36일에 실험 종료시 작은 종양(<150mm3)의 완전 종양 퇴화로 모두 생존하였다.
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법이 더 큰 종양에 대해 효과적인지를 결정하기 위해서, TC-1 종양 세포 종양을 2개 군의 C57BL/6 생쥐(n=4/군)에 이식한 후, 종양이 작지만 촉지성 종양 이식 후 6일간 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 매주 치료를 지연시켰다. 제6일에 치료를 시작한 생쥐는 처음에 대조군 군과 유사한 종양 성장을 보였다; 그러나 제16일에 시작한 경우 종양 퇴화가 관찰되었다. 제6일에 치료를 시작한 생쥐에서 종양은 제20일에 시작한 대조군 군보다 유의하게 더 작았으며(p<0.05) 4마리 중 3마리 생쥐는 제27일까지 완전 퇴화를 보였다. 제6일에 시작한 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 투여는 또한 유의한 생존 이점을 제공하였다(p<0.01).
최종적으로, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법이 크게 확립된 종양에서 효과적인지 결정하기 위해서, TC-1 종양 세포를 2개 군의 C57BL/6 생쥐(n=4/군)에 이식한 후 종양이 ~100mm3이 되는 종양 이식 후 13일까지 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 매주 치료를 지연시켰다. 이 치료 군에서, 초기 종양 성장은 대조군 군과 유사한 것으로 관찰되었지만 대조군 군의 일부 생쥐는 제23일에 안락사 기준에 도달하였으며, 이는 추가의 시점에서 유의성 분석을 방해하였다. 그러나 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리된 군에서 종양 부피는 제29일까지 안락사 역치 미만이었고, 이때 벡터 대조군 군의 모든 생쥐의 종양이 1500mm3을 초과하여 안락사시켰다(도 5B). 이 결과는 TC-1 종양 모델에서, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역치료제가 종양의 강력한 억제제이었고 유의한 전체 생존 이점을 가져왔다는 것을 나타내지만, 종양의 완전 제거는 치료가 더 작은 종양에서 개시될 때에만 관찰되었다. 게다가, 이 결과는 종양 세포에 면역 억제하는 PDL1이 존재하는데에도, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역치료법은 결과적으로 종양 성장의 유의한 억제를 일으킨다는 것을 증명해 준다.
면역 관문 억제와의 복합 면역요법
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7의 치료 효과가 큰 종양 환경에서 향상될 수 있는지를 결정하기 위해서, 항-PD1 항체를 동시 투여하였다. 4개 군의 생쥐(n=7/군)에 2x105 TC-1 종양 세포를 제0일에 이식하고 제10일에 시작하여 생쥐는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + IP 100μg 항-PD1, 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 100μg 항-PD1, 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 100 μg 쥐 IgG2a 이소형 대조군, 또는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 100 μg 쥐 IgG2a 이소형 대조군을 매주 SQ 투여받았다. 종양 크기를 시간 경과에 따라 모니터하고 종양 크기가 1500 mm3을 초과하거나 종양 궤양이 존재할 때 생쥐를 안락사시켰다. Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 100 μg 쥐 IgG2a 이소형 대조군을 받은 대조군 생쥐(도 6A) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 100μg 항-PD1로 처리된 생쥐(도 6B)는 유사한 종양 성장 양상을 보였다(도 6B). 상기 두 군 사이에 유의한 생존 이점이 관찰되지 않았다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 쥐 IgG2a 이소형 대조군을 받은 생쥐는 대조군과 비교하여 지연된 종양 성장 양성을 보였으며 생쥐 중 2마리는 종양 이식 후 제52일에 기준선 가까이 까지 종양 퇴화를 보였다(도 6C). Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1을 받은 7마리 생쥐 중 4마리는 제25일에 시작하여 종양 퇴화를 보였으며 이들 중 2마리는 결과적으로 제53일의 실험 종료까지 종양 제거를 가져왔다(도 6D).
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 쥐 IgG2a 이소형 대조군으로 처리된 생쥐(도 7)는 또한 연구 종료시 생존한 동물의 29.6%의 생존 이점을 경험한 반면 대조군 생쥐(Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 쥐 IgG2a 이소형 대조군) 및 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 + 항-PD1 처리된 생쥐의 100%는 각각 제28 및 32일까지 희생되었다(도 7). Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1 항체 둘 다로 처리된 생쥐는 더 큰 치료 이점을 보였으며(도 7), 이는 대조군과 비교하여 지연된 종양 성장 및 생존의 유의한 향상(P≤ 0.0006)을 증명해준다.
생쥐 항-쥐 IgG 항체 반응을 쥐 항-PD1 항체로 2차 주사(ELISA에 의한 종점 항체 역가 1:200, 자료 미제시)에 의해 유도하였으며, 이들 반응은 3차 주사(ELISA에 의한 종점 항체 역가 1:4000 내지 1:8000, 자료 미제시)에 의해 극적으로 증가하였다. 상기 항-쥐 항체 반응은 항-PD1 항체 단독으로 주사 후에 항종양 활성이 관찰되지 않은 이유를 설명할 수 있다. 또한, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역요법과 병용된 항-PD1 항체의 1차 및 가능하게는 2차 주사는 효과적이지만 항-PD1로 3차 주사는 유도된 생쥐 항-쥐 IgG 반응에 의해 효과적으로 중화되었던 것 같다.
복합 면역요법 후 종양 미세환경
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리된 생쥐에서 지연된 종양 성장 및 생존을 제공한 세포 집단을 분석하기 위해서, 종양 침습 림프구(TIL)를 유세포 분석하였다. 4개 군의 생쥐에 2x105 TC-1 세포를 이식하고 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + PD1 항체의 2주마다 면역화 후 10일에 치료를 시작하였다. 제27일에, 전체 종양을 수집하고 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 종양 mg당 침습 CD8+ T 세포 수는 Ad5 [E1-, E2b-]-눌을 받은 군과 비교하여 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 처리된 군에서 유의하게 증가하였다(도 8C). 항-PD1 항체 치료는 침습 CD8+ T 세포 수에 약간의 효과를 보이거나 전혀 효과를 보이지 않았다(도 8C). 종양 mg당 침습 Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)의 수와 관련하여 4개 군 사이에 차이가 전혀 없었다(도 8B). 그러나 생쥐가 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신 또는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신 + 항-PD1 항체 치료로 처리받았을 때 종양 미세 환경에서 CD8+ T 세포의 증가는 Treg:CD8+ T 세포 비율의 감소를 가져왔다(도 8A).
Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역요법에 대한 항-PD1 항체의 상승/상가 효과를 더 연구하기 위해서, PD1, LAG-3, 및 CTLA-4의 발현을 TIL에서 조사하였다. 종양 미세환경 내에 T 세포에서 이들 공동 억제 분자의 발현은 항원 특이적 T 세포의 활성화를 하향 조절하는 것을 보였다. Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 대조군 항체 치료로 면역화는 PD1+ 및 LAG-3+ CD8+ TIL의 비율을 유의하게 증가시켰지만, CD4+ TIL에서 이들 공동 억제 분자의 발현은 이 치료에 의해 영향받지 않았다. CD4+ 및 CD8+ TIL 발현 CTLA-4의 퍼센트는 백신 치료에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다(자료 미제시). Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신 치료와 항-PD1 항체 주사의 병용은 결과적으로 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 + 대조군 항체로 처리된 생쥐에서 확인된 것과 비교하여 PD1+ CD8+ 및 CD4+ TIL의 비율에 유의한 감소를 가져왔다(CD8+ TIL 경우 p=0.0083 및 CD4+ TIL 경우 p=0.0016). 게다가, PD1+ CD8+ TIL의 비율은 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 처리된 대조군 군에서 관찰된 발현 수준에 비해 감소하였고, PD1+ CD4+ TIL의 비율은 대조군 군에서 관찰된 것보다 유의하게 낮게 감소하였다(p=0.0016, 도 9A). 또한, LAG-3+ CD8+ TIL의 퍼센트는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 면역화를 항-PD1 관문 억제제와 병용하였을 때 감소하는 것으로 관찰되었다(p=0.0363, 도 9B). 백신 치료가 생체 외 종양 세포에서 PDL1 발현을 향상시킬 수 있다는 것을 이전에 보였기 때문에, 종양세포에서 PDL1의 발현을 조사하였다. 백신 치료 후 종양 세포에서 PDL1의 중앙값 형광 세기에서 증가가 있었다. 그러나 PDL1 발현은 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 및 항-PD1 항체를 병용하여 처리된 생쥐에서 감소하였지만, 이 수준은 Ad5 [E1-, E2b-]-눌 처리된 대조군 생쥐에서 관찰된 것보다 훨씬 유의하게 높게 발현되었다.
요약하면, 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7이 용량 의존적 방식으로 HPV-E6/E7에 대한 CMI 반응을 유도할 수 있고, 이는 결과적으로 종양 세포에서 PDL1의 상승조절을 일으킨다는 것을 증명해준다. 최고 용량의 백신으로 종양 보유 생쥐에서 다중 동종 면역화는 결과적으로 유의한 항종양 활성을 일으키고 생존을, 특히 작은 종양을 보유하는 생쥐에서 증가시켰다. 중요하게는, Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법이 큰 종양을 갖는 생쥐에서 항-PD1과 병용될 때 더 큰 정도의 항종양 활성이 달성되었다. 종합적으로, 항-PD1 항체와 병용된 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신으로 면역화는 결과적으로 기능소실/무반응 표현형을 더 적게 가진 CD8+ 및 CD4+ 이펙터 집단에서 증가를 일으켜서 종양 미세 환경에서 더 많은 염증유발 상태와의 균형을 돕는다. 병용된 치료가 큰 종양 질량의 감소와 관련된다는 결과는 항-PD1 항체와 병용된 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7을 이용한 면역요법이 HPV-관련 두경부암 또는 자궁경부암 환자의 면역요법 과정에서 임상 효과를 증가시킬 수 있었다는 것을 나타낸다. 게다가, 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-E6/E7 백신을 이용한 임상 시험이 면역 경로 관문 조절 인자와 병용되어야 하고 여전히 최우선 순위를 두어야 한다는 것을 시사한다.
상기에 기재된 여러 실시양태는 조합되어 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 개별적으로 참고로 포함된다고 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다.
또 다른 실시양태를 제공하기 위해 여러 특허, 출원 및 간행물의 개념을 이용할 필요가 있는 경우 실시양태의 측면은 변형될 수 있다.
상기 상세한 설명을 고려하여 실시양태에 상기 및 기타 변형이 만들어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시양태에 제한하는 것으로 해석해서 안 되지만, 상기 청구범위에 주어진 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석해야 한다. 따라서, 청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> ETUBICS CORPORATION
<120> METHODS AND COMPOSTIONS FOR COMBINATION IMMUNOTHERAPY
<130> 39891-718.601
<140> PCT/US2016/012496
<141> 2016-01-07
<150> 62/150,236
<151> 2015-04-20
<150> 62/101,969
<151> 2015-01-09
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2109
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60
acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120
acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180
catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240
ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300
atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360
accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420
tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480
gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540
aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600
actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660
gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720
accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780
gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840
acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900
gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960
gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020
gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080
cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140
ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200
gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260
tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320
tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380
gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440
aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500
cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560
ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620
ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680
gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740
cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800
ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860
ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920
tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980
gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040
cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100
ctgatatag 2109
<210> 2
<211> 2109
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60
acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120
acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180
catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240
ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300
atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360
accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420
tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480
gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540
aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600
actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660
gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720
accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780
gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840
acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900
gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960
gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020
gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080
cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140
ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200
gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260
tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320
tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380
gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440
aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500
cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560
ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620
ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680
gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740
cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800
ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860
ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920
tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980
gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040
cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100
ctgatatag 2109
<210> 3
<211> 32315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactgtaata gtaatcaatt 360
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 420
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 480
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 540
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 600
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 660
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 720
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 780
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 840
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 900
agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagagatctg gtaccgtcga cgcggccgct 960
cgagcctaag cttggtaccg agctcggatc cactagtaac ggccgccagt gtgctggaat 1020
tcggcttaaa ggtacccaga gcagacagcc gccaccatgg agtctccctc ggcccctccc 1080
cacagatggt gcatcccctg gcagaggctc ctgctcacag cctcacttct aaccttctgg 1140
aacccgccca ccactgccaa gctcactatt gaatccacgc cgttcaatgt cgcagagggg 1200
aaggaggtgc ttctacttgt ccacaatctg ccccagcatc tttttggcta cagctggtac 1260
aaaggtgaaa gagtggatgg caaccgtcaa attataggat atgtaatagg aactcaacaa 1320
gctaccccag ggcccgcata cagtggtcga gagataatat accccaatgc atccctgctg 1380
atccagaaca tcatccagaa tgacacagga ttctacaccc tacacgtcat aaagtcagat 1440
cttgtgaatg aagaagcaac tggccagttc cgggtatacc cggagctgcc caagccctcc 1500
atctccagca acaactccaa acccgtggag gacaaggatg ctgtggcctt cacctgtgaa 1560
cctgagactc aggacgcaac ctacctgtgg tgggtaaaca atcagagcct cccggtcagt 1620
cccaggctgc agctgtccaa tggcaacagg accctcactc tattcaatgt cacaagaaat 1680
gacacagcaa gctacaaatg tgaaacccag aacccagtga gtgccaggcg cagtgattca 1740
gtcatcctga atgtcctcta tggcccggat gcccccacca tttcccctct aaacacatct 1800
tacagatcag gggaaaatct gaacctctcc tgccacgcag cctctaaccc acctgcacag 1860
tactcttggt ttgtcaatgg gactttccag caatccaccc aagagctctt tatccccaac 1920
atcactgtga ataatagtgg atcctatacg tgccaagccc ataactcaga cactggcctc 1980
aataggacca cagtcacgac gatcacagtc tatgcagagc cacccaaacc cttcatcacc 2040
agcaacaact ccaaccccgt ggaggatgag gatgctgtag ccttaacctg tgaacctgag 2100
attcagaaca caacctacct gtggtgggta aataatcaga gcctcccggt cagtcccagg 2160
ctgcagctgt ccaatgacaa caggaccctc actctactca gtgtcacaag gaatgatgta 2220
ggaccctatg agtgtggaat ccagaacgaa ttaagtgttg accacagcga cccagtcatc 2280
ctgaatgtcc tctatggccc agacgacccc accatttccc cctcatacac ctattaccgt 2340
ccaggggtga acctcagcct ctcctgccat gcagcctcta acccacctgc acagtattct 2400
tggctgattg atgggaacat ccagcaacac acacaagagc tctttatctc caacatcact 2460
gagaagaaca gcggactcta tacctgccag gccaataact cagccagtgg ccacagcagg 2520
actacagtca agacaatcac agtctctgcg gagctgccca agccctccat ctccagcaac 2580
aactccaaac ccgtggagga caaggatgct gtggccttca cctgtgaacc tgaggctcag 2640
aacacaacct acctgtggtg ggtaaatggt cagagcctcc cagtcagtcc caggctgcag 2700
ctgtccaatg gcaacaggac cctcactcta ttcaatgtca caagaaatga cgcaagagcc 2760
tatgtatgtg gaatccagaa ctcagtgagt gcaaaccgca gtgacccagt caccctggat 2820
gtcctctatg ggccggacac ccccatcatt tcccccccag actcgtctta cctttcggga 2880
gcggacctca acctctcctg ccactcggcc tctaacccat ccccgcagta ttcttggcgt 2940
atcaatggga taccgcagca acacacacaa gttctcttta tcgccaaaat cacgccaaat 3000
aataacggga cctatgcctg ttttgtctct aacttggcta ctggccgcaa taattccata 3060
gtcaagagca tcacagtctc tgcatctgga acttctcctg gtctctcagc tggggccact 3120
gtcggcatca tgattggagt gctggttggg gttgctctga tatagcagcc ctggtgtagt 3180
ttcttcattt caggaagact gacagttgtt ttgcttcttc cttaaagcat ttgcaacagc 3240
tacagtctaa aattgcttct ttaccaagga tatttacaga aaagactctg accagagatc 3300
gagaccatcc tctagataag atatccgatc caccggatct agataactga tcataatcag 3360
ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa 3420
cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg 3480
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 3540
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc ggatctgggc gtggttaagg 3600
gtgggaaaga atatataagg tgggggtctt atgtagtttt gtatctgttt tgcagcagcc 3660
gccgccgcca tgagcaccaa ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaacg 3720
cgcatgcccc catgggccgg ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc 3780
cccgtcctgc ccgcaaactc tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg 3840
gagactgcag cctccgccgc cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact 3900
gactttgctt tcctgagccc gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat 3960
gacaagttga cggctctttt ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt 4020
tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc 4080
aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca gactctgttt ggatttggat caagcaagtg 4140
tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg 4200
tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga 4260
tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc 4320
ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg 4380
tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg 4440
ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat atgagatgca tcttggactg tatttttagg 4500
ttggctatgt tcccagccat atccctccgg ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca 4560
gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac 4620
ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg 4680
ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt 4740
tccaggatga gatcgtcata ggccattttt acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc 4800
ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg tagttaccct cacagatttg catttcccac 4860
gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc 4920
ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag 4980
ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag 5040
ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt 5100
tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa 5160
gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca 5220
agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc acctgctcta cggcatctcg atccagcata 5280
tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca 5340
gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca 5400
cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc 5460
tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg 5520
tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg 5580
cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg 5640
attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc 5700
aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt 5760
tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt 5820
ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata 5880
gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt 5940
gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca 6000
tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg 6060
gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg 6120
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga 6180
cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg 6240
cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt 6300
caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg cgttggacag caacttggcg atggagcgca 6360
gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt 6420
cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca 6480
cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta 6540
ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt 6600
ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg 6660
cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg 6720
caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg 6780
aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg 6840
tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg 6900
gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct 6960
gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg 7020
cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga 7080
ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt 7140
catacttatc ctgtcccttt tttttccaca gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt 7200
ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtaagag cctagcatgt 7260
agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct 7320
gcgcggcctt ccggcatgac cagcatgaag ggcacgagct gcttcccaaa ggcccccatc 7380
caagtatagg tctctacatc gtaggtgaca aagagacgct cggtgcgagg atgcgagccg 7440
atcgggaaga actggatctc ccgccaccaa ttggaggagt ggctattgat gtggtgaaag 7500
tagaagtccc tgcgacgggc cgaacactcg tgctggcttt tgtaaaaacg tgcgcagtac 7560
tggcagcggt gcacgggctg tacatcctgc acgaggttga cctgacgacc gcgcacaagg 7620
aagcagagtg ggaatttgag cccctcgcct ggcgggtttg gctggtggtc ttctacttcg 7680
gctgcttgtc cttgaccgtc tggctgctcg aggggagtta cggtggatcg gaccaccacg 7740
ccgcgcgagc ccaaagtcca gatgtccgcg cgcggcggtc ggagcttgat gacaacatcg 7800
cgcagatggg agctgtccat ggtctggagc tcccgcggcg tcaggtcagg cgggagctcc 7860
tgcaggttta cctcgcatag acgggtcagg gcgcgggcta gatccaggtg atacctaatt 7920
tccaggggct ggttggtggc ggcgtcgatg gcttgcaaga ggccgcatcc ccgcggcgcg 7980
actacggtac cgcgcggcgg gcggtgggcc gcgggggtgt ccttggatga tgcatctaaa 8040
agcggtgacg cgggcgagcc cccggaggta gggggggctc cggacccgcc gggagagggg 8100
gcaggggcac gtcggcgccg cgcgcgggca ggagctggtg ctgcgcgcgt aggttgctgg 8160
cgaacgcgac gacgcggcgg ttgatctcct gaatctggcg cctctgcgtg aagacgacgg 8220
gcccggtgag cttgaacctg aaagagagtt cgacagaatc aatttcggtg tcgttgacgg 8280
cggcctggcg caaaatctcc tgcacgtctc ctgagttgtc ttgataggcg atctcggcca 8340
tgaactgctc gatctcttcc tcctggagat ctccgcgtcc ggctcgctcc acggtggcgg 8400
cgaggtcgtt ggaaatgcgg gccatgagct gcgagaaggc gttgaggcct ccctcgttcc 8460
agacgcggct gtagaccacg cccccttcgg catcgcgggc gcgcatgacc acctgcgcga 8520
gattgagctc cacgtgccgg gcgaagacgg cgtagtttcg caggcgctga aagaggtagt 8580
tgagggtggt ggcggtgtgt tctgccacga agaagtacat aacccagcgt cgcaacgtgg 8640
attcgttgat aattgttgtg taggtactcc gccgccgagg gacctgagcg agtccgcatc 8700
gaccggatcg gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag tcacagtcgc aaggtaggct 8760
gagcaccgtg gcgggcggca gcgggcggcg gtcggggttg tttctggcgg aggtgctgct 8820
gatgatgtaa ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg gtcgacagaa gcaccatgtc 8880
cttgggtccg gcctgctgaa tgcgcaggcg gtcggccatg ccccaggctt cgttttgaca 8940
tcggcgcagg tctttgtagt agtcttgcat gagcctttct accggcactt cttcttctcc 9000
ttcctcttgt cctgcatctc ttgcatctat cgctgcggcg gcggcggagt ttggccgtag 9060
gtggcgccct cttcctccca tgcgtgtgac cccgaagccc ctcatcggct gaagcagggc 9120
taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc acctgcgtga gggtagactg 9180
gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg ttgatggtgt aagtgcagtt 9240
ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc gagagctcgg tgtacctgag 9300
acgcgagtaa gccctcgagt caaatacgta gtcgttgcaa gtccgcacca ggtactggta 9360
tcccaccaaa aagtgcggcg gcggctggcg gtagaggggc cagcgtaggg tggccggggc 9420
tccgggggcg agatcttcca acataaggcg atgatatccg tagatgtacc tggacatcca 9480
ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cggaaagtcg cggacgcggt tccagatgtt 9540
gcgcagcggc aaaaagtgct ccatggtcgg gacgctctgg ccggtcaggc gcgcgcaatc 9600
gttgacgctc tagcgtgcaa aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg 9660
gataaattcg caagggtatc atggcggacg accggggttc gagccccgta tccggccgtc 9720
cgccgtgatc catgcggtta ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac 9780
gggggagtgc tccttttggc ttccttccag gcgcggcggc tgctgcgcta gcttttttgg 9840
ccactggccg cgcgcagcgt aagcggttag gctggaaagc gaaagcatta agtggctcgc 9900
tccctgtagc cggagggtta ttttccaagg gttgagtcgc gggacccccg gttcgagtct 9960
cggaccggcc ggactgcggc gaacgggggt ttgcctcccc gtcatgcaag accccgcttg 10020
caaattcctc cggaaacagg gacgagcccc ttttttgctt ttcccagatg catccggtgc 10080
tgcggcagat gcgcccccct cctcagcagc ggcaagagca agagcagcgg cagacatgca 10140
gggcaccctc ccctcctcct accgcgtcag gaggggcgac atccgcggtt gacgcggcag 10200
cagatggtga ttacgaaccc ccgcggcgcc gggcccggca ctacctggac ttggaggagg 10260
gcgagggcct ggcgcggcta ggagcgccct ctcctgagcg gcacccaagg gtgcagctga 10320
agcgtgatac gcgtgaggcg tacgtgccgc ggcagaacct gtttcgcgac cgcgagggag 10380
aggagcccga ggagatgcgg gatcgaaagt tccacgcagg gcgcgagctg cggcatggcc 10440
tgaatcgcga gcggttgctg cgcgaggagg actttgagcc cgacgcgcga accgggatta 10500
gtcccgcgcg cgcacacgtg gcggccgccg acctggtaac cgcatacgag cagacggtga 10560
accaggagat taactttcaa aaaagcttta acaaccacgt gcgtacgctt gtggcgcgcg 10620
aggaggtggc tataggactg atgcatctgt gggactttgt aagcgcgctg gagcaaaacc 10680
caaatagcaa gccgctcatg gcgcagctgt tccttatagt gcagcacagc agggacaacg 10740
aggcattcag ggatgcgctg ctaaacatag tagagcccga gggccgctgg ctgctcgatt 10800
tgataaacat cctgcagagc atagtggtgc aggagcgcag cttgagcctg gctgacaagg 10860
tggccgccat caactattcc atgcttagcc tgggcaagtt ttacgcccgc aagatatacc 10920
atacccctta cgttcccata gacaaggagg taaagatcga ggggttctac atgcgcatgg 10980
cgctgaaggt gcttaccttg agcgacgacc tgggcgttta tcgcaacgag cgcatccaca 11040
aggccgtgag cgtgagccgg cggcgcgagc tcagcgaccg cgagctgatg cacagcctgc 11100
aaagggccct ggctggcacg ggcagcggcg atagagaggc cgagtcctac tttgacgcgg 11160
gcgctgacct gcgctgggcc ccaagccgac gcgccctgga ggcagctggg gccggacctg 11220
ggctggcggt ggcacccgcg cgcgctggca acgtcggcgg cgtggaggaa tatgacgagg 11280
acgatgagta cgagccagag gacggcgagt actaagcggt gatgtttctg atcagatgat 11340
gcaagacgca acggacccgg cggtgcgggc ggcgctgcag agccagccgt ccggccttaa 11400
ctccacggac gactggcgcc aggtcatgga ccgcatcatg tcgctgactg cgcgcaatcc 11460
tgacgcgttc cggcagcagc cgcaggccaa ccggctctcc gcaattctgg aagcggtggt 11520
cccggcgcgc gcaaacccca cgcacgagaa ggtgctggcg atcgtaaacg cgctggccga 11580
aaacagggcc atccggcccg acgaggccgg cctggtctac gacgcgctgc ttcagcgcgt 11640
ggctcgttac aacagcggca acgtgcagac caacctggac cggctggtgg gggatgtgcg 11700
cgaggccgtg gcgcagcgtg agcgcgcgca gcagcagggc aacctgggct ccatggttgc 11760
actaaacgcc ttcctgagta cacagcccgc caacgtgccg cggggacagg aggactacac 11820
caactttgtg agcgcactgc ggctaatggt gactgagaca ccgcaaagtg aggtgtacca 11880
gtctgggcca gactattttt tccagaccag tagacaaggc ctgcagaccg taaacctgag 11940
ccaggctttc aaaaacttgc aggggctgtg gggggtgcgg gctcccacag gcgaccgcgc 12000
gaccgtgtct agcttgctga cgcccaactc gcgcctgttg ctgctgctaa tagcgccctt 12060
cacggacagt ggcagcgtgt cccgggacac atacctaggt cacttgctga cactgtaccg 12120
cgaggccata ggtcaggcgc atgtggacga gcatactttc caggagatta caagtgtcag 12180
ccgcgcgctg gggcaggagg acacgggcag cctggaggca accctaaact acctgctgac 12240
caaccggcgg cagaagatcc cctcgttgca cagtttaaac agcgaggagg agcgcatttt 12300
gcgctacgtg cagcagagcg tgagccttaa cctgatgcgc gacggggtaa cgcccagcgt 12360
ggcgctggac atgaccgcgc gcaacatgga accgggcatg tatgcctcaa accggccgtt 12420
tatcaaccgc ctaatggact acttgcatcg cgcggccgcc gtgaaccccg agtatttcac 12480
caatgccatc ttgaacccgc actggctacc gccccctggt ttctacaccg ggggattcga 12540
ggtgcccgag ggtaacgatg gattcctctg ggacgacata gacgacagcg tgttttcccc 12600
gcaaccgcag accctgctag agttgcaaca gcgcgagcag gcagaggcgg cgctgcgaaa 12660
ggaaagcttc cgcaggccaa gcagcttgtc cgatctaggc gctgcggccc cgcggtcaga 12720
tgctagtagc ccatttccaa gcttgatagg gtctcttacc agcactcgca ccacccgccc 12780
gcgcctgctg ggcgaggagg agtacctaaa caactcgctg ctgcagccgc agcgcgaaaa 12840
aaacctgcct ccggcatttc ccaacaacgg gatagagagc ctagtggaca agatgagtag 12900
atggaagacg tacgcgcagg agcacaggga cgtgccaggc ccgcgcccgc ccacccgtcg 12960
tcaaaggcac gaccgtcagc ggggtctggt gtgggaggac gatgactcgg cagacgacag 13020
cagcgtcctg gatttgggag ggagtggcaa cccgtttgcg caccttcgcc ccaggctggg 13080
gagaatgttt taaaaaaaaa aaagcatgat gcaaaataaa aaactcacca aggccatggc 13140
accgagcgtt ggttttcttg tattcccctt agtatgcggc gcgcggcgat gtatgaggaa 13200
ggtcctcctc cctcctacga gagtgtggtg agcgcggcgc cagtggcggc ggcgctgggt 13260
tctcccttcg atgctcccct ggacccgccg tttgtgcctc cgcggtacct gcggcctacc 13320
ggggggagaa acagcatccg ttactctgag ttggcacccc tattcgacac cacccgtgtg 13380
tacctggtgg acaacaagtc aacggatgtg gcatccctga actaccagaa cgaccacagc 13440
aactttctga ccacggtcat tcaaaacaat gactacagcc cgggggaggc aagcacacag 13500
accatcaatc ttgacgaccg gtcgcactgg ggcggcgacc tgaaaaccat cctgcatacc 13560
aacatgccaa atgtgaacga gttcatgttt accaataagt ttaaggcgcg ggtgatggtg 13620
tcgcgcttgc ctactaagga caatcaggtg gagctgaaat acgagtgggt ggagttcacg 13680
ctgcccgagg gcaactactc cgagaccatg accatagacc ttatgaacaa cgcgatcgtg 13740
gagcactact tgaaagtggg cagacagaac ggggttctgg aaagcgacat cggggtaaag 13800
tttgacaccc gcaacttcag actggggttt gaccccgtca ctggtcttgt catgcctggg 13860
gtatatacaa acgaagcctt ccatccagac atcattttgc tgccaggatg cggggtggac 13920
ttcacccaca gccgcctgag caacttgttg ggcatccgca agcggcaacc cttccaggag 13980
ggctttagga tcacctacga tgatctggag ggtggtaaca ttcccgcact gttggatgtg 14040
gacgcctacc aggcgagctt gaaagatgac accgaacagg gcgggggtgg cgcaggcggc 14100
agcaacagca gtggcagcgg cgcggaagag aactccaacg cggcagccgc ggcaatgcag 14160
ccggtggagg acatgaacga tcatgccatt cgcggcgaca cctttgccac acgggctgag 14220
gagaagcgcg ctgaggccga agcagcggcc gaagctgccg cccccgctgc gcaacccgag 14280
gtcgagaagc ctcagaagaa accggtgatc aaacccctga cagaggacag caagaaacgc 14340
agttacaacc taataagcaa tgacagcacc ttcacccagt accgcagctg gtaccttgca 14400
tacaactacg gcgaccctca gaccggaatc cgctcatgga ccctgctttg cactcctgac 14460
gtaacctgcg gctcggagca ggtctactgg tcgttgccag acatgatgca agaccccgtg 14520
accttccgct ccacgcgcca gatcagcaac tttccggtgg tgggcgccga gctgttgccc 14580
gtgcactcca agagcttcta caacgaccag gccgtctact cccaactcat ccgccagttt 14640
acctctctga cccacgtgtt caatcgcttt cccgagaacc agattttggc gcgcccgcca 14700
gcccccacca tcaccaccgt cagtgaaaac gttcctgctc tcacagatca cgggacgcta 14760
ccgctgcgca acagcatcgg aggagtccag cgagtgacca ttactgacgc cagacgccgc 14820
acctgcccct acgtttacaa ggccctgggc atagtctcgc cgcgcgtcct atcgagccgc 14880
actttttgag caagcatgtc catccttata tcgcccagca ataacacagg ctggggcctg 14940
cgcttcccaa gcaagatgtt tggcggggcc aagaagcgct ccgaccaaca cccagtgcgc 15000
gtgcgcgggc actaccgcgc gccctggggc gcgcacaaac gcggccgcac tgggcgcacc 15060
accgtcgatg acgccatcga cgcggtggtg gaggaggcgc gcaactacac gcccacgccg 15120
ccaccagtgt ccacagtgga cgcggccatt cagaccgtgg tgcgcggagc ccggcgctat 15180
gctaaaatga agagacggcg gaggcgcgta gcacgtcgcc accgccgccg acccggcact 15240
gccgcccaac gcgcggcggc ggccctgctt aaccgcgcac gtcgcaccgg ccgacgggcg 15300
gccatgcggg ccgctcgaag gctggccgcg ggtattgtca ctgtgccccc caggtccagg 15360
cgacgagcgg ccgccgcagc agccgcggcc attagtgcta tgactcaggg tcgcaggggc 15420
aacgtgtatt gggtgcgcga ctcggttagc ggcctgcgcg tgcccgtgcg cacccgcccc 15480
ccgcgcaact agattgcaag aaaaaactac ttagactcgt actgttgtat gtatccagcg 15540
gcggcggcgc gcaacgaagc tatgtccaag cgcaaaatca aagaagagat gctccaggtc 15600
atcgcgccgg agatctatgg ccccccgaag aaggaagagc aggattacaa gccccgaaag 15660
ctaaagcggg tcaaaaagaa aaagaaagat gatgatgatg aacttgacga cgaggtggaa 15720
ctgctgcacg ctaccgcgcc caggcgacgg gtacagtgga aaggtcgacg cgtaaaacgt 15780
gttttgcgac ccggcaccac cgtagtcttt acgcccggtg agcgctccac ccgcacctac 15840
aagcgcgtgt atgatgaggt gtacggcgac gaggacctgc ttgagcaggc caacgagcgc 15900
ctcggggagt ttgcctacgg aaagcggcat aaggacatgc tggcgttgcc gctggacgag 15960
ggcaacccaa cacctagcct aaagcccgta acactgcagc aggtgctgcc cgcgcttgca 16020
ccgtccgaag aaaagcgcgg cctaaagcgc gagtctggtg acttggcacc caccgtgcag 16080
ctgatggtac ccaagcgcca gcgactggaa gatgtcttgg aaaaaatgac cgtggaacct 16140
gggctggagc ccgaggtccg cgtgcggcca atcaagcagg tggcgccggg actgggcgtg 16200
cagaccgtgg acgttcagat acccactacc agtagcacca gtattgccac cgccacagag 16260
ggcatggaga cacaaacgtc cccggttgcc tcagcggtgg cggatgccgc ggtgcaggcg 16320
gtcgctgcgg ccgcgtccaa gacctctacg gaggtgcaaa cggacccgtg gatgtttcgc 16380
gtttcagccc cccggcgccc gcgccgttcg aggaagtacg gcgccgccag cgcgctactg 16440
cccgaatatg ccctacatcc ttccattgcg cctacccccg gctatcgtgg ctacacctac 16500
cgccccagaa gacgagcaac tacccgacgc cgaaccacca ctggaacccg ccgccgccgt 16560
cgccgtcgcc agcccgtgct ggccccgatt tccgtgcgca gggtggctcg cgaaggaggc 16620
aggaccctgg tgctgccaac agcgcgctac caccccagca tcgtttaaaa gccggtcttt 16680
gtggttcttg cagatatggc cctcacctgc cgcctccgtt tcccggtgcc gggattccga 16740
ggaagaatgc accgtaggag gggcatggcc ggccacggcc tgacgggcgg catgcgtcgt 16800
gcgcaccacc ggcggcggcg cgcgtcgcac cgtcgcatgc gcggcggtat cctgcccctc 16860
cttattccac tgatcgccgc ggcgattggc gccgtgcccg gaattgcatc cgtggccttg 16920
caggcgcaga gacactgatt aaaaacaagt tgcatgtgga aaaatcaaaa taaaaagtct 16980
ggactctcac gctcgcttgg tcctgtaact attttgtaga atggaagaca tcaactttgc 17040
gtctctggcc ccgcgacacg gctcgcgccc gttcatggga aactggcaag atatcggcac 17100
cagcaatatg agcggtggcg ccttcagctg gggctcgctg tggagcggca ttaaaaattt 17160
cggttccacc gttaagaact atggcagcaa ggcctggaac agcagcacag gccagatgct 17220
gagggataag ttgaaagagc aaaatttcca acaaaaggtg gtagatggcc tggcctctgg 17280
cattagcggg gtggtggacc tggccaacca ggcagtgcaa aataagatta acagtaagct 17340
tgatccccgc cctcccgtag aggagcctcc accggccgtg gagacagtgt ctccagaggg 17400
gcgtggcgaa aagcgtccgc gccccgacag ggaagaaact ctggtgacgc aaatagacga 17460
gcctccctcg tacgaggagg cactaaagca aggcctgccc accacccgtc ccatcgcgcc 17520
catggctacc ggagtgctgg gccagcacac acccgtaacg ctggacctgc ctccccccgc 17580
cgacacccag cagaaacctg tgctgccagg cccgaccgcc gttgttgtaa cccgtcctag 17640
ccgcgcgtcc ctgcgccgcg ccgccagcgg tccgcgatcg ttgcggcccg tagccagtgg 17700
caactggcaa agcacactga acagcatcgt gggtctgggg gtgcaatccc tgaagcgccg 17760
acgatgcttc tgatagctaa cgtgtcgtat gtgtgtcatg tatgcgtcca tgtcgccgcc 17820
agaggagctg ctgagccgcc gcgcgcccgc tttccaagat ggctacccct tcgatgatgc 17880
cgcagtggtc ttacatgcac atctcgggcc aggacgcctc ggagtacctg agccccgggc 17940
tggtgcagtt tgcccgcgcc accgagacgt acttcagcct gaataacaag tttagaaacc 18000
ccacggtggc gcctacgcac gacgtgacca cagaccggtc ccagcgtttg acgctgcggt 18060
tcatccctgt ggaccgtgag gatactgcgt actcgtacaa ggcgcggttc accctagctg 18120
tgggtgataa ccgtgtgctg gacatggctt ccacgtactt tgacatccgc ggcgtgctgg 18180
acaggggccc tacttttaag ccctactctg gcactgccta caacgccctg gctcccaagg 18240
gtgccccaaa tccttgcgaa tgggatgaag ctgctactgc tcttgaaata aacctagaag 18300
aagaggacga tgacaacgaa gacgaagtag acgagcaagc tgagcagcaa aaaactcacg 18360
tatttgggca ggcgccttat tctggtataa atattacaaa ggagggtatt caaataggtg 18420
tcgaaggtca aacacctaaa tatgccgata aaacatttca acctgaacct caaataggag 18480
aatctcagtg gtacgaaaca gaaattaatc atgcagctgg gagagtccta aaaaagacta 18540
ccccaatgaa accatgttac ggttcatatg caaaacccac aaatgaaaat ggagggcaag 18600
gcattcttgt aaagcaacaa aatggaaagc tagaaagtca agtggaaatg caatttttct 18660
caactactga ggcagccgca ggcaatggtg ataacttgac tcctaaagtg gtattgtaca 18720
gtgaagatgt agatatagaa accccagaca ctcatatttc ttacatgccc actattaagg 18780
aaggtaactc acgagaacta atgggccaac aatctatgcc caacaggcct aattacattg 18840
cttttaggga caattttatt ggtctaatgt attacaacag cacgggtaat atgggtgttc 18900
tggcgggcca agcatcgcag ttgaatgctg ttgtagattt gcaagacaga aacacagagc 18960
tttcatacca gcttttgctt gattccattg gtgatagaac caggtacttt tctatgtgga 19020
atcaggctgt tgacagctat gatccagatg ttagaattat tgaaaatcat ggaactgaag 19080
atgaacttcc aaattactgc tttccactgg gaggtgtgat taatacagag actcttacca 19140
aggtaaaacc taaaacaggt caggaaaatg gatgggaaaa agatgctaca gaattttcag 19200
ataaaaatga aataagagtt ggaaataatt ttgccatgga aatcaatcta aatgccaacc 19260
tgtggagaaa tttcctgtac tccaacatag cgctgtattt gcccgacaag ctaaagtaca 19320
gtccttccaa cgtaaaaatt tctgataacc caaacaccta cgactacatg aacaagcgag 19380
tggtggctcc cgggctagtg gactgctaca ttaaccttgg agcacgctgg tcccttgact 19440
atatggacaa cgtcaaccca tttaaccacc accgcaatgc tggcctgcgc taccgctcaa 19500
tgttgctggg caatggtcgc tatgtgccct tccacatcca ggtgcctcag aagttctttg 19560
ccattaaaaa cctccttctc ctgccgggct catacaccta cgagtggaac ttcaggaagg 19620
atgttaacat ggttctgcag agctccctag gaaatgacct aagggttgac ggagccagca 19680
ttaagtttga tagcatttgc ctttacgcca ccttcttccc catggcccac aacaccgcct 19740
ccacgcttga ggccatgctt agaaacgaca ccaacgacca gtcctttaac gactatctct 19800
ccgccgccaa catgctctac cctatacccg ccaacgctac caacgtgccc atatccatcc 19860
cctcccgcaa ctgggcggct ttccgcggct gggccttcac gcgccttaag actaaggaaa 19920
ccccatcact gggctcgggc tacgaccctt attacaccta ctctggctct ataccctacc 19980
tagatggaac cttttacctc aaccacacct ttaagaaggt ggccattacc tttgactctt 20040
ctgtcagctg gcctggcaat gaccgcctgc ttacccccaa cgagtttgaa attaagcgct 20100
cagttgacgg ggagggttac aacgttgccc agtgtaacat gaccaaagac tggttcctgg 20160
tacaaatgct agctaactat aacattggct accagggctt ctatatccca gagagctaca 20220
aggaccgcat gtactccttc tttagaaact tccagcccat gagccgtcag gtggtggatg 20280
atactaaata caaggactac caacaggtgg gcatcctaca ccaacacaac aactctggat 20340
ttgttggcta ccttgccccc accatgcgcg aaggacaggc ctaccctgct aacttcccct 20400
atccgcttat aggcaagacc gcagttgaca gcattaccca gaaaaagttt ctttgcgatc 20460
gcaccctttg gcgcatccca ttctccagta actttatgtc catgggcgca ctcacagacc 20520
tgggccaaaa ccttctctac gccaactccg cccacgcgct agacatgact tttgaggtgg 20580
atcccatgga cgagcccacc cttctttatg ttttgtttga agtctttgac gtggtccgtg 20640
tgcaccagcc gcaccgcggc gtcatcgaaa ccgtgtacct gcgcacgccc ttctcggccg 20700
gcaacgccac aacataaaga agcaagcaac atcaacaaca gctgccgcca tgggctccag 20760
tgagcaggaa ctgaaagcca ttgtcaaaga tcttggttgt gggccatatt ttttgggcac 20820
ctatgacaag cgctttccag gctttgtttc tccacacaag ctcgcctgcg ccatagtcaa 20880
tacggccggt cgcgagactg ggggcgtaca ctggatggcc tttgcctgga acccgcactc 20940
aaaaacatgc tacctctttg agccctttgg cttttctgac cagcgactca agcaggttta 21000
ccagtttgag tacgagtcac tcctgcgccg tagcgccatt gcttcttccc ccgaccgctg 21060
tataacgctg gaaaagtcca cccaaagcgt acaggggccc aactcggccg cctgtggact 21120
attctgctgc atgtttctcc acgcctttgc caactggccc caaactccca tggatcacaa 21180
ccccaccatg aaccttatta ccggggtacc caactccatg ctcaacagtc cccaggtaca 21240
gcccaccctg cgtcgcaacc aggaacagct ctacagcttc ctggagcgcc actcgcccta 21300
cttccgcagc cacagtgcgc agattaggag cgccacttct ttttgtcact tgaaaaacat 21360
gtaaaaataa tgtactagag acactttcaa taaaggcaaa tgcttttatt tgtacactct 21420
cgggtgatta tttaccccca cccttgccgt ctgcgccgtt taaaaatcaa aggggttctg 21480
ccgcgcatcg ctatgcgcca ctggcaggga cacgttgcga tactggtgtt tagtgctcca 21540
cttaaactca ggcacaacca tccgcggcag ctcggtgaag ttttcactcc acaggctgcg 21600
caccatcacc aacgcgttta gcaggtcggg cgccgatatc ttgaagtcgc agttggggcc 21660
tccgccctgc gcgcgcgagt tgcgatacac agggttgcag cactggaaca ctatcagcgc 21720
cgggtggtgc acgctggcca gcacgctctt gtcggagatc agatccgcgt ccaggtcctc 21780
cgcgttgctc agggcgaacg gagtcaactt tggtagctgc cttcccaaaa agggcgcgtg 21840
cccaggcttt gagttgcact cgcaccgtag tggcatcaaa aggtgaccgt gcccggtctg 21900
ggcgttagga tacagcgcct gcataaaagc cttgatctgc ttaaaagcca cctgagcctt 21960
tgcgccttca gagaagaaca tgccgcaaga cttgccggaa aactgattgg ccggacaggc 22020
cgcgtcgtgc acgcagcacc ttgcgtcggt gttggagatc tgcaccacat ttcggcccca 22080
ccggttcttc acgatcttgg ccttgctaga ctgctccttc agcgcgcgct gcccgttttc 22140
gctcgtcaca tccatttcaa tcacgtgctc cttatttatc ataatgcttc cgtgtagaca 22200
cttaagctcg ccttcgatct cagcgcagcg gtgcagccac aacgcgcagc ccgtgggctc 22260
gtgatgcttg taggtcacct ctgcaaacga ctgcaggtac gcctgcagga atcgccccat 22320
catcgtcaca aaggtcttgt tgctggtgaa ggtcagctgc aacccgcggt gctcctcgtt 22380
cagccaggtc ttgcatacgg ccgccagagc ttccacttgg tcaggcagta gtttgaagtt 22440
cgcctttaga tcgttatcca cgtggtactt gtccatcagc gcgcgcgcag cctccatgcc 22500
cttctcccac gcagacacga tcggcacact cagcgggttc atcaccgtaa tttcactttc 22560
cgcttcgctg ggctcttcct cttcctcttg cgtccgcata ccacgcgcca ctgggtcgtc 22620
ttcattcagc cgccgcactg tgcgcttacc tcctttgcca tgcttgatta gcaccggtgg 22680
gttgctgaaa cccaccattt gtagcgccac atcttctctt tcttcctcgc tgtccacgat 22740
tacctctggt gatggcgggc gctcgggctt gggagaaggg cgcttctttt tcttcttggg 22800
cgcaatggcc aaatccgccg ccgaggtcga tggccgcggg ctgggtgtgc gcggcaccag 22860
cgcgtcttgt gatgagtctt cctcgtcctc ggactcgata cgccgcctca tccgcttttt 22920
tgggggcgcc cggggaggcg gcggcgacgg ggacggggac gacacgtcct ccatggttgg 22980
gggacgtcgc gccgcaccgc gtccgcgctc gggggtggtt tcgcgctgct cctcttcccg 23040
actggccatt tccttctcct ataggcagaa aaagatcatg gagtcagtcg agaagaagga 23100
cagcctaacc gccccctctg agttcgccac caccgcctcc accgatgccg ccaacgcgcc 23160
taccaccttc cccgtcgagg cacccccgct tgaggaggag gaagtgatta tcgagcagga 23220
cccaggtttt gtaagcgaag acgacgagga ccgctcagta ccaacagagg ataaaaagca 23280
agaccaggac aacgcagagg caaacgagga acaagtcggg cggggggacg aaaggcatgg 23340
cgactaccta gatgtgggag acgacgtgct gttgaagcat ctgcagcgcc agtgcgccat 23400
tatctgcgac gcgttgcaag agcgcagcga tgtgcccctc gccatagcgg atgtcagcct 23460
tgcctacgaa cgccacctat tctcaccgcg cgtacccccc aaacgccaag aaaacggcac 23520
atgcgagccc aacccgcgcc tcaacttcta ccccgtattt gccgtgccag aggtgcttgc 23580
cacctatcac atctttttcc aaaactgcaa gataccccta tcctgccgtg ccaaccgcag 23640
ccgagcggac aagcagctgg ccttgcggca gggcgctgtc atacctgata tcgcctcgct 23700
caacgaagtg ccaaaaatct ttgagggtct tggacgcgac gagaagcgcg cggcaaacgc 23760
tctgcaacag gaaaacagcg aaaatgaaag tcactctgga gtgttggtgg aactcgaggg 23820
tgacaacgcg cgcctagccg tactaaaacg cagcatcgag gtcacccact ttgcctaccc 23880
ggcacttaac ctacccccca aggtcatgag cacagtcatg agtgagctga tcgtgcgccg 23940
tgcgcagccc ctggagaggg atgcaaattt gcaagaacaa acagaggagg gcctacccgc 24000
agttggcgac gagcagctag cgcgctggct tcaaacgcgc gagcctgccg acttggagga 24060
gcgacgcaaa ctaatgatgg ccgcagtgct cgttaccgtg gagcttgagt gcatgcagcg 24120
gttctttgct gacccggaga tgcagcgcaa gctagaggaa acattgcact acacctttcg 24180
acagggctac gtacgccagg cctgcaagat ctccaacgtg gagctctgca acctggtctc 24240
ctaccttgga attttgcacg aaaaccgcct tgggcaaaac gtgcttcatt ccacgctcaa 24300
gggcgaggcg cgccgcgact acgtccgcga ctgcgtttac ttatttctat gctacacctg 24360
gcagacggcc atgggcgttt ggcagcagtg cttggaggag tgcaacctca aggagctgca 24420
gaaactgcta aagcaaaact tgaaggacct atggacggcc ttcaacgagc gctccgtggc 24480
cgcgcacctg gcggacatca ttttccccga acgcctgctt aaaaccctgc aacagggtct 24540
gccagacttc accagtcaaa gcatgttgca gaactttagg aactttatcc tagagcgctc 24600
aggaatcttg cccgccacct gctgtgcact tcctagcgac tttgtgccca ttaagtaccg 24660
cgaatgccct ccgccgcttt ggggccactg ctaccttctg cagctagcca actaccttgc 24720
ctaccactct gacataatgg aagacgtgag cggtgacggt ctactggagt gtcactgtcg 24780
ctgcaaccta tgcaccccgc accgctccct ggtttgcaat tcgcagctgc ttaacgaaag 24840
tcaaattatc ggtacctttg agctgcaggg tccctcgcct gacgaaaagt ccgcggctcc 24900
ggggttgaaa ctcactccgg ggctgtggac gtcggcttac cttcgcaaat ttgtacctga 24960
ggactaccac gcccacgaga ttaggttcta cgaagaccaa tcccgcccgc ctaatgcgga 25020
gcttaccgcc tgcgtcatta cccagggcca cattcttggc caattgcaag ccatcaacaa 25080
agcccgccaa gagtttctgc tacgaaaggg acggggggtt tacttggacc cccagtccgg 25140
cgaggagctc aacccaatcc ccccgccgcc gcagccctat cagcagcagc cgcgggccct 25200
tgcttcccag gatggcaccc aaaaagaagc tgcagctgcc gccgccaccc acggacgagg 25260
aggaatactg ggacagtcag gcagaggagg ttttggacga ggaggaggag gacatgatgg 25320
aagactggga gagcctagac gaggaagctt ccgaggtcga agaggtgtca gacgaaacac 25380
cgtcaccctc ggtcgcattc ccctcgccgg cgccccagaa atcggcaacc ggttccagca 25440
tggctacaac ctccgctcct caggcgccgc cggcactgcc cgttcgccga cccaaccgta 25500
gatgggacac cactggaacc agggccggta agtccaagca gccgccgccg ttagcccaag 25560
agcaacaaca gcgccaaggc taccgctcat ggcgcgggca caagaacgcc atagttgctt 25620
gcttgcaaga ctgtgggggc aacatctcct tcgcccgccg ctttcttctc taccatcacg 25680
gcgtggcctt cccccgtaac atcctgcatt actaccgtca tctctacagc ccatactgca 25740
ccggcggcag cggcagcaac agcagcggcc acacagaagc aaaggcgacc ggatagcaag 25800
actctgacaa agcccaagaa atccacagcg gcggcagcag caggaggagg agcgctgcgt 25860
ctggcgccca acgaacccgt atcgacccgc gagcttagaa acaggatttt tcccactctg 25920
tatgctatat ttcaacagag caggggccaa gaacaagagc tgaaaataaa aaacaggtct 25980
ctgcgatccc tcacccgcag ctgcctgtat cacaaaagcg aagatcagct tcggcgcacg 26040
ctggaagacg cggaggctct cttcagtaaa tactgcgcgc tgactcttaa ggactagttt 26100
cgcgcccttt ctcaaattta agcgcgaaaa ctacgtcatc tccagcggcc acacccggcg 26160
ccagcacctg ttgtcagcgc cattatgagc aaggaaattc ccacgcccta catgtggagt 26220
taccagccac aaatgggact tgcggctgga gctgcccaag actactcaac ccgaataaac 26280
tacatgagcg cgggacccca catgatatcc cgggtcaacg gaatacgcgc ccaccgaaac 26340
cgaattctcc tggaacaggc ggctattacc accacacctc gtaataacct taatccccgt 26400
agttggcccg ctgccctggt gtaccaggaa agtcccgctc ccaccactgt ggtacttccc 26460
agagacgccc aggccgaagt tcagatgact aactcagggg cgcagcttgc gggcggcttt 26520
cgtcacaggg tgcggtcgcc cgggcagggt ataactcacc tgacaatcag agggcgaggt 26580
attcagctca acgacgagtc ggtgagctcc tcgcttggtc tccgtccgga cgggacattt 26640
cagatcggcg gcgccggccg ctcttcattc acgcctcgtc aggcaatcct aactctgcag 26700
acctcgtcct ctgagccgcg ctctggaggc attggaactc tgcaatttat tgaggagttt 26760
gtgccatcgg tctactttaa ccccttctcg ggacctcccg gccactatcc ggatcaattt 26820
attcctaact ttgacgcggt aaaggactcg gcggacggct acgactgaat gttaagtgga 26880
gaggcagagc aactgcgcct gaaacacctg gtccactgtc gccgccacaa gtgctttgcc 26940
cgcgactccg gtgagttttg ctactttgaa ttgcccgagg atcatatcga gggcccggcg 27000
cacggcgtcc ggcttaccgc ccagggagag cttgcccgta gcctgattcg ggagtttacc 27060
cagcgccccc tgctagttga gcgggacagg ggaccctgtg ttctcactgt gatttgcaac 27120
tgtcctaacc ctggattaca tcaagatcct ctagttaatg tcaggtcgcc taagtcgatt 27180
aactagagta cccggggatc ttattccctt taactaataa aaaaaaataa taaagcatca 27240
cttacttaaa atcagttagc aaatttctgt ccagtttatt cagcagcacc tccttgccct 27300
cctcccagct ctggtattgc agcttcctcc tggctgcaaa ctttctccac aatctaaatg 27360
gaatgtcagt ttcctcctgt tcctgtccat ccgcacccac tatcttcatg ttgttgcaga 27420
tgaagcgcgc aagaccgtct gaagatacct tcaaccccgt gtatccatat gacacggaaa 27480
ccggtcctcc aactgtgcct tttcttactc ctccctttgt atcccccaat gggtttcaag 27540
agagtccccc tggggtactc tctttgcgcc tatccgaacc tctagttacc tccaatggca 27600
tgcttgcgct caaaatgggc aacggcctct ctctggacga ggccggcaac cttacctccc 27660
aaaatgtaac cactgtgagc ccacctctca aaaaaaccaa gtcaaacata aacctggaaa 27720
tatctgcacc cctcacagtt acctcagaag ccctaactgt ggctgccgcc gcacctctaa 27780
tggtcgcggg caacacactc accatgcaat cacaggcccc gctaaccgtg cacgactcca 27840
aacttagcat tgccacccaa ggacccctca cagtgtcaga aggaaagcta gccctgcaaa 27900
catcaggccc cctcaccacc accgatagca gtacccttac tatcactgcc tcaccccctc 27960
taactactgc cactggtagc ttgggcattg acttgaaaga gcccatttat acacaaaatg 28020
gaaaactagg actaaagtac ggggctcctt tgcatgtaac agacgaccta aacactttga 28080
ccgtagcaac tggtccaggt gtgactatta ataatacttc cttgcaaact aaagttactg 28140
gagccttggg ttttgattca caaggcaata tgcaacttaa tgtagcagga ggactaagga 28200
ttgattctca aaacagacgc cttatacttg atgttagtta tccgtttgat gctcaaaacc 28260
aactaaatct aagactagga cagggccctc tttttataaa ctcagcccac aacttggata 28320
ttaactacaa caaaggcctt tacttgttta cagcttcaaa caattccaaa aagcttgagg 28380
ttaacctaag cactgccaag gggttgatgt ttgacgctac agccatagcc attaatgcag 28440
gagatgggct tgaatttggt tcacctaatg caccaaacac aaatcccctc aaaacaaaaa 28500
ttggccatgg cctagaattt gattcaaaca aggctatggt tcctaaacta ggaactggcc 28560
ttagttttga cagcacaggt gccattacag taggaaacaa aaataatgat aagctaactt 28620
tgtggaccac accagctcca tctcctaact gtagactaaa tgcagagaaa gatgctaaac 28680
tcactttggt cttaacaaaa tgtggcagtc aaatacttgc tacagtttca gttttggctg 28740
ttaaaggcag tttggctcca atatctggaa cagttcaaag tgctcatctt attataagat 28800
ttgacgaaaa tggagtgcta ctaaacaatt ccttcctgga cccagaatat tggaacttta 28860
gaaatggaga tcttactgaa ggcacagcct atacaaacgc tgttggattt atgcctaacc 28920
tatcagctta tccaaaatct cacggtaaaa ctgccaaaag taacattgtc agtcaagttt 28980
acttaaacgg agacaaaact aaacctgtaa cactaaccat tacactaaac ggtacacagg 29040
aaacaggaga cacaactcca agtgcatact ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc 29100
acaactacat taatgaaata tttgccacat cctcttacac tttttcatac attgcccaag 29160
aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac gtgtttattt ttcaattgca gaaaatttca 29220
agtcattttt cattcagtag tatagcccca ccaccacata gcttatacag atcaccgtac 29280
cttaatcaaa ctcacagaac cctagtattc aacctgccac ctccctccca acacacagag 29340
tacacagtcc tttctccccg gctggcctta aaaagcatca tatcatgggt aacagacata 29400
ttcttaggtg ttatattcca cacggtttcc tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta 29460
ataaactccc cgggcagctc acttaagttc atgtcgctgt ccagctgctg agccacaggc 29520
tgctgtccaa cttgcggttg cttaacgggc ggcgaaggag aagtccacgc ctacatgggg 29580
gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc gcgaataaac 29640
tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc ctcagcgatg 29700
attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc 29760
tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag 29820
tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg gccatcatac 29880
cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat aaacattacc 29940
tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg attaaacatg 30000
gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc 30060
agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc atggatcatc 30120
atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg 30180
attacaagct cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc 30240
gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg 30300
ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa 30360
ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt 30420
agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg 30480
ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg tgtagtagtt 30540
gtagtatatc cactctctca aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt ctatgtaaac 30600
tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc caccaccgca gaataagcca cacccagcca 30660
acctacacat tcgttctgcg agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg gaagaaccat 30720
gttttttttt ttattccaaa agattatcca aaacctcaaa atgaagatct attaagtgaa 30780
cgcgctcccc tccggtggcg tggtcaaact ctacagccaa agaacagata atggcatttg 30840
taagatgttg cacaatggct tccaaaaggc aaacggccct cacgtccaag tggacgtaaa 30900
ggctaaaccc ttcagggtga atctcctcta taaacattcc agcaccttca accatgccca 30960
aataattctc atctcgccac cttctcaata tatctctaag caaatcccga atattaagtc 31020
cggccattgt aaaaatctgc tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag cagcgaatca 31080
tgattgcaaa aattcaggtt cctcacagac ctgtataaga ttcaaaagcg gaacattaac 31140
aaaaataccg cgatcccgta ggtcccttcg cagggccagc tgaacataat cgtgcaggtc 31200
tgcacggacc agcgcggcca cttccccgcc aggaaccatg acaaaagaac ccacactgat 31260
tatgacacgc atactcggag ctatgctaac cagcgtagcc ccgatgtaag cttgttgcat 31320
gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa 31380
agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac 31440
agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata 31500
aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt 31560
ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga 31620
ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta 31680
aacacatcag gttgattcac atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga 31740
atacataccc gcaggcgtag agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta 31800
ataggagaga aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc 31860
tcccgctcca gaacaacata cagcgcttcc acagcggcag ccataacagt cagccttacc 31920
agtaaaaaag aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca 31980
cagtgtaaaa aagggccaag tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg 32040
gttaaagtcc acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag 32100
ccaaaaaacc cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtcacttcc 32160
cattttaaga aaactacaat tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc 32220
acccgccccg ttcccacgcc ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt 32280
ggcttcaatc caaaataagg tatattattg atgat 32315
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 4
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1 5
<210> 5
<211> 1826
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cgctccacct ctcaagcagc cagcgcctgc ctgaatctgt tctgccccct ccccacccat 60
ttcaccacca ccatgacacc gggcacccag tctcctttct tcctgctgct gctcctcaca 120
gtgcttacag ttgttacggg ttctggtcat gcaagctcta ccccaggtgg agaaaaggag 180
acttcggcta cccagagaag ttcagtgccc agctctactg agaagaatgc tgtgagtatg 240
accagcagcg tactctccag ccacagcccc ggttcaggct cctccaccac tcagggacag 300
gatgtcactc tggccccggc cacggaacca gcttcaggtt cagctgccac ctggggacag 360
gatgtcacct cggtcccagt caccaggcca gccctgggct ccaccacccc gccagcccac 420
gatgtcacct cagccccgga caacaagcca gccccgggct ccaccgcccc cccagcccac 480
ggtgtcacct cggccccgga caccaggccg gccccgggct ccaccgcccc cccagcccat 540
ggtgtcacct cggccccgga caacaggccc gccttgggct ccaccgcccc tccagtccac 600
aatgtcacct cggcctcagg ctctgcatca ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 660
acctctgcca gggctaccac aaccccagcc agcaagagca ctccattctc aattcccagc 720
caccactctg atactcctac cacccttgcc agccatagca ccaagactga tgccagtagc 780
actcaccata gcacggtacc tcctctcacc tcctccaatc acagcacttc tccccagttg 840
tctactgggg tctctttctt tttcctgtct tttcacattt caaacctcca gtttaattcc 900
tctctggaag atcccagcac cgactactac caagagctgc agagagacat ttctgaaatg 960
tttttgcaga tttataaaca agggggtttt ctgggcctct ccaatattaa gttcaggcca 1020
ggatctgtgg tggtacaatt gactctggcc ttccgagaag gtaccatcaa tgtccacgac 1080
gtggagacac agttcaatca gtataaaacg gaagcagcct ctcgatataa cctgacgatc 1140
tcagacgtca gcgtgagtga tgtgccattt cctttctctg cccagtctgg ggctggggtg 1200
ccaggctggg gcatcgcgct gctggtgctg gtctgtgttc tggttgcgct ggccattgtc 1260
tatctcattg ccttggctgt ctgtcagtgc cgccgaaaga actacgggca gctggacatc 1320
tttccagccc gggataccta ccatcctatg agcgagtacc ccacctacca cacccatggg 1380
cgctatgtgc cccctagcag taccgatcgt agcccctatg agaaggtttc tgcaggtaat 1440
ggtggcagca gcctctctta cacaaaccca gcagtggcag ccacttctgc caacttgtag 1500
gggcacgtcg cccgctgagc tgagtggcca gccagtgcca ttccactcca ctcaggttct 1560
tcagggccag agcccctgca ccctgtttgg gctggtgagc tgggagttca ggtgggctgc 1620
tcacagcctc cttcagaggc cccaccaatt tctcggacac ttctcagtgt gtggaagctc 1680
atgtgggccc ctgagggctc atgcctggga agtgttgtgg tgggggctcc caggaggact 1740
ggcccagaga gccctgagat agcggggatc ctgaactgga ctgaataaaa cgtggtctcc 1800
cactgcgcca aaaaaaaaaa aaaaaa 1826
<210> 6
<211> 1826
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 6
cgctccacct ctcaagcagc cagcgcctgc ctgaatctgt tctgccccct ccccacccat 60
ttcaccacca ccatgacacc gggcacccag tctcctttct tcctgctgct gctcctcaca 120
gtgcttacag ttgttacggg ttctggtcat gcaagctcta ccccaggtgg agaaaaggag 180
acttcggcta cccagagaag ttcagtgccc agctctactg agaagaatgc tgtgagtatg 240
accagcagcg tactctccag ccacagcccc ggttcaggct cctccaccac tcagggacag 300
gatgtcactc tggccccggc cacggaacca gcttcaggtt cagctgccct ttggggacag 360
gatgtcacct cggtcccagt caccaggcca gccctgggct ccaccacccc gccagcccac 420
gatgtcacct cagccccgga caacaagcca gccccgggct ccaccgcccc cccagcccac 480
ggtgtcacct cgtatcttga caccaggccg gccccggttt atcttgcccc cccagcccat 540
ggtgtcacct cggccccgga caacaggccc gccttgggct ccaccgcccc tccagtccac 600
aatgtcacct cggcctcagg ctctgcatca ggctcagctt ctactctggt gcacaacggc 660
acctctgcca gggctaccac aaccccagcc agcaagagca ctccattctc aattcccagc 720
caccactctg atactcctac cacccttgcc agccatagca ccaagactga tgccagtagc 780
actcaccata gcacggtacc tcctctcacc tcctccaatc acagcacttc tccccagttg 840
tctactgggg tctctttctt tttcctgtct tttcacattt caaacctcca gtttaattcc 900
tctctggaag atcccagcac cgactactac caagagctgc agagagacat ttctgaaatg 960
tttttgcaga tttataaaca agggggtttt ctgggcctct ccaatattaa gttcaggcca 1020
ggatctgtgg tggtacaatt gactctggcc ttccgagaag gtaccatcaa tgtccacgac 1080
gtggagacac agttcaatca gtataaaacg gaagcagcct ctcgatataa cctgacgatc 1140
tcagacgtca gcgtgagtga tgtgccattt cctttctctg cccagtctgg ggctggggtg 1200
ccaggctggg gcatcgcgct gctggtgctg gtctgtgttc tggtttatct ggccattgtc 1260
tatctcattg ccttggctgt cgctcaggtt cgccgaaaga actacgggca gctggacatc 1320
tttccagccc gggataaata ccatcctatg agcgagtacg ctctttacca cacccatggg 1380
cgctatgtgc cccctagcag tcttttccgt agcccctatg agaaggtttc tgcaggtaat 1440
ggtggcagct atctctctta cacaaaccca gcagtggcag ccgcttctgc caacttgtag 1500
gggcacgtcg cccgctgagc tgagtggcca gccagtgcca ttccactcca ctcaggttct 1560
tcagggccag agcccctgca ccctgtttgg gctggtgagc tgggagttca ggtgggctgc 1620
tcacagcctc cttcagaggc cccaccaatt tctcggacac ttctcagtgt gtggaagctc 1680
atgtgggccc ctgagggctc atgcctggga agtgttgtgg tgggggctcc caggaggact 1740
ggcccagaga gccctgagat agcggggatc ctgaactgga ctgaataaaa cgtggtctcc 1800
cactgcgcca aaaaaaaaaa aaaaaa 1826
<210> 7
<211> 2500
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ggaggacact tctcagaagg ggttgttttg cttttgctta tttccgtcca tttccctctc 60
tgcgcgcgga ccttcctttt ccagatggtg agagccgcgg ggacacccga cgccggggca 120
ggctgatcca cgatcctggg tgtgcgtaac gccgcctggg gctccgtggg cgagggacgt 180
gtggggacag gtgcaccgga aactgccaga ctggagagtt gaggcatcgg aggcgcgaga 240
acagcactac tactgcggcg agacgagcgc ggcgcatccc aaagcccggc caaatgcgct 300
cgtccctggg aggggaggga ggcgcgcctg gagcggggac agtcttggtc cgcgccctcc 360
tcccgggtct gtgccgggac ccgggacccg ggagccgtcg caggtctcgg tccaaggggc 420
cccttttctc ggaagggcgg cggccaagag cagggaaggt ggatctcagg tagcgagtct 480
gggcttcggg gacggcgggg aggggagccg gacgggagga tgagctcccc tggcaccgag 540
agcgcgggaa agagcctgca gtaccgagtg gaccacctgc tgagcgccgt ggagaatgag 600
ctgcaggcgg gcagcgagaa gggcgacccc acagagcgcg aactgcgcgt gggcctggag 660
gagagcgagc tgtggctgcg cttcaaggag ctcaccaatg agatgatcgt gaccaagaac 720
ggcaggagga tgtttccggt gctgaaggtg aacgtgtctg gcctggaccc caacgccatg 780
tactccttcc tgctggactt cgtggcggcg gacaaccacc gctggaagta cgtgaacggg 840
gaatgggtgc cggggggcaa gccggagccg caggcgccca gctgcgtcta catccacccc 900
gactcgccca acttcggggc ccactggatg aaggctcccg tctccttcag caaagtcaag 960
ctcaccaaca agctcaacgg agggggccag atcatgctga actccttgca taagtatgag 1020
cctcgaatcc acatagtgag agttgggggt ccacagcgca tgatcaccag ccactgcttc 1080
cctgagaccc agttcatagc ggtgactgct tatcagaacg aggagatcac agctcttaaa 1140
attaagtaca atccatttgc aaaagctttc cttgatgcaa aggaaagaag tgatcacaaa 1200
gagatgatgg aggaacccgg agacagccag caacctgggt actcccaatg ggggtggctt 1260
cttcctggaa ccagcaccct gtgtccacct gcaaatcctc atcctcagtt tggaggtgcc 1320
ctctccctcc cctccacgca cagctgtgac aggtacccaa ccctgaggag ccaccggtcc 1380
tcaccctacc ccagccccta tgctcatcgg aacaattctc caacctattc tgacaactca 1440
cctgcatgtt tatccatgct gcaatcccat gacaattggt ccagccttgg aatgcctgcc 1500
catcccagca tgctccccgt gagccacaat gccagcccac ctaccagctc cagtcagtac 1560
cccagcctgt ggtctgtgag caacggcgcc gtcaccccgg gctcccaggc agcagccgtg 1620
tccaacgggc tgggggccca gttcttccgg ggctcccccg cgcactacac acccctcacc 1680
catccggtct cggcgccctc ttcctcggga tccccactgt acgaaggggc ggccgcggcc 1740
acagacatcg tggacagcca gtacgacgcc gcagcccaag gccgcctcat agcctcatgg 1800
acacctgtgt cgccaccttc catgtgaagc agcaaggccc aggtcccgaa agatgcagtg 1860
actttttgtc gtggcagcca gtggtgactg gattgaccta ctaggtaccc agtggcagtc 1920
tcaggttaag aaggaaatgc agcctcagta acttcctttt caaagcagtg gaggagcaca 1980
cggcaccttt ccccagagcc ccagcatccc ttgctcacac ctgcagtagc ggtgctgtcc 2040
caggtggctt acagatgaac ccaactgtgg agatgatgca gttggcccaa cctcactgac 2100
ggtgaaaaaa tgtttgccag ggtccagaaa ctttttttgg tttatttctc atacagtgta 2160
ttggcaactt tggcacacca gaatttgtaa actccaccag tcctacttta gtgagataaa 2220
aagcacactc ttaatcttct tccttgttgc tttcaagtag ttagagttga gctgttaagg 2280
acagaataaa atcatagttg aggacagcag gttttagttg aattgaaaat ttgactgctc 2340
tgccccctag aatgtgtgta ttttaagcat atgtagctaa tctcttgtgt tgttaaacta 2400
taactgtttc atatttttct tttgacaaag tagccaaaga caatcagcag aaagcatttt 2460
ctgcaaaata aacgcaatat gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2500
<210> 8
<211> 1251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
tctagagcca ccatgagctc ccctggcacc gagagcgcgg gaaagagcct gcagtaccga 60
gtggaccacc tgctgagcgc cgtggagaat gagctgcagg cgggcagcga gaagggcgac 120
cccacagagc gcgaactgcg cgtgggcctg gaggagagcg agctgtggct gcgcttcaag 180
gagctcacca atgagatgat cgtgaccaag aacggcagga ggatgtttcc ggtgctgaag 240
gtgaacgtgt ctggcctgga ccccaacgcc atgtactcct tcctgctgga cttcgtggcg 300
gcggacaacc accgctggaa gtacgtgaac ggggaatggg tgccgggggg caagccggag 360
ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac cccgactcgc ccaacttcgg ggcccactgg 420
atgaaggctc ccgtctcctt cagcaaagtc aagctcacca acaagctcaa cggagggggc 480
cagatcatgc tgaactcctt gcataagtat gagcctcgaa tccacatagt gagagttggg 540
ggtccacagc gcatgatcac cagccactgc ttccctgaga cccagttcat agcggtgact 600
gctagaagtg atcacaaaga gatgatggag gaacccggag acagccagca acctgggtac 660
tcccaatggg ggtggcttct tcctggaacc agcaccgtgt gtccacctgc aaatcctcat 720
cctcagtttg gaggtgccct ctccctcccc tccacgcaca gctgtgacag gtacccaacc 780
ctgaggagcc accggtcctc accctacccc agcccctatg ctcatcggaa caattctcca 840
acctattctg acaactcacc tgcatgttta tccatgctgc aatcccatga caattggtcc 900
agccttggaa tgcctgccca tcccagcatg ctccccgtga gccacaatgc cagcccacct 960
accagctcca gtcagtaccc cagcctgtgg tctgtgagca acggcgccgt caccccgggc 1020
tcccaggcag cagccgtgtc caacgggctg ggggcccagt tcttccgggg ctcccccgcg 1080
cactacacac ccctcaccca tccggtctcg gcgccctctt cctcgggatc cccactgtac 1140
gaaggggcgg ccgcggccac agacatcgtg gacagccagt acgacgccgc agcccaaggc 1200
cgcctcatag cctcatggac acctgtgtcg ccaccttcca tgtgagatat c 1251
<210> 9
<211> 475
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly
20 25 30
Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu
65 70 75 80
Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln
85 90 95
Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr
100 105 110
Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr
130 135 140
Arg Pro Ala Pro Val Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
145 150 155 160
Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His
165 170 175
Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu
180 185 190
Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys
195 200 205
Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr
210 215 220
Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser
225 230 235 240
Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu
245 250 255
Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu
260 265 270
Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu
275 280 285
Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly
290 295 300
Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val
305 310 315 320
Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp
325 330 335
Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr
340 345 350
Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe
355 360 365
Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu
370 375 380
Val Leu Val Cys Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ala Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile
405 410 415
Phe Pro Ala Arg Asp Lys Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Ala Leu Tyr
420 425 430
His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro
435 440 445
Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr
450 455 460
Asn Pro Ala Val Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu
465 470 475
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
silencer oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (8)..(8)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 11
tctctccna 9
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 12
Ala Leu Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 13
Lys Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Ala Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 14
Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val
1 5
Claims (158)
- (a) E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 MUC1 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 MUC1 항원은 서열 번호 9의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MUC1-C 항원인 벡터;
(b) E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 브라큐리(Brachyury) 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 브라큐리 항원은 서열 번호 8의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터; 및
(c) E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 CEA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 CEA 항원은 서열 번호 1의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터
를 포함하는, 인간 유두종 바이러스(HPV)에 대한 면역요법을 위한 조성물. - 제1항에 있어서, MUC1-C 항원의 아미노산 서열은 서열 번호 9와 100% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 브라큐리 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 8과 100% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, CEA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1과 100% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, MUC1-C 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터, 브라큐리 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 및 CEA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 E3 유전자 영역, E4 유전자 영역 또는 이의 임의의 조합에서의 결실을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 면역원성 구성요소를 추가로 포함하고, 면역원성 구성요소는 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13의 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 바이러스 벡터는 MUC1-C 항원, 브라큐리 항원 및 CEA 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, CEA 항원의 아미노산 서열은 서열 번호 10을 포함하는 것인 조성물.
- 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은,
E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 MUC1 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 MUC1 항원은 서열 번호 9의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MUC1-C 항원인 벡터; E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 브라큐리 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 브라큐리 항원은 서열 번호 8의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터; 및 E2b 유전자 영역 결실, E1 유전자 영역 결실 및 CEA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스 5형 바이러스 벡터로서, 상기 CEA 항원은 서열 번호 1의 모든 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터를 포함하고, 조성물은 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여되는 것을 특징으로 하고;
상기 조성물은, MUC1 항원, 브라큐리 항원 또는 CEA 항원, 또는 MUC1 항원, 브라큐리 항원 또는 CEA 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하고,
치료를 필요로 하는 피험체는 암을 갖는 조성물. - 제9항에 있어서, 조성물은 5x1011 바이러스 입자(VP)의 MUC1-C 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터, 적어도 5x1011 바이러스 입자(VP)의 브라큐리 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 및 적어도 5x1011 바이러스 입자(VP)의 CEA 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 면역 반응은 기저의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25배인 조성물.
- 제9항에 있어서, 면역 반응은 항원 특이적 항체 반응으로서, 항원 특이적 세포 매개 면역(CMI)으로서, 항원 특이적 IFN-γ 분비로서, 항원 특이적 IL-2 분비로서, ELISpot 분석법에 의해 또는 이의 임의의 조합으로 측정되는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 투여는 피하 투여를 포함하는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 피험체는 결장직장 선암종; 전이성 결장직장암; 진행된 MUC1-C, 브라큐리 또는 CEA 발현 결장직장암; 유방암; 폐암; 방광암; 또는 췌장암을 갖는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 치료를 필요로 하는 피험체는 인간인 조성물.
- 제9항에 있어서, CEA 항원의 아미노산 서열은 서열 번호 10을 포함하는 것인 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562101969P | 2015-01-09 | 2015-01-09 | |
US62/101,969 | 2015-01-09 | ||
US201562150236P | 2015-04-20 | 2015-04-20 | |
US62/150,236 | 2015-04-20 | ||
PCT/US2016/012496 WO2016112195A1 (en) | 2015-01-09 | 2016-01-07 | Methods and compositions for combination immunotherapy |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170098947A KR20170098947A (ko) | 2017-08-30 |
KR102193635B1 true KR102193635B1 (ko) | 2020-12-21 |
Family
ID=56356431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177022200A KR102193635B1 (ko) | 2015-01-09 | 2016-01-07 | 복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11352642B2 (ko) |
EP (1) | EP3242940B1 (ko) |
JP (1) | JP6647315B2 (ko) |
KR (1) | KR102193635B1 (ko) |
CN (2) | CN107406857B (ko) |
AU (1) | AU2016205215B2 (ko) |
CA (1) | CA2974237C (ko) |
IL (1) | IL253341B (ko) |
WO (1) | WO2016112195A1 (ko) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2725450T3 (es) | 2007-07-02 | 2019-09-24 | Etubics Corp | Métodos y composiciones para la producción de un vector adenoviral para su uso en vacunaciones múltiples |
US9605276B2 (en) | 2012-08-24 | 2017-03-28 | Etubics Corporation | Replication defective adenovirus vector in vaccination |
WO2016112188A1 (en) | 2015-01-09 | 2016-07-14 | Etubics Corporation | Methods and compositions for ebola virus vaccination |
US11352642B2 (en) | 2015-01-09 | 2022-06-07 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
US11149087B2 (en) | 2015-04-20 | 2021-10-19 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
AU2017272356A1 (en) * | 2016-06-03 | 2018-12-20 | Etubics Corporation | Compositions and methods for the treatment of human papillomavirus (HPV)-associated diseases |
CA3030447A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Etubics Corporation | Compositions and methods for flavivirus vaccination |
CN109803677A (zh) | 2016-07-15 | 2019-05-24 | 埃特彼塞斯公司 | 用于α病毒疫苗接种的组合物和方法 |
US11422127B2 (en) | 2016-12-07 | 2022-08-23 | Albany Medical College | Ex vivo antigen and adjuvant pulsed peripheral blood mononuclear cells as a screening platform for candidate novel vaccines and candidate antigens |
CN110740748A (zh) * | 2017-01-17 | 2020-01-31 | 芝加哥大学 | 肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性cd8+t细胞 |
CA3063735A1 (en) * | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Etubics Corporation | Combination immunotherapies comprising il-15 superagonists |
PE20200613A1 (es) * | 2017-07-11 | 2020-03-11 | Pfizer | Composiciones inmunogenicas |
JP2021502114A (ja) * | 2017-11-10 | 2021-01-28 | キネオ メディカル テクノロジー カンパニー リミテッド | 改変された免疫細胞およびその使用 |
WO2019147921A1 (en) * | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Nantcell, Inc. | Rapid verification of virus particle production for a personalized vaccine |
CN111836639A (zh) * | 2018-01-26 | 2020-10-27 | 河谷细胞有限公司 | 用于联合癌症疫苗和免疫辅助疗法的组合物和方法 |
WO2019195626A1 (en) * | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Altimmune Inc | T-cell inducing vaccine composition combinations and uses thereof |
WO2020132595A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | The Regents Of The University Of California | Il-10-containing vaccines and uses thereof |
US20230036911A1 (en) * | 2019-12-30 | 2023-02-02 | Greffex, Inc. | Culture systems for the efficient production of gene transfer vectors |
KR102371663B1 (ko) * | 2020-01-21 | 2022-03-04 | 코오롱생명과학 주식회사 | 아데노바이러스 벡터 |
CN116059339B (zh) * | 2021-11-04 | 2023-09-22 | 元本(珠海横琴)生物科技有限公司 | 一种治疗和预防癌症的药物和应用 |
CN117110607B (zh) * | 2023-09-16 | 2024-01-26 | 鲁东大学 | 一种检测副溶血性弧菌的组合物及其应用 |
Family Cites Families (87)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US820079A (en) | 1903-07-15 | 1906-05-08 | Auto Manual Piano Action Company | Musical instrument. |
US4866034A (en) | 1982-05-26 | 1989-09-12 | Ribi Immunochem Research Inc. | Refined detoxified endotoxin |
US4436727A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4877611A (en) | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
US5725871A (en) | 1989-08-18 | 1998-03-10 | Danbiosyst Uk Limited | Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid |
US5466468A (en) | 1990-04-03 | 1995-11-14 | Ciba-Geigy Corporation | Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids |
DK0641192T3 (da) | 1992-05-18 | 1998-03-02 | Minnesota Mining & Mfg | Anordning til transmucosal lægemiddelafgivelse |
US5830463A (en) | 1993-07-07 | 1998-11-03 | University Technology Corporation | Yeast-based delivery vehicles |
ATE328890T1 (de) | 1994-07-15 | 2006-06-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
US6045802A (en) | 1994-10-03 | 2000-04-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Enhanced immune response to an antigen by a composition of a recombinant virus expressing the antigen with a recombinant virus expressing an immunostimulatory molecule |
US7118754B1 (en) | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
US5856462A (en) | 1996-09-10 | 1999-01-05 | Hybridon Incorporated | Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides |
US5994132A (en) | 1996-10-23 | 1999-11-30 | University Of Michigan | Adenovirus vectors |
US6706693B1 (en) | 1997-08-13 | 2004-03-16 | The Uab Research Foundation | Vaccination by topical application of genetic vectors |
US6716823B1 (en) | 1997-08-13 | 2004-04-06 | The Uab Research Foundation | Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof |
KR20010022863A (ko) | 1997-08-13 | 2001-03-26 | 피터 브이. 오`네일 | 유전자 벡터의 국소 적용에 의한 백신접종 |
US6348450B1 (en) | 1997-08-13 | 2002-02-19 | The Uab Research Foundation | Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof |
US6756038B1 (en) | 1997-10-10 | 2004-06-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Agonist and antagonist peptides of carcinoembryonic antigen (CEA) |
EP1447414B1 (en) | 1997-10-10 | 2007-06-06 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Antagonist peptides of carcinoembryonic antigen (CEA) |
ES2286530T3 (es) | 1997-10-10 | 2007-12-01 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Peptidos antagonistas del antigeno carcinoembrionario (cea). |
US6969609B1 (en) | 1998-12-09 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces | Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
WO2000034494A1 (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | The Government Of The United States Of America Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
GB9727262D0 (en) | 1997-12-24 | 1998-02-25 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US6413513B1 (en) | 1998-05-22 | 2002-07-02 | Entremed, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endothelial cell proliferation and regulating angiogenesis using cancer markers |
US6734172B2 (en) | 1998-11-18 | 2004-05-11 | Pacific Northwest Research Institute | Surface receptor antigen vaccines |
US20040009936A1 (en) | 1999-05-03 | 2004-01-15 | Tang De-Chu C. | Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts |
US7001995B1 (en) | 1999-08-25 | 2006-02-21 | Merck & Co., Inc. | Synthetic human papillomavirus genes |
US7009042B1 (en) | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
WO2001030382A1 (en) * | 1999-10-22 | 2001-05-03 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
US20030232399A1 (en) | 2000-06-14 | 2003-12-18 | Robertson John Forsyth Russell | Cancer detection methods and reagents |
WO2002008436A2 (en) | 2000-07-20 | 2002-01-31 | Genstar Therapeutics Corporation | Mini-adenoviral vector system for vaccination |
AU2002225681A1 (en) | 2000-11-15 | 2002-05-27 | Globe Immune, Inc. | Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof |
WO2003008537A2 (en) | 2001-04-06 | 2003-01-30 | Mannkind Corporation | Epitope sequences |
US20040091995A1 (en) | 2001-06-15 | 2004-05-13 | Jeffrey Schlom | Recombinant non-replicating virus expressing gm-csf and uses thereof to enhance immune responses |
WO2003008649A1 (en) | 2001-07-20 | 2003-01-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to hpv-associated pre-cancerous and cancerous growths, including cin |
US7786278B2 (en) | 2002-04-09 | 2010-08-31 | Sanofi Pasteur Limited | Modified CEA nucleic acid and expression vectors |
US8236776B2 (en) | 2002-04-09 | 2012-08-07 | Sanofi Pasteur Limited | Modified CEA nucleic acid and expression vectors |
AU2003304203A1 (en) | 2002-10-29 | 2005-01-04 | Pharmacia Corporation | Differentially expressed genes involved in cancer, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same |
KR101164509B1 (ko) | 2002-12-16 | 2012-07-10 | 글로브이뮨 | 면역 요법으로서의 효모계 백신 |
CN1548537B (zh) | 2002-12-27 | 2010-05-05 | 深圳市源兴生物医药科技有限公司 | 疫苗制备方法和抗肿瘤疫苗 |
WO2004099247A2 (en) | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof |
US8207314B2 (en) | 2003-05-16 | 2012-06-26 | Sanofi Pasteur Limited | Tumor antigens for prevention and/or treatment of cancer |
JP4772674B2 (ja) | 2003-07-21 | 2011-09-14 | イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー | ヒト上皮成長因子2/neu抗原をコードする合成遺伝子およびその用途 |
CA2544946A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-03-06 | Sidney Kimmel Cancer Center | Mucin antigen vaccine |
CA2548347A1 (en) * | 2003-12-11 | 2005-06-30 | Sidney Kimmel Cancer Center | Methods for generating immunity to antigen |
CA2547635C (en) * | 2003-12-12 | 2016-02-09 | Jeffrey Schlom | A human cytotoxic t-lymphocyte epitope and its agonist epitope from the non-variable number of tandem repeat sequence of muc-1 |
PL2163260T3 (pl) | 2004-01-23 | 2017-12-29 | Msd Italia S.R.L. | Szympansie adenowirusowe nośniki szczepionek |
NZ549048A (en) | 2004-02-11 | 2009-04-30 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Carcinoembryonic antigen fusion proteins and uses thereof |
US8562988B2 (en) * | 2005-10-19 | 2013-10-22 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Strategies for improved cancer vaccines |
WO2006033672A2 (en) | 2004-04-28 | 2006-03-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost |
KR101131727B1 (ko) | 2004-06-11 | 2012-03-28 | 가톨릭대학교 산학협력단 | CEA-특이적인 세포독성 T세포를 생성하는 재조합 아데노바이러스 AdVCEA로 트랜스덕션된 수지상세포, 이를 포함하는 백신 및 약제학적 조성물 |
CN101437964B (zh) | 2004-10-18 | 2012-06-13 | 全球免疫股份有限公司 | 基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗 |
CA2614884A1 (en) | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Globeimmune, Inc | Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies |
DE602006019916D1 (de) | 2005-12-12 | 2011-03-10 | Canji Inc | Adenovirale expressionsvektoren mit einer expressionskassette im e1-bereich und einer inaktivierten e2b-polymerase |
JP2009534331A (ja) | 2006-04-21 | 2009-09-24 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | Hpv‐18を主体とするパピローマウイルスワクチン |
ES2725450T3 (es) | 2007-07-02 | 2019-09-24 | Etubics Corp | Métodos y composiciones para la producción de un vector adenoviral para su uso en vacunaciones múltiples |
JP5352586B2 (ja) | 2007-07-27 | 2013-11-27 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | 腫瘍関連ペプチドおよび関連抗癌ワクチンの組成物 |
MX2011010977A (es) * | 2009-04-17 | 2012-02-29 | Us Health | Composiciones inmunoterapeuticas combinadas contra cancer y metodos. |
US20150182621A1 (en) | 2009-04-28 | 2015-07-02 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for enhancing antigen-specific immune responses |
AU2010291985B2 (en) | 2009-09-14 | 2016-05-05 | The Regents Of The University Of Colorado | Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses |
WO2011115914A1 (en) | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Globeimmune, Inc. | Pharmacogenomic and response-guided treatment of infectious disease using yeast-based immunotherapy |
AU2011226992B2 (en) | 2010-05-10 | 2012-03-22 | Ascend Biopharmaceuticals Pty Ltd | Immunostimulatory and vaccine compositions |
WO2012019127A2 (en) | 2010-08-05 | 2012-02-09 | The Regents Of The University Of Colorado | Combination yeast-based immunotherapy and arginine therapy for the treatment of myeloid-derived supressor cell-associated diseases |
EP3238731B1 (en) | 2011-03-17 | 2021-02-17 | Globeimmune, Inc. | Yeast-brachyury immunotherapeutic compositions |
RU2017143985A (ru) * | 2011-08-17 | 2019-02-14 | Глоубиммьюн, Инк. | Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей-muc1 и способы их применения |
BR112014019049A2 (pt) | 2012-02-02 | 2017-07-04 | Univ Texas | adenovirus imunogênico |
EP3553086A1 (en) | 2012-05-31 | 2019-10-16 | Sorrento Therapeutics Inc. | Antigen binding proteins that bind pd-l1 |
SG11201408652SA (en) | 2012-06-26 | 2015-01-29 | Biodesix Inc | Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies |
GB201214007D0 (en) | 2012-08-07 | 2012-09-19 | Scancell Ltd | Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes |
US9382329B2 (en) | 2012-08-14 | 2016-07-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells |
US9605276B2 (en) | 2012-08-24 | 2017-03-28 | Etubics Corporation | Replication defective adenovirus vector in vaccination |
EP2895191B1 (en) | 2012-09-14 | 2019-06-05 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Brachyury protein, adenoviral vectors encoding brachyury protein, and their use |
US20140220056A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-07 | Nitto Denko Corporation | Vaccine composition for transdermal administration |
ES2693213T3 (es) | 2013-10-23 | 2018-12-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Epítopos agonistas de HLA-A24 de oncoproteína MUC1-C y composiciones y métodos de uso |
EP3092004A4 (en) | 2014-01-06 | 2017-02-22 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pd1 and pdl1 antibodies and vaccine combinations and use of same for immunotherapy |
AU2015205342B2 (en) * | 2014-01-07 | 2020-01-23 | Babita Agrawal | Immunomodulatory compositions and methods of use thereof |
WO2015123532A1 (en) | 2014-02-16 | 2015-08-20 | Globeimmune, Inc. | Ras g12r immunotherapy for ras mutation-positive cancers |
US10434152B2 (en) | 2014-02-20 | 2019-10-08 | Wayne State University | HER2 antigenic polypeptide compositions, and methods for their use in treatment and prevention of carcinomas |
CA2948803A1 (en) | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based immunotherapy and type i interferon sensitivity |
US9925247B2 (en) | 2014-06-30 | 2018-03-27 | Altor Bioscience Corporation | IL-15-based molecules and methods of use thereof |
CA2954278A1 (en) | 2014-07-07 | 2016-01-14 | Duke University | Vaccines against an oncogenic isoform of her2 (erbb2) and methods of using the same |
US9732119B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
TWI595006B (zh) | 2014-12-09 | 2017-08-11 | 禮納特神經系統科學公司 | 抗pd-1抗體類和使用彼等之方法 |
US11352642B2 (en) | 2015-01-09 | 2022-06-07 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
KR20230164243A (ko) | 2015-03-23 | 2023-12-01 | 조운스 테라퓨틱스, 인크. | Icos에 대한 항체 |
US11149087B2 (en) | 2015-04-20 | 2021-10-19 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
-
2016
- 2016-01-07 US US15/542,005 patent/US11352642B2/en active Active
- 2016-01-07 KR KR1020177022200A patent/KR102193635B1/ko active IP Right Grant
- 2016-01-07 CA CA2974237A patent/CA2974237C/en active Active
- 2016-01-07 AU AU2016205215A patent/AU2016205215B2/en active Active
- 2016-01-07 WO PCT/US2016/012496 patent/WO2016112195A1/en active Application Filing
- 2016-01-07 JP JP2017555423A patent/JP6647315B2/ja active Active
- 2016-01-07 EP EP16735415.8A patent/EP3242940B1/en active Active
- 2016-01-07 CN CN201680014846.8A patent/CN107406857B/zh active Active
- 2016-01-07 CN CN202110784166.7A patent/CN113456812A/zh active Pending
-
2017
- 2017-07-05 IL IL253341A patent/IL253341B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2974237A1 (en) | 2016-07-14 |
KR20170098947A (ko) | 2017-08-30 |
EP3242940A4 (en) | 2018-06-13 |
EP3242940A1 (en) | 2017-11-15 |
IL253341A0 (en) | 2017-09-28 |
AU2016205215B2 (en) | 2021-03-11 |
CA2974237C (en) | 2021-07-20 |
US11352642B2 (en) | 2022-06-07 |
US20180187211A1 (en) | 2018-07-05 |
JP2018508567A (ja) | 2018-03-29 |
CN107406857B (zh) | 2021-06-29 |
JP6647315B2 (ja) | 2020-02-14 |
AU2016205215A1 (en) | 2017-07-06 |
CN113456812A (zh) | 2021-10-01 |
CN107406857A (zh) | 2017-11-28 |
EP3242940B1 (en) | 2023-03-29 |
WO2016112195A1 (en) | 2016-07-14 |
IL253341B (en) | 2022-04-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102193635B1 (ko) | 복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물 | |
EP3286213B1 (en) | Methods and compositions for combination immunotherapy | |
US10563224B2 (en) | Replication defective adenovirus vector in vaccination | |
US11304998B2 (en) | Combination immunotherapies comprising IL-15 superagonists | |
KR20190033483A (ko) | 인간 파필로마바이러스 (hpv)-연관 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
KR20190034160A (ko) | Her2/neu 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법 | |
AU2017274540B2 (en) | Compositions and methods for tumor vaccination using prostate cancer-associated antigens | |
JP2018502922A (ja) | エボラウイルスワクチン接種のための方法および組成物 | |
US20210046177A1 (en) | Compositions and methods for combination cancer vaccine and immunologic adjuvant therapy | |
US11116827B2 (en) | Compositions and methods for tumor vaccination and immunotherapy involving HER antigens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |