KR20200138418A - 네오에피토프 백신 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20200138418A
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KR
South Korea
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tumor
replication
neo
antigen
vector
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KR1020207034341A
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프랭크 알 존스
애드리안 라이스
패트릭 순-시옹
카이반 니아지
샤루즈 라비자데
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이투빅스 코포레이션
난트셀, 인크.
난트 홀딩스 아이피, 엘엘씨
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Abstract

특정 구체예에서, 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 아데노바이러스에 대해 사전존재하는 면역성을 갖는 개체에서 백신화를 가능하게 하는 종양 네오-항원 및 네오-에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신을 제작하고 생산하기 위한 방법이 제공될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 조작된 자열 살해 세포와 조합된 재조합 아데노바이러스-기반 벡터를 기반으로 하는 면역요법을 사용하여 암의 치료를 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산을 더 포함한다.

Description

네오에피토프 백신 조성물 및 이의 사용 방법{NEOEPITOPE VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
교차 참조
본 출원은 2016년 5월 27일 출원된 미국 가출원 제62/342,752호의 이득을 청구하고, 이의 전체 내용을 본 명세서에서 참조로 편입시킨다.
암에 대한 백신화는 관련 표적 항원들의 식별로 인해 제한되었다. 결과적으로, 종양-연관된 자기-항원을 표적으로 삼는 임상적 백신화 실험은 일반적으로 혈액 내에서 백신-유도된 T-세포 반응의 검출에도 불구하고 치료적 면역성을 유발시키는데 실패하였다.
돌이켜보면, 이들 실패는 많은 이들 자기-항원이 흉선에서 발현되고, 그 결과로 고도의 반응성 T-세포 레파토리의 결실 및 억제성 T-조절성 세포의 발생이 야기된다는 발견으로 설명될 수 있다. 게다가, 이러한 항원을 표적으로 하는 유전자 조작된 T 세포의 주입에 의한 흉선 내성의 우회가 치명적인 체조직에서의 심각한 독성과 연관된다는 것이 확인되어, 많은 종양-연관된 항원에 대한 면역학적 내성의 생리학적 중요성이 설명되었다.
그러므로, 복합 질환 예컨대 암에 대한 증강된 치료적 반응을 위한 신규 조성물 및 방법을 발견하려는 요구가 남아있다.
다양한 양상에서, 본 개시내용은 복제-결함 벡터로서, 여기서 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 벡터; 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
다양한 양상에서, 본 개시내용은 복제-결함 벡터로서, 여기서 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 벡터; 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad5 벡터이다. 일부 양상에서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역, E1 영역, E3 영역, 및 E4 영역, 또는 이의 임의 조합 내에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 E2b 영역 내에 DNA 폴리머라제, 프리터미널 단백질 (preterminal protein (pTP)), 또는 이의 조합의 결실을 포함한다. 추가 양상에서, 복제-결함 벡터는 완전 결실형 (gutted) 벡터가 아니다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 다수의 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 적어도 10종의 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 적어도 5종의 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 핵산 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종 (Mycobacterium sp.), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis)-유래된 Ra12 단편, 그람-음성 박테리아 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) B의 표면 단백질 유래 단백질 D, LYTA, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, CpG-ODN, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 A 서브유닛 코딩 영역, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 B 서브유닛 코딩 영역, Hp91, CCL20, CCL3, GM-CSF, G-CSF, LPS 펩티드 모방체, 시가 독소, 디프테리아 독소, IL-15 수퍼 효현제, ALT-803, CRM197, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종, 마이코박테리움 튜버큘로시스-유래된 Ra12 단편, 그람-음성 박테리아 해모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질 유래 단백질 D, LYTA, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, CpG-ODN, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 A 서브유닛 코딩 영역, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 B 서브유닛 코딩 영역, Hp91, CCL20, CCL3, GM-CSF, G-CSF, LPS 펩티드 모방체, 시가 독소, 디프테리아 독소, IL-15 수퍼 효현제, ALT-803, CRM197, 또는 이의 임의 조합의 단편 또는 유도체이다. 일부 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 90 및 서열번호 109 -서열번호 112 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 90%가 동일하다.
추가 양상에서, 복제-결함 벡터는 링커를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 양상에서, 링커는 1 내지 약 150개 핵산 길이, 약 5 내지 약 100개 핵산 길이, 또는 약 10 내지 약 50개 핵산 길이이다. 다른 양상에서, 핵산 서열은 아미노산 잔기를 코딩한다. 일부 양상에서, 아미노산 잔기는 아미노산 서열을 형성한다. 일부 양상에서, 아미노산 서열은 1 내지 약 50개 아미노산 잔기, 약 5 내지 약 25개 아미노산 잔기, 또는 10개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 양상에서, 링커는 폴리알라닌 링커, 또는 폴리글리신 링커이다. 일부 양상에서, 링커는 알라닌 및 글리신의 혼합물을 포함한다. 일부 양상에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열 사이에 존재한다. 일부 양상에서, 링커는 서열번호 91 - 서열번호 105 중 어느 하나이다.
추가 양상에서, 복제-결함 벡터는 하나를 초과하는 종양 네오-항원을 코딩하는 하나를 초과하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 백신이다. 일부 양상에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 적어도 10종의 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 추가적인 양상에서, 조성물은 적어도 10종의 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
일부 양상에서, 종양 네오-항원은 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, Her 4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 추가 양상에서, 종양 네오-항원은 종양 네오-에피토프를 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 CEA, MUC1, Brachyury, PSA, PSMA, Her2/neu, Her3, HPV-E6, HPV-E7, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 서열번호 1 - 서열번호 22 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 23 - 서열번호 30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 종양 네오-에피토프이거나, 또는 하기 돌연변이: 유전자 SLC4A11의 Q678P 돌연변이, 유전자 SIGLEC1의 D1143N 돌연변이, 유전자 SIGLEC14의 A292T 돌연변이, PIEZO2의 T2356M 돌연변이, 유전자 FAT4의 S1613L 돌연변이, 유전자 FCRL1의 R268C 돌연변이, 또는 유전자 VIPR2의 V73M 돌연변이, 또는 유전자 FLRT2의 R346W 돌연변이 중 하나를 갖는다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 공자극성 분자를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 양상에서, 공자극성 분자는 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 조작된 자연 살해 (NK) 세포를 추가적으로 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 KIR (살해 억제 수용체 (killer inhibitory receptor))의 발현이 본질적으로 결여되도록 변형된 NK 세포, 고친화성 CD16 변이체를 발현하도록 변형된 NK 세포, 및 CAR (키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor))를 발현하도록 변형된 NK 세포, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 KIR 발현이 본질적으로 결여되도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 고친화성 CD16 변이체를 발현하도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 추가 양상에서, 조작된 NK 세포는 CAR을 발현하도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, HER4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 또는 TEL/AML1에 대한 CAR이다.
일부 양상에서, 조성물은 면역자극제를 추가적으로 포함한다. 추가 양상에서, 면역자극제는 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터루킨-2 (IL-2), IL-7, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, 및 IL-32로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 조성물은 IL-15 또는 IL-15를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 벡터의 치료적 유효량을 추가적으로 포함한다. 일부 양상에서, 조성물은 암 요법을 추가적으로 포함한다.
일부 양상에서, 암 요법은 화학요법의 용량, 방사선의 선량, 면역요법, 또는 이의 임의 조합이다. 일부 양상에서, 면역요법은 종양-연관 항원 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 양상에서, 화학요법의 용량 및 방사선의 선량의 조합은 화학요법의 용량 및 방사선의 선량이 단독으로 존재하는 경우의 권장 용량보다 낮은 용량으로 조성물에 존재한다. 일부 양상에서, 암 요법은 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙이다.
추가 양상에서, 조성물은 면역 경로 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 추가적으로 포함한다. 일부 양상에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 면역 경로 체크포인트 리간드에 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 양상에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, 또는 IDO에 결합하는 항체이다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열에 부착된 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 추가 양상에서, 복제-결함 벡터는 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 (VP)와 동일하거나 또는 그를 초과하는 용량으로 존재한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 면역화 당 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자와 동일하거나 또는 그 미만인 용량으로 존재한다.
일부 양상에서, 종양 항원은 대상체에 특이적이다.
일부 양상에서, 종양 네오-항원은 종양-특이적 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 세포-매개 면역 반응을 구동시키거나 또는 세포-매개 면역 반응을 구동시키도록 결정된다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 6개 내지 10개 아미노산의 크기를 갖는 펩티드이다. 일부 양상에서, CEA는 서열번호 106과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, MUC1-c는 서열번호 107과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, Brachyury는 서열번호 108과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다양한 양상에서, 세포를 포함하는 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물을 포함한다. 일부 양상에서, 세포는 수지상 세포 (DC)이다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열; 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
다양한 양상에서, 대상체의 상태를 모니터링하는 방법은 a) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 대상체의 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 b) 대상체에서 종양 네오-항원의 상태를 모니터링하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 대상체에서 종양을 검출하는 방법은 a) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 b) 투여 이후에 대상체에서 종양 네오-항원의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 a) 대상체에게 암 요법을 투여하는 단계; b) 대상체에서 종양 네오-항원의 존재를 검출하는 단계; c) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 d) 단계 b)-c)를 반복하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물의 세포의 개체군을 포함하고, 여기서 세포의 개체군 중 세포는 복제-결함 벡터를 포함하고, 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산 서열; 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 대상체의 상태를 모니터링하는 방법은 a) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 b) 대상체에서 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합의 상태를 모니터링하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 대상체에서 종양을 검출하는 방법은 a) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 b) 투여 이후에 대상체에서 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 a) 대상체에게 암 요법을 투여하는 단계; b) 대상체에서 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합의 존재를 검출하는 단계; c) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 d) 단계 b)-c)를 반복하는 단계를 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 세포의 개체군을 포함하고, 여기서 세포의 개체군 중 세포는 복제-결함 벡터를 포함하고, 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad5 벡터이다. 일부 양상에서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역, E1 영역, E3 영역 및 E4 영역 또는 이의 임의 조합 내에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역 내에 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 E2b 영역 내에 DNA 폴리머라제, 프리터미널 단백질 (pTP), 또는 이의 조합의 결실을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 완전 결실형 벡터가 아니다.
추가 양상에서, 복제-결함 벡터는 다수의 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 적어도 10종의 복제-결함 벡터를 포함하고, 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 적어도 5종의 복제-결함 벡터를 포함하고, 각각의 복제-결함 벡터는 상이한 종양 네오-항원-코딩 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종, 마이코박테리움 튜버큘로시스-유래된 Ra12 단편, 그람-음성 박테리아 해모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질 유래 단백질 D, LYTA, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, CpG-ODN, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 A 서브유닛 코딩 영역, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 B 서브유닛 코딩 영역, Hp91, CCL20, CCL3, GM-CSF, G-CSF, LPS 펩티드 모방체, 시가 독소, 디프테리아 독소, IL-15 수퍼 효현제, ALT-803, CRM197, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종, 마이코박테리움 튜버큘로시스-유래된 Ra12 단편, 그람-음성 박테리아 해모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질 유래 단백질 D, LYTA, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, CpG-ODN, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 A 서브유닛 코딩 영역, 박테리아 ADP-리보실화 외독소 유래 절두형 B 서브유닛 코딩 영역, Hp91, CCL20, CCL3, GM-CSF, G-CSF, LPS 펩티드 모방체, 시가 독소, 디프테리아 독소, IL-15 수퍼 효현제, ALT-803, CRM197, 또는 이의 임의 조합의 단편 또는 유도체일 수 있다. 일부 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 90 및 서열번호 109 - 서열번호 112 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 90%가 동일하다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 링커를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 양상에서, 링커는 1 내지 약 150개 핵산 길이, 약 5 내지 약 100개 핵산 길이, 또는 약 10 내지 약 50개 핵산 길이이다.
일부 양상에서, 핵산 서열은 아미노산 잔기를 코딩한다. 일부 양상에서, 아미노산 잔기는 아미노산 서열을 형성한다. 일부 양상에서, 아미노산 서열은 1 내지 약 50개 아미노산 잔기, 약 5 내지 약 25개 아미노산 잔기, 또는 10개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 양상에서, 링커는 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커이다. 일부 양상에서, 링커는 알라닌 및 글리신의 혼합물을 포함한다. 일부 양상에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열 사이에 존재한다. 일부 양상에서, 링커는 서열번호 91 - 서열번호 105 중 어느 하나이다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 하나를 초과하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 약학 조성물은 백신이다. 일부 양상에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 양상에서, 약학 조성물은 적어도 10종의 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
제66항 내지 제100항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 약학 조성물은 적어도 5종의 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
일부 양상에서, 종양 네오-항원은 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, Her 4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 종양 항원은 종양 네오-에피토프를 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 CEA, MUC1, Brachyury, PSA, PSMA, Her2/neu, Her3, HPV-E6, HPV-E7, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 서열번호 1 - 서열번호 22 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 23 - 서열번호 30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 종양 네오-에피토프이거나, 또는 다음의 돌연변이: 유전자 SLC4A11의 Q678P 돌연변이, 유전자 SIGLEC1의 D1143N 돌연변이, 유전자 SIGLEC14의 A292T 돌연변이, PIEZO2의 T2356M 돌연변이, 유전자 FAT4의 S1613L 돌연변이, 유전자 FCRL1의 R268C 돌연변이, 또는 유전자 VIPR2의 V73M 돌연변이, 또는 유전자 FLRT2의 R346W 돌연변이 중 하나를 갖는다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 공자극성 분자를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 양상에서, 공자극성 분자는 B7, ICAM-1, LFA-3, 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 대상체에게 조작된 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 KIR (살해 억제 수용체)의 발현이 본질적으로 결여되도록 변형된 NK 세포, 고친화성 CD16 변이체를 발현하도록 변형된 NK 세포, 및 CAR (키메라 항원 수용체)을 발현하도록 변형된 NK 세포, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 KIR 발현이 본질적으로 결여되도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 고친화성 CD16 변이체를 발현하도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 조작된 NK 세포는 CAR을 발현하도록 변형된 NK 세포를 포함한다. 추가 양상에서, CAR은 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, HER4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, 또는 TEL/AML1에 대한 CAR이다.
다른 양상에서, 방법은 대상체에게 면역자극제를 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극제는 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터루킨-2 (IL-2), IL-7, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양상에서, 방법은 대상체에게 IL-15 또는 IL-15를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 대상체는 대상체가 종양 네오-항원을 갖는 것으로 결정되기 이전에 암 요법을 투여받았다. 일부 양상에서, 암 요법은 화학요법, 방사선 치료, 면역요법, 또는 이의 임의 조합이다. 일부 양상에서, 면역요법은 종양-연관 항원 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 양상에서, 화학요법 및 방사선의 조합은 화학요법 및 방사선이 단독으로 투여되는 경우의 권장 용량보다 낮은 용량으로 투여된다. 일부 양상에서, 암 요법은 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙이다.
일부 양상에서, 방법은 대상체에게 면역 경로 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 면역 경로 체크포인트 리간드에 결합하는 항체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 포함한다. 일부 양상에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, 또는 IDO에 결합하는 항체이다.
일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열에 부착된 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 (VP)와 동일하거나 또는 그를 초과하는 용량으로 존재한다. 일부 양상에서, 복제-결함 벡터는 면역화 당 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5 x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자와 동일하거나 또는 그 미만의 용량으로 존재한다.
일부 양상에서, 종양 네오-항원은 대상체에 특이적이다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 종양-특이적 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 세포-매개 면역 반응을 구동시키거나 또는 세포-매개 면역 반응을 구동시키도록 결정된다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 6개 내지 10개 아미노산의 크기를 갖는 펩티드이다. 일부 양상에서, 대상체는 투여 이전에 종양 네오-항원을 갖는다.
일부 양상에서, 방법은 대상체가 투여 동안 또는 투여 이후에 신규한 네오-항원을 발생시키는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원은 대상체의 종양 샘플의 게놈 프로파일을 기준과 비교한 결과로서 동정된다.
일부 양상에서, 방법은 대상체의 종양 샘플의 게놈 프로파일을 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 종양-특이적 돌연변이를 동정하기 위해서 대상체의 종양 샘플의 게놈 프로파일을 기준과 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 게놈 프로파일의 수득은 차세대 시퀀싱, 전체-엑솜 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱용 나노-기술, 이온 반도체 시퀀싱 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 종양-특이적 돌연변이로부터 종양 네오-항원을 동정하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 종양 네오-항원을 동정하는 단계는 단백질체의 사용을 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 종양 네오-에피토프를 동정하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 기준 또는 대상체의 이전에 저장된 게놈 프로파일을 수득하기 위해 데이타베이스에 접속하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 약학 조성물을 투여하는 단계 이후에 대상체에서 추가적인 종양 네오-항원을 동정하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 약학 조성물을 투여하는 단계 이후에 대상체에서 추가적인 종양 네오-항원을 동정하는 단계, 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하고, 추가적인 약학 조성물은 대상체에게 추가적인 종양 네오-항원을 포함하는 추가적인 복제-결함 벡터를 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 약학 조성물이 투여된 대상체에서 종양 네오-항원의 상태를 모니터링하는 단계를 더 포함한다.
일부 양상에서, 암은 췌장암, 직결장암, 유방암, 유방암, 폐암, 전립선암, 위암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종 또는 이의 임의 조합이다.
일부 양상에서, 종양 네오-항원은 대상체에 존재하는 하나를 초과하는 종양 네오-항원이다.
일부 양상에서, 약학 조성물 및 추가적인 약학 조성물은 동시에 투여된다.
일부 양상에서, 세포는 수지상 세포 (DC)이다.
일부 양상에서, CEA는 서열번호 106과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, MUC1-c는 서열번호 107과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, Brachyury는 서열번호 108과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다양한 양상에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 제1 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 약학 조성물은 제1 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 제1 복제-결함 벡터는 CEA, MUC1-c, Brachyury, 또는 이의 임의 조합; 또는 본 명세서에 기술된 임의 조성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계; 및 대상체에게 제2 약학 조성물을 투여하는 단계로서, 제2 약학 조성물은 제2 복제-결함 벡터를 포함하고, 여기서 복제-결함 벡터는 본 명세서에 기술된 임의 조성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상들을 더욱 입증하고자 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특별한 구체예의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 이들 도면을 참조해서 더욱 이해할 수 있을 것이다.
도 1. 종양 네오-에피토프의 동정을 예시하는 비제한적인 예시적인 구체예.
도 2. 종양 네오-에피토프의 암 엑솜-기반 동정을 예시하는 비제한적인 예시적인 구체예. 종양 물질은 비동의적 체세포 돌연변이에 대해 분석된다. RNA 시퀀싱 데이타는 발현된 유전자 내 돌연변이에 집중시키기 위해 사용된다. 임의의 동정된 비동의 돌연변이를 함유하는 펩티드 스트렛치(stretch)는 인 실리코(in silico)로 생성되고 예측 알고리즘의 사용을 통해 필터링되거나 또는 질량 분광분석 데이타에서 MHC-연관된 네오-에피토프를 동정하는데 사용된다. 최종 펩티드-MHC 복합체에 대한 돌연변이의 효과의 모델링은 추가적인 필터로서 사용된다. 최종 에피토프 세트는 CD8과 CD4 T 세포 개체군 내에서 MHC 다량체-기반 스크린 및 기능적 어세이를 통해서 생리학적으로 발생된 네오-에피토프-특이적 T 세포 반응을 동정하는데 사용된다.
도 3. Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼으로 종양 네오-에피토프의 삽입을 위해 디자인된 4종의 예시적인 유전자 구성체.
도 4. Ad5[E1-,E2b-]-UCLA-유전자 1-hTRICOM로 형질감염된 A549 세포: 리포터 엘리먼트 앞에 위치된 유전자 1의 발현을 검증하기 위해 리포터 유전자로서 말단에 위치된 Tricom의 48시간 형질감염 및 발현.
본 발명의 다양한 구체예의 제조 및 사용을 이하에서 상세하게 설명하지만, 본 발명은 광범위하게 다양한 특별한 문맥에서 구현될 수 있는 많은 적용가능한 발명 개념을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 설명되는 특별한 구체예들은 본 발명을 만들고 사용하는 특별한 방식을 단지 예시하는 것이며 본 발명의 범주를 한정하는 것이 아니다.
일정한 양상의 이해를 용이하게 하기 위해서, 하기에 많은 용어들을 정의한다. 본 명세서에서 정의되는 용어는 본 발명이 관련된 영역의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다.
"한", "하나" 및 "그것"과 같은 용어는 오직 단수 독립체를 의미하려는 것이 아니며, 특별한 예가 예시에 사용될 수 있는 일반 부류를 포함한다. 본 명세서의 전문용어는 본 발명의 특별한 구체예를 설명하기 위해 사용되지만, 그들 용법은 청구항에 약술되는 것을 제외하고, 본 발명을 한정하지 않는다.
"개체", "대상체", "환자"는 제한없이 인간, 인간 이외의 영장류, 설치류, 개 또는 돼지를 포함하여, 요법이 바람직한 임의의 단일 대상체를 의미한다. 또한 질환의 임의의 임상적 징후를 보이지 않는 임상 연구 실험에 관여되는 임의 대상체, 또는 역학 실험에 관여되는 대상체, 또는 대조군으로서 사용되는 대상체를 대상체로서 포함하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자"는 기능성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드-코딩 유닛을 의미한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 기능적 용어는 게놈 서열, cDNA 서열, 또는 단편 또는 이의 조합을 비롯하여, 인간의 손으로 변경할 수 있는 것들을 포함한, 유전자 생성물을 포함한다. 정제된 유전자, 핵산, 단백질 등은 정상적으로는 회합되어 있는 적어도 하나의 오염된 핵산 또는 단백질로부터 동정 및 분리되었을 때 이들 독립체를 의미하는데 사용된다. 용어 "대립유전자" 또는 "대립유전자 형태"는 동일한 기능성 단백질을 코딩하지만 동일 유전자의 다른 형태와 뉴클레오티드 서열에 차이를 함유하는 유전자의 대안적인 형태를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 의미한다. 핵산은 천연 발생 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA), 또는 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 천연 발생 뉴클레오티드의 α-거울상이성질체), 또는 이 둘의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 하나 이상의 히드록실 기를 할로겐, 알킬 기, 아민, 및 아지도 기로의 치환을 포함할 수 있거나, 또는 당이 에테르 또는 에스테르로 작용화될 수 있다. 게다가, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 탄소환 당 유사체로 치환될 수 있다. 염기 모이어티의 변형의 예는 알킬화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 알려진 복소환 치환체를 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결부의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결부의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 골격에 부착된 천연 발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥일 수 있거나 또는 이중 가닥일 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 달리 표시하지 않으면, 관사 "한"은 명백하게 제공하지 않으면 하나 이상을 의미한다.
달리 표시하지 않으면 본 명세서에서 사용되는 용어 예컨대 "함유하다", "함유하는", "포괄하다", "포괄하는" 등은 "포함하는"을 의미한다.
달리 표시하지 않으면 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 결합적일 수 있거나 또는 택일적일 수 있다.
달리 표시하지 않으면 본 명세서에서 사용되는 임의의 구체예는 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있다.
달리 표시하지 않으면 본 명세서에서 사용시 본 명세서의 일부 발명의 구체예는 수치 범위를 고려한다. 다양한 양상은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편리함과 간결성때문이고 본 발명의 범주에 대한 확고한 제한으로서 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 명백하게 기재된 바와 같은 범위 내의 개별 수치값을 비롯하여 특별하게 개시된 모든 가능한 하위범위를 갖는다고 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 특별히 개시된 하위범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등을 비롯하여, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 무관하게 적용된다. 범위가 존재할 때, 그 범위는 범위 종결점을 포함한다.
용어 "아데노바이러스" 또는 "Ad"는 아데노바이러스과 유래의 비엔벨로프형(non-enveloped) DNA 바이러스의 군을 의미한다. 인간 숙주 이외에도, 이들 바이러스는 제한없이, 새, 소, 돼지 및 개 종에서 발견될 수 있다. 특정 양상은 E2b 결실된 바이러스 벡터, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 결실을 함유하는 벡터를 기반으로 하여 아데노바이러스과의 4개 속 (예를 들어, 아비아데노바이러스, 마스타데노바이러스, 아타데노바이러스 및 시아데노바이러스) 중 어느 하나로부터 유래되는 임의 아데노바이러스의 사용을 고려한다. 또한, 몇몇 혈청형이 각각의 종에서 발견된다. Ad는 또한 제한없이, 유전자 돌연변이, 결실 또는 동종성 또는 이종성 DNA 서열의 전위를 포함하는, 임의의 이들 바이러스 혈청형의 유전자 유도체에 속한다.
"헬퍼 아데노바이러스" 또는 "헬퍼 바이러스"는 특정한 숙주 세포가 할 수 없는 바이러스 기능을 공급할 수 있는 Ad를 의미한다 (숙주는 E1 단백질과 같은 Ad 유전자 생성물을 제공할 수 있음). 이러한 바이러스는 제2 바이러스, 또는 헬퍼 의존적 바이러스에 결여된 기능 (예를 들어, 단백질)을 트랜스로, 공급하는데 사용되고 (예를 들어, 완전 결실형 (gutted 또는 gutless) 바이러스, 또는 영역 예컨대 E2b 또는 본 명세서에 기술된 다른 영역이 결실된 바이러스); 제1 복제-무능 바이러스가 제2, 헬퍼 의존적 바이러스를 "돕고", 그리하여 세포에서 제2 바이러스 게놈의 생산을 가능하게 한다고 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아데노바이러스5 무효 (Ad5null)"는 발현을 위한 임의의 이종성 핵산 서열을 함유하지 않는 비복제성 Ad를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "제1 세대 아데노바이러스"는 초기 영역 영역 1 (E1)이 결실된 Ad를 의미한다. 추가적인 경우에서, 불필수 초기 영역 3 (E3)이 또한 결실될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "완전 결실형 (gutted 또는 gutless)"은 모든 바이러스 코딩 영역이 결실된 아데노바이러스 벡터를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질감염"은 진핵생물 세포로 외래 핵산의 도입을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 동시침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총을 포함하는 당분야에 공지된 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다.
용어 "안정한 형질감염" 또는 "안정하게 형질감염된"은 형질감염된 세포의, 게놈으로의 외래 핵산, DNA 또는 RNA의 도입 및 통합을 의미한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 게놈 DNA로 안정하게 통합된 외래 DNA를 갖는 세포를 의미한다.
용어 "리포터 유전자"는 리포트 분자 (효소 포함)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "리포터 분자"는 제한없이 효소-기반 검출 어세이 (예를 들어, ELISA를 비롯하여 효소-기반 조직화학적 어세이), 형광발광성, 방사능, 및 발광성 시스템을 포함하는 임의의 다양한 검출 시스템으로 검출가능하다.
일 구체예에서, 리포터 유전자로서 이. 콜라이 β-갈락토시다제 유전자 (Pharmacia Biotech (Pistacataway, N.J.)에서 입수가능), 녹색 형광발광 단백질 (GFP) (Clontech (Palo Alto, Calif.)에서 시판중), 인간 태반 알칼리 포스파타제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자가 제공될 수 있고; 다른 리포터 유전자가 당분야에 공지되어 있으며 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코딩하는 핵산 분자", "코딩하는 DNA 서열" 및 "코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라서 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 의미한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따르는 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성 핵산 서열"은 자연계에서 결찰되지 않았거나, 또는 자연계에서 상이한 위치에서 결찰되는 핵산 서열과 결찰되거나, 또는 결찰되도록 조작된 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이종성 핵산은 천연 발생 서열에 비해서 일부 변형을 함유할 수 있는 이종성 핵산 또는 그것이 도입되는 세포에서 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
용어 "이식유전자"는 검사 대상체의 게놈 또는 세포에 도입되는, 천연 또는 이종성 핵산 서열 또는 융합된 동종성 또는 이종성 핵산 서열인, 임의의 유전자 코딩 영역을 의미한다. 특정 양상에서, 이식유전자는 대상체의 세포로 이식유전자를 도입시키는데 사용되는 임의의 바이러스 벡터 상에서 운반된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "2세대 아데노바이러스"는 E1, E2, E3, 및, 특정 구체예에서, E4 DNA 유전자 서열의 전부 또는 일부가 바이러스로부터 결실 (제거)된 Ad를 의미한다.
핵산 서열, 유전자 또는 폴리펩티드에 적용되는 본 명세서에서 사용되는 용어 "단편 또는 절편"은 대개는 길이가 적어도 약 5개의 인접하는 핵산 염기 (핵산 서열 또는 유전자의 경우) 또는 아미노산 (폴리펩티드의 경우), 전형적으로 적어도 약 10개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산, 보다 전형적으로 적어도 약 20개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산, 일반적으로 적어도 약 30개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산, 바람직하게 적어도 약 40개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 약 50개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산, 및 보다 더 바람직하게 적어도 약 60 내지 80개 또는 그 이상의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산이게 될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "중첩 단편"은 핵산 또는 단백질의 아미노 말단에서 시작하여 핵산 또는 단백질의 카복시 말단에서 종결되는 인접하는 핵산 또는 펩티드 단편을 의미한다. 각각의 핵산 또는 펩티드 단편은 다음의 핵산 또는 펩티드 단편과 공동으로 적어도 약 한개의 인접하는 핵산 또는 아미노산 위치, 보다 바람직하게 공동으로 적어도 약 3개의 인접하는 핵산 염기 또는 아미노산 위치, 가장 바람직하게 공동으로 적어도 약 10개의 인접하는 핵산 염기 아미노산 위치를 갖는다.
핵산 상황에서 상당한 "단편"은 적어도 약 17개 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 20개 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 적어도 23개 뉴클레오티드, 대개는 적어도 26개 뉴클레오티드, 보다 대개는 적어도 29개 뉴클레오티드, 종종 적어도 32개 뉴클레오티드, 보다 종종 적어도 35개 뉴클레오티드, 전형적으로 적어도 38개 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 적어도 41개 뉴클레오티드, 대체로 적어도 44개 뉴클레오티드, 보다 대체로 적어도 47개 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 50개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게 적어도 53개 뉴클레오티드의 인접하는 절편이고, 특히 바람직한 구체예는 적어도 56개 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 것이다.
"벡터"는 세포를 형질도입, 형질감염, 형질전환 또는 감염시킬 수 있어서, 세포가 세포에게 자연적이지 않은 방식으로, 또는 세포에게 자연적인 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하게 하는 조성물이다. 세포는 핵산이 세포외 환경으로부터 세포로 전좌될 때 핵산에 의해 "형질도입"된다. 세포로 핵산을 전달하는 임의 방법이 사용될 수 있으며; 달리 표시하지 않으면, 이 용어는 세포로 핵산을 전달하는 임의의 특정한 방법을 암시하는 것이 아니다. 세포는 핵산이 세포로 형질도입되어 안정하게 복제될 때 핵산에 의해서 "형질전환"된다. 벡터는 세포에 의해 발현시키려는 핵산 (대개는 RNA 또는 DNA)을 포함한다. 벡터는 임의로 세포로 핵산의 진입을 달성하는데 도움이 되는 재료, 예컨대 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅부 등을 포함한다. "세포 형질도입 벡터"는 핵산이 세포를 형질도입시키면 세포에서 안정한 복제 및 발현을 할 수 있는 핵산을 코딩하는 벡터이다.
폴리뉴클레오티드 서열의 맥락에서 사용시 용어 "변이체"는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포괄할 수 있다. 이 정의는 또한 예를 들어 "대립유전자", "스플라이스", "종" 또는 "다형성" 변이체를 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 분자와 유의한 동일성을 가질 수 있지만, 일반적으로 mRNA 프로세싱 동안 엑손의 선택적 스플라이싱으로 인해 더 많거나 또는 더 적은 개수의 폴리뉴클레오티드를 가지게 될 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 추가적인 기능성 도메인을 보유할 수 있거나 또는 도메인이 부재할 수 있다. 종 변이체는 종마다 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 특정한 유용성은 야생형 표적 유전자의 변이체이다. 변이체는 핵산 서열 중 적어도 하나의 돌연변이에 의해 생성될 수 있고 그 구조 또는 기능이 변경될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 폴리펩티드 또는 변경된 mRNA를 생성시킬 수 있다. 임의의 소정 천연 또는 재조합 유전자는 대립유전자 형태를 전혀 갖지 않거나, 하나 또는 더 많이 가질 수 있다. 변이체를 야기시키는 일반적인 돌연변이적 변화는 대체로 뉴클레오티드의 천연 결실, 첨가 또는 치환에 의한 것이다. 각각의 이들 유형의 변화는 단독으로, 또는 다른 것과 조합하여 소정 서열에서 1회 이상으로 발생될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 폴리펩티드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된 아미노산 서열을 의미한다. 변이체는 "보존성" 변화를 가질 수 있고, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다 (예를 들어, 이소류신으로 류신의 대체). 보다 드물게, 변이체는 "비보존성" 변화를 가질 수 있다 (예를 들어, 트립토판으로 글리신의 대체). 유사한 소수 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 활성을 폐기시키지 않고 아미노산 잔기를 치환할 수 있거나, 삽입할 수 있거나, 또는 결실시킬 수 있는지를 결정하는 지침은 당분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 LASERGENE 소프트웨어 (DNASTAR)를 사용해 확인할 수 있다.
최종 폴리펩티드는 일반적으로 서로에 대해서 유의한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 소정 종의 개체 간에 특정한 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이이다. 다형성 변이체는 또한 폴리뉴클레오티드 서열이 한개 염기 만큼 다른 "단일 뉴클레오티드 다형성" (SNP) 또는 단일 염기 돌연변이를 포괄할 수 있다.
"항원"은 항체 또는 T 림프구 (T 세포)와 특이적으로 반응하는 임의 물질이다. "항원-결합 부위"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자의 일부분이다. 추가적으로, 항원-결합 부위는 제한없이, MHC 분자 또는 T 세포 수용체를 포함하는 임의의 항원-결합 분자 상의 이러한 임의 부위를 포함한다. "항원 프로세싱"은 항원의 단편으로의 분해 (예를 들어, 단백질의 펩티드로의 분해) 및 특정 T 세포에게의 "항원-제시 세포"에 의한 제시를 위한, MHC 분자와 하나 이상의 이들 단편의 회합 (예를 들어, 결합을 통함)을 의미한다.
"수지상 세포" (DC)는 강건한 적응성 면역 반응을 생체내에서 촉발시킬 수 있는 강력한 항원-제시 세포이다. 활성화된, 성숙한 DC가 T 세포 활성화 및 증식에 요구되는 신호를 제공한다는 것이 확인되었다. 이들 신호는 2개 유형으로 분류될 수 있다. 제1 유형은 면역 반응에 특이성을 제공하는 것으로서, T-세포 수용체/CD3 ("TCR/CD3") 복합체 및 APC의 표면 상에 주요 면역적합성 복합체 (상기 정의된 "MHC") 클래스 I 또는 II 단백질에 의해 제시된 항원성 펩티드 간 상호작용을 통해 매개된다. 공자극성 신호라고 불리는, 제2 유형의 신호는 항원-특이적이지도 않거나 또는 MHC-제한적이지도 않고, 제1 유형의 신호 존재 하에서 T 세포 이펙터 기능의 유도 및 T 세포의 완전한 증식 반응을 야기시킬 수 있다. 그러므로, 이러한 2배 신호전달은 활기찬 면역 반응을 일으킬 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 대부분의 조류이외의 척추동물에서, DC는 골수-유래 전구체로부터 발생된다. 미성숙한 DC는 말초 혈액 및 제대혈 및 흉선에서 발견된다. 추가적인 미성숙한 개체군은 그외의 곳에 존재할 수 있다. 다양한 성숙 단계의 DC가 또한 비장, 림프절, 편도선, 및 인간 장에서 발견된다. 조류 DC는 또한 조류에 고유한 주요 면역 장기인 파브리시우스낭에서 발견될 수 있다. 특정한 구체예에서, 수지상 세포는 포유동물, 바람직하게 인간, 마우스 또는 래트의 것이다.
"공자극성 분자"는 T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체에 의해 결합된 펩티드 MHC 복합체와 함께 작용시, 펩티드에 결합하는 T 세포의 활성화를 달성하는 공자극성 효과를 제공하는 임의의 단일 분자 또는 분자의 조합을 포괄한다.
"진단" 또는 "진단하는"은 병리학적 상태의 존재 또는 성질을 식별하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그들의 감도 및 특이도가 상이하다. 진단 어세이의 "감도"는 양성으로 검사된 질환 개체의 백분율 ("참양성"의 백분율)이다. 어세이에 의해서 검출되지 않는 질환 개체는 "거짓 음성"이다. 어세이에서 음성으로 검사되고 질환이 아닌 대상체는 "참음성"이라고 한다. 진단 어세이의 "특이도"는 1 마이너스 거짓 양성 비율로서, 여기서 "거짓 양성" 비율은 양성으로 검사된 질환이 없는 개체의 비율로서 정의된다. 특정한 진단 방법이 병태의 확정적 진단을 제공할 수 없지만, 방법이 진단에 도움이 되는 양성 지표를 제공한다면 충분하다.
본 출원 전반에서, 용어 "약"은 값이 그 값을 결정하는데 적용되는 방법, 장치에 대한 고유한 오류 편차, 또는 실험 대상체 간에 존재하는 편차를 포함한다는 것을 의미하기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 단어 "포함하는" (및 포함하는의 임의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 포함한다"), "가지는" (및 가지는의 임의 형태, 예컨대 "가지다" 및 "갖다"), "포괄하는" (및 포괄하는의 임의 형태, 예컨대 "포괄하다" 및 "포괄한다") 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의 형태, 예컨대 "함유하다" 및 "함유한다")은 총괄적이거나 또는 제약이 없고 추가적이거나, 인용되지 않은 요소들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "∼으로 본질적으로 이루어지는"은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들 및 명시된 재료 또는 단계에 대해 청구항의 범주를 한정한다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "∼으로 이루어지는"은 예를 들어, 제한 또는 요소와 대개는 회합된 불순물을 제외하고 청구항에 명시되지 않은 임의 요소, 단계 또는 성분은 배제한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "또는 이의 조합"은 이 용어 앞에 열거된 항목들의 모든 변경 및 조합을 의미한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하려는 의도이고, 순서가 특정한 문맥에서 중요하다면, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB이다. 이 예를 계속하면, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합, 예컨대 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 분명하게 포함한다. 당업자는 전형적으로 문맥에서 명확하게 하지 않으면, 임의 조합의 항목 또는 용어의 수에 제한이 없다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 근사치의 단어 예컨대 제한없이, "약", "실질적인" 또는 "실질적으로"는 그렇게 변형되었을 때 반드시 절대적이거나 또는 완벽한 것으로 이해될 필요는 없지만 존재하는 대로 상태를 지정하는 것을 보장하도록 당업자에게 충분히 가깝게 간주되는 상태를 의미한다. 설명이 가변적일 수 있는 정도는 얼마나 많은 변화를 시작할 수 있고 여전히 당업자가 변형된 특징을 미변형된 특성의 필수 특징 및 능력을 여전히 갖는 것으로 인식하는 가에 따라 좌우될 것이다. 대체로, 앞의 설명 하에서, 근사치 단어 예컨대 "약"에 의해 변형된 본 명세서의 수치값은 적어도 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 또는 15% 만큼 언급된 값에서 변화될 수 있다.
I. 종양 항원
특정 양상에서, 방법은 하나 이상의 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 대상체는 투여 이전에 종양 네오-항원을 갖는지 결정될 수 있다. 다른 구체예에서, 방법은 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특별한 구체예에서, 복제-결함 아데노바이러스 벡터 및/또는 부분적으로 E2b-결실된 아데노바이러스 벡터를 사용하여 대상체에게 종양 네오-항원을 투여할 수 있다.
1. 면역계
면역계는 T 세포에 의한 항원 인식의 기본 기전을 기반으로 종양 세포를 인식한다. T-세포는 흉선에서 성숙하는데, 여기서 T-세포 수용체 (TCR) 유전자좌의 체세포 재배열이 각 T 세포에 대한 고유한 TCR을 생성시킨다. 또한 흉선 내에서, 자가-반응성 T 세포는 음성-선택 또는 중추 내성이라고 하는 과정을 통해서 결실된다. 그 결과는 자기에 대해서는 제한된 반응성을 갖지만 외래 항원에 대해서는 강력한 반응성을 갖는 성숙한 T-세포 레파토리이다. T 세포 상의 TCR은 표적 세포 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 결합된 짧은 펩티드 (에피토프라고 함)로서 항원을 인식한다. 각 단백질 유래의 오직 소수의 펩티드가 바람직한 생화학적 특징을 가져서 부모 단백질로부터 그들을 단백질가수분해적으로 절단시키고 MHC에 결합될 수 있게 한다.
인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자에 의해 코딩되는 MHC 분자의 2가지 유형: MHC 클래스 I (MHCI) 및 MHC 클래스 II (MHCII)가 존재한다. 거의 모든 유핵 세포는 MHCI을 발현하고, 이것은 또한 세포독성 T 림프구 (CTL)이라고도 하는 '살해' CD8+ T 세포에게 에피토프를 제시한다. CTL은 MHCI 상에 동족 에피토프를 표시하는 세포를 직접적으로 용해시킬 수 있고, 이것은 항종양 면역성의 근간이되는 가장 중요한 기전이라고 여겨진다.
전문적인 항원-제시 세포 (APC)는 CD4+ T-헬퍼 세포 (Th)에게 에피토프를 제시하는 MHCII를 발현한다. Th 세포는 다수의 항종양 기능 예컨대 종양 세포의 직접적인 사멸, CD8+ T-세포 반응의 증가, 및 선천성 항종양 면역 세포의 활성화를 가질 수 있다. 가장 일반적으로, T 세포는 병원체로부터 유래된 항원을 인식하지만, 또한 T 세포는 그들이 건강한 조직에 존재하는 자가-단백질과 충분히 상이하다면, 종양 항원을 인식할 수 있다.
2. 종양 항원
종양 항원은 종양-연관된 항원 (TAA), 암-배선/암정소 항원 (CTA) 및 종양-특이적 항원 (TSA)을 포함할 수 있다.
TAA는 정상 게놈에서 코딩되는 단백질을 포함하고 정상 분화 항원일 수 있거나 또는 비정상적으로 발현되는 정상 단백질일 수 있다. 성장/생존-촉진 기능을 보유하는 과발현되는 정상 단백질, 예컨대 빌름 종양 1 (WT1) 또는 Her2/neu은 종양형성 과정에 직접적으로 관여하는 TAA를 의미한다. 단백질의 번역후 변형 예컨대 인산화는 또한 TAA의 형성을 야기시킬 수 있다. 추가적인 예는 유방 및 난소 암종 상의 인간 상피 성장 인자 수용체 2, 및 다수 암에서 마우스 더블 미닛트 2 상동체를 포함한다. 또한, 종양 기원의 조직에서 차등적으로 발현되는 단백질은 '분화' 항원을 야기시킬 수 있다. 예를 들어, 흑색종은 종종 분화 항원 MART1, gp100, 및 티로시나제를 발현한다.
TAA 예컨대 분화 및 과발현된 항원이 정상 단백질이고 또한 건강한 조직에도 존재하므로, 그들의 항원성은 면역학적 내성의 천연 발생적 기전을 우회하는 상황 또는 비정상적 발현 수준에 의존적이다. 이들 라인과 함께, TAA는 일반적으로 흉선 음성-선별의 결과로서 TSA 또는 외래 항원과 비교하여 더 낮은 T 세포 수용체 (TCR) 친화성을 갖는다. 게다가, 면역요법으로 이러한 항원의 표적화는 자가면역 독성의 위험성을 야기한다.
다른 유형의 종양 항원은 CTA를 포함하며, 이것은 정소, 태아 난소, 및 세포영양막에서 정상적으로 발현되고, 또한 암 세포에서도 발현될 수 있다. 그들이 정상 게놈에서 코딩되지만 고도로 제한된 조직 발현을 나타내기 때문에, CTA는 면역요법을 위한 매력적인 표적으로서 상당한 주목을 받고 있다.
TSA는 체세포 돌연변이의 결과로서 발생된 비정상적인 단백질 및 종양형성성 바이러스 단백질을 포함하고 정상 숙주 게놈에서 코딩되지 않는 항원이다 (네오-항원 포함). 바이러스 기원의 암은 면역계에 의해 인식될 수 있는 바이러스-유래된 단백질을 발현한다. 예를 들어, 인간 파필로마바이러스 유래의 E6 및 E7 단백질은 이상적인 면역요법 표적을 만든다. 종양형성성 바이러스 단백질 이외에도, 암 개시 및 진행 동안, 종양 세포는 형질전환의 원인이 되거나 (드라이버 돌연변이) 또는 세포 형질전환을 수반하는 게놈 불안정성의 부산물 (패신저 돌연변이)인 단백질-변경 돌연변이를 획득한다. 이들 변경의 일부는 그 결과로 면역계에 의해서 외래 단백질로서 인지되는 돌연변이체 단백질의 발현을 야기시킬 수 있다. 이러한 클래스의 항원은 아마도 면역학적 내성 기전에 덜 감수성일 것이고 그러므로 면역-매개 종양 제어에 대한 보다 가시적인 표적을 대표할 수 있다.
3. 종양 네오-항원
종양은 종양발생 과정 동안 수십 내지 수천의 코딩 돌연변이를 발생시킨다. 적은 비율의 돌연변이는 EGFRvIII 돌연변이와 같이, 세포 표면 단백질의 세포외 도메인에 영향을 미치고, 항체-기반 면역요법에 고유한 표적을 제공한다. 그러나, T 세포에 의해 인식되기 위해서, 돌연변이는 프로세싱되어 MHCI 또는 MHCII 상에 제시되어서, 소위 네오-항원을 생기게 한다.
네오-항원은 돌연변이가 TCR 접촉 잔기에 영향을 미치거나 또는 펩티드 에피토프의 잔기를 친화성으로 MHCI 또는 II에 앵커링시키는 경우에 발생될 수 있다. 단일 아미노산 치환이더라도 T-세포-매개 파괴에 대해 종양 세포를 표지하도록 자기와 충분히 상이한 에피토프를 산출할 수 있다.
종양-반응성 T-세포 클론으로 종양-유래된 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 몇몇 초기 연구들은 네오-항원의 면역계 인식의 일화적 예를 제공하였다. 이러한 연구들은 네오-항원이 드라이버 및 패신저 유전자 둘 모두로부터 유래될 수 있고 흑색종, 신장 세포 암종, 경구 편평 세포 암종, 직결장 암종, 폐 암종, 및 만성 골수성 백혈평을 포함하는 많은 상이한 유형의 종양에 존재한다는 것을 입증하였다. 일부 연구들은 네오-항원이 TIL에 의해 인식되는 항원의 지배적인 클래스일 수 있다는 것을 시사한다. 더 나아가서, 네오-항원-특이적 T-세포 반응은 자발적으로 또는 요법 이후에 완전 또는 부분 종양 퇴행과 연관되었다.
치료적 표적으로서, 네오-항원는 종양 항원의 다른 클래스에 비해 몇몇 장점을 갖는다. 첫번째, 네오-항원-특이적 T 세포는 흉선 또는 말초 내성을 겪지 않고; 그러므로, 고친화성 T-세포 클론이 면역용법에 이용가능하다. 주목할만하게, 그들 동족 항원에 대한 고친화성의 TCR을 보유하는 T 세포는 종양 환경에서 보다 큰 세포독성 능력, 더 긴 지속성, 및 면역 억제에 대한 감소된 감수성을 갖는다. 두번째, 분화 및 과발현된 항원이 비종양 조직에 의해 발현되지만, 네오-항원은 종양 세포에 의해 독점적으로 발현되고, 표적외 독성에 대한 잠재성을 감소시킨다. 세번째, 바이러스 및 CT 항원은 오직 제한된 수의 종양에서만 발현될 수 있지만, NGS는 많은 비율의 종양이 잠재적으로 T-세포 표적으로서 제공될 수 있는 다수의 돌연변이체 유전자 산물을 발현한다는 것을 밝혔다.
예를 들어, 환자의 종양에 고유한 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생성시키는 유용한 돌연변이 (예를 들어, 네오-항원)는 (1) 단백질 내 상이한 아미노산을 초래하는 비동의적 돌연변이; (2) 중지 코돈이 변형되거나 또는 결실되어, C-말단에서 신규한 종양-특이적 서열을 갖는 보다 긴 단백질의 번역을 초래하는 리드-쓰루 돌연변이; (3) 성숙한 mRNA에 인트론의 포함을 초래하고 그에 따라 고유한 종양-특이적 단백질 서열을 초래하는 스플라이스 부위 돌연변이; (4) 2개 단백질의 접합부에서 종양-특이적 서열을 갖는 키메라 단백질을 발생시키는 염색체 재배열 (즉, 유전자 융합); (5) 신규한 종양-특이적 단백질 서열을 갖는 신규한 오픈 리딩 프레임을 초래하는 프레임쉬프트 돌연변이 또는 결실 등을 포함할 수 있다. 종양 세포에서 예를 들어 스플라이스-부위, 프레임쉬프트, 리드-쓰루, 또는 유전자 융합 돌연변이로부터 발생된 돌연변이를 갖는 펩티드 또는 돌연변이된 폴리펩티드는 정상 세포 대비 종양에서 DNA, RNA 또는 단백질을 시퀀싱하여 동정될 수 있다.
본 명세서는 또한 이전에 동정된 종양 특이적 돌연변이를 더 포함할 수 있는, 공통 종양 드라이버 유전자로부터 유래된 개인 네오-항원 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 기지의 공통 종양 드라이버 유전자 및 공통 종양 드라이버 유전자의 종양 돌연변이는 (www)sanger.ac.uk/cosmic의 월드 와이드 웹에서 확인할 수 있다.
II. 종양 돌연변이의 동정을 위한 핵산 어세이
특정 양상에서, 종양 돌연변이 및 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원을 동정하기 위한 핵산 어세이 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서는 인간 암의 제어에 관여하는 고유한 종양 항원 및 종양 에피토프로부터 T 세포 에피토프를 동정하기 위해서 역 (reverse) 면역학과 암 DNA의 차세대 시퀀싱과 같은 핵산 어세이를 조합할 수 있다는 것을 개시한다. 특정 양상에서, 초기 단계는 특히 종양 세포에서 발현되는 유전자에서, 네오-항원을 생성시키는 돌연변이 (미스센스 및 네오ORF 둘 모두)를 동정하기 위해 환자의 종양 및 정상 조직으로부터 DNA 또는 RNA를 서열분석하는 것이다.
특정 양상에서, 종양 재료는 종양-특이적 돌연변이, 예컨대 비동의적 체세포 돌연변이에 대한 시퀀싱 예컨대 전체 엑솜 시퀀싱 또는 전체 게놈 시퀀싱을 통해 분석될 수 있다 (도 1 또는 도 2). 특정 양상에서, RNA 시퀀싱 데이타는 발현된 유전자 내 종양 돌연변이에 집중하도록 사용된다. 특정 양상에서, 임의의 동정된 비동의적 종양 돌연변이를 함유하는 펩티드 스트렛치를 인 실리코로 생성시키고 예측 알고리즘의 사용을 통해 필터링하거나 또는 질량 분광분석 데이타에서 MHC-연관된 네오-에피토프를 동정하는데 사용한다. 특정 양상에서, 최종 펩티드-MHC 복합체에 대한 종양 돌연변이의 효과의 모델링은 추가적인 필터로서 사용된다. 특정 양상에서, MHC-결합 네오-에피토프 세트는 CD8 및 CD4 T 세포 개체군 둘 모두 내에서 MHC 다량체-기반 스크린 및 기능적 어세이에 의해서 생리적으로 발생된 네오-에피토프-특이적 T 세포 반응을 동정하는데 사용된다.
일 구체예에서, 돌연변이된 에피토프는 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 암 환자 유래의 종양 및 건강한 조직의 게놈 및/또는 엑솜의 시퀀싱에 의해 결정된다. 다른 구체예에서, 그들의 돌연변이 빈도 및 네오-항원으로서 작용하는 능력을 기반으로 선택된 유전자는 차세대 시퀀싱 기술을 사용해 서열분석된다.
차세대 시퀀싱은 게놈 시퀀싱, 게놈 재시퀀싱, 전사체 프로파일링 (RNA-Seq), DNA-단백질 상호작용 (ChIP-시퀀싱), 및 후성유전체 특징규명에 적용된다.
이제 차세대 시퀀싱은 별개의 돌연변이의 존재 예컨대 개별 종양 내 코딩 돌연변이, 가장 일반적인 단일 아미노산 변화 (예를 들어, 미스센스 돌연변이) 및 프레임쉬프트 삽입/결실/유전자 융합에 의해 생성된 아미노산의 덜 빈번하게 신규한 스트렛치, 중지 코돈의 리드-쓰루 돌연변이, 및 부적절하게 스플라이싱된 인트론의 번역 (예를 들어, 네오ORF)을 신속하게 밝힐 수 있다.
네오ORF는 그들 서열의 전체가 면역계에 완전히 새롭고 그래서 바이러스 또는 박테리아 외래 항원과 유사하기 때문에 면역원으로서 가치있다. 따라서, 네오ORF는: (1) 종양에 고도로 특이적이고 (즉, 임의의 정상 세포에서는 발현이 없음); (2) 중추 내성을 우회할 수 있어서, 네오-항원-특이적 CTL의 전구체 빈도를 증가시킨다.
시퀀싱 기술은 각각의 종양이 유전자의 단백질 코딩 내용을 변경시키는 다수의, 환자-특이적 돌연변이를 함유한다는 것을 밝혔다. 이러한 돌연변이는 단일 아미노산 변화 (미스센스 돌연변이에 의해 야기됨)부터, 프레임쉬프트, 종결 코돈의 리드-쓰루 또는 인트론 영역의 번역 (신규 오픈 리딩 프레임 돌연변이; 네오ORF)에 기인하여 신규한 아미노산 서열의 긴 영역의 첨가에 이르는 범위까지 변경된 단백질을 생성시킨다. 이들 돌연변이된 단백질은 천연 단백질과 달리 그들이 자가-내성의 면역-약화 (dampening) 효과를 겪지 않기 때문에 종양에 대한 숙주 면역 반응의 귀중한 표적이다. 그러므로, 돌연변이된 단백질은 아마도 더욱 면역원성일 수 있고 또한 환자의 정상 세포와 비교하여 종양 세포에 더 특이적이다.
시퀀싱 기술의 진보는 동일한 장비 운용으로 수억개의 게놈 단편에 대한 뉴클레오티드 혼입의 검출과 시퀀싱 반응을 커플링시킴으로써 암-특이적 돌연변이를 해독하는 우리의 능력을 변환시켰다.
특히, 종양-특이적 또는 "체세포" 돌연변이는 정상 공급원 대비 종양으로부터 단리된 DNA를 비교하기 위해 대량 병렬 시퀀싱 (MPS) 접근법을 사용해 동정될 수 있다.
MPS를 사용하는 DNA-기반 어세이와 유사하게, 종양 유래 RNA는 cDNA로의 전환 및 시퀀싱에 적합한 라이브러리의 구축에 의해 분석될 수 있다.
게놈이 거대하고 (30억 염기쌍) 이의 분석이 복잡하므로, 하이브리드 포획 기술의 출현은 연구자들이 기지 유전자의 코딩 엑손 (즉, "엑솜")을 포함하는 게놈의 1%에만 집중할 수 있게 하였다. 여기서, 주석달린(annotated) 유전자의 엑손 서열에 결합하도록 디자인된 프로브가 합성되고, 바이오틴화되며, 단편화된 전체 게놈 라이브러리와 용액 중에서 하이브리드화된다. 프로브-결합된 라이브러리 단편은 이후에 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 사용해 포획되고 단리된다. 변성에 의해 비드로부터 방출 후, 라이브러리 단편을 증폭하고, 정량하고, 서열분석한다.
엑솜-포획은 임상적 상황에서 사용될 수 있지만, 그 도전에는 (a) 임상적으로 관련된 기간에 정보의 수득, (b) 코어 생검 절차로부터 이용가능한 소량의 DNA/RNA, (c) 골격 가교를 통해 핵산의 분해를 촉진하는 포르말린 및 파라핀 중 조직의 보존 (포르말린-고정 파라핀 포매 [FFPE]), 및 (d) 데이타 해석이 포함된다. 최근의 기술적 혁신은 하이브리드 포획에 대해 대략 1주에서 대략 2시간으로 이러한 접근법에 대한 시간을 단축시켰다. 이제 약 3일 안에 엑솜-포획 데이타를 생성시키고 체세포 돌연변이 목록을 만드는 것이 실현가능하다. 하이브리드 포획은 또한 특히 낮은 수율 및/또는 FFPE-유래된 샘플에 대해서, 종양 RNA (cDNA) 시퀀싱으로 수득된 시퀀싱 데이타 품질을 향상시킨다.
엑폼-포획 시퀀싱 데이타로부터 호출된 돌연변이는 MPS 플랫폼에 의해 생성된 짧은 판독 길이 (∼100 bp)를 분석하기 위한 핵심으로서 제공되는, 기준 게놈에 대해 서열 판독치를 정렬하여 획득된다. 판독치가 게놈에 대해 정렬되면, 변이체는 점 돌연변이 (또는 단일 뉴클레오티드 변이체 [SNV]) 및 집중 삽입 또는 결실 변이체 (indel)를 포함한, 상이한 유형의 돌연변이를 해석하기 위한 몇몇 알고리즘을 사용해 동정된다. 다음으로 종양-고유 ("체세포") 돌연변이를 동정하기 위해서 유사한 포획 시약을 사용하여 일치된 정상 조직 DNA 유래의 데이타와 종양 변이체 호출값을 비교한다. 후속 주석 단계는 핵산 서열의 변이를 아미노산 서열의 변화로 전환시키고, 그리하여 종양 네오-항원을 동정하고 순위매기는데 요구되는 초기 데이타가 제공된다.
이러한 과정의 일 양상은 보다 "극심한" 돌연변이로부터 발생된 네오-항원을 예측하는 능력이다. 이론적으로, 아미노산을 첨가하거나 또는 결실하거나 또는 오픈 리딩 프레임을 연장하거나 또는 절단한 변이체 또는 잔좌 또는 도치로 발생된 융합 유전자는 고도의 항원성 신규 에피토프의 공급원일 수 있지만, indel 변이체는 과거에, 이러한 유형의 돌연변이를 검출하기 위해 특별히 조율된 알고리즘을 적용한 경우에도, 높은 확실성으로 검출하는 것이 어려웠다. 그러나, 최근의 진보는 이제 고도의 반복성 영역을 함유하는 indel은 여전히 어려움이 남아있지만, 상당히 높은 정도의 확실성으로 일부 indel의 동정을 가능하게 한다. 구조적 변이체도 역시 특히, 엑솜-포획 데이타로부터 동정하는 것이 어려워서, RNA 시퀀싱 (RNA-Seq) 데이타가 (상관적인 높은 거짓-양성 비율을 갖는) 융합 전사물에 대해 평가될 수 없으면 쉽게 검출할 수 없을 것이다. 모든 경우에서, 이러한 변이체를 동정하고/하거나 확증하기 위해 cDNA 포획 시퀀싱 (cDNA Cap-Seq) 또는 RNA-Seq로부터의 RNA 데이타의 사용이 결정적으로 중요하다.
특정 양상에서, "기준"은 종양 돌연변이를 동정하기 위해 종양 표본으로부터 핵산 어세이 방법에서 수득된 결과를 상관짓고 비교하는데 사용될 수 있다. 전형적으로 "기준"은 하나 이상의 정상 표본, 특히 하나 이상의 상이한 개체, 특히 건강한 개체 또는 환자로부터 수득된 암 질환에 의해 영향받지 않은 표본을 기반으로 수득될 수 있다. 추가 양상에서, "기준"은 충분히 많은 수의 정상 표본을 검사하여 실증적으로 결정할 수 있다.
생물학적 샘플에서 종양-특이적 돌연변이 또는 종양 네오-항원 또는 에피토프를 동정하기 위해서 수많은 어세이가 적용될 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 어세이는 제한없이, 차세대 시퀀싱, 단백질체, 어레이 하이브리드화, 용액 하이브리드화, 핵산 증폭, 폴리머라제 사슬 반응, 정량적 PCR, RT-PCR, 인시츄 하이브리드화, 노던 하이브리드화, 하이브리드화 보호 어세이 (HPA) (GenProbe), 분지된 DNA (bDNA) 어세이 (Chiron), 롤링 서클 증폭법 (RCA), 단일 분자 하이브리드화 검출법 (US Genomics), 인베이더 어세이 (ThirdWave Technologies), 및/또는 올리고 결찰 어세이 (OLA), 하이브리드화, 및 어레이 분석을 포함한다.
특정 양상에서, 백신 면역요법을 위한 네오-에피토프를 동정하기 위해 하나 이상의 시퀀싱 방법이 제공될 수 있다. 시퀀싱은 아데노바이러스 벡터-기반 백신을 이용하는 표적에 대한 가능한 네오-에피토프를 동정하기 위해 환자-유래 샘플 상에서 수행될 수 있다. 시퀀싱 분석은 돌연변이체 종양 연관 항원 및 에피토프를 동정하기 위해 유전체학, 생물정보학, 및 면역학적 접근법과 조합될 수 있다.
임의의 적합한 시퀀싱 방법이 사용될 수 있다. 특히, 차세대 시퀀싱, 또는 "NGS"가 사용될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 생어 (Sanger) 화학으로 알려진 "통상의" 시퀀싱 방법론과 대조적으로, 전체 게놈을 작은 조작으로 파쇄하여 전체 게놈을 따라서 병렬로 무작위로 핵산 주형을 판독하는 모든 신규한 고속 대량 시퀀싱 기술을 포함할 수 있다.
이러한 NGS 기술 (대량 병렬 시퀀싱 기술이라고도 알려짐)은 전체 게놈, 엑솜, 전사체 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬 (게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 짧은 기간, 예를 들어 1 내지 2주 이내, 또는 1일 내지 7일 이내, 또는 24시간 미만 이내에 전달할 수 있고 특히 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능하게 한다. 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 문헌에 언급된 다중 NGS 플랫폼, 예를 들어 문헌 [Zhang et al. 2011: The impact of next- generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109]; 또는 [Voelkerding et al. 2009]에 상세하게 기술된 것들을 본 명세서에서 기술된 대로 사용할 수 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 가역적 염료-종결인자를 기반으로 하고 예를 들어, Illumina/Solexa Genome Analyzer™ 및 Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer로 실행되는 Solexa (현 Illumina Inc.의 일부, San Diego, California)가 개발한 시퀀싱-바이-합성 접근법을 포함한다. 이 기술에서, 전체 4개 뉴클레오티드가 DNA 폴리머라제와 함께 유세포 채널 중 올리고-프라이밍된 클러스터 단편에 동시에 첨가된다. 브릿지 증폭은 시퀀싱을 위해 모든 4종의 형광발광 표지된 뉴클레오티드로 클러스터 가닥을 확장시킨다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 예를 들어 Applied Biosystems (현 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)의 SOLid™ 플랫폼에서 실행되는 시퀀싱-바이-결찰 접근법을 포함할 수 있다. 이러한 기술에서는, 고정된 길이의 모든 가능한 올리고뉴클레오티드의 풀이 서열분석되는 위치에 따라서 표지된다. 올리고뉴클레오티드가 어닐링되고 결찰되며, 일치되는 서열에 대한 DNA 리가제에 의한 우선적인 결찰은 그 결과로 그 위치의 뉴클레오티드 정보를 주는 신호를 생성시킨다. 시퀀싱 이전에, DNA는 에멀션 PCR에 의해 증폭된다. 각각 동일 DNA 분자의 카피만을 함유하는 최종 비드를 유리 슬라이드 상에 침착시킨다. 두번째 예로서, Dover Systems (Salem, New Hampshire)의 Polonator™ G.007이 또한 동시 시퀀싱을 위해 DNA 단편을 증폭하도록 무작위 어레이된, 비드-기반, 에멀션 PCR을 사용하여 시퀀싱-바이-결찰 접근법을 적용한다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 예컨대, 예를 들어 Pacific Biosciences (Menlo Park, California)의 PacBio RS 시스템 또는 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)의 HeliScope™ 플랫폼으로 실행되는 단일-분자 시퀀싱 기술을 포함할 수 있다. 이러한 기술의 구별되는 특징은 SMRT (Single-Molecule Real Time) DNA 시퀀싱으로 정의되는, 증폭없이 단일 DNA 또는 RNA 분자를 서열분석하는 이의 능력이다. 예를 들어, HeliScope는 합성되면서 각각의 뉴클레오티드를 직접적으로 검출하도록 고도로 민감한 형광발광 검출 시스템을 사용한다. 형광발광 공명 에너지 전달 (FRET)을 기반으로 하는 유사한 접근법은 Visigen Biotechnology (Houston, Texas)가 개발하였다. 다른 형광발광-기반 단일-분자 기술은 U.S. Genomics (GeneEngine™) 및 Genovoxx (AnyGene™)에서 개발되고 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 예를 들어 복제 동안 단일 가닥 상에서 폴리머라제 분자의 이동을 모니터링하도록 칩 상에 정렬된 다양한 나노 구조가 사용되는 단일-분자 시퀀싱을 위한 나노-기술을 포함할 수 있다. 나노-기술을 기반으로 하는 접근법의 비제한적인 예에는 Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK)의 GridON™ 플랫폼, Nabsys (Providence, Rhode Island)가 개발한 하이브리드화-보조형 나노-포어 시퀀싱 (HANS™) 플랫폼, 조합 프로브-앵커 결찰이라고 하는 DNA 나노볼 (DNB) 기술을 사용하는 특허된 리가제-기반 DNA 시퀀싱 플랫폼 (cPAL™), 및 단일-분자 시퀀싱을 위한 전자 현미경 기반 기술이 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 DNA의 중합 동안 방출되는 수소 이온의 검출을 기반으로 하는 이온 반도체 시퀀싱을 포함할 수 있다. 예를 들어, Ion Torrent Systems (San Francisco, California)는 대량 동시 방식으로 이러한 생화학적 과정을 수행하도록 미세-규격화된 웰의 고밀도 어레이를 사용한다. 각각의 웰은 상이한 DNA 주형을 보유한다. 웰 아래에는 이온-감응성 층이 있고 그 아래는 특허된 이온 센서가 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에서 사용되는 NGS 방법은 엑솜 시퀀싱을 위한 몇몇 표적화된 NGS 방법을 포함할 수 있다 (고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), Rl 45-51을 참조함). 많은 이들 방법 (예를 들어, 게놈 포획, 게놈 분획화, 게놈 농축 등으로 기술됨)은 하이브리드화 기술을 사용하고 어레이-기반 (예를 들어, 문헌 [Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527]) 및 액체-기반 (예를 들어, 문헌 [Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101]) 하이브리드화 접근법을 포함한다. DNA 샘플 준비 및 후속 엑솜 포획을 위한 상업적 키트, 예를 들어, Illumina Inc. (San Diego, California)는 TruSeq™ DNA 샘플 제조 키트 및 엑솜 농축 키트 TruSeq™ 엑솜 농축 키트를 이용할 수 있다.
본 명세서는 환자 종양의 전체 게놈 시퀀싱 또는 RNA 시퀀싱 또는 이의 임의 조합을 이용할 수 있는 팬오믹스 (panomics)-기반 검사의 사용을 포함하는 방법을 개시한다. 전체 게놈 시퀀싱 또는 RNA 시퀀싱을 이용할 수 있는 팬오믹스-기반 검사는 환자 종양의 DNA 및 RNA에서 분자적 변경을 동정하기 위해서, 환자의 정상 샘플 또는 기준과 환자 종양을 비교할 수 있다. 일부 경우에서, DNA 및 RNA의 전체 게놈 기반 시퀀싱은 비정상적인 단백질을 생성시킬 수 있는 암 환자의 분자적 변경을 기반으로 하는 임상적 정보를 제공할 수 있다. 비정상적인 단백질은 표적화할 수 있는 종양 네오-에피토프를 포함할 수 있다.
팬오믹스-기반 검사는 게놈 분석을 수반할 수 있다. 일부 경우에서, 게놈 분석은 각 환자 유래의 정상 게놈 서열과 종양 게놈 서열을 직접적으로 대조하고 발현된 환자의 돌연변이된 유전자를 동정하여 단일 뉴클레오티드 변이 (SNV), 카피수 변이, 삽입, 결실, 재배열, 또는 이의 임의 조합을 포함하는 관련 돌연변이에 대해 선택될 수 있다
적합한 샘플은 임의의 환자 샘플일 수 있다. 적합한 샘플은 DNA 또는 RNA 추출이 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 시퀀싱 분석은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 또는 신선한 동결 샘플에 대해 수행된다. 일부 경우에서, 전혈이 사용될 수 있다. 환자 샘플은 검사전에 처리될 수 있다. 일부 경우에서, 환자는 종양 샘플을 기증할 수 있다. 종양 샘플은 고형 종양 샘플일 수 있다. 종양 샘플은 또한 액상 종양 샘플일 수 있다. 일부 경우에서, 샘플은 농축될 수 있다. 농축은 종양 세포에 고유한 단백질 농도의 증가를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 방법이 농축에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 레이저 현미해부법이 샘플 농축에 사용될 수 있다. 레이저 현미해부법은 질량 분광 분석법을 사용하는 화학요법 및 표적화되는 관련 단백질의 절대량을 측정할 수 있다.
표적화 농축 방법은 2개 범주로 광범위하게 분류될 수 있다: PCR-앰플리콘 및 하이브리드화 포획 접근법. PCR-기반 접근법은 진단 실험실에서 일상적으로 쉽게 사용할 수 있으므로 그들은 현행 진단 작업흐름과 잘 맞춰진다. PCR은 고도로 특이적일 수 있고 개별 PCR 생성물의 농도가 풀링 및 시퀀싱 이전에 적절하게 정규화된다면 비교 하이브리드화 접근법보다 더 균일한 포괄범위를 생성하는 장점을 갖는다.
상이한 전략이 PCR 증폭된 라이브러리를 생성시키는데 사용되어 왔다. 일부는 단편 라이브러리를 생성시키기 위해 PCR 생성물의 연쇄화를 사용하는데, PCR 연쇄부의 전단 및 샷건 라이브러리 조제물로의 공급을 사용하는 것이다. 긴-판독 시퀀싱 장비와 상용성인 보다 간결한 프로토콜은 앰플리콘을 풀링하고 시퀀싱을 지정할 수 있게 PCR 프라이머의 5' 말단 또는 3' 말단에 서열 어댑터를 도입하는 것이다. 당분야에서 이용할 수 있는 임의의 표적화 농축 방법을 본 명세서에서 사용할 수 있다.
일부 경우에서, 다중층 소프트 리쏘그라피 (MSL)을 사용하는 미세유체학-기반 방법인 Fluidigm이 본 명세서에서 사용될 수 있다. 미세유체 회로는 PCR을 위한 반응 챔버 및 회로에 작은 밸브를 생성하도록 압력을 사용하여 시약의 제어된 흐름을 가능하게 하는 연질 고무 복합체로 제작될 수 있다. Fluidigm은 본래 실시간 정량적 PCR 및 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 유전자형 분석 적용을 위해 개발되었지만 보다 최근에 표적화 재시퀀싱 적용을 위해 PCR 생성물의 회수를 가능하게 하는 Access Array가 발표되었다. 현행 Access Array 시스템은 48 단일-플렉스 어세이에 의해 48개 샘플에 대한 동시 PCR 반응을 할 수 있다. 이러한 플랫폼의 매력적인 측면은 비교적 소량의 주형이 요구될 수 있다는 것이다 (<50 ng/샘플). 어세이는 또한 처리량을 개선시키기 위해 다중화될 수 있다.
본 명세서는 또한 RainStorm (Raindance Technologies)의 사용을 개시할 수 있다. RainStorm은 오일 에멀션 중 미세액적의 생성을 포함하며, 이후에 이것은 PCR을 위한 초소형 반응 챔버로서 작용한다. 이 방법은 FFPE 조직으로부터 추출된 DNA에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로, 분자적 반전 프로브 (MIP)가 본 명세서에서 사용될 수 있다. MIP는 보편적인 링커 서열에 의해 속박된 서열 특이적 프라이머 말단으로 구성된 긴 올리고뉴클레오티드이다. 표적 특이적 프라이머 말단은 관심 영역에 측접하는 상보적 DNA와 하이브리드화된다. 폴리머라제 연장과 이후 결찰의 결과로 MIP의 고리화가 일어난다. 포획된 영역을 이후에 롤링 서클 증폭에 의하거나 또는 링커 영역 내 보편적인 PCR 프라이밍 부위로부터 PCR에 의해 증폭된다.
일부 경우에서, RNA 시퀀싱 (RNA-seq)이 이용될 수 있다. 일부 경우에서, RNA의 개체군 (전체 또는 분획화, 예컨대 폴리 (A)+)은 하나 또는 양쪽 말단에 어댑터가 부착된 cDNA 단편의 라이브러리로 전환될 수 있다. 증폭되거나 또는 되지 않은 각각의 분자는 이후에 한쪽 말단 (단일-말단 시퀀싱) 또는 양쪽 말단 (쌍-말단 시퀀싱)으로부터 짧은 서열을 획득하기 위해서 대량 처리 방식으로 서열분석될 수 있다. 판독은 사용되는 DNA-시퀀싱 기술에 따라서 전형적으로 30-400 bp일 수 있다.
예를 들어, Illumina IG, Applied Biosystems SOLiD 및 Roche 454 Life Science systems을 포함하여, 임의의 대량 시퀀싱 기술이 RNA-Seq에 사용될 수 있다. 다른 경우에서, Helicos Biosciences tSMS 시스템이 RNA-Seq 연구에 사용될 수 있다. 시퀀싱 이후에, 최종 판독치는 기준 게놈 또는 기준 전사물에 대해 정렬될 수 있거나, 또는 게놈 서열 없이 새롭게 조립되어 전사 구조 및/또는 각 유전자에 대한 발현 수준으로 이루어진 게놈-규모 전사 맵을 생성할 수 있다.
일부 경우에서, 종양-특이적 또는 "체세포" 돌연변이는 정상 공급원 대비 종양에서 단리된 DNA를 비교하기 위해 대량 병렬 시퀀싱 (MPS) (Simpson AJ, et al. Nat Rev Cancer. 2005;5(8):615-625.) 접근법을 사용해 동정될 수 있다. MPS를 사용하는 DNA-기반 어세이와 유사하게, 종양 유래 RNA는 cDNA로의 전환 및 시퀀싱에 적합한 라이브러리의 구축에 의해 분석될 수 있다. 프로브는 합성되고, 바이오틴화되어, 단편화된 게놈 라이브러리와 용액 중에서 하이브리드화될 수 있는 주석달린 유전자의 엑손 서열에 결합하도록 디자인될 수 있다. 프로브-결합된 라이브러리 단편을 이후에 스크렙타비딘-코팅된 자성 비드를 사용해 포획하고 단리할 수 있다. 변성에 의해 비드로부터 방출된 후, 라이브러리 단편을 증폭, 정량 및 서열분석한다.
엑솜-포획은 특정 양상에서 시퀀싱 방법에서 사용될 수 있다. 엑솜-포획 시퀀싱 데이타로부터 돌연변이 호출은 MPS 플랫폼에 의해 생성된 짧은 판독 길이 (∼100 bp)를 분석하기 위한 중추로서 제공되는, 기준 게놈에 대해 서열 판독치를 정렬시켜 획득될 수 있다. 판독치를 게놈에 대해 정렬시키면, 변이체는 점 돌연변이 (또는 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)) 및 집중 삽입 또는 결실 변이체 (indel)를 포함하는 상이한 유형의 돌연변이를 해석하기 위한 몇몇 알고리즘을 사용해 동정될 수 있다. 이후에 종양 변이체 호출은 종양-고유 ("체세포") 돌연변이를 동정하기 위해 유사한 포획 시약을 사용하여 수득된 일치되는 정상 조직 DNA 유래의 데이타와 비교될 수 있다. 후속 주석 단계는 핵산 서열의 변이를 아미노산 서열의 변화로 전환시켜서, 종양 네오-에피토프를 동정하고 순위매기는데 필요한 초기 데이타를 제공한다. 일부 경우에서, 네오-에피토프 변이체를 동정하고/하거나 확증하기 위해 cDNA 포획 시퀀싱 (cDNA Cap-Seq) 또는 RNA-Seq 유래 RNA 데이타의 사용이 수행될 수 있다.
단일-핵 전체-게놈 및 전체-엑솜 시퀀싱에 의한 체세포 변이체의 포괄적 특징규명은 90%가 넘는 평균 포괄범위를 획득하여 기술된 nuc-seq 프로토콜에 따라 이미 입증되었다. 관련 클론 구조는 또한 예측된 변이체에서 표적화된 보다 비용 효율적인 단일-세포 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 수득될 수 있다. 이들 생물정보학-집약적 접근법은 네오-에피토프의 동정에 대한 임의의 모든 접근법을 위한 필수 체계를 생성시키는데 중요하다.
III. 종양 네오-에피토프의 동정
일 구체예에서, 암 환자에서 돌연변이의 존재를 결정하여 유래된 시퀀싱 데이타를 분석하여 개체의 HLA 분자에 결합할 수 있는 개인 돌연변이된 펩티드를 예측한다. 일 구체예에서, 데이타는 컴퓨터를 사용하여 분석된다. 다른 구체예에서, 서열 데이타는 네오-항원의 존재에 대해 분석된다. 일 구체예에서, 네오-항원은 MHC 분자에 대한 그들 친화성에 의해 결정된다.
면역원으로 이용하기 위해 어떠한 특정한 돌연변이를 효율적으로 선택하는 것은 환자 HLA 유형의 동정 및 어떠한 돌연변이된 펩티드가 환자의 HLA 대립유전자에 효율적으로 결합하는가를 예측하는 능력을 포함한다. 검증된 결합 및 미결합 펩티드를 사용한 신경 네트워크 기반 학습 접근법은 주요 HLA-A 및 -B 대립유전자에 대한 예측 알고리즘의 정확도를 진보시켰다. 어떠한 미스센스 돌연변이가 환자의 동족 MHC 분자와의 강력한 결합 펩티드를 형성시키는가를 예측하기 위한 진보된 알고리즘의 이용으로, 각 환자에 대해 최적의 돌연변이된 에피토프 (네오ORF 및 미스센스)를 대표하는 펩티드 세트가 동정될 수 있고 우선순위가 결정될 수 있다.
특정 양상에서, 네오-에피토프 예측 알고리즘을 사용하여 후보 펩티드와 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자와의 결합을 예측한다. 인간에서, MHC 클래스 I 항원 제시 경로는 내생성 세포-고유 단백질로부터 유래된 펩티드를 CD8 CTL에 제시하는 것을 담당한다. 내생성 단백질은 프로테오솜에 의해 처리되고, 최종 8-11개 아미노산 펩티드는 항원 프로세싱과 연관된 수송체 (TAP)에 의해 ER로 수송되며, 여기서 그들은 새롭게 합성된 클래스 I 분자 상에 적재되고 안정화된 펩티드-MHCI (p-MHCI) 복합체가 세포 표면으로 수송된다. 일부 경우에서, 네오-에피토프는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있다. 예를 들어, 네오-에피토프는 6량체 내지 10량체의 펩티드일 수 있다.
본 명세서는 또한 MHC 클래스 I과 펩티드 결합을 예측하는 도구를 사용하여 종양-유래된 네오-에피토프를 동정하는 프로토콜을 개시할 수 있다. 본 명세서에서는 또한 MHC 클래스 II와 펩티드 결합을 예측하는 도구를 사용하여 종양-유래된 네오-에피토프를 동정하는 방법을 개시할 수 있다.
MHCI 또는 MHCII와 펩티드 결합을 예측하기 위한 다수의 도구가 존재한다. 예측 도구에 대한 종합 목록이 이용가능하다 (http://cancerimmunity.org/resources/webtools를 통해서 입수가능). 일부 경우에서, 펩티드 결합 도구는 PAProC, NetChop, MAPPP, TAPPred, RankPep, MHCBench, HLA 펩티드 결합 예측, PREDEP, nHLAPred-I, ProPred-1, SVMHC, EPIPREDICT, ProPred, NetMHC, NetMHCII, NetMHCpan, SMM, POPI, OptiTope, 모자이크 백신 도구 스위트, HLABinding, 항원성 결정부의 예측, ANTIGENIC, BepiPred, DiscoTope, ElliPro, 항체 에피토프 예측, CTLPred, NetCTL, MHC-I 프로세싱 예측, 에피토프 클러스터 분석, 에피토프 보존성 분석, VaxiJen, 또는 이의 조합을 포함하는 목록에서 선택될 수 있다. 다른 프로그램 예컨대 SYFPEITHI (Rammensee H, et al. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-219), Rankpep (Reche PA, et al. Hum Immunol. 2002; 63(9):701-709), 또는 BIMAS (Parker KC, et al. J Immunol. 1994;152(1):163-175.)가 또한 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 면역 에피토프 데이타베이스 및 분석 자원 (Immune Epitope Database and Analysis Resource) (IEDB) (Vita R, et al. Nucleic Acids Res. 2015; 43 (Database issue):D405-D412)을 이용하여 적합한 종양 네오-항원을 동정할 수 있다. 일부 경우에서, 이들 알고리즘은 출력물로서 예측된 IC50 을 제공하는, 인공 신경 네트워크 (ANN)를 기반으로 상이한 MHC 클래스 I 변이체와 결합하는 펩티드를 예측할 수 있다. 일부 경우에서, NetMHC (Lundegaard C, et al. Nucleic Acids Res. 2008;36 (Web Server issue):W509-W512.)가 사용될 수 있다. 신경 네트워크-기반 접근법은 훈련 세트의 품질 및 크기에 따라 좌우될 수 있으며 따라서 아마도 보다 일반적인 대립유전자에 대해서 더 정확할 수 있을 것이다. 일부 경우에서, 프로그램 예컨대 SMM (Peters B, et al. BMC Bioinformatics. 2005; 6:132) 및 SMMPMBEC (Kim Y, et al. BMC Bioinformatics. 2009; 10:394)이 사용될 수 있다. 이들 프로그램은 p-MHCI 결합 데이타로부터 통계적 선호도를 설명하기 위해 위치-가중 매트릭스를 사용한다. 이러한 접근법은 훈련 세트에 존재하는 제한된 수의 데이타 점 및 실험 오차 둘 모두에 의해 야기되는 노이즈를 억제할 수 있다.
특정 양상에서, SNP는 후보 네오-항원 또는 네오-에피토프로부터 제거된다. SNP에 관한 정보는 미국립 인간 게놈 연구 기관 (National Human Genome Research Institute (NHGRI))과 협력하여 미국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information (NCBI))에서 개발하고 주관하는 상이한 종내 및 종간 유전자 변이에 대한 무료 공공 기록 보관소인, 단일 뉴클레오티드 다형성 데이타베이스 (dbSNP)로부터 수득할 수 있다. 데이타베이스의 명칭이 오직 다형성의 한 부류의 수집물을 암시하지만 (즉, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)), 사실 다양한 분자 변이: (1) SNP, (2) 짧은 결실 및 삽입 다형성 (indel/DIP), (3) 미세위성 마커 또는 짧은 탠덤 반복부 (STR), (4) 다중뉴클레오티드 다형성 (MNP), (5) 이형접합 서열, 및 (6) 지명된 변이체를 함유한다. dbSNP는 명백하게 중성 다형성, 기지 표현형에 해당되는 다형성, 및 변이없는 영역을 수용한다. 이것은 공개적으로 이용가능한 핵산 및 단백질 서열의 NCBI 수집물, 유전자은행을 보충하기 위해 1998년 9월에 생성되었다.
특정 양상에서, 종양 특이적 네오-항원을 동정하기 위한 단백질체-기반 방법 예컨대 직접 단백질 시퀀싱을 제공한다. 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS))를 포함한 다차원 MS 기술을 사용하는 효소적 분해물의 단백질 시퀀싱이 또한 네오-항원을 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질체 접근법은 신속한, 고도로 자동화된 분석을 가능하게 한다. 미지 단백질의 신규 시퀀싱을 위한 고속-대량 방법을 사용하여 발현된 네오-항원을 동정하기 위해 환자 종양의 단백질체를 분석할 수 있다는 것을 더욱 고려한다. 예를 들어, 메타-샷건 단백질 시퀀싱을 사용하여 발현된 네오-항원을 동정할 수 있다.
종양 특이적 네오-항원은 또한 네오-항원-특이적 T-세포 반응을 동정하기 위해 MHC 다량체를 사용해 동정될 수도 있다. 예를 들어, 환자 샘플 중에서 네오-항원-특이적 T-세포 반응의 고속-대량 분석은 MHC 사량체-기반 스크리닝 기술을 사용해 수행될 수 있다. 이러한 사량체-기반 스크리닝 기술은 종양 특이적 네오-항원의 초기 동정을 위해서, 또는 대안적으로 환자가 이미 노출되었을 수 있는 네오-항원을 평가하여, 후보 네오-항원의 선택을 촉진하는 2차 스크리닝 프로토콜로서 사용될 수 있다.
추가적인 필터가 (1) 면역프로테아솜에 의해 불충분하게 프로세싱될 것으로 예측되는 에피토프 및 (2) 상응하는 야생형 서열보다 낮은 결합 친화성의 에피토프를 제거하는데 적용될 수 있다. 특정 양상에서, 후보 돌연변이된 펩티드가 합성되고 스크리닝되어 T 세포 네오-항원을 동정한다. 이러한 접근법은 네오-항원을 동정하는데 매우 효율적일 수 있다.
특정 양상에서, 종양 네오-에피토프를 동정하는 다른 접근법은 최소 T 세포 에피토프를 포괄하는 비교적 긴 합성 펩티드로 항원 제시 세포를 펄싱하여 제공된다. 최근의 보고에서, 비동의적 돌연변이된 에피토프는 개별 돌연변이를 포괄하는 31개 아미노산 길이 펩티드로 펄싱된 자기유래 B 세포에 대한 CD4+ 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 반응을 평가하여 3개 흑색종 병변에서 동정되었다. 이러한 접근법의 사용 결과로서 돌연변이된 CIRH1A, GART, ASAP1, RND3, TNIK, RPS12, ZC3H18 및 LEMD2 T 세포 에피토프가 동정되었다. 더 나아가서, 최근 보고에서, 펩티드 스크리닝은 2개 펩티드 라이브러리: (1) 15량체 중첩의 긴-펩티드 (2) MHC-결합 예측 기반 펩티드의 조합을 기반으로 수행되었다. 이러한 스크리닝에 의해서 난소 종양으로부터 단리된 돌연변이된 HSDL1-반응성 T 세포가 동정되었다.
특정 양상에서, 탠덤 미니유전자 스크리닝 접근법을 사용하여 종양 네오-에피토프를 동정할 수 있다. 탠덤 미니유전자 구성체는 12개 아미노산 만큼 그들 N-말단 및 C-말단 상에서 측접된 돌연변이된 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드를 코딩하는 6 내지 24개 미니유전자로 구성된다. 특정 양상에서, 탠덤 미니유전자 구성체를 합성하여 자기유래 HLA 분자를 공동발현하는 세포주 또는 자기유래 APC를 형질감염시키는데 사용한다. 이러한 접근법을 사용하여, 돌연변이된 KIF2 C 및 POLA2 에피토프가 2명의 흑색종 환자에서 동정되었다. 또한, 돌연변이된 ERBB2IP 에피토프가 담관암종 환자에서 동정되었다. 이러한 접근법을 사용한 최근 연구에 따르면 위장, 유방 및 난소 암에서 발현되는 돌연변이된 항원의 동정이 유도되었다. 주목할만하게, 네오-항원 반응성은 비교적 낮은 수의 돌연변이를 갖는, 담관암종 또는 위장암을 갖는 환자로부터 단리된 TIL에서 동정될 수 있었다.
특정 양상에서, 종양 네오-에피토프는 전체-엑솜/전사체 시퀀싱 분석, MHC 결합 예측을 비롯하여 HLA 분자로부터 용리된 펩티드를 검출하기 위한 질량 분광분석법과 조합된 접근법을 사용하여 동정된다. 흥미롭게도, 오직 적은 분획의 예측된 고결합 펩티드가 질량 분광분석법으로 확증되었다. 질량 분광분석법에 의해 동정된 비교적 적은 수의 돌연변이된 펩티드는 펩티드 정제 및 질량 분광법의 감도에 기인한 것일 수 있지만, 또한 세포에서 천연 항원 프로세스 및 제시가 매우 비효율적일 수 있다는 것을 시사할 수 있다. 이러한 접근법에 의해 동정된 7종의 네오-에피토프 중에서, 돌연변이된 Adpgk, Reps1 및 Dpagt1 에피토프가 면역원성인 것으로 확증되었다.
IV. 종양 네오-에피토프 우선순위화
특정 양상에서, 방법은 하나 이상의 기준 예컨대 MHC 결합 친화성, 에피토프 존재비, 항원 프로세싱 및/또는 제시를 기반으로 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원의 우선순위화를 위해 제공할 수 있다. 이러한 동정된 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원은 본 명세서에 개시된 아데노바이러스 벡터를 사용하는 표적화 백신 또는 면역 요법에서 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 종양-유래된 돌연변이체 에피토프를 동정하기 위해서 기준 예컨대 예측된 p-MHCI 결합 친화성을 사용하여 후보 네오-에피토프의 초기 우선순위화 목록을 생성시킬 수 있다. 일부 경우에서, 종양 네오-에피토프에 대한 천연 번역 반응은 최고로 강력한 MHCI 결합 친화성을 갖는 것으로 예측되는 그룹 내에서 에피토프에 대해 선택적으로 지정된다.
펩티드/MHCI 결합은 2가지 추가적인 매개변수 - 에피토프 존재비 및 항원 프로세싱 (즉, 단백질 분해 및 펩티드 수송)에 의해 영향받을 수 있다.
일부 양상에서, 질량 분광분석법은 잠재적으로 에피토프 존재비에 대한 정보를 제공할 수 있다. 추가 양상에서, 체세포 돌연변이는 RNA 시퀀싱에서 존재하거나 또는 풍부한 것으로 검출되면, 표적 네오-항원으로서 우선순위화될 수 있다. 추가적인 양상에서, 에피토프 존재비는 RNA 발현 수준을 정량하여 간접적으로 추산할 수 있다. 한 접근법에서, 종양-대-정상 DNA 비교에 의해 정의되는 돌연변이는 그들 면역원성을 예측하기 위해 생물정보학적 분석이 수행되고 후보 면역 자극성 펩티드의 수준은 RNA-Seq에 의해 추산된다. RNA 평가는 (a) 변이체가 RNA에서 발현되는지 여부 및 (b) 다른 유전자 대비 돌연변이체 대립유전자의 발현 수준에 관한 정보를 제공한다. 두번째 접근법에서, cDNA 포획은 종양 RNA로부터 수행될 수 있고 정상 DNA와 비교하여 돌연변이된 펩티드의 목록을 제공할 수 있다.
일부 경우에서, 역전사효소의 오차 비율 및 DNA 대비 RNA에서 호출된 변이체에서 거짓 양성도의 공급원에 기인하여, 예측된 돌연변이는 거짓-양성 변이체의 기지 공급원 (예를 들어, 종양 또는 정상에서의 낮은 포괄범위, 또는 변이체-함유 판독치의 낮은수)을 제거하고 비발현된 유전자 및/또는 대립유전자를 제거하기 위해서 일련의 필터를 더욱 적용하여 개량될 수 있다. 필터는 낮은 발현의 유전자를 제거할 수 있다. 면역원성 예측의 하류 단계들을 이후에 이러한 필터링된 세트의 돌연변이체 펩티드에 대해 수행할 수 있다.
추가적인 알고리즘이 정의된 프로테오솜 절단에 집중된 것들 (즉, NetChop) (Nielsen M, et al. Immunogenetics. 2005;57(1-2):33-41) 및/또는 TAP 수송 (즉, NetCTL 및 NetCTLpan) (Peters B, et al. J Immunol. 2003;171(4):1741-1749)을 포함하여 에피토프 예측을 개량하도록 존재한다.
본 명세서는 또한 MHC 클래스 II 네오-에피토프를 예측하기 위한 방법 또는 도구를 개시할 수 있다. MHC 클래스 I 결합 그루브가 양쪽 말단에서 폐쇄되는데 반해, MHC 클래스 II는 개방된 펩티드-결합 그루브를 가져서, 결합 코어의 위치 및 MHC 클래스 II에 결합할 수 있는 펩티드의 길이 둘 모두에 상당한 변이를 초래한다. 다수의 MHC 클래스 II 결합 예측 알고리즘은 예컨대 TEPITOPE (Hammer J, et al. J Exp Med. 1994;180(6):2353-2358); netMHCII (Nielsen M, et al. BMC Bioinformatics. 2009;10:296); 및 SMM-align (Nielsen M, et al. BMC Bioinformatics 2007;8:238) 등이 이용가능하고 본 명세서에서 사용될 수 있다.
소프트웨어를 사용하여 돌연변이체 네오-에피토프를 동정할 수 있다. 일부 경우에서, 잠재적인 네오-에피토프의 결합 친화성을 계산할 수 있다. 예를 들어, NetMHCpan 소프트웨어 프로그램은 돌연변이체 네오-에피토프를 잠재적으로 예측할 수 있다. 임의의 적합한 프로그램 또는 알고리즘을 사용하여 네오-에피토프를 동정할 수 있다.
네오-에피토프는 예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 400, 450, 500 nmol/L 미만 또는 임의의 중간 범위 또는 값으로, MHC 분자에 대한 임의 친화성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 강한 친화성은 절반의 최대 억제성 농도 (IC50) < 50 nmol/L일 수 있다. 일부 경우에서, 중간 친화성은 50 < IC50 < 150일 수 있다. 일부 경우에서, 약한 친화성은 HLA에 대해서 150 < IC50 < 500일 수 있다. 일부 경우에서, IC50 > 500은 낮은 친화성일 수 있거나 또는 전혀 없을 수 있다.
추가 양상에서, 본 명세서에서 방법은 예를 들어 환자-특이적 클래스 I HLA 분자의 틈에 결합하는 펩티드를 예측하는 알고리즘 (예를 들어, NetMHC, IEDB)에 의해서, 강건한 면역 반응을 아마도 최고로 생성시킬 수 있는 펩티드를 동정하기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 백혈병을 갖는 인간 환자에서 2가지 연구는 이러한 접근법을 사용하여 기지의 종양유전자의 돌연변이된 영역으로부터 유래된 CTL 표적화 HLA-결합 펩티드, 급성 골수성 백혈병의 뉴클레오포스민, 및 만성 골수성 백혈병의 BCR-ABL을 동정하였다.
또한, 네오-항원에 대한 비편중 검색을 수행하기 위해서, 전체-엑솜 시퀀싱은 예를 들어 최근 보고에서 만성 림프구성 백혈병을 갖는 환자에서 모든 백혈병-특이적 돌연변이를 동정하는데 사용될 수 있다. 동정된 HLA 대립유전자를 갖는 환자의 서브셋 내에서, 방법은 어떠한 돌연변이된 펩티드가 환자-특이적 HLA에 결합하는지 예측하고, 그들 결합을 생화학적으로 검증하고, 이들 네오-항원-유래된 펩티드의 서브셋을 표적화하는 CTL의 존재를 확증하기 위해서 NetMHC를 사용하기 위해 제공될 수 있다.
더 나아가서, 입증된 예측 규칙 (항원 프로세싱에서의 추가적인 단계를 기반으로 함)은 공산을 더 개선할 수 있다. 특정 양상에서, 네오-에피토프 중에서, 네오ORF는 그들이 완전하게 신규한 단백질 서열의 긴 스트렛치를 제공하기 때문에 우선순위화될 수 있다 (중추 내성을 우회하고 임의의 정상 세포에서 대응물을 갖지 않음).
또한, 오직 하위개체군 (즉, 서브클론) 대신에 모든 암세포 (즉, 클론)에 존재하는 것들을 비롯하여, 발현이 감소될 때 적응도를 감소시키거나 또는 종양 세포 생존에 요구되는 유전자에 돌연변이를 품고 있는 표적 (예를 들어, "종양유전자 드라이버")을 우선순위화하기 위한 방법이 제공될 수 있다.
특정 양상에서, 단백질체 방법 예컨대 MHC-용리된 펩티드의 질량 분광분석법을 사용하여 실제로 존재하는 네오-에피토프를 동정한다. MHC 분자에 의한 존재가능성의 예측은 또한 생물정보학 전략을 사용할 수 있다.
특정 양상에서, 알고리즘-기반 방법 또는 도구, 예컨대 DAI 알고리즘은 "자기" 항원과 네오-에피토프의 차이점을 정의하기 위해 사용될 수 있다.
특정 양상에서, T-세포 반응을 측정하기 위한 방법은 종양 네오-항원에 대한 추가적인 선택을 위해 제공될 수 있다. 종양 네오-항원이 생체내에서 확인되는 항종양 활성은 시험관내에서 측정되는 T-세포 활성을 측정하여 검사될 수 있다. 특별히, CD8-의존적 방식으로 종양 거부을 유발하는 네오-에피토프는 시험관내에서 측정할 수 있는 CD8 반응을 유발시킴으로써 대표될 수 있다. 고도의 민감성 및 다원적 방식으로 많은 수의 항원에 대한 T-세포 활성화를 측정하는 개선된 고속-대량 어세이는 네오-에피토프 발견을 도울 수 있다. T-세포 수용체의 시퀀싱을 기반으로 하는 어세이가 이러한 한 예일 수 있다.
V. 종양 네오-항원-기반 암 요법
본 명세서는 환자의 암에 고유할 수 있는 변화를 동정하기 위한 방법 및 조성물을 개시할 수 있다. 일부 경우에서, 방법은 환자의 암에 특이적인 치료적 중재술을 선택하는데 유용할 수 있다. 일부 경우에서, 백신으로 환자의 종양 네오-에피토프의 표적화가 적합한 방법일 수 있다. 예를 들어, 차세대 DNA-시퀀싱 또는 RNA-시퀀싱 기술은 요법을 위한 종양 네오-에피토프의 동정에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 백신접종 방법이 추가적인 요법을 비롯하여 사용될 수 있다. 추가적인 요법의 비제한적인 예는 추가적인 면역요법, 화학요법, 방사선, 유전자 요법, 표적화 요법, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 백신 방법은 또한 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 복제-결함 벡터는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열; 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 경우에서, 환자는 환자 샘플에 대해 수행된 시퀀싱이 후속되는 요법을 받을 수 있다. 환자 샘플은 시퀀싱이 수행될 수 있다 (도 1). 시퀀싱은 암-특이적 SNV를 동정할 수 있다. SNV는 SNV가 발현되는 단백질에 있는지 여부를 결정하기 위해서 추가 조사를 겪을 수 있다. 단백질은 MHC 면역성을 구동할 수 있다. MHC는 클래스 I일 수 있거나 또는 클래스 II일 수 있다. 임의의 MHC 유형 또는 HLA 유형을 갖는 환자는 시퀀싱 분석을 겪을 수 있다.
본 명세서에서 만성 질환으로서 암을 표적화하기 위한 전략이 개시된다. 일부 경우에서, 환자는 서열분석되는 암 샘플을 가질 수 있다. 시퀀싱은 종양 네오-에피토프를 동정할 수 있다. 표적 네오-에피토프는 아데노바이러스 벡터에 클로닝될 수 있고 백신접종으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 환자의 암은 돌연변이될 수 있고 신규한 네오-에피토프는 제2 백신접종 용법에 사용될 수 있다. 본 명세서는 진화됨에 따라서 환자 암을 치료하도록 종양 네오-에피토프를 동정하고 이용하는 방법을 개시한다. 일부 경우에서, 암은 치료를 극복하기 위해 돌연변이될 수 있다. 돌연변이는 본 명세서에 개시된 아데노바이러스 벡터로 표적화할 수 있는 신규한 종양 네오-에피토프를 생성시킬 수 있다.
종양이 발생됨에 따라서, 그들은 수많은 서브클론을 진화시킬 수 있고, 이들 서브클론 간 유전자 발현은 다양할 수 있다. 또한, 대부분의 서브클론이 종양 성장 및 생존의 지원을 담당하는 드라이버 돌연변이를 공유하지만, 그들은 보다 가변적일 수 있는 더 많은 패신저 돌연변이 (종양 생존에 필수적이지 않은 유전자 내 돌연변이)를 가질 수 있다. 드라이버 대 패신저 돌연변이의 불균일한 비율은 이것이 아마도 서브클론에 걸쳐 균일하게 발현되지 않을 수 있고 생존에 필수적이지 않을 수 있는 네오-에피토프를 표적화하도록 백신을 강제할 수 있기 때문에 문제에 놓일 수 있다. 종양 변이는 원발성 종양 유래의 서브클론 서브셋에서만 유래된 전이부 사이의 변이를 고려할 때 보다 복잡해 진다.
본 명세서는 그것이 진화함에 따라서 암을 치료하기 위한 방법을 개시한다. 일부 경우에서, 네오-에피토프를 표적화하는 백신이 투여된다. 네오-에피토프 표적화 백신으로 처리된 환자는 종양 진화로부터 야기될 수 있는 신규한 네오-에피토프를 동정하기 위해 샘플의 2차 시퀀싱을 겪을 수 있다. 종양은 치료를 우회하여 계속 지속되도록 진화될 수 있다.
특정 양상은 진화되는 암에 대항하여 백신접종하고 만성 질환으로서 암을 치료하기 위한 치료 방법을 포함한다. 환자는 샘플의 시퀀싱을 겪을 수 있고 상이한 시점에 샘플의 추가적인 시퀀싱을 겪을 수 있다. 샘플의 시퀀싱은 임의 시점에 일어날 수 있다. 시퀀싱은 사전 정해진 시점에 일어날 수 있다. 일부 경우에서, 시점은 치료에 대한 반응에 따라 결정된다. 다른 경우에서, 시점은 사전결정된다. 시점은 임의 시점에 일어날 수 있다. 시점은 1주 단위일 수 있다. 시점은 1개월 단위일 수 있다. 시점은 1년 단위일 수 있다. 일부 경우에서, 시점은 또한 1시간 단위일 수 있다. 샘플의 시퀀싱은 암이 진화함에 따라 돌연변이 또는 네오-에피토프를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 신규한 네오-에피토프는 백신접종 또는 적합한 표적화 요법에 사용될 수 있다.
특정 양상은 다수의 백신접종이 종양 네오-에피토프에 대항하여 광범위하게 반응성 면역 반응을 생성시킬 수 있는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 다양한 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키는 백신을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
일 양상은 대상체에서 몇몇 종양 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공하고, 이것은 대상체에게 a) 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터, 및 b) 하나 또는 다수의 종양 네오-에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 대상체에게 적어도 1회 아데노바이러스 벡터를 재투여하는 단계로서, 그리하여 종양 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 대상체에서 몇몇 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 대상체는 아데노바이러스에 대해 기존 면역성을 가지며, 이 방법은 대상체에게 a) 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터, 및 b) 다수의 종양 네오-에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 대상체에게 적어도 1회 아데노바이러스 벡터를 재투여하는 단계로서, 그리하여 종양 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
면역계는 면역편집이라고 하는 과정을 통해서 종양의 클론 조성물을 형성시킬 수 있다. 면역편집은 항종양 반응을 시작하는 면역계의 잠재성을 입증하지만, 이것은 면역편집이 최고 면역원성 네오-에피토프를 발현하는 종양 세포를 삭제할 수 있고 그러므로 최선의 백신 표적이 남겨진채 단지 덜 면역원성이고 덜 최적인 표적이 시퀀싱에 의해 선택될 수 있기 때문에 종양 뮤톰 (mutome)-표적화 백신의 문제를 가질 수 있다. 더 나아가서, 면역편집된 종양의 과성장은 반드시 단지 우세한 네오-에피토프일 필요는 없지만, 종양 서브클론의 전체 레파토리를 포괄하는 에피토프의 표적화의 중요성을 입증한다. 본 명세서는 진화된 종양을 표적화하기 위한 방법을 개시한다.
본 명세서는 암을 치료하기 위한 방법을 개시할 수 있다. 예를 들어, 환자는 암 백신으로 치료될 수 있다. 일부 양상에서, 암 백신은 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 암 백신은 임의의 적합한 제2 요법과 조합될 수 있다. 제2 요법은 면역요법, 방사선, 화학요법, 방사능 요법, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다.
인 실리코에서 예측된 바람직한 MHC 클래스 II 결합 및 풍부한 발현에 대해 선택된 돌연변이를 갖는 백신은 강한 항종양 제어성을 부여한다. 일부 경우에서, 면역원성 및 비면역원성 돌연변이된 네오-에피토프 표적의 MHC II 결합 점수의 비교는 적합한 표적을 동정할 수 있다. 일부 경우에서, 돌연변이의 CD4 T-세포 인식은 MHC 클래스 I 에피토프와 비교하여 MHC 클래스 II 분자와의 펩티드 결합에 대해 덜 엄격한 길이 및 서열 요건을 가질 수 있어서 제시된 펩티드 내에서 소정 돌연변이가 발견될 가능성이 증가될 수 있다. 일부 경우에서, MHC 클래스 II 네오-에피토프가 사용될 수 있다. 다른 경우에서, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 둘 모두의 네오-에피토프를 표적화하는 벡터로 구성된 라이브러리가 투여된다.
본 명세서의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 발현 구성체, 특히 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 관심 표적 항원을 예컨대 면역 반응을 생성시키는 임의의 하나 이상의 종양 네오-항원 또는 종양 네오-에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 제한없이, 고형 또는 액상 종양에서 동정된 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 발현 구성체는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
발현 구성체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 하나 이상의 표적 항원에 대해 면역 반응을 생성시키기 위해 많은 백신 상황에서 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 그들이 Ad에 대해 기존 면역성을 갖는 대상체에서 면역 반응을 생성시키는데 사용될 수 있고, 이전 세대의 아데노바이러스 벡터를 사용해서는 가능하지 않은 용법인, 아데노바이러스 벡터를 사용해 다수 회차의 면역화를 포함하는 백신접종 용법에서 사용할 수 있기 때문에 특히 중요하다.
일반적으로, 면역 반응의 생성은 체액성 반응 및/또는 세포-매개 반응의 유도를 포함한다. 특정 구체예에서, 관심 표적 항원에 대해 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 "면역 반응을 생성시키는" 또는 "면역 반응을 유도시키는"은 임의의 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어 하나 이상의 면역 세포 (T 세포, B 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 호중구 등)의 수 또는 하나 이상의 이들 면역 세포의 활성 (CTL 활성, HTL 활성, 사이토카인 분비, 사이토카인 분비 프로파일의 변화 등)의 증가를 포함한다.
당업자는 면역 반응에 변경이 발생되었는지 여부를 확립하기 위한 다수 방법을 이용할 수 있다는 것을 쉽게 이해하게 될 것이다. 면역 반응에서 변경 (예를 들어, 세포수, 사이토카인 발현, 세포 활성)을 검출하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고 특정 양상에서 유용하다. 예시적인 방법은 문헌 [Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY) Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)]; [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)]; [Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)] 및 그외에 기술되어 있다. 본 문맥에서 유용한 예시적인 방법은 세포내 사이토카인 염색법 (ICS), ELISpot, 증식 어세이, 크롬 방출 또는 균등한 어세이를 포함한 세포독성 T 세포 어세이, 및 임의 수의 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 RT-PCR 기반 어세이를 사용한 유전자 발현 분석을 포함한다.
특정 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여되는 대상체에서 표적 항원-특이적 CTL 활성의 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터루킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 다른 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이로 측정시, 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적 항원-특이적 세포-매개 면역 활성의 증가를 포함한다.
추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 적절한 대조군과 비교하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 아데노바이러스가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 표적-특이적 항체 생성의 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배 또는 그 이상의 표적-특이적 항체 생성의 증가를 포함한다.
따라서, 종양 항원에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 a) 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터, 및 b) 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 대상체에게 적어도 1회 아데노바이러스 벡터를 재투여하는 단계로서, 그리하여 종양 항원에 대한 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 투여되는 아데노바이러스 벡터가 완전 결실형 벡터가 아닌 방법이 제공될 수 있다.
추가 구체예에서, 대상체에서 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원에 대한 면역 반응을 생성시키기 위한 방법을 제공할 수 있고, 여기서 대상체는 Ad에 대한 기존 면역성을 가지며, 이 방법은 대상체에게 a) 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터, 및 b) 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 및 대상체에게 적어도 1회 아데노바이러스 벡터를 재투여하는 단계로서, 그리하여 종양 항원에 대한 면역 반응이 생성되는 것인 단계에 의한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
Ad에 대한 기존 면역성과 관련하여, 이것은 당분야에 공지된 방법, 예컨대 Ad 항체의 존재에 대해 검사하는 항체-기반 어세이를 사용해 결정될 수 있다. 추가적으로, 특정 구체예에서, 방법은 대상체가 Ad에 대한 기존 면역성을 갖는지 먼저 결정하고 난 후에 본 명세서에 기술된 바와 같은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일 구체예는 개체에서 하나 이상의 표적 항원에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 개체에게 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터 및 적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계; 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역에 결실을 갖는 것인 벡터 및 적어도 하나의 표적 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 아데노바이러스 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원은 제1 아데노바이러스 벡터의 적어도 하나의 표적 항원과 동일하거나 또는 상이하다. 특정한 구체예에서, 표적 항원은 야생형 단백질, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 변이체 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 종양 항원, 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-연관 항원, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제2 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
따라서, 특정 구체예는 동일한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의한 다수 면역화 또는 상이한 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의한 다수 면역화를 고려한다. 각 경우에서, 아데노바이러스 벡터는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 각각의 경우에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 하나의 표적 항원을 코딩하는 E2b 결실된 아데노바이러스에 의한 다수의 면역화, 및 동일한 아데노바이러스 벡터의 다수회 재투여에 의해서, 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 종양 항원, 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-연관 항원, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 포함한다.
추가 구체예에서, 방법은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제1 아데노바이러스 벡터에 의한 면역화, 및 이후에 제1 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되는 항원과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 제2 아데노바이러스 벡터의 투여를 포함한다. 이와 관련하여, 코딩되는 표적 항원 중 하나가 상이할 수 있거나 또는 코딩되는 항원의 전부가 상이할 수 있거나, 또는 일부는 동일할 수 있고 일부는 상이할 수 있다. 추가로, 특정 구체예에서, 방법은 제1 아데노바이러스를 다수회 투여하는 단계 및 제2 아데노바이러스를 다수회 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 방법은 제1 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회, 또는 그 이상의 회차로 투여하는 단계 및 제2 아데노바이러스 벡터를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회, 또는 그 이상의 회차로 투여하는 단계를 포함한다. 투여 순서는 제1 아데노바이러스를 1회 또는 다수회 연이어 투여한 후에 제2 아데노바이러스 벡터를 1회 또는 다수회 연이어 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터를 각각 1회 투여로서, 각각 2회 투여로서, 각각 3회 투여 등으로 교차로 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터는 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 제1 및 제2 아데노바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 종양 항원, 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-연관 항원, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변이체 단편를 포함한다. 일부 양상에서, 제1 및/또는 제2 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
당업자에 쉽게 이해하게 되는 바와 같이, 2개 초과의 아데노바이러스 벡터가 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있다. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 상이한 아데노바이러스 벡터가 본 명세서에서 사용되는 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 한번에 1개 초과의 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 관심 다수 표적 항원에 대한 면역 반응은 다수의 상이한 아데노바이러스 벡터를 동시에 투여하여 생성될 수 있고, 벡터 각각은 하나 이상의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 암, 예컨대 암종 또는 육종 (예를 들어, 고형 종양, 림프종 및 백혈병)에 대한 면역 반응을 생성시키는데 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 암, 예컨대 신경학적 암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 직결장암, 신장암, 신장 세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 고환암, 위암, 다발성 골수종, 간세포암, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 또는 다른 암에 대한 면역 반응을 생성시키는데 사용될 수 있다.
방법은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 감염성 질환 또는 암의 증상을 치료하거나 또는 완화시키기 위해 제공된다. 치료 방법은 본 명세서에 기술된 감염성 질환 또는 암을 앓거나 또는 앓게 될 위험성이 있는 개체에게 1회 이상으로 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 이와 같이, 특정 구체예는 이러한 질환이 발생될 위험성이 있는 개체에서 감염성 질환 또는 암에 대해 백신접종하기 위한 방법을 제공한다. 위험성이 있는 개체는 언젠가 감염성 작용제에 노출될 수 있거나 또는 이전에 노출되었지만 아직 감염 증상을 갖지 않는 개체일 수 있거나 또는 암이 발생될 유전적 경향을 갖거나 또는 감염성 작용제에 특히 감수성인 개체일 수 있다. 명세서에 기술된 감염성 질환 또는 암을 앓는 개체는 본 명세서의 요법을 가이드하는데 사용될 수 있는 표적 항원을 발현하고/하거나 제시하는지 결정될 수 있다. 예를 들어, 개체는 표적 항원을 발현하고/하거나 제시하는 것으로 확인될 수 있고, 표적 항원, 이의 변이체, 단편 또는 변이체 단편을 코딩하는 아데노바이러스 벡터는 이후에 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정 구체예는 표적 항원, 또는 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변이체 단편을 코딩하는 핵산의 생체내 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 용도를 고려한다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 대상체에게 주사되면, 핵산 서열은 발현되어 그 서열에 의해 코딩되는 항원에 대한 면역 반응을 일으킨다. 아데노바이러스 벡터 백신는 "유효량", 즉 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 면역 반응을 유발하도록 선택된 투여 경로 또는 경로들에서 유효한 아데노바이러스 벡터의 양으로 투여될 수 있다. 유효량은 표적 감염성 작용제 또는 암에 대해 숙주의 보호 또는 치료를 촉진하는데 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 각 백신 용량 중 벡터의 양은 일반적으로 전형적인 백터와 연관된 상당한 부작용없이 면역, 면역보호성 또는 다른 면역치료적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 백신접종되면, 대상체는 백신 치료의 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 백신접종의 효능의 모니터링은 당업자에게 공지된 임의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액 또는 유체 샘플은 항체의 수준을 검출하기 위해 어세이될 수 있다. 다른 구체예에서, ELISpot 어세이는 순환 혈액 세포 또는 림프계 조직 세포로부터 세포-매개 면역 반응을 검출하기 위해 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 1 내지 10 용량이 52주 기간 동안 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 6 용량이 1, 2, 3주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12개월 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위 또는 값의 간격으로 투여되고, 추가의 부스터 백신접종은 주기적으로 이후에, 1, 2, 3주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12개월 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위 또는 값의 간격으로 제공될 수 있다. 대안적인 프로토콜이 개별 환자에게 적절할 수 있다. 이와 같이, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 용량이 1년 기간 또는 보다 짧거나 또는 더 긴 기간 동안, 예컨대 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100주 기간 동안 투여될 수 있다. 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주 간격 또는 그 이상의 간격으로 투여될 수 있다.
백신은 약 4시간 미만의 기간 동안, 보다 바람직하게, 약 3시간 미만의 기간 동안 주입될 수 있다. 예를 들어, 처음 25-50 mg이 30분 이내, 바람직하게 심지어 15분 이내에 주입될 수 있고, 나머지는 다음 2 내지 3시간 동안 주입될 수 있다. 보다 일반적으로, 투여되는 백신 구성체의 용량은 2주 또는 3주 마다 한 용량으로서 투여될 수 있고, 총 적어도 3 용량에 대해 반복될 수 있다. 또는, 구성체는 4 내지 6주 동안 주 당 2회 투여될 수 있다. 용량 스케줄은 임의로 다른 간격으로 반복될 수 있고 용량은 다양한 비경구 경로를 통해서, 적절하게 조정된 용량 및 스케줄로 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물은 임의 수의 관련 치료 방식과 함께 (예를 들어, 이전에, 동시에, 또는 이후에) 환자에게 투여될 수 있다.
적합한 용량은 상기 기술된 바와 같이 투여시, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양이다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 기준 (즉, 미처리) 수준보다 적어도 10-50%이다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 기준 수준 보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 그 이상이다. 이러한 반응은 표적 항원(들) 항체를 환자에서 측정하거나 또는 시험관내에서 환자 종양 또는 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존적 생성에 의해서, 또는 면역반응의 모니터링을 위한 당분야에 공지된 다른 방법에 의해서 모니터링될 수 있다. 이러한 백신은 또한 비백신접종된 환자와 비교하여 백신접종된 환자에서 대상 질환의 개선된 임상적 결과를 초래하는 면역 반응을 야기할 수 있어야 한다. 일부 구체예에서, 개선된 임상 결과는 질환의 치료, 질환 증상의 감소, 질환 진행의 변화, 또는 수명의 연장을 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 조성물은 개체에게 투여될 수 있다. "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 개체는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 동물 예컨대 인간 이외의 영장류, 설치류, 토끼, 래트, 마우스, 말, 당나귀, 염소, 고양이, 개, 소, 돼지 또는 양일 수 있다. 구체예에서, 개체는 인간이다. 구체예에서, 개체는 태아, 배아 또는 유아이다. 일부 경우에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 생체외에서 세포에 투여된다. 일부 경우에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 개체는 유전자 질환을 갖는다. 일부 경우에서, 개체는 질환, 예컨대 본 명세서에 기술된 임의의 질환을 가질 위험성이 있다. 일부 구체예에서, 개체는 불충분한 양의 단백질 또는 불충분한 활성의 단백질에 의해 야기되는 질환 또는 장애를 가질 높은 위험성이 있다. 개체가 질환 또는 장애를 가질 "높은 위험성"이 있다면, 방법은 보호적 또는 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 개체는 질환의 가족력때문에 이러한 질환 또는 장애를 가질 높은 위험성이 있을 수 있다. 전형적으로, 이러한 질환 또는 장애를 가질 높은 위험성에 있는 개체는 예방적 치료에 의해 혜택을 받는다 (예를 들어, 질환 또는 장애의 개시 또는 진행의 예방 또는 지연에 의함).
일부 경우에서, 대상체는 질환을 갖지 않는다. 일부 경우에서, 본 명세서에 기술된 치료는 질환의 개시 이전에 투여된다. 대상체는 미검출 질환을 가질 수 있다. 대상체는 낮은 질환 부담을 가질 수 있다. 대상체는 또한 높은 질환 부담을 가질 수 있다. 특정 경우에서, 대상체는 등급 척도에 따라서 본 명세서에 기술된 치료가 투여될 수 있다. 등급 척도는 글리슨 (Gleason) 분류법일 수 있다. 글리슨 분류는 얼마나 상이한 종양 조직이 정상 전립선 조직에서 유래되는가를 반영한다. 이것은 1 내지 5의 척도를 사용한다. 의사는 암 세포의 성장 및 패턴을 기반으로 하는 수치를 암에 부여한다. 수치가 낮을수록, 더 많은 정상 조직에서 암 세포가 보이고 등급은 더 낮아진다. 수치가 높을수록, 더 적은 정상 조직에서 암 세포가 보이고 등급은 더 높아진다. 특정 경우에서, 치료는 낮은 글리슨 점수의 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게, 3 또는 그 이하의 글리슨 점수를 갖는 환자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료가 투여될 수 있다.
다양한 구체예는 선택된 환자 개체군에서 하나 이상의 특정한 표적 항원에 대해 면역 반응을 상승시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물은 제한없이 암종 또는 육종 예컨대 신경학적 암, 흑색종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 백혈병, 형질세포종, 선종, 신경교종, 흉선종, 유방암, 전립선암, 직결장암, 신장암, 신장 세포 암종, 자궁암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 고환암, 위암, 다발성 골수종, 간세포암, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하는 암을 갖는 환자를 표적으로 할 수 있거나, 또는 다른 암이 요법에 대해 표적화될 수 있다. 일부 경우에서, 표적화된 환자 개체군은 직결장 선암종, 전이성 직결장암, 후기 MUC1, MUC1c, MUC1n, T, 또는 CEA 발현 직결장암, 두경부암, 간암, 유방암, 폐암, 방광암, 또는 췌장암을 갖는 개체에게 제한될 수 있다. 선택된 암, 예를 들어 직결장 선암종의 조직학적으로 확진된 진단이 사용될 수 있다. 특정한 질환 병기 또는 진행이 선택될 수 있는데, 예를 들어, 전이성, 재발성, III기, 또는 IV기 암 중 하나 이상을 갖는 환자가 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 의한 요법에 대해 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 환자는 제한없이 플루오로피리미딘, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 베바시주맙, 세툭시맙, 또는 파니투무맙 함유 요법을 포함하는 다른 요법을 통해서 받고, 임의로 그를 통해서 진행되는 것이 요구될 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 요법의 수용에 대한 개체의 거부는 환자를 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 의한 요법 적격한 풀에 포함시킬 수 있게 한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 받는 개체는 적어도, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 21, 또는 24개월의 추정 수명 기대치를 갖는 것이 요구될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 수용하는 환자 풀은 연령에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 50, 60세, 또는 그 이상의 연령 이상의 개체는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 의한 요법에 적격할 수 있다. 다른 예에서, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 40, 35, 30, 25, 20세, 또는 그 이하 연령보다 어린 개체는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 의한 요법에 적격할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 수용하는 환자는 적절한 혈액학적 함수, 예를 들어 마이크로리터 당 적어도 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 또는 그 이상의 WBC 계측치, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 이상의 g/dL의 혈액학적 수준, 마이크로리터 당 적어도 50,000; 60,000; 70,000; 75,000; 90,000; 100,000; 110,000; 120,000; 130,000; 140,000; 150,000 또는 그 이상의 혈소판 계측치; 0.8, 1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 또는 그 이상과 동일하거나 또는 그 미만의 PT-INR 값, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 X ULN 또는 그 이상과 동일하거나 또는 그 미만의 TPP 값 중 하나 이상을 갖는 개체에 제한된다. 다양한 구체예에서, 혈액학적 함수 지표 한계는 상이한 성별 및 연령 그룹, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80 또는 80세 초과의 개체에 대해 상이하게 선택된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 요법을 수용한 환자는 적절한 신장 및/또는 간 기능, 예를 들어 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 또는 그 이상과 같거나 또는 그 미만인 혈청 크레아티닌 수준, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 mg/dL 또는 그 이상의 빌리루빈 수준을 갖고, 반면 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 또는 2.4 mg/dL 이하의 길버트 증후군에 대해 더 높은 한계를 허용하면서, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 x 상한치 (ULN) 또는 그 이상과 같거나 또는 그 이하와 같거나 또는 그 이하인 ALT 및 AST 값 중 하나 이상을 갖는 개체에 제한된다. 다양한 구체예에서, 신장 또는 간 기능 지표 한계는 상이한 성별 및 연령 그룹이 상이한 개체, 예를 들어 0-5, 5-10, 10-15, 15-18, 18-21, 21-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80세 또는 80세 초과인 개체에 대해 상이하게 선택된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법을 사용하는 요법에 대한 후보인 개체의 K-ras 돌연변이 상태가 결정될 수 있다. 사전선택된 K-ras 돌연변이 상태를 갖는 개체는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대해 적격한 환자 풀에 포함될 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법을 수용하는 환자는 동시발생적 세포독성 화학요법 또는 방사선 요법, 이력 또는 현행, 뇌 전이, 자가면역 질환 이력, 예컨대 제한없이, 염증성 장질환, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 경피증, 다발성 경화증, 갑상선 질환 및 백반증, 중증 병발성 만성 또는 급성 질병, 예컨대 심장 질환 (NYHA 클래스 III 또는 IV), 또는 간 질환, 프로토콜에 대한 가능한 준수에 대한 의학적 또는 정신적 방해, 비흑색종 피부 암이외의 동시발생적 (또는 지난 5년 이내) 속발성 악성 종양, 제자리 자궁경부 암종, 제어성 표재성 방광암, 또는 치료된 다른 제자리 암종, 비뇨기 감염, HIV (예를 들어, ELISA에 의해 결정되고 웨스턴 블롯에 의해 확증됨), 및 만성 간염을 포함하는 활성형 급성 또는 만성 감염, 또는 공존 스테로이드 요법 (또는 다른 면역-억제성 약물, 예컨대 아자티오프린 또는 사이클로스포린 A)이 없는 개체에 제한된다. 일부 경우에서, 임의의 스테로이드 요법 (화학요법 또는 조영 증강 실험에 대한 예비약물로서 사용되는 것 제외)의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 휴약기 환자가 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용한 요법에 적격한 개체 풀에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 요법을 수용하는 환자는 갑상선 질환 및 백반증을 갖는 개체를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 용법에 대한 개체 또는 후보 개체 유래의 샘플, 예를 들어 혈청 또는 소변 샘플이 수집될 수 있다. 샘플은 요법 이전, 그 동안, 및/또는 그 이후에, 예를 들어, 요법 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내, 요법 시작부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 또는 12주 이내, 요법 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내, 요법 시작부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 이내, 요법 동안 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 간격으로, 요법 이후에 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 간격으로, 요법 이후에 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 또는 그 이상 이내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상 동안 수집될 수 있다. 샘플은 본 명세서에 기술된 임의의 혈액학적, 신장 또는 간 기능 지표를 비롯하여 당분야에 공지된 적합한 다른 것들, 예를 들어 가임기 여성에 대한 β-HCG에 대해 검사될 수 있다. 그와 관련하여, 차등적인, PT, INR 및 PTT에 의한 세포 혈액 계측을 포함한, 혈액학적 및 생화학적 검사, Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아틴, Ca, 전체 단백질, 알부민, 전체 빌리루빈, 알칼리 포스파타제, AST, ALT, 및 포도당 측정 검사가 특정 양상에서 고려된다. 일부 구체예에서, HIV 항체, 간염 BsAg, 또는 간염 C 항체의 존재 또는 양이 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 개체 또는 후보 개체 유래 샘플에서 결정된다.
생물학적 마커, 예컨대 표적 항원에 대한 항체 또는 Ad5 벡터에 대한 중화 항체가 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 개체 또는 후보 개체 유래의 샘플, 예컨대 혈청에서 검사될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 샘플, 예컨대 혈액 샘플은 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 개체 또는 후보 개체로부터 수집될 수 있고 보관될 수 있다. 수집된 샘플은 면역학적 평가를 위해 어세이될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법에 대한 개체 또는 후보 개체는 예를 들어 흉부, 복부 또는 골반의 CT 스캔 또는 MRI를 사용하는 영상화 실험으로 평가될 수 있다. 영상화 실험은 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법 이전, 그 동안, 또는 그 이후에, 요법 동안 및/또는 그 이후에, 예를 들어, 요법 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내, 요법 시작부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 또는 12주 이내, 요법의 시작 이전 2, 4, 6, 8, 10주 이내, 요법의 시작부터 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 이내, 요법 동안 1주, 10일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 9주, 또는 12주 간격으로, 요법 이후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년 간격으로, 요법 이후 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 또는 그 이상 이내에, 6개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 요법 동안 다양한 용량 및 투여 용법을 고려한다. 환자는 하나 이상의 복제-결함 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 본 명세서에 기술된 표적 항원에 대해 개체에서 면역 반응을 상승시킬 수 있는 표적 항원을 포함하는 Ad5 [E1-, E2B-]-벡터를 수용할 수 있다. 일부 양상에서, Ad5 [E1-, E2B-]-벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 복제-결함 아데노바이러스는 이러한 면역 반응을 실행하거나 또는 증강시키는데 적합한 용량으로 투여된다. 일부 경우에서, 복제-결함 아데노바이러스는 면역화 당 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자 (VP)와 동일하거나 또는 그를 초과하는 용량으로 투여된다. 일부 경우에서, 복제-결함 아데노바이러스는 면역화 당 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 2 x 1011, 3 x 1011, 4 x 1011, 5x 1011, 6 x 1011, 7 x 1011, 8 x 1011, 9 x 1011, 1 x 1012, 1.5 x 1012, 2 x 1012, 3 x 1012, 또는 그 이상의 바이러스 입자와 동일하거나 또는 그 미만의 용량으로 투여된다. 다양한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바람직한 용량은 제제 완충제의 적합한 부피, 예를 들어 약 0.1-10 mL, 0.2-8 mL, 0.3-7 mL, 0.4-6 mL, 0.5-5 mL, 0.6-4 mL, 0.7-3 mL, 0.8-2 mL, 0.9-1.5 mL, 0.95-1.2 mL, 또는 1.0-1.1 mL 부피로 투여된다. 당업자는 부피가 임의의 이들 값에 의해 정해지는 임의 범위 (예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 1.1 mL)에 속할 수 있다는 것을 이해한다. 바이러스 입자의 투여는 다양한 적합한 전달 경로를 통할 수 있고, 예를 들어 주사 (예를 들어, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내 (예를 들어, 흡입에 의함), 알약 형태 (예를 들어, 삼킴, 질 또는 직장 전달용 좌제)에 의할 수 있다. 일부 구체예에서, 피하 전달이 바람직할 수 있고 수지상 세포에 대한 보다 큰 접근성을 제공할 수 있다.
개체에 바이러스 입자의 투여는 반복할 수 있다. 바이러스 입자의 반복된 전달은 스케줄에 따를 수 있거나 또는 대안적으로, 필요한 기준에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원, 예를 들어 종양 항원, 종양 네오-항원, 종양 네오-에피토프, 종양-연관 항원, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 변이체 단편에 대한 개체의 면역성은 추가적인 전달이 필요하면 검사되어 보충될 수 있다. 일부 구체예에서, 전달 스케줄은 정기적 간격으로 바이러스 입자의 투여를 포함한다. 관절 전달 용법은 스케줄의 하나 이상의 기간 및/또는 투여 이전에 평가되는 필요 기반 투여 기간을 포함하는 것이 디자인될 수 있다. 예를 들어, 요법 용법은 죽음을 포함한 임의 이유로 요법이 제거될 때까지 3개월 마다 피하 투여와 같은 투여를 포함할 수 있다. 다른 예시적 용법은 3주마다 3회 투여 이후 3개월 마다 다른 세트의 3회 면역요법 치료를 포함한다.
다른 예시적 용법은 제1 빈도로 1회차 투여의 제1 기간, 제2 빈도로 2회차 투여의 제2 기간, 제3 빈도로 3회차 투여의 제3 기간 등, 및 임의로 필요 기준에 따라 미결정된 회차의 투여가 있는 하나 이상이 기간을 포함한다. 각 기간에 투여 횟수는 독립적으로 선택될 수 있고 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회, 또는 그 이상일 수 있다. 각 기간에 투여 빈도도 역시 독립적으로 선택될 수 있고, 예를 들어 대략 매일, 1일 간격, 3일 간격, 주 당 2회, 주당 1회, 2주에 1회, 3주 간격, 매월, 6주 간격, 2개월 간격, 3개월 간격, 4개월 간격, 5개월 간격, 6개월 간격, 1년 1회 등일 수 있다. 요법은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36개월, 또는 그 이상의 전체 기간이 걸릴 수 있다.
면역화 간 계획된 간격은 면역화 사이의 간격이 간격의 최대 5분의 1, 4분의 1, 3분의 1, 또는 절반만큼 개정되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 3주 간격 스케줄의 경우, 면역화는 20일 내지 28일 (3주 -1일 내지 3주 +7일) 사이에 반복될 수 있다. 처음 3회 면역화의 경우, 제2 및/또는 제3 면역화가 지연되면, 후속 면역화는 면역화 간 완충제의 최소량을 허용하도록 바뀔 수 있다. 예를 들어, 3주 간격 스케줄의 경우, 면역화가 지연되면, 후속 면역화는 이전 면역화 이후에 17, 18, 19, 또는 20일 보다 빠르지 않게 일어나도록 일정 조정될 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물은 다양한 상태, 예를 들어 실온, 얼음 상에, 또는 동결되어 제공될 수 있다. 조성물은 적합한 크기의 용기, 예를 들어 2 mL 바이알의 바이알에 제공될 수 있다. 일 구체예에서, 1.0 mL의 추출성 백신을 갖는 12 ml 바이알은 5x 1011 의 전체 바이러스 입자/mL을 함유한다. 온도 및 습도를 포함한 저장 조건은 다양할 수 있다. 예를 들어, 용법에 사용을 위한 조성물은 실온, 4℃, -20℃ 또는 그 이하에서 저장될 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따른 치료를 수용한 개체에 대해 일반적인 평가가 수행된다. 하나 이상의 임의 검사는 필요에 따라서 스케줄 잡힌 기준에 따라, 예컨대 0, 3, 6주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 검사가 면역화없는 시점 대비 면역화와 동시발생적으로 수행될 수 있다.
일반 평가는 하나 이상의 병력, ECOG 수행 점수, 카르노프스키(Karnofsky) 수행 상태, 및 참관의에 의한 체중과 완전한 신체 검사를 포함할 수 있다. 환자가 수용하거나 또는 마지막 방문 이후에 수용한 임의의 다른 치료, 약물, 생물제 또는 혈액 생성물은 기록될 수 있다. 환자는 임의의 부정적 반응을 모니터링하기 위해서 백신 수용 이후에 적합한 기간, 예를 들어 대략 30분간 클리닉에서 추적될 수 있다.
특정 구체예에서, 백신의 각 용량 이후 국소 및 전신 반응원성은 선택된 시간, 예를 들어 3일 동안 (면역화 당일 및 이후 2일) 날마다 평가될 수 있다. 일지 카드를 사용하여 증상을 기록하고 자를 사용하여 국소 면역원성을 측정할 수 있다. 면역화 주사 부위가 평가될 수 있다. 흉부, 복부 및 골반의 CT 스캔 또는 MRI가 수행될 수 있다.
다양한 구체예에서, 혈액학적 및 생화학적 평가가 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물에 따라서 치료를 수용하는 개체에 대해 수행된다. 하나 이상의 임의 검사가 필요에 따라서 또는 스케줄된 기준으로, 예컨대 0, 3, 6주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 검사가 면역화없는 시점 대비 면역화와 동시발생적으로 수행될 수 있다. 조직학적 및 생화학적 평가는 차등적인, Na, K, Cl, CO2, BUN, 크레아틴, Ca, 전체 단백질, 알부민, 전체 빌리루빈, 알칼리 포스파타제, AST, ALT, 포도당, 및 ANA에 의한 CBC, 화학 및 혈액학에 대한 혈액 검사 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 생물학적 마커가 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따라서 치료를 수용하는 개체에 대해 평가된다. 하나 이상의 임의 검사가 필요에 따라서 또는 스케줄된 기준에 따라서, 예컨대 0, 3, 6 중에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 검사가 면역화없는 시점 대비 면역화와 동시발생적으로 수행될 수 있다.
생물학적 마커 평가는 적절한 부피의 혈청으로부터, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터 또는 표적 항원에 대한 측정 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 예를 들어, 5 mL 생물마커가, 결정되고 이용가능하면, 고찰될 수 있다.
다양한 구체예에서, 면역학적 평가는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따른 치료를 수용한 개체에게 수용된다. 임의 검사 중 하나 이상이 필요에 따라서 스케줄된 기준에 따라서, 예컨대 0, 3, 6 주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 검사가 면역화 없는 시점 대비 면역화와 동시발생적으로 수행될 수 있다.
말초 혈액, 예를 들어 약 90 mL을 각 면역화 이전 및 적어도 일부 면역화 이후 시점에 채혈되어서, 특정 횟수의 면역화 이후 및/또는 실험 동안 특정한 시점에 면역 반응에 대한 효과가 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 면역학적 평가는 ELISpot을 사용한 표적 항원에 대한 T-세포 반응의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 어세이, 증식 어세이, 다중매개변수 유세포측정 분석, 세포독성 어세이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 각 혈액 채취물 유래 혈청을 보관할 수 있고 수송할 수 있고 결정할 수 있다.
다양한 구체예에서, 종양 평가는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 따라서 치료를 수용한 개체에 대해 수행된다. 임의 검사 중 하나 이상은 필요에 따라서 또는 스케줄된 기준에 따라서, 예컨대 치료 이전에, 0, 3, 6주 등에 수행될 수 있다. 상이한 세트의 검사가 면역화없는 시점 대비 면역화와 동시발생적으로 수행될 수 있다. 종양 평가는 치료 이전에, 적어도 일부 면역화 이후 시점에 그리고 선택된 횟수, 예를 들어 2, 3 또는 4회의 처음 치료의 완료 이후 대략 3개월 마다, 및 예를 들어 치료로부터 제거까지, 수행되는 흉부, 복부 또는 골반의 CT 또는 MRI 스캔 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 표적 항원, 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원에 대한 면역 반응은 면역 반응에 적합한 하나 이상의 검사, 예컨대 ELISpot, 사이토카인 유세포측정, 또는 항체 반응을 사용하여, 샘플, 예컨대 개체의 말초 혈액 샘플로부터 평가될 수 있다. 양성 면역 반응은 T-세포 반응을 측정하여 결정할 수 있다. T-세포 반응은 항원이 있는 6개 웰 중 배경값에 대해 조정된 스팟의 평균수가 10만큼 6개 대조군 웰 중 스팟의 수를 초과하고, 항원을 함유하는 6개 웰 및 6개 대조군 웰의 단일 값 사이의 편차가 스튜던트 t-검정을 사용해 p≤0.05의 수준에서 통계적으로 유의하면 양성으로 간주할 수 있다. 면역원성 어세이는 각 면역화 이전 및 치료 기간 동안 스케줄된 시점에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 치료의 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 30, 36, 또는 48주에 면역원성 어세이에 대한 시점은 이 시점에 스케줄된 면역화없이도 스케줄 결정될 수 있다. 일부 경우에서, 개체는 그들이 적어도 최소 횟수의 면역화, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상의 면역화를 수용하면 면역 반응에 대해 평가할 수 있는 것으로 간주될 수 있다.
일부 구체예에서, 질환 진행 또는 임상 반응 결정은 측정가능/평가가능 질환을 갖는 환자 중에서 RECIST 1.1 기준에 따라 수행된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 사용되는 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 수용하는 개체에서 완전 반응 (CR; 표적 병변에 대한 모든 표적 병변의 소멸 또는 모든 비표적 병변의 소멸 및 비표적 병변에 대한 종양 마커 수준의 정규화)에 영향을 미친다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 수용하는 개체에서 부분 반응 (PR; 표적 병변에 대한 기준 합 LD를 기준으로서 취하는, 표적 병변의 LD의 합의 적어도 30% 감소)에 영향을 미친다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 수용하는 개체에서 안정한 질환 (SD; 치료가 표적 병변에 대해 시작된 이래로 최소 합 LD를 기준으로 하여, PR에 대한 품질로 충분히 수축되지도 않거나 또는 PD에 대한 품질로 충분히 증가하지도 않음)에 영향을 미친다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 수용하는 개체에서 불완전 반응/안정한 질환 (SD; 하나 이상의 비표적 병변(들)의 지속 및/또는 비표적 병변에 대한 정상 한계 이상으로 종양 마커 수준의 유지)에 영향을 미친다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하는 요법은 요법을 수용하는 개체에서 진행성 질환 (PD; 치료 시작 이래로 기록된 최소 합 LD를 기준으로 하여, 표적 병변의 LD의 합의 적어도 20% 증가 또는 표적 병변에 대한 하나 이상의 신규한 병변의 출현 또는 하나 이상의 비표적 병변(들)의 지속 또는/및 비표적 병변에 대한 정상 한계 이상으로 종양 마커 수준의 유지)에 영향을 미친다.
VI. 벡터
특정 양상은 하나 이상의 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구성체를 세포로 전달하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 발현 구성체는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포로 발현 구성체의 전달은 바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 벡터는 그에 클로닝된 재조합 유전자 구성체를 발현시키는데 충분한 바이러스 서열을 함유하는 구성체를 포함시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서는 다수의 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프를 표적화하는 벡터의 라이브러리를 포함하는 조성물을 개시할 수 있다. 벡터의 라이브러리는 암의 모든 동정된 네오-에피토프를 표적화할 수 있다. 일부 경우에서, 벡터의 라이브러리는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 벡터의 라이브러리는 다수의 네오-에피토프를 발현하는 이종성 종양을 더 공격적으로 표적화할 수 있다. 일부 경우에서, 벡터의 라이브러리는 적어도 2개 벡터이다. 벡터의 라이브러리는 2개를 초과하는 벡터일 수 있다. 벡터의 라이브러리는 상이한 네오-에피토프를 표적화하는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 벡터를 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 있다. 벡터의 라이브러리는 드라이버 돌연변이 및 패신저 돌연변이를 동시에 표적화할 수 있다. 일부 경우에서, 벡터의 라이브러리는 환자의 종양 풍경에 따라 디자인된다. 일부 경우에서, 벡터의 라이브러리 중 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 선형 이중-가닥 게놈을 함유하는 20면체, 비엔벨로프형 캡시드를 특징으로 하는 DNA 바이러스의 패밀리이다. 인간 아데노바이러스 중에서, 어떠한 것도 임의의 신생물성 질환과 연관되지 않고, 면역적격성 개체에서 비교적 약한, 자가-제한적 질병만을 야기시킨다.
아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA로 통합되는 낮은 능력을 가질 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 고도로 효율적인 유전자 전달을 일으킬 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 추가적인 장점은 그들이 비분열 및 분열 세포 둘 모두로 유전자 전달에서 효율적이고 대량으로 생산될 수 있다는 것을 포함한다.
통합 바이러스와 대조적으로, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전독성없이 에피솜 방식으로 복제될 수 있기 때문에 염색체 통합을 일으키지 않을 수 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 구조적으로 안정할 수 있고, 게놈 재배열이 광범위 증폭 이후에 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 이의 중간 크기 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 광범위 표적-세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 사용에 특히 적합하다.
바이러스에 의해 발현되는 제1 유전자는 E1 유전자로서, 이것은 야생형 게놈에 존재하는 다른 Ad5 유전자 프로모터로부터 고수준 유전자 발현을 개시하도록 작용한다. 바이러스 DNA 복제 및 자손 비리온의 조립은 감염된 세포의 핵 내에서 발생되고, 전체 생활 주기는 세포 당 대략 104 비리온의 산출량으로 약 36시간이 걸린다.
야생형 Ad5 게놈은 대략 36 kb이고, 그들이 DNA 복제 이전 또는 이후에 발현되는지 여부에 따라서, 초기 및 후기 바이러스 기능으로 나뉘는 유전자를 코딩한다. 초기/후기 설명은 거의 절대적인데, Ad5에 의해 이전에 감염된 세포의 초감염은 이 자체 게놈이 복제된 이후까지 초감염 바이러스로부터 후기 유전자 발현의 결여를 야기한다는 것이 입증되었기 때문이다. 이론에 국한하려는 것은 아니지만, 이것은 아마도 복제된 게놈이 캡슐화되어 존재할 때까지 후기 유전자 발현 (주로 Ad5 캡시드 단백질)을 방지하는, Ad5 주요 후기 프로모터 (MLP)의 복제 의존적 시스-활성화에 기인한 듯하다.
아데노바이러스 벡터는 복제-결함일 수 있거나, 또는 적어도 조건적으로 결함적일 수 있다. 아데노바이러스는 임의의 42종의 상이한 기지의 혈청형 또는 서브그룹 A-F일 수 있고 다른 혈청형 또는 서브그룹이 고려된다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 제5형은 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해 특정 구체예에서 사용될 수 있다. 이것은 아데노바이러스 제5형이 상당한 생화학적 및 유전자적 정보가 알려진 인간 아데노바이러스이기 때문이고, 이것은 벡터로서 아데노바이러스를 적용하는 대부분의 구성에서 역사적으로 사용되었다.
아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내에서 광범위 숙주 범위를 나타낸다. CAR 도메인이 변경된 변형된 바이러스, 예컨대 아데노바이러스가 또한 사용될 수 있다. 전달을 증강시키거나 또는 면역 반응을 회피하기 위한 방법, 예컨대 바이러스의 리포솜 캡슐화가 또한 계획된다.
벡터는 아데노바이러스의 유전자 조작된 형태, 예컨대 E2 결실된 아데노바이러스 벡터, 또는 보다 특별히, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "E2b 결실된"은 적어도 하나의 E2b 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방해하는 방식으로 돌연변이된 특정한 DNA 서열을 의미한다. 따라서, 특정 구체예에서, "E2b 결실된"은 Ad 게놈으로부터 결실된 (제거된) 특정한 DNA 서열을 의미한다. E2b 결실되거나 또는 "E2b 영역 내에 결실을 함유하는"은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 의미한다. 특정 구체예에서, 하나를 초과하는 염기쌍이 결실되고 추가 구체예에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 염기쌍이 결실된다. 다른 구체예에서, 결실은 Ad 게놈의 E2b 영역 내에서 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 염기쌍을 초과한다. E2b 결실은 적어도 하나의 E2b 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실일 수 있고, 따라서 프로모터 및 리더 서열 내 결실을 비롯하여 E2b-특이적 단백질의 일부분을 코딩하는 엑손 내 결실을 포함한다. 특정 구체예에서, E2b 결실은 E2b 영역의 프리터미널 단백질 및 DNA 폴리머라제 중 하나 또는 둘 모두의 발현 및/또는 기능을 방지하는 결실이다. 추가 구체예에서, "E2b 결실된"은 하나 이상의 코딩된 단백질이 비기능성이도록 Ad 게놈의 이 영역의 DNA 서열 내 하나 이상의 점 돌연변이를 의미한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질이 생성되는 아미노산 서열 내 변화를 야기하는 상이한 잔기로 치환된 잔기를 포함한다.
본 개시 내용을 읽을 때 당업자가 이해하는 바와 같이, Ad 게놈의 다른 영역이 결실될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용시 Ad 게놈의 특정한 영역 내 "결실된"이란 그 영역에 의해 코딩되는 적어도 하나의 유전자 산물의 발현 및/또는 기능을 방지하는 방식으로 돌연변이된 특정한 DNA 서열을 의미한다. 특정 구체예에서, 특정한 영역 내에서 "결실된"이란, 그 영역에 의해 코딩되는 발현 및/또는 기능 (예를 들어, DNA 폴리머라제 E2b 기능 또는 프리터미널 단백질 기능)을 방지하는 방식으로 Ad 게놈으로부터 결실된 (제거된) 특정한 DNA 서열을 의미한다. 특정한 영역 내에 "결실을 함유하는" 또는 "결실된"은 Ad 게놈의 그 영역 내에 적어도 하나의 염기쌍의 결실을 의미한다.
따라서, 특정 구체예에서, 하나를 초과하는 염기쌍이 결실되고, 추가 구체예에서, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 염기쌍이 특정한 영역으로부터 결실된다. 다른 구체예에서, 결실은 Ad 게놈의 특정한 영역 내에서 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 또는 300 염기쌍을 초과한다. 이들 결실은 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현 및/또는 기능이 방지되도록 한다. 따라서, 결실은 단백질의 일부를 코딩하는 엑손 내 결실을 비롯하여 프로모터 및 리더 서열 내 결실을 포함한다. 추가 구체예에서, Ad 게놈의 특정 영역 내에서 "결실된"은 하나 이상의 코딩된 단백질이 비기능성이도록 Ad 게놈의 이 영역의 DNA 서열 내 하나 이상의 점 돌연변이를 의미한다. 이러한 돌연변이는 비기능성 단백질을 야기하는 아미노산 서열 내 변화를 초래하는 상이한 잔기로 치환된 잔기를 포함한다.
특정 구체예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내에 결실을 갖는 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터, 및 임의로 E1 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 결실된 Ad 게놈의 임의의 다른 영역을 갖지 않는다.
다른 구체예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실, 및 임의로 E1 및 E3 영역 내 결실을 갖는 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 결실된 다른 영역을 갖지 않는다.
추가 구체예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실, 및 임의로, E1, E3 내 결실, 및 또한 임의로, E4 영역의 부분 또는 완전 제거를 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
다른 구체예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 E2b 영역 내 결실, 및 임의로 E1 및/또는 E4 영역 내 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 함유하지 않는다.
추가적인 구체예에서, 사용에 고려되는 아데노바이러스 벡터는 Ad 게놈의 2a, E2b 및/또는 E4 영역 내에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 기능 및/또는 E1을 갖는 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
추가 구체예에서, 본 명세서에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E2b 영역의 프리터미널 단백질 기능 및/또는 E1을 갖는다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
다른 구체예에서, 본 명세서에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1, DNA 폴리머라제 및/또는 프리터미널 단백질 기능을 갖는다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다. 특정한 일 구체예에서, 본 명세서에서 사용이 고려되는 아데노바이러스 벡터는 E2b 영역 및/또는 E1 영역의 적어도 한 부분에 대해 결실된다.
일부 경우에서, 이러한 벡터는 "완전 결실형" 아데노바이러스 벡터가 아니다. 이와 관련하여, 벡터는 E2b 영역의 DNA 폴리머라제 및 프리터미널 단백질 기능 둘 모두에 대해 결실될 수 있다. 추가 구체예에서, 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1, E2b 및/또는 100K 영역에 결실을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 "완전 결실형" 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1, E2b 및/또는 프로테아제 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 벡터는 다른 결실을 갖지 않는다.
추가 구체예에서, 본 명세서에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실된 E1 및/또는 E2b 영역을 갖지만, 섬유 유전자는 돌연변이 또는 다른 변경에 의해 변형되었다 (예를 들어, Ad 향성의 변경을 위함). E3 또는 E4 영역 유래 유전자의 제거가 임의의 언급된 아데노바이러스 벡터에 첨가될 수 있다.
결실된 아데노바이러스 벡터는 당분야에 공지된 재조합 기술을 사용해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33; Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59] 참조). 당업자가 인식하는 바와 같이, 특정 양상에서 사용을 위한 아데노바이러스 벡터는 결실되었을 수 있는 임의의 필수 유전자의 산물 및 E2b 유전자 산물을 항상적으로 발현하는 적절한 패키징 세포주를 사용해 높은 역가로 성공적으로 성장시킬 수 있다. 특정 구체예에서, E1 및 DNA 폴리머라제 단백질뿐만 아니라, 또한 Ad-프리터미널 단백질을 항상적으로 발현하는 HEK-293-유래된 세포가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, E.C7 세포가 아데노바이러스의 고역가 스톡을 성공적으로 성장시키는데 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33; Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59] 참조).
자가-전파성 아데노바이러스로부터 핵심 유전자를 결실시키기 위해서, 표적화된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 HEK-293 세포에서, 또는 유사하게, E1 단백질과 함께 공동발현될 수 있다. 그러므로, 오직 항상적으로 공동발현시 무독성인 단백질 (또는 유도적으로 발현시 독성 단백질)만이 이용될 수 있다. E1 및 E4 유전자의 HEK-293 세포에서의 공동발현이 입증되었다 (항상성 프로모터가 아닌 유도성 프로모터 이용) ([Yeh, et al. J. Virol. 1996; 70:559; Wang et al. Gene Therapy 1995; 2:775]; 및 [Gorziglia, et al. J. Virol. 1996; 70:4173]). E1 및 단백질 IX 유전자 (비리온 구조 단백질)가 공동발현되고 (Caravokyri, et al. J. Virol. 1995; 69: 6627), E1, E4, 및 단백질 IX 유전자의 공동발현도 역시 설명된 바 있다 (Krougliak, et al. Hum. Gene Ther. 1995; 6:1575). E1 및 100k 유전자는 E1 및 프로테아제 유전자를 가지므로, 트랜스컴플리멘팅 세포주에서 성공적으로 발현되었다 (Oualikene, et al. Hum Gene Ther 2000; 11:1341-53; Hodges, et al. J. Virol 2001; 75:5913-20).
E2b 결실된 Ad 입자의 고역가 성장에 사용을 위한 E1 및 E2b 유전자 산물을 공동발현하는 세포주가 미국 특허 제6,063,622호에 기술되어 있다. E2b 영역은 Ad 게놈 복제에 절대적으로 요구되는 바이러스 복제 단백질을 코딩한다 (Doerfler, et al. Chromosoma 1992; 102:S39-S45). 유용한 세포주는 항상적으로 대략 140 kDa Ad-DNA 폴리머라제 및/또는 대략 90 kDa 프리터미널 단백질을 발현한다. 특히, 독성없이, E1, DNA 폴리머라제, 및 프리터미널 단백질의 고수준, 항상적 공동 발현을 갖는 세포주 (예를 들어, E.C7)가 다수 백신접종에 사용을 위한 Ad의 전파에 사용하기 바람직하다. 이들 세포주는 E1, DNA 폴리머라제, 및 프리터미널 단백질이 결실된 아데노바이러스 벡터의 전파를 가능하게 한다.
재조합 Ad는 당분야에 공지된 기술을 사용해 전파될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, E.C7 세포를 함유하는 세포 조직 플레이트를 적절한 MOI (예를 들어, 5)에서 아데노바이러스 벡터 바이러스 스톡으로 감염시키고 37.0℃에서 40-96시간 동안 인큐베이션시킨다. 감염된 세포를 회수하고 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 바이러스를 2회 세슘 클로라이드 밀도 원심분리를 통해 정제한다. 특정 기술에서, 바이러스 함유 밴드를 Sephadex CL-6B 컬럼 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.) 상에서 탈염시키고, 수크로스 또는 글리세롤을 첨가하고 분취액을 -80℃에 저장한다. 일부 구체예에서, 바이러스는 이의 안정성을 증강시키기 위해 디자인된 용액, 예컨대 A195 (Evans, et al. J Pharm Sci 2004; 93:2458-75)에 위치될 것이다. 스톡의 역가가 평가된다 (예를 들어, SDS 용해 이후에 바이러스 분취액의 260 nm에서의 광학 밀도 측정에 의함). 다른 구체예에서, 전체 재조합 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 포괄하는 선형 또는 원형인 플라스미드 DNA를 E.C7, 또는 유사한 세포에 형질감염시킬 수 있고, 바이러스 생산 증거가 존재할 때까지 (예를 들어, 세포변성 효과) 37.0℃에서 인큐베이션시킨다. 이들 세포로부터의 조건화 배지를 사용하여 더 많은 E.C7, 또는 유사한 세포를 감염시켜서, 정제 이전에 생산된 바이러스의 양을 확장시킬 수 있다. 저제는 2회의 세슘 클로라이드 밀도 원심분리 또는 선택적 여과에 의해 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 상업적으로 입수할 수 있는 제품 (예를 들어, Adenopure from Puresyn, Inc., Malvem, PA) 또는 고객 맞춤 크로마토그래피 컬럼을 사용해 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
특정 구체예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 감염시키려는 세포가 특정 수의 바이러스와 마주하도록 보장하기 위해서 충분한 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 재조합 Ad의 RCA-무함유 스톡으로, 재조합 Ad의 스톡을 제공할 수 있다. Ad 스톡의 제조 및 분석은 당분야에서 이용할 수 있는 임의 방법을 사용할 수 있다. 바이러스 스톡은 대체로 그들을 제조하는데 사용된 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 세포주에 따라서, 역가가 상당히 다양하다. 바이러스 스톡은 적어도 약 106, 107, 또는 108 pfu/mL의 역가를 가질 수 있고, 이러한 많은 스톡은 더 높은 역가, 예컨대 적어도 약 109, 1010, 1011, 또는 1012 pfu/mL을 가질 수 있다.
특정 양상은 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 사용, 예컨대 미국 특허 제6,063,622호; 제6,451,596호; 제6,057,158호; 제6,083,750호; 및 제8,298,549호에 기술된 것의 사용을 고려한다. 많은 경우에서 E2b 영역 내 결실을 갖는 벡터는 바이러스 단백질 발현이 손상되고/되거나 복제 능력 Ad (RCA)를 생성하는 빈도를 감소시킨다.
이들 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 전파는 결실된 E2b 유전자 산물을 발현사키는 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 특정 양상은 또한 이러한 패키징 세포주, 예를 들어 HEK-293 세포주로부터 유래된 E.C7 (이전에 C-7이라함)을 제공한다.
추가 양상에서, E2b 유전자 산물, DNA 폴리머라제 및 프리터미널 단백질은 E1 유전자 산물과 함께 E.C7, 또는 유사한 세포에서 항상적으로 발현된다. 생산 세포주로 Ad 게놈 유래 유전자 절편의 전달은 다음의 즉각적인 이득을 갖는다: (1) 증가된 운반 능력; 및 (2) 전형적으로 RCA를 발생시키는 둘 이상의 독립적 재조합 사건을 요구하는 RCA 생성의 감소된 잠재력. 본 명세서에서 사용되는 E1, Ad DNA 폴리머라제 및/또는 프리터미널 단백질 발현 세포는 오염 헬퍼 바이러스의 필요없이, 13 kb에 접근하는 운반 능력으로 아데노바이러스 벡터를 전파할 수 있다. 또한, 바이러스 생활 주기에 핵심적인 유전자 (예를 들어, E2b 유전자)가 결실되었을 때, 다른 바이러스 유전자 단백질을 복제하거나 또는 발현시키기 위한 Ad의 추가적인 손상이 일어난다. 이것은 바이러스 감염된 세포의 면역 인식을 감소시킬 수 있고, 외래 이식유전자 발현의 연장된 지속기간을 가능하게 한다.
E1, DNA 폴리머라제, 및 프리터미널 단백질 결실된 벡터는 전형적으로 E1 및 E2b 영역으로부터 개별 단백질을 발현할 수 없다. 더 나아가서, 그들은 대부분의 바이러스 구조 단백질의 발현 결여를 보여줄 수 있다. 예를 들어, Ad의 주요 후기 프로모터 (MLP)는 후기 구조 단백질 L1 내지 L5의 전사를 담당한다. MLP가 Ad 게놈 복제 이전에 최소로 활성화되지만, 고도로 독성인 Ad 후기 유전자는 바이러스 게놈 복제가 일어난 이후에만 MLP로부터 주로 전사되고 번역된다. 후기 유전자 전사의 이러한 시스-의존적 활성화는 일반적으로 DNA 바이러스의 특성, 예컨대 폴리오마 및 SV-40의 성장에서의 특성이다. DNA 폴리머라제 및 프리터미널 단백질은 Ad 복제에서 중요하다 (E4 또는 단백질 IX 단백질과 다름). 그들 결실은 아데노바이러스 벡터 후기 유전자 발현에 극도로 유해할 수 있고, 세포 예컨대 APC에서 그 발현의 독성 효과일 수 있다.
E1-결실된 아데노바이러스 벡터
특정 양상은 E1-결실된 아데노바이러스 벡터의 사용을 고려한다. 제1 세대, 또는 E1-결실된 아데노바이러스 벡터 Ad5 [E1-]는 이식유전자가 오직 유전자의 D1 영역을 교체하도록 구축된다. 전형적으로, 약 90%의 야생형 Ad5 게놈이 벡터에 유지된다. Ad5 [E1-] 벡터는 감소된 복제 능력을 가지며 Ad5 E1 유전자를 발현하지 않는 세포의 감염 이후에 감염성 바이러스를 생산할 수 없다. 재조합 Ad5 [E1-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터 복제 및 패키징을 가능하게 하는 인간 세포 (전형적으로, 293 개 세포)에서 전파된다. Ad5 [E1-] 벡터는 많은 긍정적 속성을 갖는데, 가장 중요한 것 중 하나는 대량화에 대한 그들의 상대적 용이함 및 cGMP 생산이다. 현재, 220명의 인간 임상 실험에서 충분히 Ad5 [E1-] 벡터를 이용하여, 2천명이 넘는 대상체에게 피하로, 근육내로 또는 정맥내로 바이러스가 제공되고 있다.
추가적으로, Ad5 벡터는 통합되지 않고, 그들 게놈이 에피솜으로 남아있다. 일반적으로, 숙주 게놈으로 통합되지 않는 벡터의 경우, 삽입 돌연변이유발 및/또는 배선 전달의 위험성이 있어도 극도로 낮다. 통상의 Ad5 [E1-] 벡터는 7 kb에 접근하는 운반 능력을 갖는다.
인간 및 동물에서의 실험은 Ad5에 대한 기존 면역성이 Ad-기반 백신의 상업적 사용에 대한 억제 인자일 수 있다는 것이 입증되었다. 대부분의 인간은 Ad5에 대한 항체를 가지며, 인간 백신용으로 가장 광범위하게 사용되는 아형이고, 실험된 인간의 2/3이 Ad5에 대한 림프 증식성 반응을 갖는다. 이러한 기존 면역성은 전형적인 Ad5 백신을 사용한 면역화 또는 재면역화를 억제할 수 있고 이후 시점에 Ad5 벡터를 사용한 제2 항원에 대한 백신의 면역화를 불가능하게 할 수 있다. 기존 항-벡터 면역성의 문제 극복은 광대한 조사의 주제였다. 대안적인 인간 (비-Ad5 기반) Ad5 아형 또는 심지어 Ad5의 비인간 형태를 사용한 연구가 조사되었다. 이러한 접근법이 초기 면역화에서 성공했더라도, 후속 백신접종은 신규 Ad5 아형에 대한 면역 반응으로 인해 문제가 될 수 있다.
Ad5 면역화 장벽을 피하고, 최적 면역 반응을 유도하는 1세대 Ad5 [E1-] 벡터의 제한된 효능을 개선하기 위해서, 차세대 Ad5 벡터 기반 백신 플랫폼과 관련된 특정 구체예를 제공한다. 차세대 Ad5 플랫폼은 DNA 폴리머라제 및 프리터미널 단백질 유전자를 제거하는, E2b 영역 내 추가적인 결실을 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 플랫폼은 많은 가능한 유전자의 포함을 가능하게 하는데 충분한 확장된 클로닝 능력을 갖는다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 필요하다면 다수 유전자를 위한 공간을 제공하는 7 kb 능력의 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 최대 약 12 kb-유전자 운반 능력을 갖는다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 kb를 초과하는 삽입부가 Ad5 벡터, 예컨대 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 도입된다.
E2b 영역의 결실은 Ad 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서, 표적 이식유전자 항원, 예컨대 종양 네오-에피토프에 대한 강력한 면역 반응을 종종 유발시키는, Ad5 벡터에 대해 유리한 면역 특성을 부여할 수 있다.
다양한 구체예에서, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad 면역성의 존재 하에서도, 표적 항원, 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 네오-에피토프를 발현하는 벡터에 대한 항체를 비롯하여, 강력한 CMI를 유도할 수 있다.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 또한 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 역반응, 특히 간세포독성 및 조직 손상의 출현이 감소된다.
이들 Ad5 벡터의 특정 양상은 Ad 후기 유전자의 발현이 상당히 감소된다는 것이다. 예를 들어, 캡시드 섬유 단백질의 생산이 Ad5 [E1-] 벡터의 경우 생체내에서 검출될 수 있는데 반해, 섬유 발현이 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 백신으로부터는 폐기되었다. 야생형 Ad에 대한 선천성 면역 반응은 복잡하다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로부터 결실된 단백질은 일반적으로 중요한 역할을 한다. 특히, 프리터미널 단백질 또는 DNA 폴리머라제가 결실된 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 Ad5 [E1-] 벡터와 비교하여 주사 이후 처음 24시간 내지 72시간 동안 감소된 염증성을 나타낸다. 다양한 구체예에서, Ad5 유전자 발현의 결여는 항-Ad 활성이 보이지 않는 감염된 세포를 야기하고 감염된 세포가 연장된 기간 동안 이식유전자를 발현시킬 수 있게 하고, 표적에 대한 면역성이 발생된다.
다양한 구체예는 수지상 세포를 형질도입시키는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 능력 증가, Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 바이러스 단백질에 대한 감소된 염증 반응을 이용하여 백신 중 항원 특이적 면역 반응의 개선 및 그 결과로 기존 Ad 면역성의 회피를 고려한다.
일부 경우에서, 이러한 면역 유도는 수개월이 걸릴 수 있다. Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 보다 안전할 뿐만 아니라, 항원 특이적 면역 반응의 유도에서도 Ad5 [E1-] 벡터보다 우수한 것으로 나타나서, 그들은 임상 반응을 일으킬 수 있는 종양 백신을 전달하는 플랫폼으로서 훨씬 더 적합하게 된다.
특정 구체예에서, 다른 Ad5 시스템에서 발견되는 장벽을 극복하고 Ad5에 이전에 노출된 사람의 면역화를 가능하게 하는 치료적 종양 백신을 개발하기 위해 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 시스템을 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다.
E2b 결실된 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터의 5 내지 6 kb 능력과 비교하여 최대 13 kb 유전자-운반 능력을 가질 수 있어서, 임의의 다양한 표적 항원, 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열에 쉽게 공간을 제공한다. 일부 양상에서, E2b 결실된 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 위한 공간을 더 제공할 수 있다.
E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 또한 1세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여 감소된 역반응을 갖는다. E2b 결실된 벡터는 바이러스 유전자의 발현이 감소되고, 이러한 특징은 생체내에서 연장된 이식유전자 발현을 초래한다.
1세대 아데노바이러스와 비교하여, 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터의 특정 구체예는 DNA 폴리머라제 유전자 (pol) 내에 추가적인 결실 및 프리터미널 단백질 (pTP)의 결실을 함유한다.
아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 Ad 단백질은 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. 특히, E2b 결실된 벡터에서 프리터미널 단백질 및 DNA 폴리머라제의 결실은 주사 이후 처음 24시간 내지 72시간 동안 염증을 감소시키는 것으로 나타나는데 반해, 1세대 아데노바이러스 벡터는 이 기간 동안 염증을 자극한다.
또한, E2b 결실에 의해 생성된 추가적인 복제 차단이 또한 E1, E3 결실 단독에 의한 것보다 훨씬 넘게, Ad 후기 유전자 발현에서 10,000배 감소를 초래한다고 보고되었다. E2b 결실된 아데노바이러스 벡터에 의해 생산된 Ad 단백질의 감소된 수준은 Ad 항원에 대한 경쟁적인, 바람직하지 않은, 면역 반응, Ad 면역화 또는 노출 개체에서 플랫폼의 반복 사용을 방해하는 반응에 대한 잠재성을 효과적으로 감소시킨다.
2세대 E2b 결실된 벡터에 의한 염증 반응의 감소된 유도는 항원 제시 세포 (즉, 수지상 세포)의 감염 동안 바람직한 백신 항원, 예컨대 종양 네오-에피토프를 발현하는 벡터의 증가된 잠재력, 항원성 경쟁에 대한 잠재력의 감소를 야기하여, 1세대 아데노바이러스 벡터에 의한 동일한 시도와 비교하여 바람직한 항원에 대한 백신의 더 큰 면역화를 야기시킨다.
E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 1세대 아데노바이러스 벡터를 사용하는 이전에 기술된 백신 후보보다 더 안전하고, 더 효과적이며, 더 다재다능한 개선된 Ad-기반 백터 후보를 제공한다.
따라서, 1세대 E1-결실된 아데노바이러스 아형 5 (Ad5)-기반 벡터는 백신으로서 사용을 위한 유망한 플랫폼이지만, 천연 발생되거나 또는 유도된 Ad-특이적 중화 항체에 의한 활성에 방해될 수 있다.
이론에 국한되지 않고, E1 및 E2b 영역에 결실이 있는 Ad5-기반 벡터 (Ad5 [E1-, E2b-])로서, 후자는 DNA 폴리머라제 및 프리터미널 단백질을 코딩하는 것이고, 이 벡터는 예를 들어 후기 바이러스 단백질 감소 덕분으로 면역학적 청소를 피할 수 있고 Ad-면역 숙주에서, 코딩된 항원 이식유전자, 예컨대 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도할 수 있다.
VII. 표적 항원
특정 양상에서, 하나 이상의 관심 표적 단백질 또는 표적 항원, 예컨대 종양 에피토프 또는 종양 네오-에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성체 또는 벡터를 제공할 수 있다. 이와 관련하여, 적어도, 최대로 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500종의 상이한 관심 표적 항원 또는 그로부터 유래된 임의 수 또는 범위를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있는 발현 구성체 또는 벡터를 제공할 수 있다. 발현 구성체 또는 벡터는 하나의 관심 표적 단백질 유래의 다수 단편 또는 에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있거나 또는 수많은 상이한 관심 표적 네오-에피토프 항원 단백질 유래의 하나 이상의 단편 또는 에피토프를 함유할 수 있다. 일부 양상에서, 아데노바이러스 벡터는 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 표적 항원은 종양 네오-항원 또는 종양 네오-에피토프일 수 있다. 암은 그들 발생 동안 수십 내지 수백개의 체세포 돌연변이 ("종양 뮤톰"이라고 함)를 획득할 수 있다. 이들 각각의 돌연변이는 각각의 개별 환자 종양에 고유하게 특이적인 하나 이상의 신규한 T-세포 네오-항원 및 "네오-에피토프"를 생성시키는 잠재력을 갖는다. 이들 네오-에피토프는 배선에는 존재하지 않고, 종양발생 개시 이후까지 접할 수 없기 때문에, 고-화합력 T 세포의 레파토리는 그들을 인식할 수 있고 중추 내성을 피할 수 있고 흉선에서 제거를 피할 수 있다. 특정 양상에서, 종양-특이적 돌연변이는 항원-특이적 종양 백신을 개발하기 위한 항원성 표적의 매력적인 공급원으로서 사용될 수 있다.
일부 경우에서 종양 네오-에피토프는 8 내지 10개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에서, 네오-에피토프는 4 내지 10개 아미노산 길이이거나 10개 아미노산 길이 이상이다. 네오-에피토프는 적어도, 약, 또는 최대로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 아미노산, 또는 그로부터 유래되는 임의 개수 또는 범위의 아미노산 길이를 포함할 수 있거나 또는 길이를 포함할 수 있다. 네오-에피토프는 임의의 아미노산 길이일 수 있다.
표적 네오-항원 또는 네오-에피토프는 암 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 암 돌연변이는 다수의 표적 네오-에피토프를 산출할 수 있다. 예를 들어, 암 돌연변이는 표적가능한 네오-에피토프를 생산하도록 HLA 클래스 I 분자에 잠재적으로 결합할 수 있는 38종의 상이한 펩티드를 생성시킬 수 있다. 일부 경우에서, 펩티드는 단백질가수분해적으로 노출될 수 있지만, 파괴되지 않고, 세포질 망상구조로 따라가고, MHC 클래스 I에 결합할 수 있으면 T-세포 인식을 위해 세포 표면으로 전달된다. 일부 경우에서, 에피토프는 더 길수 있고 차등적으로 프로세싱될 수 있으며, 또한 노출되어야만 하고 파괴되어서는 안되며, HLA 클래스 I 대신 HLA 클래스 II 분자에 대한 친화성을 가질 수 있다.
추가적인 양상에서, 표적 네오-항원 또는 네오-에피토프는 종양 요법에 대응하여 종양 세포에서 생산될 수 있다. 본 명세서는 개선된 임상 반응과 함께 환자 CD8 T 세포에 의해 인식되는 이전에 동정된 돌연변이체 종양 네오-에피토프의 풀의 생성을 개시할 수 있다. 네오-에피토프는 고형 및 혈액학적 종양 둘 모두를 포함하여, 상이한 인간 암 유형을 대표하는 미스센스 돌연변이 및 프레임쉬프트 돌연변이로 이루어질 수 있다. 일부 경우에서, 네오-에피토프는 임의 돌연변이일 수 있다. 일부 경우에서, 돌연변이는 미스센스 돌연변이일 수 있다. 추가적으로, 다른 경우에서 돌연변이는 프레임쉬프트 돌연변이일 수 있다.
일부 경우에서, 항원 제시 세포에 의해 프로세싱되고 제시되며 종양에 의해 HLA 상에 제시되는 백신 표적에 대한 농축이 수행된다. 일부 경우에서, 가능한 표적은 HLA에 대한 친화성에 의해 스크리닝된다. 일 구체예에서, HLA 클래스 I 또는 II에 결합할 수 있는 펩티드는 적격한 백신 표적을 제공한다. HLA는 임의 클래스일 수 있다. 일부 경우에서, HLA 클래스 I이 사용된다. 다른 경우에서, HLA 클래스 II가 사용된다.
백신 표적을 선택하기 위한 한가지 가능한 방법은 환자에 의해 발현되는 HLA 분자에 대한 그들의 예측 친화성을 기반으로 후보 네오-에피토프를 선택하는 것이다. 환자는 임의 HLA 유형을 가질 수 있다. 일부 경우에서, HLA-결합 친화성 예측 알고리즘 (Parker KC, et al. J Immunol 1994; 152:163-75)을 사용하여 적합한 종양 네오-에피토프를 동정할 수 있다.
특정 구체예에서, 표적 항원 예컨대 네오-에피토프는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 표적 항원이 이러한 결합이 당분야에 공지된 임의 어세이를 사용해 검출가능하다면 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 "결합한다"고 말한다. 예를 들어, MHC 클래스 I에 결합하는 폴리펩티드의 능력은 125I 표지된 β2-마이크로글로불린 (β2m)의 MHC 클래스 l/β2m/펩티드 이종삼량체 복합체로 도입을 촉진하는 능력을 모니터링하여 간접적으로 평가될 수 있다 (Parker, et al. J. Immunol. 752:163, 1994). 대안적으로, 기능성 펩티드 경쟁 어세이가 적용될 수 있다.
표적 항원은 전체 길이 단백질일 수 있거나 또는 이의 면역원성 단편 (예를 들어, 에피토프)일 수 있다. 면역원성 단편은 이용가능한 기술, 예컨대 문헌 [Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 이에 인용된 참조 문헌에 요약된 것들을 사용해 동정될 수 있다. 면역원성 단편을 동정하기 위한 대표적인 기술은 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대한 폴리펩티드의 스크리닝을 포함한다. 특정한 표적 폴리펩티드의 면역원성 단편은 전체 길이 표적 폴리펩티드보다 실질적으로 낮지 않은 수준으로 이러한 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 단편일 수 있다 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 어세이에서). 달리 말해서, 면역원성 단편은 전체 길이 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 또는 그보다 큰 수준으로 이러한 어세이에서 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 일반적으로 당업자가 이용가능한 방법, 예컨대 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 것들을 사용해 수행될 수 있다.
표적 항원은 제한없이 임의의 암의 항원을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 네오-에피토프가 표적화될 수 있다. 네오-에피토프는 백신으로 표적화될 수 있다. 일부 경우에서, 아데노-바이러스 기반 백신이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 네오-항원이 표적화된다. 네오-에피토프는 네오-항원 내에 포함될 수 있다. 네오-항원은 다수 네오-에피토프를 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 표적 항원은 종양 세포 에피토프, 네오-항원 또는 네오-에피토프, 종양-연관 항원 또는 에피토프, 또는 이의 조합일 수 있다. 항원은 종양 세포 항원일 수 있다. 에피토프는 종양 세포 에피토프일 수 있다. 종양 세포 에피토프는 광범위하게 다양한 종양 항원 예컨대 돌연변이에 의해 생성된 종양 유래 항원, 공유된 종양 특이적 항원, 분화 항원, 및 종양에서 과발현된 항원으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 종양 네오-에피토프는 종양-특이적 에피토프, 예컨대 EQVWGMAVR 또는 CQGPEQVWGMAVREL (FLRT2의 R346W 돌연변이), GETVTMPCP 또는 NVGETVTMPCPKVFS (VIPR2의 V73M 돌연변이), GLGAQCSEA 또는 NNGLGAQCSEAVTLN (FCRL1의 R286C 돌연변이), RKLTTELTI, LGPERRKLTTELTII, 또는 PERRKLTTE (FAT4의 S1613L 돌연변이), MDWVWMDTT, AVMDWVWMDTTLSLS, 또는 VWMDTTLSL (PIEZO2의 T2356M 돌연변이), GKTLNPSQT, SWFREGKTLNPSQTS, 또는 REGKTLNPS (SIGLEC14의 A292T 돌연변이), VRNATSYRC, LPNVTVRNATSYRCG, 또는 NVTVRNATS (SIGLEC1의 D1143N 돌연변이), FAMAQIPSL, PFAMAQIPSLSLRAV, 또는 AQIPSLSLR (SLC4A11의 Q678P 돌연변이)이다. 종양 네오-에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 실시예 9의 표 3에 표시되어 있다.
종양-연관된 항원은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있고, 그들은 돌연변이되거나, 절단되거나, 미스폴딩되거나 또는 아니면 숙주에 의해 정상적으로 발현되는 분자의 비정상적인 발현일 수 있으며, 그들은 정상적으로 발현되는 분자와 동일할 수 있지만 비정상적으로 높은 수준으로 발현될 수 있거나, 또는 그들은 비정상적인 상황 또는 환경에서 발현될 수 있다. 종양-연관된 항원은 예를 들어, 단백질 또는 단백질 단편, 복합체 탄수화물, 강글리오시드, 햅텐, 핵산, 다른 생물학적 분자 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
표적 항원의 추가적인 비제한적인 예는 암배 항원 (CEA), 폴레이트 수용체 알파, WT1, brachyury (TIVS7-2, 다형성), brachyury (IVS7 T/C 다형성), T brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, HPV E6, HPV E7, BAGE, DAM-6, DAM-10, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSMA, PSCA, STEAP, PAP, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, Cyp-B, EGFR, Her2/neu, Her3, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1-c, MUC1-n, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2/neu), 인간 상피 성장 인자 수용체 3 (HER3), 인간 파필로마바이러스 (HPV), 전립선-특이적 항원 (PSA), 알파-액티닌-4, ARTC1, CAR-ABL 융합 단백질 (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, 베타-카테닌, Cdc27, CDK4, CDKN2A, COA-1, dek-can 융합 단백질, EFTUD2, 연장 인자 2, ETV6-AML1 융합 단백질, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, LDLR-푸코실트랜스퍼라제 융합 단백질, HLA-A2d, HLA-Al ld, hsp70-2, KIAAO205, MART2, ME1, 네오-PAP, 미오신 클래스 I, NFYC, OGT, OS-9, pml-RAR알파 융합 단백질, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, SYT-SSx 1- 또는 -SSX2 융합 단백질, TGF-베타RII, 트리오스포스페이트 이소머라제, BAGE-1, GAGE-1, 2, 8, Gage 3, 4, 5, 6, 7, GnTVf, HERV-K-MEL, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al2, MAGE-C2, mucink, NA-88, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, Sp17, SSX-2, SSX-4, TAG-1, TAG-2, TRAG-3, TRP2-INT2g, XAGE-1b, gp100/Pmel17, 칼리크레인 4, 맘마글로빈-A, 멜란-A/MART-1, NY-BR-1, OA1, PSA, RAB38/NY-MEL-1, TRP-1/gp75, TRP-2, 티로시나제, 아디포필린, AIM-2, ALDH1A1, BCLX (L), BCMA, BING-4, CPSF, 사이클린D1, DKK1, ENAH (hMena), EP-CAM, EphA3, EZH2, FGF5, G250/MN/CAIX, HER-2/neu, IL13R알파2, 장 카복실 에스터라제, 알파 페토단백질, M-CSFT, MCSP, mdm-2, MMP-2, MUC1, p53, PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RGS5, RNF43, RU2AS, 세서린 1, SOx 10, STEAP1, 서비빈, 텔로머라제, VEGF, 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, CEA는 하기 서열번호 106의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다:
Figure pat00001
일부 구체예에서, MUC1-c는 하기 서열번호 107의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다:
Figure pat00002
일부 구체예에서, Brachyury는 하기 서열번호 108의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다:
Figure pat00003
VIII. 이종성 핵산
일부 구체예에서, 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터는 면역 반응을 조정할 수 있는, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원, 이의 융합체 또는 이의 단편을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터는 면역 반응을 조정할 수 있는, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 이종성 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 이종성 핵산 서열을 더 포함하는 2세대 E2b 결실된 아데노바이러스 벡터를 제공할 수 있다.
이와 같이, 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의 공급원 유래의 종양 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 구성체 및 이러한 벡터 또는 발현 구성체로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공할 수 있다. 더 나아가서, 본 명세서에서 더욱 기술하는 임의 공급원 유래의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 구성체 및 이러한 벡터 또는 발현 구성체로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공할 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본질적으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 당업자가 또한 인식하게 되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스)일 수 있거나 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 추가적인 코딩 또는 논코딩 서열은 그럴 필요는 없지만, 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있고, 그럴 필요는 없지만, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 다른 코딩 서열로부터 멀리 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 단리된 DNA 분자는 많은 비율의 미관련 코딩 DNA, 예컨대 거대 염색체 단편 또는 다른 기능성 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 영역을 함유하지 않는다. 물론, 이것은 본래 단리된 대로의 DNA 분자를 의미하고, 실험실에서 재조합을 통해서 절편에 이후에 첨가된 유전자 또는 코딩 영역을 배제하지 않는다.
당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 항원, 항원의 단편, 펩티드 등을 발현하거나, 또는 발현하도록 적합화될 수 있는 게놈 서열, 추가-게놈 및 플라스미드-코딩된 서열 및 보다 작게 조작된 유전자 절편을 포함할 수 있다. 이러한 절편은 천연적으로 단리될 수 있거나, 또는 인간의 손을 통해 합성적으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원 또는 이의 일부분을 코딩하는 내생성 서열)을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 서열 또는 변이체와 실질적으로 다를 수 있지만 유사한 단백질 항원을 코딩하는 특별한 세포 유형 (즉, 인간 세포주)에서 발현을 위해 최적화된 신규한 유전자 서열을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너 또는 이의 일부분을 코딩하는 내생성 서열)을 더 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열는 본 명세서에 기술된 것과 같은 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 서열 또는 변이체와 실질적으로 다를 수 있지만 유사한 단백질 항원을 코딩하는 특별한 세포 유형 (즉, 인간 세포주)에서 발현을 위해 최적화된 신규한 유전자 서열을 나타낸다.
다른 관련 구체예에서, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 천연 서열과 실질적인 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 변이체, 예를 들어 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 (예를 들어, 하기에 기술된 바와 같은 표준 매개변수를 사용하는 BLAST 분석) 적어도 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성 또는 이의 유도가능한 범위 또는 값, 특히 적어도 75% 내지 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함하는 것을 제공할 수 있다. 당업자는 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치화 등을 고려하여 2개 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정하도록 적절하게 조정될 수 있다는 것은 인식하게 될 것이다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 특히 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리뉴클레오티드의 에피토프의 면역원성 또는 이종성 표적 단백질의 면역원성이 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 비해서 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유하게 될 것이다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 특정 양상에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원, 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프)의 변이체를 코딩하고, 여기서 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프)의 경향은 천연 폴리펩티드에 비해 실질적으로 감소되지 않는다. 용어 "변이체"는 또한 이종발생성 기원의 상동성 유전자를 포괄하는 것으로 이해해야만 한다.
특정 양상에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 단백질 항원을 포함하여, 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 약 5 내지 1000 개 또는 그 이상의 인접하는 뉴클레오티드를 비롯하여, 그 사이의 중간 길이를 포함하거나 또는 그로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 이 상황에서 "중간 길이"는 200-500; 500-1,000의 모든 정수를 포함하여, 인용된 값 사이의 임의 길이, 예컨대 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등을 의미하는 것으로 쉽게 이해될 것이다. 본 명세서에서 기술되는 폴리뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 폴리펩티드, 예컨대 에피토프 또는 이종성 표적 단백질를 코딩하는 천연 서열에는 존재하지 않는 추가적인 뉴클레오티드만큼 한쪽 또는 양쪽 말단에서 연장될 수 있다. 이러한 추가적인 서열은 개시된 서열의 말단 또는 개시된 서열의 양쪽 말단에서 1 내지 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상으로 이루어질 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은 그 자체의 코딩 서열의 길이와 무관하게, 그들 전체 길이가 상당히 다양할 수 있도록, 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 발현 제어 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 절편과 조합될 수 있다. 그러므로, 일부 양상에서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 적용될 수 있고, 전체 길이는 제조의 용이성 및 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한된다는 것을 고려한다. 예를 들어, 전체 길이가 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 길이 등의 예시적인 폴리뉴클레오티드 절편 (모든 중간 길이 포함)이 특정 양상에서 유용한 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오티드 서열과 비교시, 2개 서열은 하기에 기술된 바와 같이 최대 대응성에 대해 정렬될 때 2개 서열 내 뉴클레오티드의 서열이 같다면 "동일하다"고 한다. 2개 서열 간 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교하기 위해서 비교창 상에서 서열을 비교하여 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 "비교창"은 적어도 약 20개의 인접하는 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50의 절편을 의미하고, 여기서 서열은 2개 서열을 최적으로 정렬한 이후에 인접하는 위치의 동일 수의 기준 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 매개변수를 사용하는, 생물정보학 소프트웨어의 Lasergene suite에서 Megalign 프로그램 (DNASTAR, Inc., Madison, Wl)을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 다음의 문헌에서 기술된 몇몇 정렬 계획을 구현한다: Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in Proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff MO (ed.) Atlas of Protein Seqeunce and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345- 358; Hein J Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, et al. PM CABIOS 1989; 5:151-53; Myers EW, et al. CABIOS 1988; 4:11-17; Robinson ED Comb. Theor 1971; 11A 05; Saitou N, et al. Mol. Biol. Evol. 1987; 4:406-25; Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur WJ, et al. Proc. Natl. Acad., Sci. USA 1983 80:726-30).
대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 [Smith, et al. Add. APL. Math 1981; 2:482]의 국소 동일성 알고리즘에 의해서, [Needleman, et al. Mol. Biol. 1970 48:443]의 동일성 정렬 알고리즘에 의해서, [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444]의 유사성 방법의 검색에 의해서, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 ([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl]의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA)에 의해서, 또는 정밀 검사에 의해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성의 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로서, 이것은 각각 문헌 [Altschul et al., Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402], 및 [Altschul et al. J. MoI. Biol. 1990 215:403-10]에 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 동일성 백분율을 결정하기 위해서, 예를 들어 본 명세서에 기술된 매개변수를 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국립 생물공학 정보 센터를 통해 공공으로 입수할 수 있다. 예시적인 일례에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해서, 매개변수 M (일치되는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (불일치하는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산할 수 있다. 각 방향으로 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 이의 최고 획득 값으로부터 X 분량만큼 떨어지거나; 하나 이상의 음성-점수화 잔규 정렬의 축적에 기인하여 누적 점수가 0 또는 그 이하가 되거나; 또는 양쪽 서열의 말단에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이 (W), 및 10의 기대치 (E), 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (Henikoff, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:10915) 정렬, 50의 (B), 10의 예측치 (E), M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
일부 양상에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20 위치의 비교 창 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정되며, 여기서 비교창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 2개 서열의 최적 정렬을 위해서 기준 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 20% 또는 그 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기가 양쪽 서열에 존재하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 일치되는 위치의 수를 기준 서열 (즉, 창 크기)의 전체 위치 수로 나누고 그 결과에 100을 곱해서 서열 동일성 백분율을 산출하여 위치 수를 결정하여 계산된다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 특정한 관심 항원, 또는 이의 단편을 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드의 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오티드가 특별히 고려된다.
추가로, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 또한 고려될 수 있다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오티드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내생성 유전자이다. 최종 mRNA 및 단백질은 그럴 필요는 없지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기술 (예를 들어, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이타베이스 서열 비교)을 사용하여 동정될 수 있다.
그러므로, 다른 구체예에서, 돌연변이유발 접근법, 예컨대 부위-특이적 돌연변이유발법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원, 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열의 변이체 및/또는 유도체의 제조에 적용된다. 이러한 접근법에 의해서, 폴리펩티드 서열 중 특별한 변형은 그들을 코딩하는 기본 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발을 통해서 만들어질 수 있다. 이들 기술은 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 도입시켜서, 예를 들어 전술한 고려사항 중 하나 이상을 편입시켜서, 서열 변이체를 제조하고 검사하는 간단한 접근법을 제공한다.
부위-특이적 돌연변이유발법은 횡단하는 결실 접합부의 양쪽 측면 상에 안정한 듀플렉스를 형성하도록 서열 복잡성 및 충분한 크기의 프라이머 서열을 제공하기 위해서 바람직한 돌연변이의 DNA 서열을 코딩하는 특별한 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 통한 돌연변이체의 생산을 비롯하여, 인접한 뉴클레오티드의 충분한 수를 가능하게 한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드 그 자체의 특성을 개선시키거나, 변경시키거나, 감소시키거나, 변형시키거나, 또는 아니면 변화시키고/시키거나, 코딩된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 1차 서열을 변경시키기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 적용될 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 절편 또는 단편은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 통상적으로 실행되는 바와 같이, 예를 들어 화학 수단에 의해 단편을 직접적으로 합성시켜서 쉽게 제조될 수 있다. 또한, 단편은 핵산 복제 기술, 예컨대 미국 특허 제4,683,202호의 PCR™ 기술의 적용에 의해서, 재조합 생산을 위한 재조합 벡터로 선택된 서열을 도입하여, 그리고 분자 생물학 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지된 다른 재조합 DNA 기술에 의해서 수득될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY] 참조).
본 명세서에 기술된 바와 같이, 바람직한 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원, 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 임의의 상기의 것을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위해서, 폴리펩티드, 또는 기능성 균등물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 적절한 벡터 예컨대 복제-결함 아데노바이러스 벡터에 삽입된다. 적절한 벡터는 삽입된 코딩 서열 및 임의의 바람직한 링커의 전사 및 번역을 위해 필요한 엘리먼트를 함유한다. 면역학적 융합 파트너 예컨대 본 명세서에 기술된 것들을 발현시키기 위해서, 폴리펩티드, 또는 기능성 균등물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열는 당분야에 공지된 재조합 기술을 하용하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 적절한 벡터 예컨대 복제-결함 아데노바이러스 벡터에 삽입된다. 적절한 벡터는 삽입된 코딩 서열 및 임의의 바람직한 링커의 전사 및 번역을 위해 필요한 엘리먼트를 함유한다.
당업자가 이용할 수 있는 방법을 사용하여 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원 및 적절한 전사 및 번역 제어 엘리먼트를 코딩하는 서열을 함유하는 이들 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌 [in Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33]; [Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-259]; [Sambrook J, et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.], 및 [Ausubel FM, et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y]에 기술되어 있다. 일부 양상에서, 이들 방법은 또한 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다.
다양한 벡터/숙주 시스템이 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고 제조하는데 이용될 수 있다. 이들은 제한없이, 미생물 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 벡터 (예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함한다.
벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터에 존재하는 "제어 엘리먼트" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비번역 영역 - 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역이다. 이러한 엘리먼트는 그들 강도 및 특이성이 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 의존적으로, 항상성 및 유도성 프로모터를 포함하는, 임의 수의 적합한 전사 및 번역 엘리먼트가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 3부 리더 서열로 이루어진 Ad 전사/번역 복합체에 결찰될 수 있다. 다른 예로서, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 서열은 후기 프로모터 및 3부 리더 서열로 이루어진 Ad 전사/번역 복합체에 결찰될 수 있다. 바이러스 게놈의 불필수 E1 또는 E3 영역 내 삽입을 사용하여 감염된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생바이러스를 수득할 수 있다 (Logan J, et al. Proc. Natl. Acad. Sci 1984; 87:3655-59). 또한, 전사 인핸서, 예컨대 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
특이적 개시 신호가 또한 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 서열 및/또는 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 서열의 보다 효율적인 번역을 획득하는데 사용될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 폴리펩티드, 이의 개시 코돈, 및 상류 서열을 코딩하는 서열이 적절한 발현 벡터로 삽입되는 경우에, 추가적인 전사 또는 번역 제어 신호가 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 오직 코딩 서열, 또는 이의 일부만이 삽입된 경우에, ATG 개시 코돈을 포함하는 외생성 번역 제어 신호가 제공되어야 한다. 뿐만아니라, 개시 코돈은 전체 삽입부의 번역을 보장하도록 올바른 리딩 프레임으로 존재해야 한다. 외생성 번역 엘리먼트 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 예컨대 문헌에 기술된 것을 사용하는 특정한 세포 시스템에 적절한 인핸서의 포함에 의해 증강될 수 있다 (Scharf D., et al. Results Probl. Cell Differ. 1994; 20:125-62). 전사 또는 번역을 위한 특정한 종료 서열은 또한 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 효율적인 번역을 획득하도록 도입될 수 있다.
생성물에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 사용하여, 폴리뉴클레오티드-코딩된 생성물 (예를 들어, 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원)의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 공지되어 있다. 예에는 효소-연결 면역흡착성 어세이 (ELISA), 방사성면역어세이 (RIA), 및 형광발광 활성화된 세포 분류법 (FACS)을 포함한다. 소정 폴리펩티드 상의 2개의 비간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용하는 2-부위, 단일클론-기반 면역어세이가 일부 적용에서 사용될 수 있지만, 경쟁적 결합 어세이가 또한 적용될 수 있다. 이들 및 다른 어세이는 다른 것들 중에서도, 문헌 [Hampton R et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.)] 및 [Maddox DE, et al. J. Exp. Med. 1983; 758:1211-16]에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 바람직한 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원의 발현을 증가시키고/시키거나 바람직한 면역학적 융합 파트너의 발현을 증가시키는 엘리먼트는 본 명세서에 기술된 발현 구성체 또는 벡터 예컨대 아데노바이러스 벡터의 핵산 서열에 도입될 수 있다. 이러한 엘리먼트는 내부 리보솜 결합 부위 (IRES; Wang, et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1995; 203:99; Ehrenfeld, et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995; 203:65; Rees, et al. Biotechniques 1996; 20:102; Sugimoto, et al. Biotechnology 1994; 2:694)를 포함한다. IRES는 번역 효율을 증가시킨다. 또한, 다른 서열은 발현을 증강시킬 수 있다. 일부 유전자의 경우, 특히 5' 말단의 서열은 전사 및/또는 번역을 억제한다. 이들 서열은 일반적으로 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 팰린드롬이다. 전달하려는 핵산 중 임의의 이러한 서열은 일반적으로 결실된다. 전사물 또는 번역된 생성물의 발현 수준은 서열이 발현에 영향을 미치는 것을 확증하거나 또는 확인하기 위해 어세이된다. 전사물 수준은 노던 블롯 하이브리드화, RNase 프로브 보호 등을 포함하는, 임의의 기지 방법에 의해 어세이될 수 있다. 단백질 수준은 ELISA를 포함하는 임의의 기지 방법에 의해 어세이될 수 있다.
당업자가 인식하는 바와 같이, 이종성 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에 기술된 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터는 당분야에 공지된 재조합 기술, 예컨대 하기 문헌들에 기술된 것들을 사용해 생성될 수 있다: Maione, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:5986-91; Maione, et al. Hum Gene Ther 2000 1:859-68; Sandig, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000; 97:1002-07; Harui, et al. Gene Therapy 2004; 11:1617-26; Parks et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:13565-570; DelloRusso, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:12979-984; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY.
IX. 약학 조성물
특정 양상에서, 면역 반응을 생성시키려는 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 종양 항원은 제한없이 고형 또는 액상 종양 상에서 동정된 종양 네오-항원을 포함할 수 있다. 종양 네오-항원은 임의의 적합한 수단에 의해 동정될 수 있다. 일부 양상에서, 이들 약학 조성물은 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 벡터 스톡은 적절한 완충제, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 등과 조합될 수 있다. 특정 구체예에서, 적절한 수의 아데노바이러스 벡터 입자가 적절한 완충제, 예컨대 멸균 PBS 중에서 투여된다. 특정 상황에서, 본 명세서에 개시된 아데노바이러스 벡터 조성물을 비경구로, 종양내로, 정맥내로, 근육내로 또는 심지어 복강내로 전달되는 것이 바람직할 것이다.
특정 구체예에서, 자유 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 약학 조성물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물에 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, E2b 결실된 아데노바이러스 벡터는 삼켜서 또는 좌제로 전달되는 알약 형태로 전달될 수 있다.
주사용 용도에 적합한 예시적인 약학 형태는 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 및 멸균 수성 용액 또는 분산물을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,466,468호 참조). 모든 경우에서 그 형태는 멸균되어야 하고 용이한 시린지이용성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야만 하고 미생물, 예컨대 박테리아, 곰팡이, 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
담체는 예를 들어, 물, 지질, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해서 및/또는 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용을 통해 일어날 수 있다.
일 구체예에서, 수성 용액 중 비경구 투여를 위해서, 용액은 필요하면 적합하게 완충될 수 있고 먼저 액체 희석제가 충분한 염 또는 포도당과 등장성을 야기시킬 수 있다. 이들 특정한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 적용될 수 있는 멸균 수성 매질이 본 개시 내용의 관점에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1 용량을 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고 1000 mL의 피하주입 유체를 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 용량 중 일부 변동은 치료하려는 대상체의 병태에 따라서 필수적으로 일어날 것이다. 게다가, 인간 투여의 경우, 조제물은 물론 바람직하게 FDA 생물학 표준 사무국이 요구하는 멸균성, 발열원성, 및 일반 안전성 및 순도 표준을 충족할 것이다.
담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 더 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 통상의 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 치료적 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분이 또한 조성물에 도입될 수 있다. 어구 "약학적으로 허용가능한"은 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사하게 곤란한 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 의미한다.
본 명세서에 기술된 치료적 조성물의 경로 및 빈도를 비롯하여 용량은 개체 마다, 질환마다 다양할 것이고, 표준 기술을 사용해 쉽게 확립할 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물 및 백신은 주사 (예를 들어, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내 (예를 들어, 흡입), 알약 형태 (예를 들어, 삼킴, 질 또는 직장 전달용 좌제)로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 1 내지 3 용량이 6주 기간 동안 투여될 수 있고 추가의 부스터 백신접종은 그 이후에 주기적으로 제공될 수 있다.
예를 들어, 적합한 용량은 상기 기술된 바와 같이 투여시, 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 표적 항원 면역 반응을 촉진할 수 있는 아데노바이러스 벡터의 양이다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 기준 (즉, 미처리) 수준보다 적어도 10-50% 이상이다. 이러한 반응은 환자에서 표적 항원 항체를 측정하거나 또는 시험관내에서 종양 네오-에피토프 발현 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존적 생성에 의해서, 또는 면역 반응을 모니터링하기 위해 당분야에 공지된 다른 방법에 의해서 모니터링될 수 있다.
일반적으로, 적절한 용량 및 치료 용법은 예방적 이득을 제공하기에 충분한 양으로 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 보호성 면역 반응은 일반적으로 면역화 (백신접종) 이전 및 이후에 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 어세이를 사용하여 평가될 수 있다.
특정 양상에서, 환자 또는 대상체에게 투여되는 조성물의 실제 용량의 양은 물리적 및 생리적 인자 예컨대 체중, 병태의 중증도, 치료하려는 질환의 유형, 이전 또는 동시발생적 치료적 중재술, 환자의 특발증 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 임의 사건에서, 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들) 및 활성 성분(들)이 농도를 결정할 것이다.
본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 장점이 특히 Ad에 대한 기존 면역성을 갖는 개체에서, 동일한 아데노바이러스 벡터로 다수 백신접종을 투여하는 능력인 한편, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 백신은 또한 프라임 및 부스트 용법의 일부로서 투여될 수도 있다. 혼합 방법 프라임 및 부스터 접종 계획은 증강된 면역 반응을 야기할 수 있다. 따라서, 일 양상은 대상체를 플라스미드 백신, 예컨대 하나 이상의 종양 항원 예컨대 종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여, 적어도 1회 플라스미드 백신을 투여하여, 프라이밍시키고, 사전정해진 시간 길이가 지나게 하고 나서, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 벡터를 투여하여 부스팅시키는 방법이다. 다른 양상은 대상체를 플라스미드 백신, 예컨대 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 플라스미드 벡터를 사용해, 적어도 1회 플라스미드 백신을 투여하여 프라이밍시키고, 사전정해진 시간 길이가 지나게 하고 나서, 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 벡터를 투여하여 부스팅시키는 방법이다.
다수 프라이밍, 예를 들어, 1-3회가 적용될 수 있지만, 그 이상이 사용될 수 도 있다. 프라이밍과 부스트 사이의 시간 길이는 전형적으로 약 6개월 내지 1년으로 다양할 수 있지만, 다른 시간 기간이 사용될 수도 잇다.
특정 구체예에서, 약학 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 치료제, 예컨대 백신으로서 본 명세서에서 사용되는 발현 구성체 또는 벡터, 치료제가 적재된 나노소포체 또는 엑소솜, 또는 관련 지질 나노소포체를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 치료제는 약 2 중량% 내지 약 75 중량%의 단위, 또는 약 25 중량% 내지 약 60 중량%, 예를 들어, 그 안에서 유도가능한 임의 범위를 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상, 및 그 안에서 유도되는 임의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 열거된 수치의 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.
약학 조성물의 유효량은 의도하는 목표를 기반으로 결정된다. 용어 "단위 용량" 또는 "용량"는 대상체에서 사용하기 적합한 물리적 개별 단위를 의미하며, 각각의 단위는 이의 투여, 즉 적절한 경로 및 치료 용법과 연관된 상기 기술된 바람직한 반응을 생성시키도록 계산된 약학 조성물의 사전결정된-분량을 함유한다. 치료수 및 단위 용량 둘 모두에 따라서, 투여하려는 분량은 바람직한 효과 또는 보호성에 의존적이다.
약학 조성물의 정밀한 양은 또한 의사의 판단에 따라 좌우되고 각 개체에게 고유하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 환자의 신체 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도하는 치료 목표 (예를 들어, 증상의 완화 대 치유) 및 특정 치료 물질의 역가, 안정성 및 독성을 포함한다.
특정 양상에서, 백신접종 용법을 포함하는 조성물은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 임의 경로로 투여될 수 있고, 이러한 투여는 단일 및 다수 용량으로 수행될 수 있다. 보다 특히, 약학 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁물, 주사용 용액, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체는 고형 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비독성 유기 용매 등을 포함한다. 게다가, 이러한 경구 약학 제제는 이러한 목적에 일반적으로 적용되는 유형의 다양한 작용제를 통해서 적합하게 감미되고/되거나 풍미될 수 있다. 전반에 기술된 조성물은 약학적 약물로 제제화될 수 있고 이를 필요로 하는 인간 또는 포유동물을 치료하거나, 질환, 예를 들어 암을 진단하거나, 또는 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바이러스 벡터 또는 조성물은 하나 이상의 면역자극제, 예컨대 보조제와 함께 투여될 수 있다. 면역자극제는 본질적으로 항원에 대한 면역 반응 (항체 및/또는 세포-매개)을 증강시키거나 또는 강화시키는 임의의 물질을 의미한다. 면역자극제의 한 유형은 보조제를 포함한다. 많은 보조제는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질, 예컨대 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일, 및 면역 반응의 자극제, 예컨대 지질 A, 보르타델라 퍼투시스 (Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리암 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 유래 단백질을 함유한다. 특정 보조제는 예를 들어, 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제 (Difco Laboratories); Merck 보조제 65 (Merck and Company, Inc.) AS-2 (SmithKline Beecham); 알루미늄 염 예컨대 수산화알루미늄 겔 (alum) 또는 인산 알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당류; 양이온성 또는 음이온성 유도된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A와 같이 상업적으로 입수할 수 있다. 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및/또는 MIF, 및 기타, 성장 인자 등이 또한 보조제로서 사용될 수 있다.
특정 구체예 내에서, 보조제 조성물은 주로 Th1 유형의 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다. 높은 수준의 Th1-유형 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포-매개 면역 반응의 유도를 촉진하는 경향이 있다. 대조적으로, 높은 수준의 Th2-유형 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 촉진하는 경향이 있다. 본 명세서에서 제공되는 백신의 적용 이후에, 환자는 Th1-유형 및/또는 Th2-유형 반응을 포함하는 면역 반응을 지원할 수 있다. 반응이 주로 Th1-유형인, 특정 구체예 내에서, Th1-유형 사이토카인의 수준은 Th2-유형 사이토카인의 수준보다 상당한 정도로 증가될 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 어세이를 사용해 쉽게 평가될 수 있다. 따라서, 다양한 구체예는 복제-결함 바이러스 벡터 치료와 동시발생적으로 공급하는, 사이토카인, 예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및/또는 MIF를 사용하여, 표적 항원, 예를 들어 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 상승시키는 요법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 사이토카인 또는 사이토카인을 코딩하는 핵산이 본 명세서에 기술된 복제-결함 바이러스 벡터와 함께 투여된다. 일부 구체예에서, 사이토카인 투여는 바이러스 벡터 투여 이전 또는 이후에 수행된다. 일부 구체예에서, 표적 항원, 예를 들어 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있는 복제-결함 바이러스 벡터는 사이토카인을 코딩하는 서열을 더 포함한다.
주로 Th1-유형 반응을 유발시키기 위한 일정한 예시적인 보조제는 예를 들어, 알루미늄 염과 함께 모노포스포릴 지질 A, 예컨대 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질의 조합을 포함한다. MPL® 보조제는 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조). CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (여기서 CpG 디뉴클레오티드는 비메틸화됨)는 또한 주로 Th1 반응을 유도한다 (예를 들어, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호 참조). 면역자극성 DNA 서열이 또한 사용될 수 있다.
일부 구체예에서 사용을 위한 다른 보조제는 QS21 및 QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.), 에스신; 디지토닌; 또는 집소필라 (Gypsophila) 또는 케노포듐 퀴노사 (Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함하는, 사포닌, 예컨대 Quil A, 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 제제는 보조제 조합에 하나를 초과하는 사포닌, 예를 들어 QS21, QS7, Quil A, β-에스신, 또는 디지토닌을 포함하는 하기 군의 적어도 둘의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 비내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 비내 미세입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용하는 약물의 전달이 적용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,725,871호 참조). 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태인 예시적인 경점막 약물 전달이 적용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,780,045호 참조).
리포솜, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포체 등은 적합한 숙주 세포/유기체로 본 명세서에 기술된 조성물의 도입을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포체, 나노구, 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 전단을 위해 제제화될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기술된 조성물은 공유적으로 또는 비공유적으로 이러한 담체 비히클의 표면에 결합될 수 있다. 리포솜은 다양한 배양된 세포주 및 동물에게 유전자, 다양한 약물, 방사능치료제, 효소, 바이러스 전사 인자, 알로스테릭 이펙터 등을 효율적으로 도입시키는데 사용될 수 있다. 더 나아가서, 리포솜의 사용은 전신 전달 이후에 허용불가한 독성 또는 자가면역 반응과 연관된 것으로 보이지 않는다. 일부 구체예에서, 리포솜은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되어 자발적으로 다층 동심원 이중층 소포체 (즉, 다층 소포체 (MLV))를 형성한다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 벡터의 약학적으로 허용가능한 나노캡슐 제제를 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 약학 조성물을 포집할 수 있다. 세포내 중합체 과적으로 인한 부작용을 피하기 위해서, 이러한 초미세 입자 (대략 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용해 디자인될 수 있다.
특정 양상에서, 치료적 유효량의 IL-15 또는 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제-결함 벡터를 포함하는 약학 조성물이 이를 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 제공되는 하나 이상의 요법, 특히 하나 이상의 종양 네오-항원 또는 종양 네오-에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 아데노바이러스 벡터와 조합하여 투여될 수 있다.
인터루킨 15 (IL-15)는 IL-2와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인이다. IL-2처럼, IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬 (CD122) 및 공통 감마 사슬 (감마-C, CD132)로 구성된 복합체를 통해서 결합하여 신호전달한다. IL-15는 바이러스(들)에 의해 감염 후 단핵 식균세포 (및 일부 다른 세포)에 의해 분비된다. 이러한 사이토카인은 그 주요 역할이 바이러스 감염된 세포를 사멸시키는 것인 선천성 면역계의 세포; 자연 살해 세포의 세포 증식을 유도한다.
IL-15는 전임상 모델에서 CD8+ T 세포의 항종양 면역성을 증강시킬 수 있다. 전이성 흑색종 및 신장 세포 암종 (신장암)을 갖는 환자에서 IL-15의 항종양 효능, 용량, 및 안전성을 평가하기 위한 I기 임상 시험은 미국립 보건원에서 환자를 참여시켜 시작되었다.
본 명세서에 개시된 IL-15는 또한 이의 천연 형태의 기능을 유지하도록 변형된 IL-15의 돌연변이체를 포함할 수 있다.
IL-15는 마우스에서 염색체 8의 중추 영역, 및 염색체 4의 34 kb 영역 4q31에 의해 코딩되는 14-15 kDa 당단백질이다. 인간 IL-15 유전자는 9개 엑손 (1 - 8 및 4A) 및 8개 인트론을 포함하고, 그들 중 4개 (엑손 5 내지 8)가 성숙한 단백질을 코딩한다. 동일 단백질을 코딩하는 이 유전자의 2개의 선택적으로 스플라이싱된 전사물 변이체가 보고되었다. 48개 아미노산의 긴 신호 펩티드를 갖는 본래의 동정된 이포솜 (IL-15 LSP)은 316 bp 5'-미번역된 영역 (UTR), 486 bp 코딩 서열 및 C-말단 400 bp 3'-UTR 영역으로 이루어진다. 다른 이소폼 (IL-15 SSP)은 엑손 4A 및 5에 의해 코딩되는 21개 아미노산의 짧은 신호 펩티드를 갖는다. 양쪽 이소폼은 N-말단의 신호 서열 사이에 11개 아미노산을 공유하였다. 양쪽 이소폼이 동일한 성숙 단백질을 생산하지만, 그들은 그들의 세포 트래킹이 상이하다. IL-15 LSP 이소폼은 골지체 [GC], 초기 엔도솜 및 세포내 망상체 (ER)에서 동정되었다. 이것은 2개 형태로 존재하는데, 분비형 및 특히 수지상 세포 상의 막결합 형태이다. 다른 한편, IL-15 SSP 이소폼은 분비되지 않고 세포질 및 핵에 국한되어 세포 주기의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
IL-15 mRNA의 2개 이소폼은 마우스에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 것으로 입증되었다. 다른 3' 스플라이싱 부위를 함유하는 대안적 엑손 5를 갖는 이소폼은 높은 번역 효율을 보였고, 생성물은 N-말단의 신호 서열 내 소수성 도메인이 결여되어 있다. 이것은 이 이소폼에서 유래된 단백질은 세포내에 위치된다는 것을 시사한다. 대안적 엑손 5의 통합적 스프라이싱으로 생성된, 정상 엑손 5를 갖는 다른 이소폼은 세포외로 방출될 수 있다.
IL-15 mRNA가 비만 세포, 암 세포 또는 섬유아세포를 포함하는 많은 세포 및 조직에서 발견될 수 있지만, 이 사이토카인은 수지상 세포, 단핵구 및 마크로파지에 의해 주로 성숙한 단백질로서 생산된다. IL-15 mRNA의 광범위 출현 및 단백질의 제한된 생산 간 이러한 차이는 IL-15 mRNA의 번역을 억제할 수 있는, 인간에서 12개 및 마우스에서 5개의 상류 개시 코돈의 존재로 설명될 수 있을 것이다. 번역 불활성 mRNA는 세포 내에 저장되고 특이적 신호 시에 유도될 수 있다. IL-15의 발현은 사이토카인 예컨대 GM-CSF, 이중 가닥 mRNA, 비메틸화 CpG 올리고뉴클레오티드, Toll-유사 수용체 (TLR)을 통한 리포폴리사카라이드 (LPS), 인터페론 감마 (IFN-γ) 또는 헤르페스 바이러스, 마이코박테리움 튜버큘로시스 및 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)에 의한 단핵구의 감염 이후에 자극될 수 있다.
X. 자연 살해 (NK) 세포
특정 구체예에서, 천연 또는 조작된 NK 세포가 본 명세서에 기술된 아데노바이러스 벡터-기반 조성물 또는 면역요법과 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위해 제공될 수 있다.
면역계는 감염 및 질환으로부터의 보호에서 그 자신의 개별 역학을 각각 갖는 다양한 면역 세포 패밀리의 태피스트리(tapestry)이다. 이들 면역 세포 중에서, 신체 방어의 최전선 세포는 자연 살해, 또는 NK 세포이다. NK 세포는 다른 지원 분자에 의한 사전 노출 또는 활성화없이, 비정상 세포, 예컨대 암 또는 바이러스 감염된 세포를 신속하게 찾고 파괴하는 선천적 능력을 갖는다. 적응성 면역 세포 예컨대 T 세포와 대조적으로, NK 세포는 I기 임상 실험에서 세포-기반 "재고품 (off-the-shelf)" 치료로서 이용되었고, 암에 대한 종양 사멸 능력이 입증되었다.
1. aNK 세포
천연 NK 세포이외에도, 질환 세포가 종종 NK 세포의 사멸 기능을 회피하도록 이용하는, 사멸 억제 수용체 (KIR)를 발현하지 않는 환자에게 투여를 위한 NK 세포를 제공할 수 있다. 이러한 고유한 활성화된 NK, 또는 aNK, 세포는 질환 세포의 선택적 표적화 및 사멸을 할 수 있는 활성화 수용체의 광범위 어레이를 유지하면서 이들 억제성 수용체는 결여된다. aNK 세포는 또한 그랜자임 및 퍼포린 함유 과립의 보다 큰 페이로드를 보유하여서, 그들이 다수 표적에게 치명적인 효소의 훨씬 더 큰 페이로드를 전달할 수 있게 한다.
2. taNK 세포
키메라 항원 수용체 (CAR) 기술은 현재 개발 중인 가장 신규한 암 요법 접근법 중 하나이다. CAR은 면역 이펙터 세포가 특이적 표면 항원을 표시하는 암 세포를 표적화할 수 있게 하는 단백질 (target-activated Natural Killer (표적-활성화된 자연 살해))로서, aNK 세포가 암에서 발견되는 단백질을 표적화하도록 하나 이상의 CAR로 조작되고 이후에 CAR의 광범위 스펙트럼으로 통합되는 플랫폼이다. 이러한 전략은 특히 규모조절성, 품질 제어 및 일관성 관점에서, 자기유래 T-세포와 같은 환자 또는 도너 공급된 이펙터 세포를 사용하는 다른 CAR 접근법보다 다수의 장점을 갖는다.
많은 암 세포 사멸은 ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (항체 의존 세포-매개 세포독성))에 의존적인데 여기서 이펙터 면역 세포는 항체에 부착되어 있고, 이호에 표적 암 세포에 결합되어서, 이펙터 세포에 의한 암의 사멸을 촉진한다. NK 세포는 ADCC에 대한 신체 내 핵신 이펙터 세포이고 항체에 결합하기 위해 특수화 수용체 (CD16)를 이용한다.
3. HaNK 세포
실험은 아마도 인간 개체군의 오직 20%만이 균일하게 CD16의 "고친화성" 변이체를 발현하고, 이것은 "저친화성" CD16을 갖는 환자와 비교하여 보다 호의적인 치료적 결과와 강력하게 상관있다는 것을 보여준다. 추가적으로, 많은 암 환자는 화학요법, 질환 자체 또는 다른 인자로 인해 심각하게 약화된 면역계를 갖는다.
특정 양상에서, haNK 세포는 고친화성 CD16을 발현하도록 변형된다. 이와 같이, haNK 세포는 암 세포에 대해 유도된 광범위 스펙트럼의 항체의 치료적 효능을 강력하게 할 것이다.
XI. 병용 요법
전반에서 기술된 조성물은 약학적 약물로 제제화될 수 있고 이를 필요로 하거나 또는 질환, 예를 들어 암으로 진단된 인간 또는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 약물은 인간 또는 포유동물에게 하나 이상의 추가적인 백신과, 또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 통상적인 암 요법 또는 대안적인 암요법, 사이토카인 예컨대 IL-15 또는 이러한 사이토카인을 코딩하는 핵산 서열, 조작된 자연 살해 세포, 또는 면역 경로 체크포인트 조정인자와 함께 공동 투여될 수 있다.
통상적인 암요법은 화학적 또는 방사선 기반 치료 및 수술의 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 화학요법은 예를 들어, 시스플라틴 (CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드 (VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 젬시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 전술한 것의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함한다.
DNA 손상을 야기하고 광범위하게 사용된 방사선 요법은 γ-선, X-선이라고 일반적으로 알려진 것, 및/또는 종양 세포에 방사성동위원소의 지정 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자가 또한 고려되는데 예컨대 마이크로웨이브 및 UV-조사이다. 아마도 모든 이들 인자가 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 일으킬 것이다. X-선에 대한 선량 범위는 장기간 동안 (3 내지 4주) 50 내지 200 뢴트겐의 1일 용량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량 범위이다. 방사선동위원소에 대한 선량 범위는 광범위하게 다양하고, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 좌우된다.
세포에 적용시 용어 "접촉되는" 및 "노출되는"은 본 명세서에서 치료적 구성체 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포로 전달되거나 또는 표적 세포와 직접 병치로 위치되는 과정을 설명하는데 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 획득하기 위해서, 양쪽 작용제는 세포를 사멸시키거나 또는 분열을 방지하기에 유효한 조합된 양으로 세포에게 전달된다.
암 환자의 대략 60%가 예방적, 진단적 또는 병기확인, 치유적 및 고식적 수술을 포함하는, 일부 유형의 수술을 겪을 것이다. 치유적 수술은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료, 예컨대 본 명세서에 기술된 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체요법이다.
치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴하는 절개를 포함한다. 종양 절개는 종양의 적어도 일부분의 물리적 제거를 의미한다. 종양 절개이외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술, 및 현미경적 제어 수술 (모즈 (Mohs) 수술)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 치료 방법은 표피상 암, 전암, 또는 정상 조직의 부수적인 양의 제거와 함께 사용될 수 있다는 것을 더욱 고려한다.
암성 세포, 조직 또는 종양 전체의 일부분의 절제 시에, 구멍이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 추가적인 항암요법의 관류, 직접 주사 또는 국소 도포에 의해 수행될 수 있다. 이러한 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 역시 다양한 용량일 수 있다.
대체 암 요법은 수술, 화학요법 및 방사선 요법 이외의 임의의 암 요법, 예컨대 면역요법, 유전자 요법, 호르몬 요법 또는 이의 조합을 포함한다. 본 방법을 사용하여 불충분한 예후로 확인된 대상체는 통상의 치료(들) 단독에 대해 호의적인 반응을 갖지 않을 것이고 하나 이상의 대안적 암 요법 그 자체로 또는 하나 이상의 통상적인 치료와 조합하여 처방될 수 있거나 또는 투여될 수 있다.
면역요법제는 일반적으로 암 세포를 표적으로 하여 파괴시키는 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존적이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 이펙터로서 제공될 수 있거나 또는 세포 사멸을 실질적으로 실시하도록 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학요법제, 방사성핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 퍼투시스 독소 등)에 접합될 수 있고 단지 표적화제로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
유전자 요법은 질환을 치료하기 위해서 대상체 세포 및 조직으로 DNA 또는 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 삽입이다. 안티센스 요법은 또한 유전자 요법의 한 형태이다. 치료적 폴리뉴클레오티드는 처음 암 요법 이전에, 그 이후에 또는 동시에 투여될 수 있다. 다양한 단백질을 코딩하는 벡터의 전달이 특정 양상에서 고려된다. 예를 들어, 외생성 종양 억제인자 종양유전자의 세포 발현은 과도한 세포 증식을 억제하는 그들 기능을 발휘하며, 예컨대 p53, p16 및 C-CAM 등이다.
치료의 치료적 효능을 개선시키는데 사용되는 추가적인 작용제는 면역조정제, 세포 표면 수용체의 상향조절 및 GAP 접합부에 영향을 미치는 작용제, 세포분열억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 또는 아폽토시스 유도인자에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 작용제를 포함한다. 면역조정제는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타, 및 감마; IL-2 및 다른 사이토카인; F42K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1베타, MCP-1, RANTES, 및 다른 케모카인을 포함한다. 세포 표면 수용체 또는 그들 리간드 예컨대 Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL의 상향조절은 과증식성 세포에 대한 자기분비 또는 주변분비 효과의 확립에 의해서 아폽토시스 유도 능력을 강력하게 하는 것을 더욱 고려한다. GAP 접합부의 수 상승에 의한 세포내 신호전달의 증가는 이웃하는 과증식성 세포 개체군에 대한 항과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구체예에서, 세포분열억제제 또는 분화제는 치료의 항과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 명세서에 기술된 약학 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 부착의 억제제가 본 명세서에 기술된 약학 조성물의 효능을 개선시키는데 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 초점성 부착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감성을 증가시키는 다른 작용제, 예컨대 항체 c225가 치료 효능을 개선시키기 위해 본 명세서에 기술된 약학 조성물과 조합되어 사용될 수 있다는 것을 더욱 고려한다.
호르몬 요법은 또한 이전에 기술된 임의의 다른 암 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 호르몬의 사용은 특정 호르몬 예컨대 테스토스테론 또는 에스트로겐의 효과를 차단하거나 또는 그 수준을 저하시키도록 특정 암 예컨대 유방, 전립선, 난소 또는 자궁경부 암의 치료에서 적용될 수 있다. 이러한 치료는 종종 치료 선택안으로서 또는 전이 위험성을 감소시키기 위해 적어도 하나의 다른 암 요법과 조합하여 사용된다.
"화학요법제" 또는 "화학요법 화합물" 및 본 명세서에서 사용되는 그들의 문법적 균등물은 암의 치료에 유용한 화학적 화합물일 수 있다. 개시된 T 세포와 조합하여 사용할 수 있는 암 화학요법제는 제한없이, 유사분열 억제제 (빈카 알칼로이드)를 포함한다. 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 Navelbine™ (비노렐빈, 5'-노르안히드로블라스틴)을 포함한다. 역시 다른 구체예에서, 암 화학요법제는 토포이소머라제 I 억제제 예컨대 캠프토테신 화합물을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "캠프토테신 화합물"은 Camptosar™ (이리노테칸 HCL), Hycamtin™ (토포테칸 HCL) 및 캠프토테신 유래된 다른 화합물 및 이의 유사체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용할 수 있는 암 화학요법제의 다른 범주는 포도필로톡신 유도체, 예컨대 에토포시드, 테니포시드 및 미토포도지드이다.
특정 양상에서, 본 명세서에 기술된 방법 또는 조성물은 종양 세포 내 유전자 물질을 알킬화시키는 알킬화제로 알려진 다른 암 화학요법제의 사용을 더 포괄한다. 이들은 제한없이 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 니트로겐 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진을 포함한다. 개시내용은 화학요법제로서 항대사산물을 포괄한다. 이들 유형의 작용제의 예에는 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토푸린, 아자티오프림 및 프로카바진이 포함된다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용할 수 있는 암 화학요법제의 추가적인 범주는 항생제를 포함한다. 예에는 제한없이 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노바이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신을 포함한다. 이들은 이들 화합물에 대해 상업적으로 입수할 수 있는 수많은 리포솜 제제로 존재한다. 특정 양상에서, 본 명세서에 기술된 방법 또는 조성물은 제한없이 항종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하는 다른 암 화학요법제의 사용을 더 포괄한다.
본 명세서에 개시된 아데노바이러스 백신은 세포독성/항신생물제 및 항혈관생성제를 포함하는, 다른 항종양제와 조합하여 투여될 수 있다. 세포독성/항신생물제는 암 세포를 공격하여 사멸시키는 작용제로서 정의될 수 있다. 일부 세포독성/항신생물제는 종양 세포에서 유전자 물질을 알킬화시키는 알킬화제, 예를 들어 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 니트로겐 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진을 포함한다. 다른 세포독성/항신생물제는 종양 세포에 대한 항대사산물제일 수 있고, 예를 들어 시토신 아라비노시스, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토푸린, 아자티오프림 및 프로카바진일 수 있다. 다른 세포독성/항신생물제는 항생제, 예를 들어 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 입수할 수 있는 수많은 리포솜 제제가 존재한다. 여전히 다른 세포독성/항신생물제는 유사분열 억제제 (빈카 알칼로이드)일 수 있다. 이들은 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드를 포함한다. 다양한 세포독성/항신생물제는 탁솔 및 이의 유도체, L-아스파라기나제, 항종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미톡산트론 및 빈데신을 포함한다.
CAR T 세포, T 세포 수용체 조작 T 세포, B 세포 수용체 조작 세포의 개체군(들)을 포함하는 추가적인 제제가 본 명세서에 기술된 약학 조성물의 투여와 함께, 그 이전에 또는 그 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 양자적으로 전달된 세포의 치료적 유효 개체군이 본 명세서에 기술된 방법이 실시될 때 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010 CAR T 세포, T 세포 수용체 조작된 세포, 또는 B 세포 수용체 조작된 세포를 포함하는 제제가 투여된다. 일부 경우에서, 제제는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 의 조작된 세포, 약 5 x 105 내지 약 5 x 108 의 조작된 세포, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 의 조작된 세포를 포함한다. 그러나, 대상체에게 투여되는 조작된 세포의 수는 암의 위치, 공급원, 정체, 정도 및 중증도, 치료하려는 대상체의 연령 및 상태 등에 따라서, 광범위한 제한 사이에 다양할 것이다. 의사는 궁극적으로 사용하려는 적절한 용량을 결정할 것이다.
항혈관생성제가 또한 사용될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 적합한 항혈관생성제는 인간화 및 키메라 항체를 포함하는 항-VEGF 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 혈관생성의 다른 억제제는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터루킨 1 (α 및 β 포함) 인터루킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테이나제-1 및 메탈로프로테이나제-2 (TIMP-1 및 TIMP-2)의 조직 억제제를 포함한다. 토포이소머라제를 포함하는 소형 분자, 예컨대 라족산, 항혈관생성 활성을 갖는 토포이소머라제 II 억제제가 또한 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 예를 들어, 암을 치료하는 조성물, 제제 및 방법에서, 투여되는 조성물 또는 제제의 단위 용량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg일 수 있다. 일부 경우에서, 투여되는 조성물 또는 제제의 총량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 g일 수 있다.
XII. 면역학적 융합 파트너 항원 표적
본 명세서에 기술된 바이러스 벡터 또는 조성물은 표적 항원 예컨대 표적 항원, 표적 에피토프, 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프의 면원성을 증가시킬 수 있는, 단백질 또는 "면역학적 융합 파트너"를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 단백질을 함유하는 바이러스 벡터로 면역화된 후 생성되는 단백질은 관심 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 단백질 단백질에 융합된 관심 표적 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 더 나아가서, 양쪽 치료적 모이어티의 조합이 네오-에피토프 또는 표적 에피토프 단독, 또는 면역학적 융합 파트너 단독을 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터보다 면역 반응을 상승적으로 부스팅시키도 작용하여, 그 결과로 네오-에피토프 또는 표적 에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 면역 반응을 부스팅시킬 수 있다. 예를 들어, 네오-에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 항원-특이적 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포를 사멸시키도록 지정되는 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 기전을 통해 감염된 세포를 사멸시키도록 지정하는 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극, 또는 이의 임의 조합의 상승적 증강을 일으킬 수 있다. 이러한 상승적 부스트는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여 이후에 생존 결과를 엄청나게 개선시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 네오-에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상으로 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함하는 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 네오-에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터루킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 다른 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이에 의해 측정시 대조군과 비교하여 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상으로, 표적 항원-특이적 세포-매개 면역 활성의 증가를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 적절한 대조군과 비교하여 본 명세서에 기술된 네오-에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상체에서 1.5 내지 5배의 표적-특이적 항체 생산 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적-특이적 항체 생산 증가를 포함한다.
추가적인 예로서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 항원-특이적 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포를 사멸시키도록 지정된 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 기전을 통해 감염된 세포를 사멸시키도록 지정된 호중구 또는 단핵구 세포의 자극, 또는 이의 임의 조합의 상승적 증강을 일으킬 수 있다. 이러한 상승적 부스트는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여 이후에 생존 결과를 엄청나게 개선시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적 항원-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 표적 에피토프 항원 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적-특이적 CTL 활성의 증가를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여, 사이토카인 분비, 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터루킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 다른 사이토카인을 측정하는 ELISpot 어세이에 의해 측정시 표적 항원-특이적 세포-매개 면역 활성의 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 증가를 포함한다. 추가 구체예에서, 면역 반응의 생성은 적절한 대조군과 비교하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 투여한 대상체에서 1.5 내지 5배의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 반응의 생성은 대조군과 비교하여 아데노바이러스 벡터가 투여된 대상체에서 약 1.5 내지 20배, 또는 그 이상의 표적-특이적 항체 생산의 증가를 포함한다.
일 구체예에서, 이러한 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리움 종, 예컨대 마이코박테리움 튜버큘로시스-유래된 Ra12 단편으로부터 유래된다. 마이코박테리움 종으로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 47에 기재된 서열 중 어느 하나일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증강시키는데서 그들 사용을 위한 방법 및 Ra12 조성물은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제7,009,042호에 기술되어 있다. 간략하게, Ra12는 마이코박테리움 튜버큘로시스 MTB32A 핵산의 하위서열인 폴리뉴클레오티드 영역을 의미한다. MTB32A는 엠. 튜버큘로시스의 독성 및 무독성 균주의 유전자에 의해 코딩되는 32 kDa의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제7,009,042호; 문헌 [Skeiky et al., Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999)]을 참조하고, 그들 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킴). MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현될 수 있으며 정제 과정 전반에서 가용성 폴리펩티드로서 남아있을 수 있다. 게다가, Ra12는 그것이 융합되는 이종성 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14 kDa C-말단 단편을 포함할 수 있다. 다른 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 Ra12 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 적어도 약 15, 30, 60, 100, 200, 300, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 코딩하는 내생성 서열)을 포함할 수 있거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여, 코딩된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 실질적으로 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 천연 Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 또는 90%의 동일성 또는 그 이상을 가질 수 있다.
특정 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 박테리아 해모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질인, 단백질 D로부터 유래될 수 있다. 단백질 D로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 서열번호 48에 기재된 서열일 수 있다. 일부 경우에서, 단백질 D 유도체는 단백질의 대략 1/3 (예를 들어, 처음 N-말단의 100-110개 아미노산)을 포함할 수 있다. 단백질 D 유도체는 지지화될 수 있다. 특정 구체예 내에서, 지질단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 추가적인 외생성 T-에피토프를 갖는 폴리펩티드를 제공하도록 N-말단 상에 포함되어서, 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킬 수 있고 발현 인핸서로서 기능할 수 있다. 지질 꼬리부는 항원 제시 세포에게 항원의 최적 제시를 보장할 수 있다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스 유래의 비구조적 단백질, NS1 (헤마글루티닌)을 포함할 수 있다. 전형적으로, N-말단 81개 아미노산이 사용되지만, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편이 사용될 수도 있다.
특정 양상에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 알려진 단백질, 또는 이의 일부분 (특히 C-말단 부분)일 수 있다. LYTA로부터 유래된 면역학적 융합 파트너는 서열번호 49에 기재된 서열일 수 있다. LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래되며, 아미다제 LYTA라고 알려진 N-아세틸-L-알라닌 마이다제 (LytA 유전자에 의해 코딩됨)를 합성한다. LYTA는 펩티도글리칸 골격 내 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가분해소이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 일부 콜린 유사체 예컨대 DEAE와의 친화성을 담당한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이.콜라이 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발을 위해 활용되었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 적용될 수 있다. 다른 구체예 내에서, LYTA의 반복부가 융합 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 반복부는 예를 들어 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견될 수 있다. 하나의 특정한 반복부는 잔기 188-305를 도입한다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, 본 명세서에서 "면역원성 성분"이라고도 하는 면역학적 융합 파트너에 융합된다. 표적 항원 융합은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 중 하나 이상과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 표적 항원 융합은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF 중 하나 이상과 실질적인 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원 융합은 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, 본 명세서에서 "면역원성 성분"이라고도 하는, 하나 이상의 면역학적 융합 파트너를 더 포함한다. IFN-γ의 서열은 제한없이, 서열번호 50에 기재된 서열일 수 있다. TNFα의 서열은 제한없이, 서열번호 51에 기재된 서열일 수 있다. IL-2의 서열은 제한없이, 서열번호 52에 기재된 서열일 수 있다. IL-8의 서열은 제한없이, 서열번호 53에 기재된 서열일 수 있다. IL-12의 서열은 제한없이, 서열번호 54에 기재된 서열일 수 있다. IL-18의 서열은 제한없이, 서열번호 55에 기재된 서열일 수 있다. IL-7의 서열은 제한없이, 서열번호 56에 기재된 서열일 수 있다. IL-3의 서열은 제한없이, 서열번호 57에 기재된 서열일 수 있다. IL-4의 서열은 제한없이, 서열번호 58에 기재된 서열일 수 있다. IL-5의 서열은 제한없이, 서열번호 59에 기재된 서열일 수 있다. IL-6의 서열은 제한없이, 서열번호 60에 기재된 서열일 수 있다. IL-9의 서열은 제한없이, 서열번호 61에 기재된 서열일 수 있다. IL-10의 서열은 제한없이, 서열번호 62에 기재된 서열일 수 있다. IL-13의 서열은 제한없이, 서열번호 63에 기재된 서열일 수 있다. IL-15의 서열은 제한없이, 서열번호 64에 기재된 서열일 수 있다. IL-16의 서열은 제한없이, 서열번호 109에 기재된 서열일 수 있다. IL-17의 서열은 제한없이, 서열번호 110에 기재된 서열일 수 있다. IL-23의 서열은 제한없이, 서열번호 111에 기재된 서열일 수 있다. IL-32의 서열은 제한없이, 서열번호 112에 기재된 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, , IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, 본 명세서에서 "면역원성 성분"이라고도 하는, 면역학적 융합 파트너와 융합되거나 또는 그에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF의 군으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는, 본 명세서에서 "면역원성 성분"이라고도 하는, 면역학적 융합 파트너와 세포에서 공동발현된다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 CpG ODN (비제한적인 예의 서열은 서열번호 65로 기재됨), 콜레라 독소 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 66으로 기재됨), 박테리아 ADP-리보실화 외독소로부터 유래된 절두형 A 서브유닛 코딩 영역 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 67로 기재됨), 박테리아 ADP-리보실화 외독소로부터 유래된 절두형 B 서브유닛 코딩 영역 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 68로 기재됨), Hp91 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 69로 기재됨), CCL20 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 70으로 기재됨), CCL3 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 71로 기재됨), GM-CSF (비제한적인 예의 서열은 서열번호 72로 기재됨), G-CSF (비제한적인 예의 서열은 서열번호 73으로 기재됨), LPS 펩티드 모방체 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 74 - 서열번호 85로 기재됨), 시가 독소 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 86으로 기재됨), 디프테리아 독소 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 87로 기재됨), 또는 CRM197 (비제한적인 예의 서열은 서열번호 90으로 기재됨)을 포함하는, 면역학적 융합 파트너와 융합되거나 또는 그에 연결된다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 IL-15 초효현제를 포함하는 면역학적 융합 파트너와 융합되거나 또는 그에 연결된다. 인터루킨 15 (IL-15)는 바이러스 감염 이후에 분비되는 천연 발생 염증성 사이토카인이다. 분비된 IL-15는 이펙터 면역 세포 상의 이의 동족 수용체를 통한 신호전달에 의해 이의 기능을 수행할 수 있고, 그리하여 이펙터 면역 세포 활성의 전반적인 증강을 초래할 수 있다.
세포 면역 반응을 자극하고 유지시키는 IL-15의 광범위한 능력을 기반으로 특정 암을 잠재적으로 치유할 수 있는 유망한 면역요법적 약물이라고 여겨진다. 그러나, IL-15의 임상 개발에서 주요한 한계는 표준 포유동물 세포 발현 시스템에서의 낮은 생산 수율 및 짧은 혈청 반감기를 포함한다. 게다가, 자유 IL-15 사이토카인보다는, 동일 세포에 의해 공동발현된 단백질을 포함하는 IL-15:IL-15Rα 복합체는 IL-15 βγc 수용체를 보유하는 면역 이펙터 세포를 자극시키는 원인일 수 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해서, IL-15Rβγc에 결합하는 증가된 능력 및 증강된 생물학적 활성을 갖는 신규한 IL-15 초효현제 돌연변이 (IL-15N72D)가 동정되었다. 동일 몰 농도의 IL-15N72D에 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 영역)의 첨가는 IL-15 생물학적 활성의 증가를 더 제공할 수 있고, 그리하여 IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 초효현제 복합체는 자유 IL-15 사이토카인보다 10배를 초과하여 적은 IL-15-의존적 세포 성장을 지원하는 중간 유효 농도 (EC50)를 나타낸다.
일부 구체예에서, IL-15 초효현제는 신규한 IL-15 초효현제 돌연변이체 (IL-15N72D)일 수 있다. 특정 구체예에서, 동일 몰 농도의 IL-15N72D에 마우스 또는 인간 IL-15Rα 및 Fc 융합 단백질 (면역글로불린의 Fc 영역)의 첨가는 IL-15 생물학적 활성의 증가를 더 제공할 수 있고, 그리하여 IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 초효현제 복합체는 자유 IL-15 사이토카인보다 10배를 초과하게 낮을 수 있는 IL-15-의존적 세포 성장을 뒷받침하는 중간 유효 농도 (EC50)를 나타낸다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 개시내용은 자유 IL-15 사이토카인보다 2배 초과로 낮거나, 3배 초과로 낮거나, 4배 초과로 낮거나, 5배 초과로 낮거나, 6배 초과로 낮거나, 7배 초과로 낮거나, 8배 초과로 낮거나, 9배 초과로 낮거나, 10배 초과로 낮거나, 15배 초과로 낮거나, 20배 초과로 낮거나, 25배 초과로 낮거나, 30배 초과로 낮거나, 35배 초과로 낮거나, 40배 초과로 낮거나, 45배 초과로 낮거나, 50배 초과로 낮거나, 55배 초과로 낮거나, 60배 초과로 낮거나, 65배 초과로 낮거나, 70배 초과로 낮거나, 75배 초과로 낮거나, 80배 초과로 낮거나, 85배 초과로 낮거나, 90배 초과로 낮거나, 95배 초과로 낮거나, 또는 100배 초과로 낮은 IL-의존적 세포 성장의 지원에 대한 EC50로 IL-15N72D:IL-15Rα/Fc 초효현제 복합체를 제공한다.
일부 구체예에서, IL-15 수퍼 효현제는 ALT-803으로 알려진, 가용성 IL-15Rα/Fc 융합 단백질의 이량체 및 2개 IL-15N72D 분자의 생물학적 활성 단백질 복합체이다. ALT-803의 조성물 및 ALT-803의 사용 및 제조 방법은 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 공개 특허 출원 2015/0374790에 기술되어 있다. N 말단에 소위 "sushi" 도메인 (Su)을 함유하는 가용성 IL-15Rα 단편은 고친화성 사이토카인 결합을 담당하는 대부분의 구조적 엘리먼트를 포유할 수 있는 것으로 알려져 있다. 가용성 융합 단백질은 Fc 도메인 (232개 아미노산)을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 영역과 인간 IL-15RαSu 도메인 (성숙한 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1-65)을 연결시켜 생성될 수 있다. 이러한 IL-15RαSu/IgG1 Fc 융합 단백질은 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법을 사용한 정제의 용이함 및 IgG1 도메인을 통해서 디술피드 결합을 통한 이량체 형성의 장점을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, ALT-803은 이량체 IL-15Rα sushi 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질과 높은 친화성으로 회합된 인간 IL-15 변이체의 2개 단백질 서브유닛으로 이루어진 가용성 복합체를 가질 수 있다. IL-15 변이체는 헬릭스의 위치 72에서 Asp로 Asn의 치환 (N72D)을 갖는 성숙한 인간 IL-15 사이토카인 서열을 포함하는 114개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 IL-15R sushi 도메인/인간 IgG1 Fc 융합 단백질은 Fc 도메인 (232개 아미노산)을 함유하는 인간 IgG1 CH2-CH3 영역과 연결된 IL-15R 서브유닛의 sushi 도메인 (성숙한 인간 IL-15Rα 단백질의 아미노산 1-65)을 포함한다. N72D 치환이외에, 모든 단백질 서열은 인간의 것이다. 서브유닛의 아미노산 서열을 기반으로 2개 IL-15N72D 폴리펩티드 (예를 들어 IL-15N72D 서열은 서열번호 88로 기재됨) 및 디술피드 연결된 동종이량체 IL-l5RαSu/IgG1 Fc 단백질 (예를 들어, IL-15RαSu/Fc 도메인은 서열번호 89로 기재됨)을 포함하는 복합체의 계산된 분자량은 92.4 kDa이다. 일부 구체예에서, 표적 항원 및 ALT-803을 코딩하는 재조합 벡터는 표적 항원을 코딩하기 위한 본 명세서에 기술된 임의 서열을 가질 수 있고 ALT-803을 코딩하기 위해, 임의 순서로, 서열번호 88, 서열번호 88, 및 서열번호 89를 가질 수 있다.
각각의 IL-15N720 폴리펩티드는 대략 12.8 kDa의 계산된 분자량을 가지고 IL-15RαSu/IgG 1 Fc 융합 단백질은 대략 33.4 kDa의 계산된 분자량을 갖는다. IL-15N72D 및 IL-15RαSu/IgG 1 Fc 단백질 둘 모두는 당화될 수 있고 그 결과로 크기 배제 크로마토그래피에 따라 대략 114 kDa의 ALT-803의 겉보기 분자량이 얻어질 수 있다. ALT-803에 대해 결정된 등전점 (pI)은 대략 5.6 내지 6.5 범위일 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 pH 7에서 음으로 하전될 수 있다.
네오-에피토프 및 ALT-803을 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 면역 반응을 부스팅시킬 수 있고, 그리하여 양쪽 치료적 모이어티의 조합은 단독 요법보다 면역 반응을 상승적으로 부스팅하도록 작용한다. 예를 들어, 네오-에피토프 및 ALT-803을 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 항원-특이적 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극, 감염된 세포를 사멸시키도록 지정되는 NK 세포 반응의 자극, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 또는 항체 의존적 세포 식균작용 (ADCP) 기전을 통한 감염된 세포를 사멸시키도록 지정되는 호중구 또는 단핵구 세포 반응의 자극의 상승적 증강을 초래할 수 있다. 네오-에피토프 항원 및 ALT-803을 코딩하는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터와의 병용 요법은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여 이후에 생존 결과를 엄청나게 개선시키도록, 상기 반응 중 어느 하나, 또는 상기 반응의 조합을 상승적으로 부스팅시킬 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 면역원성 증강제는 본 명세서에 기술된 임의의 재조합 벡터를 사용하여, 동일한 재조합 벡터에서 면역원성 증강제 및 표적 항원을 박현시켜 표적 항원에 융합시킬 수 있거나 또는 그에 연결될 수 있다.
이러한 면역원성 증강제를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 39 - 서열번호 90 중 어느 하나일 수 있고 표 1에 요약하였다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
일부 구체예에서, 표적 항원 및 면역학적 융합 파트너에 대한 핵산 서열은 임의 핵산에 의해 분리되지 않는다. 다른 구체예에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열이 본 명세서에 기술된 임의 표적 항원을 코딩하는 핵산 서열과 본 명세서에 기술된 임의의 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 핵산 서열 사이에 삽입될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 항원, 링커, 및 면역학적 융합 파트너를 함유하는 바이러스 벡터로 면역화 이후에 생산되는 단백질은 링커가 후속되고 면역학적 융합 파트너로 종결되는 관심 표적 항원을 포함하고, 그리하여 링커를 통해서 표적 항원의 면역원성을 증가시키는 면역학적 융합 파트너에 표적 항원을 연결시킨, 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커 핵산의 서열은 약 1 내지 약 150개 핵산 길이, 약 5 내지 약 100 핵산 길이, 또는 약 10 내지 약 50 핵산 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기를 코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커의 아미노산 서열은 길이가 약 1 내지 약 50개, 또는 약 5 내지 약 25개 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커의 서열은 10개 미만의 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 폴리알라닌 링커, 폴리글리신 링커, 또는 알라닌과 글리신 둘 모두를 갖는 링커일 수 있다.
이러한 링커를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 91 - 서열번호 105 중 어느 하나일 수 있고 표 2에 요약하였다.
Figure pat00010
XIII. 공자극성 분자
종양 네오-에피토프 또는 네오-항원을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신의 사용이외에도, 공자극성 분자가 면역원성을 증가시키게 될 상기 백신에 도입될 수 있다.
면역 반응의 개시는 APC에 의한 나이브 T 세포의 활성화를 위해 적어도 2종의 신호를 요구한다 (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84:3261-82 (1994); Hellstrom, et al. Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); Hodge, et al. Cancer Res 39:5800-07 (1999)). 항원 특이적 제1 신호는 펩티드/주요 조직적합성 복합체 (MHC)를 통해 T 세포 수용체 (TCR)로 전달되어 T 세포의 세포 주기에 진입하게 한다. 제2 또는 공자극성 신호는 사이토카인 생산 및 증식을 위해 전달될 수 있다.
전문적인 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에서 정상적으로 발견되는 적어도 3종의 별개 분자가 T 세포 활성화에 핵심적인 제2 신호를 제공할 수 있다고 보고되었다: B7-1 (CD80), ICAM-1 (CD54), 및 LFA-3 (인간 CD58) (Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992); Guinan, et al. Blood 84: 3261-82 (1994); Wingren, et al. Crit Rev Immunol 15: 235-53 (1995); Parra, et al. Scand. J Immunol 38: 508-14 (1993); Hellstrom, et al. Ann NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); Parra, et al. J Immunol 158: 637-42 (1997); Sperling, et al. J Immunol 157: 3909 -17 (1996); Dubey, et al. J Immunol 155: 45-57 (1995); Cavallo, et al. Eur J Immunol 25: 1154 -62 (1995)).
이들 공자극성 분자는 별개의 T 세포 리간드를 갖는다. B7-1는 CD28 및 CTLA-4 분자와 상호작용하고, ICAM-1은 CD11a/CD18 (LFA-1b2 인테그린) 복합체와 상호작용하고, LFA-3은 CD2 (LFA-2) 분자와 상호작용한다. 그러므로, 특정 구체예에서, 표적 항원 예컨대 종양 네오-항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 재조합 아데노바이러스-기반 벡터 백신과 조합시, 특이적 표적 항원에 대한 항 종양 면역 반응을 더욱 증가/증강시키게 되는, 각각 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3을 함유하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 갖는 것이 바람직하다.
XIV. 면역 경로 체크포인트 조정인자
특정 구체예에서, 면역 경로 체크포인트 억제제는 본 명세서에 개시된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 조합된다. 일부 경우에서, 체크포인트 억제제에 의해 촉발된 T 세포는 보존된 자기-항원보다는 비동의적 돌연변이로부터 유래된 환자-특이적 및 암-특이적 네오-에피토프를 인식한다. 전처리 및 후처리 종양 조직의 전체-엑솜 시퀀싱은 특히 높은 돌연변이가 부담성이 있는 2가지 유형의 암인 인간 흑색종 및 비소세포 폐암에서 전처리 비동의적 돌연변이의 빈도와 체크포인트 억제에 대한 임상 반응의 강력한 연관성을 밝혀주었다.
본 명세서는 아데노바이러스-기반 조성물 및/또는 면역 경로 체크포인트 억제제로 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 단계 이후에 암 샘플을 시퀀싱하는 단계를 포함하는 치료 방법을 개시할 수 있다. 시퀀싱은 신규한 표적 네오-에피토프를 동정할 수 있다. 시퀀싱은 제2 아데노바이러스-기반 조성물 예컨대 제2 백신에 포함시키려는 신규한 네오-에피토프를 동정할 수 있다. 일부 구체예에서, 환자는 시퀀싱에 의해 동정될 수 있는 네오-에피토프에 대해 백신접종된다. 일부 구체예에서, 환자는 본 명세서에 기술된 백신 또는 약학 조성물과 함께 면역 경로 체크포인트 억제제를 수용하였다.
추가 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 면역 경로 체크포인트 조정인자와 함께 투여된다. 활성화 및 억제성 신호 간 균형은 T 림프구와 질환 세포 간 상호작용을 조절하며, 여기서 T-세포 반응은 T-세포 수용체 (TCR)에 의한 항원 인식을 통해 개시된다. 억제성 경로 및 신호는 면역 경로 체크포인트라고 한다. 정상적 상황에서, 면역 경로 체크포인트는 자가면역의 제어 및 예방에서 핵심적인 역할을 하고 또한 병원체 감염에 대응하여 조직 손상으로부터 보호한다.
특정 구체예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 면역 경로 체크포인트 억제성 경로를 조정하기 위한 바이러스 벡터-기반 백신 및 조성물을 포함하는 병용 면역요법을 제공한다. 일부 구체예에서, 조정은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 증가이다. 일부 구체예에서, 조정은 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소이다. 일부 구체예에서, 조정은 유전자 또는 단백질 패밀리에 영향을 미친다.
일반적으로, 면역 억제성 경로는 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시된다. 질환에서, 질환이 대상체에서 면역 저항성을 유도하기 위한 기전으로서 면역-체크포인트 경로를 끌어들일 수 있다는 것은 이제 분명하다.
소정 질환에 의해 대상체에서 면역 저항성 또는 면역 억제성 경로의 유도는 분자 조성물 예컨대 siRNA, 안티센스, 소형 분자, 모방체, 리간드, 수용체 또는 단백질의 재조합 형태, 또는 면역 억제성 경로 중 하나 이상을 조정하는 것으로 알려진 항체 (IgG 융합 단백질일 수 있음)에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, 면역-체크포인트 단백질의 차단제, 예컨대 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA4) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD1)에 의한 예비 임상 결과는 항면역 면역성을 증가시킬 가능성을 보여주었다.
질환 세포가 다수의 억제성 리간드를 발현할 수 있고, 질환-침윤성 림프구가 다수의 억제성 수용체를 발현할 수 있기 때문에, 면역 경로 체크포인트 단백질의 이중 또는 삼중 차단은 항질환 면역성을 증강시킬 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 병용 면역요법은 하기의 면역-체크포인트 단백질 중 하나 이상을 표적화하는 면역 경로 체크포인트 조정인자를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포함할 수 있다: PD1, PDL1, PDL2, CD28, CD80, CD86, CTLA4, B7RP1, ICOS, B7RPI, B7-H3 (CD276이라고도 함), B7-H4 (B7-S1, B7x 및 VCTN1이라고도 함), BTLA (CD272라고도 함), HVEM, KIR, TCR, LAG3 (CD223이라고도 함), CD137, CD137L, OX40, OX40L, CD27, CD70, CD40, CD40L, TIM3 (HAVcr2라고도 함), GAL9, A2aR 및 아데노신.
일부 구체예에서, 분자 조성물은 siRNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 조성물은 소형 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 조성물은 리간드의 재조합 형태를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 조성물은 수용체의 재조합 형태를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 조성물은 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 요법은 하나를 초과하는 분자 조성물 및/또는 하나를 초과하는 유형의 분자 조성물을 포함한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 면역 체크포인트 억제성 경로의 향후 발견되는 단백질을 또한 본 개시내용에 포괄하고자 한다.
일부 구체예에서, 병용 면역요법은 CTLA4의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 PD1의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 PDL1의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 LAG3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 B7-H3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 B7-H4의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 면역요법은 TIM3의 조정을 위한 분자 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조정의 발현의 증가 또는 증강이다. 다른 구체예에서, 조정은 발현의 부재의 감소이다.
2가지 비제한적인 예의 면역 경로 체크포인트 억제제는 세포독성 T 림프구 연관 항원-4 (CTLA-4) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD1)을 포함한다. CTLA-4는 T-세포 활성화의 초기 단계를 조절하는 T-세포 상에서 독점적으로 발현될 수 있다. CTLA-4는 T-세포 활성을 억제하는 신호를 야기할 수 있는 공자극성 T-세포 수용체 CD28과 상호작용한다. TCR 항원 인식이 일어나면, CD28 신호전달은 TCR 신호전달을 증강시킬 수 있고, 일부 경우에서는 활성화된 T-세포를 야기시키고 CTLA-4는 CD28의 신호전달 활성을 억제한다. 본 개시내용은 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 항-CTLA-4 단일클론 항체와 조합되는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 면역요법을 제공한다. 본 개시내용은 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 CTLA-4 분자 조성물과 조합한 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 백신 또는 면역요법을 제공한다.
프로그램된 사멸 세포 단백질 리간드-1 (PDL1)는 B7 패밀리의 구성원이고 다양한 조직 및 세포 유형에 분포되어 있다. PDL1은 PD1과 상호작용하여 T-세포 활성화 및 CTL 매개 용해를 억제한다. PDL1의 유의한 발현이 다양한 인간 종양에서 입증되었고 PDL1 발현은 종양이 숙주 항종양 면역 반응을 회피하는 핵심 기전 중 하나이다. 프로그램된 사멸-리간드 1 (PDL1) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD1)은 면역 경로 체크포인트로서 상호작용한다. 이러한 상호작용은 항-종양 면역 반응 및 후속 종양 진행의 둔화를 야기시키는 주요 내성 기전일 수 있다. PD1은 활성화된 T 세포 상에 존재하고, PD1의 주요 리간드인 PDL1은 종종 종양 세포 및 항원-제시 세포 (APC)를 비롯하여 B 세포를 포함한 다른 세포 상에서 발현된다. PDL1의 유의한 발현이 HPV-연관 두경부암을 포함한 다양한 인간 종양에서 입증되었다. PDL1은 T 세포 상의 PD1과 상호작용하여 T 세포 활성화 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 매개 용해를 억제한다. 본 개시내용은 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 항-PD1 또는 항-PDL1 단일클론 항체와 조합하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 면역요법을 제공한다.
특정 구체예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해서 PD1 또는 항-PDL1 분자 조성물과 조합하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구체예는 암 및 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해서 항-CTLA-4 및 항-PD1 단일클론 항체와 조합하여 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구체예는 항-CTLA-4 및 PDL1 단일클론 항체와 조합하여 본 명세서에 제공되는 바와 같은 면역요법을 제공할 수 있다. 특정 구체예는 암 및 감염성 질환의 치료를 위해서, 항-CTLA-4, 항-PD1, 항-PDL1 단일클론 항체, 또는 이의 조합과 조합하여 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 백신 또는 면역요법을 제공할 수 있다.
면역 경로 체크포인트 분자는 T 세포에 의해 발현될 수 있다. 면역 경로 체크포인트 분자는 면역 반응을 하향조정하거나 또는 억제하기 위한 "브레이크"로서 효율적으로 제공될 수 있다. 면역 경로 체크포인트 분자는 제한없이, 면역 세포를 직접적으로 억제하는, 프로그램된 사멸 1 (PD1 또는 PD-1, PDCD1 또는 CD279라고도 알려짐, 수탁 번호: NM_005018), 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4, CD152라고도 함, 유전자은행 수탁 번호 AF414120.1), LAG3 (CD223이라고도 함, 수탁 번호: NM_002286.5), Tim3 (간염 A 바이러스 세포 수용체 2 (HAVCR2)로도 알려짐, 유전자은행 수탁 번호: JX049979.1), B 및 T 림프구 연관 (BTLA) (CD272라고도 알려짐, 수탁 번호: NM_181780.3), BY55 (CD160이라고도 알려짐, 유전자은행 수탁 번호: CR541888.1), TIGIT (IVSTM3으로도 알려짐, 수탁 번호: NM_173799), LAIR1 (CD305라고도 알려짐, 유전자은행 수탁 번호: CR542051.1), SIGLECIO (유전자은행 수탁 번호: AY358337.1), 자연 살해 세포 수용체 2B4 (CD244라고도 알려짐, 수탁 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIFl, ILIORA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3을 포함한다. 예를 들어, PD1은 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해서 아데노바이러스 벡터-기준 조성물과 조합될 수 있다.
표적화할 수 있는 추가적인 면역 경로 체크포인트는 아데노신 A2a 수용체 (ADORA), CD276, V-set 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1 (VTCN1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1 (IDO1), 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체, 3개 도메인, 긴 세포질 꼬리부, 1 (KIR3DL1), T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 억제인자 (VISTA), 사이토카인 유도성 SH2-함유 단백질 (CISH), 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT), 아데노-연관 바이러스 통합 부위 1 (AAVS1), 또는 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5 (유전자/위유전자) (CCR5), 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
빠짐없이 철저한 것은 아니지만, 표 3은 본 명세서에 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 효율을 개선시키도록 불활성화될 수 있는 예시적인 면역 경로 체크포인트 유전자를 보여준다. 면역 경로 체크포인트 유전자는 표 1에 열거된 이러한 유전자 및 공억제성 수용체 기능, 세포 사멸, 사이토카인 신호전달, 아르기닌 트립토판 결핍, TCR 신호전달, 유도된 T-reg 억제, 고갈 또는 아네르기를 제어하는 전사 인자, 및 저산소증 매개 내성에 관여되는 다른 것들로부터 선택될 수 있다.
Figure pat00011
아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조정인자의 조합은 작용제 단독과 비교하여, 치료되는 환자에서 질환의 감염, 진행 또는 증상의 감소를 야기시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조정인자의 조합은 작용제 단독과 비교하여, 치료되는 환자의 개선된 전체 생존율을 야기시킬 수 있다. 일부 경우에서, 아데노바이러스-기반 조성물 및 면역 경로 체크포인트 조정인자의 조합은 작용제 단독과 비교하여 치료되는 환자에서 질환-특이적 T 세포 반응의 빈도 또는 강도를 증가시킬 수 있다.
특정 구체예는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 효율을 개선시키기 위한 면역 경로 체크포인트 억제제의 사용을 제공할 수 있다. 특정 면역 경로 체크포인트 억제제는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 시점에 투여될 수 있다. 특정 면역 경로 체크포인트 억제제는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 이후에 투여될 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 아데노바이러스 백신 투여와 동시에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 백신접종 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60분에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간에 일어날 수 있다. 일부 경우에서, 면역 억제는 백신접종 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 일어날 수 있다. 면역 경로 체크포인트 억제는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물의 투여 이전 또는 이후 임의 시기에 일어날 수 있다.
다른 양상에서, 항원 및 면역 경로 체크포인트 조정인자를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 백신을 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 면역 경로 체크포인트 단백질, 예를 들어 PD1, 및 대상체 세포 상에서 이의 천연 결합 파트너(들)의 하향조절로 이득을 얻는 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
면역 경로 체크포인트 조정인자는 임의 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물과 조합될 수 있다. 예를 들어, 항원은 종양 항원, 예컨대 종양 네오-항원 또는 종양 네오-에피토프, 또는 본 명세서에 기술된 임의 항원일 수 있다.
면역 경로 체크포인트 조정인자는 아데노바이러스 벡터-기반 조성물, 예컨대 백신과 조합할 때 상승적 효과를 생성시킬 수 있다. 면역 경로 체크포인트 조정인자는 또한 아데노바이러스 벡터-기반 조성물와 조합할 때 유익한 효과를 생성시킬 수 있다.
XV. 암 치료
본 명세서에 기술된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 예컨대 과형성, 이형성, 신생물, 전암 및 암 간에 또는 원발성 종양 및 전이된 종양 간에, 질환의 병기를 평가하거나 또는 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 특히 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신생물성 세포" 및 "신생물"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 비교적 자율적인 성장을 나타내어서, 그들이 세포 증식의 상당한 제어 상실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 의미한다. 신생물성 세포는 악성일 수 있거나 또는 양성일 수 있다. 특정한 양상에서, 신생물은 이형성 및 암 둘 모두를 포함한다. 신생물은 양성, 전악성 (제자리 암종 또는 이형성)일 수 있거나 또는 악성 (암)일 수 있다. 신생물성 세포는 덩어리 (즉, 종양)을 형성할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
용어 "이형성"은 초기, 제자리 신생물의 경우처럼, 세포 이상성이 본래 조직에 국한될 때 사용될 수 있다. 이형성은 초기 신생물성 과정의 지표일 수 있다. 용어 "암"은 비조절된 세포 성장을 포함하는 다양한 질환의 광범위 그룹을 포함하는, 악성 신생물을 의미할 수 있다.
전이 또는 전이성 질환은 한 장기 또는 부분에서 다른 비인접한 장기 또는 부분으로 암의 확산을 의미할 수 있다. 이렇게 생성된 질환의 새로운 발생을 전이라고 할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물에 의해 평가되거나 또는 치료될 수 있는 암은 췌관 선암종 (PDAC)을 포함하는 췌장 유래 암 세포, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 치은, 머리, 신장, 간, 폐, 인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁 유래의 암 세포를 포함할 수 있다.
또한, 암은 이들에 제한되는 것은 아니나, 특히 하기의 조직학적 유형의 것일 수 있다: 신생물, 악성; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭포암종; 샘종성 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 대장 폴립증; 고형 암종; 악성, 카시노이드 종양; 기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 색소혐성 암종; 호산구 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종; 아포크린 선암종; 피지샘 선암종; 귀지샘 선암종; 점막표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질성 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유선, 파제트 질환; 선포 세포 암종; 선편평세포 암종; 편평 화생을 수반한 선암종; 악성, 흉선종; 악성, 난소 기질 종양; 악성, 난포막종; 악성, 과립막 세포 종양; 악성, 남성아세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성, 라이디히(leydig) 세포 종양; 악성, 지질 세포 종양; 악성, 부신경절종; 악성, 유선외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무멜라닌 흑색종; 표재 산발성 흑색종; 거대 색소성 모반의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 악성, 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성, 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성, 혼합종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성, 간엽종; 악성, 브레너 종양; 악성, 가엽 종양; 윤활막 육종; 악성, 중피종; 비분화배세포종; 배아 암종; 악성, 기형종; 악성, 난소갑상선종; 융모막암종; 악성, 중신종; 혈관육종; 악성, 혈관내피종; 카포시 육종; 악성, 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주변 골육종; 연골육종; 악성, 연골아세포종,; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성, 치원성 종양; 법랑아세포 치아육종; 악성, 법랑아세포종; 법랑아세포 섬유육종; 악성, 송과체종; 척색종; 악성, 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상아세포종; 교아세포종; 핍지교종; 희소돌기아교세포종; 원시신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막아세포종; 후각 신경원성 종양; 수막종, 악성 신경섬유육종; 악성, 신경집종; 악성, 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 소림프구성, 악성 림프종; 거대세포, 미만성, 악성 림프종; 악성 림프종, 여포성; 균상 식육종; 기타 명시된 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적혈백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수양성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수양성 육종; 및 모발 세포 백혈병. 게다가, 종양 네오-항원 또는 네오-에피토프는 전암, 예컨대 화생, 이형성, 및 과형성에서 평가될 수 있다.
XVI. 키트
본 명세서에 기술된 조성물, 면역요법 또는 백신은 키트의 형태로 공급될 수 있다. 본 개시 내용의 키트는 치료 용법 정보를 포함하는 용량 및 또는 투여에 관한 지시서를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 기술된 면역요법 또는 백신을 제공하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 키트의 일부 구체예에서는 키트 성분을 투여하는데 유용한 성분 및 성분을 제조하는 방법에 관한 지시서를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 적절한 실험실 검사에 의한 처리 이전 및 이후에 환자의 모니터링을 수행하거나, 또는 결과 및 환자 데이타를 의료진과 통신하기 위한 소프트웨어를 더 포함할 수 있다.
키트를 포함하는 성분은 건조 형태이거나 또는 액체 형태일 수 있다. 그들이 건조 형태인 경우, 키트는 건조된 재료를 용해시키기 위한 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 액체 또는 건조 형태의 운반 인자를 포함할 수 있다. 운반 인자가 건조 형태이면, 키트는 운반 인자를 용해시키기 위한 용액을 포함하게 될 것이다. 키트는 또한 성분을 혼합하고 제조하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예를 들어 바늘, 튜빙, 도포기, 흡입기, 시린지, 파이펫, 포셉, 계량 스푼, 점안기 또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 전달 비히클과 같은 투여의 보조를 위한 장비를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술되는 키트 또는 약물 전달 시스템은 또한 전형적으로 상업적 판매 및 유통을 위해 밀폐된 구획에 본 개시 내용의 조성물을 함유하기 위한 수단을 포함하게 될 것이다.
XVII. 유형의 컴퓨터-판독 매체
종양 네오-에피토프 또는 종양 네오-항원의 동정, 분류 및 선택과 관련된 작업을 수행하기 위해 실행될 수 있는 컴퓨터 사용 프로그램 코드를 구비한 유형의 컴퓨터-판독 매체를 제공할 수 있다.
프로세서 또는 프로세서들을 본 명세서에 개시된 예시적인 유형 컴퓨터-판독 매체를 통해 구동되는 작업의 수행에 사용할 수 있다. 대안적으로, 프로세서 또는 프로세서들은 하드웨어 통제 하에서, 또는 하드웨어와 소프트웨어 통제의 조합 하에서 작업을 수행할 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 하나 이상의 작업, 예컨대 ASIC (application specific integrated circuit(응용 주문형 집적 회로)) 또는 FPGA (field programmable gate array (필드 프로그램가능 게이트 어레이))를 수행하도록 특별히 구성된 프로세서일 수 있다. 프로세서 또는 프로세서들의 사용은 프로세서 또는 프로세서들의 도움없이 불가능하거나, 또는 적어도 프로세서 또는 프로세서들에 의해 획득가능한 속도가 아니면 불가능한 정보 (예를 들어, 데이타)의 프로세싱을 가능하게 한다.
이러한 작업의 수행에 관한 일부 구체예는 일정한 시간량, 예컨대 1시간 이내, 30분 이내, 15분 이내, 10분 이내, 1분 이내, 1초 이내, 및 1초 내지 1시간 사이의 초 단위의 매 시간 간격 이내를 포함하여, 컴퓨터 시스템, 프로세서 또는 프로세서들의 사용없이 작업을 수행하는데 걸리는 시간 미만의 시간량 내에 획득될 수 있다.
존재하는 유형의 컴퓨터-판독 매체의 일부 구체예는 예를 들어 CD-ROM, DVD-ROM, 플래시 드라이브, 하드 드라이브, 또는 임의의 다른 물리적 저장 장치일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예는 컴퓨터로 실행시, 존재하는 유형의 컴퓨터-판독 매체와 연관된 것들을 포함하여, 본 명세서에 기술된 임의의 작업을 컴퓨터가 수행하게 하는 컴퓨터-판독 코드로 유형의 컴퓨터-판독 매체를 기록하는 것을 포함할 수 있다. 유형의 컴퓨터-판독 매체의 기록은 예를 들어, CD-ROM 또는 DVD-ROM 상에 데이타를 굽거나, 또는 아니면 데이타를 물리적 저장 장치로 옮기는 것을 포함할 수 있다.
상기에 기술된 다양한 구체예는 추가 구체예를 제공하도록 조합될 수 있다. 본 명세서에서 인용되고/되거나 출원 데이타 시트에서 열거된 모든 미국 특허, 미국 공개 특허 출원, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개물은 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 특별히 개별적으로 참조로 편입된다고 표시된 바와 동일한 정도로 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
구체예의 양상은 필요하다면 추가의 구체예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개물의 개념을 적용하도록 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화는 상기 상술한 설명의 관점에서 구체예에 대해 이루어질 수 있다. 대체로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에 개시된 특별한 구체예로 청구항을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되지만, 이러한 청구항이 부여하는 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시내용에 의해 한정되지 않는다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 입증하기 위해 포함된다. 하기의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 본 발명자가 발견한 기술을 대표하며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주할 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 본 개시내용의 관점에서, 당업자는 본 발명의 사조 및 범주를 벗어나지 않고 많은 변화가 개시된 특별한 구체예에서 만들어질 수 있고 유사하거나 또는 비슷한 결과를 여전히 수득할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1
Ad5 [E1-, E2b-]에 삽입을 위한 다수 네오-에피토프 벡터 (Alkbh6.2, Slit3 및 Atxn10.1)의 구축
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 구축: pBHG11의 대략 20 kb Xba-BamHI 하위단편 (Bett, et al 1994, Microbix, Toronto, Ontario, Canada)을 pBluescriptKSII+ (Stratagene, La Jolla, Calif.)에 서브클로닝하여, pAXB를 생산하였다. 플라스미드 pAXB를 BspEI로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 말단 충전시켰으며, BamHI로 분해하여, 대략 9.0 kb 단편을 단리하였다. 플라스미드 pAXB를 또한 BspHI로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 말단 충전시켰으며, BamHI로 분해시키고, 대략 13.7 kb 단편을 이전에 단리된 9.0 kb 단편에 결찰시켜서, pAXB-Δpol을 생성시켰다.
이러한 서브클로닝 전략은 폴리머라제 유전자의 아미노 말단 내에서 608 bp (Δpol; Ad5 7274 내지 7881)를 결실시켰다. 이러한 결실은 또한 Ad 게놈의 이 영역 내에서 우측 리딩 가닥 상에 존재하는 오픈 리딩 프레임 9.4를 효과적으로 제거하였다. pAXB-Δpol의 Xba-BamHI 하위단편을 Xba-BamHI-분해된 pBHG11에 재도입시켜서, pBHG11-Δpol을 생성시켰다.
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neu 백신의 구축: 최소의 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 엘리먼트 및 SV40 유래 폴리아데닐화 신호가 측접된 네오-에피토프 이식유전자를 셔틀 pShuttleCMV에 서브클로닝하여 셔틀 플라스미드 pShuttle CMV/네오-에피토프를 생성시켰다. 셔틀 플라스미드는 PmeI을 사용해 선형화시켰고 플라스미드 pAdΔpp와 상동성 재조합 (이. 콜라이 박테리아에서)시켜서 pAdCMV/네오-에피토프/Δpp를 생성시켰다. PacI을 사용해 선형화시킨 10 마이크로그램의 pAdCMV/ 네오-에피토프/Δpp를 Ad E1, 폴리머라제 (E2b) 및 pTP-발현 (E.C7 세포)에 CaPO4 공동형질감염시켰다. 형질감염 이후 16시간에, 세포를 수확하였고 세포 혼합물을 9개 24웰 조직 배양 클러스터 플레이트에 분배하였고 37℃에서 5 내지 9일 동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 세포변성 효과를 입증하는 개별 웰을 수확하였고 단리된 바이러스는 더 많은 수의 E.C7 세포의 반복 감염을 통해 증폭시켰다. Ad5 [E1-, E2b-]- 네오-에피토프 재조합 벡터의 단리는 이후에 (1) 벡터 게놈의 DNA 제한효소 맵핑, (2) 네오-에피토프의 발현 확인, 및 (3) 다수의 기능적 실험을 통해서 확증하였다.
네오-에피토프 이식유전자에서, 다수의 개별 네오-에피토프 유전자 서열은 각각 돼지 테스코바이러스-1 (Porcine teschovirus-1) 및 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스로부터 유래된 "자가-절단성" 2A 펩티드에 의해 분리된다 (de Felipe P, et al. Traffic 2004; 5(8), 616-26; Holst J, et al. Nature Immunol. 2008 ; 9:658-66; Kim JH, et al. PloS One, 2011; 6(4), e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556). 2A 펩티드가 리보솜 상에서 번역되므로, 2A 펩티드의 마지막 2개 잔기 사이에서 펩티드 결합은 전혀 형성되지 않고, 그 결과로 하나의 리보솜 패스에서 별개로 발현되는 단백질이 생성된다. 3개 유전자를 분리시키는 2개 펩티드 서열의 사용은 그 결과로 화학양론에 가까운 3개 단백질의 발현을 야기시킨다.
실시예 2
Alkbh6.2, Slit3, 및 Atxn10.1을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-]-벡터의 다수회 주사는 이들 네오-에피토프에 대한 세포-매개 면역 반응을 생성시킨다
마우스는 돌연변이체 펩티드 Alkbh6.2, Slit3, 및 Atxn10.1 또는 빈 벡터 대조군으로 2회, 2주 간격으로 면역화시킨다. 배출 림프절을 면역화 종결 이후 7일에 수확한다. 림프절을 시험관내에서 배양하고 이후에 20시간 동안 동족 펩티드로 자극시키거나 또는 자극시키지 않고 나서 ELISpot으로 분석한다. 비장을 마지막 면역화 (백신화) 이후 2주에 개별 마우스로부터 수득하고 IFN- 분비 비장세포에 대한 ELISpot 어세이를 적용하여 CMI에 대해 평가한다 (Gabitzsch ES, et al. Cancer Immunol Immunother. 2010; 59:1131-35; Gabitzsch ES, et al. Cancer Gene Ther. 2011; 18:326-35; Jones FR, et al. Vaccine 2011; 29:7020-26).
실시예 3
Alkbh6.2, Slit3, 및 Atxn10.1을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-]-벡터에 의한 백신접종은 이들 네오-에피토프에 대해 생체내에서 세포-매개 면역 반응을 생성시킨다
각각 다섯(5)마리 마우스의 그룹을 1 x 108, 1 x 109, 또는 1 x 1010 VP 용량의 Ad5 [E1-, E2b-]- Alkbh6.2, Slit3, 및 Atxn10.1 또는 빈 대조군 벡터로 피하에 2주 간격으로 면역화시킨다. 1주 후에, 마우스를 300,000 생존 CMS5-FFLuc 종양 세포로 피하로 공격한다. 종양 성장은 라이브 생물발광성 이미지화 (Perkin Elmer)를 사용하여 모니터링된다. 마우스 혈액을 채혈하고, T 세포를 단리하고, 시험관내에서 동족 펩티드로 자극시키고 미관련 펩티드로 자극하거나, 또는 자극하지 않는다. 배양 배지는 IFN-감마 및 IL-2 생산에 대해 분석된다. 유세포측정법을 세포내 IFN-감마 생산에 대해 마우스 T 세포 상에서 수행된다.
실시예 4
췌장암 환자에서 네오-에피토프-기반 개인화 백신의 안전성, 실행가능성, 및 예비 효능의 평가를 위한 파일럿 실험
CEA-발현 췌장암 환자에서 면역요법을 위해 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (carcinoembryonic antigen; 암배 항원) 플랫폼 백신을 적용하는 임상 실험은 Ad5 [E1-, E2b-]-네오-에피토프 표적화 벡터에 의한 후속 백신접종이 뒤따른다. 이것은 후기 또는 전이성 CEA-발현 악성 종양이 있는 환자에서, Ad5 [E1-, E2B-]-CEA (6D)에 의한 면역화의 안전성을 결정하는 것이 1차 목표인 I/II기 실험이다. 2차 목표는 면역화에 대한 네오-에피토프 면역 반응을 평가하고 이전에 백신접종 처치된 췌장암 환자에 대해 네오-에피토프 표적화 백신을 생성하는 임상적 실행가능성에 대한 예비 데이타를 수득하는 것이다.
실험 개체군은 그러한 요법을 거부하거나 또는 가능한 생존 이득을 갖는 것으로 알려진 표준 요법으로 이전에 처치된 CEA 양성인 전이성 악성 종양으로 조직학적 확진 진단받은 환자로 이루어진다. 실험은 Ad5 [E1-, E2B-]-CEA (6D) 백신 (I기 성분)의 3가지 용량 수준의 안전성, 및 Ad5 [E1-, E2B-]-네오-에피토프 백신을 생성하는 실행가능성 및 안전성을 결정한다.
실험 약물은 3회 면역화 동안 3주마다 피하 (SQ) 주사로 제공되는 Ad5 [E1-, E2B-]-CEA (6D)이다. 안전성은 이전 코호트의 마지막 환자가 그들의 첫번째 주사를 받은 이후 적어도 3주에 각 코호트에서 평가된다. 용량 계획은 용량 수준에서 처치된 환자의 < 33%이 DLT를 경험하면 안전한 것으로 간주된다 (예를 들어, 3명 환자 중 0명, 6명 환자 중 ≤1명, 12명 환자 중 ≤3명, 또는 18명 환자 중 ≤5명).
면역화 3주 후에, 환자 종양 샘플을 획득하고 시퀀싱을 위해 처리하였다 (도 1 참조). 환자의 부응하는 종양 샘플 및 정상 샘플의 전체 게놈 시퀀싱은 DNA 수준에서 종양-특이적 변경을 정확하게 찾아내며, RNA 시퀀싱은 DNA의 돌연변이 또는 SNV와의 관련성을 확증하고 제공한다. 정량적 단백질체는 또한 동정된 SNV의 임상적으로 중요한 단백질의 수준을 측정하기 위해 수행된다. 추정상 SNV는 (IC≤500)의 컷오프로 MHC 클래스 I 결합 예측을 겪을 것이다. SNV의 완결 세트를 인프레임으로 Ad5 [E1-, E2B-] 벡터에 클로닝하여 네오-에피토프 특이적 Ad5 [E1-, E2B-] 백신을 제조한다. 환자는 이후에 Ad5 [E1-, E2B-]-네오-에피토프 벡터를 사용하여 3회 면역화 동안 3주마다 피하 (SQ) 주사로 백신접종된다.
실시예 5
췌장암 환자에서 네오-에피토프-기반 개인화 백신 접근법
종양 네오-에피토프는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (암배 항원) 및 이후에 체크포인트 억제제 (항-PDL-1)로 처치된 췌장 종양을 갖는 환자로부터 단리된다. SNV와 같은 종양-특이적 돌연변이는 환자의 종양 생검 중 게놈 서열을 정상 피부 조직과 비교하여 동정된다. SNV는 그들이 발현되면 결정되고 SNV는 그들이 세포-매개 면역성을 구동하면 결정된다. 게놈 중 70종의 종양 네오-항원 중에서, 그들 중 오직 10종만이 세포-매개 면역성을 구동시킨다. 동정된 네오-항원은 인간 췌장암 환자에게 전달을 위해서 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 라이브러리에 삽입된다. 신규한 네오-항원의 동정 및 새롭게 동정된 신규한 네오-항원에 의한 처치는 주기적으로 반복된다.
실시예 6
종양 네오-항원의 동정
후보 종양 네오-에피토프는 도 1 또는 도 2에 예시된 방법을 기반으로 동정된다.
암 샘플 중 종양-특이적 돌연변이는 DNA 시퀀싱 예컨대 전체 엑솜 시퀀싱 (WES) 또는 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)을 사용해 검출되고 돌연변이 호출 알고리즘 (예컨대 Mutect)의 적용을 통해서 동정된다.
발현된 돌연변이는 RNA 시퀀싱 또는 간접 RNA 분석을 통해서 동정되어 후보 네오-항원 또는 네오-에피토프를 제공한다.
다음으로, 후보 네오-항원 또는 네오-에피토프는 예를 들어 충분히 검증된 알고리즘 (NetMHCpan)을 사용하여, MHC I 또는 MHC II에 대해 예측되는 결합 친화성 또는 HLA 타이핑을 기반으로 이들의 발현된 돌연변이로부터 동정될 수 있고, 그들 동정은 RNA 수준에서 유전자 발현의 확증 및 펩티드-HLA 결합에 대한 실험적 검증으로 개량될 수 있다.
이들 후보 네오-항원 또는 네오-에피토프는 이후에 합성될 수 있고 그들이 면역원성 네오-항원 또는 네오-에피토프인지를 입증하기 위해서 종양-특이적 T-세포 반응을 자극하는 그들 능력에 대해서 검사될 수 있다.
실시예 7
액상 종양 샘플 중에서 종양 네오-항원의 동정
환자 샘플
헤파린처리된 혈액을 임상 연구 프로토콜에 참여한 환자로부터 수득한다. 환자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 피콜/하이팩 밀도-구배 원심분리에 의해 동정하고, 10% 디메틸술폭시드를 사용해 저온보존하고, 분석 시기까지 증기-상 액체 질소에 저장하였다. HLA 타이핑을 수행한다.
CLL 및 다른 암에 대한 전체-엑솜 포획 시퀀싱 데이타
체세포 돌연변이는 정상 기준과 비교를 통해서 또는 배선 DNA의 정합 시퀀싱과 전체-게놈 시퀀싱 (WGS) 또는 전체-엑솜 포획 시퀀싱에 의해 CLL에서 검출된다.
개인 HLA 대립유전자와의 결합으로 유전자 돌연변이로부터 유래된 펩티드의 예측
주요 조직적합성 복합체 (MHC)-결합 친화성은 NetMHCpan (v2.4)을 사용하여 각각의 체세포 돌연변이 및 상응하는 야생형 펩티드로부터 생성된 모든 가능한 9량체 및 10량체 펩티드에 걸쳐 예측된다. 이들 타일식 펩티드는 환자의 HLA 프로파일 내에서 각각의 클래스 I 대립유전자에 대한 그들 결합 친화성 (IC50 nM)에 대해 분석된다. < 150 nM의 IC50 값은 예측되는 강력한 결합제로 간주되고; 150 내지 500 nM는 중간 내지 약한 결합제로서 간주되며; > 500 nM는 비결합제로 간주된다. 경쟁적 MHC 클래스 I 대립유전자-결합 실험에 의해 HLA 분자에 대해 예측되는 펩티드 결합 (IC50 < 500 nM)은 실증적으로 확증된다.
환자 항원-특이적 T 세포의 생성 및 검출
자기유래 수지상 세포 (DC)를 생성시킨다. 일부 실험의 경우, CD40L-Tri 활성화되고 확장된 CD19+ B 세포가 항원-제시 세포 (APC)로서 사용된다.
CLL 환자로부터 펩티드-반응성 T 세포를 생성시키기 위해서, 이식전 및 이식후 PBMC로부터 면역자성적으로 선택된 CD8+ T 세포 (천만개) (CD8+ 마이크로비드; Miltenyi, Auburn, CA)를 자가이식 펩티드 풀-펄싱된 DC와 배양한다 (40:1 비율). 이후에, T 세포를 기억 T-세포 반응을 검출하기 위해서 1회 더, 또는 나이브 T 세포 반응을 검출하기 위해서 3회 더 펩티드-펄싱된 CD40L-Tri-활성화 조사된 B 세포 (4:1 비율)로 약하게 재자극시킨다 (7일에 시작). 모든 자극은 10% 소 태아 혈청 및 5 내지 10 ng/mL 인터루킨 (IL)-7, IL-12, 및 IL-15 (R&D Systems, Minneapolis, MN)가 보충된 완전 배지에서 수행된다. APC는 펩티드 풀 (3시간 동안 10 μM/펩티드/풀)로 펄싱된다. 펩티드 풀 또는 자가유래 종양에 대한 T-세포 특이성은 인터페론 (IFN)-γ ELISPOT 또는 CD107a 탈과립 어세이를 통해서 마지막 자극 이후 10일에 검사된다.
통계학적 고려
변량 모델의 양측 분석은 사이토카인 분비 측정에 대해 구축되고 적절하다면 상호작용 항과 함께 고정된 효과로서 농도 및 돌연변이 상태가 포함된다. 이들 모델에 대한 P 값은 사후 다중 비교 (터키 방법)에 적합화된다. 그룹 간 연속 측정의 다른 비교의 경우, 웰치 t 검정이 사용된다. 보고된 모든 다른 P 값은 2-측면이고 다중 비교에 대한 적절한 조정으로 .05 수준에서 유의한 것으로 간주된다. 분석은 SAS, 버젼 9.2에서 수행된다.
실시예 8
고형 종양 샘플에서 종양 네오-항원의 동정
고유 항원이 CRC를 환자의 1차 수술 표본으로부터 유래된 세포주에서 먼저 동정된다. 암 표본 유래의 단일 세포 현탁물을 표준 조건에서 배양하여 "분화된" 암 세포를 수득하고, 가능한 경우에, 또한 혈청-무함유 조건에서 배양하여 CSC 특징을 나타내는 결장 구체의 생성을 지원한다.
CRC에서 20종의 가장 빈번하게 돌연변이되는 후보 암 유전자를 코딩하는 cDNA를 8종의 분화된 CRC 세포주 및 2종의 매우 유사한 CSC 배양물로부터 PCR-증폭시키고 대량 병렬 시퀀싱을 수행한다. 체세포 돌연변이는 모든 CRC 세포에서 20종의 발현된 유전자 중 몇몇개에서 발견된다.
CRC cDNA에서 발견된 돌연변이는 동일한 환자의 건강한 세포 (PBMC 또는 LCL)로부터 수득된 DNA와 비교되고, CRC 중 20종의 가장 빈번하게 돌연변이된 유전자의 시퀀싱은 고유의 T 세포 네오-에피토프의 잠재적인 공급원인, 종양 당 몇몇 체세포 돌연변이를 제공한다.
PBMC는 돌연변이된 유전자 생성물로부터 유래된 에피토프의 T 세포 인식을 조사하기 위해 제공된다. 환자 유래의 PBMC는 각각의 돌연변이된 단백질에 대해서, 돌연변이된 잔기에 걸쳐있고 11개 잔기가 중첩되는 3개의 15 aa 길이 펩티드로 이루어진 합성 펩티드의 풀로 시험관내에서 적어도 2회 자극된다. 이러한 접근법은 15 aa 길이 펩티드가, 정확한 HLA 대립유전자-특이적 에피토프 구조의 이전 지식없이, MHC 클래스 I 및 II 분자에 의해 자기유래 T 세포에게 제시되는 에피토프로 APC에 의해 자연적으로 처리된다는 증거를 기반으로 한다.
자극된 PBMC로부터 단리된 D8+ T 세포는 IFNγ 처리 시 HLA-A, B, C 및 HLA-DR이 발현되는 자기유래 암 세포의 인식에 대해 검사된다. 이들 결과는 유도된 CD8+ T 세포가 환자 특이적 HLA에 의해 제시되는 자연적으로 처리된 네오-에피토프에 특이적이라는 것을 증명한다.
실시예 9
종양 네오-에피토프의 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 구성체
후보 종양 네오-에피토프의 선택된 풀은 표 4에서 확인된다.
Figure pat00012
표 4의 후보 네오-에피토프 중에서, 데이타베이스 SNP 변이체 LILRB3 (VGPVNPSHR 중 T187N 돌연변이, Rs71257443에 상응, 개체군의 28%에서 발생)가 제거되었다.
다음으로, RNA 시퀀싱 (RNA-seq)을 수행하였고, RNA-seq 데이타를 사용하여 후보 네오-에피토프의 우선순위를 정하였다. 하나의 유전자 FLRT2가 RNA 시퀀싱에서 검출되었기 때문에, 이것은 종양 샘플에서 아마도 충분히 발현될 것이며 표적으로서 우선순위를 두어야 한다.
이들 동정된 후보 종양 네오-에피토프의 연장된 15량체 네오-에피토프를 표 5에 요약한다.
Figure pat00013
도 3에 도시된 바와 같이, 4종의 유전자 구성체가 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터 구성체로 동정된 종양 네오-에피토프의 삽입을 위해 디자인되었다:
(I) 15-aa 미니유전자는 양측에서 7-aa의 천연 서열로 선택된 종양 돌연변이이다. (MHC 클래스 I 항원 표적화)
(II) 25-aa 미니유전자는 양측에서 12-aa의 천연 서열로 선택된 종양 돌연변이이다. (MHC 클래스 I 표적화 및 존재한다면 MHC 클래스 II 항원 이용가능)
(III) "비천연" MHC 클래스 I 에피토프가 인접한 미니유전자 사이에서 형성되지 않도록 각각의 미니 유전자 사이의 9-aa 링커를 갖는 상기 (I)에서와 같은 15-aa 미니유전자.
(IV) "비천연" MHC 클래스 I 에피토프가 인접한 미니유전자 사이에서 형성되지 않도록 각각의 미니유전자 사이에 9-aa 링커를 갖는 상기 (II)에서와 같은 25-aa 미니유전자.
이들 4종의 유전자 구성체의 뉴클레오티드 서열 및 단백질 서열을 하기에 표시하였다:
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
도 4는 형질감염된 세포에서 발현을 검출할 수 있는 유전자 서열의 말단에 Tricom 리포터 엘리먼트를 갖는 네오-항원 유전자 1 서열을 함유하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 인간 A549 종양 세포의 형질감염을 도시한다. 여기서 근거는 리포터 엘리먼트가 검출되면 그 앞의 유전자 또는 유전자들도 역시 발현되어야만 한다는 것이다.
실시예 10
종양 네오-에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터로의 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나, 서열번호 39 - 서열번호 90의 면역학적 융합 파트너 중 어느 하나, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 면역학적 융합 파트너 예컨대 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, , IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF, 및 임의로 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제작한다. 네오-에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 임의 암과 같은 병태를 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개 반응을 구동시키는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
실시예 11
종양 네오-에피토프 및 ALT-803 (면역학적 융합 파트너)을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 ALT-803 (면역학적 융합 파트너)을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나, ALT-803, 및 임의로, 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제작된다. 네오-에피토프 및 ALT-803을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 병태 예컨대 암을 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개된 반응을 구동시키는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
실시예 12
종양 네오-에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 개인맞춤 처리
종양 네오-에피토프는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (암배 항원)으로 처리된 임의 종양을 갖는 환자로부터 단리된다. SNV와 같은 종양-특이적 돌연변이는 정상 피부 조직과 환자의 종양 생검 중 게놈 서열의 비교에 의해 동정된다. SNV의 발현이 결정되고 나면, 이들 SNV는 그들이 세포-매개 면역성을 구동하는지 여부가 평가된다. 발현된 네오-항원이 세포-매개 면역성을 구동하면, 그들은 인간 암 환자에게 전달을 위해서 면역학적 융합 파트너를 갖는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 라이브러리로 삽입된다. 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 90, 서열번호 109 - 서열번호 112의 면역학적 융합 파트너, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 면역학적 융합 파트너 예컨대 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, , IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF로부터 선택된다. 신규한 네오-항원의 동정 및 새롭게 동정된 신규한 네오-항원에 의한 처리는 주기적으로 반복된다.
실시예 13
종양 네오-에피토프 및 면역학적 융합 파트너를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 개인맞춤 처리
종양 네오-에피토프는 Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (암배 항원)-면역학적 융합 파트너로 처리된 임의 종양을 갖는 환자로부터 단리된다. 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 90, 서열번호 109 - 서열번호 112의 면역학적 융합 파트너, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 면역학적 융합 파트너 예컨대 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF로부터 선택된다. SNV와 같은 종양-특이적 돌연변이는 정상 피부 조직과 환자의 종양 생검 중 게놈 서열을 비교하여 동정된다. SNV의 발현이 결정되면, 이들 SNV는 그들이 세포-매개 면역성을 구동하는지 여부가 평가된다. 발현된 네오-항원이 세포-매개 면역성을 구동하면, 그들은 인간 암 환자에게 전달을 위해서 면역학적 융합 파트너를 갖는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터의 라이브러리에 삽입된다. 면역학적 융합 파트너는 서열번호 39 - 서열번호 90, 서열번호 109 - 서열번호 112의 면역학적 융합 파트너, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 면역학적 융합 파트너 예컨대 IFN-γ, TNFα IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IL-7, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-23, IL-32, M-CSF (CSF-1), IFN-α, IFN-β, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-11, IL-17A, IL-17F, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A, B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36α,β,λ, IL-36Ra, IL-37, TSLP, LIF, OSM, LT-α, LT-β, CD40 리간드, Fas 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, 4-1BBL, Trail, OPG-L, APRIL, LIGHT, TWEAK, BAFF, TGF-β1, 및 MIF로부터 선택된다. 신규한 네오-항원의 동정 및 새롭게 동정된 신규한 네오-항원에 의한 처리는 주기적으로 반복된다.
실시예 14
종양 네오-에피토프 및 IL-16을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 IL-16을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나; 서열번호 109의 면역학적 융합 파트너; 및 임의로 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 실시예 1에 기재된 방법을 사용해 제작된다. 네오-에피토프 및 서열번호 109를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 병태 예컨대 암을 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개 반응을 구동하는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
실시예 15
종양 네오-에피토프 및 IL-17을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 IL-17을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나; 서열번호 110의 면역학적 융합 파트너; 및 임의로, 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제작된다. 네오-에피토프 및 서열번호 110을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 병태 예컨대 암을 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개 반응을 구동하는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
실시예 16
종양 네오-에피토프 및 IL-23을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 IL-23을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나; 서열번호 111의 면역학적 융합 파트너; 및 임의로, 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제작된다. 네오-에피토프 및 서열번호 111을 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 병태 예컨대 암을 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개 반응을 구동하는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
실시예 17
종양 네오-에피토프 및 IL-32를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료
이 실시예는 종양 네오-에피토프 및 IL-32를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에 의한 암의 치료를 기술한다. 서열번호 23 - 서열번호 30의 종양 네오-에피토프 중 어느 하나; 서열번호 112의 면역학적 융합 파트너; 및 임의로, 서열번호 91 - 서열번호 105의 링커 중 어느 하나를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 제작된다. 네오-에피토프 및 서열번호 112를 코딩하는 Ad5 [E1-, E2b-] 벡터는 치료적 백신으로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간 이외의 영장류이다. 대상체는 병태 예컨대 암을 갖는다. 암에 대항하여 항체 및 세포-매개 반응을 구동하는 세포 및 체액 면역성의 확립은 백신의 투여 이후에 유도된다. 암 병태는 백신의 투여 이후에 완화된다.
본 명세서에서 개시하고 청구하는 모든 방법은 본 개시내용의 관점에서 과도한 실험없이 실행될 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 구체예로 설명하였지만, 본 발명의 개념, 사조 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 방법의 단계의 순서에 변동이 가해질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 생리학적으로 관련된 특정 작용제는 동일하거나 또는 유사한 결과가 획득되는 본 명세서에 기술된 작용제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해서 정의되는 본 발명의 사조, 범주 및 개념 내에 속하게 된다.
<110> ETUBICS CORPORATION <120> NEOEPITOPE VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 39891-723.601 <140> PCT/US2017/034802 <141> 2017-05-26 <150> 62/342,752 <151> 2016-05-27 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Glu Thr Val Thr Met Pro Cys Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Val Gly Pro Val Asn Pro Ser His Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Leu Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Pro Glu Arg Arg Lys Leu Thr Thr Glu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Met Asp Trp Val Trp Met Asp Thr Thr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Val Trp Met Asp Thr Thr Leu Ser Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gly Lys Thr Leu Asn Pro Ser Gln Thr 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Arg Glu Gly Lys Thr Leu Asn Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Val Arg Asn Ala Thr Ser Tyr Arg Cys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Asn Val Thr Val Arg Asn Ala Thr Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ala Gln Ile Pro Ser Leu Ser Leu Arg 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Pro Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu Ser Leu Arg Ala Val 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Leu Pro Asn Val Thr Val Arg Asn Ala Thr Ser Tyr Arg Cys Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ser Trp Phe Arg Glu Gly Lys Thr Leu Asn Pro Ser Gln Thr Ser 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ala Val Met Asp Trp Val Trp Met Asp Thr Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Leu Gly Pro Glu Arg Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile Ile 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Asn Val Gly Glu Thr Val Thr Met Pro Cys Pro Lys Val Phe Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Glu Gln Val Trp Gly Met Ala Val Arg 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Cys Gln Gly Pro Glu Gln Val Trp Gly Met Ala Val Arg Glu Leu 1 5 10 15 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 cccttcgcca tggcccagat ccccagcctg agcctgaggg ccgtg 45 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ctgcccaacg tgaccgtgag gaacgccacc agctacaggt gcggc 45 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 agctggttca gggagggcaa gaccctgaac cccagccaga ccagc 45 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gccgtgatgg actgggtgtg gatggacacc accctgagcc tgagc 45 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ctgggccccg agaggaggaa gctgaccacc gagctgacca tcatc 45 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 aacaacggcc tgggcgccca gtgcagcgag gccgtgaccc tgaac 45 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 aacgtgggcg agaccgtgac catgccctgc cccaaggtgt tcagc 45 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 tgccagggcc ccgagcaggt gtggggcatg gccgtgaggg agctg 45 <210> 31 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 ctcgaggaag cttgccgcca ccatgccatt tgccatggcc cagatcccca gcctgagcct 60 gagagctgtg ctgcctaatg tgaccgtgcg gaacgccacc agctacagat gtggcagctg 120 gttcagagag ggcaagaccc tgaaccccag ccagaccagc gccgtgatgg actgggtgtg 180 gatggacacc accctgtccc tgagcctggg ccccgagaga agaaagctga ccaccgagct 240 gacaatcatc aacaatggcc tgggcgctca gtgtagcgag gccgtgaccc tgaataatgt 300 gggcgagaca gtgaccatgc cctgccccaa ggtgttcagc tgccagggcc ccgaacaagt 360 gtggggaatg gctgtgcgcg agctgtgaga tatcgcggcc gc 402 <210> 32 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 ctcgaggaag cttgccgcca ccatgccatt tgccatggcc cagatcccca gcctgagcct 60 gagagctgtg ggaagcggga gtggctcagg ttcaggactg cctaatgtga ccgtgcggaa 120 cgccaccagc tacagatgtg gcggaagtgg gtcaggctcc ggttctggaa gctggttcag 180 agagggcaag accctgaacc ccagccagac cagcgggtca ggaagtggta gcggctccgg 240 ggccgtgatg gactgggtgt ggatggacac caccctgtcc ctgagcggaa gtggatcagg 300 ttccggctct gggctgggcc ccgagagaag aaagctgacc accgagctga caatcatcgg 360 atccgggtct ggcagtggtt caggcaacaa tggcctgggc gctcagtgta gcgaggccgt 420 gaccctgaat ggatcagggt ccggcagcgg tagtggcaat gtgggcgaga cagtgaccat 480 gccctgcccc aaggtgttca gcgggtccgg atctggtagt ggctcaggtt gccagggccc 540 cgaacaagtg tggggaatgg ctgtgcgcga gctgtgagat atcgcggccg c 591 <210> 33 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 ctcgaggaag cttgccgcca ccatgcctag cgagagccct ccatttgcca tggcccagat 60 ccccagcctg agcctgagag ctgtgtctgg cgctatggga gcccacagca tccccctgcc 120 taatgtgacc gtgcggaacg ccaccagcta cagatgtggc gtgggacctc ctggccctcc 180 tgcttccctg agctggttca gagagggcaa gaccctgaac cccagccaga ccagcatgag 240 cggcaccctg ctgacagagc tgagagccgt gatggactgg gtgtggatgg acaccaccct 300 gtccctgagc agctggatct gtgtggtgtc cgccacagac ctgggccccg agagaagaaa 360 gctgaccacc gagctgacaa tcatcctgca gggcctggac tacagctgcg aggccaacaa 420 tggcctgggc gctcagtgta gcgaggccgt gaccctgaat ttcaccgtgc ccacctgttg 480 gaggcccgcc aatgtgggcg agacagtgac catgccctgc cccaaggtgt tcagcaactt 540 ctacagcaaa gtgcggggct tcatgtgcca gggccccgaa caagtgtggg gaatggctgt 600 gcgcgagctg aacatgaacc tgctgtgaga tatcgcggcc 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ggctcaggtg tgcggggctt catgtgccag ggccccgaac aagtgtgggg 780 aatggctgtg cgcgagctga acatgaacct gctgtgagat atcgcggccg c 831 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Met Pro Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu Ser Leu Arg Ala Val 1 5 10 15 Leu Pro Asn Val Thr Val Arg Asn Ala Thr Ser Tyr Arg Cys Gly Ser 20 25 30 Trp Phe Arg Glu Gly Lys Thr Leu Asn Pro Ser Gln Thr Ser Ala Val 35 40 45 Met Asp Trp Val Trp Met Asp Thr Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly Pro 50 55 60 Glu Arg Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile Ile Asn Asn Gly Leu 65 70 75 80 Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn Asn Val Gly Glu Thr 85 90 95 Val Thr Met Pro Cys Pro Lys Val Phe Ser Cys Gln Gly Pro Glu Gln 100 105 110 Val Trp Gly Met Ala Val Arg Glu Leu 115 120 <210> 36 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Pro Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu Ser 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Synthetic polypeptide <400> 38 Met Pro Ser Glu Ser Pro Pro Phe Ala Met Ala Gln Ile Pro Ser Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ala Val Ser Gly Ala Met Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Gly Ala His Ser Ile Pro Leu Pro Asn Val Thr Val Arg Asn 35 40 45 Ala Thr Ser Tyr Arg Cys Gly Val Gly Pro Pro Gly Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Pro Pro Ala Ser Leu Ser Trp Phe Arg Glu Gly 65 70 75 80 Lys Thr Leu Asn Pro Ser Gln Thr Ser Met Ser Gly Thr Leu Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Thr Glu Leu Arg Ala Val Met Asp 100 105 110 Trp Val Trp Met Asp Thr Thr Leu Ser Leu Ser Ser Trp Ile Cys Val 115 120 125 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Val Ser Ala Thr Asp Leu Gly 130 135 140 Pro Glu Arg Arg Lys Leu Thr Thr Glu Leu Thr Ile Ile Leu Gln Gly 145 150 155 160 Leu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Cys Glu Ala 165 170 175 Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gln Cys Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn Phe 180 185 190 Thr Val Pro Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Cys Trp Arg 195 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 89 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Arg Ser Thr Gly 1 <210> 93 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Thr Arg 1 <210> 94 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Arg Ser Gln 1 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Arg Ser Ala Gly Glu 1 5 <210> 96 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Arg Ser 1 <210> 97 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gly Gly 1 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 106 <211> 2109 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60 acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120 acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180 catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240 ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300 atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360 accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420 tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480 gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540 aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600 actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660 gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720 accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780 gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840 acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900 gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960 gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020 gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080 cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140 ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200 gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260 tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320 tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380 gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440 aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500 cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560 ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620 ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680 gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740 cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800 ccagactcgt cttacctttc gggagcggac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860 ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920 tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980 gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040 cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100 ctgatatag 2109 <210> 107 <211> 1428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60 gttacgggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 180 ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240 gccccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgcccttt ggggacagga tgtcacctcg 300 gtcccagtca ccaggccagc cctgggctcc accaccccgc cagcccacga tgtcacctca 360 gccccggaca acaagccagc cccgggctcc accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 420 tatcttgaca ccaggccggc cccggtttat cttgcccccc cagcccatgg tgtcacctcg 480 gccccggaca acaggcccgc cttgggctcc accgcccctc cagtccacaa tgtcacctcg 540 gcctcaggct ctgcatcagg ctcagcttct actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 600 gctaccacaa ccccagccag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 660 actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 720 acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 780 tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 840 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 900 tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 960 gtacaattga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 1020 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1080 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1140 atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gtttatctgg ccattgtcta tctcattgcc 1200 ttggctgtcg ctcaggttcg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg 1260 gataaatacc atcctatgag cgagtacgct ctttaccaca cccatgggcg ctatgtgccc 1320 cctagcagtc ttttccgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagctat 1380 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc gcttctgcca acttgtag 1428 <210> 108 <211> 1233 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 atgagctccc ctggcaccga gagcgcggga aagagcctgc agtaccgagt ggaccacctg 60 ctgagcgccg tggagaatga gctgcaggcg ggcagcgaga agggcgaccc cacagagcgc 120 gaactgcgcg tgggcctgga ggagagcgag ctgtggctgc gcttcaagga gctcaccaat 180 gagatgatcg tgaccaagaa cggcaggagg atgtttccgg tgctgaaggt gaacgtgtct 240 ggcctggacc ccaacgccat gtactccttc ctgctggact tcgtggcggc ggacaaccac 300 cgctggaagt acgtgaacgg ggaatgggtg ccggggggca agccggagcc gcaggcgccc 360 agctgcgtct acatccaccc cgactcgccc aacttcgggg cccactggat gaaggctccc 420 gtctccttca gcaaagtcaa gctcaccaac aagctcaacg gagggggcca gatcatgctg 480 aactccttgc ataagtatga gcctcgaatc cacatagtga gagttggggg tccacagcgc 540 atgatcacca gccactgctt ccctgagacc cagttcatag cggtgactgc tagaagtgat 600 cacaaagaga tgatggagga acccggagac agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg 660 tggcttcttc ctggaaccag caccgtgtgt ccacctgcaa atcctcatcc tcagtttgga 720 ggtgccctct ccctcccctc cacgcacagc tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac 780 cggtcctcac cctaccccag cccctatgct catcggaaca attctccaac ctattctgac 840 aactcacctg catgtttatc catgctgcaa tcccatgaca attggtccag ccttggaatg 900 cctgcccatc ccagcatgct ccccgtgagc cacaatgcca gcccacctac cagctccagt 960 cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca 1020 gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc 1080 ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc 1140 gcggccacag acatcgtgga cagccagtac gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc 1200 tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg tga 1233 <210> 109 <211> 1331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Met Glu Ser His Ser Arg Ala Gly Lys Ser Arg Lys Ser Ala Lys Phe 1 5 10 15 Arg Ser Ile Ser Arg Ser Leu Met Leu Cys Asn Ala Lys Thr Ser Asp 20 25 30 Asp Gly Ser Ser Pro Asp Glu Lys Tyr Pro Asp Pro Phe Glu Ile Ser 35 40 45 Leu Ala Gln Gly Lys Glu Gly Ile Phe His Ser Ser Val Gln Leu Ala 50 55 60 Asp Thr Ser Glu Ala Gly Pro Ser Ser Val Pro Asp Leu Ala Leu Ala 65 70 75 80 Ser Glu Ala Ala Gln Leu Gln Ala Ala Gly Asn Asp Arg Gly Lys Thr 85 90 95 Cys Arg Arg Ile Phe Phe Met Lys Glu Ser Ser Thr Ala Ser Ser Arg 100 105 110 Glu Lys Pro Gly Lys Leu Glu Ala Gln Ser Ser Asn Phe Leu Phe Pro 115 120 125 Lys Ala Cys His Gln Arg Ala Arg Ser Asn Ser Thr Ser Val Asn Pro 130 135 140 Tyr Cys Thr Arg Glu Ile Asp Phe Pro Met Thr Lys Lys Ser Ala Ala 145 150 155 160 Pro Thr Asp Arg Gln Pro Tyr Ser Leu Cys Ser Asn Arg Lys Ser Leu 165 170 175 Ser Gln Gln Leu Asp Cys Pro Ala Gly Lys Ala Ala Gly Thr Ser Arg 180 185 190 Pro Thr Arg Ser Leu Ser Thr Ala Gln Leu Val Gln Pro Ser Gly Gly 195 200 205 Leu Gln Ala Ser Val Ile Ser Asn Ile Val Leu Met Lys Gly Gln Ala 210 215 220 Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile Val Gly Gly Lys Asp Ser Ile Tyr Gly 225 230 235 240 Pro Ile Gly Ile Tyr Val Lys Thr Ile Phe Ala Gly Gly Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Leu Gln Glu Gly Asp Glu Ile Leu Glu Leu Asn Gly 260 265 270 Glu Ser Met Ala Gly Leu Thr His Gln Asp Ala Leu Gln Lys Phe Lys 275 280 285 Gln Ala Lys Lys Gly Leu Leu Thr Leu Thr Val Arg Thr Arg Leu Thr 290 295 300 Ala Pro Pro Ser Leu Cys Ser His Leu Ser Pro Pro Leu Cys Arg Ser 305 310 315 320 Leu Ser Ser Ser Thr Cys Ile Thr Lys Asp Ser Ser Ser Phe Ala Leu 325 330 335 Glu Ser Pro Ser Ala Pro Ile Ser Thr Ala Lys Pro Asn Tyr Arg Ile 340 345 350 Met Val Glu Val Ser Leu Gln Lys Glu Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile 355 360 365 Gly Leu Cys Ser Val Pro Tyr Phe Gln Cys Ile Ser Gly Ile Phe Val 370 375 380 His Thr Leu Ser Pro Gly Ser Val Ala His Leu Asp Gly Arg Leu Arg 385 390 395 400 Cys Gly Asp Glu Ile Val Glu Ile Ser Asp Ser Pro Val His Cys Leu 405 410 415 Thr Leu Asn Glu Val Tyr Thr Ile Leu Ser Arg Cys Asp Pro Gly Pro 420 425 430 Val Pro Ile Ile Val Ser Arg His Pro Asp Pro Gln Val Ser Glu Gln 435 440 445 Gln Leu Lys Glu Ala Val Ala Gln Ala Val Glu Asn Thr Lys Phe Gly 450 455 460 Lys Glu Arg His Gln Trp Ser Leu Glu Gly Val Lys Arg Leu Glu Ser 465 470 475 480 Ser Trp His Gly Arg Pro Thr Leu Glu Lys Glu Arg Glu Lys Asn Ser 485 490 495 Ala Pro Pro His Arg Arg Ala Gln Lys Val Met Ile Arg Ser Ser Ser 500 505 510 Asp Ser Ser Tyr Met Ser Gly Ser Pro Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly 515 520 525 Ser Ala Glu Lys Pro Ser Ser Asp Val Asp Ile Ser Thr His Ser Pro 530 535 540 Ser Leu Pro Leu Ala Arg Glu Pro Val Val Leu Ser Ile Ala Ser Ser 545 550 555 560 Arg Leu Pro Gln Glu Ser Pro Pro Leu Pro Glu Ser Arg Asp Ser His 565 570 575 Pro Pro Leu Arg Leu Lys Lys Ser Phe Glu Ile Leu Val Arg Lys Pro 580 585 590 Met Ser Ser Lys Pro Lys Pro Pro Pro Arg Lys Tyr Phe Lys Ser Asp 595 600 605 Ser Asp Pro Gln Lys Ser Leu Glu Glu Arg Glu Asn Ser Ser Cys Ser 610 615 620 Ser Gly His Thr Pro Pro Thr Cys Gly Gln Glu Ala Arg Glu Leu Leu 625 630 635 640 Pro Leu Leu Leu Pro Gln Glu Asp Thr Ala Gly Arg Ser Pro Ser Ala 645 650 655 Ser Ala Gly Cys Pro Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gln Thr Lys Ser Ser 660 665 670 Thr Glu Gly Glu Pro Gly Trp Arg Arg Ala Ser Pro Val Thr Gln Thr 675 680 685 Ser Pro Ile Lys His Pro Leu Leu Lys Arg Gln Ala Arg Met Asp Tyr 690 695 700 Ser Phe Asp Thr Thr Ala Glu Asp Pro Trp Val Arg Ile Ser Asp Cys 705 710 715 720 Ile Lys Asn Leu Phe Ser Pro Ile Met Ser Glu Asn His Gly His Met 725 730 735 Pro Leu Gln Pro Asn Ala Ser Leu Asn Glu Glu Glu Gly Thr Gln Gly 740 745 750 His Pro Asp Gly Thr Pro Pro Lys Leu Asp Thr Ala Asn Gly Thr Pro 755 760 765 Lys Val Tyr Lys Ser Ala Asp Ser Ser Thr Val Lys Lys Gly Pro Pro 770 775 780 Val Ala Pro Lys Pro Ala Trp Phe Arg Gln Ser Leu Lys Gly Leu Arg 785 790 795 800 Asn Arg Ala Ser Asp Pro Arg Gly Leu Pro Asp Pro Ala Leu Ser Thr 805 810 815 Gln Pro Ala Pro Ala Ser Arg Glu His Leu Gly Ser His Ile Arg Ala 820 825 830 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Arg Gln Arg Ile Ser Ser Phe Glu Thr 835 840 845 Phe Gly Ser Ser Gln Leu Pro Asp Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ser Leu 850 855 860 Gln Pro Ser Ser Gly Glu Ala Ala Lys Pro Leu Gly Lys His Glu Glu 865 870 875 880 Gly Arg Phe Ser Gly Leu Leu Gly Arg Gly Ala Ala Pro Thr Leu Val 885 890 895 Pro Gln Gln Pro Glu Gln Val Leu Ser Ser Gly Ser Pro Ala Ala Ser 900 905 910 Glu Ala Arg Asp Pro Gly Val Ser Glu Ser Pro Pro Pro Gly Arg Gln 915 920 925 Pro Asn Gln Lys Thr Leu Pro Pro Gly Pro Asp Pro Leu Leu Arg Leu 930 935 940 Leu Ser Thr Gln Ala Glu Glu Ser Gln Gly Pro Val Leu Lys Met Pro 945 950 955 960 Ser Gln Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gln Ser Cys Glu 965 970 975 Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser Ser 980 985 990 Gln Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser Ser 995 1000 1005 Ile Ser Cys Ala Gln Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser Pro 1010 1015 1020 Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala Glu Thr 1025 1030 1035 1040 Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu Leu Arg Glu 1045 1050 1055 Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp Asp Gly Asp His 1060 1065 1070 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Gln Ser Val Ile Ser Leu Leu Ser Ser Glu 1075 1080 1085 Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys Val Leu Asp Glu Ala Thr 1090 1095 1100 Leu Lys Gln Leu Asp Gly Ile His Val Thr Ile Leu His Lys Glu Glu 1105 1110 1115 1120 Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu Asn 1125 1130 1135 Lys Val Ile Thr Val His Arg Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser Gln 1140 1145 1150 Glu Gly Thr Ile Gln Lys Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly Lys 1155 1160 1165 Ser Leu Lys Gly Thr Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg Gln 1170 1175 1180 Ala Arg Glu Pro Arg Gln Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr Pro 1185 1190 1195 1200 Glu Ala Met Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala 1205 1210 1215 Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Glu Ala Thr Val Cys 1220 1225 1230 Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu Glu 1235 1240 1245 Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile Asn Arg 1250 1255 1260 Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser Glu Thr Val Gln Pro Gly 1265 1270 1275 1280 Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala Met Gln Gly Leu Thr Arg 1285 1290 1295 Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro Asp Gly Pro Val Thr 1300 1305 1310 Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser Lys Glu Thr Thr Ala Ala 1315 1320 1325 Gly Asp Ser 1330 <210> 110 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 111 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln 1 5 10 15 Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val 20 25 30 Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp 35 40 45 Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu 85 90 95 Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile 115 120 125 Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe 130 135 140 Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val 145 150 155 160 Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro Ile Trp Glu Leu Lys Lys 165 170 175 Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu 180 185 190 Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp 195 200 205 Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys 225 230 235 240 Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu 245 250 255 Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys 260 265 270 Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe 275 280 285 Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val 290 295 300 Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala 305 310 315 320 Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu 325 330 335 Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu 340 345 350 Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr 355 360 365 Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp 370 375 380 Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val 385 390 395 400 Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr 405 410 415 Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu 420 425 430 Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys 435 440 445 Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser 450 455 460 Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 465 470 475 <210> 112 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp 20 25 30 Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp 35 40 45 Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 50 55 60 His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser 65 70 75 80 Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His 100 105 110 Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys 115 120 125 Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala 145 150 155 160 Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val 165 170 175 Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys 180 185 190 Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser 195 200 205 Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 225 230

Claims (37)

  1. 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물로서, 여기서 복제-결함 벡터는
    종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열; 및
    ALT-803을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 복제-결함 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역, E1 영역, E3 영역 및 E4 영역, 또는 이의 임의 조합 내에 결실을 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 완전 결실형 (gutted) 벡터가 아닌 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ALT-803은 서열번호 88 - 서열번호 89 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 링커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 링커는 폴리알라닌 링커 또는 폴리글리신 링커인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 링커는 알라닌 및 글리신의 혼합물을 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 서열번호 91 - 서열번호 105 중 어느 하나인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 적어도 10종의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 네오-항원은 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, Her4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 네오-항원은 서열번호 1 - 서열번호 22 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 23 - 서열번호 30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 종양 네오-에피토프이거나, 또는 다음의 돌연변이: 유전자 SLC4A11의 Q678P 돌연변이, 유전자 SIGLEC1의 D1143N 돌연변이, 유전자 SIGLEC14의 A292T 돌연변이, PIEZO2의 T2356M 돌연변이, 유전자 FAT4의 S1613L 돌연변이, 유전자 FCRL1의 R268C 돌연변이, 또는 유전자 VIPR2의 V73M 돌연변이, 또는 유전자 FLRT2의 R346W 돌연변이 중 하나를 갖는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 공자극성(costimulatory) 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 조작된 자연 살해 (NK) 세포를 추가적으로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 면역자극제를 추가적으로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 요법을 추가적으로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 면역 경로 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 추가적으로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한, 복제-결함 벡터를 포함하는 조성물.
  21. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 복제-결함 벡터를 포함하는 약학 조성물로서, 여기서 복제-결함 벡터는
    종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열; 및
    ALT-803을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  22. 대상체에서 종양을 검출하는 방법에 사용하기 위한 복제-결함 벡터를 포함하는 약학 조성물로서, 여기서 복제-결함 벡터는
    종양 네오-항원을 코딩하는 핵산 서열, 및
    ALT-803을 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하는 것이고,
    여기서 방법은
    a) 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 단계; 및
    b) 투여 이후에 대상체에서 종양 네오-항원의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 복제-결함 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 약학 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 벡터는 E2b 영역, E1 영역, E3 영역 및 E4 영역, 또는 이의 임의 조합 내에 결실을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 완전 결실형 (gutted) 벡터가 아닌 것인, 약학 조성물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, ALT-803은 서열번호 88 - 서열번호 89 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 것인, 약학 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 링커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 링커는 폴리알라닌 링커 또는 폴리글리신 링커인, 약학 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 링커는 알라닌 및 글리신의 혼합물을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 서열번호 91 - 서열번호 105 중 어느 하나인, 약학 조성물.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 네오-항원은 종양 네오-에피토프, WT1, HPV-E6, HPV-E7, p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, DAM-10, 폴레이트 수용체 알파, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-8, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her1, Her2/neu, Her3, Her4, BRCA1, Brachyury, Brachyury (TIVS7-2, 다형성), Brachyury (IVS7 T/C 다형성), T Brachyury, T, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC1 (VNTR 다형성), MUC1c, MUC1n, MUC2, PRAME, P15, PSCA, PSMA, RU1, RU2, SART-1, SART-3, AFP, β-카테닌/m, 캐스파제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPl/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARα, TEL/AML1, 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 네오-항원은 서열번호 1 - 서열번호 22 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 23 - 서열번호 30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 종양 네오-에피토프이거나, 또는 다음의 돌연변이: 유전자 SLC4A11의 Q678P 돌연변이, 유전자 SIGLEC1의 D1143N 돌연변이, 유전자 SIGLEC14의 A292T 돌연변이, PIEZO2의 T2356M 돌연변이, 유전자 FAT4의 S1613L 돌연변이, 유전자 FCRL1의 R268C 돌연변이, 또는 유전자 VIPR2의 V73M 돌연변이, 또는 유전자 FLRT2의 R346W 돌연변이 중 하나를 갖는 것인, 약학 조성물.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 공자극성(costimulatory) 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대상체에게 조작된 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대상체에게 면역자극제를 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대상체에게 면역 경로 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 추가적인 약학 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 복제-결함 벡터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
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