CN110461345A - 用于调控免疫应答的包含乳酸细菌的口服组合物和与其相关的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及例如包含至少一种选自以下的细菌菌株的益生菌组合物：嗜热链球菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌KE99和保加利亚乳酸杆菌，任选地其中所述至少一种细菌菌株是活的或经声波处理的。

Description

用于调控免疫应答的包含乳酸细菌的口服组合物和与其相关 的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月15日提交的美国临时申请号62/434,837的权益，所述美国临时申请的整个内容通过这个引用整体并入本文。
发明背景
自然杀伤(NK)细胞是在骨髓中产生，并且占外周血液和次级淋巴器官中的淋巴细胞的约5-10％的免疫细胞。NK细胞效应功能包括直接细胞毒性、抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和炎症性细胞因子和趋化因子分泌。这些分泌因子间接调控其他免疫细胞的功能。NK细胞通过释放预先形成的蛋白质颗粒穿孔素和粒酶B来介导针对经转化细胞与健康细胞两者的细胞毒性。这些蛋白质可诱导靶细胞的凋亡。NK细胞靶向和杀灭癌症干细胞(CSC)/未分化肿瘤以及健康非转化干细胞，这些细胞表达低水平的I类主要组织相容性复合物(MHC-I)、CD54和B7H1以及高水平的CD44。
在对干细胞样肿瘤进行选择(NK细胞介导的裂解)之后，NK细胞通过分泌型和膜结合型IFN-γ和TNF-α来使另外称为未分化或不良分化肿瘤的CSC分化。这导致肿瘤生长阻止和肿瘤微环境重塑。识别在肿瘤或受病毒感染细胞上表达的配体的活化性受体和共受体负责介导NK细胞活化。外周血液中淋巴细胞的中等/高度细胞毒性活性与癌症风险降低相关联，并且肿瘤内高水平的NK细胞浸润与较好预后相关联。在另一方面，低细胞毒性活性与癌症风险增加相关联。在癌症患者中，NK细胞的数目以及它们的细胞毒性和细胞因子分泌功能显著减弱。
NK细胞中的分割无反应性(split anergy)指示在存在大量分泌细胞因子的情况下NK细胞细胞毒性降低(Tseng等(2014)Front Immunol,5:269；Magister等(2012)Eur JCell Biol,91(5):391-401；Tseng等(2015)Oncotarget 6(11):8947-59)。诱导NK细胞中的分割无反应性会通过分泌型和膜结合型因子来促进靶细胞的分化，使肿瘤细胞上的关键分化受体增加，诱导肿瘤细胞对NK细胞介导的细胞毒性的抗性，并且由于在肿瘤分化之后细胞因子和趋化因子产生降低或停止而抑制炎症。
对NK细胞免疫调节的潜在机理尚不了解。存在极大需要来鉴定用于达成改进NK免疫疗法的治疗性组合物和方法。
发明内容
本发明至少部分地基于发现益生细菌的特定组合诱导活化NK细胞中的显著分割无反应性，从而导致显著诱导IFN-γ和TNF-α。此外，益生细菌的所述组合物诱导NK细胞的显著扩增。本文所述的益生细菌的组合物可用于抑制或预防炎症，和/或在需要NK细胞时(例如在炎症、感染或恶性肿瘤情况下)使它们高度活化。为比较不同的组合，使用NK细胞的一种新型活化指数，该指数评估可在病理性状况下减弱自体免疫性同时使NK细胞的显著活化增强的若干重要细胞因子和趋化因子的比率。以这个方式，菌株被选择来：1)在不需要NK细胞的活化时提供调控的NK细胞活化；2)在由细胞因子和/或如在癌症的情况下在NK细胞的功能性活化期间所发生的受体交联活化时促进NK细胞活化加强；和/或3)促进肠道微生物区系的多样性。在这些各种组合物和方法中，细菌以仅在感染或恶性肿瘤期间需要时使NK活化增加的方式调控肠道粘膜免疫性。当不需要活化NK细胞时，细菌可调控NK功能以抑制炎症。对NK细胞功能的这种协调调控可介导NK活性以减轻非所要的炎症，同时在疾病期间促进免疫性。
附图说明
图1包括标识为图A和图B的2个图，其显示用益生细菌处理NK细胞诱导IFN-γ和抗炎性细胞因子IL-10的较高分泌。在有或无1:5(NK细胞:细菌)比率下的益生细菌sAJ2下，使纯化NK细胞(1x106/mL)不经处理，用IL-2(1000单位/mL)或抗CD16 mAb(3μg/mL)和IL-2(1000单位/mL)处理18小时。收集培养物的上清液，并且用于多路阵列分析。以上是IFN-γ(图1A)和IL-10(图1B)的分泌水平。
图2显示益生细菌不影响NK细胞介导的针对人口腔鳞状癌干细胞(OSCSC)的细胞毒性。使纯化NK细胞(1x 106/mL)不经处理，用IL-2(1000单位/mL)处理，或用抗CD16 mAb(3μg/mL)和IL-2(1000单位/mL)处理，并且在存在或不存在1:3(NK细胞:细菌)比率下的活体AJ2或经声波处理AJ2下培养12-18小时。在过夜孵育之后，将它们添加至经51Cr标记的OSCSC细胞(靶细胞)中。通过进行标准4小时51Cr释放测定来测定NK细胞细胞毒性。γ计数器用于测量释放至上清液中的放射性。使用裂解单位(LU 30/106)来确定NK细胞介导的针对经放射性标记的OSCSC的细胞毒性的水平。
图3显示表面表达趋势证明在用经IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2活化NK细胞分化的OSCSC中，分化标志物上调。在有或无1:3(NK细胞:细菌)比率下的经声波处理AJ2(sAJ2)下，使纯化NK细胞不经处理，或用抗CD16 mAb(3μg/mL)和IL-2(1000单位/mL)处理18小时。之后，收集来自各NK样品的上清液，并且用于处理/分化OSCSC 4天。使OSCSC从组织培养板脱离，并且来自各处理的5x 104个细胞用于通过流式细胞术来测量表面标志物的表面表达。针对同种型对照、CD54、MHC-I、B7H1和CD44的PE缀合抗体用于对未处理OSCSC或用NK细胞上清液处理的那些OSCSC进行染色，如图中所详述。同种型对照抗体用作对照。对于各直方图，在右手角的数字是百分比和平均通道荧光强度。
图4显示用分割无反应的NK细胞的上清液处理的OSCSC对NK细胞介导的细胞毒性具有显著更大抗性—最高抗性水平在用分割无反应的NK细胞的上清液与sAJ2组合处理的那些OSCSC中。如图3中所述处理纯化NK细胞。之后，收集来自各NK样品的上清液，并且用于处理/分化OSCSC 4天。使OSCSC从组织培养板脱离，并且使用标准4小时51Cr释放测定来评估它们对NK细胞介导的裂解的敏感性。使用裂解单位(LU 30/106)来确定NK细胞介导的针对经放射性标记OSCSC情况的细胞毒性的水平。
图5显示对用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2NK细胞上清液处理的OSCSC的分化的诱导由NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的组合介导。纯化NK细胞(1x 106/mL)用在1:3(NK细胞:细菌)比率下的单独sAJ2，或与IL-2(1000单位/mL)和抗CD16 mAb(3μg/mL)组合处理18小时。之后，收集来自各NK样品的上清液，并且用于处理/分化OSCSC 4天。将抗IFN-γ抗体(1:100)和抗TNF-α抗体(1:100)添加至OSCSC中，随后开始NK上清液处理。使OSCSC从组织培养板脱离，并且来自各处理的5x104个细胞用于通过流式细胞术来测量表面标志物的表面表达。针对同种型对照、CD54、MHC-I和B7H1的PE缀合抗体用于对未处理OSCSC或用NK细胞上清液处理的那些OSCSC(有或没有针对IFN-γ的抗体和/或TNF-α抗体)染色，如图中所详述。同种型对照抗体用作对照。对于各直方图，在右手角的数字是百分比和平均通道荧光强度。
图6显示对用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2NK细胞上清液处理的OSCSC的分化的诱导以及因此对NK细胞介导的裂解的抗性由NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的组合介导。如图5中所述处理纯化NK细胞。之后，收集来自各NK样品的上清液，并且用于处理/分化OSCSC 4天。将抗IFN-γ抗体(1:100)和抗TNF-α抗体(1:100)添加至OSCSC中，随后开始NK上清液处理。接着使OSCSC从组织培养板脱离，并且使用标准4小时51Cr释放测定来评估它们对NK细胞介导的裂解的敏感性。使用裂解单位(LU 30/106)来确定NK细胞介导的针对经放射性标记的OSCSC情况的细胞毒性的水平。
图7显示对用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2NK细胞上清液处理的OSCSC的分化的诱导由NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的组合介导，所述诱导也导致所述OSCSC的生长抑制。如图5中所述处理纯化NK细胞。之后，收集来自各NK样品的上清液，并且用于处理/分化OSCSC 4天。将抗IFN-γ抗体(1:100)和抗TNF-α抗体(1:100)添加至OSCSC中，随后开始NK上清液处理。接着使OSCSC从组织培养板脱离，并且通过显微术来对细胞计数。
图8显示sAJ2与破骨细胞组合使NK细胞而非T细胞扩增，持续较长时期维持它们。从健康供者的PBMC获得纯化NK细胞和单核细胞，如材料和方法章节中所述。为产生破骨细胞，在含有M-CSF(25ng/mL)和RANKL(25ng/mL)的α-MEM培养基中培养单核细胞21天，每3天进行培养基补充。接着用IL-2(1000单位/mL)和抗CD16 mAb(3μg/mL)的组合处理纯化NK细胞(1x 106个细胞/毫升)18小时，随后在有或无1:2:4(OC:NK:sAJ2)比率下的自体破骨细胞的情况下，使它们与sAJ2共培养。在图中详述的相应日，将使NK细胞扩增的培养基更新，并且再补充以IL-2(1000单位/mL)。使用流式细胞术在相应日分析CD3、CD16和CD56的表面表达水平。
图9显示用破骨细胞作为饲养细胞进行扩增的NK细胞持续延长时长具有高度细胞毒性。如图8中所述来培养和处理来自PBMC的纯化NK细胞和单核细胞。在第6、9和15天，使用标准4小时51Cr释放测定来测量这些经扩增NK细胞的NK细胞介导的细胞毒性功能。使用裂解单位(LU 30/106)来确定这些NK细胞情况的NK细胞介导的针对经放射性标记的OSCSC(靶细胞)的细胞毒性的水平。
图10显示经破骨细胞扩增NK细胞持续延长时期分泌显著较高水平的细胞因子。如图8中所述来培养和处理来自PBMC的纯化NK细胞和单核细胞。用IL-2(1000单位/mL)和抗CD16 mAb(3μg/mL)的组合处理纯化NK细胞(1x 106个细胞/mL)18小时，随后在有或无1:2:4(OC:NK:sAJ2)比率下的自体破骨细胞的情况下，使它们与sAJ2共培养。在第6、9、12、15、18和21天，收集扩增NK细胞的上清液，并且使用人IFN-γELISA测量IFN-γ的水平。在图中详述的相应日，将细胞用新鲜培养基补充，并且再补充以IL-2(1000单位/mL)。
图11显示经破骨细胞扩增的NK细胞的扩增倍数。从健康供者的PBMC获得高度纯化NK细胞和单核细胞。为产生破骨细胞，在含有M-CSF(25ng/mL)和RANKL(25ng/mL)的α-MEM培养基中培养单核细胞21天。对于扩增，用IL-2(1000单位/mL)和抗CD16 mAb(3μg/mL)的组合处理纯化NK细胞(1x 106个细胞/mL)18小时；接着在sAJ2存在下在1:2:4(OC:NK:sAJ2)比率下使它们与自体破骨细胞共培养。在图中详述的相应日，将使NK细胞扩增的培养基更新，并且再补充以IL-2(1000单位/mL)。通过显微术来基于手动细胞计数测定扩增倍数。
图12显示益生菌补充与NK免疫疗法组合用于经OSCSC原位植入BLT小鼠的一示例性实验概述。在肿瘤植入之前，每隔一天对所选小鼠饲喂5x 109个AJ2细菌(8种以上所列的益生菌菌株的组合)，在肿瘤植入之前一周开始。这个辅助疗法每隔一天继续直至处死那天。对于各小鼠，将冻干AJ2再混悬于200μL脱脂奶中，并且通过吸移对它们饲喂。将OSCSC原位注射至hu-BLT小鼠的口底中。在注射肿瘤细胞之后，每隔一天对所有小鼠的疾病进展进行连续监测。在肿瘤植入之后7天，所选hu-BLT小鼠通过尾部静脉(IV)注射来接受1.5x 106个经破骨细胞扩增的人NK细胞。观察小鼠的总体发病征象，诸如体重减轻、毛皮起皱、驼背姿态和不动。在初始肿瘤植入之后3周将小鼠处死。
图13显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的骨髓细胞的IFN-γ分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集股骨，并且使用补充以10％FBS的RPMI培养基将骨髓细胞冲洗出来。以1x 106个细胞/mL培养骨髓细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IFN-γELISA，测定第6天(图12A)和第11天(图12B)上清液的IFN-γ分泌水平。
图14显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的骨髓细胞的IL-10分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集股骨，并且使用补充以10％FBS的RPMI培养基将骨髓细胞冲洗出来。以1x 106个细胞/mL培养骨髓细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IL-10ELISA，测定第6天(图14A)和第11天(图14B)上清液的IL-10分泌水平。
图15显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的PBMC的细胞介导的细胞毒性。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，从小鼠收集血液，并且使用Ficoll-Hypaque离心来分离PBMC。以0.4x106个细胞/mL培养PBMC，并且在第0、3和7天补充以IL-2(1000单位/mL)。使用针对经放射性标记的OSCSC(靶细胞)的标准4小时51Cr释放测定，在第7天测量PBMC的细胞毒性功能。如实施例1中的材料和方法所述来测定裂解单位(LU 30/106)。
图16显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的PBMC的IFN-γ分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，从小鼠收集血液，并且使用Ficoll-Hypaque离心来分离PBMC。以0.4x 106个细胞/mL培养PBMC，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3天收集上清液，并且以0.4x 106个细胞/mL再次再混悬细胞并补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IFN-γELISA，测定上清液的IFN-γ分泌水平。
图17显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的脾细胞的细胞介导的细胞毒性。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。以1x106个细胞/mL培养脾细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL下再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用针对经放射性标记的OSCSC(靶细胞)的标准4小时51Cr释放测定，在第11天测量经IL-2处理的脾细胞的细胞毒性功能。如实施例1中的材料和方法所述来测定裂解单位(LU 30/106)。
图18显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的脾细胞的IFN-γ分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。以1x 106个细胞/mL培养脾细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IFN-γELISA，测定第3天(图18A)、第6天(图18B)和第11天(图18C)上清液的IFN-γ分泌水平。
图19显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的脾细胞的IL-10分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。以1x 106个细胞/mL培养脾细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IL-10ELISA，测定第3天(A)和第6天(B)上清液的IL-10分泌水平。
图20显示从hu-BLT小鼠的脾细胞正性选择的经IL-2活化的CD3+ T细胞的IFN-γ分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。脾细胞经受CD3正性选择，并且以1x 106个细胞/mL培养纯化T细胞并在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IFN-γELISA，测定第11天上清液的IFN-γ分泌水平。
图21显示从hu-BLT小鼠的脾细胞正性选择的经IL-2活化的CD3+ T细胞的IL-10分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。脾细胞经受CD3正性选择，并且以1x 106个细胞/mL培养纯化T细胞并在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IL-10ELISA，测定第11天上清液的IL-10分泌水平。
图22显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的CD3消减脾细胞的IFN-γ分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。从脾细胞消减CD3+细胞，并且以1x 106个细胞/mL培养，在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IFN-γELISA，测定第3天(图22A)和第11天(图22B)上清液的IFN-γ分泌水平。
图23显示来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化的CD3经消减脾细胞的IL-10分泌。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。从脾细胞消减CD3+细胞，并且以1x 106个细胞/mL培养，在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x 106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用人IL-10ELISA，测定第11天上清液的IL-10分泌水平。
图24显示对从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤的尺寸分析。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，并且并行地进行拍照。
图25显示从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤上的MHC-I表面表达。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，解离，并且过滤以获得单细胞混悬液。使用PE缀合MHC-I抗体，在第0天进行流式细胞术。同种型对照抗体用作对照。
图26显示NK细胞介导的针对从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤的细胞毒性。如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，解离，并且过滤以获得单细胞混悬液。在第0天以每孔0.75x 106个细胞培养各肿瘤的细胞。对于各条件，在第7天使细胞脱离，并且以10,000个细胞再培养。在第15天，使口腔肿瘤细胞脱离，并且用于实验。使用针对经新鲜分离以及经IL-2(1000单位/mL)活化NK细胞的标准4小时51Cr释放测定，测量肿瘤对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性。测定裂解单位(LU 30/106)。
图27显示相较于饲喂CD的WT小鼠，来自饲喂高脂肪卡路里膳食(HFCD)的WT小鼠和饲喂对照膳食(CD)和HFCD的KC小鼠的循环PBMC中DX5+NK细胞的细胞毒性和百分比。显示根据饲喂的膳食类型对WT小鼠和条件性KC小鼠分组的流程图显示于这个图中。持续3-4个月对LSL-KRAS(G12D)小鼠和PDX-1-Cre小鼠的后代饲喂CD或HFCD。每周测量各动物的食物摄取和体重(图27A)。从小鼠的外周血液分离PBMC，并且与IL-2(10,000U/mL)一起培养7天，随后它们作为针对经51Cr标记的ST63细胞的效应物以各种效应物与靶标比率用于标准4小时51Cr释放测定中。使用为使30％的ST63细胞裂解所需的细胞数的倒数×100来测定裂解单位(LU)30/106个细胞(图27B)。从脾细胞正性选择T细胞，并且与IL-2(1,000U/mL)一起培养7天，随后它们作为针对经51Cr标记的ST63细胞的效应物以各种效应物与靶标比率用于标准4小时51Cr释放测定中。如图27B中所述测定LU(图27C)。从小鼠的外周血液分离PBMC，并且与IL-2(10,000U/ml)一起培养7天并测定CD45+免疫细胞上DX5的表面表达(n＝2)(图27D)。从由饲喂CD或HFCD的WT小鼠和KC小鼠获得的脾细胞纯化NK细胞，并且以(1×106个细胞/ml)培养，随后用IL-2(10,000U/ml)处理7天。在孵育之后，对NK细胞计数，并且在标准4小时51铬释放测定中使来自各组的相等数目的细胞与经51Cr标记的肿瘤细胞一起培养。使用为使30％的ST63细胞裂解所需的细胞数的倒数×100来测定裂解单位(LU)30/106个细胞(图27E)。
图28显示在收集来自四组小鼠(显示于图中)的培养齿龈组织以及制备单细胞混悬液之后，在饲喂CD和高脂肪卡路里膳食的KC小鼠中，齿龈内自然杀伤(NK)细胞的数目和IFN-γ分泌。对于各组小鼠，在用相应PE和FITC缀合小鼠抗体染色之后测定在处死时齿龈细胞内表达CD45和DX5的免疫细胞的百分比，并且测定CD45+免疫细胞的数目以及CD45+免疫细胞内的DX5+NK细胞。(n＝3)(图28A)。对于各组小鼠，使齿龈细胞(5×105/ml)与IL-2(10,000U/ml)一起培养7天，此后对各情况下的细胞总数计数，测定齿龈细胞内表达CD45和DX5的免疫细胞的百分比，并且测定CD45+免疫细胞内CD45+免疫细胞和DX5+NK细胞的数目。(n＝3)(图28B)。如图中所述培养齿龈细胞(图28B)，并且收集它们的上清液并使用特异性ELISA来测定IFN-γ(图28C)和IL-6(图28D)分泌。
图29显示在进行以及不进行用AJ2饲喂的情况下，尾部静脉注射超动力NK细胞。如图29A中所示来产生人源化BLT(hu-BLT)小鼠。使用人和小鼠CD45抗体来分析在hu-BLT小鼠的血液、BM和脾中的人免疫细胞重构。人CD45+免疫细胞和小鼠CD45+免疫细胞各自的百分比显示于各相应象限中(图29B)。从各组小鼠收集齿龈组织，并且制备单细胞混悬液。在用相应PE和FITC缀合抗体染色之后，使用流式细胞术分析来测定人CD45、CD3、CD16和CD56的表面表达。同种型对照抗体用作对照。三个代表性实验中的一个显示于图中(图29C)。流程图呈现使用hu-BLT小鼠的实验设计。对小鼠在口底中或胰腺中原位植入1×106个人口腔肿瘤细胞或胰腺肿瘤细胞。在肿瘤植入之后1至2周，所选hu-BLT小鼠通过尾部静脉注射来接受1.5×106个人或hu-BLT小鼠超动力NK细胞。在肿瘤植入之前2周，用AJ2(50亿/剂)饲喂小鼠，并且在整个实验时期中每48小时继续(图29D)。在肿瘤植入之后4至5周，将小鼠处死，并且使来自用NK细胞注射以及饲喂和不饲喂AJ2益生细菌的携带肿瘤的小鼠的齿龈细胞解离并制备单细胞混悬液，并且用IL-2(1,000单位/ml)处理，并使用特异性ELISA来测定在培养7天之后收集的上清液中的IFN-γ水平(n＝4)(图29E)。来自各小鼠群组(即对照、在携带肿瘤的小鼠中注射NK、或在携带肿瘤的小鼠中注射NK以及饲喂AJ2)的齿龈细胞的IFN-γ分泌倍数增加基于从由仅携带肿瘤的小鼠获得的细胞释放的量来计算(图29F)。为证明自体NK细胞与同种异体NK细胞在各组小鼠之中显示相同活化概况，用IL-2(1,000单位/ml)处理来自用自体超动力NK细胞注射以及饲喂和不饲喂AJ2益生细菌的携带肿瘤的hu-BLT小鼠的齿龈细胞的单细胞混悬液，并且使用特异性ELISA在培养7天之后测定来自上清液的IFN-γ水平(n＝2)(图29G)。用IL-2(1,000单位/ml)处理来自用NK细胞注射以及饲喂和不饲喂AJ2益生细菌的携带肿瘤的小鼠的齿龈细胞的单细胞混悬液，并且使用多路阵列试剂盒在培养7天之后测定上清液中的IL-8水平(n＝4)(图29H)。在实验结束时切除来自用NK细胞注射，进行以及不进行用AJ2饲喂的携带肿瘤的hu-BLT小鼠的胰腺肿瘤，并且测定肿瘤重量(n＝3)(图29I)。用IL-2(1,000单位/ml)处理来自用NK细胞注射以及饲喂和不饲喂AJ2的携带口腔肿瘤的小鼠的齿龈细胞，并且使用特异性ELISA来在培养7天之后测定上清液中的IFN-γ水平(n＝2)(图29J)。
图30显示用NK细胞注射以及饲喂AJ2的携带肿瘤的小鼠的齿龈中CD45+和CD3+ T细胞的百分比。收集来自用NK细胞注射以及饲喂和不饲喂AJ2的携带口腔肿瘤的小鼠的齿龈，并且制备单细胞混悬液，如实施例中所述。在用相应PEcy5缀合抗体和FITC缀合抗体染色之后，使用流式细胞术分析来测定四组小鼠中齿龈中的CD45+和CD3+ T细胞的百分比。同种型对照抗体用作对照。
具体实施方式
基于免疫学分析、药理学分析和分子分析，益生细菌的特定组合诱导活化NK细胞中的显著分割无反应性，从而导致显著诱导IFN-γ和TNF-α。此外，益生细菌的所述组合物诱导NK细胞的显著扩增。
举例来说，本文所述的益生细菌组合物可单独施用，或与其他NK免疫疗法施用组合。在不希望受理论限制下，NK免疫疗法使受试者的免疫组织中的细胞因子产生增加，而益生菌补充进一步增强这些作用，从而导致在体内有更多分化肿瘤。
因此，本发明部分地涉及用于治疗炎症或其他免疫疾病或病症(包括癌症(例如口腔癌、结肠癌、胰腺癌或胃肠(GI)道中的其他癌症))的益生细菌的组合物和方法，所述方法采用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌菌株的组合物。在另一方面，本发明提供基于对本文所述的生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)的测定和分析来将患者分层以及预测靶标疾病(例如炎症性疾病和/或免疫疾病、癌症等)对用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌菌株的组合物进行的治疗的响应的诊断性、预后性和防治性方法。
I.定义
冠词“一个(种)(a/an)”在本文中用于指代冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个(种)要素”意指一个(种)要素或超过一个(种)要素。
术语“施用”意图包括允许剂执行它的预定功能的施用途径。可使用的用于身体治疗的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入和经皮途径。注射可为团式注射或可为连续输注。视施用途径而定，剂可用所选材料包衣或安置在所选材料中以保护它免遭可不利地影响它执行它的预定功能的能力的天然条件。剂可单独施用，或与药学上可接受的载体联合施用。剂也可以前药形式施用，所述前药在体内转化成它的活性形式。
术语“改变量”或“改变水平”是指生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)核酸的拷贝数(例如种系和/或体细胞)增加或降低，例如相较于对照样品中所述生物标志物核酸的表达水平或拷贝数，癌症样品中的表达水平增加或降低。生物标志物的术语“改变量”也包括相较于正常对照样品中的相应蛋白质水平，例如癌症样品的样品中的生物标志物蛋白质的蛋白质水平增加或降低。此外，生物标志物蛋白质的改变量可通过检测可影响所述生物标志物蛋白质的表达或活性的翻译后修饰诸如标志物的甲基化状况来测定。
如果相比于正常水平，生物标志物的量分别增大或减小超过用于评估数量的测定的标准误差的量，并且优选是相比于正常量，分别增大或减小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多，那么受试者中的所述生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)的量“显著”高于或低于所述生物标志物的正常量。或者，如果相比于生物标志物的正常量，量是分别至少约两倍，并且优选是至少约三倍、四倍或五倍高或低，那么受试者中的生物标志物的量可被视为“显著”高于或低于正常量。所述“显著性”也可应用于本文所述的任何其他测量参数，诸如表达、抑制、细胞毒性、细胞生长参数等。
生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)的术语“表达水平改变”是指相比于对照样品(例如来自未患有相关疾病的健康受试者的样品)中的所述生物标志物的表达水平或拷贝数，并且优选是相比于若干对照样品中的所述生物标志物的平均表达水平或拷贝数，测试样品例如源于罹患疾病或病症(例如炎症和/或其他免疫疾病或病症，包括癌症)的患者的样品中的所述生物标志物的表达水平或拷贝数增大或减小超过用于评估表达或拷贝数的测定的标准误差，并且优选是所述对照表达水平或拷贝数的至少两倍，并且更优选是三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍大或小。相比于对照样品(例如来自未患有相关疾病的健康受试者的样品)中的所述生物标志物的表达水平或拷贝数，并且优选是相比于若干对照样品中的所述生物标志物的平均表达水平或拷贝数，表达水平改变增大或减小超过用于评估表达或拷贝数的测定的标准误差，并且优选是相比于所述对照表达水平或拷贝数增大或减小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或是所述对照表达水平或拷贝数的更多倍大或小。在一些实施方案中，生物标志物的水平是指生物标志物自身的水平、经修饰生物标志物(例如磷酸化生物标志物)的水平或生物标志物相对于另一测量变量诸如对照的水平(例如磷酸化生物标志物相对于未磷酸化生物标志物)。
生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)的术语“活性改变”是指相较于正常对照样品中的所述生物标志物的活性，在疾病状态下例如在癌症样品中所述生物标志物的活性增加或降低。生物标志物的活性改变可为例如生物标志物的表达改变、生物标志物的蛋白质水平改变、生物标志物的结构改变或例如与和生物标志物涉及于相同或不同路径中的其他蛋白质的相互作用改变或与转录活化因子或抑制因子的相互作用改变的结果。
生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子诸如表1中所列的那些)的术语“结构改变”是指相较于正常或野生型基因或蛋白质，在生物标志物核酸或蛋白质内存在突变或等位基因变体，例如影响所述生物标志物核酸或蛋白质的表达或活性的突变。举例来说，突变包括但不限于取代、缺失或添加突变。突变可存在于生物标志物核酸的编码区或非编码区中。
除非本文内另外规定，否则术语“抗体”广泛涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体诸如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体、以及所有前述各物的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有至少抗原结合位点。抗体衍生物可包含缀合于抗体的蛋白质或化学部分。
如本文所用的术语“抗体”也包括抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)。如本文所用的术语“抗原结合部分”是指抗体的一种或多种保留特异性结合抗原(例如生物标志物多肽或其片段)的能力的片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)经分离互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但可使用重组方法由使得它们能够成为其中VL区和VH区配对以形成单价多肽的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；以及Osbourn等1998,NatureBiotechnology 16:778)的合成接头来使它们接合。所述单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。可使特定scFv的任何VH和VL序列连接于人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列以产生编码完整IgG多肽或其他同种型的表达载体。VH和VL也可用于使用蛋白质化学或重组DNA技术来产生Fab、Fv或其他免疫球蛋白片段。也涵盖其他形式的单链抗体，诸如微型双功能抗体(diabody)。微型双功能抗体是二价双特异性抗体，其中VH结构域和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短以致不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。
抗体可为多克隆或单克隆抗体；异种异体、同种异体或同种同基因抗体；或其经修饰形式(例如人源化抗体、嵌合抗体等)。抗体也可为完全人抗体。优选地，本发明的抗体特异性或大致上特异性结合生物标志物多肽或其片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指仅含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的一个种类的抗原结合位点的抗体多肽的群体，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有能够与特定抗原相互作用的多个种类的抗原结合位点的抗体多肽的群体。单克隆抗体组合物通常显示对它与其起免疫反应的特定抗原的单一结合亲和力。
术语“指定评分”是指在患者样品中测量之后对各生物标志物指定的数值。指定评分与生物标志物在样品中的不存在、存在或推断量相关联。指定评分可手动(例如通过目视检查)或借助于用于图像获取和分析的仪器产生。在某些实施方案中，指定评分通过定性评估例如根据分级量表检测荧光读出数据，或通过定量评估来确定。在某些实施方案中，确定“总计评分”，其是指多种测量生物标志物的指定评分的组合。举例来说，总计评分可为指定评分的总和。或者，指定评分的组合可涉及对指定评分进行数学运算，随后将它们组合成总计评分。在某些实施方案中，总计评分在本文中也称为“预测评分”。
术语“生物标志物”是指本发明的可测量实体，其已被确定可预测单独或与至少一种其他NK细胞相关免疫疗法组合的本文所述的益生细菌疗法对靶标疾病或病症(例如炎症性和/或免疫疾病或病症中的一者，诸如癌症)的作用。生物标志物可包括不限于核酸和蛋白质，包括表(例如表1)、实施例、附图中所示以及另外本文所述的那些。如本文所述，可使用生物标志物的任何相关特征，诸如拷贝数、数量、活性、定位、修饰(例如磷酸化)等。
术语“体液”是指从身体排泄或分泌的流体以及通常不从身体排泄或分泌的流体(例如羊水、水状液、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耳垢和耳屎、考珀氏液(cowper’s fluid)或射精前液、乳糜、食糜、粪便、雌性射出液、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物)。
术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增生”是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，所述特征诸如增殖不受控制、永生性、转移潜力、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态特征。除非另外陈述，否则所述术语包括化生。在一些实施方案中，所述特征包括以下中的至少一者：使宿主免疫应答沉默、使宿主免疫应答降低和/或避免宿主免疫应答，和/或对宿主细胞(例如NK细胞)裂解和/或分化具有抗性。在一些实施方案中，所述致癌细胞是癌症干细胞(例如口腔鳞状癌干细胞(OSCSC))。在一些实施方案中，所述细胞部分地或完全地由于至少一种遗传突变而展现所述特征。癌细胞经常呈肿瘤形式，但所述细胞可单独存在于动物内，或可为非致肿瘤性癌细胞诸如白血病细胞。如本文所用，术语“癌症”包括恶变前癌症以及恶性癌症。癌症包括但不限于B细胞癌例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、重链疾病诸如像α链疾病、γ链疾病和μ链疾病、良性单克隆γ球蛋白病和免疫细胞性淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、子宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。本发明涵盖的方法可适用的癌症类型的其他非限制性实例包括人肉瘤和癌瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚性癌、韦尔姆斯氏肿瘤(Wilms'tumor)、子宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经管母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突神经胶质细胞瘤、脑脊髓膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(髓母细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中，癌症在性质上是上皮性的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈部癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳型(Brenner)或未分化。
在一些实施方案中，癌症是“三阴性乳腺癌”或“TNBC”，其是指呈雌激素受体(ER)阴性、孕酮受体(PR)阴性和人表皮生长因子受体2(HER-2)阴性的乳腺癌(Pegram等(1998)J.Clin.Oncol.16:2659-2671；Wiggans等(1979)Cancer Chemother.Pharmacol.3:45-48；Carey等(2007)Clin.Cancer Res.13:2329-2334)。
在某些实施方案中，癌症是“PI3Kβ依赖性癌症”，其可指在功能上依赖于PI3Kβ的癌症。举例来说，即使肿瘤组织中的PI3Kβ(例如PI3KβmRNA、PI3Kβ蛋白、新合成的PI3Kβ蛋白等)的表达水平与它在正常组织中的表达水平类似，但如果诸如通过使用RNAi或任何其他手段来直接或间接抑制PI3KβmRNA和/或蛋白质，或缺失PI3Kβ基因(例如通过敲除或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术)导致对肿瘤发生、肿瘤细胞增殖、肿瘤转移或诱导肿瘤细胞分化的抑制，那么癌症也是PI3Kβ依赖性的。术语“PI3Kβ依赖性癌症”也指其中相比于在与PI3Kβ依赖性癌症具有相同细胞类型的非癌性细胞中表达的PI3Kβ的正常量，PI3Kβ以显著更高水平表达(例如PI3KβmRNA、PI3Kβ蛋白、新合成的PI3Kβ蛋白等)的癌症。
如本文所用的术语“微转移”优选定义为在最大宽度方面测量为大于0.2mm和/或具有大于200个细胞直至2mm的一组汇合癌细胞。更优选地，“微转移”定义为在最大宽度方面是0.2mm至2mm的一组汇合癌细胞(参见Edge等(2010)AJCC Cancer Staging Manual andHandbook(第7版))。对“微转移”的一替代性优选定义是一组至少1000个汇合癌细胞，并且在最宽尺寸方面是至少0.1mm直至在最宽尺寸方面是1mm。在标准对比MRI成像或其他临床成像技术的情况下，微转移通常不可见。然而，在某些癌症的情况下，针对肿瘤选择性抗原(例如乳腺癌转移的Her2)的放射性抗体允许使微转移显像。其他间接检测方法包括由于VEGF诱导的血管渗漏而在脑微转移部位处发生的造影介质渗漏(Yano等(2000)CancerRes.60:4959-49067；美国专利公布2015/0352113)。更灵敏的成像技术也可应用于检测微转移。举例来说，血容量可通过使用替代性造影剂USPIO(Molday Iron，Biopal,Worcester,Mass.)进行MRI来成像以检测微转移(Yin等(2009)Clin.Exp.Metastasis.26:403-414)。
术语“编码区”是指核苷酸序列的包含翻译成氨基酸残基的密码子的区域，而术语“非编码区”是指核苷酸序列的不翻译成氨基酸的区域(例如5'非翻译区和3'非翻译区)。
术语“互补”涉及两个核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广泛概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与反向平行于所述第一区域的第二核酸区域的某一残基形成特定氢键(“碱基配对”)，条件是所述残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反向平行于所述第一链的第二核酸链的某一残基碱基配对，条件是所述残基是鸟嘌呤。如果当核酸的第一区域和同一或不同核酸的第二区域以反向平行方式排列时，所述第一区域的至少一个核苷酸残基能够与所述第二区域的残基碱基配对，那么所述第一区域互补于所述第二区域。优选地，第一区域包含第一部分，并且第二区域包含第二部分，借此，当所述第一部分和所述第二部分以反向平行方式排列时，所述第一部分的至少约50％，并且优选至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
术语“对照”是指适于提供与测试样品中的表达产物的比较的任何参照标准。在某些实施方案中，对照包括获得“对照样品”，从所述对照样品检测表达产物水平，并且与来自测试样品的表达产物水平进行比较。这种对照样品可包括任何适合样品，包括但不限于来自具有已知结果的对照癌症患者的样品(可为储存样品或先前样品测量结果)；从受试者诸如正常患者或癌症患者分离的正常组织或细胞、从受试者诸如正常受试者或癌症患者分离的经培养原代细胞/组织、从癌症患者的相同器官或身体位置获得的邻近正常细胞/组织、从正常受试者分离的组织或细胞样品、或从寄存处获得的原代细胞/组织。在其他优选实施方案中，对照可包括来自包括但不限于持家基因的任何适合来源的参照标准表达产物水平、来自正常组织(或其他先前分析的对照样品)的表达产物水平范围、来自一组患者或一组具有某一结果(例如存活1年、2年、3年、4年等)或接受某一治疗(例如护理标准癌症疗法)的患者的测试样品内先前测定的表达产物水平范围。本领域技术人员应了解此类对照样品和参照标准表达产物水平可以组合方式作为对照用于本发明的方法中。在某些实施方案中，对照可包括正常或非癌性细胞/组织样品。在其他优选的实施方案中，对照可包括一组患者，诸如一组癌症患者，或一组接受某一治疗的癌症患者，或一组相对于另一结果，具有一种结果的患者的表达水平。在前述情况下，各患者的特定表达产物水平可被指定为百分位表达水平，或表示为高于或低于参照标准表达水平的平均值或均值。在其他优选的实施方案中，对照可包括正常细胞、来自用组合化学疗法治疗的患者的细胞、以及来自患有良性癌症的患者的细胞。在其他实施方案中，对照也可包括测量值，例如相较于持家基因在群体中的表达水平，特定基因在相同群体中的平均表达水平。这种群体可包含正常受试者、尚未经受任何治疗(即治疗原初性)的癌症患者、经受护理标准疗法的癌症患者、或患有良性癌症的患者。在其他优选的实施方案中，对照包括表达产物水平的比率变换，包括但不限于测定测试样品中两个基因的表达产物水平的比率，以及将它与参照标准中相同两个基因的任何适合比率进行比较；测定测试样品中两个或更多个基因的表达产物水平，以及测定任何适合对照中在表达产物水平方面的差异；以及测定测试样品中两个或更多个基因的表达产物水平，使它们的表达相对于测试样品中的持家基因的表达加以标准化，以及与任何适合对照进行比较。在特别优选的实施方案中，对照包括与测试样品具有相同谱系和/或类型的对照样品。在其他实施方案中，对照可包括一组患者样品诸如所有癌症患者内或基于一组患者样品诸如所有癌症患者以百分位形式群聚的表达产物水平。在某些实施方案中，确定对照表达产物水平，其中相对于例如特定百分位是较高或较低的表达水平用作用于预测结果的基础。在其他优选的实施方案中，使用来自具有已知结果的癌症对照患者的表达产物水平来确定对照表达产物水平，并且将来自测试样品的表达产物水平与所述对照表达产物水平进行比较，作为用于预测结果的基础。如由以下数据所显示，在将测试样品中的表达产物水平与对照进行比较时，本发明方法不限于使用特定截断点(cut-point)。
生物标志物核酸的“拷贝数”是指细胞(例如种系和/或体细胞)中编码特定基因产物的DNA序列的数目。通常，对于给定基因，哺乳动物具有各基因的两个拷贝。然而，拷贝数可通过基因扩增或重复来增加，或通过缺失来降低。举例来说，种系拷贝数变化包括在一个或多个基因组基因座处的变化，其中所述一个或多个基因组基因座不由对照中正常整套种系拷贝中的拷贝数(例如与从其测定特定种系DNA和相应拷贝数的物种相同的物种的种系DNA中的正常拷贝数)加以说明。体细胞拷贝数变化包括在一个或多个基因组基因座处的变化，其中所述一个或多个基因组基因座不由对照的种系DNA中的拷贝数(例如与从其测定体细胞DNA和相应拷贝数的受试者相同的受试者的种系DNA中的拷贝数)加以说明。
生物标志物核酸的“正常”拷贝数(例如种系和/或体细胞)或生物标志物核酸或蛋白质的“正常”表达水平是来自未罹患癌症的受试者例如人或来自患有癌症的同一受试者中的相应非癌性组织的生物样品中的活性/表达水平或拷贝数，所述生物样品例如含有组织、全血、血清、血浆、颊刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓的样品。
如本文所用，关于活化的免疫细胞的术语“共刺激”包括共刺激性分子能够提供诱导增殖或效应功能的第二非活化性受体介导信号(“共刺激性信号”)。举例来说，共刺激性信号可导致细胞因子分泌，例如在已接收T细胞受体介导的信号的T细胞的情况下。已例如通过活化性受体来接收细胞受体介导的信号的免疫细胞在本文中被称为“活化的免疫细胞”。
术语“确定适于受试者的治疗方案”用于意指确定用于受试者的治疗方案(即单药疗法或用于预防和/或治疗受试者的癌症的不同疗法的组合)，所述治疗方案基于或基本上基于或至少部分基于根据本发明的分析结果而起始、修改和/或终止。一个实例是在手术之后起始辅助疗法，其目的在于使复发风险降低，另一实例将在于修改特定化学疗法的剂量。除根据本发明的分析结果之外，确定可基于待治疗的受试者的个人特征。在大多数情况下，对适于受试者的治疗方案的实际确定将由主治医师或医生进行。
术语“诊断癌症”包括使用本发明的方法、系统和规程来确定癌症或其亚型在个体中的存在或不存在。所述术语也包括用于评估个体中的疾病活动性水平的方法、系统和规程。
如果分子与基底共价或非共价缔合以使所述基底可用流体(例如标准柠檬酸盐盐水，pH 7.4)冲洗而无所述分子的实质性部分从所述基底解离，那么所述分子被“固定”或“附接”于所述基底。
术语“表达特征”或“特征”是指一组一种或多种协调表达的与所测量表型相关的生物标志物。举例来说，组成这个特征的基因、蛋白质、代谢物等可在特定细胞谱系、分化阶段中或在特定生物应答期间表达。生物标志物可反映它们在其中表达的肿瘤的生物方面，诸如癌症起源细胞、活检中非恶性细胞的性质、以及导致癌症的致癌性机理。表达数据和基因表达水平可储存在计算机可读介质例如与微阵列或芯片读取装置联合使用的计算机可读介质上。所述表达数据可被操作来产生表达特征。
如本文所用的“同源”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列类似性。当两个区域中的某一核苷酸残基位置均由相同核苷酸残基占据时，那么所述区域在那个位置处是同源的。如果各区域的至少一个核苷酸残基位置由相同残基占据，那么第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性以两个区域的由相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位置的比例表示。举例来说，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域和具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域共有50％同源性。优选地，第一区域包含第一部分，并且第二区域包含第二部分，借此，各部分的至少约50％，并且优选至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置由相同核苷酸残基占据。更优选地，各部分的所有核苷酸残基位置都由相同核苷酸残基占据。
术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞为造血起源，并且包括淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
术语“免疫检查点”是指CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞表面上的一组通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来对免疫应答进行微调的分子。免疫检查点蛋白在本领域中是熟知的，并且包括不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT和A2aR(参见例如WO 2012/177624)。所述术语进一步涵盖生物活性蛋白片段以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白片段的核酸。在一些实施方案中，所述术语进一步涵盖根据本文提供的同源性描述的任何片段。
术语“细胞因子”是指在细胞信号传导中重要的一个广泛和宽松种类的小蛋白质(约5–20kDa)。它们的释放对在它们周围的细胞的行为具有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导中。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，并且可另外包括本公开中的激素或生长因子。细胞因子由广泛范围的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、纤维母细胞和各种基质细胞。优选的细胞因子例示于本公开的说明书和附图中，例如于表1中。
术语“细胞因子/趋化因子活性”包括细胞因子或趋化因子能够调节至少一种细胞功能。通常，细胞因子或趋化因子调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且它们调控特定细胞群体的成熟、生长和应答性。因此，术语“细胞因子/趋化因子活性”包括细胞因子或趋化因子能够结合它的天然细胞受体，能够调节细胞信号，以及能够调节免疫应答。
术语“免疫应答”包括T细胞介导和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞性细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞活化影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答性细胞例如巨噬细胞的活化。
术语“免疫治疗剂”可包括可刺激宿主免疫系统以产生对受试者的肿瘤或癌症的免疫应答的任何分子、肽、抗体或其他剂。各种免疫治疗剂适用于本文所述的组合物和方法中。
术语“抑制”包括降低、限制或阻断例如特定作用、功能或相互作用。在一些实施方案中，如果癌症的至少一种症状被缓和、终止、减缓或预防，那么癌症被“抑制”。如本文所用，如果癌症的复发或转移被减轻、减缓、延迟或预防，那么癌症也被“抑制”。类似地，如果相较于参照状态诸如对照如野生型状态，生物功能诸如蛋白质的功能被降低，那么它被抑制。举例来说，如果相较于野生型PI3激酶和/或未与抑制剂接触的PI3激酶，激酶活性由于突变和/或与抑制剂接触而被降低，那么突变PI3激酶或与PI3激酶抑制剂接触的PI3激酶的激酶活性被抑制。所述抑制可诸如通过在特定时间和/或地点施加剂来诱导，或诸如由于可遗传突变而可为组成型的。所述抑制也可为部分的或完全的(例如相较于参照状态诸如对照如野生型状态，基本上无可测量活性)。基本上完全抑制被称为阻断。
术语“相互作用”在涉及两个分子之间的相互作用时是指分子彼此的物理接触(例如结合)。通常，这种相互作用导致所述分子中的一者或两者具有活性(其产生生物作用)。
“试剂盒”是包括至少一种用于特异性检测和/或影响本发明的标志物的表达的试剂例如探针或小分子的任何制品(例如包装或容器)。试剂盒可以用于进行本发明方法的单元形式推销、销售或售卖。试剂盒可包括一种或多种为使适用于本发明方法中的组合物表达所必需的试剂。在某些实施方案中，试剂盒可进一步包括参照标准，例如编码不影响或调控控制细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的信号传导路径的蛋白质的核酸。本领域技术人员可设想许多所述对照蛋白质，包括但不限于常见分子标签(例如绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)、未由GeneOntology参考数据库分类在涵盖细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的任何路径中的蛋白质、或遍在持家蛋白。试剂盒中的试剂可提供于个别容器中，或以两种或更多种试剂的混合物形式提供于单一容器中。此外，可包括描述试剂盒内组合物的用途的指导材料。
术语“新辅助疗法”是指在初级治疗之前给与的治疗。新辅助疗法的实例可包括化学疗法、放射疗法和激素疗法。举例来说，在治疗乳腺癌时，新辅助疗法可允许患有大型乳腺癌的患者经受保乳手术。
生物标志物的“正常”表达水平和/或活性是未罹患癌症的受试者例如人患者的细胞中的所述生物标志物的表达水平和/或活性。生物标志物的“过度表达”或“显著较高的表达水平”是指相比于对照样品(例如来自未患有生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中的所述生物标志物的表达活性或水平，并且优选是相比于若干对照样品中的所述生物标志物的平均表达水平，测试样品中的表达水平大于用于评估表达的测定的标准误差，并且优选是相比于所述对照表达活性或水平，增大至少10％，并且更优选是所述对照表达活性或水平的1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍高或更多。生物标志物的“显著较低的表达水平”是指相比于对照样品(例如来自未患有生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中的所述生物标志物的表达水平，并且优选是相比于若干对照样品中的所述生物标志物的平均表达水平，测试样品中的表达水平降低至少10％，并且更优选是所述对照表达水平的1/1.2、1/1.3、1/1.4、1/1.5、1/1.6、1/1.7、1/1.8、1/1.9、1/2.0、1/2.1、1/2.1、1/2.2、1/2.3、1/2.4、1/2.5、1/2.6、1/2.7、1/2.8、1/2.9、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5、1/5、1/5.5、1/6、1/6.5、1/7、1/7.5、1/8、1/8.5、1/9、1/9.5、1/10、1/10.5、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20低或更大降低。可进行相同测定以确定过度活性或活性不足。
益生细菌
在一些实施方案中，本发明涉及能够调控NK细胞功能的包含至少一种益生细菌菌株的组合物。所述益生细菌诱导活化NK细胞中的显著分割无反应性，从而导致显著诱导IFN-γ和TNF-α。此外，所述益生细菌诱导NK细胞的显著扩增。
许多商业益生菌是可用的，具有使胃肠不适减轻或使免疫系统强化的各种作用。用于本文所述的组合物和方法中的优选益生细菌种包括可商购获得的那些益生细菌菌株，尤其是来自链球菌属(Streptococcus)(例如嗜热链球菌(S.thermophiles))、双歧杆菌属(Bifidobacterium)(例如长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)(例如嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、保加利亚乳酸杆菌(L.bulgaricus)、鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus)、植物乳酸杆菌(L.plantarum)和干酪乳酸杆菌(L.casei))的那些。本公开包括向受试者优选是哺乳动物(例如人)施用至少一种益生细菌菌株优选是两种或更多种不同细菌菌株的组合的方法。所述施用可全身或局部(例如直接向肠)进行。一优选施用途径是口服施用。也可使用其他途径(例如经直肠)。对于施用，可施用细菌(例如呈潮湿、经声波处理、经研磨或干燥形式或呈制剂形式)、含有细菌的细菌培养基、或细菌培养基上清液(不含有细菌)。
破骨细胞
破骨细胞是一种源于造血干细胞的骨细胞类型。它们的对骨组织进行再吸收的功能对骨的维持、修复和重塑至关重要。当在骨母细胞骨形成与破骨细胞骨再吸收之间存在平衡时，实现骨体内平衡。破骨细胞通过来自表达RANKL的骨母细胞的刺激和它们的由通过ICAM-1进行的坚固粘附介导的相互作用来成熟。破骨细胞也表达存在于活化NK细胞上的受体的许多配体。他们报道破骨细胞表达ULBP-1、ULBP-2/5/6和ULBP-3，但表达少许或不表达NK细胞的活化性受体NKG2D的MIC-A、MIC-B或I类MHC样配体。
相较于树突细胞(DC)和单核细胞，破骨细胞(OC)是NK细胞扩增和功能的显著活化物(Tseng等(2015)Oncotarget 6(24):20002-25)。另外，破骨细胞分泌大量已知会使NK细胞活化的IL-12、IL-15、IFN-γ和IL-18；破骨细胞也表达重要的NK活化配体。本公开提供一种关于如何使高度功能性超动力经破骨细胞扩增NK细胞扩增以致水平显著高于通过其他方法确立的水平的新型策略。若干体外NK扩增技术已被开发来确立较高治疗性细胞剂量，同时使NK细胞的活性和体内增殖潜力加强。这些技术中的一些包括刺激外周血液单核细胞(PBMC)，从PBMC纯化NK细胞群体，或有时与各种饲养细胞诸如表达膜结合型IL-15和41BB配体的K562细胞(K562-mb15-41BBL)、EBV-TM-LCL、韦尔姆斯氏肿瘤或经照射PBMC组合使用人脐带血。这些研究已产生具有良好功能的临床相关NK细胞数目。
本公开提供一种使用破骨细胞使NK细胞扩增的新型方法，从而导致肿瘤靶细胞对NK细胞介导的凋亡的敏感性增强以及细胞因子产生增强。
术语“预定”生物标志物量和/或活性测量结果可为仅举例来说用于评估可被选择来进行特定治疗的受试者，评估对诸如使用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌菌株的组合物进行的治疗的响应，和/或评估疾病状态的生物标志物量和/或活性测量结果。预定生物标志物量和/或活性测量结果可于患有或不患有癌症的患者的群体中测定。预定生物标志物量和/或活性测量结果可为可同等适用于每个患者的单一数目，或预定生物标志物量和/或活性测量结果可变化以反映特定患者子群体之中的差异。受试者的年龄、重量、身高和其他因素可影响个体的预定生物标志物量和/或活性测量结果。此外，可个别地测定各受试者的预定生物标志物量和/或活性。在某些实施方案中，在本文所述的方法中测定和/或比较的量基于绝对测量结果。在其他实施方案中，在本文所述的方法中测定和/或比较的量基于相对测量结果，诸如比率(例如相对于持家生物标志物或另外通常恒定的生物标志物的表达标准化的血清生物标志物)。预定生物标志物量和/或活性测量结果可为任何适合标准。举例来说，预定生物标志物数量和/或活性测量结果可从正对其进行患者选择评估的同一人或不同人获得。在一些实施方案中，预定生物标志物量和/或活性测量结果可从同一患者的先前评估获得。以这种方式，可随时间监测患者的选择进展。此外，如果受试者是人，那么对照可从对另一人或多人例如所选人群组的评估获得。以这种方式，可将正对其进行选择评估的人的选择程度与适合其他人例如处于与目标人类似情况下的其他人进行比较，所述其他人诸如罹患类似或相同病状和/或属于相同族群的那些。
术语“预测”包括使用在疗法之前、期间或之后的生物标志物核酸和/或蛋白质状况例如过度活性或活性不足、肿瘤的出现、表达、生长、缓解、复发或抗性来确定癌症对采用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物进行的疗法发生响应的可能性。对生物标志物的所述预测性使用可由例如以下来确认：(1)例如在超过约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多的经测定人癌症类型或癌症样品中，拷贝数增加或降低(例如通过FISH、FISH加SKY、例如如本领域中至少在J.Biotechnol.,86:289-301处所述的单分子测序、或qPCR)，生物标志物核酸的过度表达或表达不足(例如通过ISH、Northern印迹或qPCR)，生物标志物蛋白质增加或降低(例如通过IHC)，或活性增加或降低；(2)它在生物样品中绝对或相对受调节存在或不存在，所述生物样品例如含有来自罹患癌症的受试者例如人的组织、全血、血清、血浆、颊刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便或骨髓的样品；(3)它在患有癌症的患者(例如对单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物发生响应的那些，或发展对单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物的抗性的那些)的临床子组中绝对或相对受调节存在或不存在。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“防治性治疗”等是指使不患有疾病、病症或病状，但处于发展所述疾病、病症或病状的风险下或容易发展所述疾病、病症或病状的受试者中发展疾病、病症或病状的概率降低。
术语“探针”是指能够选择性结合明确预定靶标分子例如由生物标志物核酸编码或对应于生物标志物核酸的核苷酸转录物或蛋白质的任何分子。探针可由本领域技术人员合成，或源于适当的生物制剂。出于检测靶标分子的目的，探针可如本文所述被具体设计以加以标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
术语“预后”包括预测癌症的可能过程和结果或从疾病恢复的可能性。在一些实施方案中，使用统计算法提供个体的癌症预后。举例来说，预后可为手术、发展癌症(例如实体肿瘤诸如食道癌和胃癌)的临床亚型、发展一种或多种临床因素、或从疾病恢复。
术语“对抗癌疗法的响应”或“对用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物进行的疗法的响应”涉及过度增生性病症(例如癌症)对一种或多种抗癌剂诸如用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物进行的治疗的任何响应，优选涉及在启动新辅助疗法或辅助疗法之后肿瘤质量和/或体积的变化。可评估过度增生性病症响应的例如功效，或可评估在新辅助或辅助情况下的过度增生性病症响应，其中在新辅助或辅助情况中可将在全身性干预之后的肿瘤尺寸与初始尺寸和大小进行比较，所述尺寸和大小如通过CT、PET、乳房摄影术、超声或触诊所测量。响应也可通过在活检或手术切除之后对肿瘤进行测径规测量或病理性检查来评估。响应可以定量方式如肿瘤体积变化百分比记录，或以定性方式如“病理性完全响应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进行性疾病”(cPD)或其他定性准则记录。过度增生性病症响应的评估可在开始新辅助或辅助疗法之后早期进行，例如在数小时、数天、数周之后或优选在数月之后。响应评估的一典型终点是在终止新辅助化学疗法后或在手术移除残余肿瘤细胞和/或肿瘤床后。这通常在启动新辅助疗法之后3个月。在一些实施方案中，本文所述的治疗性治疗的临床功效可通过测量临床受益率(CBR)来确定。临床受益率通过在疗法结束后至少6个月的时间点测定处于完全缓解(CR)的患者的百分比、处于部分缓解(PR)的患者的数目百分比和患有稳定疾病(SD)的患者的数目百分比的总和来测量。这个公式的简写形式是CBR＝超过6个月的CR+PR+SD。在一些实施方案中，特定癌症治疗方案的CBR是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更大。用于评估对癌症疗法的响应的额外准则与“存活”相关，所述存活包括以下中的全部：直至死亡的存活期，也称为总存活期(其中所述死亡可不管原因或与肿瘤相关)；“无复发存活期”(其中术语复发应包括局部复发与远端复发两者)；无转移存活期；无疾病存活期(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。所述存活期的长度可通过参照确定起点(例如诊断或开始治疗的时间)和终点(例如死亡、复发或转移)来计算。此外，用于确定治疗功效的准则可被扩展来包括对化学疗法的响应、存活概率、在给定时期内的转移概率以及肿瘤复发概率。举例来说，为确定适当阈值，可向受试者群体施用特定癌症治疗方案，并且可使结果与在施用任何癌症疗法之前测定的生物标志物测量结果相关联。结果测量结果可为对在新辅助环境下给与的疗法的病理性响应。或者，结果量度诸如总存活期和无疾病存活期可在已知其生物标志物测量值的癌症疗法之后一段时期内对受试者加以监测。在某些实施方案中，施用的剂量是本领域中已知的用于癌症治疗剂的标准剂量。监测受试者所持续的时期可变化。举例来说，可监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。与癌症疗法的结果相关联的生物标志物测量阈值可使用在本领域中的熟知方法诸如实施例章节中所述的那些来测定。
术语“抗性”是指癌症样品或哺乳动物对癌症疗法的获得性抗性或天然抗性(即对治疗性治疗是非响应性的，或对治疗性治疗具有降低或有限的响应)，诸如具有的对治疗性治疗的响应降低25％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，降低至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20或更大降低。响应降低可通过与在获得抗性之前的相同癌症样品或哺乳动物进行比较，或通过与已知不具有对治疗性治疗的抗性的不同癌症样品或哺乳动物进行比较来测量。对化学疗法的典型获得性抗性被称为“多药物抗性”。多药物抗性可由P-糖蛋白介导，或可由其他机理介导，或它可在哺乳动物受多药物抗性微生物或微生物的组合感染时发生。确定对治疗性治疗的抗性在本领域中是常规的，并且属于普通熟练临床医师的技能，例如可如同“敏化”一样通过如本文所述的细胞增殖测定和细胞死亡测定来测量。在一些实施方案中，术语“使抗性逆转”意指使用第二剂与初级癌症疗法(例如化学治疗或放射疗法)组合能够在相较于在一定情况下未得以治疗的肿瘤的肿瘤体积时，在统计学显著水平(例如p<0.05)下产生肿瘤体积显著降低，在所述情况下单独所述初级癌症疗法(例如化学治疗或放射疗法)不能相较于未治疗肿瘤的肿瘤体积而产生肿瘤体积的统计学显著降低。这通常适用于在未治疗肿瘤以对数节奏生长时进行的肿瘤体积测量。
术语“响应”或“响应性”是指抗癌响应，诸如在使肿瘤尺寸降低或抑制肿瘤生长的意义上。所述术语也可指预后改善，例如如由达到复发的时间增加所反映，所述时间是达到第一复发的时期，删截作为第一事件的第二原发性癌症或无复发迹象的死亡；或总存活期增加，所述总存活期是从治疗至由于任何原因的死亡的时期。发生响应或具有响应意指存在当暴露于刺激物时获得的有益终点。或者，在暴露于刺激物时，负面或有害症状得以最小化、缓和或减弱。应了解评估肿瘤或受试者将展现有利响应的可能性等效于评估所述肿瘤或受试者将不展现有利响应(也就是将展现缺乏响应或是非响应性的)的可能性。
用于检测或测定至少一种生物标志物的存在或水平的术语“样品”通常是脑组织、脑脊髓液、全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便(例如屎)、泪液和任何其他体液(例如如上在对“体液”的定义下所述)，或组织样品(例如活检)诸如小肠、结肠样品或手术切除组织。在某些情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定至少一种标志物在样品中的存在或水平之前从个体获得样品。
术语“敏化”意指以允许用癌症疗法更有效治疗相关癌症的方式(例如通过用本文所述的组合物治疗)改变癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，正常细胞未在导致正常细胞被过度损伤的程度上受到影响。对治疗性治疗的敏感性增加或敏感性降低根据用于特定治疗的本领域中已知方法和本文在以下所述的方法来测量，所述方法包括但不限于细胞增殖测定(Tanigawa等(1982)Cancer Res.42:2159-2164)、细胞死亡测定(Weisenthal等(1984)Cancer Res.94:161-173；Weisenthal等(1985)Cancer Treat.Rep.69:615-632；Weisenthal L M,Kaspers等编Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma.Langhorne,P A:Harwood Academic Publishers,1993:415-432；Weisenthal等(1994)Contrib.Gynecol.Obstet.19:82-90)。敏感性或抗性也可通过历经一段时期例如对于人是6个月以及对于小鼠是4-6周测量肿瘤尺寸减小来在动物中测量。如果相较于在不存在组合物或方法下的治疗敏感性或抗性，治疗敏感性增加或抗性降低是25％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多，治疗敏感性增加至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，抗性降低至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/15、1/20或更大降低，那么所述组合物或方法使对治疗性治疗的响应敏化。确定对治疗性治疗的敏感性或抗性在本领域中是常规的，并且属于普通熟练临床医师的技能。应了解本文所述的用于增强癌症疗法的功效的任何方法都可同等应用于使过度增殖性或另外癌性细胞(例如抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。
术语“特异性结合”是指剂诸如抗体结合预定靶标诸如抗原。通常，当通过使用作为分析物的目标抗原和作为配体的抗体，在测定仪器中采用表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以约小于10-7M诸如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低值的亲和力(KD)结合，并且相比于它与除预定抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)或密切相关抗原结合的亲和力，以是至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或更大的亲和力结合预定抗原。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。选择性结合是涉及抗体能够区别一种抗原的结合与另一抗原的结合的相对术语。
术语“协同作用”是指两种或更多种抗癌剂(例如用单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物的组合进行的治疗)的组合作用可大于单独抗癌剂的单独作用的总和。
术语“受试者”是指任何健康动物、哺乳动物或人、或罹患癌症的任何动物、哺乳动物或人，所述癌症例如脑转移、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤等。术语“受试者”可与“患者”互换。
术语“存活”包括以下中的全部：直至死亡的存活期，也称为总存活期(其中所述死亡可不管原因或与肿瘤相关)；“无复发存活期”(其中术语复发应包括局部复发与远端复发两者)；无转移存活期；无疾病存活期(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。所述存活期的长度可通过参照确定起点(例如诊断或开始治疗的时间)和终点(例如死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的准则可被扩展来包括对化学疗法的响应、存活概率、在给定时期内的转移概率以及肿瘤复发概率。
术语“治疗作用”是指由药理活性物质在动物，特别是哺乳动物，并且更特别是人中导致的局部或全身作用。因此，所述术语意指意图用于在动物或人中诊断、治愈、缓和、治疗或预防疾病，或增强合乎需要的身体或心理发展和状况的任何物质。短语“治疗有效量”意指这种物质的在可适用于任何治疗的合理益处/风险比率下产生一定所需局部或全身作用的那个量。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量将取决于它的治疗指数、溶解性等。举例来说，由本发明方法发现的某些化合物可以足以产生可适用于所述治疗的合理益处/风险比率的量施用。
“经转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与成熟mRNA的全部或一部分互补或同源(或同一)的多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA、或所述RNA或cDNA的类似物)，其通过生物标志物核酸的转录和RNA转录物的正常转录后加工(例如剪接)(如果有的话)以及RNA转录物的逆转录所产生。
如本文所用，术语“不响应”包括癌细胞对疗法的抵抗性或治疗性细胞诸如免疫细胞对刺激例如通过活化性受体或细胞因子进行的刺激的抵抗性。不响应可例如由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量的抗原而发生。如本文所用，术语“无反应性”或“耐受性”包括对活化性受体介导的刺激的抵抗性。所述抵抗性通常具有抗原特异性，并且在已停止暴露于耐受抗原之后持续。举例来说，在T细胞的情况下的无反应性(与不响应相对比)的特征在于缺乏细胞因子产生，例如IL-2。T细胞无反应性在T细胞暴露于抗原以及在不存在第二信号(共刺激性信号)下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时发生。在这些条件下，使细胞重新暴露于相同抗原(即使重新暴露在共刺激性多肽存在下发生)导致不能产生细胞因子，并且因此导致不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，那么无反应性T细胞可增殖。举例来说，T细胞无反应性也可根据缺乏由T淋巴细胞产生IL-2来观察，如通过ELISA或通过使用指示细胞系进行增殖测定来测量。或者，可使用报告基因构建体。举例来说，无反应性T细胞未能引发在5’IL-2基因增强子控制下由异源性启动子诱导，或由可见于增强子内的AP1序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等(1992)Science 257:1134)。
在特定蛋白质的氨基酸序列与可编码所述蛋白质的核苷酸序列之间存在已知和明确对应性，如由遗传密码所限定。同样，在特定核酸的核苷酸序列与由那个核酸编码的氨基酸序列之间存在已知和明确对应性，如由遗传密码所限定。
遗传密码的一重要和熟知特征是它的冗余性，借此，对于大多数用于产生蛋白质的氨基酸，可采用超过一种编码核苷酸三联体。因此，许多不同核苷酸序列可编码给定氨基酸序列。所述核苷酸序列被视为具有功能等效性，因为它们导致在所有生物体中都产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可翻译一些序列比它们翻译其它序列更加高效)。此外，有时，嘌呤或嘧啶的甲基化变体可见于给定核苷酸序列中。所述甲基化不影响三核苷酸密码子与相应氨基酸之间的编码关系。
鉴于先前所述，编码生物标志物核酸(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列可用于使用用以将所述DNA或RNA翻译成氨基酸序列的遗传密码来获得多肽氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可编码多肽的相应核苷酸序列可从遗传密码推导(由于遗传密码的冗余性，此将产生任何给定氨基酸序列的多个核酸序列)。因此，本文对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应被视为也包括对由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文对多肽氨基酸序列的描述和/或公开应被视为也包括对可编码所述氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的描述和/或公开。
最后，本发明的基因座和生物标志物的核酸和氨基酸序列信息在本领域中是熟知的，并且可易于采用可公开获得数据库诸如国家生物技术信息中心(NCBI)数据库来获得。
II.受试者
在某些实施方案中，适于本文公开的组合物和方法的受试者是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、灵长类动物、非人哺乳动物、家养动物，诸如狗、猫、母牛、马等)，并且优选是人。在其他实施方案中，受试者是癌症动物模型。举例来说，动物模型可为人口腔鳞状癌的原位异种移植物动物模型，或包含癌症干细胞(CSC)/未分化肿瘤。
在本发明方法的其他实施方案中，受试者尚未经受治疗，诸如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或抗免疫疗法(诸如NK细胞相关免疫疗法)。在其他实施方案中，受试者已经受治疗，诸如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或抗免疫疗法(诸如NK细胞相关免疫疗法)。
在某些实施方案中，受试者已进行用以移除癌性组织或癌前组织的手术。在其他实施方案中，癌性组织尚未被移除，例如癌性组织可位于身体的不宜手术区域中，诸如在为生命所必需的组织中，或在手术程序将在其中导致可观患者伤害风险的区域中。
本发明方法可用于治疗和/或确定受试者的许多不同癌症诸如本文所述的那些对单独或与其他NK免疫疗法组合的包含至少一种益生细菌的组合物的响应性。
III.抗癌疗法
在一个方面，可施用其他抗癌疗法和/或免疫疗法组合或各种疗法的组合(例如一种或多种PI3Kβ选择性抑制剂诸如KIN193与一种或多种免疫检查点抑制剂诸如抗PD-1抗体组合，单独或与额外抗癌疗法诸如靶向疗法组合)，特别是如果受试者已首先被指示为是对如本文公开的组合物的可能响应者。在其他实施方案中，一旦受试者被指示为不是对所述疗法的可能响应者，即可避免所述疗法，并且替代性治疗方案诸如靶向和/或非靶向抗癌疗法可连同如本文公开的组合物一起施用。
组合疗法也被涵盖，并且可包括例如一种或多种化学治疗剂和放射、一种或多种化学治疗剂和免疫疗法、或一种或多种化学治疗剂、放射和化学疗法，各组合可与如本文公开的疗法一起。如下所述，剂可以与例如化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、经放射性标记化合物或与手术、冷冻疗法和/或放射疗法的组合疗法形式施用。先前治疗方法可与其他形式的常规疗法(例如为熟练技术人员所熟知的癌症护理标准治疗)联合施用，采用与常规疗法连续，在常规疗法之前，或在常规疗法之后的方式。举例来说，这些调节剂可与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在其他实施方案中，这些调节剂与化学疗法联合施用以使化学治疗剂的活性和功效增强。医师案头参考(Physicians’ Desk Reference，PDR)公开已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。在治疗上有效的这些以上提及的化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定黑素瘤、疾病的程度和为本领域中熟练医师所熟悉的其他因素，并且可由医师确定。
术语“靶向疗法”是指施用与所选生物分子选择性相互作用以由此治疗癌症的剂。一个实例包括乳腺癌或卵巢癌抗原。
或者，免疫疗法是可包括例如使用癌症疫苗和/或敏化抗原递呈细胞的一种靶向疗法形式。举例来说，溶瘤性病毒是能够感染和裂解癌细胞，同时使正常细胞不受伤害，从而使得它们潜在适用于癌症疗法中的病毒。溶瘤性病毒的复制有助于肿瘤细胞破坏，并且也在肿瘤部位处产生剂量扩增。它们也可充当抗癌基因的载体，从而使得它们被特异性递送至肿瘤部位。免疫疗法可涉及通过施用预先形成的针对癌症抗原或疾病抗原的抗体(例如施用任选连接于化学治疗剂或毒素的针对肿瘤抗原的单克隆抗体)来实现的被动免疫性以短期保护宿主。免疫疗法也可着重于使用细胞毒性淋巴细胞识别的癌细胞系表位。或者，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等可用于选择性调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理相关联的生物分子。
术语“非靶向疗法”是指施用不与所选生物分子选择性相互作用，但治疗癌症的药剂。非靶向疗法的代表性实例包括不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。
在某些实施方案中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。这种化学治疗剂可为但不限于从以下化合物群组之中加以选择的那些：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、烷基化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物碱和毒素；及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷基化剂：顺铂(cisplatin)、曲奥舒凡(treosulfan)和氯乙环磷酰胺(trofosfamide)；植物碱：长春花碱(vinblastine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxol)；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素(mitomycin)；抗叶酸剂：甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸(mycophenolic acid)和羟基脲(hydroxyurea)；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)和胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)；嘌呤类似物：巯基嘌呤(mercaptopurine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；DNA抗代谢剂：2'-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)和吡唑并咪唑；以及抗有丝分裂剂：大田软海绵素(halichondrin)、秋水仙碱(colchicine)和根霉素(rhizoxin)。也可使用包含一种或多种化学治疗剂的组合物(例如FLAG、CHOP)。FLAG包含氟达拉滨(fludarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺、长春新碱、多柔比星(doxorubicin)和泼尼松(prednisone)。在另外实施方案中，使用PARP(例如PARP-1和/或PARP-2)抑制剂，并且所述抑制剂在本领域中是熟知的(例如奥拉帕尼(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-Gene Research Laboratories,Inc.)；INO-1001(InotekPharmaceuticals Inc.)；PJ34(Soriano等,2001；Pacher等,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen)；4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲酰胺(再颁美国专利36,397)；和NU1025(Bowman等))。作用机理通常与PARP抑制剂能够结合PARP以及使它的活性降低相关。PARP催化.β.-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化成烟酰胺和聚ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)与PARP两者均已与转录调控、细胞增殖、基因组稳定性和癌发生相关联(Bouchard V.J.等Experimental Hematology,第31卷,第6期,2003年6月,第446-454页(9)；Herceg Z.；Wang Z.-Q.Mutation Research/Fundamental and MolecularMechanisms of Mutagenesis,第477卷,第1、2期,2001年6月,第97-110页(14))。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)是DNA单链断裂(SSB)修复中的关键分子(de Murcia J.等1997.ProcNatl Acad Sci USA94:7303-7307；Schreiber V,Dantzer F,Ame J C,de Murcia G(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528；Wang ZQ等(1997)Genes Dev 11:2347-2358)。通过抑制PARP1功能来敲除SSB修复会诱导DNA双链断裂(DSB)，其可触发同源性引导的DSB修复有缺陷的癌细胞的合成致死性(Bryant H E等(2005)Nature 434:913-917；Farmer H等(2005)Nature 434:917-921)。化学治疗剂的前述实例是说明性的，并且不意图具有限制性。
在其他实施方案中，使用放射疗法。用于放射疗法中的辐射可为电离辐射。放射疗法也可为γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外部射束放射疗法、间质植入放射性同位素(I-125、钯、铱)、放射性同位素诸如锶-89、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或总体腹部和骨盆放射疗法。对于放射疗法的一般性概述，参见Hellman,第16章:Principles of Cancer Management:Radiation Therapy,第6版,2001,DeVita等编,J.B.Lippencott Company,Philadelphia。放射疗法可以外部射束放射或远距疗法形式施用，其中辐射从远距离源头加以引导。放射治疗也可以内部疗法或近距疗法形式施用，其中将放射源接近于癌细胞或肿瘤团块来放置在身体内部。也涵盖使用光动力疗法，其包括施用光敏剂，诸如血卟啉(hematoporphyrin)和它的衍生物、维替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂Pc4、脱甲氧基-竹红菌素A(demethoxy-hypocrellinA)；和2BA-2-DMHA。
在其他实施方案中，手术干预可物理移除癌性细胞和/或组织。
在其他实施方案中，使用激素疗法。激素治疗性治疗可包括例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(利普安(LUPRON))、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂以及类固醇(例如地塞米松(dexamethasone)、类视黄醇(retinoid)、德尔托伊德(deltoids)、倍他米松(betamethasone)、皮质醇(cortisol)、可的松(cortisone)、泼尼松(prednisone)、脱氢睾固酮(dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoid)、矿物类皮质激素(mineralocorticoid)、雌激素(estrogen)、睾酮(testosterone)、孕激素(progestin)、维生素A衍生物(例如全反式视黄酸(全反式视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗促孕激素剂(例如米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素剂(例如乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate))。
在其他实施方案中，使用高温，即一种其中使身体组织暴露于高温(多达106℉)的程序。热可通过使细胞受损或将它们需要用以生存的物质从它们剥夺来有助于使肿瘤收缩。高温疗法可为使用外部和内部加热装置达成的局部性、区域性和全身高温。高温几乎始终与其他疗法形式(例如放射疗法、化学疗法和生物疗法)一起使用以试图使它们的有效性增加。局部高温是指将热施加于极小区域诸如肿瘤。区域可用来自在身体外部的装置的瞄准肿瘤的高频波在外部加热。为实现内部加热，可使用若干类型的无菌探针中的一者，包括纤细经加热丝线或用温水填充的中空管；植入微波天线；和射频电极。在区域性高温中，对器官或肢体加热。将产生高能量的磁体和装置放置在待加热区域上。在称为灌注的另一方法中，将一些患者血液移除，加热，接着泵送(灌注)至待在内部加热的区域中。全身加热用于治疗已遍及身体进行扩散的转移性癌症。这可使用温水毯、热蜡、感应线圈(如电热毯中的那些)或热腔室(类似于大型孵育器)来实现。高温不导致辐射副作用或并发症的任何显著增加。然而，直接施加于皮肤的热量可在约一半治疗患者中导致不适或甚至显著局部疼痛。这也可导致水疱，其通常会快速愈合。
在其他实施方案中，光动力疗法(也称为PDT、光辐射疗法、光线疗法或光化学疗法)用于治疗一些类型的癌症。
在其他实施方案中，激光疗法用于利用高强度光照来破坏癌细胞。这个技术经常用于减轻癌症的症状诸如流血或阻塞，尤其是在癌症不能通过其他治疗来治愈时。它也可用于通过使肿瘤收缩或破坏来治疗癌症。
用疗法进行的治疗的持续时间和/或剂量可根据特定治疗剂或其组合而变化。适于特定癌症治疗剂的治疗时间将由熟练技术人员所了解。本发明涵盖连续评估各癌症治疗剂的最优治疗时程，其中受试者的如通过本发明方法确定的癌症表型是确定最优治疗剂量和时程的一个因素。
在其他实施方案中，可向受试者施用重组生物标志物多肽及其片段。在一些实施方案中，可构建和施用具有增强的生物性质的融合蛋白。此外，生物标志物多肽及其片段可根据本领域中熟知的药理学方法加以修饰(例如聚乙二醇化、糖基化、寡聚化等)以进一步增强合乎需要的生物活性，诸如生物可用度增加和蛋白水解降解降低。
临床功效可通过本领域中已知的任何方法来测量。举例来说，对疗法诸如如本文公开的组合物的响应涉及癌症例如肿瘤对疗法的任何响应，优选涉及在启动新辅助化学疗法或辅助化学疗法之后肿瘤质量和/或体积的变化。可评估在新辅助或辅助情况下的肿瘤响应，在所述新辅助或辅助情况下可将在全身性干预之后的肿瘤尺寸与初始大小和尺寸进行比较，所述大小和尺寸如通过CT、PET、乳房摄影术、超声或触诊所测量，并且可在组织学方面估计肿瘤的细胞性并与在启动治疗之前获取的肿瘤活检的细胞性进行比较。响应也可通过在活检或手术切除之后对肿瘤进行测径规测量或病理性检查来评估。响应可以定量方式如肿瘤体积或细胞性变化百分比或使用半定量评分系统诸如残余癌症负荷(Symmans等,J.Clin.Oncol.(2007)25:4414-4422)或米勒-佩恩(Miller-Payne)评分(Ogston等,(2003)Breast(Edinburgh,Scotland)12:320-327)加以记录，以定性方式如“病理性完全响应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进行性疾病”(cPD)或其他定性准则加以记录。肿瘤响应评估可在开始新辅助或辅助疗法之后早期进行，例如在数小时、数天、数周之后或优选在数月之后。响应评估的一典型终点是在终止新辅助化学疗法后或在手术移除残余肿瘤细胞和/或肿瘤床后。
在一些实施方案中，本文所述的治疗性治疗的临床功效可通过测量临床受益率(CBR)来确定。临床受益率通过自疗法结束的至少6个月的时间点测定处于完全缓解(CR)的患者的百分比、处于部分缓解(PR)的患者的数目百分比和患有稳定疾病(SD)的患者的数目百分比的总和来测量。这个公式的简写形式是在6个月期间CBR＝CR+PR+SD。在一些实施方案中，特定治疗方案的CBR是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更大。
用于评估对如本文公开的疗法的响应的额外准则与“存活期”相关，所述存活包括以下中的全部：直至死亡的存活期，也称为总存活期(其中所述死亡可不管原因或与肿瘤相关)；“无复发存活期”(其中术语复发应包括局部化复发与远端复发两者)；无转移存活期；无疾病存活期(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。所述存活期的长度可通过参照确定起点(例如诊断或开始治疗的时间)和终点(例如死亡、复发或转移)来计算。此外，治疗功效的准则可被扩展来包括对化学疗法的响应、存活概率、在给定时期内的转移概率以及肿瘤复发概率。
举例来说，为确定适当的阈值，可向受试者群体施用特定抗癌治疗方案，并且可使结果与在施用任何如本文公开的组合物之前测定的生物标志物测量结果相关联。结果测量结果可为对在新辅助环境下给与的疗法的病理性响应。或者，结果量度诸如总存活期和无疾病存活期可在已知其生物标志物测量值的疗法之后历经一段时期对受试者加以监测。在某些实施方案中，向各受试者施用相同剂量的治疗性组合物。监测受试者所持续的时期可变化。举例来说，可监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。与如本文公开的疗法的结果相关联的生物标志物测量阈值可使用各种方法诸如实施例章节中所述的那些来测定。
3.药物组合物
本发明提供本文公开的组合物的药学上可接受的组合物。如以下所详述，本发明的药物组合物可以固体或液体形式特别配制以进行施用，所述固体或液体形式包括适合于以下的那些形式：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)例如通过以例如无菌溶液或混悬液形式皮下、肌肉内或静脉内注射进行的胃肠外施用；(3)局部施加，例如以乳膏剂、软膏剂或喷雾剂形式向皮肤施加；(4)阴道内或直肠内，例如以阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂形式；或(5)气雾剂，例如以水性气雾剂、脂质体制剂或固体粒子形式。
本文所述的组合物可用于口服施用以到达胃肠道，从而对准将益生细菌引入胃肠道的组织中的目标。本发明的治疗性组合物的制剂也可包括其他益生菌剂或促进芽孢萌发和/或细菌生长的营养物。一示例性物质是促双歧杆菌生长性寡糖，其促进有益益生细菌的生长。在某一实施方案中，将益生细菌菌株与治疗有效剂量的(优选是广谱)抗生素或抗真菌剂组合。在一些实施方案中，本文所述的组合物被囊封成以肠溶方式包衣的定时释放的胶囊或片剂。肠溶性包衣允许胶囊/片剂在它穿过胃肠道时保持完整(即未溶解)，直至在某一时间之后和/或直至它到达胃肠道的某一部分(例如小肠)。定时释放组分持续预定时期防止本文所述的组合物中的益生细菌菌株的“释放”。
本发明的治疗性组合物也可包括已知的抗氧化剂、缓冲剂和其他剂诸如着色剂、调味剂、维生素或矿物质。
在一些实施方案中，将本发明的治疗性组合物与载体组合，所述载体在生理上可与它向其施用的物种的胃肠组织相容。载体可包含基于固体的干燥物质以用于配制成片剂、胶囊或粉状形式；或载体可包含基于液体或凝胶的物质以用于配制成液体或凝胶形式。载体的特定类型以及最终制剂部分地取决于所选施用途径。本发明的治疗性组合物也可包括多种载体和/或粘合剂。一种优选的载体是以足以完成1克剂量总重量的量添加的微晶纤维素(MCC)。载体可为基于固体的干燥物质以用于以片剂、胶囊或粉状形式配制，并且可为基于液体或凝胶的物质以用于以液体或凝胶形式配制，所述形式部分地取决于施用途径。用于干燥制剂的典型载体包括但不限于：海藻糖、麦芽糖糊精、米粉、微晶纤维素(MCC)、硬脂酸镁、肌醇、FOS、GOS、右旋糖、蔗糖和类似载体。适合的基于液体或凝胶的载体包括但不限于：水和生理盐溶液；脲；醇和衍生物(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)；二醇(例如乙二醇、丙二醇等)。优选地，基于水的载体具有中性pH值(即pH7.0)。用于施用本文所述的组合物的其他载体或剂在本领域中是已知的，例如在美国专利号6,461,607中。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理益处/风险比率相称的那些剂、物质、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指将主题化学物质从一个器官或身体部分运载或运送至另一器官或身体部分时涉及的药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封物质。各载体在可与制剂的其他成分相容，并且不对受试者有损伤的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于药物制剂中的其他无毒可相容物质。
适于口服施用的制剂可呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂形式，或呈于水性或非水性液体中的溶液或混悬液形式，或呈水包油或油包水液体乳液形式，或呈酏剂或糖浆形式，或呈软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)形式和/或呈嗽口水等形式，各自含有预定量的一种或多种如本文公开的细菌菌株。
本发明也涵盖用于检测和/或调节本文所述的生物标志物的试剂盒。本发明的试剂盒也可包括公开或描述在所公开发明的如本文提供的方法中使用所述试剂盒或所公开发明的抗体的指导材料。试剂盒也可包括额外组分以有助于所述试剂盒被设计所针对的特定应用。举例来说，试剂盒可另外含有检测标记的手段(例如酶标记的酶底物、用以检测荧光标记的过滤套件、适当二级标记诸如绵羊抗小鼠HRP抗体等)和为对照所必需的试剂(例如对照生物样品或标准物)。试剂盒可另外包括缓冲剂和被认定用于所公开发明的方法中的其他试剂。非限制性实例包括用以降低非特异性结合的试剂诸如载体蛋白或清洁剂。
本发明的其他用途和方法
本文所述的组合物可用于多种诊断性、预后性和治疗性应用中。在任何本文所述的方法诸如诊断方法、预后方法、治疗方法或其组合中，方法的所有步骤都可由单一行动者进行，或替代地，由超过一个行动者进行。举例来说，诊断可直接由提供治疗性治疗的行动者进行。或者，提供治疗剂的人士可要求进行诊断测定。诊断医师和/或治疗干预者可解释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地，所述替代性过程可适用于其他测定诸如预后测定。
1)预测医学
本发明可涉及预测医学的领域，其中诊断测定、预后测定和监测临床试验用于预后(预测)目的以由此防治性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及用于在生物样品(例如血液、血清、细胞或组织)的情形下测定本文所述的生物标志物(例如细胞因子和/或趋化因子，诸如表1中所列的那些)的量和/或活性水平以由此确定罹患癌症的个体是否可能对如本文公开的组合物发生响应的诊断测定，诸如在癌症的情况下的诊断测定。所述测定可用于单独预后或预测目的，或可与治疗干预联用以由此在特征在于生物标志物多肽、核酸表达或活性或与生物标志物多肽、核酸表达或活性相关的病症的发作之前或在所述病症的复发之后防治性地治疗个体。熟练技术人员将了解任何方法都可使用一种或多种本文所述的生物标志物，诸如表格、附图、实施例中以及另外描述于说明书中的那些。
2)诊断测定
本发明部分地提供用于对生物样品是否与可能对如本文公开的组合物发生响应的癌症相关进行准确分类的方法、系统和规程。在一些实施方案中，本发明适用于使用统计算法和/或经验数据(例如本文所述的生物标志物诸如表格、附图、实施例中以及另外描述于说明书中的生物标志物的量或活性)将样品(例如来自受试者)分类为与对如本文公开的组合物发生响应或不对如本文公开的组合物发生响应相关或处于对如本文公开的组合物发生响应或不对如本文公开的组合物发生响应的风险下。
用于检测本文所述的生物标志物的量或活性，因此适用于对样品是否可能或不可能对如本文公开的组合物发生响应进行分类的一示例性方法涉及从测试受试者获得生物样品，以及使所述生物样品与能够检测所述生物样品中的所述生物标志物的量或活性的剂诸如蛋白质结合剂如抗体或其抗原结合片段或核酸结合剂如寡核苷酸接触。在一些实施方案中，使用至少一种抗体或其抗原结合片段，其中可组合(例如在夹心式ELISA中)或顺次使用两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种所述抗体或抗体片段。在某些情况下，统计算法是单一学习统计分类系统。举例来说，单一学习统计分类系统可用于基于预测值或概率值以及生物标志物的存在或水平对样品进行分类。使用单一学习统计分类系统通常以至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总精确性将样品分类为例如可能疗法响应者或进展者样品。
其他适合的统计算法为本领域技术人员所熟知。举例来说，学习统计分类系统包括能够适应于复杂数据集(例如目标标志物组套)以及基于所述数据集作出决策的机器学习算法技术。在一些实施方案中，使用单一学习统计分类系统诸如分类树(例如随机森林)。在其他实施方案中，优选以串联方式使用2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个学习统计分类系统的组合。学习统计分类系统的实例包括但不限于使用归纳学习(例如决策/分类树诸如随机森林，分类和回归树(C&RT)、提升树等)、可能近似正确(PAC)学习、连接学习(例如神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、感知器诸如多层感知器、多层前馈网络、神经网络的应用、贝叶斯信念网络学习(Bayesian learning in beliefnetwork)等)、强化学习(例如在已知环境中的被动学习诸如朴素学习、自适应动态学习和时序差分学习、在未知环境中的被动学习、在未知环境中的主动学习、学习动作-价值函数、强化学习的应用等)和遗传算法以及进化规划的那些。其他学习统计分类系统包括支持向量机(例如核方法)、多元自适应回归样条(MARS)、利文贝格-马夸特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、高斯混合(mixtureof Gaussian)、梯度下降算法和学习向量量化(LVQ)。在某些实施方案中，本发明方法进一步包括将样品分类结果传送给临床医师例如肿瘤学家。
在其他实施方案中，对受试者诊断之后是基于诊断向个体施用治疗有效量的确定治疗。
在一些实施方案中，方法进一步涉及获得对照生物样品(例如来自不患有癌症或其癌症易感于如本文公开的组合物的受试者的生物样品)、来自在缓解期间受试者的生物样品、或来自在治疗期间尽管采用如本文公开的组合物但显现癌症进展的受试者的生物样品。
3)预后测定
此外，本文所述的诊断方法可用于鉴定患有可能或不可能对如本文公开的组合物具有响应性的癌症或处于发展所述癌症的风险下的受试者。本文所述的测定诸如先前诊断测定或以下测定可用于鉴定患有与至少一种本文所述的生物标志物的量或活性的错误调控诸如在癌症的情况下的错误调控相关的病症或处于发展所述病症的风险下的受试者。或者，预后测定可用于鉴定患有与至少一种本文所述的生物标志物的错误调控诸如在癌症的情况下的错误调控相关的病症或处于发放中所述病症的风险下的受试者。此外，本文所述的预后测定可用于确定受试者是否可被施用如本文公开的组合物和/或另一治疗方案以治疗与异常生物标志物表达或活性相关的疾病或病症。
4)生物标志物核酸和多肽
本发明的治疗方法和其他方法涉及某些目标生物标志物。在一些实施方案中，目标生物标志物是对应于编码生物标志物多肽或这种多肽的一部分的生物标志物核酸的经分离核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及DNA或RNA的使用核苷酸类似物产生的类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选是双链DNA。
“经分离”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。优选地，“经分离”核酸分子不含在核酸所源于的生物体的基因组DNA中天然侧接于核酸的序列(优选是蛋白质编码序列)(即位于核酸的5'末端和3'末端处的序列)。举例来说，在各种实施方案中，经分离核酸分子可含有小于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的在核酸所源于的细胞的基因组DNA中天然侧接于核酸分子的核苷酸序列。此外，“经分离”核酸分子诸如cDNA分子在通过重组技术产生时可大致上不含其他细胞物质或培养基，或在化学合成时大致上不含化学前体或其他化学物质。
本发明的生物标志物核酸分子可使用标准分子生物学技术和本文所述的数据库记录中的序列信息进行分离。使用所述核酸序列的全部或一部分，本发明的核酸分子可使用标准杂交和克隆技术(例如如Sambrook等编,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述)来分离。
本发明的核酸分子可使用作为模板的cDNA、mRNA或基因组DNA以及适当寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。可将如此扩增的核酸分子克隆至适当载体中，并且通过DNA序列分析来表征。此外，对应于目标核酸分子的全部或一部分的寡核苷酸可通过标准合成技术例如使用自动化DNA合成仪来制备。
此外，适用于所述方法中的核酸分子可仅包含核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包含目标标志物或编码对应于目标标志物的多肽。所述核酸分子可例如用作探针或引物。探针/引物通常以一种或多种大致上纯化的寡核苷酸形式使用。寡核苷酸通常包含在严格条件下杂交于生物标志物核酸序列的至少约7个，优选约15个，更优选约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个或更多个连续核苷酸的核苷酸序列的区域。基于生物标志物核酸分子的序列的探针可用于检测对应于一种或多种目标标志物的转录物或基因组序列。探针包含与其连接的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
也涵盖与编码对应于生物标志物的蛋白质的核酸分子的核苷酸序列由于遗传密码的简并性而不同，因此编码同一蛋白质的生物标志物核酸分子。
此外，本领域技术人员应了解导致氨基酸序列变化的DNA序列多态性可存在于群体(例如人群体)内。所述遗传多态性可由于天然等位基因变化而存在于群体内的个体之中。等位基因是替代地存在于给定遗传基因座处的一组基因中的一者。此外，应了解也可存在影响RNA表达水平的DNA多态性，其可影响那个基因的总体表达水平(例如通过影响调控或降解)。
在本文中可与“等位基因变体”互换使用的术语“等位基因”是指基因或其部分的替代性形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当受试者具有某一基因的两个相同等位基因时，所述受试者被称为就所述基因或等位基因来说是纯合的。当受试者具有某一基因的两个不同等位基因时，所述受试者被称为就所述基因或等位基因来说是杂合的。举例来说，生物标志物等位基因可在单一核苷酸或若干核苷酸方面彼此不同，并且可包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可为基因的含有一个或多个突变的形式。
在本文中可互换使用的术语“基因的多态性区域的等位基因变体”或“等位基因变体”是指基因的具有在群体中见于所述基因的那个区域中的若干可能核苷酸序列中的一者的替代性形式。如本文所用，等位基因变体意图涵盖功能性等位基因变体、非功能性等位基因变体、SNP、突变和多态性。
术语“单核苷酸多态性”(SNP)是指由单一核苷酸占据的多态性位点，其是等位基因序列之间的变化位点。所述位点通常前置有以及继之以等位基因的高度保守序列(例如在群体的小于1/100或1/1000成员中变化的序列)。SNP通常由于在多态性位点处一个核苷酸被取代成另一核苷酸而出现。SNP也可由相对于参照等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入产生。通常，多态性位点由除参照碱基以外的碱基占据。举例来说，当参照等位基因在多态性位点处含有碱基“T”(胸苷)时，经改变等位基因可在多态性位点处含有“C”(胞苷)、“G”(鸟嘌呤)或“A”(腺嘌呤)。SNP可存在于编码蛋白质的核酸序列中，在所述情况下，它们可导致缺陷性或另外变异蛋白质或遗传疾病。这种SNP可改变基因的编码序列，因此指定另一氨基酸(“错义”SNP)，或SNP可引入终止密码子(“无义”SNP)。当SNP不改变蛋白质的氨基酸序列时，所述SNP被称为具有“沉默”。SNP也可存在于核苷酸序列的非编码区域中。这可例如由于选择性剪接而导致缺陷性蛋白质表达，或这可对蛋白质的功能不具有影响。
如本文所用，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码对应于本发明的标志物的多肽的开放阅读框的核酸分子。所述天然等位基因变化可通常导致给定基因的核苷酸序列变化1-5％。替代性等位基因可通过对许多不同个体中的目标基因测序来鉴定。这可易于通过使用杂交探针来进行以鉴定多种个体中的相同遗传基因座。是天然等位基因变化的结果以及不改变功能活性的任何和所有所述核苷酸变化和所得氨基酸多态性或变化都意图在本发明的范围内。
如本文所用，术语“在严格条件下杂交”意图描述彼此至少60％(65％、70％、75％、80％，优选85％)同一的核苷酸序列通常保持彼此杂交所处的杂交和洗涤条件。所述严格条件为本领域技术人员所知，并且可见于Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons,N.Y.(1989))的章节6.3.1-6.3.6中。严格杂交条件的一优选非限制性实例是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在50-65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
“经分离的”或“经纯化的”蛋白质或其生物活性部分大致上不含来自蛋白质所源于的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白质，或在化学合成时大致上不含化学前体或其他化学物质。措辞“大致上不含细胞物质”包括其中使蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，大致上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源性蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，它也优选大致上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20％、10％或5％。当蛋白质通过化学合成产生时，它优选大致上不含化学前体或其他化学物质，即它与蛋白质的合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。因此，所述蛋白质制剂具有小于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的除目标多肽以外的化学前体或化合物。
5)分析生物标志物核酸和多肽
对于任何本文所述的方法，生物标志物核酸和/或生物标志物多肽都可根据本文所述的方法和为熟练技术人员所知的技术来分析以鉴定适用于本发明的所述遗传或表达改变，所述遗传或表达改变包括但不限于1)生物标志物转录物或多肽的水平改变，2)来自生物标志物基因的一个或多个核苷酸的缺失或添加，4)生物标志物基因的一个或多个核苷酸的取代，5)生物标志物基因的异常修饰诸如表达调控区的异常修饰等。
a.用于检测生物标志物拷贝数的方法
评估生物标志物核酸的拷贝数的方法为本领域技术人员所熟知。存在或不存在染色体性获得或丧失可简单地通过测定本文鉴定的区域或标志物的拷贝数来评估。
评估生物标志物基因座的拷贝数的方法包括但不限于基于杂交的测定。基于杂交的测定包括但不限于传统“直接探测”方法，诸如Southern印迹、原位杂交(例如FISH和FISH加SKY)方法，以及“比较探测”方法，诸如比较基因组杂交(CGH)，例如基于cDNA或基于寡核苷酸的CGH。方法可以广泛多种形式使用，包括但不限于基底(例如膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。
在一些实施方案中，评估样品中的生物标志物基因拷贝数涉及Southern印迹。在Southern印迹中，使基因组DNA(通常片段化并在电泳凝胶上分离)与对靶标区域具有特异性的探针杂交。来自针对靶标区域的探针的杂交信号与由分析正常基因组DNA(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)获得的对照探针信号的强度比较提供对靶标核酸的相对拷贝数的估计。或者，Northern印迹可用于评估样品中编码核酸的拷贝数。在Northern印迹中，使mRNA杂交于对靶标区域具有特异性的探针。来自针对靶标区域的探针的杂交信号与由分析正常RNA(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)获得的对照探针信号的强度比较提供对靶标核酸的相对拷贝数的估计。或者，可使用适于检测RNA的其他方法，以致相对于适当对照(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的表达增高或降低提供对靶标核酸的相对拷贝数的估计。
一种用于测定基因组拷贝数的替代性手段是原位杂交(例如Angerer(1987)Meth.Enzymol 152:649)。通常，原位杂交包括以下步骤：(1)将待分析的组织或生物结构进行固定；(2)对所述生物结构进行杂交前处理以使靶标DNA的可及性增加，以及使非特异性结合降低；(3)使核酸的混合物杂交于所述生物结构或组织中的核酸；(4)进行杂交后洗涤以移除在杂交中未结合的核酸片段和(5)检测杂交核酸片段。这些步骤各自中使用的试剂和使用条件视特定应用而变化。在一典型原位杂交测定中，使细胞固定于固体载体，通常是玻璃载片。如果要探测核酸，那么通常用热或碱使细胞变性。接着使细胞与杂交溶液在适度温度下接触以容许对编码蛋白质的核酸序列具有特异性的经标记探针的退火。接着通常在预定严格性下或在递增严格性下洗涤靶标(例如细胞)直至获得适当信噪比。探针通常例如用放射性同位素或荧光报告基因标记。在一些实施方案中，探针足够长以便在严格条件下与靶标核酸特异性杂交。探针的长度通常在约200个碱基至约1000个碱基的范围内。在一些应用中，必须阻断重复序列的杂交能力。因此，在一些实施方案中，tRNA、人基因组DNA或Cot-I DNA用于阻断非特异性杂交。
一种用于测定基因组拷贝数的替代性手段是比较基因组杂交。一般来说，从正常参照细胞以及从测试细胞(例如肿瘤细胞)分离基因组DNA，并且扩增(如果必要)。将两个核酸进行差异性标记，接着与参照细胞的中期染色体进行原位杂交。通过一些手段，使参照DNA与测试DNA两者中的重复序列移除或使它们的杂交能力降低，所述手段例如通过与适当阻断核酸预杂交和/或在所述杂交期间包括针对所述重复序列的所述阻断核酸序列。如果必要，那么接着致使所结合的经标记DNA序列呈可显现形式。测试细胞中的处于拷贝数增加或降低的情况下的染色体区域可通过检测其中来自两个DNA的信号的比率被改变的区域来鉴定。举例来说，相较于基因组的其他区域，测试细胞中拷贝数已降低的那些区域将显示相比于参照，来自测试DNA的相对较低的信号。测试细胞中拷贝数已增加的区域将显示来自测试DNA的相对较高的信号。当存在染色体缺失或增加时，将检测到来自两个标记的信号的比率差异，并且比率将提供拷贝数的量度。在对CGH的一替代性使用中，即在阵列CGH(aCGH)中，固定的染色体元件被在阵列上的一批固体载体结合的靶标核酸替换，从而允许大百分比或完全百分比的基因组以这批固体载体结合的靶标表示。靶标核酸可包括cDNA、基因组DNA、寡核苷酸(例如用以检测单核苷酸多态性)等。基于阵列的CGH也可用单色标记进行(与在杂交之前用两种不同染料标记对照和可能肿瘤样品以及使它们混合相对比，此将由于对阵列上探针的竞争性杂交而产生比率)。在单色CGH中，将对照进行标记并使其与一个阵列杂交且读取绝对信号，并且将可能的肿瘤样品进行标记并使其与第二阵列(具有相同内含物)杂交且读取绝对信号。基于来自两个阵列的绝对信号计算拷贝数差异。制备固定化染色体或阵列以及进行比较基因组杂交的方法在本领域中是熟知的(参见例如美国专利号：6,335,167；6,197,501；5,830,645；和5,665,549以及Albertson(1984)EMBO J.3:1227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9138-9142；EPO公布号430,402；Methods inMolecular Biology,第33卷:In situ Hybridization Protocols,Choo编,Humana Press,Totowa,N.J.(1994)等)。在其他实施方案中，使用Pinkel等(1998)Nature Genetics 20:207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 89:5321-5325(1992)的杂交方案。
在其他实施方案中，基于扩增的测定可用于测量拷贝数。在所述基于扩增的测定中，核酸序列在扩增反应(例如聚合酶链式反应(PCR))中充当模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样品中模板的量成比例。与适当对照例如健康组织的比较提供拷贝数的量度。
“定量”扩增的方法为本领域技术人员所熟知。举例来说，定量PCR涉及使用相同引物同时共同扩增已知量的对照序列。这提供可用于校正PCR反应的内部标准。定量PCR的详述方案提供于Innis等(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.中。使用定量PCR分析在微卫星基因座处测量DNA拷贝数描述于Ginzonger等(2000)Cancer Research 60:5405-5409中。基因的已知核酸序列足以使得本领域技术人员能够常规选择引物来扩增基因的任何部分。荧光定量PCR也可用于本发明方法中。在荧光定量PCR中，定量基于荧光信号例如TaqMan和SYBR green的量。
其他适合扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace(1989)Genomics 4:560，Landegren等(1988)Science 241:1077，以及Barringer等(1990)Gene89:117)、转录扩增(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173)、自身维持序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874)、点式PCR和接头衔接物PCR(linkeradapter PCR)等。
杂合性丧失(LOH)和主要拷贝比例(MCP)绘图(Wang,Z.C.等(2004)Cancer Res 64(1):64-71；Seymour,A.B.等(1994)Cancer Res 54,2761-4；Hahn,S.A.等(1995)CancerRes 55,4670-5；Kimura,M.等(1996)Genes Chromosomes Cancer 17,88-93；Li等,(2008)MBC Bioinform.9,204-219)也可用于鉴定扩增或缺失区域。
b.用于检测生物标志物核酸表达的方法
生物标志物表达可通过用于检测经转录分子或蛋白质的表达的广泛多种熟知方法中的任一者来评估。所述方法的非限制性实例包括用于检测分泌型蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞质蛋白质或核蛋白质的免疫方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在优选实施方案中，特定基因的活性通过测量基因转录物(例如mRNA)，通过测量所翻译蛋白质的量，或通过测量基因产物活性来表征。标志物表达可以多种方式监测，包括通过检测mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性，其中任一者都可使用标准技术来测量。检测可涉及定量基因表达(例如基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质或酶活性)的水平，或替代地，可为定性评估基因表达水平，特别是与对照水平进行比较。所检测水平的类型将根据上下文而是明确的。
在其他实施方案中，检测或测定生物标志物及其功能类似同源物包括其片段或遗传改变形式(例如处于其调控区域或启动子区域中)的表达水平包括检测或测定目标标志物的RNA水平。在一些实施方案中，获得一个或多个来自待测试受试者的细胞，并且从细胞分离RNA。
在某些实施方案中，从单一细胞获得RNA。举例来说，可通过激光捕集显微切割(LCM)来从组织样品分离细胞。使用这种技术，可从组织切片包括染色组织切片分离细胞，由此确保所需细胞得以分离(参见例如Bonner等(1997)Science 278:1481；Emmert-Buck等(1996)Science 274:998；Fend等(1999)Am.J.Path.154:61以及Murakami等(2000)KidneyInt.58:1346)。举例来说，Murakami等人(上文)描述从先前免疫染色的组织切片分离细胞。
也有可能从受试者获得细胞，并且在体外培养细胞诸如以获得可从其提取RNA的较大细胞群体。用于建立非转化细胞的培养物即原代细胞培养物的方法在本领域中是已知的。
当从来自个体的组织样品或细胞分离RNA时，可重要的是防止在已从受试者移除组织或细胞之后基因表达的任何进一步变化。已知表达水平的变化会在扰动例如热激或用脂多糖(LPS)或其他试剂活化之后快速变化。此外，组织和细胞中的RNA可快速变得被降解。因此，在优选实施方案中，使从受试者获得的组织或细胞尽快被快速冷冻。
RNA可通过多种方法来从组织样品提取，所述方法例如硫代氰酸胍裂解继之以CsCl离心(Chirgwin等,1979,Biochemistry 18:5294-5299)。来自单一细胞的RNA可如用于从单一细胞制备cDNA文库的方法中所述获得，所述方法诸如Dulac,C.(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36,245以及Jena等(1996)J.Immunol.Methods 190:199中所述的那些。必须注意避免RNA降解，例如通过包括RNAsin。
可接着使RNA样品富集特定种类。在一些实施方案中，从RNA样品分离聚(A)+RNA。一般来说，所述纯化利用mRNA上的聚A尾部。特定来说以及如上所指示，可将聚T寡核苷酸固定在固体载体内以充当mRNA的亲和配体。出于这个目的的试剂盒可商购获得，例如MessageMaker试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)。
在优选的实施方案中，使RNA群体富集标志物序列。富集可例如通过引物特异性cDNA合成或基于cDNA合成的多轮线性扩增以及模板引导的体外转录来进行(参见例如Wang等(1989)PNAS 86,9717；Dulac等(上文)以及Jena等(上文))。
可进一步扩增富集或未富集特定种类或序列的RNA群体。如本文所定义，“扩增过程”被设计来使RNA内的分子强化、增加或扩充。举例来说，当RNA是mRNA时，扩增过程诸如RT-PCR可用于扩增mRNA，以使信号可检测或检测得以增强。这种扩增过程是有益的，特别是当生物样品、组织样品或肿瘤样品具有小尺寸或体积时。
可使用各种扩增和检测方法。举例来说，在本发明的范围内的是使mRNA逆转录成cDNA，继之以进行聚合酶链式反应(RT-PCR)；或如美国专利号5,322,770中所述将单一酶用于两个步骤，或使mRNA逆转录成cDNA，继之以进行对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)，如由R.L.Marshall等,PCR Methods and Applications 4:80-84(1994)所述。也可使用实时PCR。
可在本文中利用的其他已知扩增方法包括但不限于PNAS USA 87:1874-1878(1990)中所述并且也描述于Nature 350(第6313期):91-92(1991)中的所谓“NASBA”或“3SR”技术；如公开欧洲专利申请(EPA)号4544610中所述的Q-β扩增；链置换扩增(如G.T.Walker等,Clin.Chem.42:9-13(1996)以及欧洲专利申请号684315中所述)；靶标介导的扩增，如由PCT公布WO9322461所述；PCR；连接酶链式反应(LCR)(参见例如Wu和Wallace,Genomics 4,560(1989)，Landegren等,Science 241,1077(1988))；自身维持序列复制(SSR)(参见例如Guatelli等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990))；以及转录扩增(参见例如Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173(1989))。
在目前技术状态下已知用于测定基因表达的绝对和相对水平的许多技术，通常使用的适用于本发明中的技术包括Northern分析、RNA酶保护测定(RPA)、微阵列和基于PCR的技术，诸如定量PCR和差异性显示PCR。举例来说，Northern印迹涉及在变性琼脂糖凝胶上运行RNA制剂，以及将它转移至适合载体诸如活化纤维素、硝化纤维素或玻璃或尼龙膜中。接着使经放射性标记的cDNA或RNA与制剂杂交，洗涤并通过放射自显影术来分析。
也可采用原位杂交显像，其中使经放射性标记的反义RNA探针与活检样品的薄切片杂交，洗涤，用RNA酶裂解，并且暴露于感光乳液以进行放射自显影术。样品可用苏木精(hematoxylin)染色以显示样品的组织学组成，并且用适合滤光器进行的暗视野成像显示经显影乳液。也可使用非放射性标记诸如地高辛(digoxigenin)。
或者，可在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。可使从受试者获得的测试样品的经标记核酸与包含生物标志物DNA的固体表面杂交。阳性杂交信号用含有生物标志物转录物的样品获得。制备DNA阵列以及它们的使用的方法在本领域中是熟知的(参见例如美国专利号：6,618,6796；6,379,897；6,664,377；6,451,536；548,257；U.S.20030157485以及Schena等(1995)Science 20,467-470；Gerhold等(1999)Trends In Biochem.Sci.24,168-173；和Lennon等(2000)Drug Discovery Today 5,59-65，其以引用的方式整体并入本文)。也可进行基因表达系列分析(SAGE)(参见例如美国专利申请20030215858)。
为监测mRNA水平，举例来说，从待测试生物样品提取mRNA，逆转录，并且产生经荧光标记的cDNA探针。接着用经标记的cDNA探针探测能够于标志物cDNA杂交的微阵列，扫描载片，并且测量荧光强度。这个强度与杂交强度和表达水平相关联。
可用于本文所述的方法中的探针类型包括cDNA、核糖探针、合成寡核苷酸和基因组探针。所用探针类型将通常由特定情况决定，诸如举例来说核糖探针用于原位杂交，并且cDNA用于Northern印迹。在某些实施方案中，探针针对为RNA所特有的核苷酸区域。探针可短至为差异性识别标志物mRNA转录物所需，并且可短至例如15个碱基；然而，可使用具有至少17、18、19或20个或更多个碱基的探针。在一些实施方案中，引物和探针在严格条件下特异性与具有对应于标志物的核苷酸序列的DNA片段杂交。如本文所用，术语“严格条件”意指杂交将仅当存在至少95％核苷酸序列同一性时发生。在其他实施方案中，当在序列之间存在至少97％同一性时发生在“严格条件”下的杂交。
探针的标记形式可为任何适当形式，诸如使用放射性同位素例如32P和35S。可通过使用经适合标记的碱基来实现用放射性同位素进行的标记，无论探针是化学合成的还是生物合成的。
在某些实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的多肽分子。或者，生物样品可含有来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。
在其他实施方案中，方法进一步涉及从对照受试者获得对照生物样品，使所述对照样品与能够检测标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的化合物或试剂接触，以便检测所述标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段在所述生物样品中的存在，以及将所述标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段在所述对照样品中的存在与所述标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段在测试样品中的存在进行比较。
c.用于检测生物标志物蛋白质表达的方法
生物标志物蛋白质的活性或水平可通过检测或定量所表达多肽来检测和/或定量。多肽可通过为本领域技术人员所熟知的许多手段中的任一者来检测和定量。由生物标志物核酸及其功能类似同源物包括其片段或遗传改变形式(例如处于其调控区域或启动子区域中)编码的多肽的异常多肽表达水平与癌症对如本文公开的组合物发生响应的可能性相关联。可使用本领域中已知的用于检测多肽的任何方法。所述方法包括但不限于免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Western印迹、结合剂-配体测定、免疫组织化学技术、凝集、补体测定、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、高扩散色谱法等(例如Basic and Clinical Immunology,Sites和Terr编,Appleton and Lange,Norwalk,Conn.第217-262页,1991，其以引用的方式并入本文)。优选的是结合剂-配体免疫测定方法，包括使抗体与一种或多种表位反应以及竞争性置换经标记的多肽或其衍生物。
举例来说，可进行ELISA和RIA程序以使所需生物标志物蛋白质标准物经标记(用放射性同位素诸如125I或35S、或可测定酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，并且使其连同未标记样品一起与相应抗体接触，在其上使用第二抗体来结合第一抗体，并且测定放射性或固定化酶(竞争性测定)。或者，使样品中的生物标志物蛋白质与相应固定化抗体反应，使经放射性同位素或酶标记的抗生物标志物蛋白质抗体与系统反应，并且测定放射性或酶(ELISA夹心式测定)。在适合时也可采用其他常规方法。
以上技术可基本上以“一步”或“两步”测定形式进行。“一步”测定涉及使抗原与固定化抗体接触，以及在不进行洗涤下使混合物与经标记抗体接触。“两步”测定涉及在使混合物与经标记抗体接触之前进行洗涤。在适合时也可采用其他常规方法。
在某些实施方案中，一种用于测量生物标志物蛋白质水平的方法包括以下步骤：使生物试样与选择性结合所述生物标志物蛋白质的抗体或其变体(例如片段)接触，以及检测所述抗体或其变体是否结合于所述样品并由此测量所述生物标志物蛋白质的水平。
对生物标志物蛋白质和/或抗体的酶标记和放射性标记可通过常规手段来实现。所述手段将通常包括使酶诸如通过戊二醛来共价连接于所论述的抗原或抗体，特别来说以便不会不利地影响酶的活性，此意指酶必须仍然能够与它的底物相互作用，但不必要使酶的全部都具有活性，条件是足够部分保持活性以容许实现测定。实际上，一些用于使酶结合的技术是非特异性的(诸如使用甲醛)，并且将仅产生一定比例的活性酶。
通常合乎需要的是将测定系统的一个组分固定在载体上，由此允许系统的其他组分与所述组分接触，并且易于在不花费繁重和耗时劳动力下加以移除。有可能使第二相离开第一相加以固定，但一个相通常是足够的。
有可能将酶自身固定在载体上，但如果需要固相酶，那么这通常通过与抗体结合以及使抗体固定于载体来最佳实现，用于实现此举的模型和系统在本领域中是熟知的。普通聚乙烯可提供适合的载体。
可用于标记的酶不受特定限制，但可选自例如氧化酶群组的成员。这些酶通过与它们的底物的反应来催化产生过氧化氢，并且葡萄糖氧化酶由于它的良好稳定性、易于可得性和廉价性以及它的底物(葡萄糖)现成可用性而经常加以使用。氧化酶的活性可通过测量在经酶标记抗体与底物在本领域中熟知的控制条件下反应之后形成的过氧化氢的浓度来测定。
其他技术可用于根据从业者的偏好基于本公开来检测生物标志物蛋白质。一种所述技术是Western印迹(Towbin等,Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))，其中在SDS-PAGE凝胶上运行经适合处理的样品，随后转移至固体载体诸如硝化纤维素滤膜中。接着使抗生物标志物蛋白质抗体(未标记)与载体接触，并且通过二级免疫试剂诸如经标记蛋白A或抗免疫球蛋白抗体(适合的标记包括125I、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)来测定。也可使用色谱检测。
免疫组织化学分析可用于检测例如活检样品中的生物标志物蛋白质的表达。使适合抗体与例如细胞薄层接触，洗涤，接着与第二经标记抗体接触。标记可通过荧光标记、酶诸如过氧化物酶、亲和素或放射性标记来进行。使用显微术对测定进行目视评分。
可用于检测生物标志物蛋白质的抗体包括足够强烈且特异性结合待检测的生物标志物蛋白质的任何抗体，无论是天然还是合成全长抗体或其片段。抗体可具有至多约10- 6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M的Kd。短语“特异性结合”是指例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇以以下方式进行的结合：结合可用相同或类似表位、抗原或抗原决定簇的第二制剂置换或与所述第二制剂竞争。相对于其他蛋白质诸如相关蛋白质，抗体可优先结合生物标志物蛋白质。
抗体可为可商购获得的，或可根据本领域中已知的方法制备。
可使用的抗体及其衍生物涵盖多克隆抗体或单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类动物源化(CDR移植)抗体、镶饰抗体或单链抗体以及抗体的功能性片段，即生物标志物蛋白质结合片段。举例来说，可使用能够结合生物标志物蛋白质或其部分的抗体片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段。所述片段可通过酶裂解或通过重组技术来产生。举例来说，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分别产生Fab或F(ab')2片段。具有必要底物特异性的其他蛋白酶也可用于产生Fab或F(ab')2片段。也可使用其中一个或多个终止密码子已被引入在天然终止位点上游的抗体基因以多种截短形式产生抗体。举例来说，编码F(ab')2重链部分的嵌合基因可被设计来包括编码重链的CH结构域和铰链区的DNA序列。
在一些实施方案中，使用除抗体以外的特异性结合生物标志物蛋白质的剂，诸如肽。特异性结合生物标志物蛋白质的肽可通过本领域中已知的任何手段来鉴定。举例来说，可使用肽噬菌体展示文库筛选生物标志物蛋白质的特定肽结合剂。
d.取样方法
在一些实施方案中，将来自受试者的样品中的生物标志物的量和/或活性测量结果与预定对照(标准)样品进行比较。来自受试者的样品通常来自患病组织诸如癌细胞或组织。对照样品可来自同一受试者或来自不同受试者。对照样品通常是正常非患病样品。然而，在一些实施方案中，诸如为对疾病分期或为评估治疗功效，对照样品可来自患病组织。对照样品可为来自若干不同受试者的样品的组合。在一些实施方案中，将来自受试者的生物标志物的量和/或活性测量结果与预定水平进行比较。这个预定水平通常从正常样品获得。如本文所述，“预定”生物标志物的量和/或活性测量结果可为仅举例来说用于评估可被选择来进行治疗的受试者(例如基于基因组突变的数目和/或导致DNA修复基因的非功能性蛋白质的基因组突变的数目)，评估对单独或与其他NK免疫疗法以及与一种或多种额外抗癌疗法组合的如本文公开的组合物的响应的生物标志物的量和/或活性测量结果。预定生物标志物的量和/或活性测量结果可于患有或不患有癌症的患者的群体中测定。预定生物标志物的量和/或活性测量结果可为可同等适用于每个患者的单一数目，或预定生物标志物的量和/或活性测量结果可根据特定患者子群体而变化。受试者的年龄、重量、身高和其他因素可影响个体的预定生物标志物数量和/或活性测量结果。此外，可个别地测定各受试者的预定生物标志物数量和/或活性。在一些实施方案中，在本文所述的方法中测定和/或比较的量基于绝对测量结果。
在其他实施方案中，在本文所述的方法中测定和/或比较的量基于相对测量结果，诸如比率(例如在治疗之前相对于在治疗之后的生物标志物拷贝数、水平和/或活性，所述生物标志物测量结果相对于外加对照或人造对照，所述生物标志物测量结果相对于持家基因的表达等)。举例来说，相对分析可基于治疗前生物标志物测量结果相较于治疗后生物标志物测量结果的比率。治疗前生物标志物测量结果可在启动抗癌疗法之前任何时间获得。治疗后生物标志物测量结果可在启动抗癌疗法之后任何时间获得。在一些实施方案中，治疗后生物标志物测量结果在启动抗癌疗法之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长时间获得，并且甚至更长久朝向无限期以进行连续监测。治疗可包括抗癌疗法，诸如包括如本文公开的组合物或所述组合物进一步与其他抗癌剂组合的治疗方案。
预定生物标志物的量和/或活性测量结果可为任何适合标准。举例来说，预定生物标志物的量和/或活性测量结果可从正对其进行患者选择评估的同一人或不同人获得。在一些实施方案中，预定生物标志物的量和/或活性测量结果可从同一患者的先前评估获得。以这种方式，可随时间监测患者选择的进展。此外，如果受试者是人，那么对照可从对另一人或多人例如所选人群组的评估获得。以这种方式，可将正对其进行选择评估的人的选择程度与适合其他人例如处于与目标人类似情况下的其他人进行比较，所述其他人诸如罹患类似或相同病状和/或属于相同族群的那些。
在本发明的一些实施方案中，生物标志物的量和/或活性测量结果与预定水平相比的变化是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大，或介于之间的任何范围，包括端值。当测量结果基于相对变化诸如基于治疗前生物标志物测量结果相较于治疗后生物标志物测量结果的比率时，所述截断值同等适用。
生物样品可从来自患者的多种来源收集，包括包含核酸和/或蛋白质的体液样品、细胞样品或组织样品。“体液”是指从身体排泄或分泌的流体以及通常不从身体排泄或分泌的流体(例如羊水、水状液、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耳垢和耳屎、考珀氏液或射精前液、乳糜、食糜、粪便、雌性射出液、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物)。在优选实施方案中，受试者样品和/或对照样品选自由细胞、细胞系、组织学载片、石蜡包埋组织、活检体、全血、乳头抽吸物、血清、血浆、颊刮擦物、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓组成的组。在一些实施方案中，样品是血清、血浆或尿液。在其他实施方案中，样品是血清。
样品可历经纵向时期从个体重复收集(例如约数天、数周、数月、每年、每半年等一次或更多次)。历经一段时期从个体获得众多样品可用于验证来自较早检测的结果和/或鉴定由于例如疾病进展、药物治疗等的生物样式改变。举例来说，根据本发明，可每个月、每两个月或以一个、两个或三个月间隔的组合获取和监测受试者样品。此外，在监测时期期间，可将受试者的随时间获得的生物标志物的量和/或活性测量结果适宜地进行彼此比较，以及与正常对照的那些测量结果进行比较，由此提供受试者的自身值作为用于长期监测的内部或个人对照。
视收集的样品的类型和/或对生物标志物测量结果的分析而定，样品制备和分离可涉及任何程序。仅举例来说，所述程序包括浓缩、稀释、调整pH、移除高丰度多肽(例如白蛋白、γ球蛋白和转铁蛋白等)、添加防腐剂和校准物、添加蛋白酶抑制剂、添加变性剂、使样品脱盐、浓缩样品蛋白质、提取和纯化脂质。
样品制备也可使以非共价复合物形式结合于其他蛋白质(例如载体蛋白)的分子分离。这个过程可分离结合于特定载体蛋白(例如白蛋白)的那些分子，或使用更一般性过程，诸如通过蛋白质变性例如使用酸来使结合分子从所有载体蛋白释放，继之以移除载体蛋白。
从样品移除非所需蛋白质(例如高丰度、不提供信息或不可检测的蛋白质)可使用高亲和力试剂、高分子量过滤器、超速离心和/或电渗析来实现。高亲和力试剂包括选择性结合高丰度蛋白质的抗体或其他试剂(例如适体)。样品制备也可包括离子交换色谱法、金属离子亲和色谱法、凝胶过滤、疏水性色谱法、色谱聚焦、吸附色谱法、等电聚焦和相关技术。分子量过滤器包括基于尺寸和分子量来使分子分离的膜。所述过滤器可进一步采用反渗透、纳滤、超滤和微滤。
超速离心是一种用于从样品移除非所需多肽的方法。超速离心是在约15,000-60,000rpm下离心样品，同时用光学系统监测粒子的沉降(或缺乏所述沉降)。电渗析是在过程中使用电膜或半透膜的程序，其中离子在电势梯度的影响下穿过半渗透膜从一种溶液被运送至另一溶液中。因为用于电渗析中的膜可具有选择性运送具有正电荷或负电荷的离子，排斥具有相对电荷的离子，或基于尺寸和电荷来使物质穿过半渗透膜进行迁移的能力，所以这致使电渗析适用于浓缩、移除或分离电解质。
本发明中的分离和纯化可包括本领域中已知的任何程序，诸如毛细管电泳(例如在毛细管中或在芯片上)或色谱法(例如在毛细管、柱中或在芯片上)。电泳是可用于在电场的影响下使离子型分子分离的方法。电泳可在凝胶、毛细管中或在芯片上的微通道中进行。用于电泳的凝胶的实例包括淀粉、丙烯酰胺、聚氧化乙烯、琼脂糖或其组合。凝胶可通过它的交联、添加清洁剂或变性剂、对酶或抗体(亲和电泳)或底物(酶谱法)进行固定以及并入pH梯度来改性。用于电泳的毛细管的实例包括与电喷雾对接的毛细管。
毛细管电泳(CE)优选用于分离复杂亲水性分子和高度带电荷溶质。CE技术也可在微流体芯片上执行。视所用毛细管和缓冲剂的类型而定，CE可被进一步分成各种分离技术，诸如毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(cITP)和毛细管电色谱法(CEC)。通过使用挥发性溶液例如含有挥发性酸和/或碱和有机物诸如醇或乙腈的水性混合物，CE技术可与电喷雾离子化联用。
毛细管等速电泳(cITP)是其中分析物以恒定速度移动通过毛细管，但然而根据它们的相应移动性而加以分离的技术。毛细管区带电泳(CZE)，也称为自由溶液CE(FSCE)，基于物质的电泳移动性的差异，所述电泳移动性由分子上的电荷和分子在迁移期间遭遇的经常与分子的尺寸成正比的摩擦阻力决定。毛细管等电聚焦(CIEF)允许可微弱离子化的两性分子通过pH梯度中进行电泳来分离。CEC是传统高效液相色谱法(HPLC)与CE之间的杂合技术。
用于本发明中的分离和纯化技术包括本领域中已知的任何色谱法程序。色谱法可基于对某些分析物的差异性吸附和洗脱或分析物在流动相与固定相之间的分配。色谱法的不同实例包括但不限于液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等。
实施例
实施例1：用于实施例2-3的材料和方法
细胞系、试剂和抗体
人免疫细胞在补充以10％胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-Products,CA)的RPMI1640中培养。口腔鳞状癌症干细胞(OSCSC)在UCLA医学院从口腔癌患者舌部肿瘤分离，并且在补充以10％FBS(Gemini Bio-Products,CA)、1.4％抗生素抗霉菌素(antimycotic)、1％丙酮酸钠、1.4％MEM非必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺、0.2％庆大霉素(gentimicin)(GeminiBio-products,CA)和0.15％碳酸氢钠(Fisher Scientific,PA)的RPMI 1640中培养。
针对CD16的抗体购自Biolegend(San Diego,CA,USA)。重组IL-2从NIH-BRB获得。针对同种型对照、MHC-I、CD45(人)、CD45(小鼠)、CD3、CD16、CD56、CD8、HLADR和CD11b的抗体购自Biolegend(San Diego,CA)。人NK纯化试剂盒从Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)获得。
人单核细胞/破骨细胞在补充以10％FBS和青霉素-链霉素(Gemini Bio-Products,CA)的α-MEM培养基(Life Technologies,CA)中培养。将人M-CSF(Biolegend,CA)和可溶性RANKL(PeproTech,NJ)溶解于α-MEM中，并且在-80℃下储存。
细菌选择和制备
AJ2是8种不同革兰氏阳性益生细菌菌株(嗜热链球菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)KE99和保加利亚乳酸杆菌)的组合，其用于诱导干细胞的分化。
测试不同益生细菌菌株诱导IFN-g以及许多重要细胞因子、趋化因子和生长因子(表1)的能力。为评估用于组合中的各菌株的水平，我们使用在实验室中确立的NK细胞的活化指数，其由使用特定比率的对在病理性状况下防止自体免疫性同时使NK细胞的显著活化增强的若干重要细胞因子和趋化因子所组成。因此，菌株被选择来：1)在不需要NK细胞的活化时提供NK细胞的调控活化；2)在由细胞因子和/或重要受体的在癌症的情况下在NK细胞的功能性活化期间所发生的交联活化时用以诱导NK细胞的最大活化；和3)为肠道微生物区系提供多样性。这些准则允许我们使用细菌来以我们将仅在感染或恶性肿瘤期间需要时使NK活化增加的方式调控肠道粘膜免疫性。换句话说，当不需要NK细胞的功能时，细菌将调控NK功能以不诱发炎症；然而，在发生在病理性状况下的需要期间，NK细胞被触发以以最大水平起作用。对NK细胞功能的所述协调调控应有效使非所要的炎症停止，同时在疾病期间提供有效和最大免疫性。
将AJ2称重，并且以每1mL 10mg的浓度再混悬于含有10％FBS的RPMI培养基1640中。使细菌充分涡旋，接着在冰上以6至8振幅进行声波处理15秒。接着在冰上孵育经声波处理的样品30秒。在每五个脉冲之后，获取样品以在显微镜下观察直至至少80％的细胞壁被裂解。确定的是进行约20轮声波处理/冰上孵育以实现完全声波处理。最后，将经声波处理的样品(sAJ2)等分，并且储存在-80摄氏度冷冻器中。
从外周血液纯化NK细胞
由UCLA机构审查委员会(IRB)核准的书面知情同意书从健康供血者获得，并且所有程序都由UCLA-IRB核准。使用Ficoll-Hypaque离心来分离外周血液，此后，收集含有外周血液单核细胞(PBMC)的白色混浊层，洗涤，并且再混悬于补充以10％FBS的RPMI1640(Invitrogen by Life Technologies,CA)中并涂铺在塑料组织培养皿上。在孵育1-2小时之后，收集非粘附性人外周血液淋巴细胞(PBL)。使用购自Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)的人NK细胞富集试剂盒，从PBL对NK细胞进行负性选择和分离。经分离NK细胞用抗CD16抗体染色以使用流式细胞计量分析来测量NK细胞纯度。经分离NK细胞群体的纯度大于90％。在补充以10％FBS(Gemini Bio-Products,CA)、1％抗生素抗霉菌素、1％丙酮酸钠和1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen,Life Technologies,CA)的RPMI培养基1640中培养纯化的NK细胞。
表1.由用细菌菌株处理的NK细胞达成的细胞因子、生长因子和趋化因子产生
在存在或不存在处于1:5比率(NK细胞:细菌)下的细菌菌株下，使来自健康供者的纯化NK细胞不经处理，或用IL-2(1000单位/ml)或抗CD16 mAb(3μg/ml)和IL-2(1000单位/ml)的组合处理12-18小时。之后，使用Bio-Plex Pro人细胞因子27-plex测定试剂盒测定细胞因子、生长因子和趋化因子的水平。
NK细胞上清液用于干细胞分化
如上所述，从健康供者的PBMC纯化人NK细胞。使NK细胞不经处理，用处于1:3(NK:sAJ2)下的sAJ2、和/或抗CD16 mAb(3μg/mL)和IL-2(1,000U/mL)的组合处理18小时，随后移除上清液，并且用于分化实验。用IFN-γELISA(Biolegend,CA,USA)评估由活化NK细胞产生的IFN-γ的量。以逐渐每日添加递增量的NK细胞上清液(经相应处理)来使OSCSC分化。平均来说，为诱导分化，持续4天添加从经IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2处理的NK细胞获得的含有总计4,500pg IFN-γ的上清液以诱导OSCSCS的分化和对NK细胞介导的细胞毒性的抗性。之后，靶细胞用1xPBS洗涤，使其脱离，并且用于实验。
从外周血液纯化单核细胞
由UCLA机构审查委员会(IRB)核准的书面知情同意书从健康供血者获得，并且所有程序都由UCLA-IRB核准。使用Ficoll-Hypaque离心来分离外周血液，此后，收集含有外周血液单核细胞(PBMC)的白色混浊层，洗涤，并且再混悬于补充以10％FBS的RPMI 1640(Invitrogen by Life Technologies,CA)中并涂铺在塑料组织培养皿上。在孵育1-2小时之后，使PBMC的粘附性子群体从组织培养板脱离。使用从Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)获得的人单核细胞富集试剂盒纯化单核细胞。基于对经CD14抗体染色的经富集单核细胞的流式细胞计量分析，得知单核细胞群体具有大于95％纯度。
破骨细胞(hOC)的产生
破骨细胞由从PBMC纯化的单核细胞产生，并且在含有M-CSF(25ng/mL)和RANK配体(RANKL)(25ng/mL)的α-MEM培养基中培养21天。每3天用含有M-CSF(25ng/mL)和RANKL(25ng/mL)的新鲜α-MEM使培养基更新。
分析免疫缺陷和人源化小鼠中的人OSCSC细胞生长
根据所有联邦指导方针、州指导方针和当地指导方针，在UCLA动物研究委员会(ARC)的书面核准下进行动物研究。联合免疫缺陷NOD.CB17-Prkdcscid/J和NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(缺乏T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的NSG小鼠)购自JacksonLaboratory，并且根据由UCLA动物研究委员会核准的方案在处于UCLA的动物设施中维持。人源化BLT(hu-BLT；人骨髓/肝/胸腺)小鼠如先前所述根据NSG背景制备(Shimizu等(2010)Blood 115(8):1534-44；Vatakis等(2011)Proc Natl Acad Sci U.S A.108(51):E1408-16)。
在肿瘤植入之前，每隔一天对所选小鼠饲喂5x 109个AJ2细菌(8种以上所列的益生菌菌株的组合)，持续一周。这个辅助疗法每隔一天加以继续直至处死那天。对于各小鼠，将冻干AJ2再混悬于200μL脱脂奶中，并且通过吸移对它们饲喂。
通过用肿瘤细胞向hu-BLT小鼠中进行原位细胞植入来测定人口腔鳞状癌干细胞(OSCSC)的体内生长。为建立原位肿瘤，首先使用异氟烷设置使小鼠麻醉，并且接着通过将与10μl HC基质胶(Corning,NY)混合的1x 106个细胞直接注射至口腔中来将OSCSC转移至口底。在肿瘤细胞注射之前立刻皮下注射5.0mg/kg卡洛芬(carprofen)，并且每24小时重复这个注射，持续48小时。
在注射肿瘤细胞之后，每隔一天对所有小鼠的疾病进展进行连续监测。观察小鼠的总体致病性征象，诸如体重减轻、毛皮起皱、驼背姿态和不动。在肿瘤植入之后7天，所选hu-BLT小鼠通过尾部静脉(IV)注射来接受1.5x 106个经扩增的人NK细胞。
从携带肿瘤的hu-BLT和NSG小鼠的组织进行的细胞解离和细胞培养
在实验结束时，使小鼠安乐死，并且从hu-BLT小鼠或NSG小鼠获得口腔肿瘤、肝、骨髓、脾和血液。通过使用补充以胶原酶II(1mg/mL)(口腔肿瘤)(Invitrogen,CA)和DNA酶(10u/mL)(Sigma-Aldrich,CA)以及1％BSA的DMEM培养基对组织进行消化来获得单细胞混悬液。使经消化组织穿过70μM过滤器(Fisher Scientific,CA)以获得单细胞混悬液。从动物收集股骨和脾，并且使骨髓细胞和脾细胞穿过70μM过滤器(Fisher Scientific,CA)以获得单细胞混悬液。使用对肝素化血液试样进行的Ficoll-Hypaque离心来获得鼠外周血液单核细胞(PBMC)。收集含有外周血液单核细胞(PBMC)的白色混浊层，洗涤，并且再混悬于培养基中。使用补充以10％FBS的RPMI 1640培养基(Life Technologies,CA)，在存在和/或不存在IL-2(1000单位/mL)处理下培养各组织的单细胞混悬液。
从hu-BLT小鼠纯化人T细胞
使用来自Stem Cell Technologies(Vancouver,BC,Canada)的分离试剂盒，从脾细胞对来自hu-BLT小鼠的CD3+ T细胞进行正性选择。在补充以10％FBS的RMPI 1640培养基(Life Technologies,CA)中连同采用IL-2(1000单位/mL)处理，以1x 106个细胞/mL培养细胞。也以相同方式培养流穿细胞(在正性选择T细胞之后的CD3阴性细胞)。
表面染色
如实验中所详述，用预定最优浓度的PE缀合抗体在100μl的1％冷PBS-BSA中对来自各条件的1x 105个细胞染色，并且在4℃下孵育30分钟。接着，将细胞洗涤，并且再混悬于1％PBS-BSA中。Epics C(Coulter)流式细胞仪用于细胞表面分析。
51Cr释放细胞毒性测定
51Cr购自Perkin Elmer(Santa Clara,CA)。标准51Cr释放细胞毒性测定用于测定NK细胞在实验培养物的情况下的细胞毒性功能以及靶细胞对NK细胞介导的裂解的敏感性。将效应细胞(1x 105个NK细胞/孔)等分至96孔圆底微孔板(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中，并且以4至6次连续稀释滴定。靶细胞(5x 105个OSCSC)用50μCi51Cr(Perkin Elmer,Santa Clara,CA)标记，并且铬酸化1小时。在孵育之后，将靶细胞洗涤两次以移除过量未结合的51Cr。将经51Cr标记的靶细胞以1x 104个细胞/孔的浓度在最佳效应物:靶标(E:T)比率5:1下等分至含有效应细胞的96孔圆底微孔板中。使板离心并孵育4小时的时期。在4小时孵育时期之后，从各样品收集上清液，并且使用γ计数器加以计数以测定释放的放射性。测量总体(含有经51Cr标记的靶细胞)释放值和自发性(单独靶细胞的上清液)释放值，并且用于计算特异性细胞毒性百分比。使用下式计算特异性细胞毒性百分比：
通过使用为使30％的靶细胞裂解所需的效应细胞数目的倒数x100来计算LU 30/106。
酶联免疫吸附测定(ELISA)和多路细胞因子测定
针对IFN-γ和IL-10的人ELISA试剂盒购自Biolegend(San Diego,CA)。进行ELISA以检测从细胞培养物产生的IFN-γ和IL-10的水平。如制造商方案中所述进行测定。简要来说，96孔EIA/RIA板用对应于靶细胞因子的稀释捕集抗体涂布，并且在4℃下孵育过夜。在孵育16-18小时之后，将板用洗涤缓冲液(含0.05％吐温(Tween)的1x PBS)洗涤4次，并且用测定稀释剂(含1％BSA的1x PBS)阻断。将板在室温下在板振荡器上以200rpm孵育1小时；在孵育之后将板洗涤4次。接着，将100μL标准物和从各培养物收集的样品添加至孔中，并且在室温下在板振荡器上以200rpm孵育2小时。在孵育之后，将板洗涤4次，用检测抗体装载，并且在室温下在板振荡器上以200rpm孵育1小时。在孵育1小时之后，将板洗涤4次；各孔用亲和素-HRP溶液装载，并且在室温下在板振荡器上以200rpm孵育30分钟。在用洗涤缓冲液将板洗涤5次之后，将100μL TMB底物溶液添加至孔中，并且将板在黑暗中孵育直至它们显现所需蓝色(或直至30分钟)。接着，每孔添加100μL终止溶液(2N H2SO4)以使反应终止。最后，在微板读取器中在450nm下读取各板以获得吸光度值(Biolegend,ELISA手册)。
细胞因子和趋化因子的水平通过多路测定来考查，所述测定如各指定试剂盒的制造商方案中所述进行。使用Luminex多路仪器(MAGPIX,Millipore,Billerica,MA)进行分析，并且使用专有软件(xPONENT 4.2，Millipore,Billerica,MA)分析数据。
统计分析
进行未配对双尾学生t检验(student t-test)以对两个组进行统计分析。采用邦弗伦尼(Bonferroni)事后检验的单因素ANOVA用于比较超过两个组。
人源化小鼠模型
裸品系、NOD-scid品系和NSG品系中不同水平的NK细胞损害和/或缺失可解释CSC在这些不同免疫缺陷品系中产生人肿瘤的能力差异。基于对免疫缺陷动物进行的先前研究，已提出关于特定免疫子组以及它们在控制癌起始、生长和转移方面的作用的许多问题。因为难以使用免疫缺陷小鼠品系评估和比较原始CSC的侵袭性和转移潜力，所以具有经重建人免疫系统的人源化小鼠提供最适于植入所述肿瘤的平台。
已进行了众多尝试来产生携带完全重构人免疫系统的小鼠。在由特定小鼠品系支持的人免疫系统重构水平之间也存在差异。因为对背景品系至关重要的是具有重度免疫缺陷，所以NSG或NRG小鼠已通常成为所选品系。在创建各种人源化小鼠模型方面存在许多方法，其中差异在于小鼠的龄期、经移植细胞类型、来源或供体细胞类型、注射/植入方法、照射等。在这些变化形式之中，最简单人源化方法由用从成年健康供者/患者获得的人PBMC注射免疫缺陷小鼠组成。PBMC在血液中循环，从而死亡或迁移至其他组织；不利面是这些小鼠仅可用于短期实验，因为小鼠中的循环成熟免疫细胞会引发针对鼠接受者的移植物抗宿主疾病(GvHD)。
另一方法使用起源于外周血液、脐带血或胎儿肝的经分离的CD34+祖细胞。将CD34+细胞注射至新生NSG小鼠或成体NSG小鼠中。它们稳定移入骨髓，并且能够分化成人免疫系统的所有造血谱系。CD34+人源化小鼠模型的主要限制是它缺乏人胸腺的存在，因此作为替代，T细胞在小鼠MHC的情形下经受选择。
BLT人源化小鼠(hu-BLT)代表迄今为止产生的最先进和完全人源化小鼠模型。人免疫移植方案由以下组成：通过手术将人胎儿肝和胸腺组织的片块植入在NSG小鼠的肾囊下，继之以尾部静脉IV注射同一供者CD34+造血细胞以支持对人骨髓的完全重构。因此，在人胸腺存在下进行对发育T细胞的正性和负性选择。因此，不成熟T细胞在人I类和II类MHC限定之后变为功能性CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。hu-BLT模型是显示粘膜免疫性的唯一已知人源化小鼠模型。在BLT的组织中，造血干细胞(HSC)至少在一定程度上发育成人T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、巨噬细胞、树突细胞、红细胞和血小板。人CD45+免疫细胞的长期外周重构通常在30-80％范围内，如在血液、脾和骨髓中所检测(处于准备中的手稿)。已在雌性的生殖道、肠和直肠以及齿龈中检测到人免疫细胞(处于准备中的手稿)。也值得注意的是相比于NOD-scid-BLT小鼠，NSG-BLT小鼠(从NSG背景品系开发的BLT小鼠)展现在它们的外周血液中的人白细胞重构水平实质上更高。这些特征证明从NSG背景开发的hu-BLT可论证地是迄今为止用于研究人免疫性的最佳可用模型。
实施例2：益生细菌使NK细胞活化
益生细菌诱导细胞因子分泌但对细胞毒性不具有影响
为探究益生菌对NK细胞功能的影响，使NK细胞在不同活化条件下与或不与sAJ2一起培养。在用sAJ2益生菌处理之后，保留为对照或用IL-2或IL-2+抗CD16 mAb活化的NK细胞诱导较高水平的IFN-γ和IL-10(图1)。尽管活化NK细胞分泌IFN-γ，但用sAJ2细菌处理活化NK细胞使IFN-γ的水平进一步显著增加(图1A)。用sAJ2处理在所有NK条件下都诱导IL-10的分泌，尤其是对于对照NK细胞(未经活化)(图1B)。
尽管sAJ2细菌在NK细胞中诱导细胞因子分泌功能，但它们对NK细胞的细胞毒性功能不具有影响(图2)。当用活体AJ2细菌或经声波处理AJ2细菌处理时，未处理NK细胞以及经活化NK细胞在它们靶向和裂解OSCSC的能力方面不展现显著变化(图2)。因此，sAJ2细菌使NK细胞的通过细胞因子分泌达成的功能作用增强，同时NK细胞也维持相同细胞毒性水平。
经sAJ2细菌处理的分割无反应的NK细胞的上清液诱导OSCSC的分化和对NK细胞介导的细胞毒性的抗性。
为探究用sAJ2处理的分割无反应的NK细胞(用抗CD16 mAb和IL-2活化的NK细胞)的分化能力，如图3中所述来活化和处理NK细胞，并且收集上清液并用于处理干细胞样肿瘤细胞OSCSC，如材料和方法章节中所述。在分化之后，研究关键细胞表面标志物的表面表达。发现在用来自单独以及与sAJ2组合的分割无反应的NK细胞的上清液分化的OSCSC的表面上，MHC-I、CD54和B7H1上调，但以组合形式与sAJ2一起进行的处理使它们的表达水平显著增加(图3)。对于用单独以及与sAJ2组合的分割无反应的NK上清液分化的OSCSC，CD44干细胞标志物的表达也存在适度降低。来自用单独sAJ2处理的NK细胞的上清液不有效使OSCSC分化(图3)。
此外，在用上清液进行分化之后，使用51Cr释放测定来测定各种条件的OSCSC对NK细胞介导的裂解的易感性(图4)。用从未处理或单独sAJ2处理的NK细胞获得的上清液处理的OSCSC显示在它们对NK细胞介导的裂解的易感性方面无变化。在另一方面，用来自用IL-2+抗CD16 mAb处理的NK细胞的上清液处理OSCSC导致肿瘤对NK细胞介导的裂解的抗性。相较于对照，包括分割无反应的对照，在用来自经IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2活化NK细胞的上清液处理之后，OSCSC显示对经IL-2活化NK细胞介导的裂解的显著更大抗性(P<0.05)(图4)。
由分割无反应的NK细胞诱导的分化通过IFN-γ和TNF-α的细胞因子分泌来显著介导
为了解OSCSC分化以及变得对NK细胞介导的裂解具有抗性所利用的机理，用从用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2处理的NK细胞获得的上清液以及针对IFN-γ和/或TNF-α的抗体处理OSCSC。如早先所述，来自用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2处理的NK细胞的上清液诱导肿瘤的分化和对NK细胞介导的细胞毒性的抗性(图3-图6)。单独抗IFN-γ处理阻止对分化OSCSC上CD54、MHC-I和B7H1的表面表达调节，而单独TNF-α抗体阻止CD54表面表达上调。同时，补充以来自用IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2处理的NK细胞的上清液的OSCSC在IFN-γ抗体和TNF-α抗体的组合的情况下显示对所述补充的表面表达调节作用的抑制(图5)。
当将抗TNF-α或抗IFN-γ添加至经上清液处理细胞中时，对OSCSC对NK细胞介导的裂解的抗性不存在抑制作用或存在适度抑制作用(图6)。在另一方面，当两种抗体一起使用时，OSCSC维持它们对NK细胞介导的裂解的敏感性(图6)。另外，相较于未处理或分割无反应的NK上清液处理的OSCSC，用经IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2活化的NK细胞上清液使OSCSC分化导致肿瘤生长抑制(图7)。当抗IFN-γ和抗TNF-α的组合连同来自经IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2活化NK细胞的上清液一起使用时，肿瘤生长恢复至在未处理OSCSC的情况下所见的水平(图7)。
实施例3：破骨细胞和单核细胞与益生细菌组合使NK细胞扩增
sAJ2与破骨细胞组合使NK细胞而非T细胞扩增，持续较长时期维持它们
从健康供者PBMC分离NK细胞，并且在进行培养之前使用CD3和CD16/CD56抗体测定NK纯度。接着在使NK细胞与单独sAJ2(“对照”)或sAJ2与破骨细胞组合(“+破骨细胞”)共培养之前18-20小时，用抗CD16 mAb和IL-2使NK细胞活化(图8)。用sAJ2处理的NK细胞未能扩增以及随时间维持NK细胞纯度，而与sAJ2和破骨细胞一起培养的NK细胞持续长久时期维持NK纯度和扩增。OC和sAJ2的组合优先使NK细胞扩增，同时在整个培养中维持低比例的T细胞(图8)。
经扩增NK细胞就细胞毒性功能与细胞因子分泌功能两者而言均是高度功能性的
为探究经sAJ2和破骨细胞扩增的NK细胞的功能性能力，测量细胞介导的细胞毒性和IFN-γ分泌水平。相比于与单独sAJ2共培养的NK细胞，与sAJ2和破骨细胞共培养的如先前所述的用抗CD16mAb和IL-2活化的NK细胞使显著更多OSCSC裂解；并且从第9天至第15天，经扩增NK细胞的细胞毒性显著增加(图9)，这与在第14天之后与sAJ2和破骨细胞共培养的NK细胞的较高扩增相关联(图11)。相较于与单独sAJ2共培养的用IL-2和抗CD16 mAb活化的NK细胞，与sAJ2和破骨细胞一起培养的经IL-2和抗CD16 mAb活化NK细胞分泌显著更高量的IFN-γ(图10)。
sAJ2与破骨细胞组合持续延长时期维持高水平的NK扩增
为探究经扩增NK细胞(用抗CD16 mAb和IL-2活化过夜，并且与sAJ2和破骨细胞共培养)的扩增速率，在各种时间点通过显微术来对细胞计数(图11)。在分析NK细胞扩增速率和群体倍增(由最终计数与基线计数的比率的对数除以2的对数加以定义)后，发现NK细胞在第20天扩增21,000-132,000倍，并且在第31天扩增30-510万倍，其中在4周内达到17-21群体倍增(表2)。
表2.NK扩增方法
这个表总结了本领域或由申请人进行的未发表研究工作(例如关于从PBMC加以负性选择的那些NK)中详述的描述各种NK扩增方案的方法，包括NK细胞的来源、所用饲养细胞(如果可适用)以及所得扩增成果(包括为实现所述扩增所需的天数)。
来自经NK注射的携带肿瘤的小鼠的单核细胞和破骨细胞在相较于来自在不存在NK注射下携带肿瘤的小鼠的那些单核细胞和破骨细胞时具有使NK细胞活化的更大能力
当相较于在不存在NK细胞注射下用未分化肿瘤植入的那些小鼠时，来自经NK注射的携带肿瘤的小鼠和携带经NK上清液分化的肿瘤的小鼠的NK细胞在与自体单核细胞一起培养时具有显著增大的细胞毒性和IFN-γ分泌。通过在植入之前添加针对TNF-α和IFN-γ的抗体来阻断NK介导的肿瘤分化使细胞毒性和IFN-γ分泌降低。从hu-BLT小鼠的BM源性单核细胞产生破骨细胞，并且与来自健康人供者的同种异体NK细胞一起培养以研究NK细胞扩增的程度。因此，相较于从未进行NK注射的携带肿瘤的小鼠获得的那些NK细胞扩增和IFN-γ分泌，在经NK注射的携带肿瘤的小鼠或携带经NK上清液分化的肿瘤的小鼠中，NK细胞扩增和IFN-γ分泌得以增大。因此，相比于来自在不存在NK注射下携带肿瘤的小鼠的那些单核细胞和破骨细胞，来自经NK注射的携带肿瘤的小鼠的单核细胞和破骨细胞具有使NK细胞活化的更大能力。
实施例4：在hu-BLT小鼠中采用辅助益生菌补充与经破骨细胞扩增NK免疫疗法组 合
hu-BLT小鼠模型用于探究利用实施例3中所述的扩增方法(详述于实施例1中的材料和方法部分中)，使用辅助益生菌补充与基于NK细胞的过继性免疫疗法组合来靶向干细胞样癌细胞。图12提供对实验设计的详细描述。
NK免疫疗法导致在各种组织区室中募集T细胞；AJ2益生菌补充使这个作用进一步增加
为探究NK免疫疗法在人源化小鼠癌症模型中的免疫调节作用，收集多个组织区室并分析免疫细胞标志物。在接受NK免疫疗法的小鼠中，在处死当天从小鼠收集的所有免疫组织区室包括骨髓(表3A)、血液(表4)和脾(表6A)中，CD3+免疫细胞(T细胞)的存在都升高—与AJ2补充组合显示更高T细胞存在水平。也在培养的稍后时间点期间观察到较高T细胞存在(表3B、表6B)。在接受NK免疫疗法的小鼠中，从小鼠收集的骨髓也显示MDSC(骨髓源性抑制细胞)的存在升高(表13)。当考虑在处死时的T细胞百分比时，在用单独NK细胞注射或联合用AJ2饲喂的携带肿瘤的小鼠中，PBMC、脾和BM展现较高CD3+ T细胞百分比，并且BM展现HLADR+CD11B+免疫子组升高。
除显示T细胞水平升高的免疫组织之外，也在存在于从动物切除的肿瘤内的免疫细胞(CD45+细胞)中观察到这个趋势(表9)。接受NK免疫疗法的小鼠显示T细胞在存在于肿瘤中的免疫群体内的百分比较高，其中AJ2补充显示略微更高水平。大多数浸润性CD45+免疫细胞是CD3+T细胞，其中CD4+T细胞子组比CD8+ T细胞具有适度更高比例，并且显示CD3+CD56+CD16+NKT子组。当用IL-2处理肿瘤时，在与肿瘤相互作用期间被下调的高强度CD4、CD8和CD56/CD16表面表达得以恢复。相较于仅接受口腔肿瘤注射的对照，单独AJ2补充作为处理的情况显示CD3细胞的水平高得多(表9)。
在单独实验中，发现来自经OC扩增NK细胞的大多数T细胞污染物是CD8+ T细胞。将来自第9天经OC扩增的NK细胞的T细胞污染物分选出来以获得纯化T细胞和NK细胞。接着使用CD16和CD3/56抗体测试NK细胞的纯度。接着用IL-2处理NK细胞和T细胞18-20小时，随后将它们用于针对OSCSC和K562的51Cr释放测定中。从经OC扩增NK细胞分离的CD3+ T细胞未能使OSCSC或K562裂解。相较于T细胞，来自NK细胞的上清液分泌显著更高水平的IFN-γ。
由来自患者的NK细胞达成的降低的细胞毒性和较低IFN-γ分泌与T细胞的扩增增加相符。当与OC一起培养时，来自癌症患者的纯化的NK细胞不能维持NK细胞的扩增，并且实际上，截至第12天，大于半数的扩增细胞是T细胞。此外，截至第31天。培养中剩余细胞中仅10％是NK细胞。此外，当在扩增的31-36天内测定在癌症患者中的经扩增NK细胞和T细胞的总数时，在相较于健康对照时，存在来自癌症患者的较少扩增细胞，并且扩增T细胞的水平显著高于NK细胞。相比之下，从健康供者分离的NK细胞维持NK细胞的扩增，并且NK扩增水平显著高于T细胞。在不同培养天数当相较于健康NK细胞时，在患者NK细胞的情况下观察到NK细胞不增殖或低得多的增殖。不可观察到来自健康供者或患者的扩增细胞的显著细胞死亡，但相比于健康供者，来自患者的细胞的死亡率略微更高。
当相较于与OC一起培养的健康NK细胞时，与OC一起培养的患者NK细胞以显著更小程度使OSCSC裂解。当基于NK细胞的数目加以标准化时，在相较于来自健康对照的NK细胞时，患者的每个NK细胞诱导的细胞毒性更小。当相较于经OC扩增健康NK细胞时，经OC扩增患者NK细胞分泌显著更少IFN-γ。当相较于健康NK细胞时，经OC扩增口腔癌患者的NK细胞分泌显著更少的IL-10，而当相较于健康NK细胞时，来自胰腺癌患者的那些NK细胞分泌更高IL-10。对于由健康NK细胞或癌症患者NK细胞达成的IL-6分泌水平，不可观察到显著差异。相较于由破骨细胞扩增的患者NK细胞，健康NK细胞上的NKG2D表面表达水平是类似的。相较于健康对照，在患者NK细胞的表面上，CD94表达强度较高。当相较于健康NK细胞时，在经OC扩增患者NK细胞的表面上，KIR2、NKp30、NKp44和NKp46表达较低，而当相较于健康NK细胞时，在经OC扩增患者NK细胞的表面上，KIR3表达相同或较低。
经破骨细胞活化NK细胞实质上使CD8+ T细胞数目增加。当相较于健康对照时，癌症患者平均来说具有更高百分比的CD8+ T细胞，以及更低百分比的CD4+ T细胞。当与破骨细胞一起培养时，在不存在NK细胞下，T细胞未能使CD8+ T细胞扩增，然而，含有不可检测或极小部分的污染性T细胞的用OC活化的纯化NK细胞使来自健康培养物与患者培养物两者的CD8+ T细胞扩增，尽管相比于健康NK细胞，患者NK细胞培养物使T细胞更快扩增。当相较于从健康对照分离的T细胞时，从患者分离的T细胞具有更高水平的CD45RO和更低CD45RA、CD62L、CD28、CCR7和CD127。
经OC活化的NK细胞优先使CD8+ T细胞扩增，而经DC活化的NK细胞使CD4+ T细胞扩增。为确定在由经OC活化的NK细胞相对于经DC活化的NK细胞扩增的T细胞的子群体之间是否存在差异，分析健康供者中的CD4和CD8子群体。经OC活化的NK细胞优先使CD8+ T细胞扩增，而经DC活化的NK细胞使CD4+ T细胞扩增。由经OC活化的NK细胞扩增的CD8+ T细胞展现较高CD45RO和CD44，低得多的水平的CD62L、CCR7和CD127，以及中等水平的CD28，而由经DC活化的NK细胞扩增的CD4+ T细胞展现较低水平的CD45RO，中等水平的CD44和较高水平的CD62L、CCR7，其中在CD127方面具有少许变化，以及较低水平的CD28。在不存在NK细胞下，由OC或DC活化的T细胞展现的表面概况类似于由经NK活化DC获得的那些，例外之处是CD28表达类似于由经OC活化NK获得的CD28表达。在PBMC与在不存在NK细胞下由OC或DC扩增的那些T细胞之间，CD4和CD8在CD3+ T细胞内的比例是类似的，并且不可观察到在存在或不存在NK细胞下由OC或DC活化的T细胞上的显著水平的PD-1、Tim 3或KLRG-1。
NK免疫疗法治疗使各种组织区室中的细胞因子分泌水平增加，而AJ2益生菌补充使细胞因子水平进一步增加
为了解NK免疫疗法和益生菌补充对各种组织区室内的细胞因子水平的影响，收集组织并分析细胞因子分泌水平。单独以及与AJ2补充组合的NK免疫疗法均诱导PBMC(图16)、脾细胞(图18，表7)和经CD3消减的脾细胞(图22)中在培养的各个时间点期间的高水平IFN-γ分泌。在NK免疫疗法与AJ2补充组合的情况下，对于各种培养时间点，来自骨髓细胞(图13)、脾细胞(图18，表7)和从脾细胞分离的CD3细胞(图20)的IFN-γ水平高得多。在处死之后立刻从小鼠收集的血清显示在接受NK免疫疗法的小鼠中，IFN-γ水平升高—在NK免疫疗法与AJ2补充组合的情况下水平高得多(表5)。
接受NK免疫疗法和/或AJ2补充的小鼠显示血清中的IL-10细胞因子的水平增加(表5A)，而仅接受NK免疫疗法的小鼠显示在使用骨髓细胞(图14B)、脾细胞(图19)、从脾细胞分离的CD3细胞(图21)和经CD3消减的脾细胞(图23)进行的细胞培养中，IL-10的水平升高。益生菌补充连同NK免疫疗法一起以协同方式使由骨髓细胞(图14)、脾细胞(图19)和从脾细胞分离的CD3细胞(图21)分泌的IL-10水平增加，所述水平增加在各个时间点被观察到。
遵循类似趋势的其他细胞因子包括接受NK免疫疗法的小鼠的血清中的IL-23和IL-17升高，其中在NK免疫疗法与AJ2补充组合的情况下，IL-23水平显著增加(表5A)。某些标志物诸如IL-8、MIP-3α和ITAC在仅肿瘤对照组中高得多，从而指示口腔癌的潜在免疫标志物(表4B)。
携带肿瘤的小鼠在各种组织区室中具有降低的细胞毒性功能，而接受NK免疫疗法治疗的小鼠具有显著改进的细胞毒性功能
为探究NK细胞在这些组织区室内的细胞毒性功能，使用来自所收集组织的免疫细胞进行51Cr释放测定。如图15中所述培养PBMC，并且在第7天，在51Cr释放测定中将它们用于测量它们的细胞毒性功能。来自健康对照(仅接受AJ2补充以及无肿瘤)的PBMC具有高度细胞毒性，并且接受NK免疫疗法的小鼠也具有高水平的细胞毒性。即使相较于接受AJ2补充作为对肿瘤的对照治疗的群组，肿瘤对照组也显示极低的细胞毒性(图15)。如图17中所述培养的脾细胞也在51Cr释放测定中用于测量它们的细胞毒性功能。相较于其他组，只有肿瘤对照组的脾细胞具有显著降低水平的细胞毒性(图17)。NK免疫疗法组和/或AJ2补充组的细胞毒性水平类似于或高于对照(不携带肿瘤)组(图17)。在另一组实验中，单独NK注射或联合用AJ2饲喂的携带肿瘤的小鼠在所有组织区室中都展现NK细胞毒性升高，其中当对小鼠饲喂AJ2以及用NK细胞和PD1抗体注射时观察到最高增加。然而，在采用NK注射和AJ2的携带肿瘤的hu-BLT小鼠中，PD1抗体不使IFN-γ分泌进一步增加(在一些情况下，甚至使IFN-γ分泌降低)。
单独以及与AJ2补充组合的NK免疫疗法均在体内阻止肿瘤生长在将动物处死之后，从hu-BLT小鼠切除口腔肿瘤。当并行比较尺寸时，显然明确的是接受NK免疫疗法的小鼠具有较小肿瘤(图24)。这个信息通过根据某一尺度测量肿瘤以及在使所收集肿瘤解离之后的肿瘤细胞计数来进一步验证(表8)。相较于其他对照，接受NK免疫疗法的小鼠的肿瘤称重更小，并且由更少肿瘤细胞组成。此外，相较于饲喂AJ2以及未给与NK注射的小鼠，经NK注射以及经AJ2饲喂小鼠中的肿瘤重量实质上更小。
从接受NK免疫疗法的小鼠解剖的肿瘤更加分化，对NK细胞介导的细胞毒性具有抗性，以及生长较缓慢
为探究NK免疫疗法在体内使OSCSC分化的有效性，如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在处死之后，使用流式细胞术分析所切除的肿瘤。相较于未接受免疫疗法的那些小鼠，在口腔肿瘤注射之后接受NK免疫疗法的小鼠展现更加分化表型，即更高MHC-I表达(图25)。也培养所切除肿瘤以进行生长分析。相较于在未接受免疫疗法的条件下的小鼠，来自接受NK免疫疗法的小鼠的肿瘤具有慢得多的生长速率(表10)。一旦以培养方式使肿瘤生长，即进行51Cr释放测定以测量这些细胞对NK细胞介导的裂解的易感性。来自接受NK免疫疗法的小鼠的肿瘤对NK细胞介导的裂解更加具有抗性，而未接受治疗的小鼠显著更加易感于NK细胞介导的裂解，指示它们的得以维持的干细胞样特征(图26)。当NK介导的肿瘤细胞分化在植入之前用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断时，肿瘤对NK细胞介导的细胞毒性的易感性得以恢复。此外，当基于来自携带肿瘤的小鼠的VEGF的分泌加以标准化时，来自用NK细胞注射的hu-BLT小鼠的口腔肿瘤分泌相对较少VEGF。
NK免疫疗法诱导用经IL-2+抗CD16 mAb处理NK上清液分化的OSCSC的显著细胞死亡
用NK上清液使OSCSC分化导致肿瘤对CDDP(顺铂)的显著易感性。尽管有效性小于CDDP，但紫杉醇(PTX)也介导经NK分化的OSCSC的较高细胞死亡，而添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)使紫杉醇介导的细胞死亡显著增加。用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断NK介导的OSCSC分化使由在有或没有有NAC的情况下CDDP或紫杉醇诱导的细胞死亡实质上降低。用CDDP或紫杉醇和NAC处理患者源性分化的口腔肿瘤的OSCC也展现较高细胞死亡。
表3：存在于hu-BLT小鼠的骨髓中的人免疫细胞群体
3A
BM，第0天，CD45+ CD16+56 CD3 HLADR+CD11b
AJ2对照 0.91 2.14 10.2
OSCSC 1.54 2.12 11.1
OSCSC+NK 1.45 2.36 15.7
OSCSC+AJ2 1.83 1.79 11.2
OSCSC+NK+AJ2 2.51 5.98 16.1
3B
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集股骨，并且使用补充以10％FBS的RPMI培养基将骨髓细胞冲洗出来。使用FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体进行CD45、CD3、CD16、CD56、HLADR和/或CD11b的表面表达分析，并且通过流式细胞术来评估。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照(表3A)。以1x106个细胞/mL培养骨髓细胞，并且在第0天、第3天、第6天和第11天补充以IL-2(1000单位/mL)。使用针对CD45、CD3、CD16、CD56或CD8的FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体，在第11天进行流式细胞术。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照(表3B)。
表4：存在于hu-BLT小鼠的PBMC中的人免疫细胞群体
PBMC，第0天，CD45+ CD16+56 CD3
AJ2对照 9.67(3.41) 66.0
OSCSC 28.2(8.97) 44.6
OSCSC+NK 12.4(4.46) 67.6
OSCSC+AJ2 20.4(7.57) 50.2
OSCSC+NK+AJ2 10.0(4.64) 72.8
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，从小鼠收集血液，并且使用Ficoll-Hypaque离心来分离PBMC。使用FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体进行CD45、CD3、CD16和CD56的表面表达分析，并且通过流式细胞术来评估。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照。
表5：在处死后从hu-BLT小鼠的心脏血液收集的血清样品的细胞因子和趋化因子概况
5A.
5B
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，从心脏血液收集血清。用血清样品进行多路阵列分析以测量细胞因子(表5A)和趋化因子(表5B)。使用MAGPIX Luminex多路仪器进行分析，并且使用专有软件(xPONENT 4.2)分析数据。
表6：存在于hu-BLT小鼠的脾细胞中的人免疫细胞群体。
6A
脾，第0天，CD45+(A设门) CD16+56 CD3
AJ2对照 0.98 55.8
OSCSC 2.86 38.2
OSCSC+NK 0.81 64.1
OSCSC+AJ2 3.66 52.1
OSCSC+NK+AJ2 1.50 69.9
6B
脾，第11天，CD45+ CD3+ CD3+CD8+
AJ2对照 40.2 28.2
OSCSC 34.61 19.8
OSCSC+NK 73.0 39.2
OSCSC+AJ2 14.12 11.1
OSCSC+NK+AJ2 81.3 50.2
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。使用FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体进行CD45、CD3、CD16和/或CD56的表面表达分析，并且通过流式细胞术来评估。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照(表6A)。以1x 106个细胞/mL培养脾细胞，并且在第0天、第3天、第6天和第11天补充以IL-2(1000单位/mL)。使用针对CD45、CD3或CD8的FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体，在第11天进行流式细胞术。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照(表6B)。
表7：来自hu-BLT小鼠的经IL-2活化脾细胞的细胞因子分泌概况
7A
脾，第3天 IL-6 IFN-γ GM-CSF TNF-α IL-8 IL-10
AJ2对照 74 250 103 52 2418 5
OSCSC 134 263 106 56 5832 5
OSCSC+NK 1342 393 151 64 11227 10
OSCSC+AJ2 23 230 68 49 947 2
OSCSC+NK+AJ2 1332 585 164 74 N/A 16
7B
脾，第6天 IL-6 IFN-γ GM-CSF TNF-α IL-8 IL-10
AJ2对照 24 244 103 51 672 13
OSCSC 57 245 104 53 1613 6
OSCSC+NK 242 328 238 56 4878 25
OSCSC+AJ2 14 226 72 47 283 3
OSCSC+NK+AJ2 178 381 229 55 4591 29
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集脾，解离，过滤以获得单细胞混悬液。以1x 106个细胞/mL培养脾细胞，并且在第0天补充以IL-2(1000单位/mL)。在第3、6和11天收集上清液。对于各培养时间点，接着将细胞以1x106个细胞/mL再混悬，并且补充以IL-2(1000单位/mL)。使用多路阵列分析测定第3天(表7A)和第6天(表7B)上清液的细胞因子分泌水平。使用MAGPIX Luminex多路仪器进行分析，并且使用专有软件(xPONENT4.2)分析数据。
表8：对从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤的测量结果
肿瘤，第0天，处死日 重量(克) 第0天总计数(百万个细胞)
1-AJ2对照 N/A N/A
2-OSCSC 0.15 6.9
3-OSCSC+NK 0.04 2.1
4-OSCSC+AJ2 0.071 5.2
5-OSCSC+NK+AJ2 0.062 2.3
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，并且记录肿瘤的重量。接着使肿瘤细胞解离，并且过滤以获得单细胞混悬液。如上表中所示记录细胞计数。
表9：存在于从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤中的人免疫细胞群体
肿瘤，第0天，CD45+ CD3
OSCSC 56.3
OSCSC+NK 81.0
OSCSC+AJ2 76.5
OSCSC+NK+AJ2 83.7
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，解离，并且过滤以获得单细胞混悬液。使用针对CD45、CD3的FITC、PE和/或PE-Cy5缀合抗体，在第0天进行流式细胞术以测量免疫细胞在肿瘤内的存在。对人CD45阳性群体内的细胞进行设门，并且同种型对照抗体用作对照。
表10：对从hu-BLT小鼠切除的口腔肿瘤的体外生长分析
肿瘤(附着) 第7天 第15天
OSCSC 0.268 0.792
OSCSC+NK 0.042 0.2
OSCSC+AJ2 0.216 0.856
OSCSC+NK+AJ2 0.062 0.3
如图12中所述来处理hu-BLT小鼠。在安乐死之后，收集口腔肿瘤，解离，并且过滤以获得单细胞混悬液。在第0天以每孔0.75x 106个细胞培养各肿瘤的细胞。对于各条件，在第7天使细胞脱离并计数，并且以10,000个细胞再培养。在第15天再次使细胞脱离并计数。
实施例5：在KC小鼠和BLT人源化小鼠的胰腺癌的癌前阶段和癌性阶段对齿龈NK细 胞的抑制
这个实施例说明在携带胰腺特异性致癌性Kras突变的P48+/Cre；LSL-KRASG12D(KC)小鼠和BLT人源化小鼠的胰腺癌和口腔癌的癌前阶段和癌性阶段，齿龈中自然杀伤(NK)细胞调节的动态。饲喂对照膳食(CD)或高脂肪卡路里膳食(HFCD)的野生型小鼠和KC小鼠以及携带胰腺肿瘤和口腔肿瘤的人源化BLT(hu-BLT)小鼠用于确定癌前期和癌症诱导的齿龈NK细胞数目和功能变化。饲喂CD和HFCD的KC小鼠的胰腺中增加数目的PanIN病变和最大炎症评分与在培养之后循环NK细胞和齿龈NK细胞的百分比显著下降，缺乏DX5+NK扩增以及IFN-γ和IL-6的分泌增加相互关联。在胰腺癌的恶性阶段，相较于来自非携带肿瘤的小鼠的那些IFN-γ分泌，携带肿瘤的hu-BLT小鼠具有IFN-γ从解离自齿龈组织的细胞的最低分泌。将NK细胞注射至携带肿瘤的小鼠中使IFN-γ分泌增加，并且分泌类似于或高于通过来自非携带肿瘤的hu-BLT对照小鼠的齿龈细胞获得的那些。当用AJ2益生细菌对携带肿瘤的小鼠饲喂以及用NK细胞注射时，观察到IFN-γ分泌的最高增加。连同IFN-γ的分泌增加一起，在携带胰腺肿瘤的小鼠中，在存在以及不存在用AJ2饲喂下注射NK细胞使口腔齿龈细胞中的CD45+和CD3+ T细胞的百分比增加。在口腔肿瘤的情况下观察到类似结果。总之，这些结果指示口腔可反映全身性疾病，并且提供为何癌症患者可倾向于罹患不同口腔病变的基本原理。
材料和方法
参见Kaur等(2017)Front Immunol 8:1606，其全部内容通过这个引用整体并入本文，以完整描述材料和方法。除实施例1中的材料和方法之外，也在以下描述一些示例性方法。
条件性KRAS(G12D)小鼠模型
为研究在胰腺癌发展期间高卡路里膳食对免疫功能的影响，如Hingorani等(2003)Cancer Cell 4:437-450中所述使用条件性KRAS(G12D)模型。在断奶之后，对LSL-KRAS(G12D)和p48-Cre(或PDX-1-Cre)小鼠的后代饲喂高脂肪卡路里膳食(HFCD)或对照膳食(CD)，持续3-4个月(图27A)。然后，使动物安乐死，并且收集整个胰腺、内脏脂肪组织和其他器官。将经福尔马林固定石蜡包埋的组织切片(4μm)，并且用H&E染色。由胃肠病理学家在组织学方面评估胰腺组织的切片中鼠PanIN病变(mPanIN)的存在和阶段，如Hruban等(2001)Am J Surg Pathol 25:579-586中所述。动物研究由加州大学洛杉矶分校(University of California,Los Angeles)的校长动物研究委员会根据NIH实验室动物护理和使用指导加以核准(ARC#2012-101-13A和2011-118)。
实验膳食
膳食从Dyets,Inc.,Pennsylvania获得。略微修改的AIN-76A纯化啮齿动物膳食充当CD。相较于CD，我们的HFCD具有增加的卡路里含量(4,536相对于3,726kcal/kg)，其归因于基于玉米油的脂肪含量增加(1,800相对于450kcal/kg)。尽管AIN-76A CD中总卡路里的约12％来自脂肪，但HFCD中总卡路里摄取的约40％归因于脂肪。玉米油含有约60％ω-6多不饱和脂肪酸(亚油酸)、饱和脂肪酸(10.8％棕榈酸、2.1％硬脂酸)、单不饱和脂肪酸(26.5％油酸)和少量ω-3多不饱和脂肪酸(0.6％亚麻酸)。重要的是，蔗糖、盐和维生素的量在两种膳食中均保持相同。为抵消玉米油增加，使HFCD中的玉米淀粉的量相应降低。在低光条件下处理膳食，并且储存在-20℃下。每周两次替换膳食。膳食中脂肪酸的稳定性由UCLA营养生物标志物和植物化学核心部门定期监测。
基因分型分析
在膳食随机化之前，通过对从尾部活检获得的基因组DNA的PCR分析来确定KrasG12D和Cre等位基因的存在，如其他地方所述(Funahashi等(2007)Cancer Res 67:7068-7071)。具有KrasG12D与Cre等位基因两者的动物被指定为突变体(KRAS+/G12D)，并且既不具有KrasG12D也不具有Cre等位基因的动物被视为野生型(KRAS+/+)。在研究结束时，在处死时，成功切除–重组事件通过PCR根据在胰腺中存在单一LoxP位点来确认，如Funahashi等(2007)中所述。
制备齿龈组织、PBMC和脾的单细胞混悬液
为制备小鼠齿龈组织的单细胞混悬液以进行后续分析，将动物处死，并且收集来自腭部位的齿龈组织。立刻将齿龈组织切割成1mm3片块并放置至在DMEM中含有1mg/ml胶原酶II、10U/ml DNA酶I和1％牛血清白蛋白的消化缓冲液中，并且在37℃烘箱在150rpm振荡器上孵育20分钟。在消化之后，使样品经40μm细胞滤网过滤，并且在4℃下以1,500rpm离心10分钟。将沉淀再混悬于DMEM中，并且进行细胞计数。遵循如对于齿龈所述的组织解离程序以制备从hu-BLT小鼠获得的胰腺肿瘤和口腔肿瘤的单细胞混悬液。通过心脏穿刺来获得外周血液，并且分离PBMC，如先前所述(Tseng等(2015)Oncotarget 6:20002-20025以及Jewett和Bonavida(1996)J Immunol 156:907-915)。
结果
饲喂HFCD的KC小鼠中的胰腺中PanIN病变的数目增加
当相较于采用CD的KC小鼠时，饲喂HFCD的KC小鼠展现显著更加进展的癌前期PanIN-2和PanIN-3病变。在3–4个月时，在饲喂CD或HFCD的KC小鼠中，未能发现侵袭性胰腺导管腺癌。在饲喂CD或HFCD的WT小鼠中，未发现胰腺赘生性病变。此外，相较于饲喂CD的KC小鼠，饲喂HFCD的KC小鼠具有显著更大程度的炎症、腺泡细胞损失和增加的胰腺炎评分。当相较于饲喂CD的那些小鼠时，在饲喂HFCD的KC小鼠中，胰腺内正常导管的数目少得多，并且仅在KC小鼠中而非在WT小鼠中观察到胰腺纤维化。
就采用HFCD的WT小鼠和KC小鼠的PBMC来说，DX5+NK细胞的百分比和NK细胞细胞毒性降低
为评估KRAS突变和HFCD对NK细胞毒性的影响，从各组小鼠分离PBMC，并且在培养7天之后测定循环PBMC中NK细胞介导的细胞毒性和DX5+免疫细胞的百分比。ST63肿瘤细胞用作靶细胞，ST63先前被用作NK细胞的特定靶标(Regunathan等(2005)Blood 105:233-240)。观察到针对ST63的以下细胞毒性样式(WT/CD>WT/HFCD>KC/CD>KC/HFCD)(图27B)。从各组小鼠的脾分离的CD3+ T细胞不能介导针对ST63靶细胞的细胞毒性，从而确定NK细胞的功能具有特异性(图27C)。当在培养7天之后测定CD45+免疫细胞内的DX5+细胞的百分比时，DX5+细胞的百分比存在一致降低，所述DX5+细胞显示以下在PBMC中从高到低的表达样式(WT/CD>WT/HFCD>或＝KC/CD>KC/HFCD)(图27D)。从不同组小鼠纯化的NK细胞展现如对于PBMC所示的类似细胞毒性概况(图27A和图27E)。
饲喂CD或HFCD的WT小鼠和KC小鼠的齿龈中NK细胞调节和细胞因子分泌的动态
为评估KRAS突变和高脂肪卡路里膳食的影响，在培养细胞7天(图28B)之前，在第0天(图28A)测定WT小鼠和KC小鼠的口腔齿龈细胞中CD45+免疫细胞的总数、DX5+NK细胞的百分比和NK细胞的总数。因为难以测定在炎症期间在齿龈微环境中体内活化NK细胞的命运和数目，这可能归因于NK细胞从循环向炎症部位连续募集和/或齿龈微环境内的增殖增加和/或细胞死亡诱导，所以在体外培养从齿龈组织解离的细胞，并且测定齿龈内NK细胞的命运。在第0天培养来自各组的相等数目的细胞并在第7天对细胞的总数计数，并且发现在不同组之间是相当的(图28B)。平均来说，在第0天(图28A)或培养的第7天(图28B)，在4组小鼠之间，在口腔齿龈组织中的CD45+免疫细胞的数目方面不存在显著差异。当相较于饲喂CD的WT小鼠时，观察到在饲喂HFCD的WT小鼠、采用CD的KC小鼠和饲喂HFCD的KC小鼠中，在时间0时表达DX5的NK细胞适度增加(图28A)，然而，差异不是统计显著的。当在培养齿龈细胞7天之后测定DX5+NK细胞的百分比时，在饲喂HFCD的WT小鼠或饲喂CD以及HFCD的KC小鼠内，在DX5+细胞的百分比方面存在一致下降，展现以下概况(WT/CD>WT/HFCD>KC/CD>KC/HFCD)(图28B)，最严重下降见于饲喂HFCD的KC小鼠(图28B)。当测定在时间0时CD45+齿龈免疫细胞的群体内NK细胞的总数时，在饲喂HFCD的WT小鼠或饲喂CD以及HFCD的KC小鼠中观察到类似数目，但当相较于饲喂CD的WT小鼠时，这三组具有适度更高数目的NK细胞(图28A)。在细胞培养之后在第7天，在饲喂HFCD的WT小鼠或饲喂CD以及HFCD的KC小鼠内，在NK细胞的数目方面存在一致下降，展现以下概况(WT/CD>WT/HFCD>KC/CD>KC/HFCD)(图28B)。因此，当使齿龈细胞与IL-2一起培养7天时NK细胞的百分比降低不归因于CD45+免疫细胞的总群体或从齿龈解离的细胞的总数的下降(图28B)。与在培养7天之后DX5+NK细胞的下降对比，当相较于饲喂CD的WT小鼠时，在各组内存在IFN-γ(图28C和表11)和IL-6(图28D和表11)分泌增加，并且最高分泌用从饲喂HFCD的KC小鼠的齿龈培养的免疫细胞获得。因此，各组内的IFN-γ分泌样式如下(WT/CD<WT/HFCD<KC/CD<KC/HFCD)。IFN-γ的分泌可能来自齿龈内的NK细胞与T细胞两者。相较于WT小鼠，在来自KC小鼠的齿龈免疫细胞中，G-CSF、MIP-1a、TNF-α和LIX的水平也更高(表11)。此处呈现的数据不能排除DX5+ T细胞小群体在所观察结果中的任何贡献。
表11.由来自饲喂HFCD的KC小鼠的齿龈细胞分泌的增加的细胞因子、趋化因子和生长因子以及配体。
在将小鼠处死之后收集齿龈组织并制备单细胞混悬液，并且在IL-2(10,000U/ml)存在下培养7天，此后收集上清液，并且使用多路阵列来测定不同细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌。
超动力NK细胞恢复由饲喂以及不饲喂AJ2的携带胰腺肿瘤的小鼠中的齿龈免疫细胞达成的IFN-γ和IL-8分泌
人源化BLT小鼠被重构来在不同组织区室中具有超过90％的人免疫细胞(图29A和图29B)，并且在口腔齿龈组织中具有的T细胞百分比高于NK细胞(图29C)。在用胰腺肿瘤或口腔肿瘤分别在胰腺或口底中植入hu-BLT小鼠之前2周，用AJ2益生细菌饲喂它们，并且在1–2周的肿瘤生长之后，通过尾部静脉注射来递送超动力NK细胞，并且当致病性征象明显时将小鼠处死(图29D)。用AJ2饲喂在整个实验中持续。当在IL-2存在下培养来自hu-BLT小鼠的齿龈细胞，并且测定IFN-γ和IL-8分泌(图29E-图29J)时，相较于非携带肿瘤的健康小鼠，存在显著更低的来自携带胰腺肿瘤的小鼠的口腔齿龈细胞的IFN-γ分泌(图29E-图29G)。在携带胰腺肿瘤的小鼠中静脉内注射人(同种异体)超动力NK细胞(图29E和图29F)或hu-BLT(自体)超动力NK细胞(图29G)使IFN-γ分泌增加，并且当对小鼠饲喂AJ2益生菌时，水平得以进一步增加(图29E-图29G)。对于来自齿龈细胞的IL-8分泌，获得类似结果(图29H)。除IFN-γ之外，也测试IL-8以证明除细胞因子之外，在携带肿瘤的hu-BLT小鼠中，在存在以及不存在NK注射下，在进行以及不进行用AJ2饲喂下，趋化因子也类似地受调节。在存在以及不存在AJ2饲喂下注射超动力NK细胞导致胰腺肿瘤重量实质上降低(图29I)。在存在以及不存在用AJ2饲喂下注射超动力NK细胞导致来自携带口腔肿瘤的小鼠中的齿龈细胞的类似IFN-γ分泌概况(图29J)以及hu-BLT小鼠中口腔肿瘤重量显著降低。
当相较于非携带肿瘤的健康小鼠时，携带口腔肿瘤的hu-BLT小鼠中的人CD45+免疫细胞的百分比存在降低，而用超动力NK细胞注射的携带口腔肿瘤的小鼠与健康非携带肿瘤的小鼠展现齿龈组织中类似百分比的CD45+免疫细胞(图30A)。类似地，在用超动力NK细胞注射的携带口腔肿瘤的hu-BLT小鼠中，T细胞的百分比存在增加(图30A和图30B)。饲喂AJ2以及用超动力NK细胞注射的携带口腔肿瘤的hu-BLT小鼠具有最高CD45+免疫细胞增加，并且这个增加反映在CD3+ T细胞增加上(图30A和图30B)。
实施例6：超动力NK细胞使肿瘤中免疫细胞浸润增加并且通过分化来抑制人源化 BLT小鼠中不良分化胰腺癌的生长和转移
这个实施例说明NK细胞在通过抑制胰腺CSC/不良分化的MiaPaCa-2(MP2)肿瘤的侵袭性、转移潜力以及增加的对化学疗法的易感性来靶向胰腺CSC/不良分化MiaPaCa-2(MP2)肿瘤方面的作用。在NSG和hu-BLT的体内小鼠模型中，NK细胞驱动胰腺CSC/不良分化肿瘤的选择和分化。因此，CSC/不良分化肿瘤的由在患者中缺乏的强力NK细胞达成的体内选择和分化是这些肿瘤的侵袭性降低中的关键事件。
类似地，如先前实施例中所说明，MP2肿瘤在4周内生长，并且转移至肝与肺两者中并杀死小鼠，而用较大数目的PL12注射的小鼠在12周内产生极小肿瘤，并且不转移，也不杀死小鼠。将经NK上清液分化MP2注射至胰腺中不展现生长，也不转移至肝和肺中，并且所有小鼠都在终止实验所处的12周时存活。因为经NK上清液分化的MP2在移除NK上清液之后在孵育的12天内恢复成它们的干细胞样表型(Tseng等(2015)Oncotarget 6:8947-8959)，所以将经恢复的MP2细胞(Diff-MP2-R)植入胰腺中，从而导致在4周内生长增加以及转移至肝中。
接着用NK上清液使MP2肿瘤分化，并且通过手术植入hu-BLT小鼠的胰腺中。将生长动态和对小鼠的总体影响与携带未分化MP2肿瘤的小鼠进行比较。未分化MP2肿瘤快速生长，并且在胰腺中形成可触肿瘤，并且小鼠在4-6周内展现所有致病性征象，并且在第7周时处死后，它们展现跨越整个腹部，并且已包裹脾、胃和一部分肠的肿瘤。当将经NK上清液分化的MP2植入小鼠中时，无肿瘤在触碰时可触知或在任何时刻变得可见，并且小鼠不展现任何致病性征象，并且在第12周时处死后，胰腺展现正常尺寸和形状，并且无肿瘤可目视可见。
用未分化MP2肿瘤植入以及用1.5X 106个具有强力细胞毒性和细胞因子分泌能力的超动力NK细胞注射的小鼠展现显著较小的肿瘤，并且不可观察到对其他器官的涉及或致病性征象。此外，单独植入未分化肿瘤的小鼠中的较大百分比的CD45+免疫细胞是CD3+T细胞，而接受NK细胞的携带肿瘤的小鼠或具有经植入经NK分化肿瘤的小鼠展现的CD3+T细胞比例更接近于hu-BLT对照小鼠。当相较于携带未分化肿瘤的小鼠时，在经NK注射的携带肿瘤的小鼠或经NK分化肿瘤植入的小鼠中或在对照非肿瘤植入小鼠中，观察到CD45+免疫细胞或CD45+免疫细胞内的CD16+CD56+NK细胞是约2.0-2.7倍多。
当在肿瘤植入之前1-2周对小鼠饲喂AJ2以及用超动力NK细胞注射时，在经NK注射小鼠或经NK注射/经AJ2饲喂小鼠中，无肿瘤可触知，并且与在非经NK注射小鼠中获得的大型肿瘤相比，肿瘤重量保持实质上较低。当相较于携带肿瘤的小鼠时，来自经NK注射的携带肿瘤的小鼠或经NK注射/经AJ2饲喂的携带肿瘤的小鼠的血清分别展现IFN-γ是2.73倍多和4.8倍多。类似地，注射经NK分化MP2肿瘤不显示可见肿瘤，并且用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断MP2分化导致形成大型肿瘤。自体NK细胞与同种异体NK细胞两者均有效阻断肿瘤生长，并且在两者之间不可见显著差异。
当从未接受NK注射的小鼠解离和培养肿瘤时，肿瘤快速生长，而用自体或同种异体NK细胞注射的小鼠的肿瘤不生长或极缓慢生长。类似地，经NK分化的肿瘤不生长，并且用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断分化使肿瘤生长恢复，但不达到当在不存在NK注射下植入肿瘤时获得的水平。相较于单独经NK注射的小鼠，在饲喂AJ2以及用NK细胞注射的小鼠的情况下，在解离之后的肿瘤生长程度更小，并且两者均实质上小于在不存在NK下仅接受MP2肿瘤植入的那些。相较于单独经肿瘤注射的小鼠，在从用肿瘤和NK细胞注射的小鼠培养的肿瘤中，存在是18-22倍多的浸润性hCD45+免疫细胞。大多数CD45+免疫细胞表达CD94、CD56、NKG2D和DNAM表面受体。
当从各组解离胰腺，并且使相同数目的细胞与IL-2一起培养时，相较于不具有肿瘤的对照小鼠，在用干细胞样/未分化MP2肿瘤植入的小鼠中，可观察到分泌IFN-γ的显著降低。将NK细胞注射至携带肿瘤的小鼠中使IFN-γ的分泌恢复，并且水平超过在不具有肿瘤的对照小鼠的情况下所见的那些水平。植入经NK分化的MP2肿瘤不导致对IFN-γ的抑制，并且量与从不具有肿瘤的对照小鼠获得的那些量处于相同水平。饲喂AJ2和注射NK细胞达成对IFN-γ的最高诱导，此超过在所有其他组中所见的水平。相比之下，在携带肿瘤的小鼠中IL-6分泌升高，并且在所有其他组小鼠中，它都实质上降低。
当相较于从单独经MP2植入小鼠获得的那些表达时，在从经NK注射小鼠解离的MP2肿瘤上，B7H1(PD-L1)、I类MHC和CD54的表达显著更高。此外，类似于体外实验，来自经NK注射的小鼠的MP2肿瘤展现实质上降低的对NK细胞介导的杀灭的易感性，而从未经NK注射小鼠获得的那些肿瘤保持显著更加易感。当用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断肿瘤分化时，增加的对NK细胞介导的细胞毒性的易感性被恢复。
在携带肿瘤的小鼠中在所有组织区室内，NK细胞毒性和/或IFN-γ分泌都有损失，并且在注射NK细胞和/或饲喂AJ2的情况下，细胞毒性与IFN-γ分泌两者均得以恢复。携带肿瘤的小鼠PBMC，如同胰腺癌患者的PBMC和NK细胞一样，具有显著较小的经PBMC介导和经NK介导的细胞毒性，并且展现来自PBMC和其他组织区室的IFN-γ分泌降低。当评估PBMC、脾细胞、从脾细胞富集的NK细胞、来自脾细胞的CD3+T细胞和BM源性免疫细胞的NK细胞毒性和/或IFN-γ分泌时，相较于无肿瘤对照小鼠、或用NK细胞注射的那些小鼠、或用经NK分化肿瘤植入的那些小鼠，在所有组织区室中，来自携带肿瘤的小鼠的那些细胞都具有低得多的细胞毒性和/或IFN-γ分泌(类似于癌症患者PBMC、NK细胞和T细胞)。用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断肿瘤分化使IFN-γ分泌降低至用未分化肿瘤获得的水平。类似于饲喂AJ2，注射PD1抗体与NK细胞组合使所有组织区室中的IFN-γ分泌都升高。
胰腺肿瘤中的分化阶段与对NK细胞介导的细胞毒性的易感性相关联。在处于不同分化阶段的6个胰腺肿瘤之中，干细胞样/不良分化MP2肿瘤表达较高CD44和较低I类MHC和CD54表达，并且高度易感于NK细胞介导的细胞毒性，而充分分化的PL12肿瘤具有较低CD44，但CD54和I类MHC较高，并且它们相对地对NK细胞介导的细胞毒性具有抗性。
经NK分化的MP2肿瘤对NK细胞介导的细胞毒性的抗性由从NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的组合介导。NK细胞通过IFN-γ和TNF-α的作用来介导MP2肿瘤分化。
NAC、CDDP和紫杉醇诱导经NK分化的MP2肿瘤的显著细胞死亡。
用NK上清液使MP2分化导致对CDDP和紫杉醇介导的细胞死亡的显著易感性，并且用抗IFN-γ抗体和抗TNF-α抗体阻断NK上清液介导的MP2肿瘤分化使由CDDP或紫杉醇诱导的细胞死亡实质上降低。将NAC添加至不良分化的MP2中一般来说对细胞死亡具有较低/轻微影响，然而，当添加至充分分化PL12或Capan中时，它诱导较大水平的细胞死亡。
当相较于单独经肿瘤植入小鼠的那些单核细胞或破骨细胞时，来自用NK细胞注射或用经NK分化MP2肿瘤植入的携带肿瘤的小鼠的单核细胞或破骨细胞触发来自NK细胞的显著更多的IFN-γ。当使来自hu-BLT的纯化NK细胞与从BM纯化的自体单核细胞一起培养，或使同种异体健康NK细胞与hu-BLT破骨细胞一起培养，并且评估NK扩增、细胞毒性、由NK细胞达成的IFN-γ分泌的水平时，相较于来自不存在NK或经NK分化的肿瘤的携带肿瘤的小鼠的NK+单核细胞或NK+破骨细胞培养物，与来自用肿瘤植入以及用NK细胞注射或用经NK分化肿瘤植入的小鼠的单核细胞或破骨细胞一起培养的NK细胞具有显著更高的扩增和功能。当使来自胰腺癌患者和健康对照的破骨细胞与同种异体健康NK细胞一起培养时，获得类似结果。当相较于来自健康个体的破骨细胞时，来自癌症患者的破骨细胞使NK细胞扩增、介导细胞毒性或使IFN-γ分泌的能力较小。当考查癌症患者和健康个体的破骨细胞上的表面受体表达时，相较于健康OC，可在患者OC上观察到I类MHC、CD54、KLRG1、KIR2/KIR3和MICA/B的表达降低。
此外，即使当相同量的来自NK细胞上清液的IFN-γ用于使MP2肿瘤分化时，相比于来自健康个体的NK上清液，来自患者NK细胞的那些上清液分化的MP2肿瘤也少得多。来自患者的NK上清液使I类MHC适度升高，并且诱导MP2肿瘤对NK介导的细胞毒性的仅35％抗性，而来自健康个体的NK上清液使I类MHC实质上升高，并且诱导MP2针对NK介导的细胞毒性的78％抗性。当相较于健康个体T细胞时，相比于NK细胞，在用来自患者T细胞的上清液使MP2肿瘤分化的情况下观察到较小的抑制作用。
实施例7：NK细胞和AJ2组合物的潜在治疗用途
由NK细胞分泌的细胞因子，主要是IFN-γ和TNF-α，导致分化抗原I类MHC、CD54和B7H1增加以及CD44降低，从而导致健康干细胞与经转化干细胞(包括OSCSC)两者的分化。这个研究证明益生细菌也诱导NK细胞中的显著分割无反应性，由此导致细胞因子分泌增加。
sAJ2是由于在添加至经IL-2或IL-2+抗CD16 mAb处理NK细胞中时能够诱导协同IFN-γ分泌而选择的8种益生细菌菌株的组合(Bui等(2015)Front Immunol,6:576)。这个细菌菌株组合被选择来提供细菌多样性以及用于达成它对由NK细胞产生的促炎性和抗炎性细胞因子和生长因子的最优诱导。
尽管在sAJ2的NK细胞细胞毒性水平方面未观察到显著差异，但在用sAJ2益生菌处理的NK细胞中观察到细胞因子分泌显著增大，从而表明受细菌影响的NK细胞的细胞毒性功能与细胞因子分泌功能之间不相关。基于这个课题，经sAJ2细菌处理的分割无反应的NK细胞上清液也诱导OSCSC的较大分化和对NK细胞介导的细胞毒性的抗性(另一分化指示，因为NK细胞倾向于靶向干细胞/干细胞样细胞而非它们的更加分化的对应物)(图3和图4)。由用sAJ2处理的分割无反应的NK细胞诱导的这个OSCSC分化通过IFN-γ和/或TNF-α的细胞因子分泌来显著介导(图3-图7)。因此，用sAJ2益生细菌处理NK细胞会诱导细胞因子分泌，从而进一步导致肿瘤分化以及肿瘤生长降低。
申请人发现当相较于许多先前策略时，使用作为饲养细胞的破骨细胞与IL-2+抗CD16 mAb+sAJ2组合是用以使大量具有靶向癌症干细胞的显著能力的超动力NK细胞扩增的最佳策略(表2和图11)。申请人实现在第20天扩增至约21,000-132,000倍，以及在第31天扩增至30-510万倍，其中在4周内达到17-21群体倍增—这是相比于任何先前报道的NK扩增方法，高得多的速率。尽管由于不同类型的靶标用于评估而难以在各研究之间比较经扩增NK细胞的细胞毒性功能，但我们的策略除提供较大量的IFN-γ分泌之外也提供具有靶向和裂解癌症干细胞的显著功能性的经扩增的NK细胞(其持续长久时期维持它们的纯度)(图8-图10)。
因为自体NK细胞与同种异体NK细胞两者均可使用我们的实验室NK扩增方案扩增，所以我们的新近研究结果有希望转化成用于癌症患者的治疗性免疫疗法。因此，申请人的体内研究指示NK细胞是选择和分化CSC，从而导致在疾病进展期间抑制肿瘤生长以及消退慢性炎症的主要免疫效应物。由NK细胞分化的CSC变为化学治疗性和放射性治疗策略的敏感靶标。非HLA匹配口腔CSC、胰腺CSC和黑素瘤CSC能够在具有完全重构人免疫系统的BLT人源化小鼠中形成实质性肿瘤。此外，包括NK细胞、T细胞、B细胞和单核细胞的主要人免疫子组存在于骨髓(表3)、血液(表4)、脾(表6)和经浸润肿瘤微环境(表9)中。在人源化小鼠中静脉内注射经扩增NK细胞通过使CSC分化来抑制OSCSC的肿瘤生长(表8和表10、图24-图26)。此外，通过NK免疫疗法来分化的肿瘤表达较高水平的MHC-I(图25)，对NK细胞介导的细胞毒性更加具有抗性(图26)，并且以慢得多的速率生长(表8和表10、图24)。这些结果明确显示NK细胞诱导的肿瘤分化在限制肿瘤生长和侵袭性方面是重要的。也显示益生细菌与NK活化细胞因子和作为饲养细胞的破骨细胞组合为NK细胞提供用以促进肿瘤分化的条件。
使用补充以AJ2的NK免疫疗法也使各种免疫组织区室中的NK细胞的功能增强。接受NK免疫疗法的hu-BLT小鼠的各种组织区室分泌高水平的IFN-γ和IL-10(图14B、图16、图18、图19、图21-图23和表7)。同时，采用NK免疫疗法与AJ2补充组合，相较于单独NK免疫疗法，细胞因子分泌水平存在显著增加(图13、图14、图18-图21以及表5和表7)。相较于显示在培养的PBMC(图15)与脾细胞(图17)两者中，细胞毒性功能均显著降低的单独携带肿瘤的情况，接受NK免疫疗法治疗的小鼠具有显著改进的细胞毒性功能。类似于单独肿瘤情况，癌症患者的NK细胞也显示在细胞因子分泌与细胞毒性两方面均缺乏功能。同时，类似于hu-BLT健康对照组，健康人PBMC在用单独IL-2活化时显示低细胞因子分泌和高水平的细胞毒性(图15和图16)。携带肿瘤的益生菌补充对照组展现分割无反应的表型，其中细胞毒性降低，但存在增大的IFN-γ分泌(图15和图16)。同时，在肿瘤注射之后接受NK免疫疗法的小鼠显示细胞毒性功能以及细胞因子分泌功能两者(图15和图16)。这证明与益生菌补充组合，在BLT人源化小鼠模型中，经离体扩增NK细胞具有持续体内效能，并且它们能够选择和分化癌症干细胞样肿瘤。
如上所指示，对用超动力NK细胞注射的携带肿瘤的hu-BLT小鼠饲喂AJ2使齿龈中CD45+免疫细胞的水平与CD3+ T细胞的水平两者均增加。当基于CD3+ T细胞的百分比调整时，来自饲喂AJ2以及用NK细胞注射的携带肿瘤的小鼠的IFN-γ分泌水平T细胞百分比类似于非携带肿瘤的健康小鼠(数据未显示)，因此，饲喂AJ2不仅使免疫细胞向齿龈的募集增加，而且这也使分泌的IFN-γ的量恢复至用健康小鼠的齿龈细胞所见的水平。因为口腔是可及途径，所以它可用于预测胰腺癌情况下的全身性肿瘤负荷。目前，采用现有技术，极其难以确定胰腺癌的情况下的病程，因此，通过使用唾液或来自齿龈组织的细胞，可能够预测疾病活动性以及调适治疗策略以更好靶向肿瘤。此外，齿龈内NK功能的损失可为口腔疾病的预示。此外，本论文中呈现的数据明确证明遗传因素与生活方式因素两者均可能有助于肿瘤发生以及抑制齿龈中的NK细胞功能。
经扩增NK细胞在体外系统与体内系统两者中选择和分化CSC。使用补充以AJ2的NK免疫疗法诱导较高百分比的NK细胞和T细胞，并且使NK细胞的功能尤其是细胞因子分泌能力增强。NK免疫疗法在存在益生细菌下选择和分化口腔肿瘤。这些研究结果提供至关重要的转化研究基础。申请人发现NK免疫疗法在人源化小鼠中的显著作用，最显著的是它阻止肿瘤生长以及使肿瘤分化的能力。鉴于临床环境，例如通过测试NK免疫疗法的作用的I期临床试验，益生菌补充的使用包括用以癌症治疗的辅助疗法，或作为癌症预防措施，任选与化学疗法或免疫疗法组合。归因于NK细胞靶向、杀灭和分化能够进行转移和癌症再生的CSC的独特功能性能力，所以它们具有针对患者中的癌症复发的治疗用途。这个突破性NK扩增方法会促进和优化过继性NK免疫疗法。
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以引用的方式并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请都据此以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像各个别出版物、专利或专利申请被特定地以及个别地指示以引用的方式并入一样。在起冲突的情况下，将以包括本文任何定义的本申请为准。
也以引用的方式整体并入本文的是引用与公共数据库中的条目关联的登录号的任何多核苷酸和多肽序列，诸如由基因组研究所(The Institute for Genomic Research，TIGR)在万维网上在tigr.org处和/或国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov处维持的那些。
等效案
本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效案。所述等效案意图由以下权利要求涵盖。

Claims (44)

1.一种组合物，其包含至少一种选自以下的细菌菌株：嗜热链球菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌KE99和保加利亚乳酸杆菌，任选地其中所述至少一种细菌菌株是活的或经声波处理的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含嗜热链球菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌KE99和保加利亚乳酸杆菌。
3.如任何前述权利要求所述的组合物，其进一步包含破骨细胞。
4.如任何前述权利要求所述的组合物，其进一步包含能够使NK细胞活化和/或扩增的另一剂。
5.如任何前述权利要求所述的组合物，其进一步包含NK细胞。
6.如任何前述权利要求所述的组合物，其用于使NK细胞活化和/或扩增。
7.如任何前述权利要求所述的组合物，其用于增加或促进由NK细胞产生和/或分泌至少一种细胞因子、和/或由NK细胞产生的所述至少一种细胞因子的功能。
8.如任何前述权利要求所述的组合物，其用于增加或促进受试者中至少一种细胞因子或趋化因子的产生、分泌和/或功能，任选地其中至少一种细胞因子或趋化因子的所述功能由可通过基于细胞或非基于细胞的体外测定进行测试的细胞毒性功能来度量。
9.如任何前述权利要求所述的组合物，其用于增加或促进受试者中至少一种细胞因子或趋化因子的产生和/或分泌，任选地其中
i)所述至少一种细胞因子或趋化因子的所述细胞毒性功能不由所述组合物增加；或
ii)所述至少一种细胞因子或趋化因子的所述细胞毒性功能可通过基于细胞或非基于细胞的体外测定进行测试。
10.如权利要求7-9中任一项所述的组合物，其中所述至少一种细胞因子是表1中所列的细胞因子中的一种，任选地其中所述至少一种细胞因子选自：IL-10、IL-12、IFN-γ、TGF-α、GM-CSF、IL-13、IL-17A、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-4、IL-23、IL-5和IL-7。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述至少一种细胞因子包括IL-10、IL-12、IFN-γ或TGF-α。
12.如权利要求7-11中任一项所述的组合物，其中所述至少一种趋化因子包括表1中所列的趋化因子中的一种，任选地其中所述至少一种趋化因子选自：膜结合型趋化因子、MIP-3α、MIP-1α和MIP-1β。
13.如任何前述权利要求所述的组合物，其用于在体外、离体和/或在体内降低或抑制癌生长，和/或增加或促进癌细胞分化。
14.一种试剂盒，其包含如任何前述权利要求所述的组合物。
15.一种在体外、离体和/或在体内使NK细胞活化的方法，其包括在培养基中连同如权利要求1-13中任一项所述的组合物一起培养所述NK细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述NK细胞的活化增加至少一种细胞因子和/或趋化因子从所述NK细胞的产生和/或分泌。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述NK细胞是分割无反应的。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述NK细胞的活化不增加所述至少一种细胞因子和/或趋化因子的所述功能，任选地其中所述功能是细胞毒性。
19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含至少一种能够使所述NK细胞活化的非NK细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一种非NK细胞是破骨细胞。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中相对于在不具有所述至少一种非NK细胞的相同条件下培养，与所述至少一种非NK细胞一起培养所述NK细胞促进所述NK细胞的扩增。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中相较于在没有所述至少一种非NK细胞的情况下的培养，与所述至少一种非NK细胞一起培养所述NK细胞会持续更久时间增加所述NK细胞的扩增速率和/或所述细胞毒性功能。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，借此，相较于在相同条件下但没有所述至少一种非NK细胞培养的NK细胞，所述NK细胞产生至少2、5、10、20、30、40、50、100倍或更多倍的至少一种细胞因子或趋化因子。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中相较于没有所述至少一种非NK细胞，所述NK细胞在20天时扩增增加至少10,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、132,000、140,000倍或更多倍，或在4周之后群体倍增增加至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30倍或更多倍。
25.一种诱导癌细胞的分化和/或癌细胞对NK细胞介导的细胞毒性的抗性的方法，其包括
i)在培养基中连同如权利要求1-13中任一项所述的组合物一起培养所述癌细胞；或
ii)使所述癌细胞与如权利要求1-13中任一项所述的组合物接触。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述培养基或所述培养基的上清液包含浓度和/或功能增加的至少一种细胞因子和/或趋化因子，任选地其中所述至少一种细胞因子和/或趋化因子是表1中所列的那些中的一种。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述培养基或所述培养基的所述上清液包含所述组合物和至少一种能够使所述NK细胞活化的非NK细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一种非NK细胞是破骨细胞。
29.一种治疗患有或被怀疑患有癌症或癌症相关疾病或病症的受试者的癌症或癌症相关疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-13中任一项所述的组合物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述组合物诱导和/或增加所述受试者中至少一种细胞因子或趋化因子的产生、分泌和/或功能，任选地其中所述至少一种细胞因子和/或趋化因子是表1中所列的那些中的一种。
31.如权利要求29或30所述的方法，其进一步包括共同施用至少一种能够使所述NK细胞活化的非NK细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种非NK细胞是破骨细胞。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中相较于不进行所述共同施用，所述至少一种非NK细胞的所述共同施用进一步改善对所述癌症或癌症相关疾病或病症的治疗作用。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述组合物
i)诱导和/或增加所述受试者中癌细胞的分化；
ii)诱导和/或增加所述受试者中癌细胞对NK细胞介导的细胞毒性的抗性；和/或
iii)降低所述受试者中癌细胞的生长。
35.如权利要求25-28和34中任一项所述的方法，其中所述癌症的所述分化由它的表型和/或至少一种生物标志物的表达来度量，任选地其中所述至少一种生物标志物是MHC-I。
36.如权利要求16、18、23、24、26和30中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子选自：IL-10、IL-12、IFN-γ、TGF-α、GM-CSF、IL-13、IL-17A、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-4、IL-23、IL-5、IL-7、膜结合型趋化因子、MIP-3α、MIP-1α和MIP-1β。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子是IL-10、IL-12、IFN-γ、或TGF-α、膜结合型趋化因子、MIP-3α、MIP-1α或MIP-1β。
38.如权利要求1-13中任一项所述的组合物、如权利要求14所述的试剂盒、如权利要求15-37中任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
39.如权利要求1-13中任一项所述的组合物、如权利要求14所述的试剂盒、如权利要求15-37中任一项所述的方法，其用于全身性施用。
40.如权利要求39所述的组合物，其用于口服和/或经直肠施用。
41.如权利要求13所述的组合物，其中所述癌症是口腔癌或胰腺癌。
42.如权利要求25-37中任一项所述的方法，其中所述癌症是口腔癌或胰腺癌。
43.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种化学治疗剂或毒素。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述至少一种化学治疗剂是CDDP、紫杉醇(PTX)和/或N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
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