KR102100307B1 - 인간 림프 기관-유래 억제성 기질 세포의 분리 및 용도 - Google Patents

Abstract

면역 반응의 억제 방법을 제공한다. 본 방법은, 치료가 필요한 개체에게 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 개체에서 면역 반응을 억제하는데 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은, 효소 믹스와 교반을 조합 사용하여 림프 조직 단편을 분해 (digesting)한 다음, LSSC를 수집함으로써, LSSC를 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한, LSSC를 포함하는 약학 조성물도 제공한다.

Description

인간 림프 기관-유래 억제성 기질 세포의 분리 및 용도 {ISOLATION AND USE OF HUMAN LYMPHOID ORGAN-DERIVED SUPPRESSIVE STROMAL CELLS}

본 출원은 미국 특허법 35 U.S.C. §119(e)를 토대로 2012년 3월 21일자 미국 가출원번호 61/613,697에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 NIH 교부 DK074500, K01DK087770 및 AI045757호로 정부 지원을 받아 행해졌다. 이에, 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 가진다.

면역억제제는 특정 질환을 치료하기 위해 면역계의 활성을 저해하거나 방지하는데 사용된다. 임상적으로, 면역억제제는 다수의 증상들을 치료 또는 예방하는데, 예컨대 이식받은 장기와 조직 (예, 골수, 심장, 신장, 간 등)의 거부 반응을 예방하고, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선 및 염증성 장 질환과 같은 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용된다. 현재 만성 염증성 질환의 치료용으로 허가받은 면역억제제는 자주 투여하여야 하며, 신장 독성 위험성과 발병 등의 심각한 부작용을 수반한다.

면역억제성 기질 세포 타입 (예, 간엽 기질 세포)이 개시되었지만, 충분히 규명되진 않은 상태이며, 임상 실험에서 1차 효능 엔드포인트 (primary efficacy endpoint)를 충족시키지 못하였다. 아울러, 이러한 기질 세포를 분리하는 것은, 세포의 성공적인 분리의 어려움으로 인해, 과제로 남아있다. 자가면역 또는 염증성 질환과 같이 원치않은 면역 활성에 의해 야기되는 병태의 중증도와 활력을 고려할때, 이러한 질환에 대해 효과적인 치료법의 개발이 상당히 요구되고 있다.

Ahrendt, M., Hammerschmidt, S. I., Pabst, O., Pabst, R., and Bode, U. (2008). Stromal cells confer lymph node-specific properties by shaping a unique microenvironment influencing local immune responses. J Immunol 181, 1898-1907. Ansel, K. M., Ngo, V. N., Hyman, P. L., Luther, S. A., Forster, R., Sedgwick, J. D., Browning, J. L., Lipp, M., and Cyster, J. G. (2000). A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature 406, 309-314. Bajenoff, M., Egen, J. G., Koo, L. Y., Laugier, J. P., Brau, F., Glaichenhaus, N., and Germain, R. N. (2006). Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration and territoriality in lymph nodes. Immunity 25, 989-1001. Buettner, M., Pabst, R., and Bode, U. (2011). Lymph node stromal cells strongly influence immune response suppression. Eur J Immunol 41, 624-633. Cao, G., Beyer, T. P., Yang, X. P., Schmidt, R. J., Zhang, Y., Bensch, W. R., Kauffman, R. F., Gao, H., Ryan, T. P., Liang, Y., Eacho, P. I., and Jiang, X. C. (2002). Phospholipid transfer protein is regulated by liver x receptors in vivo. J Biol Chem 277, 39561-39565. Chyou, S., Ekland, E. H., Carpenter, A. C., Tzeng, T. C., Tian, S., Michaud, M., Madri, J. A., and Lu, T. T. (2008). Fibroblast-type reticular stromal cells regulate the lymph node vasculature. J Immunol 181, 3887-3896. Cohen, J. N., Guidi, C. J., Tewalt, E. F., Qiao, H., Rouhani, S. J., Ruddell, A., Farr, A. G., Tung, K. S., and Engelhard, V. H. (2010). Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via aire-independent direct antigen presentation. J Exp Med 207, 681-688. Coles, M., Kioussis, D., and Veiga-Fernandes, H. (2010). Cellular and molecular requirements in lymph node and peyer's patch development. Prog Mol Biol Transl Sci 92, 177-205. Cyster, J. G., Ansel, K. M., Reif, K., Ekland, E. H., Hyman, P. L., Tang, H. L., Luther, S. A., and Ngo, V. N. (2000). Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunol Rev 176, 181-193. Dennis, G., Jr., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., and Lempicki, R. A. (2003). David: Database for annotation, visualization, and integated discovery. Genome Biol 4, P3. Dinarello, C. A. (1996). Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood 87, 2095-2147. Eikelenboom, P., Nassy, J. J., Post, J., Versteeg, J. C., and Langevoort, H. L. (1978). The histogenesis of lymph nodes in rat and rabbit. Anat Rec 190, 201-215. Fletcher, A. L., Lukacs-Kornek, V., Reynoso, E. D., Pinner, S. E., Bellemare-Pelletier, A., Curry, M. S., Collier, A. R., Boyd, R. L., and Turley, S. J. (2010). Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. J Exp Med 207, 689-697. Fletcher, A. L., Malhotra, D., and Turley, S. J. (2011). Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends Immunol 32, 12-18. Galdones, E., Lohnes, D., and Hales, B. F. (2006). Role of retinoic acid receptors alpha1 and gamma in the response of murine limbs to retinol in vitro. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 76, 39-45. Gallucci, R. M., Lee, E. G., and Tomasek, J. J. (2006). Il-6 modulates alpha-smooth muscle actin expression in dermal fibroblasts from il-6-deficient mice. J Invest Dermatol 126, 561-568. Gardner, J. M., Devoss, J. J., Friedman, R. S., Wong, D. J., Tan, Y. X., Zhou, X., Johannes, K. P., Su, M. A., Chang, H. Y., Krummel, M. F., and Anderson, M. S. (2008). Deletional tolerance mediated by extrathymic aire-expressing cells. Science 321, 843-847. Hadis, U., Wahl, B., Schulz, O., Hardtke-Wolenski, M., Schippers, A., Wagner, N., Muller, W., Sparwasser, T., Forster, R., and Pabst, O. (2011). Intestinal tolerance requires gut homing and expansion of foxp3+ regulatory t cells in the lamina propria. Immunity 34, 237-246. Hu, Y., Bock, G., Wick, G., and Xu, Q. (1998). Activation of pdgf receptor alpha in vascular smooth muscle cells by mechanical stress. Faseb J 12, 1135-1142. Irizarry, R. A., Hobbs, B., Collin, F., Beazer-Barclay, Y. D., Antonellis, K. J., Scherf, U., and Speed, T. P. (2003). Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264. Iwata, M. (2009). Retinoic acid production by intestinal dendritic cells and its role in t-cell trafficking. Semin Immunol 21, 8-13. Junt, T., Scandella, E., and Ludewig, B. (2008). Form follows function: Lymphoid tissue microarchitecture in antimicrobial immune defence. Nat Rev Immunol 8, 764-775. Katakai, T., Hara, T., Lee, J. H., Gonda, H., Sugai, M., and Shimizu, A. (2004a). A novel reticular stromal structure in lymph node cortex: An immuno-platform for interactions among dendritic cells, t cells and b cells. Int Immunol 16, 1133-1142. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., and Shimizu, A. (2004b). Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. J Exp Med 200, 783-795. Katakai, T., Suto, H., Sugai, M., Gonda, H., Togawa, A., Suematsu, S., Ebisuno, Y., Katagiri, K., Kinashi, T., and Shimizu, A. (2008). Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs. J Immunol 181, 6189-6200. Koni, P. A., Sacca, R., Lawton, P., Browning, J. L., Ruddle, N. H., and Flavell, R. A. (1997). Distinct roles in lymphoid organogenesis for lymphotoxins alpha and beta revealed in lymphotoxin beta-deficient mice. Immunity 6, 491-500. Lee, J. W., Epardaud, M., Sun, J., Becker, J. E., Cheng, A. C., Yonekura, A. R., Heath, J. K., and Turley, S. J. (2007). Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes t cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol 8, 181-190. Link, A., Hardie, D. L., Favre, S., Britschgi, M. R., Adams, D. H., Sixt, M., Cyster, J. G., Buckley, C. D., and Luther, S. A. (2011). Association of t-zone reticular networks and conduits with ectopic lymphoid tissues in mice and humans. Am J Pathol 178, 1662-1675. Link, A., Vogt, T. K., Favre, S., Britschgi, M. R., Acha-Orbea, H., Hinz, B., Cyster, J. G., and Luther, S. A. (2007). Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive t cells. Nat Immunol 8, 1255-1265. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., and Cyster, J. G. (2000). Coexpression of the chemokines elc and slc by t zone stromal cells and deletion of the elc gene in the plt/plt mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12694-12699. Mackay, F., and Schneider, P. (2009). Cracking the baff code. Nat Rev Immunol 9, 491-502. Magnusson, F. C., Liblau, R. S., von Boehmer, H., Pittet, M. J., Lee, J. W., Turley, S. J., and Khazaie, K. (2008). Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against cd8 t-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology 134, 1028-1037. Matsuura, T., and Ross, A. C. (1993). Regulation of hepatic lecithin: Retinol acyltransferase activity by retinoic acid. Arch Biochem Biophys 301, 221-227. Mebius, R. E. (2003). Organogenesis of lymphoid tissues. Nat Rev Immunol 3, 292-303. Mei SH, Haitsma JJ, Dos Santos CC, Deng Y, Lai PF, Slutsky AS, Liles WC, Stewart DJ. Mesenchymal stem cells reduce inflammation while enhancing bacterial clearance and improving survival in sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2010;182(8):1047-57. Muller, M., Carter, S., Hofer, M. J., and Campbell, I. L. (2010). Review: The chemokine receptor cxcr3 and its ligands cxcl9, cxcl10 and cxcl11 in neuroimmunity--a tale of conflict and conundrum. Neuropathol Appl Neurobiol 36, 368-387. Nemeth K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, Mayer B, Parmelee A, Doi K, Robey PG, Leelahavanichkul K, Koller BH, Brown JM, Hu X, Jelinek I, Star RA, Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med. 2009; 15(1):42-9 Nichols, L. A., Chen, Y., Colella, T. A., Bennett, C. L., Clausen, B. E., and Engelhard, V. H. (2007). Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol 179, 993-1003. Ohtani, H., Jin, Z., Takegawa, S., Nakayama, T., and Yoshie, O. (2009). Abundant expression of cxcl9 (mig) by stromal cells that include dendritic cells and accumulation of cxcr3+ t cells in lymphocyte-rich gastric carcinoma. J Pathol 217, 21-31. Pabst, O., Forster, R., Lipp, M., Engel, H., and Arnold, H. H. (2000). Nkx2.3 is required for madcam-1 expression and homing of lymphocytes in spleen and mucosa-associated lymphoid tissue. Embo J 19, 2015-2023. Panuncio, A. L., De La Pena, S., Gualco, G., and Reissenweber, N. (1999). Adrenergic innervation in reactive human lymph nodes. J Anat 194 ( Pt 1), 143-146. Pedersen, B. K. (2006). The anti-inflammatory effect of exercise: Its role in diabetes and cardiovascular disease control. Essays Biochem 42, 105-117. Rebe, C., Raveneau, M., Chevriaux, A., Lakomy, D., Sberna, A. L., Costa, A., Bessede, G., Athias, A., Steinmetz, E., Lobaccaro, J. M., Alves, G., Menicacci, A., Vachenc, S., Solary, E., Gambert, P., and Masson, D. (2009). Induction of transglutaminase 2 by a liver x receptor/retinoic acid receptor alpha pathway increases the clearance of apoptotic cells by human macrophages. Circ Res 105, 393-401. Scandella, E., Bolinger, B., Lattmann, E., Miller, S., Favre, S., Littman, D. R., Finke, D., Luther, S. A., Junt, T., and Ludewig, B. (2008). Restoration of lymphoid organ integrity through the interaction of lymphoid tissue-inducer cells with stroma of the t cell zone. Nat Immunol 9, 667-675. Sixt, M., Kanazawa, N., Selg, M., Samson, T., Roos, G., Reinhardt, D. P., Pabst, R., Lutz, M. B., and Sorokin, L. (2005). The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the t cell area of the lymph node. Immunity 22, 19-29. Warnock, R. A., Askari, S., Butcher, E. C., and von Andrian, U. H. (1998). Molecular mechanisms of lymphocyte homing to peripheral lymph nodes. J Exp Med 187, 205-216. Willard-Mack, C. L. (2006). Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicol Pathol 34, 409-424. Woolf, E., Grigorova, I., Sagiv, A., Grabovsky, V., Feigelson, S. W., Shulman, Z., Hartmann, T., Sixt, M., Cyster, J. G., and Alon, R. (2007). Lymph node chemokines promote sustained t lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol 8, 1076-1086. Yamagata, T., Mathis, D., and Benoist, C. (2004). Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a cd8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nat Immunol 5, 597-605. Yip, L., Su, L., Sheng, D., Chang, P., Atkinson, M., Czesak, M., Albert, P. R., Collier, A. R., Turley, S. J., Fathman, C. G., and Creusot, R. J. (2009). Deaf1 isoforms control the expression of genes encoding peripheral tissue antigens in the pancreatic lymph nodes during type 1 diabetes. Nat Immunol 10, 1026-1033. Yoneyama, H., Narumi, S., Zhang, Y., Murai, M., Baggiolini, M., Lanzavecchia, A., Ichida, T., Asakura, H., and Matsushima, K. (2002). Pivotal role of dendritic cell-derived cxcl10 in the retention of t helper cell 1 lymphocytes in secondary lymph nodes. J Exp Med 195, 1257-1266. Zampetaki, A., Zhang, Z., Hu, Y., and Xu, Q. (2005). Biomechanical stress induces il-6 expression in smooth muscle cells via ras/rac1-p38 mapk-nf-kappab signaling pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288, H2946-2954.

본 발명은, 일부 측면에서, 림프절로부터 분리된 기질 세포가 면역 반응을 억제할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 림프절 유래 기질 세포가 이의 공지된 면역 세포에 대한 공격력과 조합되어 면역 반응을 억제하는 능력은, 개체에서 면역 반응을 억제하는 유효한 도구가 된다. 이에, 본 발명의 일부 측면은, 치료가 필요한 개체에게 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 개체에서 면역 반응을 억제하는데 유효한 양으로 투여함으로써, 면역 반응을 억제하는 방법을 포함한다. 일부 구현예들에서, 개체에게 투여되는 LSSC는 생체외에서 증폭시킨 세포이다. 일부 구현예들에서, 개체에게 투여되는 LSSC에는 비-LSSC (non-LSSC)가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예들에서, LSSC가 적어도 100,000 LSSC/kg으로 개체에게 투여된다. 일부 구현예들에서, LSSC가 적어도 1,000,000 LSSC/kg으로 개체에게 투여된다.

LSSC는 하기 조직들 중 어느 하나 또는 조합으로부터 수득할 수 있다: 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 (adenoid) 및 페이어판 (Peyer's patch). LSSC는 개체의 자가, 동종 또는 이종 조직일 수 있다.

일부 구현예들에서, LSSC는 개체에 이식된 2차원 또는 3차원의 프레임워크 (framework) 상에 또는 내에 존재한다. 일부 구현예들에서, LSSC는 정맥내, 복막내, 동맥내, 피하, 또는 근육내 주입에 의해, 또는 병소, 장기, 장기 피막 (organ capsule), 지방 또는 림프절로의 국소 투여에 의해 개체에게 투여된다.

치료가 필요한 개체는, 예를 들어, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 가진 개체를 지칭한다. 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예로는, 비제한적으로, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환, 이식 편대 숙주 질환 및 패혈증을 포함한다.

본 발명의 일 측면에서, LSSC를 분리하는 방법이 제공된다. 본 방법은, 효소 믹스와 교반의 조합 (combination of an enzyme mix and agitation)을 이용하여 림프 조직의 단편들을 분해(digesting)하는 단계 및 LSSC를 수집하는 단계를 포함한다.

림프 조직 단편의 분해는,

(i) 림프 조직 단편을 효소 믹스와 인큐베이션하는 단계;

(ii) 상기 조직을 파이펫으로 교반한 후, 인큐베이션하여 큰 단편들을 침전시키는 단계;

(iii) 상층물은 제거하고, 모든 단편들이 분해될 때까지 단계 (i)과 (ii)를 반복하여 수행하는 단계를 포함하는, 일련의 단계로 수행할 수 있으며,

여기서, LSSC는 상기 상층물 분획을 모두 합한 후 원심분리하여 세포 펠렛을 수득함으로써, 수집한다.

구현예로, 분리된 LSSC는 성장 인자, 혈청, 혈소판 세포용혈물 (lysate) 및 항생제 중 하나 이상이 첨가된 기본 세포 배양 배지를 포함하는 배양 배지에서 배양한다. 구현예에 있어서, 분리된 LSSC는 1-10,000 세포/cm²의 밀도로 배양할 수 있다. 구현예에 있어서, 분리된 LSSC는 0.1-21%의 산소 분압 하에 배양한다. 일부 구현예에서, LSSC는 비-LSSC가 실질적으로 없을 때까지 배양할 수 있다. 일부 구현예들에서, LSSC는, 기질 세포의 수가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 그 이상으로 증가할 때까지, 배양한다. 일부 구현예들에서, LSSC를 포함하는 개체군은, 조혈 세포 또는 기타 비-기질 세포를 제거하거나, 또는 비-기질 세포의 증식에 비해 기질 세포를 증식시키는데 우호적인 조건에서 세포 개체군을 배양함으로써, 농화(enrichment)한다. 이러한 조건은 본원에 기술되어 있다.

일 구현예에서, 효소 믹스는 배양 배지, 디스파제 (Dispase), 콜라게나제 및 DNaseI을 포함한다. LSSC는 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 및/또는 페이어판으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예들에서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 분리된 LSSC는 개체에서 면역 반응을 억제하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 포함하는 조성물이 제공된다. LSSC는 전술한 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 분리된 림프 조직 유래 억제성 기질 세포 (LSSC)의 조성물을 포함하는 약학 조제물이 제공한다. LSSC는 화학적, 기계적 및 전기적 세포 분리 공정들 중 한가지 이상의 공정을 이용하여 림프 조직 단편들을 처리한 다음 LSSC를 수집함으로써, 분리할 수 있다.

일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 세포 배양을 통해 증폭시킨다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 생체외에서 증폭시킨 세포이다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는, LSSC에 실질적으로 비-LSSC가 존재하지 않을 때까지 수집한 세포를 증식시킴으로써, 증폭시킨다.

일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 CD140a와 PD-L2를 공동-발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 CD140a와 LTBR을 공동-발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 CD140a, PD-L2 및 LTBR을 공동-발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 PD-L1, Thy-1, MADCAM-1, MYH11, IL-7R 또는 ITGA7으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 림프성 마커를 발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 IL-6, CCL19, CCL21 또는 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 발현한다.

LSSC는 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 말, 돼지, 소 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 분리할 수 있다. LSSC는 T 세포의 증식을 생체내 또는 시험관내에서 억제할 수 있다.

본 발명의 각각의 구현예와 각각의 측면은 독립적으로 또는 조합하여 수행할 수 있다. 또한, 본원에 사용되는 표현과 용어는 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하는 것으로 간주되지 않는다. "비롯하여", "포함하는" 또는 "가지는", "함유하는", "수반하는" 및 이들의 변형어들의 사용은 본원에서 이후 열거된 항목과 이의 등가 뿐만 아니라 추가적인 항목을 포괄하는 의미이다.

본 발명의 이러한 측면들과 그외 측면들, 뿐만 아니라 다양한 이점 및 유용성은 상세한 설명을 참조하여 명확해질 것이다. 본 발명의 각 측면은 이해되는 바와 같은 다양한 구현예들을 포괄할 수 있다.

본 출원에서 밝힌 모든 문헌들은 원용에 의해 그 전체에 본 명세서에 포함된다.

도 1은 세포를 분류하기 위해 모은 뮤라인 림프절 기질 세포를 분해하고 준비하는 과정을 개략적으로 도시한 것이다. 1. 조직에 효소 믹스 (RPMI-1640 + 0.8mg/ml 디스파제, 0.2mg/ml 콜라게나제 P, 0.1mg/ml DNase I)를 첨가하여, 37℃ 수조에서 인큐베이션한다. 2. 10-20분 후 (방법 참조), 1 ml 파이펫을 이용하여 림프절 단편들을 교반한 후, 단편이 침전될 때까지 인큐베이션한다. 3. 해리된 세포가 포함된 상층물은 꺼내고, 원심 분리한 다음, 얼음 위에 보관한다. 4. 단편들 모두 완전히 분해될 때까지 1-3 단계를 반복 실시한다 (60분을 넘지 않음). 5. 상층물 분획들을 모두 모아, 원심분리 및 여과한 다음 카운팅한다. 6. 항-CD45 마이크로비드를 투입하고, 회전 휠 상에서 4℃에서 인큐베이션한다. 7. MACS 또는 AutoMACS를 사용하여, CD45+ 세포를 고갈시키고, 카운팅한다. 8. 농화된 CD45- 기질 세포를 항체로 염색하고; 20 pso에서 100 ㎛ 팁을 사용하여 고순도로 분류한다.
도 2는 림프절 기질 아종들을 분리하기 위한 저-치사성 (low-mortality) 방법에 대한 검증을 도시한 것이다. 도 2A는 저-치사성 효소 분해 방법을 이용하여 준비한 단세포 현탁물에 대한 검증 결과를 나타낸 것이다. n=6, 평균+표준 편차. 도 2B는 개개 마우스의 피부-배액성 림프절 또는 장간막 림프절로부터 금방 분리한 림프절 기질 아종들에 대한 전형적인 유세포 측정 프로파일을 도시한 것이다. 도 2C는 뮤라인 림프절의 동결단편에서 인 시추로 확인한 림프절 기질 아종을 도시한 것이다. 상단 패널: T 세포 구역 FRC (포도플라닌 + CD31^-) 및 고 내피 소정맥 (high endothelial venule) (포도플라닌^- CD31⁺ + 입방형 형태). HEV의 2가지 예를 화살표로 표시한다. 중앙 패널은 수질부 LEC (포도플라닌⁺CD31⁺)와 수질부의 대 혈관 (포도플라닌^-CD31⁺)을 보여준다. 하단 패널: 피막 구심성 (Capsular afferent) LEC (Lyve1⁺ MadCAM⁺), MRC (피막하, Lyve1^- MadCAM⁺) 및 FDC (여포, Lyve1^-, MadCAM⁺). 동일 위치 오버레이는 확대도에 백색으로 표시된다. 오리지날 배율: 200x. 도 2D는 유세포 측정 분석을 위한 분해 및 인간 림프절 (비-장간막 오리진) 염색을 도시한 것이다. 점도표는 독립적인 4번의 실험 n=4의 결과이다.
도 3은 림프절이 기질 조성에 부위-특이적인 변형을 나타냄을 도시한 것이다. 개개 C57Bl/6 마우스의 림프절을 분해하여, 유세포 측정을 위해 염색하였다. 도 3A는 림프절 세포 충실성 (cellularity)을 도시한 것이다. 도 3B는 CD45 음성 림프절 기질 아종의 비율을 도시한 것이다. 도 3C는 림프절 기질 아종의 수를 도시한 것이다. 도 3D는 총 FRC 또는 LEC에 대한 비율로서 MadCAM⁺ 세포를 도시한 것이다. 도 3E는 MadCAM⁺ FRC 또는 LEC의 총 수를 도시한 것이다. 도 3F는 동일 연령의 Rag^-/- 또는 WT (B6) 마우스에서 분리한 피부-배액성 림프절의 세포 충실성을 도시한 것이다. 도 3G는 동일 연령의 Rag^-/- 또는 WT 마우스 유래 림프절 기질의 수를 도시한 것이다. 도 3G는 동일 연령의 Rag^-/- 또는 WT 마우스 유래 림프절 기질의 수를 도시한 것이다. 도 3H는 동일 연령의 Rag^-/- 또는 WT 마우스의 SLN에서 MadCAM+ FRCs (MRC) 또는 LEC의 비율을, 도 3I는 이의 수를 도시한 것이다. 도표들은 마우스 n= 5에 대한 것이다. 도 3J는 MRC 또는 MadCAM+ LEC에서 MadCAM 염색에 대한 평균 형광 세기 (MFI)를 나타낸 것이다. WT = 야생형. *P<0.05; **P<0.01 만-휘트니 U 검정. 2-3번의 독립적인 실험에서 마우스 n=5-10.
도 4는 림프절 기질 세포의 농화와 분류 결과를 도시한 것이다. 도 4A에서, C57Bl/6 마우스 6-10마리로부터 유래된 피부-배액성 림프절을 효소 분해한 후, autoMACS를 이용하여 CD45^- 기질 세포를 농화시켰다. 컬럼에 투입한 수 (투입)와, 회수된 (산출) CD45^- 기질 세포의 수를 도표로 작성하였다. 데이타는 독립적인 실험 n=5를 보여준다. 도 4B에서, 기질의 autoMACS 농화를 통해 기질 세포 수율 %를 계산하였다. 도 4C는 기질의 autoMACS 농화 전과 후의 기질 세포의 유세포 측정 프로파일을 도시한 것이다. 도 4는 분류 전략과 림프절 기질 세포의 주요 아종들에 대한 분류 이후의 순도를 도시한 것이다. 점 도표는 CD45^-프로피듐 아이오다이드^- 기질 상에서 게이팅한 것이다.
도 5는 피부-배액성 림프절 유래 뮤라인 FRC에서의 사이토카인의 부위 특이적인 전사의 상향 조절을 도시한 것이다. 도 5A는 피부-배액성 림프절 (SLN) 또는 장간막 림프절 (MLN)로부터 분류된 FRC들을 비교한 마이크로어레이 분석 결과를 도시한 것이다. 점 도표는 선별 프로브 15,486 종을 이용한 SLN 대 MLN의 P-값 대 배수-변화 결과를 도시한 것이다. SLN에서 상향 조절된 프로브들은 붉은 색으로 표시하고, MLN에서 상향 조절된 프로브들은 청색으로 표시한다 (P<0.05 및 배수 변화 >2; t-검정). 독립적인 동일 실험 n=4-5. 도 5B는 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 코딩하는 SLN에서 농화된 유전자들을 도시한 것이다 (KEGG 경로 mmu04060; P<0.015; 피셔의 변형된 정확성 검정 (modified Fisher's exact test) + 벤자미니 보정 (Benjamini correction)). MLN 대비 SLN에서의 평균 발현의 배수-증가를 나타낸다.
도 6은 뮤라인 FRC의 3차원 (3D) 배양이 생체내 기능을 모방한다는 것을 보여준다. 도 6A에서, 림프절을 분해하고, 단일 세포 현탁물을 5일간 배양물에 투입한 다음, 트립신을 처리하고, 유세포 측정 프로파일링을 위해 염색하였다. 기질 세포는 CD45 (좌측 패널)를 이용하여 동정한 다음 CD31과 포도플라닌 (우측 패널, CD45^-에서 게이팅됨)으로 염색하였다. 특히, CD45는 조혈 세포에 대한 마커이므로, 기질 세포 상에는 존재하지 않는다. 도 6B에서, 배양한 기질 세포를 FDC-M1 또는 해당 이소형 대조군으로 염색하였다. 도 6C는 고 트립신 또는 저 트립신 프로토콜로 회수한 배양한 기질 세포에 대한 CD31 염색 결과를 도시한 것이다. 점 도표는 독립적인 3번의 실험, n=3을 표시한다. 도 6D에서, 배양한 기질 세포를 회수한 다음, autoMACS로 정제하였다. FRC, LEC 또는 FRC와 LEC의 혼합물을 2D (플라스틱 조직 배양 플레이트) 또는 3D (마트리겔 및 콜라겐 겔)로 접종하여, 다시 3일간 배양한 후 영상 촬영하였다. 오리지날 배율은 10x이다. 사진들은 2번의 독립적인 실험, n=2를 도시한다. 도 6E에서, F-액틴과 DAPI를 이용하여 정제한 FRC를 2D 또는 3D에서 염색하여, 네트워크를 가시화하였다. 사진은 3번의 독립 실험들, n=3을 보여준다. (F) 정제된 FRC를 96웰 플레이트에 3D 배양물 내에 PP2와 함께 또는 PP2 없이 접종하였다. 24-36시간 후, 겔 수축을 정량하였다. 사진은 3번의 독립 실험들, n=3을 보여준다. 막대 그래프는 평균 + 표준 편차를 나타낸 것이다, P<0.05, t-test. 도 6G에서, 정제된 FRC를 정제된 수지상 세포 (DC) 또는 B 세포와 함께 3D 배양으로 접종한 다음, 이후 90초 마다 연속하여 영상을 촬영하였다. 상위 패널은 오리지날 배율, 20 x에서 포착한 사진이다. 하위 패널은 사진 촬영한 기질 세포와 관련 이동성 백혈구의 카툰을 도시한 것이다. 도 6H에서, 림프절을 분해하고, 단세포 현탁물을 배양물에 5일간 투입한 다음, 트립신을 처리하고, 유세포 측정 프로파일 분석을 위해 염색하였다.
도 7은 인감 림프 조직-유래 억제자 세포가 활성화된 동종 비장세포의 증식을 억제함을 도시한 것이다. 분획화하지 않은 LSSC를 막관련 공여체로부터 유래된 신선하게 분리한 인간 비장세포와 함께 배양하였다. 비장 세포는 세포가 분열하였을 때 희석되는 형광 염료인 CFSE로 표지하였다. 비장 개체군 내 T 세포는 PHA와 IL-2를 이용하여 활성화하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한 것이다. 비 (ratio)는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다.
도 8은 인간 LSSC가 활성화된 이종 T 세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이다. 미분획화된 LSSC를 신선하게 분리한 마우스 비장세포와 함께 배양하였다. 비장 세포는, 세포 분열 시 희석되는 CFSE로 표시하였다. 그런 후, T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다.
도 9는 LSSC가 신규 기전을 통해 T 세포 증식을 억제함을 보여주는 것이다. 도 9A에서, 미분획화한 인간 LSSC를 야생형 또는 IFNγ-/- 마우스로부터 신선하게 분리한 비장 세포와 함께 배양하였다. 비장 세포는 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. 그런 후, T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다. 도 9B에서, PDPN⁺, PDPN^-, 및 미분획화한 LSSC를 무관련 공여체로부터 신선하게 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포는 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. 그런 후, T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한다. 상층물을 수집하여, 산화질소의 변환 산물인 아질산염의 존재를 테스트하였다.
도 10은 인간 림프 조직-유래 억제자 세포의 2종의 주요 서브개체군들이, 각각, 활성화된 동종 T 세포의 증식을 억제함을 보여주는 것이다. 도 10A에서, LSSC의 2종의 서브개체군들을 당단백질-36 (PDPN이라고도 함)의 발현 또는 결핍을 토대로 정제하였다. 서브개체군들 2종 모두 비-내피성 (CD31 음성) 및 비-조혈성 (CD45 음성)이었다. 도 10B에서, PDPN⁺ LSSC PDPN^- LSSC 또는 미분획화된 LSSC는 (LSSC : T 세포) 1:5 비율로 무관련 공여체로부터 신선하게 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다.
도 11은 인간 LSSC가 활성화되기 전의 동종 T 세포의 분열을 정지시킴을 보여주는 것이다. PDPN+ LSSC, PDPN- LSSC, 또는 미분획화된 LSSC는 무관련 공여체로부터 신선하게 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화한 후, 2일간 분열되게 둔 다음, 일부 T 세포를 LSSC 상에 접종하여 재자극하거나, 또는 재접종하여 LSSC 없이 재자극하거나, 또는 재자극없이 재접종하였다. 히스토그램은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한다. 비는 T 세포에 대한 LSSC의 비율을 표시한다.
도 12는 인간 LSSC가 중증 이식-편대-숙주 질환에 걸린 마우스에서 초기 사망율을 현저하게 감소시킴을 보여주는 것이다. 수여 마우스에 동종 골수 이식을 수행하였다 (분할-조사량 치사 조사 후, 전체 골수의 i.v. 주사). 중증 GVHD는, 동종반응성 T 세포를 포함하는 공여체 유래 비장 세포를 공동-주입함으로써 이식 시에 유도하였다. 인간 LSSC 1 x 10⁶개로 GVHD를 유도한 후 일정 시점에 복막내로 주입하였으며, 대조군 마우스에는 염수 (비히클)를 제공하였다. 생존성을 모니터링하였다.
도 13은 LSSC의 전사 특징을 도시한 것이다. 인간 LSSC의 전사 특징들을 표면 마커에 대한 유세포 측정과 분비된 인자에 대한 RT-PCR을 이용하여 입수하였으며 (도 13A), Affymetrix HuGene ST1.0 유전자 어레이를 이용하여 mRNA 트랜스크립톰 (transcriptome)을 입수하였다 (도 13B).
도 14는 인간 LSSC의 형태 특징을 도시한 것이다. 소 태아 혈청이 첨가된 α-MEM에서 배양한 LSSC 배양물에서는 섬유모세포-유사 형태가 관찰되었다. 이는 종종 긴 돌기 (long process), 라멜로포디아 (lamellopodia), 사상위족 (filopodia), 러플형 리딩 에지 (ruffled leading edge) 및 국소 부착 (focal adhesion)을 나타내었다. 오리지날 배율: 100x.
도 15는 생체외 증폭시킨 마우스 림프절의 기질이 급성 패혈증 쇼크의 치사성을 감소시킴을 보여주는 것이다.
도 16은 뮤라인 FRC가 치료 시점에 투여하였을 때, 2가지 타입의 마우스 모델에서 패혈증을 예방함을 보여주는 것이다. 도 16A에서, 3-6주령의 어린 C57Bl6/J 마우스에, 박테리아 세포벽의 일부를 구성하며 강력한 전신 면역 반응을 일으키는 다당류인 LPS를 LD100의 투여량으로 처리하였다. 이들 모델에 활성형 감염은 없기 때문에, 이들 모델은 "무균성 패혈증 (sterile sepsis)"이라고 한다. 마우스에 LPS를 투여한 지 4시간 후, 염수 중의 FRC나 대조군으로서 염수를 처리하였다. 그래프는 경시적인 생존율%을 도시한다. 도 16B에서, 무균성 패혈증은 도 16A에 상세히 기술된 바와 같이 매우 노화된 마우스 (18-24월령)에 유도한 다음, 4시간 후 FRC 또는 염수를 처리하였다. 생존성을 모니터링하였다. 도 16C에서, 어린 마우스에, 장을 바늘로 2번 뚫어 복강으로 변 물질이 유출되게 천공한 다음, 24시간 이내에 혈액 패혈증으로 진행되는 중증 감염을 확립하는, 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 패혈증을 시술하였다. 이 모델은 맹장 파열 (burst appendix), 총상 또는 그외 (장) 외상을 모방한다. CLP한 지 4시간 후에 자가 FRC를 투여하였다. 도 16D에서, 어린 마우스에 CLP 패혈증을 유도하고, 항생제를 처리하였다. CLP 후 4시간 후에 지정한 바와 같이 염수, 동종 FRC 또는 동종 MSC를 마우스에 투여하였다. MSC (장간막 기질 세포)를 세포성-음성 대조군으로 사용하였다. MSC는 억제성 기질 세포 타입으로, 몇몇 저자들은, 동종 요법으로 치료 시점에 투여하였을 때 (패혈성 공격 후 >60분), 패혈증에 대한 이들의 효과가 최소이거나 없음을 입증한 바 있다 (Nemeth et al. 2010; Mei et al. 2010). 본 발명의 결과도 마찬가지로 MSC 투여가 전체적으로 생존성에 유익하지 않은 것으로 나타났지만, 동종 FRC는 생존성에 유의한 이점을 제공하였다. 도 16E에서, 도 16D의 마우스를 대상으로 CLP 후 16시간 후에 분석하였다. 혈액 혈장내 주요 사이토카인의 농도를 측정하여, 염수 또는 동종 FRC를 제공받은 마우스와 무처리 (비-패혈성) 마우스와 비교하였다. 점선은 신뢰성 있는 검출의 하한과 상한을 나타낸다.
도 17은 뮤라인 FRC가 결장염으로 인한 사망을 예방함을 보여주는 것이다. 결장염은, 정제한 네이티브 T 세포를 면역결핍 마우스에 주입하여 유도하였다. 마우스에서는 (인간 질환에서 발생하는) 미확인 항원에 대해 T 세포-매개 염증이 발병하였으며, 이로 인해 현저한 체중 감소, 결장의 비대화 및 사망이 나타났다. 이는 인간 만성 결장염 또는 크론 질환의 모델이다. 마우스에서 질병의 신호가 나타나고 체중이 현저하게 감소되기 시작한 후 2주 후 (치료 시점)에 동종 FRC를 투여하였다. 염수-처리한 대조군과 비교하여, FRC는 2주부터 6주까지 매주 2회로 주입하였다. 생존성을 모니터링하였다.
도 18은 인간 LSSC가 용해성 사이토카인 수용체를 분비함을 보여주는 것이다. 인간 LSSC는 BSA가 첨가된 DMEM에서 배양하였으며, 외인성 인자의 자극 또는 첨가를 수행하지 않았다. 용해성 사이토카인 수용체 단백질을 접종한지 23시간 후에 루미넥스사의 MAGPIX 시스템을 제조사의 설명서에 따라 이용하여 배양 배지에서 검출하였다. 용해성 사이토카인 수용체는 유리형 사이토카인에 결합하여, 전-염증성 기능을 생체내에서 방지할 수 있다.
도 19는 림프절 및 편도선으로부터 분리된 LSSC가 표현형 측면에서 비슷하다는 것을 보여준다. 림프절 또는 편도선으로부터 유래된 인간 LSSC를 식별인자의 표면 발현에 대해 유세포 측정으로 평가하였다. 세포들 모두 CD45 음성 및 CD31 음성이다.
도 20은, 림프절 (도 20A 및 도 20B) 및 편도선 (도 20C 및 도 20D)으로부터 분리된 LSSC가 용해성 인자를 통한 T 세포 억제 수준이 비슷하다는 것을 보여준다. 인간 혈액 유래의 동종 T 세포를 세포 분열 시 마다 희석되는 CFSE로 표지하였다. 그런 후, 림프절 또는 편도선으로부터 분리한 hLSSC의 존재 또는 부재 하에 T 세포를 PHA 및 hIL-2로 활성화하였다. hLSSC를 웰 안에 두거나, 또는 용해성 인자는 통과하지만 세포는 통과하지 않는 0.4 ㎛ 트랜스웰 막으로 T 세포와 물리적으로 분리시켰다. T 세포 : hLSSC의 여러가지 비율에서 트랜스웰을 사용한 경우와 사용하지 않은 경우에 인큐베이션하였을 때, 1회, 2회, 3회 분열하거나 또는 전혀 분열하지 않은 T 세포의 %를 도시한다. 가용성 인자로 인한 억제율 %은, 트랜스웰을 사용하여 분열시킨 T 세포 / 트랜스웰 없이 분열시킨 T 세포 x 100으로 계산하였다.

본 발명은, 일 측면에서, 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)에 관한 것이다. 본 발명은, 상업적으로 이용가능한 방식으로 LSSC를 생체외에서 분리 및 증폭시키는 방법, LSSC를 포함하는 새로운 조성물, 및 LSSC의 용도, 특히, 자가, 동종 및 이종 면역 반응을 억제하기 위한 치료학적 용도를 기술한다.

본 발명자들은, 림프절 유래 기질 세포가 면역계의 활성을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 아울러, 림프 조직-유래 기질 세포는 면역 세포를 유인하는데, 이는 다른 면역억제성 기질 세포 개체군의 공지된 특징이 아니다. T 세포, B 세포, NK 세포 등의 면역 세포를 유인하는 림프 조직-유래 기질 세포의 유인력은, 이의 면역억제 기능과 조합되어, 개체에서 면역 반응을 억제하기 위한 매우 효과적인 치료 도구가 되게 한다. LSSC를 사용하여, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 수지상 세포 및 대식 세포의 활성을, 단독으로, 또는 다른 면역억제성 약물과 협력하여, 억제할 수 있다.

림프절은 체내 림프 교차부에 위치한 중요한 이차적인 림프 장기로서, 항원 제시 세포와 네이티브 T 및 B 세포 간의 효율적인 상호작용을 가능하게 하며, 면역 반응의 효율적인 개시를 촉진한다 (Warnock et al., 1998, Mebius, 2003, Katakai et al., 2004a, Katakai et al., 2004b, Sixt et al., 2005, Bajenoff et al., 2006, Junt et al., 2008). 림프절의 기질 세포도 네이티브 T 세포를 유지하는데 결정적이고 아마도 틀림없이 과소인정된 것으로 보이는 역할을 수행한다 (Link et al., 2007).

림프절은 분리할 수 있으며, 수득한 세포는 배양물로 배양할 수 있다. "림프 조직-유래 억제성 기질 세포"는 조직 배양 디쉬에 붙어 일정 기간 동안 유지시킬 수 있는 림프 조직에 존재하는 모든 세포 타입들을 지칭한다. 배양 세포는 혼성 개체군 (heterogeneous population)일 수 있으며, 섬유모세포의 세망 세포 (FRC), 여포 수지상 세포 (FDC), 림프 내피 세포 (LEC), 혈관 내피 세포 (BEC) 및 변연부 세망 세포 (MRC)와 같이, 림프절 안에 존재하는 대부분의 세포들로 구성될 수 있다. 또한, 배양 세포는 FRC, FDC, LEC, BEC 및/또는 MRC의 동종 개체군 또는 임의의 선택 조합일 수 있다. 일부 구현예들에서, LSSC를 본원에 기술된 방법을 이용하여 분리하여, 생체외에서 증폭시킨다. LSSC는 피부 또는 장간막 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 및/또는 페이어판으로부터 유래할 수 있다. LSSC는 조혈 LSSC가 없거나 고갈된다. 일부 구현예들에서, LSSC는 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 말, 돼지, 소 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 유래된다.

구분되는 기질 아종 세포들은 림프절의 구조를 구축하며, 각 마이크로니치 (microniche)를 유지한다. T 세포 영역의 섬유모세포 세망 세포 (FRC)는 케모카인 CCL19 및 CCL21을 발현하여, T 세포와 수지상 세포 (DC)를 유인하며, 이들 세포가 타고 오는 콜라겐과 수지상 세포 (DC)로 구성된 복잡한 메쉬워크를 축적한다 (Ansel et al., 2000, Luther et al., 2000, Katakai et al., 2004b, Bajenoff et al., 2006, Link et al., 2007, Woolf et al., 2007). FRC와 유사하지만 B 세포 유인용으로 특수화된 여포 수지상 세포 (FDC)는, B 세포 유인과 항원 제시용으로 특수화된 희귀한 아종이다. FDC는 B 세포 여포 안에서만 발견되며, CXCL13 분비를 통해 만든다 (Cyster et al., 2000). 림프절 피막은 기본적으로 림프 내피 세포 (LEC)로부터 구축된 확대된 림프관으로서, 세포간질액을 림프절로 운반하고 이를 실질조직으로 옮긴다. 이는 부피질과 피질을 통과하여, 궁극적으로 림프를 추가로 상류로 운반하는 수질내 수출 림프 (efferent lymphatics)에 도달한다 (Mebius, 2003, Willard-Mack, 2006). 혈액 내피 세포 (BEC)는, 혈류로부터 네이티브 T 세포를 유인하도록 특수화된 고 내피 소맥 (high endothelial venule)를 비롯한, 피질 혈관과 모세관을 구축한다 (Mebius, 2003, Willard-Mack, 2006).

수종의 다른 기질 아종들도 문헌을 통해 보고되고 있지만 충분히 연구되진 않았으며, 이들의 계통과 주 기능들은 파악되지 않았다 (Fletcher et al., 2011). 변역부 세망 세포 (MRCs)는 피막하 만곡부의 피질 면에서 생장하는 CXCL13-생산 기질 아종이다 (Katakai et al., 2008). 이 세포는 포도플라닌 발현을 비롯하여 FRC와 유사성을 보임에도 불구하고, 그 오리진은 확인되지 않았다 (Katakai et al., 2008). 비장에서, 유사한 기질 아종은 미성숙 B 세포를 여포로 이동시키는데 중요하다 (Ansel et al., 2000). MRC는 림프절 조직화를 담당하는 (Coles et al., 2010) 림프 조직 오가나이저 (Lto) 아종의 출생 후 등가체이라는 가정이 있다 (Katakai et al., 2008). 실제, 출생 후 포도플라닌 + 비장 기질이 조혈 림프 조직 유발자 세포와의 상호작용을 통해 재생될 수 있다는 것은 충분히 입증된 바 있다 (Scandella et al., 2008).

LSSC는 본 발명에 따라 면역 반응을 억제하는데 사용된다. 즉, 본 발명의 측면들은 이러한 치료가 필요한 개체에게 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 개체에서 면역 반응을 억제하는데 유효한 양으로 투여함으로써, 면역 반응을 억제하는 방법을 포함한다.

본원에서, "분리된"은 기질 세포 개체군을 다른 비-기질 세포 개체군으로부터 분리하는 것을 의미한다. 분리는 증식 조건, 자기 비드 사용 등의 정제 기법, 세포 분류 또는 그외 유사 기법과 같이 세포를 분리하는 임의의 공정에 의해 수행할 수 있다. 일부 구현예들에서, LSSC는 본원에 기술된 방법을 이용하여 분리한다.

본원에서, "억제하는"은, 예컨대, T 세포 또는 B 세포의 활성화 저하 및 체액 매개 반응과 세포 매개 반응의 감소 등의, 면역 반응의 명백한 징후를 수준, 중증도, 범위 또는 기간 측면에서 낮추는 것을 의미한다. "억제"는, 예를 들어, LSSC의 존재 또는 부재 하에 T 또는 B 세포 분열 속도 또는 존재를 조사하거나, LSSC의 존재 또는 부재 하에 면역 세포에 의한 사이토카인의 분비를 조사하거나, LSSC의 존재 또는 부재 하에 항체 생산을 측정하거나, 또는 LSSC의 존재 또는 부재 시 CTL 기능을 측정함으로써, 측정할 수 있다. 마찬가지로, 면역 반응의 억제는 염증 감소 또는 치료 중인 질환과 관련된 기타 증상의 감소를 측정함으로써와 같이 증상을 통해 측정할 수 있다. 면역 반응의 "억제"는 이러한 면역 반응의 임의 징후의 완전한 부정 또는 예방이 필수라기 보다는 임상적 또는 다른 실무적으로 중요한 수준 또는 중증도, 또는 범위 또는 지속 기간의 감소를 의미한다. 일 구현예에서, 억제는 LSSC의 존재 또는 부재시 사전-활성화된 동종 T 세포의 세포 분열 속도를 조사함으로써 측정한다. 일 구현예에서, 억제는 LSSC의 존재 또는 부재시 이식 편대 숙주 질환에 걸린 마우스에서 사망율을 조사함으로써 측정한다. 일 구현예에서, 억제는 마우스에서 급성 패혈증 쇼크로 인한 사망율을 조사함으로써 측정한다.

일부 구현예들에서, 이러한 치료가 필요한 개체는 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 가진다.

용어 '자가면역 질환 또는 염증성 질환'은, 환자의 면역 반응이 환자 자신의 구성 성분을 겨냥하여, 부적절한, 때로는 상당히 쇠약한 상태로 만드는, 질환 상태 및 병태를 의미한다. 본원에서, '자가면역 질환 또는 염증성 질환'은 자가면역 병태, 증후군 등을 추가로 포함하는 것으로 의도된다. 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예로는, 비제한적으로, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환, 이식 편대 숙주 질환 및 패혈증을 포함한다.

일부 구현예들에서, 치료가 필요한 개체는 전술한 한가지 이상의 병태를 앓고 있는 것으로 동정된 개체이며, 즉 개체는 전술한 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 (예, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여) 의사에 의해 진단받은 개체이다. 일부 구현예들에서, 치료가 필요한 개체는, 전술한 질환 또는 병태를 나타내는 한가지 이상의 증상 (예, 극심한 피로 또는 연골 통증)을 표시하는 개체와 같이, 전술한 질환 또는 병태를 앓고 있거나 발병할 것으로 의심되는 개체이다. 일부 구현예들에서, 치료가 필요한 개체는 자가면역 질환 또는 염증성 질환이 발병할 한가지 이상의 위험 인자를 가진 개체이다. 위험 인자로는, 비제한적으로, 성별, 연령, 유전적 소인, 자가면역 질환 또는 만성 염증성 질환의 발병 전례 및 생활방식을 포함한다. 용어 "치료가 필요한 개체"는 전술한 질환 또는 병태를 앓은 바 있으며 증상이 완화된 사람도 추가로 포함한다.

일부 구현예들에서, 치료가 필요한 개체는 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓고 있거나 또는 그런 것으로 의심되는 개체이다. 개체는, 예를 들어, 자가항체가 비정상적인 역가를 나타낼 수 있다.

개체는 동물, 전형적으로 포유류이다. 일 측면에서, 개체는 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소 또는 설치류이다. 주요 구현예들에서, 개체는 인간이다.

LSSC는 유효량으로 투여한다. 유효량은 의학적으로 바람직한 결과를 제공하는데 충분한 양이며, 통상적인 방법을 이용하여 당해 기술 분야의 당업자가 결정할 수 있다. 일부 구현예들에서, 유효량은 치료 중인 병태에 어떠한 개선을 발생시키는 양이다. 일부 구현예들에서, 유효량은 치료 중인 질환 또는 병태의 타입과 수준 및/또는 하나 이상의 추가적인 치료 제제에 의존할 수 있다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자는 예를 들어 시험관내 및/또는 생체내 검사 및/또는 기타 화합물 투여량에 대한 지식에 근거하여 사용하는 적정 용량과 치료 제제의 범위를 결정할 수 있다.

개체에게 투여하는 경우, 치료 제제의 유효량은 물론 치료 중인 개별 질환; 질환의 중증도; 연령, 신체 상태, 키 및 체중 등의 개개 환자의 파라미터, 병용 치료, 치료 빈도 및 투여 방식에 의존할 것이다. 이들 인자들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 통상적인 실험으로 알 수 있다. 일부 구현예들에서, 최고 용량으로 사용되며, 즉, 적합한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량으로 사용된다.

자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 경우, 유효량은 질환의 진행을 서행시키거나, 질환의 진행을 정지시키거나, 또는 질환의 진행을 되돌시키는 양이다. 유효량은 자가면역 질환 또는 염증성 질환과 관련한 한가지 이상의 증상을 서행, 저하, 저해, 완화 또는 되돌리는데 필수적인 양을 포함한다. 일부 구현예들에서, 이들 용어는 자가면역 질환 또는 염증성 질환과 관련된 통증, 피로 및/또는 열 저하 또는 하나 이상의 관절의 종창 감소를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 이들 용어는 자가면역 질환 또는 염증성 질환과 관련된 순환성 자가항체의 수준 저하를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 이들 용어는 인간의 PASI 스코어 감소를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 이들 용어는 인간의 글로벌 평가 스코어 (global assessment score)의 개선을 지칭한다.

일부 구현예들에서, (투여 모드 코스와 전술한 인자들에 따라) 수 일간 1회 이상의 용량 투여로, 개체의 kg에 대해 LSSC를 십만개 이상으로 개체에게 투여한다. 일부 구현예들에서, 개체의 kg 당 LSSC 백만개 이상으로 개체에게 투여한다. 일부 구현예들에서, 개체의 kg 당 LSSC 천만개 이상으로 개체에게 투여한다. 치료 제제의 실제 투여량 수준은 개별 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 바람직한 치료학적 반응을 달성하는데 유효한 양을 획득하도록 바꿀 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 개별 화합물의 활성, 투여 경로, 치료 중인 조직 및 기존의 환자가 치료받은 병력에 의존한다. 그러나, 당해 기술 분야의 지식내에서는, 원하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 것 보다는 적은 수준에서 화합물의 투여를 시작하여, 원하는 효과를 달성할 때까지 점진적으로 투여량을 높이는 것을 포함한다.

일부 구현예들에서, 개체에게 투여되는 LSSC는 생체외에서 증폭시킨 세포이다. LSSC는 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 생체외에서 증폭시킨다. 분리된 LSSC는 배양 배지, 예를 들어, 성장 인자, 혈청, 혈소판 세포용혈물 및 항생제 중 한가지 이상이 첨가된 기본 세포 배양 배지를 포함하는 배양 배지에서 배양할 수 있다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는, 예를 들어, 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 최소 필수 배지 (MEM) α 배지에서 배양한다. 일부 구현예들에서, 개체에게 투여되는 LSSC는 실질적으로 비-LSSC가 존재하지 않는다. 일부 구현예들에서, LSSC는 개체에 대해 자가, 동종 또는 이종의 것이다.

LSSC를 포함하는 약학 조제물은 모든 적합한 경로를 통해 개체에게 투여한다. 예를 들어, 조성물은 정맥내, 복막내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주입, 또는 병소, 장기, 장기 피막, 지방 또는 림프절 상에 또는 내로의 국소 투여에 의해 개체에게 투여할 수 있다.

일부 구현예들에서, LSSC는 개체에게 이식된 2차원 또는 3차원의 프레임워크 상에 또는 내에 존재한다. 임플란트 또는 매트릭스는 섬유 또는 하이드로겔 기재의 디바이스 등의 폴리머 매트릭스를 포함한다. 임플란트는 생분해성이거나 생분해성이 아닐 수 있다. 섬유성 또는 하이드로겔 임플란트는 상업적으로 구입가능한 물질을 이용하여 제조 또는 구축할 수 있다. LSSC는 세포 현탁물을 임플란트에 적용함으로써, 임플란트 상에 접종한다. 이는, 임플란트를 세포 배양 용기 안에 침지하거나 또는 세포를 임플란트에 주입하거나 그외 직접 적용에 의해 달성할 수 있다. 세포가 접종된 임플란트는 표준 외과적 기법을 이용하여 이식한다. 임플란트는 이식하기 전에 시험관내에서 접종 및 배양하거나, 접종하여 즉시 이식하거나, 또는 이식한 다음 세포를 접종할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 임플란트 상에 또는 내로 접종하여, 약 10시간 내지 2주간 시험관내에서 배양한다.

본 발명의 일부 측면들은 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 분리하는 방법을 포함한다. 본 방법은 효소 믹스와 교반을 조합하여 이용하여 림프 조직 단편들을 분해한 다음 LSSC를 수집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 림프 조직 단편의 분해는 (i) 림프 조직 단편을 효소 믹스와 인큐베이션하는 단계; (ii) 상기 조직을 파이펫을 이용하여 교반한 다음, 인큐베이션하여 큰 단편들을 침전시키는 단계; (iii) 상층물은 꺼내고, 모든 단편들이 분해될 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복 수행하는 단계를 포함하는, 일련의 단계들로 수행한다. 그런 후, 상층 분획들을 모두 모아, 원심분리하여 세포 펠렛을 수득함으로써, LSSC를 수집한다. 일부 구현예들에서, 효소 믹스는 배양 배지, 디스파제, 콜라게나제 및 DNase I을 포함한다. LSSC는 피부 또는 장간막 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 및/또는 페이어판으로부터 유래할 수 있다. 분리된 세포를 이용하여 전술한 바와 같이 면역 반응을 억제시킬 수 있다.

분리된 LSSC는 성장인자, 혈청, 혈소판 세포용혈물 및 항생제 중 하나 이상이 첨가된 기본 세포 배양 배지를 포함하는 배양 배지에서 배양할 수 있다. 일부 구현예들에서, LSSC는 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 최소 필수 배지 (MEM) α 배지에서 배양한다. 일부 구현예에서, 분리된 LSSC는 산소 분압 0.1-21%에서 배양한다. 일부 구현예에서, 분리된 LSSC는 산소 분압 2.5-21%에서 배양한다.

일부 구현예들에서, LSSC는 LSSC에 실질적으로 비-LSSC가 존재하지 않을 때까지 배양한다. 일부 구현예들에서, LSSC는 기질 세포의 수가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 이상 증가할 때까지 배양한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 1-10,000 cells/cm²의 밀도로 배양한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 10-500 cells/cm²의 밀도로 배양한다.

본 발명의 일부 측면에서, 조성물이 제공된다. 이 조성물은 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)를 포함하며, 이때 LSSC는 본원에 기술된 방법으로 분리된 것이다. 예를 들어, LSSC는 효소 믹스와 교반을 조합하여 이용하여 림프구 조직 단편을 분해한 다음 LSSC를 수집함으로써 분리한다.

본 발명의 일부 측면에서, 약학 조제물이 제공된다. 이 약학 조성물은 분리된 림프 조직-유래 억제성 기질 세포 (LSSC)의 조성물을 포함한다. LSSC는 화학적, 기계적 및 전기적 세포 분리 공정 중 한가지 공정을 이용하여 림프 조직 단편을 처리한 다음, LSSC를 수집함으로써, 분리할 수 있다. 예를 들어, 세포는 효소적 또는 화학적 분해, 물리적 파괴 및 교반, 및/또는 전기장에 의해 분리할 수 있다.

분리된 LSSC는 세포 배양을 통해 증폭시킬 수 있다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 생체외 증폭시킨 세포이다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 LSSC에 실질적으로 비-LSSC가 없어질 때까지 수집한 세포를 배양함으로써, 증폭시킨다. 세포는 성장인자, 혈청, 혈소판 세포용혈물 및 항생제 중 하나 이상이 첨가된 기본 세포 배양 배지를 포함하는 배양 배지에서 배양할 수 있다.

일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 혈소판 유래 성장 인자 수용체, α 폴리펩타이드 (PDGFRα 또는 CD140a) 및 프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 2 (PD-L2 또는 CD273)를 공동-발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 CD140a와 림포톡신 베타 수용체 (LTBR)를 공동-발현한다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 CD140a, PD-L2 및 LTBR을 공동-발현한다. 또한, 분리된 LSSC는 프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 1 (PD-L1), Thy-1 세포 표면 항원 (Thy-1), 점액성 혈관 어드레신 세포 (mucosal vascular addressin cell) 유착 분자 1 (MADCAM-1), 미오신 중쇄 11 (MYH11), 인터루킨 7 수용체 (IL-7R) 또는 인테그린 α 7 (ITGA7)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 림프 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현예들에서, 분리된 LSSC는 인터루킨 6 (IL-6), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 19 (CCL19), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 21 (CCL21) 또는 혈관 내피 성장인자 (VEGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 발현한다.

LSSC는 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 말, 돼지, 소 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 분리할 수 있으며, T 세포의 증식을 시험관내에서 억제한다.

본 발명의 약학 조제물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나, 이로 희석할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 본원에서, 하나 이상의 상용가능한 충진제, 희석제, 또는 인간이나 개, 고양이 또는 말과 같은 그외 포유류에게 투여하는데 적합한 기타 물질을 의미한다. 용어 "담체"는, 활성 성분을 조합하여 활용을 용이하게 하는, 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 물질을 지칭한다. 담체는, 바람직한 약제학적 효능 또는 안정성을 실질적으로 부여하는 상호작용이 없는 방식으로, 본 발명의 조제물과, 그리고 서로 혼합될 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 제형에 적합한 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.에서 볼 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 추가로 예시되지만, 어떠한 방식으로도 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 참조문헌들 (문헌의 참조문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 계류중인 특허 출원)의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.

실시예

재료 및 방법

마우스

4-6주령의 수컷 C57Bl/6 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였다. ImmGen 분류에 사용된 마우스는 6주령으로 연령을 정확하게 일치시켰다. 수컷 C57BL/6 Rag^-/- 마우스는 Taconic에서 구입하였다. 마우스 모두 이송 후 5일간 휴식 기간을 두었으며, 국립 보건 지침 협회에 준하여 특수 무균 하에 사육하였다. 실험 절차들은 Dana-Farber Cancer Institute에서 연구 동물 관리 소위원회의 승인을 받아 행하였다.

인간 림프절

인간 림프절은 NDRI (National dieased Research Interchange) 리소스 센터 (Philadelphia, USA)를 통해 공여 사체로부터 획득하였다. 무손상 림프절은 얼음 위 DMEM 중에서 이송시켰으며, 유세포 측정을 위해 가공하거나 24시간의 세포 배양을 위해 처리하였다.

항체

유세포 측정을 위해, 마우스 림프절 기질의 세포 분류 및 냉동단편의 염색에 다음과 같은 항체를 사용하였다: 항-CD45 (클론 40-F11, BD Biosciences), 항-포도플라닌 (클론 8.1.1, Developmental Studies hybridoma Bank), 항-CD31 (클론 MEC13.3, Biolegend), 항-Lyve 1 (클론 10.1.1, Dr. Andrew Farr로부터 선물받음) 및 항-MadCAM (클론 MECA-367, eBioscience). 죽은 세포와 적혈구를 제외시키는 것이 적절한 경우, 프로피듐 아이오다이드과 클론 TER119 (Biolegend)를 사용하였다. 인간 세포 염색시에는 하기 항체를 사용하고: 항-CD45 (클론 HI30, Biolegend), 항-CD31 (클론 WM59, BD Biosciences) 및 항-포도플라닌 (클론 NZ-1, AngioBio Co), 고도의 교차-흡착된 항-랫 IgG (H+L) Alexa-488 (Invitrogen)을 이용하여 검출하였다.

개개 마우스 유래 림프절의 효소적 분해

유세포 측정 분석 또는 세포 배양을 위해, 개개 마우스 유래의 림프절을 절단하고, 미세 겸자를 사용하여 한번 구멍을 뚫은 다음 RPMI-1640 50 ml 중에서 얼음 위에 두었다. 피부-배액성 림프절의 사용이 명시된 경우, 겨드랑이, 상완 및 서혜부 림프절을 적출하였다. 림프절 모두 절개한 후, RPMI-1640을 제거하고, 0.8mg/ml 디스파제 및 0.2mg/ml 콜라게나제 P (둘다 Roche에서 구입함)가 포함된 RPMI와 0.1mg/ml DNase I (Invitrogen)로 구성된 금방 제조한 효소 믹스 2ml로 교체하였다. 튜브를 수조 안 37℃에서 인큐베이션하고, 내용물이 잘 혼합되게 하기 위해 5분 간격으로 천천히 뒤집었다. 20분 후, 림프절을 1ml 파이펫을 이용하여 조심스럽게 흡입하고 방출하여, 피막을 파괴하고, 대부분의 백혈구를 방출시켰다. 혼합물을 수조에 다시 넣고, 큰 단편들은 30초간 침전되게 두었으며, 그 후 효소 믹스를 제거하고, 빙랭한 FACS 완충제 (2% FCS, 5mM EDTA / PBS) 10ml을 첨가한 다음 원심 분리하였다 (300g, 4분, 4℃). 신선한 효소 믹스 2ml을 분해 튜브에 넣고, 1ml 파이펫으로 내용물을 조심스럽게 혼합한 다음, 1ml 파이펫을 이용하여 정기적으로 서서히 혼합하면서 인큐베이션하였다. 10분 후, 세포를 1ml 파이펫을 이용하여 30초간 왕성하게 혼합하였다. 단편들을 다시 침전시키고, 상층물은 옮기고, 미리 스핀 다운한 세포 펠렛에 넣은 다음, 분해 튜브에 신선한 효소 믹스 2ml을 첨가하였다. 여기에서, 분해 믹스는, 빛에 비추었을 때, 모든 잔류 림프절 단편들이 완전히 분해되어 맑게 될 때까지, 1ml 파이펫을 이용하여 5분마다 왕성하게 혼합하였다. 1차 인큐베이션 시기부터 분해를 완료할 때까지의 공정은 통상 50분이 걸리며, 60분을 결코 초과하지 않는다. 상층물은 매번 회수한 후 원심 분리 (300g, 4분, 4℃)한 다음, 최종적으로 개개 마우스의 회수한 림프절의 전체 세포 내용물들을 각 수집 튜브에 담는다. 세포를 80㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과하고, 헤모사이토미터로 계수한 다음, 트리판 블루를 이용하여 생존성을 평가하였다. 생존성은 95%를 초과하였다. 그런 후, 염색 당 세포 5 x 10⁶개를 희석 항체 50 ㎕와 20분간 4℃에서 빙랭한 FACS 완충제 (2% FCS, 5mM EDTA / PBS) 중에서 인큐베이션한 다음, FACSCalibur 또는 FACSAria IIu (BD Biosciences)으로 포착하였다.

세포 분류 및 대규모 분리를 위한, 마우스 풀 (pool) 림프절의 효소적 분해 및 기질 농화

복수의 마우스 풀의 분해는, 아래와 같은 변형을 가미하여, 2.1에 기술된 바와 같이 전반적으로 수행하였다 (도 1에 도식적으로 기술됨): 마우스 4-10마리에서 수득한 림프절을 하나의 튜브에 모은 다음, 분해 단계 당 효소 믹스 5ml을 이용하여 분해시켰다. 림프절을 완전히 분해시키고, 세포를 원심 분리하여 계수한 후, 단일 세포 조제물에서 CD45 마이크로비드 및 autoMACS 시스템 (둘다 Miltenyi에서 구입함)을 이용하여 비-조혈 기질 세포를 농화시켰다. 세포 10⁷개 당 비드 7㎕를 사용하여, 20분간 회전 휠 위에 4℃에서 FACS 완충제 중에 인큐베이션하였다. 표지한 분획을 Depletes 프로그램을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 고갈시켰다. 그런 후, 농화시킨 기질을 계수하고, 세포 분류를 위해 상당 부피의 항체 (세포 10⁶개 당 희석 항체 칵테일 100㎕)를 이용하여 염색하였다.

인간 림프절의 효소적 분해

인간 림프절에서 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거한 다음, 미세 가위를 사용하여 작은 조각 (<0.5cm)으로 커팅하였다. 섹션 2.4에 따라 분해를 진행하였으며, RPMI-1640 중의 효소 농도는 디스파제 2.4mg/ml, 콜라게나제 P 0.6mg/ml (둘다 Roche 사 제품임), DNase I (Invitrogen) 0.3mg/ml로 높였다. 전체 장기를 분해할 수 없는 경우, 대신 림프절 전 영역을 대표하는 약 20개의 혼성 단편들을 무작위 선택하였다. 60분 후, 림프절 단편이 완전히 분해되었으며, 전술한 바와 같이, 이를 여과, 계수하고, 필요에 따라 염색하였다.

저압 유세포 측정에 의한 기질 세포의 분류

기질 세포의 유세포 측정을 이용한 분류는, 특수 저압, 대구경 셋업 (large aperture setup)을 사용하는 경우, 개선되지만, 분류기를 비-표준 항목으로 재설정한 다음 순수 개체군을 성공적으로 분류하는데 있어 태생적인 기술적 문제가 있다. 본 발명에서는 FACSDiva 소프트웨어를 이용하고, 20psi로 설정되고 100mm 팁이 장착된 FACSAria 또는 upgraded FACSAria IIu 장치 (모두 BD Bioscience사 제품임)를 사용하였다. 각 장치가 달라지면, 기질 분류용으로 설정된 4종 이상의 FACSAria 장치들에 하기와 같은 대략적인 내역을 적용하였다. 이들은 제조사가 명시한 권고된 셋업과는 차이가 있다.

스트림 압력 감소는 액적의 크기를 증가시키는데, 20psi에서는 스트림 가시화 윈도우를 통해 액적 5-6개만 볼 수 있지만, 70psi에서는 액적 10-12개를 볼 수 있다. 액적의 브레이크오프 포인트는 분류 성공에 직접적으로 영향을 미치며 항상 볼 수 있어야 하며, 새틀라이트 해리 지점 (satellite resolution point)은 액적 발생수를 높인 후에도 저압하 분류시 보이는 것 보다 아래에 생길 수 있다. 이는 성공적인 분류를 불가능하게 하며, 새틀라이트 해리가 스크린 이하에 액적을 1-2개 이하로 발생시킨다는 것을 확신하는 것이 중요하다. 이는 2가지 방식으로 합리적으로 확립할 수 있다: 일차로, 뷰 보다 높게 범위 밖으로 액적 브레이크오프 포인트를 일시적으로 조정함으로써, 새틀라이트 해리 포인트는 가시화되게 되며, 하방으로 재조정하기 전에 브레이크오프와 해리 사이의 액적의 수를 계수하고, 두번째로, 새틀라이트와 액적 사이의 거리 단축을 보면서 해리가 발생할 때까지 액적의 수를 추산함으로써, 확립할 수 있다. 새틀라이트들은, 화면 (on-screen) 상에 분리되지 않는다면, 거의 분리에 가까워야 한다.

결정적으로, 액적 진폭 (droplet amplitude)을 둔화시키는 감쇠 제어 (attenuation control)의 적용 유무를 결정하는 것은, 이후의 세목들을 상당히 바꾸게 된다. 감쇠가 가미된 경우와 가미되지 않은 경우의 샘플 셉업 분류 기록을 참조로 제공한다 (표 1). BD Biosciences 매뉴얼은 20psi에서 분류하였을 때 적용되지 않는 감쇠를 권고하고 있지만, 본 발명에서는 양호한 스트림을 발생시키기 위해서는 종종 (FACSAria IIu가 아닌) FACSAria를 이용하는 것이 필요하다는 것을 확인하였다. 100 ㎛ 팁의 매뉴얼 조정은 FACSAria를 이용하여 양호한 스트림을 발생시키는데 필요하였지만, o-링이 영구적으로 장착 경우 FACSAria IIu 시스템은 팁을 이동시키거나 감쇠를 적용하지 않아야 했다.

마지막으로, 633nm 레이저 지연 (laser delay)은 저압과 조합시 갑자기 바뀔 수 있다는 것에 유념하였다. 그 이유는 명확하지 않지만, CST를 이용하여 지연을 설정하거나 또는 SPHERO 레인보우 입자 (BD Bioscience)를 이용한 레이저 기능을 테스트하는 것을 (또는 임의의 유사한 보정 체크) 추천한다. 633nm 레이저에서 나오는 신호 결핍은 레이저 지연을 재-보정이 필요할 수 있다라는 의미임에 유념하여야 한다.

기질 세포 분류에 대한 보완 (compensation)은 농화된 기질 세포를 이용하여 엄격하게 수행되어야 한다. 기질은 자동형광을 수반하는 정도로 큰 세포이다. 백혈구를 이용하여 보완한 장치는 기질을 분류할 때 개체군을 차선으로 해리시킨다. 비-농화된 개체군에서는 기질이 늘 드물기 때문에, 농화된 기질을 보완에 사용하여야 하며, 본 발명에서는, 자동보정 소프트웨어가 해리된 단일 세포 현탁물에서의 정상적인 자동형광 수준과 진성 기질 염색을 구별할 수 없다는 것을 확인하였다.

장치를 최상으로 보정하였을 때, 분류 스트림의 탁월한 해상도와 우수한 효능으로 분류가 진행된다. 분류 스트림은 물론 밝은 개개 점들을 분류 창에서 해리시켜야 하며; 분류 스트림의 "분사 (spraying)"는 나타나지 않아야 한다.

AutoMACS-농화된 기질은 일상적으로 고순도 (>95%)로 TRIzol (Invitrogen)로 분류되었다. CD45^- 프로피듐 아이오다이드^- 기질 상에서 게이팅한 후, 아종을 다음과 같이 분류하였다: 섬유모세포 세망 세포 (FRC), 포도플라닌⁺CD31^-; 림프 내피 세포 (LEC), 포도플라닌⁺CD31^-; 혈관 내피 세포 (BEC), 포도플라닌^-CD31⁺; 이중 음성 기질 세포 (DN), 포도플라닌^-CD31^-.

마이크로어레이 분석법 및 분석

분류한 세포 10,000-15,000주로부터 RNA를 종래에 언급된 바와 같이 분리한 다음 (Yamagata et al., 2004), 증폭시켜, GeneChip Whole Transcript Sense Target Labeling Assay를 제조사의 지침서에 따라 사용하여 Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Arrays (Santa Clara, CA, USA)에 혼성화하였다. 이로써, 복수의 위치들에서 각 유전자와 교차 결합하도록 설계된 프로브를 이용하여 전체-전사체 정보를 입수하였다. 원 데이타를 Expression File Creator module of GenePattern에서 RMA (robust multi-array average) 프리프로세싱 알고리즘 (백그라운드 조정, 분위 정규화 및 요약화 (summarization)를 수행함)을 이용하여 정규화하였다 (Irizarry et al., 2003). 프로브 리스트를 대상으로 하나 이상의 아종에서의 발현 (평균 발현 값이 모든 아종들에서 <120인 경우는 제외함)과, 레플리케이트들 간의 낮은 변동성 (각 개체군에서 변동 계수가 > 0.5인 경우는 제외함)을 분석하였다. GenePattern의 멀티플롯 모듈을 이용하여, 피부 림프절 FRC와 장간막 림프절 FRC 간의 차이를 계산하였다. 발현 배수 변화가 > 2이고 P<0.05 (student's T test)인 경우, 차이는 추가적인 분석이 고려되었다. 아웃풋 데이타는 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 정렬하고, 유전자 리스트에서 DAVID 프로그램의 기능 주석 툴 (NIAID, david.abcc.ncifcrf.gov (Dennis et al., 2003))을 이용하여 KEGG 경로에서의 농화를 분석하였으며, Affymetrix 엑손 백그라운드를 MoGene-1_0-st-v-1 칩에 설정하였다. 다중 가설 (벤자미니) 교정 후 T-test P-values < 0.05인 KEGG 경로 분석 결과는 유의한 것으로 간주하였다. 데이타 시리즈의 NCBI GEO 등재 번호는 GSE15907이다.

림프절 기질 세포의 배양 기법

림프절을 전술한 바와 같이 해리하고, 계수한 다음 5 x 10⁵ 세포/cm²의 농도로 접종하였다. 세포 배양 배지는 10% 배치-테스트한 저 Ig FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 αMEM이었다. 플레이트를 24시간 후 세척하여, 부착되지 않은 세포는 제거하였다. 5일 후, 마우스 세포 배양물에는 주로 LEC와 FRC가 함유되어 있었다. 인간 세포 배양물은 더 천천히 증식하여, 7일 후에 회수하였다. 인간 림프절 기질 세포 배양물에는 주로 FRC와 DN이 함유되어 있었다. 중요한 세포 표면 마커가 트립신에 의해 잘리는 것을 최소화하기 위해, EDTA가 첨가된 저농도의 트립신 중에서 짧게 인큐베이션하는 단계로 구성된, 비-표준적인 회수 프로토콜을 통상적으로 사용하였다 (표 2). 세포를 PBS로 세척하여 잔여 단백질을 제거하고, 회수 완충제 (PBS 중의 0.2% 트립신 + 5mM EDTA)를 배양 플레이트에 첨가하였다. 세포를 회수 완충제에서 2분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 시점에, 이의 형태가 둥글게 되었고, 완전 배지를 동일 부피로 웰에 즉시 첨가하였다. 1ml 파이펫을 이용하여 부드럽게 혼합하면서 플레이트의 세포를 헹구고, 원심 분리 (300g, 3분, 4℃)하기 위해 다른 동일 부피의 완전 배지에 상층물을 첨가하였다. FRC와 LEC를 재접종하거나, 분류하거나 또는 필요에 따라 이 조제물로부터 MACS로 정제하였다.

3차원 배양과 네트워크 분석을 위해, 세포를 고농도의 랫 꼬리 콜라겐 I (BD Biosciences), 1.8mg/ml 마트리겔 기저막 매트릭스 (BD Bioscience), αMEM 분말 (Invitrogen)로 실험실에서 제조한 8.3% (v/v) 5x αMEM 스톡 배지 및 접종 세포가 함유된 30% (v/v) 배양 배지로 구축된, 변형가능한 매트릭스에서 배양하였다. 겔 성분들을 얼음 위에서 혼합하고, 이미지화를 위해 플라스틱 또는 유리-바닥의 배양 디쉬 (MatTek)에 200㎕ 접종하였다. 겔은 10분간 37℃에서 고정한 다음 배양 배지로 피복하였다. 수축 분석을 위해, 편평 바닥의 96웰 배양 플레이트에서 겔을 형성시키고, 15시간 후에 사진 촬영하였다. 다음과 같은 등식으로 수축을 측정하였다: 수축한 겔 면적 (cm²) / 웰 면적 (cm²) * 100 = 수축율%. 살아있는 세포를 타임-랩스로 촬영하기 위해, 골수 유래 수지상 세포 또는 B 세포를 정제한 FRC 배양물과 5:1의 비율로 혼합하였다. 이미지를 촬영하는 동안, 겔을 10% FCS가 포함된 αMEM에서 10% CO₂ 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 무비는 90초를 1 프레임으로 하는 타임-랩스 이미지를 나타낸다.

면역조직학 및 공초점 현미경

림프절을 신선하게 적출하여, 10% 파라포름알데하이드에서 4시간 동안 고정한 다음, 밤새 10% 슈크로스 용액 중에 두었다. 그런 후, 블록을 OCT 화합물 (VWR) 중에 포매하고, 스냅-동결한 다음 -80℃에 보관하였다. 림프절을 레이카 저온 유지 장치를 이용하여 동결단편 (7㎛)으로 자르고, 아세톤 고정한 다음 2% BSA를 사용하여 30분간 블록킹하였다. PBS로 세척한 후, 단편을 1차 항체로 60분간 염색한 다음 세척하고, 다시 60분간 2차 항체로 염색하였다. 슬라이드를 형광 마운팅 매질 (DAKO)을 이용하여 커버슬립으로 덮고, 4℃에 보관하였다. 이미지는 레이카 Sp5 공초점 현미경을 사용하여 포착하였다.

통계 분석

GenePattern의 멀티플롯 프로그램을 사용하여, 임의 샘플에 대한 레플리케이트들 간의 변동 계수가 <0.5인 정규화된 어레이 데이타에서 T-검정 P 값을 계산하였다. 관찰되는 배수-변화가 또한 <2인 경우, P-값 <0.05는 유의한 것으로 간주하였다. KEGG 경로 관련성에 대해 DAVID 프로그램 (david.abcc.ncifcrf.gov)을 이용하여 유전자들을 조사하였으며, 변형된 피셔의 정확성 검정과 벤자미니 다중 이론 교정이 연계된 T-검정을 이용하여 데이타를 비교하여, 특정 리스트에서 2 이상의 유전자들의 농화를 확인하였다. 비-모수적 만-휘트니 U 검정을 이용하여, 유세포 측정 데이타를 비교하였다 (Prism).

림프절 기질 세포의 분리 및 배양

3-6주령의 C57Bl6/J 마우스를 FRC 공여체로 사용하였다. 피부 및 장간막의 림프절을 적출하고, 효소적 수단과 기계적 수단을 이용하여 해리하였다. 마우스 10마리에서 수득한 림프절을, 0.8mg/ml 디스파제, 0.2mg/ml 콜라게나제 P 및 0.1mg/ml DNase가 첨가된 RPMI-1640에서 60분간 37℃에서 규칙적으로 교반하고, 효소 혼합물을 교체하면서 인큐베이션하였다. 원심 분리하여 분해된 세포를 회수하였다. 분해가 완료되면, 세포를 RPMI-1640에 재현탁하여, 80mm 메쉬로 여과한 다음 헤모사이토미터와 트립판 블루를 이용하여 계수하였다. 세포를 배양 플라스크에 5 x 10⁵ 세포/cm²로 접종하였다. 배양 배지는 αMEM 중의 10% 배치-테스트한 저 Ig FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된다. 세포를 24시간 후 세척하여, 다시 6일간 배양한 다음 PBS 중의 0.2% 트립신 및 5mM EDTA를 사용하여 1회 계대 배양한 후, 사용하기 전 다시 5-6일간 증폭을 위해 1:10으로 분할하였다.

MSC 분리 및 배양

전술한 FRC 공여 마우스의 골수로부터 MSC를 회수하였다. 마우스 10마리에서 대퇴골과 경골을 적출하였다. 이를 원심 분리하고, 파이펫을 이용하여 멸균 RPMI-1640에 재현탁함으로써, 골수를 회수하였다. 세포를 배양 플라스크에 5 x 10⁵ 세포/cm²로 접종하였다. 배양 배지는 αMEM 중의 10% 배치-테스트한 저 Ig FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된다. 세포를 24시간 후 세척하고, 다시 6일간 배양한 다음, PBS 중의 0.2% 트립신 및 5mM EDTA를 사용하여 1회 계대 배양한 후, 사용하기 전 다시 5-6일간 증폭을 위해 1:10으로 분할하였다.

FRC와 MSC의 정제

세포를 PBS 중의 0.2% 트립신 및 5mM EDTA를 사용하여 회수한 다음, 헤모사이토미터와 트리판 블루를 이용하여 계수하고 (생존성 > 95%), 세포 10⁷ 당 항-CD31-바이오틴 10㎕와 항-CD45-바이오틴 10㎕이 첨가된 FACS 완충제 (PBS + 2% FCS + 5mM EDTA) 1ml에 현탁하였다. 15분 후, 세포를 세척하고, 항-바이오틴 마이크로비드와 인큐베이션한 다음, 제조사의 지침서 (Miltenyi Biotec)에 따라 MACS LC 컬럼을 통해 통과시켰다. MACS로 정제한 FRC를 모든 실험들에서 사용하였다.

패혈증 유도: LPS 모델

3-6주령 (어린) 또는 18-24월령 (노화된)의 C57Bl6/J 마우스에, LPS를 1회 주사하여, 무균성 패혈성을 발생시켰다. 어린 마우스에는 LPS 300mg을 염수 100 ㎕에 용해하여 i.p.로 투여하였고, 노화된 마우스에는 LPS 150mg을 염수 100 ㎕에 용해하여 i.p.로 투여하였다. FRC 1 x 10⁶을 염수 중에 지정된 시기에 1회 주사로 i.p.로 투여하였다. 마우스는 다음과 같은 엔드포인트 중 어느 상태에 도달하면, 안락사하였다: 의식 상실, 각성 불능, 일어서있기 불능 또는 10초 당 호흡 횟수 20회 미만으로 지속적인 호흡율 감소.

패혈증 유도: CLP 모델

Balb/c 마우스에 맹장 결착과 천공 (CLP)을 수행하여, 복합 균성 패혈증을 발병시켰다. 간략하게는, 마우스를 마취시키고, 피부와 복부 근육에 중앙선으로 절개하였다. 맹장의 위치를 파악하여, 무균 외과 필드로 꺼낸 다음, 맹장의 80%를 6.0 봉합사로 결찰시키고, 23g 바늘을 이용하여 맹공에 2번 구멍을 뚫었다. 맹장을 제 위치에 두고 근육과 피부를 봉합하기 전에 변 물질 몇 방울이 배출되었다. 마우스에 염수 1ml을 s,c,로 투여하였다. 지정된 시점에, 마우스에 염수 또는 염수 중의 동종 FRC 1 x 10⁶을 1회 i.p.로 주사하였다. 이 때, 모든 마우스에 항생제 처리를 시작하였다 (염수 중의 암피실린 15mg을 i.p.로 주사함). 항생제는 12시간 마다 투여하였다. 마우스는 하기 엔드포인트 중 어느 상태에 도달하면, 안락사하였다: 의식 상실, 각성 불능, 일어서있기 불능 또는 10초 당 호흡 횟수 20회 미만으로 지속적인 호흡율 감소.

사이토카인 어레이

전술한 바와 같이 혈액을 수득하고, 원심분리에 의해 혈장을 수집하였다. 분석물의 농도를 Luminex MAGPIX 어레이와 xPONENT 소프트웨어를 이용한 리더기를 제조사의 설명서에 따라 사용하여, 수득하였다.

결장염 모델 유도

8주령의 암컷 C/B17.scid 마우스를 결장염 수여체로 사용하였다. 7주령의 Balb/c 암컷 공여 마우스는 결장염을 유도하기 위한 세포 공여체로서 사용하였다. 비장과, 피부 및 장간막 림프절을 Balb/c 마우스 20마리에서 적출하여, RPMI-1640에 기계적 파괴에 의해 현탁하였다. 세포를 여과하고, 계수한 다음 CD4⁺CD62L⁺CD44^low 분석 키트 (R&D Systems)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 네이티브 CD4+ T 세포를 농화시켰다. 그런 후, CD4⁺CD45RB^hi+ T 세포를 FACS를 이용하여 분류하여, 멸균 RPMI-1640에 재현탁하였다. C/B17.scid 마우스 15마리에 RPMI-1640 100 ㎕ 중의 세포 5 x 10⁵개를 투여하였다. 마우스는 결장염 유도 후 2주부터 체중 감소가 시작되어, 질환 개시가 확인되었다. 그런 후, 실험을 지속하는 동안, 주 당 1회로 동종 FRC 1 x 10⁶개를 i.p.로 마우스에 투여하였다. 마우스는 하기 엔드포인트 중 어느 상태에 도달하면, 안락사하였다: 출발 체중 대비 >20% 감소 또는 뒷다리 마비.

결과

마우스 및 인간 림프질 기질 세포의 효소적 분리

림프절 기질 세포에 대한 연구는 최근 기세를 받아, 몇몇 영향력이 높은 문헌들은 네이티브 T 세포를 유지 (Link et al., 2007) 및 고갈 (Lee et al., 2007, Nichols et al., 2007, Gardner et al., 2008, Magnusson et al., 2008, Yip et al., 2009, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010)시키는데 새롭게 발견된 역할을 분석하였다.

이에, 본 발명에서는, 가변성이 낮은 림프절 기질 세포를 고도로 재현가능하게 분리할 수 있는, 저-치사성 효소 분해 프로토콜을 개발하고자 하였다. 효소적 해리와 물리적 해리의 조합을 이용하여 (도 1), 분리한 직후 전체 림프절 현탁물 (1.5% 기질)에 트립판 블루를 이용하여 >95%의 생존성으로 기질 세포를 통상적으로 분리하였다 (도 2A). 분리 및 기질 농화 후 6시간째에, 프로피듐 아이오다이드를 이용한 경우 기질의 평균 생존성은 87.8% ± 0.8 (평균 ± 표준 편차, 실험 n=3)이었다. 이러한 높은 생존성은, 개개 마우스에 존재하는 각 기질 아종의 특징을 규명하고, 그 수를 비교가능하게 하므로, 이들 세포의 성공적인 분리와 배양에 주요 인자이다. 본 발명에서는, 림프절 기질의 주 아종 5종을 연구하기 위해, CD45, 포도플라닌, CD31 및 MadCAM (도 2B)을 사용하였다. 특히 MadCAM+ MRC 아종은, 기존에, 유세포 측정 분석에서 분리된 바 있다.

먼저, 본 발명의 유세포 측정을 이용한 전략을, 기존에 규정된 기질 아종의 인 시추 조직학적 분석과 직접 비교하였다 (도 2C). 본 발명의 목표는, 세포 타입의 수 또는 비율의 변화, mRNA 프로파일 및 그외 세포 분리가 필요한 기법과 병행하여, 기질의 구조 변화를 모니터링할 수 있는 방법을 확립하는 것이었다.

이에, 유세포 측정을 통해 규명된 FRC가, 예상한 바와 같이, T 세포 영역 전체에 세망 네트워크를 형성하고 있다는 것을 확인하였다 (상단 패널). BEC는 CD31을 발현하지만 포도플라닌을 발현하지 않았으며, 이의 작은 크기와 입방형 형태에 의해 구분가능한 고 내피 소정맥으로 주로 피질에 존재하였다 (상단 패널). LEC는 포도플라닌과 CD31의 공동-발현이 특징적이며, 수질 (가운데 패널)과 피막하 (데이타 도시 안함)의 문 (hilum) 영역에 큰 림프관에 라이닝되어 있었다. 이의 문 영역에는 또한 큰 혈관이 존재하였다 (CD31⁺ 포도플라닌^-). 또한, 피막하에 라이닝된 MadCAM⁺ 세망 세포 (하단 패널)와 MadCAM 염색은, 기존에 보고된 바와 같이, B 세포 영역에도 존재하였다. 또한, 피막하 LEC (여기서 Lyve-1 발현이 확인됨)이 MadCAM도 발현하여 (하단 패널), 림프절의 MadCAM-풍부 영역을 형성한다는 것을 확인하였다. 표현형 상, MRC는 유세포 측정에 의해 포도플라닌⁺ CD31^- FRC 게이트에서 아종을 형성하였다 (도 2B).

본 발명의 분리 방법을 인간 림프절 기질을 분리하는데 적용하여, 생체외 실험 시스템을 구축할 수 있다는 가설을 세웠다. 인간 림프절 기질 구조는 조직학적으로 잘 설명되어 있지만 (Link et al., 2011), 유세포 측정이나 다른 면역학적 실험에서 아종들이 분리된 적은 없다.

본 발명에서는 공여 사체의 비-장간막 오리진의 인간 림프절을 수득하였다. 림프절을 분해하기 위해서는 효소 농도 증가가 필요했지만 (방법 참조), 일단 분해시키면, 이의 기질 조성은 마우스와 상당히 비슷하였다 (도 2D와 2B 비교). 이들 결과는, 뮤라인 림프절 기질 세포 기법을 인간 실험에도 똑같이 적용할 수 있다는 것을 시사해준다.

장간막 림프절은 피부-배액성 림프절 보다 FRC를 적게 포함한다.

분해를 추가로 검증하기 위해, 연령이 동일한 마우스들에서 림프절 기질 세포 아종의 구성 비율 차이를 평가함으로써, 이의 재현성을 조사하였다. 또한, 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절의 기질 조성도 비교하였다. 이들 림프절들은 구조 유사성이 잘 확립되어 있으며, 조직학적으로도 잘 연구되어 있지만, 이들의 개체 발생은 다른 시기에 이루어지며, 다른 신호 경로에 의존한다 (Mebius, 2003). 부가적으로, 장간막 림프절은 장과 위점막 유래 항원에 계속적으로 노출되지만, 피부-배액성 림프절은 그렇지 않다.

놀랍게도, 각각의 피부-배액성 림프절 또는 장간막 림프절에서 비슷한 갯수의 세포가 분리되었지만 (도 3A), 기질 조성은 현저히 다른 것으로 (도 3B) 확인되었다. T 세포 영역 전체에서 생장하는 FRC는 더 높은 빈도로 존재하며 (도 3B, 도 2B), 장간막 림프절 보다 피부-배액성 림프절에서 더 많았다 (도 3C). LEC, BEC, DN 및 MRC는 양쪽 부위에서 비슷한 수로 존재하여 (도 3C), FRC-특이적인 차이가 나타났다.

이러한 차이가 MRC 아종의 비율 왜곡 (Katakai et al. 2008)에 의한 것인지를 확인하였으며, 이는 FRC 게이트에 해당됨을 발견하였다 (도 2B). FRC 게이트에 해당되는 세포들 중 10-20%가 5주령 수컷 마우스에서 MadCAM을 발현하였으며, 피부-배액성 림프절 보다는 장간막 림프절에서 비율이 더 높았다 (도 2B, 3D). 그러나, MRC의 비율은 LEC와 유사하게 두 부위 간에 현저한 차이가 있었지만, 이들의 전체 수는 그렇지 않았다 (도 3E). 이는, MRC가 다른 기질 아종과 마찬가지로 2 부위들 간에 수적으로 비슷한 반면, FRC는 장간막 림프절에서 감소되었기 때문에, MRC 수와 FRC 수가 차별적으로 조절됨을 시사해준다.

흉선과 같은 일부 림프성 장기에서, 우세한 기질 세포 아종의 수는 T 세포 발생과 병행하여 증폭되거나 감축된다. T 세포와 B 세포가 결핍된 Rag^-/- 마우스를 이용하여 이것이 FRC 개체군에 적용되는 지를 테스트하였다. FRC는 Rag^-/- 림프절에서 발생하지만, 이들이 림프구 수와 반응하여 증폭 및 축소하는지는 알려져 있지 않다. 림프절은 증식성 림프구를 포함하도록 단기간에 급격하게 증폭하여야 하므로, 이 의문은 특히 감염과 관련 있다.

Rag^-/- 마우스는 더 작은 림프절을 가지고 있었지만 (도 3F), 연령이 동일한 야생형 대조군에 비해 FRC를 정상적인 수로 가지고 있었다 (도 3G). 그러나, LEC의 수는 현저하게 감소되어, 이의 수적 항상성이 성숙 림프구의 존재와 연관되어 있다는 것을 시사한다. Rag^-/- FRC는 세포 턴오버 속도 면에서 WT와 다르지 않았으며 (데이타 도시 안함), 마우스에 LPS를 주입한 후, FRC의 수는 T 세포 및 B 세포와 더불어 증폭되지 않았다 (데이타 도시 안함). 따라서, FRC의 수는 림프구 감소성, 정상 상태 (steady-state) 및 염증성 병태에서 성숙형 림프구와는 완전히 독립적으로 유지되었다.

놀랍게도, MRC 서브세트가 Rag^-/- 마우스에서 과소 발생한다는 것을 확인하였다 (도 3H-J). 조직학적 방법을 통해 MadCAM+ MRC가 Rag^-/- 마우스에 존재하는 것으로 보고되었지만 (Katakai et al., 2008), 한편으로는, MadCAM+ MRC의 갯수와 MRC 당 MadCAM 단백질의 양 둘다 유의하게 감소되었다 (도 2H- J). 또한, 이는 MadCAM⁺ LEC (도 3H-J)에도 적용되는데, 양쪽 세포 타입들에서 MadCAM 발현의 상향 조절은, 단백질 자체 발현이 이의 부재 시에 이루어질 수 있음에도 불구하고, 발생 단계에 림프구의 존재가 필요하다는 것을 시사해준다. MadCAM⁺ LEC의 비율은 WT 및 Rag^-/- (도 3H)에서 비슷하였지만, LEC의 유의한 총 수 감소 (도 3G)는 MadCAM⁺ LEC의 수적 감소 (도 3I)로 해석되었다.

림프절 기질 세포 아종의 농화 및 분류

림프절을 성공적으로 분해한 후, 다음으로 기질 세포를 성공적으로 분류하여 배양하도록 방식을 개조하였다. 기질 세포의 분류는 기술적으로 어려울 수 있어 (방법 참조), 본 발명에서는 분류 시간을 단축하고 수득되는 순도를 높이기 위해, MACS-기반의 조혈 세포 고갈을 이용하였다. 이러한 추가적인 단계는 기질 소실을 최소화하였으며 (도 4A, B), 기질 조성을 인지가능할 만큼 변형시키지 않아, MACS 이후의 기질 아종의 선택적인 소실 (도 4C)이 나타나지 않았고, 분류 후 상당한 순도가 달성되었다 (도 4D).

이 방법을 이용하여, 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절로부터 FRC를 멀티센터 ImmGen Consortium의 일부로서 분류하였다. 이는, 고도로 통제되고 가변성이 최소화된 조건에서 분류된 세포를 트랜스크립톰 분석하는 것을 포함하며, 총괄적인 목료는 면역학적 게놈의 포괄적이고 교차-참조된 맵을 제공하기 위한 공개 데이타베이스를 구축하는 것이다.

피부-배액성 림프절과 장간막 림프절로부터 유래된 FRC를 대상으로 프로브 25,194개의 발현을 분석하여, 피부-배액성 림프절 또는 장간막 림프절에서 임의 역치 (arbitrary threshold) (평균 발현 값 >120) 보다 높게 발현되는 프로브 11,162종의 리스트를 확보하였다. 이들 프로브는 또한 레플리케이트들 간에 낮은 (<0.5) 변동 계수로 필터링하였다.

먼저, 이들 여러가지 위치에서의 FRC가 기존에 공개된 CD140a, CCL19 및 IL-7 등의 FRC-특이 마커들의 발현을 공유하고 있다는 것을 검증 (데이타 도시 안함)한 다음, 데이타를 대상으로 차이를 분석하였다. 피부-배액성 림프절 FRC 대 장감막 림프절 FRC를 비교한 결과, 배수-변화 및 P-값을 도시한 볼카노 그래스 (volcano plot)에서, 프로브 130종이 장간막 림프절에 비해 피부-배액성 림프절 유래 FRC에서 유의하게 상향 조절되는 반면, 프로브 97종의 발현은 피부-배액성 림프절 대비 장간막 림프절 FRC에서 유의하게 높은 것으로 나타났다 (>2배 변화, P<0.05) (도 5A). 이들 프로브를 고유 유전자로 맵핑하였을 때, 이들 데이타는 피부-배액성 림프절 FRC에서의 유전자 126종의 상향조절 (데이타 도시 안함)과 장간막 림프절 FRC에서의 유전자 54종의 상향조절에 해당되었다 (데이타 도시안함).

이 리스트가 특정 유전자 경로의 활성화에 대한 증거를 가지고 있는지, 또는 임의의 부위-특이적인 특수화에 대한 단서로서 유전자 네트워크가 양쪽 세포 타입에서 독특하게 작동하는지에 관심을 가지게 되었다. 무료 온라인 프로그램인 DAVID (version 6.7; 국립 알레르기 및 감염성 질환 협회)를 이용하고, 네트워크 분석 툴 (KEGG)을 사용하여, 리스트에서 이들 유전자들 간에 공지된 생물학적 연관성을 조사한 다음, 통계학적 분석 툴을 사용하여 연관된 유전자들이 우연히 예측되는 것 보다 높은 빈도로 함께 나타나는지를 분석하였다. 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용을 포괄하는 KEGG 경로 mmu04060는, 장간막 림프절과 비교하여 피부-배액성 림프절에서 FRC가 유의하게 농화되어 있었다 (유전자들은 우연히 예측되는 것 보다 4.8배 높은 빈도로 나타남, 벤자미니 보정한 P 값 = 0.0055). 이 리스트에는 적어도 2배 이상으로 피부-배액성 림프절에서 상향 조절된 면역학적으로 관련된 유전자 10종이 포함되어 있었다 (도 5B). 장간막 림프절에서 상향 조절된 유전자들은 동정가능한 KEGG 경로에서 유의하게 농화되지 않았지만, 섬유모세포 생장을 조절하는데 관여하는 유전자, 장 미세환경과 관련된 유전자, 예컨대 레티노익산 대사 또는 MadCAM 발현에 관여하는 유전자, 내피 세포 크로스-토크, 세포외 매트릭스 분비 및 말초 신경의 성장 (outgrowth)에 관여하는 유전자들이 포함되어 있었다 (표 3).

배양된 FRC는 생체내 기능을 모방하고, 백혈구 이동을 지원한다.

다음으로, 배양시 림프절 기질의 증식력을 조사하였다. 성공적으로 분해된 림프절 세포 현탁물 유래 기질은 접종 2시간 이내에 조직 배양 플레이트에 쉽게 부착하여, CD45+ 백혈구가 없어지면서 증폭하기 시작하였으며, CD45+ 백혈구는 5일 경과 후 배양물의 10% 미만이 되었다 (도 6A). FRC와 LCE는 배양시 쉽게 증식하였지만, BEC와 DN 세포는 그렇지 않았다 (도 6A). FDC는 배양시 증식하지 않았다 (도 6B). 중요한 것은, 본 발명의 저-트립신, 고 EDTA 회수 프로토콜은 CD31 (도 6C) 및 CD140a (도시 안함; 표 2 참조)와 같은 중요한 표면 마커들의 체류를 가능하게 한다는 것이다. 본 발명자들은, 약 5 x 10³개의 기질 세포가 포함된 5 x 10⁵ 세포/cm²이 5일 배양 후 통상적으로 약 1.5-2 x 10⁴ stroma/cm²이 된다는 것을 확인하였다. 즉, 이 배양 시스템은 FRC, LEC 및 MRC를 용이하게 증폭시키고 조작할 수 있다.

특히 FRC는 2차원 (2D) 배양시 매우 편향되어 (도 6D), 강력한 F-액틴 스트레스 파이버가 확인되었다 (도 6E). 이는 생체내 형태를 모방하는 것이 아니므로, 생체내에서 그러한 바와 같이 3차원의 증식과 연결이 가능할 때 이들의 기능을 조사하기 위한 도구로서, 콜라겐 I의 최적화된 믹스인 마트리겔과 농화된 αMEM을 사용하여, FRC와 LEC의 3차원 (3D) 배양을 조사하였다. 그 결과, 3D로 배양하였을 때, FRC가 펼쳐져 넓은 네트워크를 형성하는 (도 6D, E) 반면, LEC는 편평 표면을 선호하여 2D 배양시 더 성공적으로 증식하였다 (도 6D). 흥미롭게도, 세포 타입은 3D 조건에서 컨플루언시를 넘어서는 (overconfluence) 수준으로는 증식하지 않았는데 (데이타 도시 안함), 이는 2D 배양시에서는 발생하지 않는 세포 밀도에 대한 내재된 조절이 있음을 시사해준다. 이러한 시험관내 FRC 네트워크의 생물학적 적절성을 검증하기 위해, 2가지 실험을 수행하였다. 먼저, 소형 마트리겔 플러그에 많은 수의 FRC를 접종하여, 겔 수축시키는 능력을 모니터링하였다 (도 6F). FRC는 α 평활근 액틴을 높은 수준으로 발현하며, 수축성이 높다 (Link et al., 2007). 본 발명자들은, FRC가 겔을 매우 효과적으로 수축시키며, 이러한 수축은 Src 티로신 키나제 저해제 PP2를 겔에 첨가하였을 때 방지된다는 것을 알게 되었다. 두번째로, 골수 유래 수지상 세포 (DC) 또는 비장 유래 림프구를 FRC가 함유된 겔에 첨가하고, 라이브-영상화 방식을 사용하여, 생체내에서 보고된 바와 같이, DC 및 림프구가 효과적이고 선호적으로 FRC 네트워크를 타고 이동한다는 것을 확인하였다 (도 6G에 도시되며, 풀 타입-램스 무비는 보충 무비 1 및 2에 나타냄).

동일한 방법을 이용하여, 인간 림프절 기질 세포 아종들을 성공적으로 배양하였다. 뮤라인 세포와는 달리, BRC 및 DN 세포들이 LEC 및 FRC와 더불어 시험관내에서 배양되었다 (도 6H).

더불어, 이들 결과는, 뮤라인 림프절 기질을 유세포 측정 및 분류를 위해 쉽게 분리하여, 백혈구의 부재 하에 배양할 수 있으며, 또한 생체내에서 보고된 바와 같이 백혈구가 쉽게 타고 움직이는 넓은 3D 네트워크를 형성함을 보여준다. 본 발명의 데이타는, 인간 림프절 기질을 뮤라인 기법을 이용한 실험과 유사하게 다룰 수 있다는 것을 시사해준다.

또한, 이들 데이타는 생체외 및 시험관내 조건에서, 마우스 및 인간의 림프절 기질 세포에 대한 연구에 적용가능한 기법 세트에 대한 검증을 기술한다.

림프 조직 유래 억제자 세포는 활성화된 동종 비장세포의 증식을 억제한다.

미분획화한 LSSC를 무관련 공여체로부터 금방 분리한 인간 비장 세포와 함께 배양하였다. 비장 세포는 세포 분열시 희석되는 CFSE로 형광 염료인 표지하였다. 이 비장 세포 개체군 내 T 세포를 PHA과 IL-2를 사용하여 활성화하였다. 도 7는 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정된 T 세포를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다. 기질 세포 배양물 없이 자극한 T 세포는 LSSC와 함께 배양한 세포 보다 CFSE가 더 많이 희석되었으며, LSSC는 용량 의존적인 방식으로 T 세포 증식을 억제하였다 (도 7).

LSSC는 활성화된 이종 T 세포의 증식을 억제한다.

미분획화한 LSSC를 금방 분리한 마우스 비장 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비장 세포는 세포 분열시 희석되는 CFSE로 형광 염료인 표지하였다. T 세포를 항-CD3와 항-CD28 항체를 사용하여 활성화하였다. 도 8은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정된 T 세포를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다. 기질 세포 배양물 없이 자극한 혈액 유래 T 세포는 LSSC와 함께 배양한 세포 보다 CFSE가 더 많이 희석되었으며, PDPN+ 및 PDPN- LSSC 서브개체군들 모두 동일하게 T 세포를 억제할 수 있었다. LSSC는 (도 7에 나타낸 동종 억제와 비교하여) 이종성 반응에 대해 강력한 억제자이다.

LSSC는 새로운 기전을 통해 T 세포 증식을 억제한다.

마우스에서, 림프절 유래 PDPN+ 기질 세포는 T 세포-유래 IFNg와 기질 세포-유래 산화 질소를 결정적으로 필요로 하는 기전을 통해 자가 T 세포의 증식을 억제한다 (Lukacs-Kornek et al. Nature Immunology, 2011). 본 발명자들은, 본 발명의 LSSC가 이러한 동일한 기전을 이용하여 T 세포 반응을 억제하는 지를 조사하고자 하였다.

미분획화한 LSSC를 야생형 또는 IFNg-/- 마우스로부터 금방 분리한 비장 세포와 함께 인큐베이션하였다. 비장 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. 그런 후, T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 활성화하였다. 도 9A는 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한 히스토그램을 보여준다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다.

PDPN+, PDPN- 및 미분획화한 LSSC를 무관련 공여체로부터 금방 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화하였다. 도 9B는 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한 히스토그램을 보여준다. 상층물을 수집하여, 산화질소의 변환 산물이 아질산염의 존재를 검사하였다.

이로써, LSSC가 야생형 T 세포에서와 물론 동일하게 IFNg-/- T 세포를 억제한다는 것이 확인되었다. PDPN+ 또는 PDPN- LSSC 서브개체군 또는 미분획화된 LSSC 어느 것도 검출가능한 수준의 산화 질소/아질산염을 상층액 분석에서 생성하지 않았다. LSSC는 새로운 IFNg 및 산화질소-비의존적인 기전을 이용하여 T 세포 증식을 억제하며, 따라서 마우스 PDPN+ 림프절 기질 개체군과는 상당한 차이가 있다.

림프 조질-유래 억제자 세포의 2종의 주 서브개체군들은 각각 활성화된 동종 T 세포의 증식을 억제한다.

도 10A에서, LSSC의 2종의 서브개체군들을 당단백질-36 (PDPN으로도 알려져 있음)의 발현 또는 결핍을 토대로 정제하였다. 이들 양 서브개체군들은 비-내피성 (CD31 음성)이고 비-조혈성 (CD45 음성)이었다.

PDPN+ LSSC, PDPN- LSSC, 또는 미분획화된 LSSC는 무관련 공여체로부터 신선하게 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 1:5 비율 (LSSC : T 세포)로 배양하였다. T 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화하였다. 도 10B는 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한 히스토그램을 보여준다. 비는 기질에 대한 비장 세포의 비율을 표시한다.

기질 세포 배양물 없이 자극한 혈액-유래 T 세포는 LSSC와 함께 배양한 세포 보다 CFSE가 더 많이 희석되는 것으로 관찰되었다. PDPN+ 및 PDPN- LSSC 서브개체군들 모두 T 세포를 동일하게 억제할 수 있다.

LSSC는 사전-활성화된 동종 T 세포의 분열을 정지시킨다.

LSSC의 몇몇 치료학적 사용시 면역 반응이 진행 중인 개체는 수혈 또는 이식이 필요할 것이다. 이에, LSSC가 사전-활성화된 T 세포를 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

PDPN+ LSSC PDPN- LSSC, 또는 미분획화된 LSSC는 무관련 공여체로부터 신선하게 분리하여 정제한 인간 혈액-유래 T 세포와 함께 배양하였다. T 세포를 세포 분열시 희석되는 CFSE로 표지하였다. T 세포를 PHA 및 IL-2로 활성화한 후, 2일간 분열하게 둔 다음, 일부 T 세포를 LSSC 상에 접종하여 재자극하거나, 또는 재접종하여 LSSC 없이 재자극하거나, 또는 재자극없이 재접종하였다. 도 11은 T 세포 항원 수용체의 발현을 통해 동정한 T 세포를 도시한 히스토그램을 보여준다. 비는 T 세포에 대한 LSSC의 비율을 표시한다.

2일간 자극하고 재접종한 후 다시 LSSC로 재자극한 T 세포는, 이것이 충분히 활성화되었고, 재접종하기 전에 수회의 세포 분열을 진행하였음에도 불구하고, 세포 분열이 정지되는 것으로 확인되었다 ("재접종하나, 재자극하진 않은" 대조군과 함께 도시됨). PDPN+ 및 PDPN- LSSC 서브개체군 모두 사전-활성화된 동종 T 세포를 동일하게 억제할 수 있다.

LSSC는 중증 이식 편대 숙주 질환에 걸린 마우스의 초기 사망을 유의하게 감소시킨다.

수여 마우스에 동종 골수 이식을 수행하였다 (분할-조사량 치사 조사 후, 전체 골수의 i.v. 주사). 중증 GVHD는, 동종반응성 T 세포를 포함하는 공여체 유래 비장 세포를 공동-주입함으로써 이식 시에 유도하였다. 인간 LSSC 1 x 10⁶개를 GVHD 유도 후 일정 시점에 복막내로 주입하였으며, 대조군 마우스에는 염수 (비히클)를 제공하였다. 생존성을 모니터링하였다.

마우스들 모두 비슷한 시기에 GVHD가 발병하였지만, LSSC를 투여받은 마우스는 초기 시점에 GVHD로 인한 사망율이 유의하게 감소되는 것으로 확인되어, LSSC가 면역 공격을 저하시키는 것으로 보인다. 이러한 초기 LSSC 투여 효과는 주입 후 3주간 지속되었으며, 3주째는 보호가 무력화되는 시기인 바, 재-투여가 처방될 수 있는 것으로 보인다. 중증 마우스에 LSSC를 나중 (24일)에 투여하는 경우에는 이환율 또는 사망율을 반전시키지 못하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 생체외에서 증폭시킨 마우스 림프절 기질은 마우스에서 급성 패혈증 쇼크로 인한 사망율을 낮춘다.

LSSC의 전사 특징

인간 LSSC의 전사 특징들을 표면 마커에 대한 유세포 측정과 분비된 인자에 대한 RT-PCR을 이용하여 입수하였으며 (도 13A), Affymetrix HuGene ST1.0 유전자 어레이를 이용하여 mRNA 트랜스크립톰 (transcriptome)을 입수하였다 (도 13B).

LSSC (검정선)의 대표적인 유세포 측정 프로파일 (도 13A)을 각각의 음성 염색 대조군 (회색)과 비교한 바, 간엽 마커 PDGFRa, 관용성 관련 단백질 PD-L1과 PD-L2, 근육-관련 단백질 ITGA7 및 림프 기관 기질의 특징적인 단백질 LTBR, IL7R 및 PDPN의 발현이 확인되었다. PDPN과 ITGA7은 벌크 LSSC의 아종에 의해 발현되는 것으로 보였다. 대체물 또는 유전자 명은 괄호 안에 나타낸다. RT-PCR을 통해, LSSC가 케모타인 CCL19 및 CCL21의 전사체를 발현한다는 것이 확인되었다 (양성 대조군으로 LTbR과 비교하여 나타냄).

유전자 어레이를 이용하여, 3개의 LSSC 샘플로부터 선별된 유전자의 전사를, 3개의 인간 골수 간엽 줄기 세포 샘플에 대한 공개된 데이타 (등재 코드 GM241199, GM241201, GM241203)와 비교하여, 분석하였다. 데이타 (도 13B)에 따르면, LSSC는, BM-MSC에 비해, PD-L2, LTbR, Itga7, Myh11을 높은 수준으로 발현하였다. LSSC와 MSC는 CXCL12, Thy1, IL7R을 비슷한 수준으로 발현하였으며, LYVE1, CD3G, PECAM1 (CD31), CD34, FCGR2B 및 PTPRC (CD45) 등의 계통-특이 마커에 대해서는 마찬가지로 음성이었다. MSC는 PD-L2를 발현하지 않으며, 이 단백질이 염증성 사이토카인인 IFNg에 노출시 유도될 수 없다는 것은, 기존에 보고된 바 있다.

LSSC의 형태 규명

소 태아 혈청이 첨가된 α-MEM에서 배양한 LSSC 배양물에서는 섬유모세포와 유사한형태가 관찰되었다 (도 14). 이는 종종 긴 돌기 (long process), 라멜로포디아 (lamellopodia), 사상위족 (filopodia), 러플형 리딩 에지 (ruffled leading edge) 및 국소 부착 (focal adhesion)을 보인다. 아울러, 림프절과 편도선에서 분리한 LSSC들은 표현형 측면에서 비슷하다 (도 19).

FRC는 치료 시점에 투여하였을 때 2종의 다른 마우스 모델에서 패혈증을 예방한다.

무균성 패혈증 모델과 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 패혈증 모델 둘다에서, FRC는 유의한 생존 이점을 나타내었다 (도 16). 도 16E는 FRC-처리한 마우스 혈액에서의 염증성 사이토카인의 수준 감소를 보여준다. 이들 염증성 사이토카인은 일반적으로 선천적인 면역 시스템과 관련되어 있다. 즉, FRC는 패혈증에서 선천적인 면역 시스템과 상호작용한다.

FRC는 결장염 사망을 예방한다.

결장염은, 정제한 네이티브 T 세포를 면역결핍 마우스에 주입하여 유도하였다. 마우스에서 질병의 신호가 나타나고 체중이 현저하게 감소되기 시작한 후 2주 후 (치료 시기)에 동종 FRC를 투여하였다. 염수-처리한 대조군과 비교하여, FRC는 2주부터 6주까지 매주 2회로 주입하고, 생존을 모니터링하였다. FRC는 생존에 유의한 효과가 있었다 (도 17).

인간 LSSC는 용해성 사이토카인 인자를 분비하며, 림프절과 편도선에서 분리한 세포는 용해성 인자를 통한 T 세포 억제에 비슷한 수준을 나타낸다.

배양한 인간 LSSC는 용해성 사이토카인 인자들을 다수 분비하는 것으로 나타났다 (도 18). 림프절과 편도선에서 분리한 LSSC들은 용해성 인자를 통한 T 세포 억제에 비슷한 수준을 나타내었다 (도 20).

고찰

1차 조직 (primary tissue)으로부터 재생가능한 조성의 살아있는 단일 세포 현탁물을 제조하는 것과 같이, 면역학 및 세포 생물학 분야에서 통례적으로 사용되는 기법들은, 림프절 기질에 적용하였을 때, 문제들이 발생한다. 이와 같이, 조직학 및 전-기관 PCR, 또는 림프구 관련 정보 판독 (lymphocytic readout)을 수반하는 생체내 시스템은 본 분야의 표준 기법들이다. 이들은 정상 상태의 관용 (steady-state tolerance) 및 면역에 있어 림프절 기질 세포 아종들의 역할과 관련된 몇가지 중요한 진보를 도출하였지만, 직접적인 생물학적, 의학적 관련성에 대해 파악하지 못한 의문들이 다수 존재하는 실정이다. 본 발명자들은, 현대 면역학적 기법과 세포 생물학적 기법들은, 이러한 드물고 정교한 세포 타입들에 이용하도록 개선하고 개조하는 것이, 이러한 의문을 해명하는데 필수적일 것이라고 생각하였다.

이러한 충족되지 못한 요구를 부각시켜보면, 특히 DN 기질이 거의 전혀 규명되지 않은 상태로 남아 있다. 몇몇 그룹들에서 현재 (동종이거나 아닐 수 있는) 이 비-조혈성 기질 세포 아종의 출현에 대해 보고하고 있지만 (Link et al., 2007, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010), 림프절 기질 니치 (stromal niche)의 >10%를 구성하고 있으며 Aire-발현성 세포 타입을 보유하고 있음에도 불구하고 (Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010), 거의 전반적으로 규명되지 않은 상태이다. 형태, 계통, 표면 표현형 및 기능과 같이 기본적인 특징들도 공표되지 않았다. 이러한 정보 부족은 림프절 기질 세포를 연구함에 있어 내재된 어려움을 직접적으로 표현해준다.

DN 세포 연구에 있어 이러한 한가지 문제는, 사멸 중이거나 또는 잘 염색안 되는 림프구가 CD45에 음성이거나 낮은 것으로 표시된다는 것인데, 이는 DN 기질과 동일한 표현형 (CD31^-포도플라닌^-)으로 게이팅한 기질 세포에서 확인된다. 이런 현상은, 진성 기질 아종들의 비율을 크게 왜곡시켜, 림프절 기질 니치의 가장 기본적인 비례 조성과 비슷한 수준으로 고정하기 어렵게 만든다. 실제, 기질은 림프절 세포의 1-2%에 불과하기 때문에, 생존성이 매우 높은 (생존성 >95%) 단일 세포 현탁물 내에서도 비-생존 림프구가 기질 보다 일반적으로 그 수가 많다. 본 발명의 실험에서는, 프로피듐 아이오다이드와 같이 죽은 세포를 염색시키는 것을 포함시켜, 분해 후 CD45의 수준이 낮은 것으로 보이는 세포가 부적절하게 제외되지 않게 하였다.

이런 이유로, 본 발명자들은, 기질을 재현가능하게 분리하기 위한 열쇠가, 치사성이 낮은 효소적 분해 프로토콜의 개발에 있다는 것을 알게 되었다. 디스파제, DNase I 및 콜라게나제 P의 조합을 이용함으로써, 기질 세포를 다수 생존성 >95%로 일반적으로 분리하게 되었다. 또한, 개별 마우스와 인간들 간에 각 기질 아종을 비교할 수 있었으며, DN 세포 및 MRC 등의 드문 아종들을 성공정으로 분리할 수 있게 되었는데, 이것은 향후 연구의 대상이 될 것이다. 고유한 또는 차별적으로 발현되는 표며 마커들에 대해서는 보고되지 않아, 조직학적으로 DN 기질을 동정하는 것은 아직까지 불가능하다. 하지만, 본원에 기술된 분류 전략을 이용하면, 이러한 희귀 아종의 정체를 파악하는데 필요한 비-편향된 어레이-기반의 방식을 수행할 수 있다.

마찬가지로, 본 방법은 1차 조직으로부터 직접 인간 림프절 기질 세포의 4가지 주 개체군을 분리할 수 있어, 정교한 임상 및 전-임상 연구를 위한 길을 열어준다. 마우스 림프절 기질 세포가 다수의 임상적으로 관련있는 자가-항원을 발현하며, 직접 이를 T 세포에 제시하여 이에 대한 면역학적 관용성을 유도한다는 것은 현재 잘 확립되어 있다 (Lee et al., 2007, Nichols et al., 2007, Gardner et al., 2008, Magnusson et al., 2008, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010). 동일 기전이 인간에서도 작동하는 것도 가능한 일이다. 실험을 통해, 논의가 되는 PTA의 끊임없는 전사 또는 펩타이드-MHC의 체류가 원인인지는 불명확하지만, FRC 및 LEC가 네이티브 T 세포에 PTA를 제시하는 능력을 보유하며, 배양시 생체내에서 보여지는 상호작용을 모방한다는 것이 입증된 바 있다 (Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010). 이러한 기법들을 사용하여, 이러한 문제와 인간 림프절 생물학에 관련된 다른 다수의 중요한 문제들을 해명할 수 있다.

나아가, 림프절에 대한 3D 배양 시스템 개발은 생체내 환경과 상호작용을 모방하는 고도로 제어된 실험 시스템을 구축가능하게 할 것이다. 본 발명에서는, DC 및 림프구가, 생체내에서 관찰되는 바와 같이, 용이하고 선호적으로 FRC 네트워크를 통해 시험관내에서 이동한다는 것을 확인하였다. 이러한 기법들은 특히 인간 세포를 이용한 연구에 적용가능하다.

연령이 동일한 어린 C57Bl/6 수컷 마우스들 간에 기질 세포 아종들에서 약간의 차이가 놀랍게도 확인되었다. 림프구 및 기질 간의 크로스-토크 (cross-talk)가 특정 기질 아종들을 증폭시키는데 필요한지를 테스트함에 있어, FRC, LEC, BEC 및 DN 기질이 Rag^-/- 마우스에 정상적인 비율로 존재하여, 이들의 발생 또는 증폭에 T 세포 또는 B 세포가 필요하지 않음을 보여준다는 것을 확인하였다. MRC (MadCAM-1⁺) 기질 아종은 유세포 측정 분석용으로 기존에는 분리된 바 없으며, 본 발명에서는 MRC가 포도플라닌⁺ CD31^- FRC 게이트 내에 아종을 형성한다는 것을 확인하였다. MRC는 FRC와 유사성을 나타내어 VCAM-1과 ICAM-1을 발현하고, 라미닌과 같은 ECM 성분을 방출하지만, 이는 부가적으로 CXCL13을 다량 생산하며, MadCAM-1의 발현을 통해 동정할 수 있다 (Katakai et al., 2008).

놀랍게도, MRC의 갯수가 Rag^-/- 마우스에서 유의하게 감소되었다. 세포 당 MadCAM 단백질 수준 역시 낮아졌다. 조직학적으로, MadCAM+ MRC는 피부-배액성 Rag^-/- 림프절에서 가시화되지만 (Katakai et al., 2008), MadCAM 발현과 MRC 갯수에 대한 수적 및 정량적인 유세포 측정 분석은 기존에는 불가능하였다. 이들 데이타는, 림프구가 실제 정상적인 MRC 개발에 필요하다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, Rag^-/- 마우스 유래 LEC 역시 낮은 비율이지만 MadCAM+ 세포로 발생하였으며, 세포 당 소량의 단백질이 관찰되었다. MRC 및 MadCAM+ LEC가 Rag^-/- 마우스에서 정상적으로 증폭하는데 실패하는지 또는 MadCAM을 상향 조절하는데에만 실패하는지는 아직까지 불명확하다. 또한, MadCAM+ LEC의 역할도 알려져 있지 않다.

MRC는 림포톡신 신호전달의 림프절 하류와 NF-κB2 전사 프로그램을 구축하는 (Mebius, 2003, Coles et al., 2010), LTo 세포와 동일한 표현형을 나타내기 때문에 (Katakai et al., 2008), MRC는 림프절 기질의 출생 후 유지와 재생에 역할을 할 수 있다는 가정이 설정되었다 (Katakai et al., 2008). 본 발명의 결과, MadCAM+ MRC의 정상적인 증폭 및/또는 성숙화는 FRC, BEC 및 DN 기질의 정상적인 증폭에 필요하지 않은 것으로 보인다. 하지만, MRC 기능 (예, 케모카인의 발현)과 MadCAM 발현이 반드시 연계된 것인지를 확인하기 위해서는 추가적인 기능적인 실험들이 필요할 것이다.

예상하지 못했던 점은, 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절의 FRC가 비율, 수 및 전사 프로파일 측면에서 현저하게 다르다는 것이었다. 본 발명에서는, 몇몇 중요한 사이토카인들과 케모카인: IL6, IL7, BAFF, CXCL9, CXCL10, IL1 수용체 보조 단백질 (IL1RAP), 액티빈 수용체 IIA, VEGFa, LIF, 및 cKIT-리간드들의 발현이 감소된 장간막 림프절에서, FRC의 수가 현저하게 적다는 것을 확인하였다. 통계적으로, 경로 분석에서, 이들 유전자들은 우연히 군집할 가능성은 거의 없는 것으로 나타났다. 이러한 차이가 선천적인 발생 차이의 결과로 생기는 것인지 또는 항원 노출 빈도나 용량 차이 등의 여러가지 염증성 신호에 노출된 결과로서 생기는 것인지를 확인하는 것에 흥미를 가지게 될 것이다. 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절은 특히 여러가지 미세환경 자극에 노출된다. 피부 경계들이 파괴되지 않는 한, 본 발명에서 피부-배액성 림프절에 존재하는 FRC들은 상대적으로 미생물 기원의 다량의 항원에 직면할 가능성은 매우 드물다고 할 수 있다. 하지만, 장간막 FRC는 장의 정상적인 기능을 통해 병원체 관련 분자 패턴의 공격에 계속적으로 노출되며, Treg 유도 및 경구 관용에 중요한 정상-상태 역할을 가진다 (Hadis et al., 2011). 이들의 일상 인자들이 발현 프로파일을 미정의 결과로 변형시키는 것으로 예상하는 것은 합리적이다.

피부-배액성 림프절과 장간막 림프절 간에 발생 차이가 보고되어 있다: 장간막 림프절 일체는 Cxcl13-/- 및 Cxcr5-/- 마우스에 존재하지만, 다수의 피부-배액성 림프절들은 빠져있거나 또는 특정 위치에서 가변적으로 발생한다 (Ansel et al., 2000). 마찬가지로, Ltb-/- 마우스는 장간막 림프절 (비록 비정상적으로) 발생하지만 피부-배액성 림프절은 다수 결핍되어 있다 (Koni et al., 1997). 림프절 발생은 배발생시에 착수되기 때문에, 이러한 결과는 CXCL13 또는 LTβ를 보완할 수 있는 사이토카인을 피부-배액성 림프절 보다는 출생 전 장간막 림프절에서 더 많이 이용할 수 있다는 것을 시사한다. 마찬가지로, 추정의 림프절 조직자 세포는, 장간막 림프절에 비해, 신생아의 피부-배액성 림프절에 더 낮은 비율로 존재한다 (Cupedo et al. J Imm 2004). 마지막으로, 피부-배액성 림프절을 장간막에 이식한 후, MadCAM^- BEC가 장간막 MadCAM+ 표현형으로 바뀌지 않는다는 것이 관찰되었는데, 이는 차이가 발생학적 차이이며, 장-유래 항원에 노출된 결과가 아니라는 것을 시사해준다 (Ahrendt et al., 2008). 또한, 최근 연구에서, 흥미롭게도, 이식된 말초 림프절과 장간막 림프절의 기질이 경구 관용성을 유도하는 유도력에 차이가 있을 수 있는 것으로 시사되었는데, 이는 이식 후 공여 세포에 의해 서서히 치환된, 캐리오버 조혈 세포가 영향력이 없는 것으로 추정된다 (Buettner et al., 2011).

6주령 마우스의 피부-배액성 림프절에서, 림프절에서 역할이 알려진 수종의 사이토카인들이 더 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 피부-배액성 림프절의 FRC에서는 IL6가 6배 상향 조절되었으며, 이는 복합적인 조절에 대상이 되는 사이토카인이다. 전-염증성 IL1에 노출된 후 면역반응 초기에 생산되는 경우, IL6는 강력한 면역자극성 인자이지만, TNF α 및 IL-1 신호전달의 둔화와 IL10의 상향 조절을 통해 항-염증성 기능도 발휘할 수 있다. IL10은 기질에 의해 발현되지 않았다 (데이타 도시 안함). 대신, 본 발명에서는 피부-배액성 림프절에서 IL1 수용체 보조 단백질 (IL1Rap)의 >3배 상향 조절을 확인하였는데, 이는 피부-배액성 림프절 FRC가 감염 초기에 IL6 생산을 증가시키는 능력을 가지고 있다는 것을 시사한다. 이에, 정상 상태 동안에는, 피부-배액성 림프절 유래 FRC는 또한 IL1Rap의 고친화성 결합 파트너인 IL1R1을 높은 수준으로 발현하였지만, 데코이 유사체인 IL1-RN은 발현하지 않았다 (Dinarello, 1996) (데이타 도시 안함). 이들 결과를 토대로, 본 발명자들은, FRC가 수시간 이내에 TLR3 신호전달에 반응한다고 기존에 발표하였으며 (Fletcher et al., 2010), 이는, FRC가 감염에 대해 신속하게 반응한다는 것을 의미한다. 또한, PDGF-수용체의 인산화와 세포 수축 자극의 수단으로서 (Hu et al., 1998, Zampetaki et al., 2005), 평활근 세포가 신장된 후 이에 의해 항-염증성 기능으로 IL6를 생산한다 (Pedersen, 2006)는 것도 중요한 지적이다. 마찬가지로, 진피의 근섬유모세포에서, IL6는 α 평활근 액틴을 조절하여 수축과 상처 봉합을 강화한다 (Gallucci et al., 2006). 근섬유모세포와 같이, FRC는 α 평활근 액티을 다량 발현하는 고도의 수축성 세포이다 (Link et al., 2007, 데이타 도시 안함). IL6은 피부-배액성 림프절 유래 FRC에서 또한 상향 조절되는 LIF와 수용체를 공유한다. IL6처럼, LIF는 오토크린 또는 파라크린 근육 세포 증식을 유도하는 수단으로서, 수축성 근세포에서 상향 조절된다. IL6, IL1Rap 및 LIF는 동정한 네트워크에서 피부-배액성 림프절 유래 FRC에 의해 가장 많이 상향 조절되는 유전자 3종이다.

림프구 기능에 대한 직접적인 관련성과 더불어, 본 발명자들은, IL7과 BAFF가 피부-배액성 FRC에서 2배 이상으로 상향 조절된다는 것을 확인하였다. IL7은 FRC의 공지된 생성물로서, 네이티브 T 세포를 유지하는 기능을 한다 (Link et al., 2007). BAFF는 B 세포의 강력한 생존 인자이며 공동-자극 활성 인자이다. 2차 림프성 장기에서, 비-조혈성 FDC에서 생산되는 것으로 알려져 있지만, 기존에 FRC에서 보고된 바 없다. 그러나, 기질 세포에 의한 림프절 바깥쪽으로의 BAFF의 발현은 잘 보고되어 있지만, 만성 염증을 일으키는 것으로 보이며, 종래에는 정상 상태 기질과 연계된 바 없다 (Mackay et al., 2009). 본 발명의 세포 분류법은, 전사 분석하던 중에 Fcγ 수용체의 발현 증거를 찾지 못했고, 림프절 기질 세포의 <1%가 FDC-M1 또는 CD35에 대해 양성으로 염색되는 것으로 (데이타 도시 안함) 확인되었기에, FDC를 포함하지 않았다. FDC는 B 세포 여포로만 한정되는 반면, FRC는 B 세포 여포 주변과 때로는 B 세포 여포까지 확장된다. 하지만, 이들 2가지 유형의 세포들 모두 공통 전구체로부터 발생하는 것으로 보인다 (Mebius, 2003). 이 결과는 이들 세포 유형들 간의 유사성을 언급한 리스트에 의해 뒷받침되며 확장된다.

특히, 본 발명의 결과는, CXCL9와 CXCL10이 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절에서 FRC에 의해 발현되는 것으로 나타났다. 이들 케모카인 둘다 활성화된 T 세포, B 세포 및 NK 세포에 의해 발현된 CXCR3를 통해 신호를 전달하며, 이들의 전사는 IFNγ, IFNα 및 기타 전염증성 자극에 의해 상향 조절된다 (Muller et al., 2010). 정상 상태 동안에 림프절에서의 CXCL10의 역할은 규명되지 않았지만, 일부 감염된 경우, 새롭게 활성화된 T 세포가 또한 Th1이 되게 하여, 편향된 미생물-적합 반응을 일으키는 기전으로, CXCL10이 림프절에서 Th1 림프구를 보유하는 중요한 역할을 한다 (Yoneyama et al., 2002). 그러나, 아직까지, CXCL10 생산은 림프구 내 성숙한 DC에서 동정되었을 뿐이다 (Yoneyama et al., 2002). 이들 데이타는, CXCL10 mRNA가 또한 정상 상태 FRC에 의해서도 발현되지만, 기능은 미정임을 보여준다.

CXCL9는 충분히 연구되진 않았지만, 암-관련 림프 조직과 배액성 림프절 유래 수지상 세포에서 관찰되었다 (Ohtani et al., 2009). 림프절에서 세포 이동에 대한 정상 상태 조절에서의 어떠한 역할도 보고된 바 없다.

흥미롭게도, 장간막 림프절과 피부-배액성 림프절에서 유래된 FRC는 내피 세포로의 신호절단에 관여하는 유전자들을 발현하였다. FRC는 정상 상태 조건에서 피부-배액성 림프절에 존재하는 VEGF의 1차 생산자인 것으로 알려져 있다 (Chyou et al., 2008). 놀랍게도, 피부-배액성 림프절 유래 FRC가 장간막 림프절 보다 VEGFa를 더 높은 수준으로 발현한다는 것을 확인하게 되었다. 실제, 장간막 림프절은 피부-배액성 림프절과 비교하여 비교적 적은 유전자 리스트를 상향 조절하였으며, 그 결과는 본 발명의 다중 이론에 대한 확고한 통계학적 교정을 이행하였을 때 기능적 경로로 맵핑되지 않았다. 그러나, 본 발명에서는 장간막 림프절에서 MadCAM 발현과 림프구 분리 (lymphosyte segregation)에 필요한 (Pabst et al., 2000) Nkx2-3 등의 공지된 장-관련 유전자의 상향 조절을 관찰하였으며; 아울러 Lrat, Tgm2, Meis1 및 Pltp의 상향 조절도 관찰하였다. 이들 유전자는 레티노익산 대사 사이클에 관여하거나 또는 레티노익산에 의해 상향 조절되어 (Matsuura et al., 1993, Cao et al., 2002, Galdones et al., 2006, Rebe et al., 2009), 장간막 림프구에서 가공되어 T 세포 상에 장-특이 회귀 표현형을 부여한다 (Iwata, 2009). 또한, 본 발명에서는 수종의 혈관이완인자 (Vipr2, Itih4, Npr1)와 혈관수축인자 (Agt)의 발현을 확인하였는데, 이는 FRC가 림프절 혈관과 활발하게 상호 교류한다는 것을 시사한다. 마찬가지로, 신경돌기의 생장을 유도하는 유전자들 (Efna5, gpr126, Tmem35 및 Ngf)의 상향 조절은 림프절의 정상적인 교감 신경을 유지하는데 있어 잠재적인 역할을 시사한다 (Panuncio et al., 1999). 이들 결과를 검증하기 위한 추가적인 실험이 필요할 것이다.

요컨대, 피부-배액성 림프절에서의 사이토카인과 케모카인의 발현 변형은, FRC에 의한 미세환경 조절에 대한 새로운 그림을 제시해준다. BAFF 및 CXCR3의 발현은 기존에 보고되지 않은 조혈계와의 크로스-토크 기전을 암시한다. 마찬가지로, IL-6, IL1Rap 및 LIF의 상향 조절은, 피부-배액성 림프절 FRC가 더욱 수축성일 수 있거나, 및/또는 이의 장간막 림프절 카운터파트 보다 신속하고 활발하게 분열하며, 마찬가지로 VEGFα를 증가된 수준으로 전사함으로써 보조를 맞추어 내피 세포에 영향을 미친다는 것을 시사해준다.

그러나, 이러한 전사 현상은 모든 FRC들에서 동일하게 발생하는 것이 아닐 수 있다. 림프절은 충분히 파악되지 못한 FRC 마이크로니치를 다수개 포함하고 있다. 이에 대해 가장 잘 연구된 것이 피질 T 세포 영역 FRC (때때로 TRC로 지칭됨)인데, 이것은 IL-7, CCL19, CCL21을 생산하며, 관 시스템을 유지할 뿐만 아니라 DC, T 세포 및 B 세포의 이동을 위한 스캐폴드로서 사용된다. 하지만, 섬유모세포 gp38+CD31^-은 림프절 전역에 존재하고 있으며, 피막하 영역에는 B 세포 여포들이 인접해있고; 주피 세포 (pericyte)로서 존재하며; 수질부 전역에 존재한다. 이들 여러가지 FRC 타입들을 구분하는 것은 아직 불가능하며, 이들이 동정된 사이토카인과 케모타인을 차별적으로 발현한다면, 피부-배액성 림프절과 장간막 림프절 간의 차이는 이들의 비율 차이를 수반할 수 있다.

요컨대, 이들 데이타는 림프절 기질 세포용으로 설계된 기법의 포괄적인 목록을 제시한다.

표 1: FACSAria 및 FACSAria IIu (BD Biosciences)에서 100 ㎛ 팁에 대한 저압 기질 분류 파라미터들의 샘플 범위. 독립 실험 n=4-8.

분류 파라미터	FACSAria	FACSAria IIu
진동수	23.1-25.9	19.2-21.6
진폭	24.0-45.6	8.6-13.5
위상 (Phase)	0-3	0
감쇠 (Attenuation)	On	Off
드롭 지연 (Drop Delay)	18.56-20.81	15.96-17.92
1차 드룹 (First Drop)	189-295	200-243
타겟 갭 (Target Gap)	6-10	10

표 2: 비-조혈 림프절 기질 세포를 규명하는데 사용되는 표면 마커들에 대한 효소 민감성. 배양하거나 또는 금방 분리한 기질을 효소와 함께 10분간 인큐베이션한 다음, 유세포 측정에 의해 표면 단백질 발현을 테스트하였다. 데이타는 독립 실험 n=3을 나타낸다.

표면 마커	콜라게나제 P	디스파제	트립신
CD31	+	+	-
CD40	+	+	+/-
CD44	+	+	+
CD45	+	+	+
CD80	+	+	-
CD140a	+	+	-
ICAM-1	+	+	+
Gp38	+	+	+
Thy-1	+	+	+/-
PD-L1	+	+	+
Sca-1	+	+	+
Lyve-1	+	+	+
VCAM-1	+	+	+
MadCAM	+	+	+

+ 표면 마커 존재 (비-민감성)

- 표면 마커 부재 (민감성)

+/- 표면 마커가 일부 절단됨 (부분 민감성)

표 3: 기능 유사성으로 그룹핑한, 피부-배액성 림프절 유래 FRC 보다 장간막 림프절 유래 FRC에서 상향 조절되는 유전자들. 피부-배액성 림프절 또는 장간막 림프절 유래 분류한 FRC의 유전자 발현을 마이크로어레이 분석을 이용하여 비교하였다. 유전자 선별은 발현 (SLN 또는 MLN에서 평균 발현 >120), 레플리케이트들 간의 낮은 변동 계수 (<0.05), 배수-변화 (피부-배액성 FRC 대비 장간막 림프절 FRC에서 2배 이상 증가됨) 및 P-값 (* <0.05; **<0.01; student's T test)을 토대로 진행하였다. 유전자들을 문헌 키워드 검색 결과를 토대로 그룹화하였다.

기능적 그룹	유전자	배수 변화	P-값
섬유모세포에서 세포 증식 조절	Wnt2b	8.13	**
	Slit2	6.06	**
	Sfrp4	3.13	**
	Wfdc1	2.77	**
	Mest	2.60	*
	Dhcr24	2.48	**
	Fgfr3	2.39	**
	Igfbp6	2.20	*
	Figf	2.17	**
	Bmp2	2.12	**
장-특이 인자에 의한 유도	Nkx2-3	5.75	**
	Lrat	4.67	**
	Tgm2	2.66	**
	Enpp3	2.48	*
	Kcnn3	2.24	*
	Meis1	2.13	**
	Pltp	2.07	**
세포외 매트릭스 또는 세포-세포 정션 상호작용	Mfap5	3.38	*
	Hmcn2	2.69	**
	Gpc3	2.34	**
	Itih4	2.34	**
	Cldn10	2.32	**
	Col14a1	2.26	**
	Loxl1	2.25	**
	Cilp	2.01	*
내피 또는 주피 세포의 크로스-토크	Ptgs1	3.17	**
	Vipr2	2.92	**
	Smoc2	2.79	*
	Itih4	2.34	**
	Npr1	2.33	*
	Figf	2.17	**
	Agt	2.03	**
뉴런의 크로스-토크	Efna5	2.58	**
	Gpr126	2.22	**
	Tmem35	2.04	**
	Ngf	2.00	**

본 발명은 전술한 설명에 열거되거나 또는 도면에 예시된 구성 성분 세트의 구축 및 배열에 대한 상세한 내용으로 한정되지 않는다. 본 발명은 다른 구현예로 구현하며, 다양한 방식으로 실시하거나 이행할 수 있다. 또한, 본원에 사용되는 표현과 용어는 설명하기 위한 목적일 뿐 한정되는 것으로 간주되지 않아야 한다. "비롯하여", "포함하는" 또는 "가지는", "함유하는", "수반하는" 및 이들의 변형 형태들은 이후에 열거된 항목과 이의 등가체 뿐만 아니라 추가적인 항목을 포괄하는 의미이다.

Claims (35)

1. 면역 반응을 억제하기 위한 조성물로서,
   분리된 섬유모 세망 세포 (FRC, fibroblastic reticular cell)를 개체에서 면역 반응을 억제하는데 유효한 양으로 포함하며,
   상기 FRC가 계대 배양된 것인, 면역 반응을 억제하기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 FRC가 생체외 증폭된 세포 (ex vivo expanded cell)인, 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 FRC에는 비-FRC (non-FRC)가 실질적으로 존재하지 않는, 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 개체에게 100,000 FRC/kg 이상의 함량으로 투여되는, 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 개체에게 1,000,000 FRC/kg 이상의 함량으로 투여되는, 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 FRC는 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 (adenoid) 및/또는 페이어판 (Peyer's patch) 중 하나 이상으로부터 유래되는, 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 FRC는 상기 개체에게 이식되는 2차원 또는 3차원 프레임워크 상에 또는 내에 존재하는, 조성물.
8. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 개체에게 정맥내, 복막내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주입에 의해, 또는 병소, 장기, 장기 피막, 지방 또는 림프절로의 국소 투여에 의해 투여되는, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 개체는 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 앓고 있는 개체인, 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환이 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환, 이식 편대 숙주 질환 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FRC가 상기 개체에 대해 자가, 동종 또는 이종인, 조성물.
12. 섬유모 세망 세포 (FRC)의 분리 방법으로서,
    효소 믹스의 조합 및 교반을 이용해 림프 조직 단편을 분해 (digesting)하는 단계 및 상기 FRC를 수집 및 계대 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 림프 조직 단편의 분해가
    (i) 상기 림프 조직 단편을 효소 믹스와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (ii) 상기 조직을 파이펫을 이용하여 교반한 다음, 큰 단편들이 침전되도록 인큐베이션하는 단계;
    (iii) 상층물은 제거하고, 모든 단편들이 분해될 때까지 단계 (i)과 (ii)를 반복 수행하는 단계를 포함하는 일련의 단계들로 수행되며,
    상기 FRC는 모든 상층물 분획들을 합한 다음, 원심 분리하여 세포 펠렛을 수득함으로써 수집되는, 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 성장 인자, 혈청, 혈소판 세포용혈물 및 항생제 중 하나 이상이 첨가된 기본 세포 배양 배지를 포함하는 배양 배지에서 배양되는, 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 1-10,000 세포/cm²의 밀도로 배양되는, 방법.
16. 제14항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 산소 분압 0.1-21%에서 배양되는, 방법.
17. 제14항에 있어서,
    상기 FRC는 FRC에 비-FRC가 실질적으로 존재하지 않을 때까지 배양되는, 방법.
18. 제14항에 있어서,
    상기 FRC는 기질 세포 (stromal cell)의 수가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 그 이상으로 증가할 때까지 배양되는, 방법.
19. 제12항에 있어서,
    상기 효소 믹스는 배양 배지, 디스파제, 콜라게나제 및 DNase I을 포함하는, 방법.
20. 제12항에 있어서,
    상기 FRC는 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 또는 페이어판으로부터 유래되는, 방법.
21. 면역 반응을 억제하기 위한 조성물로서,
    분리된 섬유모 세망 세포 (FRC)를 포함하며,
    상기 FRC가 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 분리된 것인, 면역 반응을 억제하기 위한 조성물.
22. 약학적 조성물로서,
    분리된 섬유모 세망 세포 (FRC)의 조성물을 포함하며,
    상기 FRC가 계대 배양된 것인, 약학 조성물.
23. 제22항에 있어서,
    상기 FRC는, 화학적, 기계적 및 전기적 세포 분리 공정 중 한가지 이상의 공정을 이용하여 림프 조직 단편을 처리한 다음 FRC를 수집함으로써, 분리되는, 약학 조성물.
24. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 FRC에 비-FRC가 실질적으로 존재하지 않을 때까지 수집한 세포를 배양함으로써 증폭되는, 약학 조성물.
25. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 CD140a 및 PD-L2를 공동-발현하는, 약학 조성물.
26. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 CD140a 및 LTBR을 공동-발현하는, 약학 조성물.
27. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 CD140a, PD-L2 및 LTBR을 공동-발현하는, 약학 조성물.
28. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 PD-L1, Thy-1, MADCAM-1, IL-7R 또는 ITGA7으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 림프성 마커를 발현하는, 약학 조성물.
29. 제22항에 있어서,
    상기 분리된 FRC는 IL-6, VEGF, 또는 IL-6와 VEGF를 발현하는, 약학 조성물.
30. 제22항에 있어서,
    상기 세포는 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 말, 돼지, 소 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택되는 종으로부터 분리되는, 약학 조성물.
31. 제22항에 있어서,
    상기 세포는 시험관내에서 T 세포의 증식을 억제하는, 약학 조성물.
32. 제23항에 있어서,
    상기 FRC는 림프절, 비장, 흉선, 편도, 인두편도 또는 페이어판으로부터 분리되는, 약학 조성물.
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제

Images