CN104349785A - 人淋巴系器官源性抑制性基质细胞的分离和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抑制免疫反应的方法。所述方法涉及向需要此类治疗的受试者投予有效抑制所述受试者的所述免疫反应的量的分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞LSSC。本发明还涉及一种通过使用酶混合物与搅动的组合来消化淋巴系组织片段，然后收集LSSC，从而分离LSSC的方法。本发明还提供包含LSSC的医药制剂。
Description
相关申请案
本申请案依据35U.S.C.§119(e)主张2012年3月21日申请的美国临时申请案号61/613,697的权益，所述申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。
联邦赞助的研究
本发明是根据NIH拨款DK074500、K01DK087770和AI045757在政府支持下作出。因此，美国政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
免疫抑制药物被用于抑制或防止免疫系统的活性，从而治疗某些疾病。临床上，其被用于治疗或预防多种病况，例如预防移植的器官和组织(例如骨髓、心脏、肾、肝等)的排斥反应，及治疗炎症性疾病或自体免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣和炎症性肠病。当前被批准用于治疗慢性炎症性疾病的免疫抑制药物需要常常投予，并且带有显著副作用，包括肾毒性和发病的风险。
尽管已经描述免疫抑制性基质细胞类型(例如间充质基质细胞)，但其定义不明确，并且在临床试验中无法满足主要功效终点。此外，由于难以成功分离基质细胞，故这些细胞的分离仍是个问题。归因于由不想要的免疫活性引起的病况的严重程度和迹象，例如自体免疫性或炎症性疾病，故特别需要开发出这些疾病的有效治疗。
发明内容
在一些方面，本发明涉及以下发现：从淋巴结分离的基质细胞可抑制免疫反应。淋巴结源性基质细胞抑制免疫反应的能力与其已知的吸引免疫细胞的能力相结合使得其成为一种抑制受试者中的免疫反应的有效工具。因此，本发明的一些方面涉及一种用于抑制免疫反应的方法，所述方法是通过向需要此类治疗的受试者投予有效抑制所述受试者的所述免疫反应的量的分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)实现。在一些实施例中，投予受试者的LSSC是离体扩增的细胞。在一些实施例中，投予所述受试者的LSSC实质上不含非LSSC。在一些实施例中，向所述受试者投予至少10万个LSSC/kg。在一些实施例中，向所述受试者投予至少100万个LSSC/kg。
所述LSSC可从以下组织中的任一种或组合获得：淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体及派尔集合淋巴结(Peyer's patch)。所述LSSC相对于所述受试者可以是自体的、同种异体的或异种异体的。
在一些实施例中，所述LSSC是在植入所述受试者中的二维或三维构架之上或之中。在一些实施例中，所述LSSC是通过静脉内、腹膜内、动脉内、皮下或肌肉内注射或通过局部投予到病变、器官、器官囊、脂肪或淋巴结中来向所述受试者投予。
需要治疗的受试者是指患有例如自体免疫性或炎症性疾病的受试者。自体免疫性或炎症性疾病的实例包括(但不限于)类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病及败血病。
根据本发明的一个方面，提供一种分离LSSC的方法。所述方法包含使用酶混合物与搅动的组合来消化淋巴系组织片段，并且然后收集所述LSSC。
所述淋巴系组织片段的消化可以一系列步骤进行，所述步骤包含：
(i)将所述淋巴系组织片段与酶混合物一起培育；
(ii)使用移液管搅动所述组织，随后培育以使较大片段沉降；
(iii)取出上清液并重复步骤(i)和(ii)，直到所有片段都消化；并且
其中通过汇集所有上清液部分，随后离心以获得细胞团粒来收集所述LSSC。
在实施例中，使所述分离LSSC在包含补充有生长因子、血清、血小板溶解产物和抗生素中的一或多种的基础细胞培养基的培养基中生长。在实施例中，所述分离LSSC可以按1-10,000个细胞/平方厘米的密度生长。在实施例中，所述分离LSSC是在0.1-21％的氧分压下生长。在一些实施例中，所述LSSC可生长直到所述LSSC实质上不含非LSSC。在一些实施例中，使LSSC生长直到基质细胞的数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或更多。在一些实施例中，通过去除造血细胞或其它非基质细胞，或通过使细胞群在有利于基质细胞生长超过非基质细胞生长的条件下生长，来使含有LSSC的群体富集LSSC。所述条件描述于本文中。
在一个实施例中，所述酶混合物包含培养基、分散酶、胶原酶和DNA酶I。所述LSSC可来源于淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体和/或派尔集合淋巴结。在一些实施例中，使用本文所述的方法分离LSSC可用于抑制受试者中的免疫反应。
根据本发明的一个方面，提供一种包含分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)的组合物。所述LSSC可使用上述方法分离。
根据本发明的一个方面，提供一种医药制剂，其包含分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)的组合物。可通过使用化学方法、机械方法和电细胞分离方法中的一或多种处理淋巴系组织片段，并且然后收集LSSC，来分离LSSC。
在一些实施例中，所述分离LSSC是通过细胞培养扩增的。在一些实施例中，所述分离LSSC是离体扩增的细胞。在一些实施例中，所述分离LSSC是通过使所收集的细胞生长直到所述LSSC实质上不含非LSSC来扩增的。
在一些实施例中，所述分离LSSC共同表达CD140a和PD-L2。在一些实施例中，所述分离LSSC共同表达CD140a和LTBR。在一些实施例中，所述分离LSSC共同表达CD140a、PD-L2和LTBR。在一些实施例中，所述分离LSSC表达至少一种选自由以下各项组成的群组的其它淋巴系标记物：PD-L1、Thy-1、MADCAM-1、MYH11、IL-7R或ITGA7。在一些实施例中，所述分离LSSC表达至少一种选自由IL-6、CCL19、CCL21或VEGF组成的群组的因子。
所述LSSC可从选自由以下组成的群组的物种分离：人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、猪科动物、牛科动物及啮齿动物。所述LSSC可在体内或体外抑制T细胞增殖。
本发明的实施例和方法可各自独立地或组合实施。另外，本文中使用的措辞和术语都是出于说明的目的，并且不应视作限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在涵盖其后所列各项和其等效物以及其它各项。
本发明的这些和其它方面，以及各种益处和效用参照具体实施方式将显而易见。应了解，本发明的每个方面均可涵盖各种实施例。
本申请案中所标识的所有文献都以全文引用的方式并入本文中。
附图说明
图1显示了汇集的鼠类淋巴结基质细胞消化和制备用于细胞分选的示意图。1.将酶混合物(含0.8mg/ml分散酶、0.2mg/ml胶原酶P、0.1mg/ml DNA酶I的RPMI-1640)添加到组织中，在37C水浴中培育。2.在10-20分钟(参看方法)之后，使用1ml移液管搅动淋巴结片段，然后培育直到片段沉降。3.取出含有释放的细胞的上清液，对其进行离心并将其在冰上储存。4.重复步骤1-3，直到所有片段都完全消化(不超过60分钟)。5.汇集所有上清液部分，离心，过滤并计数。6.添加抗CD45微珠，在4℃下于转轮上培育。7.使用MACS或AutoMACS耗尽CD45+细胞，计数。8.用抗体对富集的CD45-基质染色；在20psi下使用100μm吸头分选达到高纯度。
图2显示了用于分离淋巴结基质细胞亚群的低死亡率方法的验证。图2A显示了使用低死亡率酶消化方法制备的单细胞悬浮液的活力。n＝6，平均值+标准偏差。图2B显示了从个别小鼠的皮肤引流或肠系膜淋巴结新鲜分离的淋巴结基质细胞亚群的典型流式细胞分析图。图2C显示了在鼠类淋巴结的冷冻切片上原位鉴别的淋巴结基质细胞亚群。顶图：T细胞区FRC(肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31-)和高内皮小静脉(肾小球足突细胞膜粘蛋白-CD31+，呈立方形的形态)。HEV的两个实例是使用箭头指示。中间图指示髓LEC(肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31+)和大髓血管(肾小球足突细胞膜粘蛋白-CD31+)。髓淋巴管使用箭头显示。底图：囊传入LEC(Lyve1+MadCAM+)、MRC(囊下，Lyve1-MadCAM+)和FDC(滤泡，Lyve1-，MadCAM+)。共定位覆盖图在合并图像上以白色显示。原始放大倍率：200x。图2D显示了经消化并染色用于流式细胞分析的人淋巴结(非肠系膜来源)。点图代表了n＝4个独立实验。
图3展现淋巴结在基质细胞组成方面显示位点特异性变化。对来自个别C57Bl/6小鼠的淋巴结进行消化并染色以用于流式细胞分析。图3A显示了淋巴结细胞结构。图3B显示了CD45阴性淋巴结基质细胞亚群的比例。图3C显示了淋巴结基质细胞亚群的数量。图3D展现以占总FRC或LEC的比例显示的MadCAM+细胞。图3E显示了MadCAM+FRC或LEC的总数量。图3F显示了从年龄相配的Rag-/-或WT(B6)小鼠分离的皮肤引流淋巴结的细胞结构。图3G显示了来自年龄相配的Rag-/-或WT小鼠的淋巴结基质的数量。图3G显示了来自年龄相配的Rag-/-或WT小鼠的淋巴结基质的数量。图3H显示了在年龄相配的Rag-/-或WT小鼠的SLN中MadCAM+FRC(MRC)或LEC的比例，或图3I显示了其数量。这些图代表n＝5只小鼠。图3J显示了在MRC或MadCAM+LEC中MadCAM染色的平均荧光强度(MFI)。WT＝野生型。*P<0.05；**P<0.01曼-惠特尼U测试(Mann-Whitney U Test)。n＝5-10只小鼠来自2-3个独立实验。
图4显示了淋巴结基质细胞富集和分选。在图4A中，对来自6-10只C57Bl/6小鼠的皮肤引流淋巴结进行酶消化并使用autoMACS富集CD45-基质细胞。对添加到柱中(输入)和从柱重新得到(输出)的CD45-基质的数量作图。数据描绘了n＝5个独立实验。在图4B中，计算了有关基质的autoMACS富集的基质细胞产率百分比。图4C显示了autoMACS富集之前和之后基质细胞的流式细胞分析图。图4显示了主要淋巴结基质细胞亚群的分选策略和分选后纯度。点图针对CD45-碘化丙啶-基质进行门控。
图5显示在来自皮肤引流淋巴结的鼠类FRC中细胞因子的位点特异性转录上调。图5A显示了比较从皮肤引流淋巴结(SLN)或肠系膜淋巴结(MLN)分选的FRC的微阵列分析。点图描绘了对于15,486个所选探针，SLN相对于MLN的P值与倍数变化的关系。在SLN中上调的探针以红色显示，而在MLN中上调的探针呈蓝色；(P<0.05并且倍数变化>2；t测试)。n＝4-5个独立重复实验。图5B显示在SLN中富集的编码细胞因子和细胞因子受体的基因(KEGG路径mmu04060；P<0.015；利用本杰明校正(Benjamini correction)的经修改费希尔氏精确检验(modified Fisher's exact test))。显示了与MLN相比较，在SLN中平均表达量的倍数增加。
图6显示了鼠类FRC的三维(3D)培养物模拟体内功能。在图6A中，对淋巴结进行消化，并将单细胞悬浮液放入培养物中保持5天，然后进行胰蛋白酶处理并染色用于流式细胞剖析。使用CD45鉴别基质细胞(左图)，然后用CD31和肾小球足突细胞膜粘蛋白进行染色(右图，针对CD45-基质进行门控)。具体地说，CD45是造血细胞的标记物，并且不存在于基质细胞上。在图6B中，针对FDC-M1或相关同型对照对培养的基质细胞染色。图3C显示在使用高胰蛋白酶或低胰蛋白酶方案采集的培养的基质细胞中的CD31染色情况。点图表示n＝3个独立实验。在图6D中，采集培养的基质细胞，然后使用autoMACS进行纯化。将FRC、LEC或混合的FRC和LEC接种于2D(塑料组织培养板)或3D(基质胶和胶原蛋白凝胶)中，并且再培养3天，随后成像。原始放大倍率10x。图像表示n＝2个独立实验。在图6E中，使用了F-肌动蛋白和DAPI来对2D或3D中纯化的FRC染色以突出网络。图像表示n＝3个独立实验。(F)在含或不含PP2的96孔板中，将纯化的FRC放入3D培养物中。24-36小时之后，对凝胶收缩进行定量。图像代表了n＝3个独立实验。直方图描绘了平均值+标准偏差，P<0.05，t测试。在图6G中，将纯化的FRC放入3D中与纯化的树突状细胞(DC)或B细胞一起培养，然后每90秒连续获取图像。上图显示了来自所捕捉的图像的照片，原始放大倍率：20x。下图显示了图像中的基质细胞和相关迁移的白细胞的草图。在图6H中，对人淋巴结进行消化，并将单细胞悬浮液放入培养物中保持7天，然后进行胰蛋白酶处理并染色用于流式细胞剖析。
图7显示，人淋巴系组织源性抑制细胞抑制活化的同种异体脾细胞的增殖。将未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的人脾细胞一起培养。脾细胞用CFSE(当细胞分裂时稀释的一种荧光染料)标记。使用PHA和IL-2活化脾细胞群内的T细胞。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。
图8显示，人LSSC抑制活化的异种异体T细胞增殖。将未分级分离的LSSC与新鲜分离的小鼠脾细胞一起培养。脾细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。然后使用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化T细胞。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。
图9显示，LSSC经由新颖机制抑制T细胞增殖。在图9A中，将未分级分离的人LSSC与来源于野生型或IFNγ-/-小鼠的新鲜分离的脾细胞一起培养。脾细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。然后使用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化T细胞。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。在图9B中，将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC和未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞一起培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。收集上清液并测试亚硝酸盐(一氧化氮的转化产物)的存在。
图10显示，两个主要的人淋巴系组织源性抑制细胞亚群各自抑制活化的同种异体T细胞的增殖。在图10A中，基于糖蛋白-36(又称为PDPN)的表达或缺乏来纯化两个LSSC亚群。两个亚群均为非内皮细胞(CD31阴性)并且非造血细胞(CD45阴性)的。在图10B中，将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC或未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞以1:5的比率(LSSC比T细胞)培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。
图11显示，人LSSC停止预先活化的同种异体T细胞的分裂。将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC或未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞一起培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞，使其分裂2天，并且然后将一些T细胞再接种到LSSC上并进行再刺激，或在无LSSC情况下进行再接种和再刺激，或进行再接种而不进行再刺激。柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示LSSC与T细胞的比例。
图12显示，人LSSC使患有严重移植物抗宿主疾病的小鼠的早期致死率显著降低。使受体小鼠接受同种异体骨髓移植(分剂量致死照射，随后静脉内注射全骨髓)。在移植时，通过共注射含有同种异体反应性T细胞的供体来源的脾细胞来诱发严重GVHD。在诱发GVHD之后的多个时间点，腹膜内注射1×106个人LSSC，而对照小鼠接受生理盐水(媒剂)。监测存活率。
图13显示LSSC的转录特征。使用针对表面标记物的流式细胞分析和针对分泌因子的RT-PCR(图13A)，以及使用昂飞人基因ST1.0(Affymetrix HuGene ST1.0)基因阵列获得mRNA转录组(图13B)来获得人LSSC的转录特征。
图14显示人LSSC的形态特征。在补充有胎牛血清的α-MEM中生长的培养的LSSC显示类成纤维细胞形态。其通常展现较长过程，板状伪足、丝状伪足、有褶皱的前导端及粘着斑。原始放大倍率：100x。
图15显示离体扩增的小鼠淋巴结基质使急性败血性休克的致死率降低。
图16显示，在2种不同的小鼠模型中，鼠类FRC当在治疗时间点投予时防止败血病。在图16A中，用LD100剂量的LPS处理3-6周龄的幼C57Bl6/J小鼠，LPS是一种多糖，其形成细菌细胞壁的一部分并且引起强烈的全身免疫反应。由于此模型中没有活动性感染，故此模型称为“无菌败血病”。小鼠接受LPS之后4小时，用含FRC的生理盐水或作为对照的生理盐水对其进行处理。所述曲线图描绘了存活率％随时间的变化。在图16B中，如图16A中所详述，在极老小鼠(18-24个月大)中诱发无菌败血病，随后在4小时后投予FRC或生理盐水。监测存活率。在图16C中，给与幼小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)败血病，其涉及用针穿刺肠两次以使粪便物漏泄到腹膜腔中，引起严重感染，所述感染在24小时内发展成败血病。此模型模拟了阑尾破裂、枪伤或其它肠外伤。在CLP之后4小时投予自体FRC。在图16D中，给与幼小鼠CLP败血病并用抗生素处理。如所指示，在CLP之后4小时，小鼠接受生理盐水、同种异体FRC或同种异体MSC。MSC(间充质基质细胞)用作基于细胞的负对照物。MSC是一种抑制性基质细胞类型，但若干作者已显示，当作为同种异体疗法在治疗时间点(败血病损害之后>60分钟)投予时，其在败血病中的作用极小或不存在(尼密斯(Nemeth)等人,2010；梅(Mei)等人,2010)。我们的结果类似地显示投予MSC并无总体存活率益处，而同种异体FRC赋予显著的存活率益处。在图16E中，在CLP之后16小时对图16D中的小鼠进行评估。测量血浆中关键细胞因子的浓度，比较接受生理盐水或同种异体FRC的小鼠与未处理(无败血病)小鼠。虚线表示可靠检测的下限和上限。
图17显示鼠类FRC防止结肠炎死亡率。通过将纯化的天然T细胞注射到免疫缺陷小鼠中来诱发结肠炎。小鼠针对未知抗原(随着人类疾病而出现)而发展T细胞介导的炎症，引起显著体重减轻、结肠肥大及死亡。这是人类慢性结肠炎或克罗恩氏病(Crohn's disease)的模型。在2周时，即在小鼠开始显示疾病病征并且体重显著减轻(治疗时程)后，投予同种异体FRC。从第2周到第6周，每周两次注射FRC，并与生理盐水处理的对照组相比较。监测存活率。
图18显示人LSSC分泌可溶性细胞因子受体。在无刺激或不添加异源因子情况下，在含BSA的DMEM中培养人LSSC。在接种之后23小时，按照制造商的说明书，使用卢米尼克斯公司(Luminex Corporation)的MAGPIX系统检测培养基中的可溶性细胞因子受体蛋白。可溶性细胞因子受体可在体内结合游离细胞因子并且防止其受促炎性功能影响。
图19展现从淋巴结和扁桃腺分离的LSSC在表型上是类似的。通过流式细胞分析针对标识符的表面表达来评估来源于淋巴结或扁桃腺的人LSSC。所有细胞都是CD45阴性并且CD31阴性的。
图20显示，从淋巴结(图20A和图20B)和扁桃腺(图20C和图20D)分离的LSSC显示相当水平的经由可溶性因子引起的T细胞抑制。用每当细胞分裂时稀释的CFSE对来源于人血液的同种异体T细胞进行标记。然后，在从淋巴结或扁桃腺分离的hLSSC存在或不存在下，使用PHA和hIL-2使T细胞活化。hLSSC存在于细胞内，或通过0.4μm的曲斯威尔膜(transwell membrane)从T细胞物理分离，所述膜允许可溶性因子通过但细胞不能通过。显示了在存在和不存在曲斯威尔情况下，当以不同的hLSSC比T细胞比率培育时分裂一次、两次、三次或不分裂的T细胞％。由可溶性因子引起的抑制％计算如下：在存在曲斯威尔情况下分裂的T细胞/在不存在曲斯威尔情况下分裂的T细胞×100。
具体实施方式
在一方面，本发明涉及分离的淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)。本文描述了以商业上适用的方式分离并离体扩增LSSC的方法、包含LSSC的新颖组合物，及LSSC的用途，特别是在抑制自体、同种异体和异种异体免疫反应方面的治疗应用。
本发明人发现，来自淋巴结的基质细胞可抑制免疫系统的活性。此外，淋巴系组织源性基质细胞吸引免疫细胞，这不是其它免疫抑制性基质细胞群的已知特征。淋巴系组织源性基质细胞吸引免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞)的能力结合其免疫抑制功能一起使得其成为用于抑制受试者中的免疫反应的意外地有效治疗工具。LSSC可单独或与其它免疫抑制性药物一起用于抑制T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞和巨噬细胞的活性。
淋巴结是位于体内淋巴管相交处的重要次级淋巴器官，允许抗原呈递细胞与天然T细胞和B细胞之间的高效相互作用并促进免疫反应的有效起始(沃诺克(Warnock)等人,1998,米布斯(Mebius),2003,片贝(Katakai)等人,2004a,片贝等人,2004b,赛希特(Sixt)等人,2005,贝杰诺夫(Bajenoff)等人,2006,乔恩特(Junt)等人,2008)。淋巴结基质细胞还在促进天然T细胞维持方面起到至关重要并且可论证地未得到正确评价的作用(林克(Link)等人,2007)。
可解离淋巴结并且使所得细胞在培养物中生长。“淋巴系组织源性抑制性基质细胞”是指存在于淋巴系组织中所有细胞类型，其粘附到组织培养皿上并且可维持一定长度的时间。培养的细胞可以是异源群体并且可由驻留在淋巴结内的大多数细胞构成，例如成纤维细胞性网状细胞(FRC)、滤泡性树突状细胞(FDC)、淋巴内皮细胞(LEC)、血液内皮细胞(BEC)及边缘网状细胞(MRC)。培养的细胞还可为同源群体，或FRC、FDC、LEC、BEC和/或MRC的任何所选组合。在一些实施例中，使用本文所述的方法分离并离体扩增LSSC。所述LSSC可来源于皮肤或肠系膜淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体和/或派尔集合淋巴结。LSSC不含或耗尽造血LSSC。在一些实施例中，LSSC来源于选自由以下组成的群组的物种：人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、猪科动物、牛科动物及啮齿动物。
截然不同的基质亚型细胞赋予淋巴结的结构并且维持每个小生境。T细胞区成纤维细胞性网状细胞(FRC)表达趋化因子CCL19和CCL21以吸引T细胞和树突状细胞(DC)，并且产生由胶原蛋白和细胞外基质构成的复杂网状物供这些细胞在其上蠕动(安赛尔(Ansel)等人,2000,卢瑟(Luther)等人,2000,片贝等人,2004b,贝杰诺夫等人,2006,林克等人,2007,沃尔夫(Woolf)等人,2007)。与FRC类似但专用于B细胞吸引的滤泡性树突状细胞(FDC)是一种专用于B细胞吸引和抗原呈递的稀少的基质细胞亚群。FDC仅在B细胞滤泡中发现，其通过CXCL13分泌产生(赛斯特(Cyster)等人,2000)。淋巴结囊是基本上由淋巴内皮细胞(LEC)构造的一个扩大的淋巴管，这些LEC将间质液带到淋巴结并将其排空到实质中。其经由副皮质和皮质过滤，最终到达骨髓中的传出淋巴，传出淋巴将淋巴液再向上游输送(米布斯,2003,维拉德-默克(Willard-Mack),2006)。血液内皮细胞(BEC)构造皮质血管和毛细血管，包括专用于吸引血流中的天然T细胞的高内皮小静脉(米布斯,2003,维拉德-默克,2006)。
文献中已报道若干其它基质细胞亚群，但研究不多，并且其谱系和主要功能尚未确定((弗雷彻(Fletcher)等人,2011)。边缘网状细胞(MRC)是在囊下窦的皮质面处生长的产生CXCL13的基质亚群(片贝等人,2008)。其起源未知，不过这些细胞显示出与FRC的相似性，包括肾小球足突细胞膜粘蛋白表达(片贝等人,2008)。在脾中，类似基质细胞亚群对于未成熟B细胞迁移到滤泡中很重要(安赛尔等人,2000)。假定MRC表示淋巴系组织的组织者(LTo)细胞亚群的出生后等效物(片贝等人,2008)，其负责淋巴结组织器官发生(寇勒(Coles)等人,2010)。事实上，已经令人信服地显示，出生后肾小球足突细胞膜粘蛋白+脾基质能够通过与造血淋巴系组织诱导细胞相互作用而再生(斯坎德拉(Scandella)等人,2008)。
LSSC是根据本发明使用以抑制免疫反应。因此，本发明的方面涉及用于抑制免疫反应的方法，所述方法是通过向需要此类治疗的受试者投予有效抑制所述受试者的所述免疫反应的量的分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)实现。
如本文所使用，“分离的”是指将基质细胞群与其它非基质细胞群分开。分离可通过分开细胞的任何程序实现，例如生长条件、纯化技术(例如使用磁珠)、细胞分选或其它类似技术。在一些实施例中，使用本文所述的方法分离LSSC。
如本文所使用，“抑制”意思指使免疫反应的明显表现的程度、或严重性、或范围、或持续时间降低，包括例如T细胞或B细胞活化的减少，以及体液和细胞介导的反应的减少。“抑制”可例如通过检查在LSSC存在或不存在下T或B细胞分裂的存在或速率；检查在LSSC存在或不存在下免疫细胞对细胞因子的释放；测量在LSSC存在或不存在下抗体的产生；或测量在LSSC存在或不存在下CTL的功能来进行测量。同样，免疫反应的抑制可例如通过测定炎症或与所治疗的疾病相关的其它症状的减少，通过症状进行测量。免疫反应的“抑制”不需要完全消除或防止免疫反应的这些表现中的任一种，而是程度、或严重性、或范围、或持续时间的降低，这具有临床或其它实践意义。在一个实施例中，抑制是通过检查在LSSC存在或不存在下预先活化的同种异体T细胞的细胞分裂速率来测量。在一个实施例中，抑制是通过检查在LSSC存在或不存在下患有移植物抗宿主疾病的小鼠的致死率来测量。在一个实施例中，抑制是通过检查小鼠中急性败血性休克的致死率来测量。
在一些实施例中，需要此类治疗的受试者患有自体免疫性或炎症性疾病。
术语‘自体免疫性或炎症性疾病’是指这样一些疾病状态和病况，其中患者的免疫反应是针对患者自身的成分，从而导致不合需要并且通常可怕的使人虚弱的病况。如本文所使用，‘自体免疫性或炎症性疾病’打算另外包括自体免疫性病况、综合症等。自体免疫性或炎症性疾病的实例包括(但不限于)类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病及败血病。
在一些实施例中，需要治疗的受试者是被鉴别为患有上述病况中的一或多种的受试者，即，所述受试者已被医师(例如使用所属领域中众所周知的方法)诊断为患有上述疾病或病况。在一些实施例中，需要治疗的受试者是怀疑患有或发展上述疾病或病况的受试者，例如呈现指示上述疾病或病况的一或多种症状(例如极度疲劳或关节疼痛)的受试者。在一些实施例中，需要治疗的受试者是具有发展自体免疫性或炎症性疾病的一或多个风险因子的受试者。风险因子包括(但不限于)性别、年龄、遗传倾向性、先前的自体免疫性或慢性炎症性疾病事件及生活方式。术语“需要治疗的受试者”另外包括曾经患有上述疾病或病况但其症状已改善的人。
在一些实施例中，需要治疗的受试者患有或怀疑患有自体免疫性或炎症性疾病。受试者可呈现例如异常的自体抗体滴度。
受试者是一种动物，通常为哺乳动物。在一方面，受试者是狗、猫、马、绵羊、山羊、母牛或啮齿动物。在重要实施例中，受试者为人类。
LSSC是以有效量投予。有效量是足以提供医学上需要的结果的剂量并且可由所属领域技术人员使用常规方法确定。在一些实施例中，有效量是引起所治疗的病况的任何改善的量。在一些实施例中，有效量可取决于所治疗的疾病或病况的类型和程度和/或一或多种其它治疗剂的使用。然而，所属领域技术人员可例如基于体外和/或体内测试和/或其它化合物剂量知识确定所使用的治疗剂的适当剂量和范围。
当投予受试者时，治疗剂的有效量当然将取决于所治疗的特定疾病；疾病的严重程度；个别患者参数，包括年龄、身体状况、体格和体重、同时治疗、治疗频率和投药模式。这些因素是所属领域技术人员众所周知的并且可仅通过常规实验确定。在一些实施例中，使用最大剂量，也就是说，根据合理医学判断的最高安全剂量。
在自体免疫性或炎症性疾病的治疗中，有效量是使疾病进展减慢、停止疾病进展或使疾病进展逆转的量。有效量包括使与自体免疫性或炎症性疾病相关的一或多种症状减慢、减少、抑制、改善或逆转所需的量。在一些实施例中，这些术语是指使一或多个关节的肿胀减轻，或使与自体免疫性或炎症性疾病相关的疼痛、疲劳和/或发烧减少。在一些实施例中，这些术语是指使与自体免疫性或炎症性疾病相关的循环自体抗体的水平降低。在一些实施例中，这些术语是指人类PASI评分的降低。在一些实施例中，这些术语是指人类总体评估评分的改善。
在一些实施例中，基于每公斤受试者以一或多次剂量投药将至少10万个LSSC投予受试者，持续一天或数天(当然取决于投药模式和以上论述的因素)。在一些实施例中，基于每公斤受试者，将至少100万个LSSC投予受试者。在一些实施例中，基于每公斤受试者，将至少1000万个LSSC投予受试者。治疗剂的实际剂量水平可变化以获得对于特定患者、组合物和投药模式有效实现所需的治疗反应的量。所选剂量水平取决于特定化合物的活性、投药途径、所治疗的组织和所治疗的患者的先前病史。然而，以低于获得所需治疗成果所需水平的水平的化合物剂量起始并且逐渐增加剂量直到实现所需作用是在所属领域的技能范围内。
在一些实施例中，投予受试者的LSSC是离体扩增的细胞。LSSC是通过使细胞在培养基中生长来离体扩增的。可使分离的LSSC在例如包含补充有生长因子、血清、血小板溶解产物和抗生素中的一或多种的基础细胞培养基的培养基中生长。在一些实施例中，使分离的LSSC例如在补充有胎牛血清和青霉素/链霉素的最低必需培养基(MEM)α培养基中生长。在一些实施例中，投予受试者的LSSC实质上不含非LSSC。在一些实施例中，LSSC相对于所述受试者是自体的、同种异体的或异种异体的。
包含LSSC的医药制剂是通过任何适合途径投予受试者。举例来说，可通过静脉内、腹膜内、动脉内、皮下或肌肉内注射或通过局部投予到病变、器官、器官囊、脂肪或淋巴结之上或之中来向受试者投予组合物。
在一些实施例中，LSSC是在植入受试者中的二维或三维构架之上或之中。植入物或基质包括聚合物基质，例如基于纤维或水凝胶的装置。植入物可为生物可降解或非生物可降解的。纤维或水凝胶植入物可使用市售材料制造或构造。植入物通常是由天然或合成聚合物形成的。通过将细胞悬浮液施加到植入物来将LSSC接种到植入物上。这可通过将植入物浸泡于细胞培养容器中或将细胞注射或以其它方式直接施加到植入物来实现。使用标准外科技术植入接种有细胞的植入物。所述植入物可在植入之前接种并在体外培养，接种并立即植入，或植入然后接种细胞。在优选实施例中，将细胞接种到植入物之上和之中并在体外培养介于约十小时与两周之间的时间。
本发明的一些方面涉及一种分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)的方法。所述方法包含使用酶混合物与搅动的组合来消化淋巴系组织片段，并且然后收集所述LSSC。在一些实施例中，所述淋巴系组织片段的消化是以一系列步骤进行，所述步骤包含：(i)将淋巴系组织片段与酶混合物一起培育；(ii)使用移液管搅动组织，随后培育以使较大片段沉降；(iii)取出上清液并重复步骤(i)和(ii)，直到所有片段都消化。然后通过汇集所有上清液部分，随后离心以获得细胞团粒来收集LSSC。在一些实施例中，所述酶混合物包含培养基、分散酶、胶原酶和DNA酶I。所述LSSC可来源于皮肤或肠系膜淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体和/或派尔集合淋巴结。如上文所述，可使用分离的细胞来抑制免疫反应。
可使分离的LSSC在包含补充有生长因子、血清、血小板溶解产物和抗生素中的一或多种的基础细胞培养基的培养基中生长。在一些实施例中，使LSSC在补充有胎牛血清和青霉素/链霉素的最低必需培养基(MEM)α培养基中生长。在一些实施例中，分离的LSSC是在0.1-21％的氧分压下生长。在一些实施例中，分离的LSSC是在2.5-21％的氧分压下生长。
在一些实施例中，使LSSC生长直到LSSC实质上不含非LSSC。在一些实施例中，使LSSC生长直到基质细胞的数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或更多。在一些实施例中，分离的LSSC是以1-10,000个细胞/平方厘米的密度生长。在一些实施例中，分离的LSSC是以10-500个细胞/平方厘米的密度生长。
根据本发明的一些方面，提供一种组合物。所述组合物包含分离的淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)，其中LSSC是通过本文所述的方法分离的。举例来说，LSSC是通过使用酶混合物与搅动的组合来消化淋巴系组织片段，并且然后收集LSSC分离的。
根据本发明的一些方面，提供一种医药制剂。所述医药制剂包含分离的淋巴系组织源性抑制性基质细胞(LSSC)的组合物。可通过使用化学方法、机械方法和电细胞分离方法中的一或多种处理淋巴系组织片段，并且然后收集LSSC，来分离LSSC。举例来说，可通过酶或化学消化、物理破坏和搅动，和/或通过使用电场来分离细胞。
分离的LSSC可通过细胞培养进行扩增。在一些实施例中，所述分离的LSSC是离体扩增的细胞。在一些实施例中，所述分离的LSSC是通过使所收集的细胞生长直到所述LSSC实质上不含非LSSC来扩增的。可使细胞在包含补充有生长因子、血清、血小板溶解产物和抗生素中的一或多种的基础细胞培养基的培养基中生长。
在一些实施例中，分离的LSSC共同表达血小板源性生长因子受体α多肽(PDGFRα或CD140a)和程序性细胞死亡蛋白1配体2(PD-L2或CD273)。在一些实施例中，分离的LSSC共同表达CD140a和淋巴毒素β受体(LTBR)。在一些实施例中，所述分离的LSSC共同表达CD140a、PD-L2和LTBR。分离的LSSC还可表达一或多种选自由以下组成的群组的其它淋巴标记物：程序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)、Thy-1细胞表面抗原(Thy-1)、粘膜血管地址素细胞粘附分子1(MADCAM-1)、肌球蛋白重链11(MYH11)、白细胞介素7受体(IL-7R)或整合素α7(ITGA7)。在一些实施例中，分离的LSSC表达至少一种选自由以下组成的群组的因子：白细胞介素6(IL-6)、趋化因子(C-C基元)配体19(CCL19)、趋化因子(C-C基元)配体21(CCL21)或血管内皮生长因子(VEGF)。
LSSC可从选自由以下组成的群组的物种分离：人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、猪科动物、牛科动物及啮齿动物，并且在体外抑制T细胞增殖。
本发明的医药制剂可包括医药学上可接受的载剂或被稀释到医药学上可接受的载剂中。如本文所使用，术语“医药学上可接受的载剂”意思指适于投予人类或其它哺乳动物(例如狗、猫或马)的一或多种可相容的填充剂、稀释剂或其它此类物质。术语“载剂”表示一种天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合以有助于应用。所述载剂能够以一定方式与本发明的制剂混合并且彼此混合，由此使得不存在会实质上削弱所需医药功效或稳定性的相互作用。适于口服、皮下、静脉内、肌肉内等调配物的载剂可见于雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences),默克出版公司(MackPublishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa)。
以下实例将进一步说明本发明，这些实例决不应解释为进一步限制。本申请案全篇所引用的所有参考文献(包括参考文献、颁布的专利、公开的专利申请案及同在申请的专利申请案)的完整内容都以引用的方式清楚地并入本文中。
实例
材料和方法
小鼠
4-6周龄的雄性C57Bl/6小鼠是从杰克森实验室(Jackson Laboratory)获得。用于免疫基因组(ImmGen)分选的小鼠的年龄精确匹配到6周。雄性C57BL/6Rag-/-小鼠是从塔康尼克(Taconic)获得。所有小鼠在运输之后休息5天，并且不携带特定病原体，并根据美国国立卫生研究院(institutional and National Institutes of Health)指南进行护理。实验程序是在实验动物护理专门委员会(Research Animal Care subcommittee)的批准下于丹娜-法伯癌症研究院(Dana-Farber Cancer Institute)进行。
人淋巴结
人淋巴结是通过美国国家疾病研究交流会(National Disease Research Interchange，NDRI)资源中心(美国费城(Philadelphia,USA))从尸体供体取得。完整淋巴结是在DMEM中于冰上运输，并且在24小时内处理以用于流式细胞分析或细胞培养。
抗体
对于小鼠淋巴结基质的流式细胞分析、细胞分选和冷冻切片染色，使用以下抗体：抗CD45抗体(克隆40-F11，BD生物科技公司(BD Biosciences))、抗肾小球足突细胞膜粘蛋白抗体(克隆8.1.1，发育研究杂交瘤库(Developmental Studies HybridomaBank))、抗CD31抗体(克隆MEC13.3，生物传奇公司(Biolegend))、抗Lyve 1抗体(克隆10.1.1，由安德鲁法尔(Andrew Farr)博士友情馈赠)及抗MadCAM抗体(克隆MECA-367，伊拜生物科技公司(eBioscience))。适当时，使用碘化丙啶和克隆TER119(生物传奇公司)来排除死细胞和红细胞。对于人类细胞染色，所用抗体为：抗CD45抗体(克隆HI30，生物传奇公司)、抗CD31抗体(克隆WM59，BD生物科技公司)及抗肾小球足突细胞膜粘蛋白抗体(克隆NZ-1，安吉奥生物公司(AngioBio Co))，用高度交叉吸附的抗大鼠IgG(H+L)艾力克斯(Alexa)-488(英杰公司(Invitrogen))检测。
来自个别小鼠的淋巴结的酶消化
对于流式细胞分析或细胞培养，解剖出个别小鼠的淋巴结，用精细镊子刺穿一次，并放入在冰上的5ml RPMI-1640中。在指定使用皮肤引流淋巴结时，解剖出腋下淋巴结、臂淋巴结和腹股沟淋巴结。在解剖出所有淋巴结之后，去除RPMI-1640并用2ml新鲜制备的酶混合物更换，所述酶混合物包括含0.8mg/ml分散酶和0.2mg/ml胶原酶P(都来自罗氏公司(Roche))及0.1mg/ml DNA酶I(英杰公司)的RPMI-1640。在水浴中，在37C下培育管并以5分钟的时间间隔将其轻柔地倒转以确保内含物充分混合。20分钟之后，使用1ml移液管特别轻柔地抽吸并放出淋巴结，此举破坏囊并释放出大部分白细胞。将混合物再放入水浴中并使较大片段沉降30秒，随后去除酶混合物并添加10ml冰冷的FACS缓冲液(含2％FCS、5mM EDTA的PBS)并离心(300g，4分钟，4℃)。将2ml新鲜的酶混合物添加到消化管中，使用1ml移液管轻柔地混合内含物，并培育，同时使用1ml移液管有规律地进行轻柔混合。10分钟之后，使用1ml移液管剧烈混合细胞30秒。再次使片段沉降，取出上清液并添加到先前离心的细胞团粒中，并将2ml新鲜的酶混合物添加到消化管中。从此时起，每5分钟使用1ml移液管剧烈地混合消化混合物，直到在将其举到灯前时，明显所有残留的淋巴结片段都完全消化。这一程序从第一次培育时起到完全消化通常花费50分钟，并且从未超过60分钟。上清液在每次取出之后都进行离心(300g，4分钟，4℃)，直到最后每个收集管都含有从个别小鼠采集的淋巴结的完整细胞内含物。使细胞滤过80μm尼龙(nylon)筛网，使用血细胞计数器进行计数，并使用台盼蓝评估活力。活力超过95％。然后，在4℃下，在冰冷的FACS缓冲液(含2％FCS、5mM EDTA的PBS)中将每次染色5×106个细胞与50μl经过稀释的抗体一起培育20分钟，之后捕获到FACSCalibur或FACSAria IIu(BD生物科技公司)上。
用于细胞分选和大规模分离的来自汇集的小鼠的淋巴结的酶消化和基质细胞富集
大体上如2.1中所述进行多只汇集的小鼠的消化，不过具有如下变化(图解描绘于图1中)：将来自4-10只小鼠的淋巴结汇集到单一管中并且每个消化步骤使用5ml酶混合物进行消化。在淋巴结完全消化，并且对细胞进行离心并计数之后，使用CD45微珠和autoMACS系统(均来自美天旖公司(Miltenyi))富集单细胞制剂中的非造血基质细胞。每107个细胞使用7μL珠粒，在转轮上，在4℃下于FACS缓冲液中培育20分钟。然后根据制造商的说明书，使用耗尽(Depletes)程序耗尽经标记部分。然后对富集的基质进行计数并使用大体积抗体(每106个细胞100μL经稀释抗体混合液)进行染色以用于细胞分选。
人淋巴结的酶消化
小心地清洗掉人淋巴结中的脂肪和结缔组织，然后使用精细剪将其切成小片(<0.5cm)。消化是根据第2.4部分进行，不过RPMI-1640中的酶浓度增加到2.4mg/ml分散酶和0.6mg/ml胶原酶P(均来自罗氏公司)及0.3mg/ml DNA酶I(英杰公司)。在一些情形中，并没有消化整个器官，而是随机选择约20个混合的片段，代表淋巴结的所有区域。60分钟之后，对淋巴结片段进行完全消化，然后过滤，计数并且必要时进行染色，如上所详述。
低压流式细胞基质细胞分选
当使用指定的低压、大孔径设置时，基质细胞的流式细胞分选得到改良；然而，在将分选仪重新设置成非标准规格并且然后成功地分选纯细胞群方面存在固有的技术问题。使用了被设定为20psi并且配备有100μm吸头的FACSAria或升级的FACSAriaIIu机器，其利用FACSDiva软件(均来自BD科技公司)。尽管每个机器将不同，但已经发现，以下近似规格已应用被设置用于基质细胞分选的至少4种不同的FACSAria机器。这些机器的不同之处在于制造商所指定的建议设置。
液流压力的降低使液滴大小增加，由此在20psi下通过液流观察窗仅可见5-6个液滴，而非在70psi下的10-12个液滴。尽管液滴的断离点直接影响分选的成功性并且应始终为可见的，但对于卫星解析点来说，在低压下分选时，甚至在增加液滴频率之后，也可能发生无法观测的情形。这不排除成功的分选；然而，重要的是确信卫星解析度在屏幕下出现不超过1-2个液滴。这可通过2种方式合理地确定：第一，通过临时调整液滴的断离点高于并且超出观测值，由此使卫星解析点变得可见，并且在向下重新调整之前，对在断离点与解析点之间的液滴数量进行计数；以及第二，通过观察卫星点与液滴之间递减的距离，并且估计液滴数量，直到解析发生。所述卫星点如果不是在屏幕上进行解析，就应非常接近解析。
重要的是，决定是否应用衰减控制(此使得液滴振幅减小)会明显改变后续的规格。提供在利用和不利用衰减情况下的样品设置分选报告供参考(表1)。BD生物科技公司手册推荐在20psi下进行分选时不应用衰减；然而，已经发现在利用FACSAria(而非FACSAria IIu)时有必要产生良好的液流。使用FACSAria需要手动调整100m吸头来产生良好的液流，而对于FACSAria IIu系统，则无需移动吸头或利用衰减，其中持久地配备有o形环。
最后，已经注意到，当结合低压力时，633nm激光延迟可突然改变。引起此情形的原因尚不明了，但推荐使用CST珠粒来设定延迟，或使用SPHERO彩虹系列颗粒(BD生物科技公司)(或任何类似的校准检查)测试激光功能。应注意，来自633nm激光的信号的缺乏可能需要对激光延迟进行再校准。
应使用富集的基质细胞严格地进行基质细胞分选的补偿。基质是伴随一定程度自发荧光的大细胞。当分选基质时，使用白细胞进行补偿的机器得到对细胞群的次最佳解析。应使用富集的基质进行补偿，因为在非富集群中，基质通常稀少，并且发现自动补偿软件无法区别消化的单细胞悬浮液中自发荧光的正常水平与实际的基质细胞染色。
当最佳地校准这些机器时，分选是在优良的分选液流解析度下以良好效率进行。分选液流应在分选窗中良好解析为明亮的离散点；分选液流的‘喷射’不应为明显的。
AutoMACS富集的基质在TRIzol(英杰公司)中常规地分选至高纯度(>95％)。在针对CD45-碘化丙啶-基质进行门控之后，亚群分选如下：成纤维细胞性网状细胞(FRC)，肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31-；淋巴内皮细胞(LEC)，肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31-；血液内皮细胞(BEC)，肾小球足突细胞膜粘蛋白-CD31+；双重阴性基质细胞(DN)，肾小球足突细胞膜粘蛋白-CD31-。
微阵列检验和分析
如先前所述，从10,000-15,000个分选的细胞中分离RNA(山形(Yamagata)等人,2004)，然后扩增并根据制造商的说明书，使用GeneChip全转录物有义靶标记检验(Whole Transcript Sense Target Labeling Assay)将其与昂飞GeneChip小鼠基因(Affymetrix GeneChip Mouse Gene)1.0ST阵列(美国加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara,CA,USA))杂交。使用设计成结合每个基因中的多个位置的探针，由此得到全转录物信息。在GenePattern的Expression File Creator模块中使用强大的多阵列平均(RMA)预处理算法(进行背景调整、百分位正规化和汇总)对原始数据进行正规化(伊利萨里(Irizarry)等人,2003)。针对至少一个亚群中的表达(在所有亚群中，如果平均表达值<120，则排除)并且针对各重复间的低方差(在任一群体中，如果变异系数>0.5，则排除)来分析探针清单。使用了GenePattern的Multiplot模块来计算皮肤淋巴结FRC与肠系膜淋巴结FRC之间的差异。如果表达的倍数变化>2并且P<0.05(斯图登氏T测试(student's Ttest))，那么认为差异适于进一步分析。使用Microsoft Excel对输出数据清单进行分级，并且使用DAVID程序的功能注释工具(Functional Annotation tool)(NIAID,david.abcc.ncifcrf.gov(丹尼斯(Dennis)等人,2003))并且在设定为MoGene-1_0-st-v-1芯片的昂飞外显子背景下，针对整个KEGG路径中的富集对基因清单进行分析。在多重假设(本杰明(Benjamini))校正之后T测试P值<0.05的KEGG路径分析被认为是显著的。数据序列的NCBI GEO登录号为GSE15907。
淋巴结基质细胞培养技术
如以上所详述，将淋巴结消化，然后计数，并以5×105个细胞/平方厘米的浓度接种。细胞培养基为补充有10％分批测试的低Ig FCS和1％青霉素/链霉素的αMEM。24小时之后，洗涤板以去除非粘附细胞。5天之后，小鼠细胞培养物主要含有LEC和FRC。人细胞培养物生长较慢并且在7天之后采集。人淋巴结基质细胞培养物主要含有FRC和DN。常规地利用非标准采集方案，其由在含EDTA的低浓度胰蛋白酶中短暂培育以使重要细胞表面标记物的基于胰蛋白酶的剪切作用减到最小组成(表2)。用PBS洗涤细胞以去除残留蛋白质，并且将采集缓冲液(含0.2％胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS)添加到培养板中。在37C下，在采集缓冲液中培育细胞2分钟。此时，其形态变得更圆，并且向各孔中立即添加等体积的完全培养基。通过使用1ml移液管轻柔搅动，从板洗涤出细胞，并且将上清液添加到另一等体积完全培养基中以进行离心(300g，3分钟，4℃)。必要时，由这一制剂对FRC和LEC进行再接种，分选或MACS纯化。
对于三维培养和网络分析，在由3.2mg/ml高浓度大鼠尾胶原蛋白I(BD生物科技公司)、1.8mg/ml基质胶基底膜基质(BD生物科技公司)、在内部由αMEM粉末(英杰公司)制成的8.3％(v/v)的5xαMEM储备液及含有待接种的细胞的30％(v/v)培养基构造的可变形基质中培养细胞。在冰上混合凝胶组分并将200μl接种到塑料或玻璃底培养皿上用于成像(马泰克(MatTek))。使凝胶在37C下静置10分钟，随后用培养基覆盖。对于收缩检验，在平底96孔培养板中产生凝胶并在15小时之后拍照。使用以下等式测量收缩：收缩凝胶的面积(cm2)/孔面积(cm2)*100＝收缩％。对于时移活细胞成像，将骨髓源性树突状细胞或B细胞以5:1比率与纯化的经培养FRC混合。在成像期间，在37C及10％CO2下于含有10％FCS的αMEM中培育凝胶。影片描绘了每90秒获取1帧的时移图像。
免疫组织学分析和共聚焦显微镜检术
新鲜解剖出淋巴结并在10％三聚甲醛中固定4小时，然后放入10％蔗糖溶液中过夜。然后，将小块包埋于OCT化合物(VWR)中并急速冷冻，然后在-80℃下储存。使用雷卡冷冻切片机(Leica cryostat)对淋巴结进行冷冻切片(7μm)，并用丙酮固定，然后使用2％BSA阻断30分钟。在PBS中洗涤之后，用一次抗体对切片染色，保持60分钟，然后洗涤并用二次抗体染色，再保持60分钟。使用荧光封片剂(达可公司(DAKO))用盖玻片对载片进行封片，并在4℃下储存。使用雷卡Sp5共聚焦显微镜获取图像。
统计学分析
使用GenePattern的Multiplot程序针对正规化的阵列数据计算T测试的P值，其中对于任何样品，各重复之间的变异系数<0.5。如果观察到的倍数变化也是<2的，那么认为P值<0.05是显著的。使用DAVID程序(david.abcc.ncifcrf.gov)针对KEGG路径关联来测试基因，其使用经修改费希尔氏精确检验及利用本杰明多重假设校正的T测试来比较数据，以显示特定清单中2个或2个以上基因的富集。使用了非参数曼-惠特尼U测试(non-parametric Mann-Whitney U test)来比较流式细胞分析数据(普林斯姆公司(Prism))。
淋巴结基质细胞分离和培养
使用3-6周龄的C57Bl6/J小鼠作为FRC供体。解剖出皮肤和肠系膜淋巴结并使用酶和机械方式进行消化。将来自10只小鼠的淋巴结在37C下于含0.8mg/ml分散酶、0.2mg/ml胶原酶P及0.1mg/ml DNA酶的RPMI-1640中培育60分钟，并且有规律地搅动并更换酶混合物。经由离心回收消化的细胞。一旦消化完成，就将细胞再悬浮于RPMI-1640中，滤过80μm筛网并且使用血细胞计数器和台盼蓝进行计数。将细胞以5×105个细胞/平方厘米接种于培养瓶中。培养基由含10％分批测试的低Ig FCS和1％青霉素/链霉素的αMEM组成。24小时之后，洗涤细胞，使其再生长6天，然后使用含0.2％胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS传代一次，并且以1:10比率分离以进行扩增，再保持5-6天，之后待用。
MSC分离和培养
从上述FRC供体小鼠的骨髓采集MSC。从10只小鼠去除大腿骨和胫骨。通过离心来回收骨髓并且使用移液管将其再悬浮于无菌RPMI-1640中。将细胞以5×105个细胞/平方厘米接种于培养瓶中。培养基由含10％分批测试的低Ig FCS和1％青霉素/链霉素的αMEM组成。24小时之后，洗涤细胞，使其再生长6天，然后使用含0.2％胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS传代一次，并且以1:10比率分离以进行扩增，再保持5-6天，之后待用。
FRC和MSC纯化
使用含0.2％胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS采集细胞，然后使用血细胞计数器和台盼蓝进行计数(活力超过95％)，并且将其再悬浮于含有10μl抗CD31-生物素和10μl抗CD45-生物素的1ml FACS缓冲液(含2％FCS和5mM EDTA的PBS)(每107个细胞)中。15分钟之后，洗涤细胞并将其与抗生物素微珠一起培育，并根据制造商的说明书，使其通过MACS LS柱(美天旖生物技术公司(Miltenyi Biotec))。对于所有研究，使用MACS纯化的FRC。
败血病诱发：LPS模型
使3-6周龄(幼)或18-24个月大(老)的C57Bl6/J小鼠接受单次LPC注射，引起无菌败血病。幼小鼠腹膜内接受含300μg LPS的100μl生理盐水，并且老小鼠腹膜内接受含150μg的100μl生理盐水。在指定时间点，以单次腹膜内注射投予含1×106个FRC的生理盐水。如果小鼠达到以下任一终点，就对其实施安乐死：失去知觉、无法唤醒、无法站立或低于20次呼吸/10秒的呼吸速率持续降低。
败血病诱发：CLP模型
使Balb/c小鼠接受盲肠结扎穿孔(CLP)，引起多菌种性败血病。简单地说，将小鼠麻醉并通过皮肤和腹膜肌肉产生中线切口。定位盲肠并且使其在无菌手术野上显露出来，然后使用6.0缝线结扎80％的盲肠，并且使用23g针穿刺盲肠两次。使一小滴粪便物流出，之后将盲肠放回原处并闭合肌肉和皮肤。小鼠皮下接受1ml生理盐水。在指定时间点，使小鼠接受单次腹膜内注射的生理盐水或含1×106个同种异体FRC的生理盐水。此时，还对所有小鼠进行抗生素治疗(腹膜内注射含15mg氨比西林(ampicillin)的生理盐水)。每12小时投予抗生素。如果小鼠达到以下任一终点，就对其实施安乐死：失去知觉、无法唤醒、无法站立或低于20次呼吸/10秒的呼吸速率持续降低。
细胞因子阵列
如以上所详述，获得血液，并且通过离心来收集血浆。根据制造商的说明书，使用卢米尼克斯公司的MAGPIX阵列和读取器，用xPONENT软件来获得分析物的浓度。
结肠炎诱发模型
使用8周龄的雌性C/B17.scid小鼠作为结肠炎受体。使用7周龄的雌性Balb/c供体作为细胞供体以诱发结肠炎。从20只Balb/c小鼠解剖出脾、以及皮肤和肠系膜淋巴结，并使用机械破坏法将其悬浮于RPMI-1640中。对细胞进行过滤并计数，然后根据制造商的说明书，使用CD4+CD62L+CD44low分离试剂盒(R&D系统公司(R&DSystems))富集天然CD4+T细胞。然后使用FACS对CD4+CD45RBhi+T细胞进行分选，并将其再悬浮于无菌RPMI-1640中。15只C/B17.scid小鼠静脉内接受含5×105个细胞的100μl RPMI-1640。在诱发结肠炎后2周，小鼠开始体重减轻，表明疾病发作。然后小鼠每周两次腹膜内注射1×106个同种异体FRC，持续整个研究。如果小鼠达到以下任一终点，就对其实施安乐死：其起始体重减轻>20％，或后肢瘫痪。
结果
小鼠和人淋巴结基质细胞的酶分离
淋巴结基质细胞的研究集合了目前的力量，其中若干高影响力论文剖析了其最新发现的在维持(林克(Link)等人,2007)和缺失(李(Lee)等人,2007,尼克斯(Nichols)等人,2007,加德纳(Gardner)等人,2008,马格努森(Magnusson)等人,2008,叶(Yip)等人,2009,寇汉(Cohen)等人,2010,弗莱彻(Fletcher)等人,2010)天然T细胞方面的作用。然而，方法能力是一个限制性因素。
因此，我们旨在开发一种低死亡率酶消化方案，其将能够以较低可变性高度可再现地分离淋巴结基质细胞。使用酶和物理解离的组合(图1)，在分离之后立即使用台盼蓝对全淋巴结悬浮液(1.5％基质)常规地分离出活力>95％的基质细胞(图2A)。分离并富集基质细胞之后六小时，使用碘化丙啶测定基质的平均活力为87.8％±0.8(平均值±标准偏差，n＝3次实验)。这一高活力也允许表征并比较个别小鼠中存在的每个基质细胞亚群的数量，并将其作为成功分选并培养这些细胞的关键因素。使用了CD45、肾小球足突细胞膜粘蛋白、CD31和MadCAM(图2B)来研究淋巴结基质的5个主要亚群。具体地说，先前未分离出MadCAM+MRC亚群用于流式细胞分析。
首先直接比较针对基质细胞亚群的流式细胞分析策略与先前确定的原位组织学分析(图2C)。我们的目标是确定能够监测基质细胞结构的变化同时监测细胞类型的数量或比例的变化的方法、mRNA谱及需要细胞分离的其它技术。
因此，发现如通过流式细胞分析所确定的FRC如所预期的那样在整个T细胞区中产生一个网状网络(顶图)。BEC表达CD31但不表达肾小球足突细胞膜粘蛋白，并且其主要存在于皮质(顶图)中，可通过其较小的大小和立方形的形态与高内皮小静脉相区别。通过肾小球足突细胞膜粘蛋白和CD31的共同表达确定的LEC内衬于骨髓(中间图)和囊下(数据未示出)的门区中的大淋巴管。所述门区还含有大血管(CD31+肾小球足突细胞膜粘蛋白-)。MadCAM+网状细胞内衬于囊下(底图)并且MadCAM染色也出现在B细胞区中，如先前所报道。已发现囊下LEC(此处显示表达Lyve-1)也表达MadCAM(底图)，使囊下成为淋巴结的富含MadCAM的区域。通过流式细胞分析，从表型看，MRC在肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31-FRC门控内形成一个亚群(图2B)。
假定我们的分离方法可用于分离人淋巴结基质，从而允许建立有用的离体实验系统。人淋巴结基质细胞结构通过组织学分析得到良好描述(林克等人,2011)，但尚未分离亚群用于流式细胞分析或其它免疫研究。
从尸体供体获取非肠系膜来源的人淋巴结。尽管需要增加酶浓度来消化淋巴结(参看方法)，但一旦消化，其基质细胞组成就明显类似于小鼠(比较图2D与2B)。这些结果表明，鼠类淋巴结基质细胞技术可同样适用于人类研究。
肠系膜淋巴结含有的FRC少于皮肤引流淋巴结
为了进一步验证我们的消化，通过评估年龄相配的小鼠之间淋巴结基质细胞亚群的构成比例的变化程度来测试其再现性。还比较了皮肤引流淋巴结与肠系膜淋巴结的基质细胞组成。尽管这些淋巴结具有充分确定的结构类似性并且通过组织学分析进行了充分研究，但其受试者发生是在不同时间出现并且取决于不同的信号传导路径(米布斯(米布斯),2003)。此外，肠系膜淋巴结不断地暴露于肠和胃粘膜源性抗原，而皮肤引流淋巴结则不是。
意外的是，我们发现尽管从每个皮肤引流或肠系膜淋巴结分离出数量类似的细胞(图3A)，但基质细胞组成明显不同(图3B)。与肠系膜淋巴结相比较，在皮肤引流淋巴结中，在整个T细胞区中生长的FRC以更高频率存在(图3B，图2B)并且数量更多(图3C)。LEC、BEC、DN和MRC在两个部位处是以类似数量存在(图3C)，使得差异为FRC特异性的。
要了解这一差异是否是由于MRC亚群比例的偏移(片贝等人,2008)，发现其在FRC门控的范围内(图2B)。在5周龄的雄性小鼠中，在FRC门控内10-20％的细胞表达MadCAM，其中肠系膜淋巴结中的比例高于皮肤引流淋巴结(图2B，3D)。然而，尽管各部位之间的MRC比例显著变化，但类似于LEC，其总体数量不变(图3E)。这表明MRC数量和FRC数量是以不同方式调控，因为MRC与其它基质细胞亚群一样，在各部位之间数量类似，而FRC在肠系膜淋巴结中较少。
在一些淋巴系器官(例如胸腺)中，主要的基质细胞亚群的数量与发育的T细胞同时扩大或缩小。我们使用缺乏T细胞和B细胞的Rag-/-小鼠测试了这是否适用于FRC群。FRC在Rag-/-淋巴结中发育，但其是否响应淋巴细胞数量而扩大和收缩尚未可知。这一问题与感染特别相关，因为淋巴结必须在短时间内急剧扩大以容纳增殖的淋巴细胞。
尽管与年龄相配的野生型对照(图3G)相比较，Rag-/-小鼠具有较小淋巴结(图3F)，但其具有正常的FRC数量。然而，LEC数量明显减少，表明其数量的动态平衡与成熟淋巴细胞的存在相关联。Rag-/-FRC与WT在细胞更新速率(数据未示出)方面并无不同，并且在将LPS注射到小鼠中之后，FRC的数量未随着T细胞和B细胞扩大(数据未示出)。因此，在淋巴细胞减少、稳态及炎症性病况下，FRC数量的维持与成熟淋巴细胞完全无关。
意外的是，我们发现MRC亚群在Rag-/-小鼠中发育不全(图3H-J)。据报道，组织学分析显示在Rag-/-小鼠中存在MadCAM+MRC(片贝等人,2008)，但在我们看来，MadCAM+MRC的数量和每个MRC中MadCAM蛋白的量显著降低(图2H-J)。这也适用于MadCAM+LEC(图3H-J)，表明在两种细胞类型中MadCAM表达的上调表示发育阶段需要淋巴细胞的存在，不过蛋白质本身的表达可在其不存在的情况下发生。尽管WT与Rag-/-之间MadCAM+LEC的比例类似(图3H)，但总LEC的显著减少(图3G)转换成MadCAM+LEC数量的减少(图3I)。
富集并分选淋巴结基质细胞亚群
在成功消化淋巴结之后，接下来采用成功分选并培养基质细胞的手段。分选基质细胞在技术上看是很难的(参看方法)并且我们使用了基于MACS的造血细胞耗尽法来减少分选时间并增加所得纯度。此另外的步骤得到最少的基质损失(图4A、B)并且不会明显地改变基质细胞组成；我们发现在MACS后基质细胞亚群无选择性损失(图4C)，并且在分选之后获得了优良的纯度(图4D)。
使用这一方法，从皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结分选出FRC作为多中心免疫基因组联盟的一部分。这涉及在高度控制、最少变化的条件下对所分选的细胞进行转录组分析，其中总体目标是产生公共数据库以提供免疫基因组的全面、交叉参考的图谱。
对来自皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结的FRC中25,194探针的表达进行分析以得到在皮肤引流淋巴结或肠系膜淋巴结中表达超过任意临界值(平均表达值>120)的11,162个探针的清单。同时针对各重复之间的低(<0.5)变异系数对这些探针进行过滤。
首先确定来自这些不同位置的FRC共有先前公开的FRC特异性标记物(例如CD140a、CCL19和IL-7)的表达(数据未示出)，然后分析这些数据的差异。将皮肤引流淋巴结FRC与肠系膜淋巴结FRC相比较，描绘倍数变化和P值的火山图显示，与肠系膜淋巴结相比较，130个探针在来自皮肤引流淋巴结的FRC中显著上调，而与皮肤引流淋巴结相比较，有97个探针的表达在肠系膜淋巴结FRC中显著更高(>2倍数变化，P<0.05)(图5A)。在将这些探针定位到独特基因之后，这些数据对应于皮肤引流淋巴结FRC中126个基因的上调(数据未示出)以及肠系膜淋巴结FRC中54个基因的上调(数据未示出)。
作为任何位点特异性特化的线索，有关这些清单是否含有特定基因路径的活化，或在任一细胞类型中独特操作的基因网络的证据引起了关注。使用免费在线程序DAVID(6.7版；美国国家过敏症和传染病研究所(National Institute of Allergy andInfectious Diseases))，我们使用了网络分析工具(KEGG)来搜索有关这些基因之间的已知生物联系的清单，然后使用统计学分析工具来评估相连的基因是否一起以高于意外预期的频率出现。与肠系膜相比较，涵盖细胞因子-细胞因子受体相互作用的KEGG路径mmu04060在来自皮肤引流淋巴结的FRC中显著富集(基因出现的频率是意外预期的频率的4.8倍，本杰明校正的P值＝0.0055)。这一清单包括在皮肤引流淋巴结FRC中上调至少两倍的具有免疫相关性的十个基因(图5B)。在肠系膜淋巴结中上调的基因在可鉴别的KEGG路径中未显著富集，但明显包括调控成纤维细胞生长所涉及的基因、与肠微环境相关的基因，例如视黄酸代谢或MadCAM表达、内皮细胞交互应答、细胞外基质分泌及外周神经元生长所涉及的基因(表3)。
培养的FRC模拟体内功能并且支持白细胞迁移
接下来测试淋巴结基质在培养物中生长的能力。我们发现，成功消化的淋巴结细胞悬浮液中的基质将易于在接种2小时内粘附到组织培养板，并且以消耗CD45+白细胞为代价开始扩增，所述白细胞在5天之后形成培养物的不到10％(图6A)。FRC和LEC易于在培养物中生长，而BEC和DN细胞则不然(图6A)。FDC不在培养物中生长(图6B)。重要的是，低胰蛋白酶、高EDTA采集方案允许保留重要的表面标记物，例如CD31(图6C)和CD140a(未示出；参看表2)。发现在培养5天之后，5×105个细胞/平方厘米(含有约5×103个基质细胞)，常规地得到约1.5-2×104个基质/平方厘米。这一培养系统能够容易地扩增并操作FRC、LEC和MRC。
具体地说，FRC在二维(2D)培养物中变得高度极化(图6D)，显示较强的F-肌动蛋白应力纤维(图6E)。这无法模拟其体内形态；因此，使用优化的胶原蛋白I、基质胶和富集的αMEM的混合物，另外探索FRC和LEC的三维(3D)培养作为检查当容许如同其在体内那样扩增并呈三维连接时其功能。发现FRC当在3D中生长时伸长并形成广大的网络(图6D、E)，而LEC偏好平坦表面并且在2D培养中生长更成功(图6D)。有趣的是，任一细胞类型在3D条件下都未生长达到超汇合(数据未示出)，表明在2D培养中未发生细胞密度的先天调控。为了验证这一体外FRC网络的生物相关性，进行了两个实验。第一，将较大数量的FRC放入较小的基质胶塞中，并监测其收缩凝胶的能力(图6F)。FRC表达高水平α平滑肌肌动蛋白并且为高度可收缩的(林克等人,2007)。我们发现FRC以高效率收缩凝胶，并且当将Src酪氨酸激酶抑制剂PP2添加到凝胶中时，阻止这一收缩。第二，将骨髓源性树突状细胞(DC)或脾源性淋巴细胞添加到含有FRC的凝胶中，并且使用活体成像方法发现，如在体内所报道的，DC和淋巴细胞有效地并且优先沿FRC网络蠕动(照片显示于图6G中，并附上以补充影片1和2显示的完整时移影片)。
使用相同方法，成功地培养出人淋巴结基质细胞亚群。与鼠类细胞不同，BEC和DN细胞在体外随LEC和FRC一起生长(图6H)。
总体而言，这些结果显示，鼠类淋巴结基质易于分离用于流式细胞分析和分选，并且可在不存在白细胞情况下培养，仍产生广大的3D网络，使白细胞易于在其上蠕动，如体内所报道。这些数据表明，人淋巴结基质类似地适于使用鼠类技术进行研究。
总体而言，这些结果描述了适用于在多种离体和体外条件下研究小鼠和人类淋巴结基质细胞的一套技术的验证。
淋巴系组织源性抑制细胞抑制活化的同种异体脾细胞增殖
将未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的人脾细胞一起培养。脾细胞用CFSE(当细胞分裂时稀释的一种荧光染料)标记。使用PHA和IL-2活化脾细胞群内的T细胞。图7显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。在无培养的基质细胞情况下刺激的T细胞对其CFSE的稀释作用超过与LSSC一起培养的细胞，并且LSSC以剂量依赖性方式抑制T增殖(图7)。
LSSC抑制活化的异种异体T细胞增殖
将未分级分离的LSSC与新鲜分离的小鼠脾细胞一起培养。脾细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。然后使用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化T细胞。图8显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。在无培养的基质细胞情况下刺激的血液源性T细胞对其CFSE的稀释作用超过与LSSC一起培养的细胞，PDPN+LSSC和PDPN-LSSC亚群能够同等地抑制T细胞。LSSC是异种异体反应的有效抑制剂(与图7中所示的同种异体抑制作用相比较)。
LSSC经由新颖基质抑制T细胞增殖
在小鼠中，来源于淋巴结的PDPN+基质细胞经由特别需要T细胞源性IFNg和基质细胞源性一氧化氮的机制抑制自体T细胞增殖(卢卡斯-科内克(Lukacs-Kornek)等人,自然免疫学(Nature Immunology),2011)。我们想要测试LSSC是否使用这些机制抑制T细胞反应。
将未分级分离的LSSC与来源于野生型或IFNg-/-小鼠的新鲜分离的脾细胞一起培养。脾细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。然后使用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化T细胞。图9A显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。
将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC和未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞一起培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞。图9B显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。收集上清液并测试亚硝酸盐(一氧化氮的转化产物)的存在。
发现LSSC与野生型T细胞同样良好地抑制IFNg-/-T细胞。在所述抑制检验中，PDPN+LSSC和PDPN-LSSC亚群以及未分级分离的LSSC都未产生可检测的一氧化氮/亚硝酸盐。LSSC使用新颖的不依赖于IFNg和一氧化氮的机制抑制T细胞增殖，并因此与小鼠PDPN+淋巴结基质细胞群明显不同。
两个主要的淋巴系组织源性抑制细胞亚群各自抑制活化的同种异体T细胞增殖
在图10A中，基于糖蛋白-36(又称为PDPN)的表达或缺乏来纯化两个LSSC亚群。两个亚群都为非内皮细胞(CD31阴性)并且非造血细胞(CD45阴性)的。
将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC或未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞以1:5的比率(LSSC比T细胞)一起培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞。图10B显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示脾细胞与基质的比例。
观察到在无培养的基质细胞情况下刺激的血液源性T细胞对其CFSE的稀释作用超过与LSSC一起培养的细胞，PDPN+LSSC和PDPN-LSSC亚群能够同等地抑制T细胞。
LSSC停止预先活化的同种异体T细胞的分裂
LSSC的一些治疗应用需要将其输注或移植到具有正在进行的免疫反应的受试者中。因此，我们想要了解LSSC是否能抑制预先活化的T细胞。
将PDPN+LSSC、PDPN-LSSC或未分级分离的LSSC与从不相关供体新鲜分离的纯化的人血液源性T细胞一起培养。T细胞用当细胞分裂时稀释的CFSE标记。使用PHA和IL-2活化T细胞，使其分裂2天，并且然后将一些T细胞再接种到LSSC上并进行再刺激，或在无LSSC情况下进行再接种和再刺激，或进行再接种而不进行再刺激。图11显示的柱状图描绘了通过T细胞抗原受体的表达鉴别的T细胞。比率指示LSSC与T细胞的比例。
发现已经刺激2天并且然后在LSSC存在下再接种并再刺激的T细胞中止细胞分裂，尽管事实是其已经完全活化并且在再接种之前已经历数次细胞分裂(以“进行再接种而不进行再刺激的”对照显示)。PDPN+LSSC和PDPN-LSSC亚群能够同等地抑制预先活化的同种异体T细胞。
LSSC显著降低患有严重移植物抗宿主疾病的小鼠的早期致死率
使受体小鼠接受同种异体骨髓移植(分剂量致死照射，随后静脉内注射全骨髓)。在移植时，通过共注射含有同种异体反应性T细胞的供体来源的脾细胞来诱发严重GVHD。在诱发GVHD之后的多个时间点，腹膜内注射1×106个人LSSC，而对照小鼠接受生理盐水(媒剂)。监测存活率。
所有小鼠在类似时间点发生GVHD，不过接受LSSC的小鼠在早期时间点显示显著降低的GVHD相关性致死率，表明LSSC降低免疫攻击。早期LSSC投予的作用持续到注射后3周，此时保护变得无效，表明可能指示再投药。投予严重患病小鼠的最后一次LSSC注射(第24天)没有逆转发病率或死亡率。
如图15中所示，离体扩增的小鼠淋巴结基质使小鼠急性败血性休克的致死率降低。
LSSC的转录特征
使用针对表面标记物的流式细胞分析和针对分泌因子的RT-PCR(图13A)，以及使用昂飞人基因ST1.0基因阵列获得mRNA转录组(图13B)来获得人LSSC的转录特征。
LSSC(黑线)与相关阴性染色对照(灰色)的比较的代表性流式细胞分析曲线(图13A)显示了间充质标记物PDGFRa、耐受性相关蛋白PD-L1和PD-L2、肌肉相关蛋白ITGA7，及淋巴系器官基质特有的蛋白质LTBR、IL7R和PDPN的表达。PDPN和ITGA7可能是由大量LSSC组成的亚群表达。选用名或基因名称示于括号中。RT-PCR显示，LSSC表达趋化因子CCL19和CCL21的转录物(相对于作为阳性对照的LTbR显示)。
使用基因阵列，还评估了选自3个LSSC样品的基因的转录，并与公开可得的3个人骨髓间充质干细胞样品(登录号GM241199、GM241201、GM241203)的数据相比较。数据(图13B)显示，与BM-MSC相比较，LSSC表达高水平PD-L2、LTbR、Itga7、Myh11。LSSC和MSC表达类似水平的CXCL12、Thy1、L7R，并且类似地对例如LYVE1、CD3G、PECAM1(CD31)、CD34、FCGR2B及PTPRC(CD45)等谱系特异性标记物呈阴性。先前已报道，MSC不表达PD-L2，这一蛋白质也不能通过暴露于炎性细胞因子IFNg进行诱导。
LSSC的形态特征
在补充有胎牛血清的α-MEM中培养生长的LSSC显示类成纤维细胞形态(图14)。其通常展现较长过程，板状伪足、丝状伪足、有褶皱的前导端及粘着斑。此外，从淋巴结和扁桃腺分离的LSSC在表型上是类似的(图19)。
在2个不同的小鼠模型中，当在治疗时间点投予FRC时，其防止败血病。
在无菌败血病模型和盲肠结扎穿刺(CLP)败血病模型中，FRC赋予显著的存活率益处(图16)。图16E显示在FRC处理的小鼠的血液中炎性细胞因子的水平降低。这些炎性细胞因子通常与先天免疫系统相关。因此，在败血病中，FRC与先天免疫系统相互作用。
FRC防止结肠炎死亡率。
通过将纯化的天然T细胞注射到免疫缺陷小鼠中来诱发结肠炎。在2周时，即在小鼠开始显示疾病病征并且体重显著减轻(治疗时程)后，投予同种异体FRC。从第2周到第6周，每周两次注射FRC，并与生理盐水处理的对照组相比较，并监测存活率。FRC赋予显著的存活率益处(图17)。
人LSSC分泌可溶性细胞因子并且从淋巴结和扁桃腺分离的细胞显示相当水平的经由可溶性因子引起的T细胞抑制。
经显示，培养的人LSSC分泌许多可溶性细胞因子(图18)。从淋巴结和扁桃腺分离的LSSC显示相当水平的经由可溶性因子进行的T细胞抑制(图20)。
讨论
免疫学和细胞生物学中常用的技术，例如由原始组织产生具有可再现组成的活性单细胞悬浮液，当应用于淋巴结基质时产生困难。因此，组织学分析和全器官PCR或涉及淋巴细胞读出的体内系统已成为本领域的标准。这些引起了有关淋巴结基质细胞亚群在稳态耐受性和免疫性中的作用的若干重要发展；不过，还存在许多直接生物和医学相关的问题未得到探索。我们相信，将需要经过改进和改编以用于这些稀少并且灵敏的细胞类型的现代免疫和细胞生物技术来回答这些问题。
这一未满足的需求最突出的是，特别是DN基质仍几乎完全未确定。若干团体现已报道这一非造血基质细胞亚群的存在(其可为或可不为同源的)(林克等人,2007,寇汉等人,2010,弗莱彻等人,2010)，但尽管构成>10％的淋巴结基质小生境并且带有表达Aire的细胞类型(寇汉等人,2010,弗莱彻等人,2010)，其仍然是几乎完全未得到表征的。如形态、谱系、表面表型和功能等基本特征尚未报道。这些不足直接道出了研究淋巴结基质细胞固有的难题。
在研究DN细胞方面的一个此类难题是频临死亡或染色不良的淋巴细胞看来为CD45较少或阴性的，出现在基质细胞门控中，具有与DN基质相同的表型(CD31-肾小球足突细胞膜粘蛋白-)。这极大歪曲了真实基质细胞亚群的比例，使得难以确定甚至淋巴结基质细胞小生境最基本的组成比例。事实上，由于基质仅占淋巴结细胞的1-2％，故无活力淋巴细胞数量常常超过基质，即使是在高活力(>95％存活)单细胞悬浮液中。根据经验，包括例如碘化丙啶等死细胞染色无法充分地去除在消化后呈低CD45的细胞。
出于这一原因，我们认为可再现地分离基质的关键是开发一种低死亡率酶消化方案。使用分散酶、DNA酶I和胶原酶P的组合，常规分离出活力>95％的较大数量的基质细胞。这也使得能在个别小鼠和人类中比较每个基质细胞亚群，并且成功分选出稀少亚群，包括DN细胞和MRC，这将成为进一步研究的主题。通过组织学分析尚不可能鉴别DN基质，因为未报道独特或有差别表达的表面标记物。然而，可使用本文所述的分选策略来进行揭露这一稀少亚群所需的基于阵列的无偏差方法。
类似地，这些方法使得能直接从原始组织分离四个主要的人淋巴结基质细胞群，为复杂的临床和临床前研究开启了一道门。现已充分确定，小鼠淋巴结基质细胞表达许多临床上相关的自体抗原并且将其直接呈递到T细胞以对其产生耐受性(李(Lee)等人,2007,尼克斯(Nichols)等人,2007,加德纳(Gardner)等人,2008,马格努森(Magnusson)等人,2008,寇汉等人,2010,弗莱彻等人,2010)。可能的情况是，相同机制可在人类中起作用。研究显示，当在培养中模拟体内所见的相互作用时，FRC和LEC保留了将PTA呈递到天然T细胞的能力(寇汉等人,2010,弗莱彻等人,2010)，不过尚不清楚这是由目标PTA的连续转录还是肽-MHC的保留引起的。这些技术都可用于解决这一问题及有关人淋巴结生物学的许多其它突出问题。
此外，针对淋巴结的3D培养系统的开发将允许建立模拟体内条件和相互作用的高度控制的实验系统。已发现DC和淋巴细胞在体外易于并且优先在FRC网络上迁移，如已在体内观察到的一样。这些技术特别适用于利用人类细胞进行的研究。
我们意外地发现在年龄相配的幼雄性C57Bl/6小鼠之间基质细胞亚群存在较少变化。在测试特定基质细胞亚群的扩增是否需要淋巴细胞与基质之间的交互应答时，发现FRC、LEC、BEC和DN基质在Rag-/-小鼠中是以正常比例存在，显示在其发育或扩增中不需要T细胞或B细胞。先前未分离MRC(MadCAM-1+)基质细胞亚群进行流式细胞分析，并且发现MRC在肾小球足突细胞膜粘蛋白+CD31-FRC门控内形成亚群。尽管MRC与FRC显示相似性，即，表达VCAM-1和ICAM-1，并且分泌ECM组分(例如层粘连蛋白)，但其另外产生大量的CXCL13并且可通过MadCAM-1的表达进行鉴别(片贝等人,2008)。
意外的是，在Rag-/-小鼠中MRC的数量显著减少。每个细胞中MadCAM蛋白的水平也较低。通过组织学分析，MadCAM+MRC在皮肤引流Rag-/-淋巴结中是可见的(片贝等人,2008)，不过MadCAM表达和MRC数量的数量和定量流式细胞分析先前是不可能进行的。这些数据表明，淋巴细胞确实是MRC正常发育所需的。有趣的是，来自Rag-/-小鼠的LEC在较低比例下也发育成MadCAM+细胞，并且每个细胞显示较少蛋白质。MRC和MadCAM+LEC在Rag-/-小鼠中无法正常扩增还是仅仅无法上调MadCAM仍不清楚。MadCAM+LEC的作用也未描述。
由于MRC显示与LTo细胞相同的表型(片贝等人,2008)，其构造淋巴毒素信号传导下游和NF-κB2转录程序的淋巴结(米布斯(Mebius),2003,寇勒(Coles)等人,2010)，故已经推断出MRC可能在淋巴结基质的出生后维持或再生方面起到作用(片贝等人,2008)。结果显示，FRC、BEC和DN基质的正常扩增不需要MadCAM+MRC的正常扩增和/或成熟。然而，将需要其它功能研究来确定MRC功能(例如趋化因子的表达)和MadCAM表达是否是紧密联系的。
一个出乎意料的发现是皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结的FRC在比例、数量和转录谱方面显著不同。在肠系膜淋巴结中发现明显较少的FRC，其含有若干重要细胞因子和趋化因子的较少表达：IL6、IL7、BAFF、CXCL9、CXCL10、IL1受体辅助蛋白(IL1RAP)、激活素受体IlA、VEGFa、LIF及cKIT-配体。从统计学上看，路径分析显示这些基因明显不太可能偶然簇集。值得关注的是确定这些改变的发生是由先天发育差异引起，还是在暴露于不同的炎性提示(例如抗原暴露频率或剂量的差异)之后引起。使皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结暴露于明显不同的微环境刺激物。除非皮肤屏障被打破，否则在本研究中，预期驻留在皮肤引流淋巴结中的FRC相对少见遭遇大剂量的微生物来源的抗原。然而，肠系膜FRC通过肠的正常功能而经常地暴露于具有病原体相关性分子模式的阻挡，并且在Treg诱导和口服耐受性方面具有重要的稳态作用(哈迪斯(Hadis)等人,2011)。可合理地预期这些日常因素将改变表达谱，从而达到未知的作用。
已报道皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结的发育差异：肠系膜淋巴结的完整补体存在于Cxcl13-/-和Cxcr5-/-小鼠中，而许多皮肤引流淋巴结则遗失，或在特定位置发生变化(安赛尔(Ansel)等人,2000)。类似地，Ltb-/-小鼠发育肠系膜淋巴结(尽管异常)但缺乏许多皮肤引流淋巴结(科尼(Koni)等人,1997)。由于淋巴结发育是在胚胎发生期间起始，故这些结果表明，能够补偿CXCL13或LTβ的细胞因子在出生前肠系膜淋巴结中的可用性高于皮肤引流淋巴结中。类似地，与肠系膜淋巴结相比较，较低比例的推定的淋巴结组织者细胞存在于新生儿的皮肤引流淋巴结中(库佩多(Cupedo)等人,免疫学杂志(JImm)2004)。最后，在将皮肤引流淋巴结移植到肠系膜中之后，发现MadCAM-BEC不呈现肠系膜MadCAM+表型，表明所述差异是发育差异并且不是暴露于肠源性抗原的结果(艾伦特(Ahrendt)等人,2008)。近期的研究也有趣地表明，假定在移植之后被供体细胞进行性置换的所携带的造血细胞没有影响，则来自移植的外周和肠系膜淋巴结的基质可能在其诱导口服耐受性方面不同(布特纳(Buettner)等人,2011)。
在6周龄小鼠的皮肤引流淋巴结中，发现已知在淋巴结中起作用的若干细胞因子的高水平表达。IL6在来自皮肤引流淋巴结的FRC中上调6倍，其为一种经历复杂调控的细胞因子。当在暴露于促炎性IL1之后，在免疫反应中较早产生时，IL6具有有效的免疫刺激性，而且还能通过减低TNFα和IL-1信号传导以及上调IL10来发挥消炎功能。基质不表达IL10(数据未示出)。相反，发现在皮肤引流淋巴结中IL1受体辅助蛋白(IL1Rap)上调>3倍，表明皮肤引流淋巴结FRC能够在感染早期增加IL6的产生。因此，在稳态期间，来自皮肤引流淋巴结的FRC也表达高水平IL1R1(IL1Rap的高亲和力结合搭配物)，并且不表达诱骗类似物IL1-RN(迪纳雷洛(Dinarello),1996)(数据未示出)。支持这些发现的是，先前已报道FRC在数小时内对TLR3信号传导起反应(弗莱彻等人,2010)，表明FRC很快地对感染起反应。还值得注意的是，平滑肌细胞在伸长后产生具有消炎能力的IL6(派德森(Pedersen),2006)，作为使PDGF-受体磷酸化并刺激细胞收缩的一种手段(胡(Hu)等人,1998,扎佩塔奇(Zampetaki)等人,2005)。类似地，在皮肤肌成纤维细胞中，IL6调节α平滑肌肌动蛋白以增强收缩和伤口闭合(盖鲁奇(Gallucci)等人,2006)。与肌成纤维细胞一样，FRC是表达大量α平滑肌肌动蛋白的高收缩性细胞((林克等人,2007)并且数据未示出)。IL6与LIF共用一种受体，LIF在来自皮肤引流淋巴结的FRC中也上调。与IL6一样，LIF在收缩的肌细胞中上调，作为诱导自分泌或旁分泌肌肉细胞增殖的一种手段。IL6、IL1Rap和LIF代表了在所鉴别的网络中由来自皮肤引流淋巴结的FRC上调最多的3种基因。
利用淋巴细胞功能的直接相关性，发现在皮肤引流FRC中IL7和BAFF上调超过两倍。IL7是已知的FRC产物，并且用于维持天然T细胞(林克等人,2007)。BAFF是B细胞的有效存活因子和共刺激活化剂。在次级淋巴系器官中，已知其是由非造血FDC产生，但先前在FRC中未曾报道。然而，在淋巴结外部的基质细胞的BAFF表达多有报道，不过这看来需要慢性炎症并且先前未曾与稳态基质相关联(马凯(Mackay)等人,2009)。我们的细胞分选不含FDC污染，因为在转录分析期间，未发现Fcγ受体表达的证据，并且<1％的淋巴结基质细胞对FDC-M1或CD35染色呈阳性(数据未示出)。FDC局限于B细胞滤泡，同时FRC包围B细胞滤泡，并且偶尔延伸到B细胞滤泡中。然而，两种细胞类型被认为是从共同的前体发育而来(米布斯(Mebius),2003)。这一结果支持并扩大了这些细胞类型之间所述相似性的清单。
意外的是，结果指示，在皮肤引流淋巴结和肠系膜淋巴结中FRC表达CXCL9和CXCL10。这些趋化因子都通过由活化的T细胞、B细胞和NK细胞表达的CXCR3进行信号传导，并且IFNγ、IFNα和其它促炎性刺激物使其转录上调(穆勒(Muller)等人,2010)。尽管未描述CXCL10在稳态期间于淋巴结中的作用，但在一些感染期间，CXCL10在保持淋巴结中的Th1淋巴细胞方面具有重要作用，这一机制促使新活化的T细胞也变为Th1，从而产生极化的适合微生物的反应(米山(Yoneyama)等人,2002)。然而，截至目前，仅在淋巴结内的成熟DC中鉴别出CXCL10的产生(米山等人,2002)。这些数据显示，稳态FRC也表达CXCL10mRNA，其功能未知。
对于CXCL9研究很少，但已在来自癌症相关淋巴系组织和引流淋巴结的树突状细胞中观察到(大谷(Ohtani)等人,2009)。其在淋巴结中细胞迁移的稳态调控方面的任何作用并未报道。
有趣的是，来自肠系膜淋巴结和皮肤引流淋巴结二者的FRC都表达涉及向内皮细胞传导信号的基因。已知FRC是在稳态条件下皮肤引流淋巴结中VEGF的主要产生者(邱(Chyou)等人,2008)。意外地发现来自皮肤引流淋巴结的FRC的VEGFa表达水平高于来自肠系膜淋巴结的FRC。事实上，与皮肤引流淋巴结相比较，肠系膜淋巴结显示相对较短的上调基因清单，并且当针对多重假设进行稳健统计校正时，这些结果未定位到功能路径。然而，观察到肠系膜淋巴结中MadCAM表达和淋巴细胞隔离所需的已知肠相关基因(例如，Nkx2-3)上调(帕斯特(Pabst)等人,2000)；以及Lrat、Tgm2、Meis1及Pltp上调。这些基因或涉及到视黄酸代谢循环，或在视黄酸作用下上调(马特苏拉(Matsuura)等人,1993,曹(Cao)等人,2002,盖尔顿(Galdones)等人,2006,雷柏(Rebe)等人,2009)，视黄酸在肠系膜淋巴结中进行加工以对T细胞赋予肠特异性归巢表型(艾瓦塔(Iwata),2009)。还发现若干血管舒张剂(Vipr2、Itih4、Npr1)和血管收缩剂(Agt)的表达，表明FRC积极地与淋巴结血管通讯。类似地，诱导神经突触生长的基因(Efna5、gpr126、Tmem35和Ngf)上调表明了在维持淋巴结正常交感神经支配方面的潜在作用(帕努西奥(Panuncio)等人,1999)。将需要其它研究来验证这些结果。
总体而言，皮肤引流淋巴结中细胞因子和趋化因子表达的变化提出了通过FRC调控微环境的一个新颖前景。BAFF和CXCR3配体的表达意味着先前未报道的与造血系统交互应答的机制。类似地，IL-6、IL1Rap和LIF上调表明，与其肠系膜淋巴结对应物相比较，皮肤引流淋巴结FRC可为收缩性更强和/或活跃分裂更快的，类似地影响内皮细胞通过转录增加的VEGFα来保持一致。
然而，这些转录事件没有同等地发生在所有FRC中。淋巴结含有许多未充分了解的FRC微小生境。其中研究最多的是皮质T细胞区FRC(有时称为TRC)，其产生IL-7、CCL19、CCL21，维持管道系统并且被用作DC、T细胞和B细胞迁移的支架。然而，成纤维细胞性gp38+CD31-细胞存在于整个淋巴结中；毗邻B细胞滤泡的囊下区中；作为周皮细胞；以及整个骨髓中。仍不太可能区分这些不同的FRC类型，并且如果其有差别地表达所鉴别的细胞因子和趋化因子，那么皮肤引流淋巴结与肠系膜淋巴结之间的差异可能涉及其比例的变化。
总体而言，这些数据表示了适用于淋巴结基质细胞的全面技术目录。
表1：在FACSAria和FACSAria IIu(BD生物科技公司)中对于100μm吸头的低压基质细胞分选参数的样品范围。n＝4-8个独立实验
| 分选参数 | FACSAria | FACSAria IIu |
| 频率 | 23.1-25.9 | 19.2-21.6 |
| 振幅 | 24.0-45.6 | 8.6-13.5 |
| 相 | 0-3 | 0 |
| 衰减 | 打开 | 关闭 |
| 液滴延迟 | 18.56-20.81 | 15.96-17.92 |
| 第一滴 | 189-295 | 200-243 |
| 靶间隔 | 6-10 | 10 |
表2：用于表征非造血淋巴结基质细胞的表面标记物的酶敏感性.将培养的或新鲜分离的基质与酶一起培育10分钟，然后通过流式细胞分析测试表面蛋白质的表达。数据表示n＝3次独立实验。
+存在表面标记物(不敏感)
-不存在表面标记物(敏感)
+/-表面标记物部分裂解(部分敏感)
表3：通过功能相似性分组的来自肠系膜淋巴结的FRC相较于来自皮肤引流淋巴结的FRC中上调的基因。使用微阵列分析来比较从皮肤引流淋巴结或肠系膜淋巴结分选的FRC的基因表达。基因选择是基于表达(在SLN或MLN中平均表达>120)、各重复之间的低变异系数(<0.05)、倍数变化(相较于皮肤引流FRC，肠系膜淋巴结FRC中至少增加2倍)及P值(*<0.05；**<0.01；斯图登氏T测试)进行。基于文献关键词搜索对基因进行分组。
本发明的应用不局限于以上说明中所陈述或图式中所说明的构造细节和组分布置。本发明能够包含其它实施例，并且能够以各种方式实践或进行。另外，本文中使用的措辞和术语都是出于说明的目的，并且不应视作限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”等旨在涵盖其后所列各项和其等效物以及其它各项。
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Claims (35)
1.一种用于抑制免疫反应的方法，其包含：
向需要此类治疗的受试者投予有效抑制所述受试者的所述免疫反应的量的分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞LSSC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中投予所述受试者的所述LSSC是离体扩增的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中投予所述受试者的所述LSSC实质上不含非LSSC。
4.根据权利要求2所述的方法，其中将至少10万个LSSC/kg投予所述受试者。
5.根据权利要求3所述的方法，其中将至少100万个LSSC/kg投予所述受试者。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中投予所述受试者的所述LSSC是来源于淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体和/或派尔集合淋巴结(Peyer'spatch)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述LSSC是在植入所述受试者中的二维或三维构架之上或之中。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述LSSC是通过静脉内、腹膜内、动脉内、皮下或肌肉内注射或通过局部投予到病变、器官、器官囊、脂肪或淋巴结中来向所述受试者投予。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者患有自体免疫性或炎症性疾病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述自体免疫性或炎症性疾病选自由以下各项组成的群组：类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病及败血病。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中所述LSSC相对于所述受试者为自体、同种异体或异种异体的。
12.一种分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞LSSC的方法，其包含使用酶混合物与搅动的组合来消化淋巴系组织片段，然后收集所述LSSC。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述淋巴系组织片段的消化是以一系列步骤进行，所述步骤包含：
(i)将所述淋巴系组织片段与酶混合物一起培育；
(ii)使用移液管搅动所述组织，随后培育以使较大片段沉降；
(iii)取出上清液并重复步骤(i)和(ii)，直到所有片段都消化；以及
其中通过汇集所有上清液部分，随后离心以获得细胞团粒来收集所述LSSC。
14.根据权利要求13所述的方法，其中使所述分离LSSC在包含补充有生长因子、血清、血小板溶解产物和抗生素中的一或多种的基础细胞培养基的培养基中生长。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述分离LSSC是以1-10,000个细胞/平方厘米的密度生长。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述分离LSSC是在0.1-21％的氧分压下生长。
17.根据权利要求14所述的方法，其中使所述LSSC生长直到所述LSSC实质上不含非LSSC。
18.根据权利要求14所述的方法，其中使所述LSSC生长直到基质细胞的数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或更多。
19.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述酶混合物包含培养基、分散酶、胶原酶和DNA酶I。
20.根据权利要求12到17中任一权利要求所述的方法，其中所述LSSC是来源于淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体或派尔集合淋巴结。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述LSSC是使用根据权利要求12到20中任一权利要求所述的方法分离的。
22.一种包含分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞LSSC的组合物，其中所述LSSC是使用根据权利要求12到20中任一权利要求所述的方法分离的。
23.一种医药制剂，其包含分离淋巴系组织源性抑制性基质细胞LSSC的组合物。
24.根据权利要求23所述的医药组合物，其中所述LSSC是通过使用化学方法、机械方法和电细胞分离方法中的一或多种处理淋巴系组织片段，然后收集所述LSSC来分离的。
25.根据权利要求24所述的医药组合物，其中所述分离LSSC是通过细胞培养扩增的。
26.根据权利要求23到25中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC是离体扩增的细胞。
27.根据权利要求23到26中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC是通过使所述收集的LSSC生长直到所述LSSC实质上不含非LSSC来进行扩增。
28.根据权利要求23到27中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC共同表达CD140a和PD-L2。
29.根据权利要求23到27中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC共同表达CD140a和LTBR。
30.根据权利要求23到27中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC共同表达CD140a、PD-L2和LTBR。
31.根据权利要求28到30中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC表达至少一种选自由以下各项组成的群组的其它淋巴系标记物：PD-L1、Thy-1、MADCAM-1、MYH11、IL-7R或ITGA7。
32.根据权利要求23到31中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述分离LSSC表达至少一种选自由IL-6、CCL19、CCL21或VEGF组成的群组的因子。
33.根据权利要求23到32中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述细胞是从选自由以下各项组成的群组的物种分离：人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、猪科动物、牛科动物及啮齿动物。
34.根据权利要求23到33中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述细胞在体外抑制T细胞增殖。
35.根据权利要求23到34中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述LSSC是从淋巴结、脾、胸腺、扁桃腺、腺样增殖体或派尔集合淋巴结分离的。
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