CN102264891A - Th2细胞诱导用组合物和Th2型疾病的治疗组合物、以及该组合物的利用 - Google Patents

Th2细胞诱导用组合物和Th2型疾病的治疗组合物、以及该组合物的利用 Download PDF

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Abstract

本发明提供：由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物、含有抗原和与该抗原结合的IgE的组合物、以及使用该复合物或该组合物的方法。通过本发明，能够将原初T细胞诱导为Th2细胞。另外，本发明明确了Th2型免疫应答的作用机制、尤其是初始IL-4的产生机制，因此如果使用本发明，则能够提供治疗/预防Th2型疾病的技术。

Description

Th2细胞诱导用组合物和Th2型疾病的治疗组合物、以及该组合物的利用
技术领域
本发明涉及一种用来诱导Th2细胞的组合物及该组合物的利用，尤其涉及一种用来产生引起Th2型免疫应答的初始IL-4的组合物及该组合物利用。另外，本发明涉及一种用来治疗Th2型疾病的组合物及该组合物的利用，尤其涉及一种用来阻断引起Th2型免疫应答的初始IL-4的产生的组合物及该组合物的利用。
背景技术
巨噬细胞或树突状细胞在细菌侵入时，树突状细胞(DC；Dendritic cell)经由Toll样受体(TLR；Toll-like receptors)识别细菌，且成熟到可以表达刺激辅助分子并产生用于诱导Th1型免疫应答的IL-12和IL-18等。原初T细胞介由这些分子与巨噬细胞或树突状细胞结合，并在IL-12的作用下分化为Th1细胞。该Th1细胞分泌的IFN-γ使巨噬细胞活化，从而使吞噬、杀菌等作用活化。
原初T细胞通过IL-12分化为Th1细胞，通过IL-4分化为Th2细胞。Th2细胞与Th1细胞都是适应性免疫系统中的重要细胞。然而，Th2型免疫应答的发达对先天性免疫细胞起到的作用却几乎未得到的足够认识。
嗜碱性粒细胞和肥胖细胞是IgE介导性过敏性炎症中的重要效应细胞(参照非专利文献1～4)。另外，在感染了寄生虫的宿主小鼠体内，嗜碱性粒细胞在脾脏和肝脏中的增殖以及Th2细胞被强力诱导(参照非专利文献5)。这一情况显示出嗜碱性粒细胞有助于诱导和/或增强Th2应答。
[现有技术文献]
非专利文献1：Galli，S.J.Curr Opin Hematol 7：32-9(2000)
非专利文献2：Galli，S.J.et al.Annu Rev Immunol 23：749-86(2005)
非专利文献3：Kawakami，T.&Galli，S.J.Nat Rev Immunol 2：773-86(2002)
非专利文献4：Mukai，K.et al.Immunity 23：191-202(2005)
非专利文献5：Min，B.et al.J Exp Med 200：507-17(2004)
发明内容
但是，关于为使原初CD4+T细胞分化为Th2细胞而需的初始IL-4，产生该初始IL-4的细胞的性质尚属未知，另外，也不知晓用以产生初始IL-4的初期刺激是利用何种物质来进行的，因此先天免疫活性细胞分化诱导Th2细胞的机制尚未明确。
本发明是鉴于所述问题研究而成的，其目的在于通过明确Th2型免疫应答的作用机制，尤其是通过明确初始IL-4的产生机制来提供一种治疗/预防Th2型疾病的技术。
本发明者们发现：嗜碱性粒细胞摄取抗原，将其片段化并提呈于表面，同时产生IL-4，在该IL-4的存在下识别到嗜碱性粒细胞表面所提呈的抗原肽/MHC-II型分子复合物原初T细胞，被诱导为Th2细胞。另外还发现，当诱导为Th2细胞时，受到刺激的B细胞发生活化，从而产生针对抗原的IgE。通过上述的发现，本发明者等完成了本发明。即，本发明的组合物的特征在于：为了将原初T细胞诱导为Th2细胞，而含有嗜碱性粒细胞。本发明的组合物优选还含有抗原，更优选还含有与该抗原结合的IgE。
本发明的组合物可以利用在将原初T细胞诱导为Th2细胞的方法中。即，本发明的Th2细胞诱导方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养。
本发明的组合物的特征在于：为了生成IL-4，而含有嗜碱性粒细胞。本发明的组合物优选还含有抗原，更优选还含有与该抗原结合的IgE。
本发明的组合物可以利用在生成IL-4的方法中。即，本发明的IL-4产生方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞。如果使用本方法，那么可以产生IL-4、尤其是初始IL-4(primary IL-4)。另外，本发明的IL-4产生方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养。如果使用本方法，那么可以产生IL-4、尤其是次级IL-4(secondary IL-4)。
本发明的组合物的特征在于：为了生成IgE，而含有嗜碱性粒细胞。本发明的组合物优选还含有抗原，更优选还含有与该抗原结合的IgE。
本发明的组合物可以利用在生成IgE的方法中。即，本发明的IgE生成方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养；第4步骤，在该抗原和抗原提呈细胞的存在下将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养。如果使用本方法，可以产生IgE、尤其是初始IgE(primary IgE)。另外，本发明的IgE生成方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养；第4步骤，在该抗原和抗原提呈细胞的存在下将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养；第5步骤，在第4步骤中所生成的IgE的存在下，培养该抗原、该Th2细胞及B细胞。如果使用本方法，可以产生IgE、尤其是次级IgE(secondary IgE)。
本发明的组合物的特征在于：为了筛选针对Th2型疾病的治疗剂，而含有嗜碱性粒细胞。本发明的组合物优选还含有抗原，更优选还含有与该抗原结合的IgE。此外，作为优选，所述Th2型疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群体。
本发明的组合物可以利用在筛选针对Th2型疾病的治疗剂的方法中。即，本发明的筛选方法的特征在于包括如下步骤：第1步骤，形成由抗原与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞。在本发明的筛选方法中，优选在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤，并测定第2步骤后的嗜碱性粒细胞的细胞表面上所提呈的MHC-II型分子或CD80分子的量。
另外，本发明的筛选方法中，还包括：将形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物的第1步骤原初T细胞，与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤，并且在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤或第3步骤，并测定第3步骤中所诱导的Th2细胞的量。
进而，本发明的筛选方法中，还包括：将形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物的第1步骤B细胞，在所述抗原和抗原提呈细胞的存在下与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养而生成IgE的第4步骤，并且在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤～第4步骤的至少1个步骤，并测定第4步骤中所生成的IgE的量。
进而，本发明的筛选方法中，包括：在通过用于形成由抗原和与该抗原结合的IgE的复合物的所述第1步骤、第4步骤所生成的IgE的存在下，培养所述抗原、Th2细胞及B细胞的第5步骤；并且在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤～第5步骤的至少1个步骤，并测定第5步骤中所生成的IgE的量。
本发明的模型动物制作方法的特征在于，为了制作Th2型疾病的模型动物而包括：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；将在所述复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞投予动物的步骤。此外，作为优选，所述Th2型疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群体。以本发明的制作方法所制作的模型动物可以是支气管哮喘的模型动物，于此情况下，优选在静脉内投予在所述复合物的存在下培养后的嗜碱性粒细胞后，经鼻投予该抗原。
以这种制作方法制作的模型动物可以用在筛选针对Th2型疾病的治疗剂中。即，本发明的筛选方法的特征在于，为了筛选针对Th2型疾病的治疗剂而包括：向动物投予通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞来制作模型动物的步骤；向该模型动物投予候选物质的步骤；以及，测定被投予了该候选物质后的模型动物中有无针对Th2型疾病的改善效果的步骤。
本发明的组合物的特征在于：为了处置Th2型疾病，而含有清除嗜碱性粒细胞的物质或、阻碍FcεR1的功能的物质。本发明的组合物优选含有针对FcεR1的抗体。
本发明的方法的特征在于，为了处置Th2型疾病而包括：从被试验体中清除嗜碱性粒细胞的步骤或、向被试验体投予阻碍FcεR1的功能的物质的步骤。本发明的方法优选包括向被试验体投予针对FcεR1的抗体的步骤。
另外，本发明者们发现：优选使用利用抗原-IgE复合物而被激活的嗜碱性粒细胞；移植至正常小鼠体内的抗原-IgE复合物诱导由内源性的嗜碱性粒细胞引起的Th2应答。即，本发明的复合物的特征在于：由抗原和与该抗原结合的IgE所组成。通过本发明，可以使用外周血、脾脏、骨髓等中所存在的嗜碱性粒细胞来诱导产生IL-4。这种嗜碱性粒细胞能够在脾脏等中诱导Th2应答。另外，本发明的组合物的特征在于：含有抗原和与该抗原结合的IgE。如果使用这种组合物，那么可以生成本发明的复合物，因此可以诱导Th2应答。进而，本发明的试剂盒的特征在于：具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。如果使用这种试剂盒，那么可以生成本发明的复合物，因此可以诱导Th2应答。
本发明的组合物可以用在将原初T细胞诱导为Th2细胞的技术中。即，本发明的组合物的特征在于：为了将原初T细胞诱导为Th2细胞，而含有抗原和与该抗原结合的IgE。另外，本发明的试剂盒的特征在于：为了将原初T细胞诱导为Th2细胞，而具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
本发明的组合物可以用在生成IL-4的技术中。即，本发明的组合物的特征在于：为了生成IL-4，而含有抗原和与该抗原结合的IgE。另外，本发明的试剂盒的特征在于：为了生成次级IL-4，而具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
本发明的组合物可以用在生成IgE的技术中。即，本发明的组合物的特征在于：为了生成IgE，而含有抗原和与该抗原结合的IgE。另外，本发明的试剂盒的特征在于：为了生成IgE，而具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
本发明的组合物可以用在筛选针对Th2型疾病的治疗剂的技术中。即，本发明的组合物的特征在于：为了筛选针对Th2型疾病的治疗剂，而含有抗原和与该抗原结合的IgE。另外，本发明的试剂盒的特征在于：为了筛选针对Th2型疾病的治疗剂，而具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
本发明的组合物可以用在制作Th2型疾病的模型动物的技术中。即，本发明的组合物的特征在于：为了制作Th2型疾病的模型动物，而含有抗原和与该抗原结合的IgE。另外，本发明的试剂盒的特征在于：为了制作Th2型疾病的模型动物，而具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
[发明的效果]
通过本发明，可以明确Th2型免疫应答的作用机制、尤其是初始IL-4的产生机制。另外，如果使用本发明，则能够实现Th2细胞诱导、IL-4生成、IgE生成、Th2疾病治疗剂的筛选。进而，如果使用本发明，则能够制作Th2型疾病的模型动物。
附图说明
图1(a)是，利用流式细胞仪对由正常小鼠或感染寄生虫的小鼠制备的脾脏非B非T细胞中的FcεR1和c-kit的表达进行分析而获得的结果、以及分离FcεR1+/c-kit-细胞(嗜碱性粒细胞)的结果的图。
图1(b)是表示所分离的嗜碱性粒细胞的培养上清液中的细胞因子含量的图。
图1(c)是，利用FACS(fluorescence-activated cell sorter荧光激活细胞分拣器)，对于在清除了T细胞的小鼠的脾细胞(ΔT脾脏)、或来自感染寄生虫的小鼠的嗜碱性粒细胞的存在下，用OVA323-339刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞上的细胞质IL-4和IFN-γ，进行分析而获得的结果的图。
图1(d)是，在清除了T细胞的小鼠的脾细胞(ΔT脾脏)、或来自感染寄生虫的小鼠的嗜碱性粒细胞的存在下，用OVA323-339刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞上的IL-33Rα链的表达的图。
图2(a)是，利用各种表面标记物对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞、以及清除了T细胞的脾细胞(ΔT脾脏)进行染色而获得的结果的图。
图2(b)是，利用流式细胞仪对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞的MHC-II型(I-A)和FcεR1的表达进行分析而获得的结果的图。
图2(c)是，就c-kit和CD203c(左)以及CD203c+c-kit-细胞中的HLA-DR(右)的表达，利用流式细胞仪，对在人类IL-3的存在下进行培养的CD34+脐带血细胞进行分析而获得的结果的图。
图3(a)是，对在清除了T细胞的小鼠脾细胞(ΔT脾脏)、源于骨髓的纯化嗜碱性粒细胞或肥胖细胞的存在下，用OVA323-339刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞中的IL-4及IFN-γ的表达，利用FACS进行分析而获得的结果的图。为了诱导成Th2细胞，进一步向培养物中添加了IL-4(1000U/mL)(Th2条件)。
图3(b)是，对在源于骨髓的纯化嗜碱性粒细胞(WT：野生型小鼠；G4/G4：IL-4缺损小鼠)或脾脏DC的存在下，用OVA323-339刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞中的IL-4和IFN-γ的表达，利用FACS进行分析而获得的结果的图。
图3(c)是，对在清除了T细胞的小鼠脾细胞(ΔT脾脏)、源于骨髓的纯化嗜碱性粒细胞的存在下，用DNP-OVA刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞中的IL-4和IFN-γ的表达，利用FACS进行分析而获得的结果的图。
图3(d)是，对于在清除了T细胞的小鼠脾细胞(ΔT脾脏)、源于骨髓的纯化嗜碱性粒细胞的存在下且在抗DNP IgE mAb的存在下或非存在下，用DNP-OVA(6.25～100μg/mL)刺激原初T细胞而生成的CD4+T细胞中的IL-4和IFN-γ的表达，用FACS进行分析而获得的结果的图。
图4(a)是，使用与DNP-OVA/抗DNP IgE一同培养的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞来免疫正常小鼠，4天后使用完整的OVA蛋白质对小鼠进行静脉内激发，在激发的2天后利用经OVA激活的APC(ΔT-脾脏)刺激由该小鼠制备的脾脏CD4+T细胞5天，并利用ELISA对培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的量进行测定而获得的结果的图。
图4(b)是，使用与DNP-OVA/抗DNP IgE一同培养的嗜碱性粒细胞来免疫正常小鼠，1周后使用完整的OVA蛋白质对小鼠进行静脉内激发，利用ELISA对在激发当天自该小鼠回收的血清中的OVA特异性IgE抗体和IgG1抗体进行测定而获得的结果的图。
图4(c)是，使用与DNP-OVA/抗DNP IgE一同培养的嗜碱性粒细胞来免疫正常小鼠，1周后使用完整的OVA蛋白质对小鼠进行静脉内激发，在激发的2周后利用经OVA激活的APC(ΔT-脾脏)刺激由该小鼠制备的脾脏CD4+T细胞5天，并利用ELISA对培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的量进行测定而获得的结果的图。
图4(d)是，使用与DNP-OVA/抗DNP IgE一同培养的嗜碱性粒细胞来免疫正常小鼠，1周后使用完整的OVA蛋白质对小鼠进行静脉内激发，在激发的2周后对由该小鼠制备的脾脏中的CD4+CD62Llow IL33Rα+Th2细胞的比例进行测定而获得的结果的图。
图4(e)是，根据作为IL-4的报告基因的GFP的表达，对注入图中所示用量的DNP-OVA/抗DNP IgE前后时的小鼠外周血、脾脏、骨髓中的IL-4产生进行确认的结果图。
图4(f)是，在注入图中所示用量的DNP-OVA/抗DNP IgE前后向小鼠腹腔内投予抗FcεR1α(MAR-1)，并在注入DNP-OVA/抗DNP IgE 4天后由该小鼠制备脾脏CD4+T细胞，利用经OVA激活的APC(ΔT-脾脏)刺激该脾脏CD4+T细胞5天，并利用ELISA对培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的量进行测定而获得的结果的图。
图4(g)是，在注入图中所示用量的DNP-OVA/抗DNP IgE前后向小鼠腹腔内投予抗FcεR1α(MAR-1)，并在注入DNP-OVA/抗DNP IgE 4天后由该小鼠制备脾脏CD4+T细胞，利用经OVA激活的APC(ΔT-脾脏)刺激该脾脏CD4+T细胞5天，并利用ELISA对培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的量进行测定而获得的结果的图。
图4(h)是，在注入DNP-OVA/抗DNP IgE 4天后，使用完整的OVA蛋白质对被注入了图中所示用量的DNP-OVA/抗DNP IgE的小鼠进行静脉内激发，并利用ELISA对在激发当天自该小鼠回收的血清中的OVA特异性IgE抗体和IgG1抗体进行测定而获得的结果的图。其中，为了减少或增加嗜碱性粒细胞的数量，而对小鼠注入了抗FcεR1α(MAR-1)。
图4(i)是，在注入DNP-OVA/抗DNP IgE 4天后，使用完整的OVA蛋白质对被注入了图中所示用量的DNP-OVA/抗DNP IgE的小鼠进行静脉内激发，并利用ELISA对在激发当天自该小鼠回收的血清中的OVA特异性IgE抗体和IgG1抗体进行测定而获得的结果的图。其中，为了减少或增加嗜碱性粒细胞的数量，而对小鼠注入了IL-3。
图5是由嗜碱性粒细胞驱动的Th2细胞的细胞因子产生的示图；图5表示了，在清除了T细胞的小鼠脾细胞(ΔT脾脏)的存在下，或在来自感染了寄生虫的小鼠的嗜碱性粒细胞的存在下，利用OVA323-339刺激原初T细胞7天，然后在经照射的清除了T细胞的小鼠脾细胞的存在下且在IL-33的存在或非存在下，使用OVA323-339激发所生成的CD4+T细胞48小时，并对所回收的上清液中的各种细胞因子的产生进行实验而获得的结果。
图6(a)是，将小鼠骨髓细胞与IL-3一同培养10天，利用流式细胞仪分析FcεR1和c-kit的表达，接着利用FACS Aria对FcεR1+/c-kit-(嗜碱性粒细胞)的细胞群与FcεR1+/c-kit+(肥胖细胞)的细胞群进行分拣而获得的结果的图。
图6(b)是利用电子显微镜观察所分拣的FcεR1+/c-kit-(嗜碱性粒细胞)和FcεR1+/c-kit+(肥胖细胞)的细胞群而获得的结果的图。
图6(c)是，对通过阴性分选而浓缩的人类外周血单核细胞的，刚分选后的(左)以及在人类IL-3的存在下培养了24小时后(右)的HLA-DR与CD203c的表达进行测定而获得的结果的图。
图6(d)是表示所分拣的CD203c+/HLA-DR+细胞群的吉姆萨染色结果(左：100×)和电子显微镜观察(右)结果的图。
图7是表示嗜碱性粒细胞诱导性的抗原特异性T细胞增殖的图；图7是，用OVA323-339(1μM)，或用抗DNP IgE mAb的存在下或非存在下的DNP-OVA，在经照射的ΔT脾脏或嗜碱性粒细胞的存在下刺激原初T细胞4天，并测定最终16小时期间内的DNA合成而获得的结果的图。
图8(a)是，用OVA323-339，或用抗DNP IgE mAb的存在下或非存在下的DNP-OVA，在经照射的ΔT脾脏或嗜碱性粒细胞的存在下刺激原初T细胞24小时，回收上清液，并利用ELISA对IL-4的产生进行实验而获得的结果的图。
图8(b)是，在抗DNP IgE mAb的存在下或非存在下，用DNP-OVA刺激源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞16小时，回收上清液，并利用ELISA对IL-4或IL-13的产生进行实验而获得的结果的图。
图8(c)是，利用RT-PCR，对从源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞中提取的mRNA，就TLR基因和β-肌动蛋白的表达进行分析而获得的结果的图。
图8(d)是，利用IL-3和IL-18、IL-33、LPS或PGN刺激源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞24小时，回收上清液，并利用ELISA对IL-4、IL-6或IL-13的产生进行实验而获得的结果的图。
图9(a)是，利用流式细胞仪，对由腹腔内被投予了抗小鼠Fcε1α(MAR-1(+))或PBS(MAR-1(-))的小鼠在最终投予的2天后制备的脾脏中的嗜碱性粒细胞的数量，进行定量而获得的结果的图。
图9(b)是，利用流式细胞仪，对由腹腔内被投予了抗小鼠Fcε1α(MAR-1(+))或PBS(MAR-1(-))的小鼠在最终投予的2天后制备的肝脏中的嗜碱性粒细胞的数量，进行定量而获得的结果的图。
图9(c)是，向腹腔内被投予了抗小鼠Fcε1α(MAR-1(+))或PBS(MAR-1(-))的小鼠，与MAR-1或PBS一起注入DNP-OVA/抗DNP IgE 3天，并利用OVA进行腹腔内激发后，进而利用MAR-1或PBS进行处理所制备的血液中的嗜碱性粒细胞数量的定量结果图。
图9(d)是，向腹腔内投予了抗小鼠Fcε1α(MAR-1(+))或PBS(MAR-1(-))的小鼠，与MAR-1或PBS一起注入DNP-OVA/抗DNP IgE 3天，并利用OVA进行腹腔内激发后，进而利用MAR-1或PBS进行处理所制备的脾脏中的嗜碱性粒细胞数量的定量结果图。
图9(e)是，针对来自注入了IL-3的小鼠的嗜碱性粒细胞的频率，FcεR1+/DX5+细胞相对脾脏非B非T细胞的比例的示图。
图10是，利用经抗原激活的嗜碱性粒细胞或IgE复合物在体内诱导Th2/IgE的机制的示意图。
具体实施方式
(1：嗜碱性粒细胞及其利用)
现已知嗜碱性粒细胞和肥胖细胞是过敏性炎症的效应细胞。此次，本发明者们发现嗜碱性粒细胞表达主要组织相容性抗原II型分子和CD80分子，并且发现嗜碱性粒细胞将抗原摄入细胞内，进而使源于抗原的肽片段以与II型分子结合的形态表达于细胞表面，且产生IL-4。进而发现，如果将这种嗜碱性粒细胞移植入正常小鼠体内，那么会诱导出抗原特异性Th2细胞，进而如果静脉投予OVA溶液，那么会诱导产生OVA特异性IgE；如果经鼻投予，那么会诱导支气管哮喘。如此，本发明是基于本领域技术人员所无法容易预测的新颖见解而完成的。
本发明的组合物的特征在于含有嗜碱性粒细胞。如上所述，本发明者们发现：嗜碱性粒细胞摄取抗原后，将其片段化并提呈于表面，且产生IL-4，在该IL-4的存在下被提呈至识别嗜碱性粒细胞表面的抗原肽/MHC-II型分子复合物被原初T细胞识别后，该原初T细胞分化为Th2细胞。还发现，当诱导出Th2细胞时，B细胞会活性化，且产生针对抗原的IgE。从而，本发明者们完成了本发明。即，本发明的组合物适于自原初T细胞向Th2细胞的诱导、IL-4的生成、IgE的生成等。
为了摄取抗原且将其片段化并提呈于表面，本发明的组合物含有嗜碱性粒细胞即可，但也可以还含有靶抗原，为了进一步促进靶抗原的摄取，优选还含有与该抗原结合的IgE。进而，为了促进需被摄入嗜碱性粒细胞内的抗原-IgE复合物的形成，也可以向抗原连结半抗原。于此情况下，IgE也可以是抗半抗原IgE，在本说明书中，抗半抗原IgE也属于与该抗原结合的IgE的范畴。
本发明所使用的优选嗜碱性粒细胞可以由各种组织制备，优选源于脾脏、脊髓等组织的嗜碱性粒细胞。由于生物体内所存在的嗜碱性粒细胞的比例非常小，所以更优选将自组织中取得的嗜碱性粒细胞在活体外培养，使之增殖并使用。本发明所使用的优选抗原是能够成为各种疾病的相关抗原(即免疫原)的蛋白质(包括肽)即可，其没有特别限定。由于本领域技术人员充分知道引起Th2型疾病的抗原，所以可以基于周知技术而容易地获取本发明所使用的优选抗原。另外，获取了靶抗原(免疫原)的本领域技术人员可以基于周知技术容易地获得本发明中所优选使用的IgE。此外，在本说明书中，“Th2型疾病”是指因诱导出Th2细胞而引起的过敏性疾病，其可以与“Th2型过敏性疾病”交换使用。作为Th2型疾病，可以列举花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎等，但并不限定是该些疾病。
“组合物”是各种成分包含在一种物质中的形态，“试剂盒”是指各种成分的至少1种包含在另一物质中的形态，在本说明书中，试剂盒也是组合物的一个形态。此外，术语“试剂盒”是指具备内含特定材料的容器(例如瓶(bottle)、板(plate)、试管(tube)、盘(dish)等)的包装。优选“试剂盒”中具备各材料使用方法的指示书。在本说明书中，在涉及到试剂盒的实施方式时，“具备”的状态是指内含在构成试剂盒的各容器的任一个中，但也可以将多种成分在同一容器中混合具备，或也可以具备在不同容器中。“指示书”可以书写或印刷在纸张或其他介质上，或者储存在磁带、计算机可读取的碟片(disk)或磁带(tape)、CD-ROM等电子介质中。本发明的试剂盒也可以具备内含稀释剂、溶剂、清洗液或其他试剂的容器。进而，本发明的试剂盒也可以一并具备使用时所需的器具。
在一个实施方式中，本发明的组合物的特征在于：是具备嗜碱性粒细胞的试剂盒。本实施方式的试剂盒优选还具备抗原，更优选还具备与该抗原结合的IgE。
如上所述，本发明的组合物可以用在将原初T细胞诱导为Th2细胞的方法中。即，本发明的Th2细胞诱导方法的特征在于具备：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养。
另外，本发明的组合物可以用在生成IL-4的方法中。即，本发明的IL-4产生方法的特征在于具备：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞。如果使用本方法，那么可以产生IL-4、尤其是初始IL-4(primary IL-4)。另外，本发明的IL-4产生方法的特征在于具备：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养。如果使用本方法，那么可以产生IL-4、尤其是次级IL-4(secondary IL-4)。
进而，本发明的组合物可以用在生成IgE的方法中。即，本发明的IgE生成方法的特征在于包括：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养；第4步骤，在该抗原和专职抗原提呈细胞的存在下，将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养。如果使用本方法，那么可以产生IgE、尤其是初始IgE(primary IgE)。另外，本发明的IgE生成方法的特征在于包括：第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物；第2步骤，在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养；第4步骤，在该抗原和专职抗原提呈细胞的存在下，将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养而生成IgE；第5步骤，在第4步骤中所生成的IgE的存在下，培养该抗原、该Th2细胞和B细胞。如果使用本方法，那么可以产生IgE、尤其是次级IgE(secondary IgE)。
本发明中所培养的细胞为嗜碱性粒细胞、原初T细胞、Th2细胞及B细胞，该些细胞的培养次序(培养条件)在该领域已是周知。因此，本领域技术人员在实施本发明时，能够适当设计周知的培养次序。
本发明的组合物可以良好地用于自原初T细胞向Th2细胞的诱导、IL-4的生成、IgE的生成等。因此，若把使用本发明的组合物时，自原初T细胞向Th2细胞的诱导、IL-4的生成、IgE的生成是否受到抑制或阻碍作为判断指标，那么便可以筛选出针对Th2型疾病的治疗剂。另外，如果使用本发明的组合物，便可以制作Th2型疾病的模型动物，如果使用该模型动物，还可以筛选出针对Th2型疾病的治疗剂。
关于Th2细胞因子引起的Th2型过敏性疾病的治疗，目前采用的方法的目的在于对因IgE抗体与Th2细胞因子而活化的效应细胞(肥胖细胞等)所产生的各种化学递质进行抑制。对Th2细胞因子本身的产生进行抑制的Th2型过敏性疾病治疗药的开发尚无突破性进展。
作为对Th2细胞因子本身的产生进行抑制的方法，目前已知的有大量投予IL-12，或投予IL-12与IL-18的组合。IL-12与IL-18的生物体内投予对各种细胞起到作用，且诱导IFN-γ的产生，所产生的IFN-γ发挥对细胞内寄生性病原体的感染防御作用和抗过敏性作用。但是，由于IL-12与IL-18的组合投予会诱导IFN-γ的过度产生，所以会引起过度的炎症反应，因而肝脏毒性等副作用强，不适合实际治疗。
对于通过抑制自原初CD4+T细胞向Th2细胞的分化诱导，以及抑制自所诱导的Th2细胞产生Th2细胞因子，来治疗/预防感染症或过敏性疾病等这些Th2型疾病的技术而言，大为期待的是该技术要有效且要无副作用。但是，关于使原初CD4+T细胞发展为Th2细胞时所需的初始IL-4，产生该初始IL-4的细胞的性质尚属未知，且先天免疫活性细胞对Th2细胞的作用机制尚不明确。
通过本发明，明确了引发Th2型免疫应答的机制。由此，明确了用以抑制自原初CD4+T细胞向Th2细胞的分化诱导的医药的获得方法、或用以抑制从所诱导的Th2细胞产生Th2细胞因子的医药的获得方法。
本发明提供一种筛选出针对Th2型疾病的治疗剂的方法。如上所述，嗜碱性粒细胞摄取抗原，且将其片段化并提呈于表面。因此，若使候选物质存在，而抑制或阻碍了嗜碱性粒细胞中的表面提呈，则可以判定该候选物质对治疗Th2型疾病有效。
即，在一个实施方式中，本发明的筛选方法的特征在于：包括形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物的第1步骤以及、在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的第2步骤；在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤，并对第2步骤后的嗜碱性粒细胞的细胞表面上所提呈的MHC-II型分子或CD80分子的量进行测定。对于嗜碱性粒细胞的细胞表面上所提呈的MHC-II型分子或CD80分子的量，使用针对该些蛋白质的抗体便可以容易地测定。
另外，嗜碱性粒细胞摄取抗原，且将其片段化并提呈于表面，且产生IL-4。原初T细胞在此IL-4的存在下识别出嗜碱性粒细胞的表面所提呈的MHC-II型分子/抗原肽复合物，而被诱导为Th2细胞。因此，若通过使候选物质存在，而抑制或阻碍了Th2细胞的诱导，便可以判定该候选物质对治疗Th2型疾病有效。
即，在一个实施方式中，本发明的筛选方法的特征在于：包括形成由抗原和与该抗原结合的IgE作组成的复合物的第1步骤以及、在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的第2步骤以及、将原初T细胞与通过第2步骤培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤；在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤或第3步骤，并测定第3步骤中所诱导的Th2细胞的量。所诱导的Th2细胞的量可以运用使用表面标记物的流式细胞仪等来容易地测定。
此外，嗜碱性粒细胞摄取抗原，且将其片段化并提呈于表面，且产生IL-4。原初T细胞在此IL-4的存在下识别出嗜碱性粒细胞的表面所提呈的复合物，而被诱导为Th2细胞，当诱导为Th2细胞时，B细胞便受到Th2细胞的作用，而产生针对抗原的IgE。因此，若通过使候选物质存在，而抑制或阻碍了IgE的产生，便可以判定该候选物质对治疗Th2型疾病有效。
即，在一个实施方式中，本发明的筛选方法的特征在于：包括形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物的第1步骤以及、在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的第2步骤以及、将原初T细胞与通过第2步骤培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤以及、在该抗原和专职抗原提呈细胞的存在下将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养而生成IgE的第4步骤；在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤～第4步骤中的至少1个步骤，并测定第4步骤中所生成的IgE的量。IgE的量可以利用抗IgE抗体等而容易地测定。
此外，所述实施方式中所测定的IgE是所谓的初始IgE。如上所述，本发明还提供一种生成次级IgE的方法。因此，若通过使候选物质存在，而抑制或阻碍了次级IgE的产生，便可以判定该候选物质对治疗Th2型疾病有效。
即，在一个实施方式中，本发明的筛选方法的特征在于：包括形成由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物的第1步骤以及、在该复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的第2步骤以及、将原初T细胞与通过第2步骤培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤以及、在该抗原和专职抗原提呈细胞的存在下将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养而生成IgE的第4步骤以及、在第4步骤中所生成的IgE的存在下培养该抗原、该Th2细胞和B细胞的第5步骤；并且在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤～第5步骤中的至少1个步骤，并测定第5步骤中所生成的IgE的量。
阅读了本发明的本领域技术人员可以容易地理解如下情况：如果使用后述的Th2型疾病的模型动物，并测定有无针对疾病的改善效果，便可以筛选出针对Th2型疾病的治疗剂。即，在一个实施方式中，本发明的筛选方法的特征在于：为了筛选针对Th2型疾病的治疗剂，而包括：在由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的步骤；将在该复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞投予动物而制作模型动物的步骤；对该模型动物投予候选物质的步骤；测定被投予了该候选物质后的模型动物中有无针对Th2型疾病的改善效果的步骤。
如上所述，本发明的组合物可以用在制作Th2型疾病的模型动物的方法中。即，本发明的模型动物制作方法的特征在于：为了制作Th2型疾病的模型动物而包括：在由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞的步骤；将在该复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞投予动物的步骤。此外，优选所述Th2型疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群。通过本发明的制作方法所制作的模型动物可以是支气管哮喘的模型动物，于此情况下，优选经鼻投予在所述复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞。
本发明的模型动物的制作方法无需佐剂。针对Th2型疾病，至今为止已制作出大量的模型动物，但并无不使用佐剂而制作模型动物的例子。
(2：抗原-IgE复合物及其利用)
如上所述，此次本发明者们发现利用嗜碱性粒细胞可以诱导Th2应答。与此同时，发现通过将抗原-IgE复合物移植入正常小鼠体内，可以同样地诱导Th2应答。具体而言，如后述实施例所示，在使用与DNP-OVA/抗DNP IgE复合物一同培养的嗜碱性粒细胞进行免疫的小鼠的脾脏内，Th2细胞迅速地被诱导。另外，在注入了DNP-OVA/抗DNP IgE复合物的初次接受试验的小鼠体内，在外周血、脾脏、骨髓中初始IL-4的产生获得诱导，在注入了IgE复合物的小鼠的脾脏内，Th2细胞迅速地被诱导。另一方面，在注入了DNP-OVA/抗DNP IgE复合物的嗜碱性粒细胞枯竭小鼠(被施以MAR-1处理的小鼠)的脾脏内，Th2细胞未被诱导。该些情况说明：嗜碱性粒细胞产生初始IL-4并接着诱导Th2应答，而且，由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物是致使由嗜碱性粒细胞产生初始IL-4的初期刺激物质。更详细而言，本发明者们的所述新颖见解为：嗜碱性粒细胞会诱导Th2应答，并且由IgE和其抗原所组成的复合物也会诱导Th2应答。如此，本发明是基于本领域技术人员所无法轻易预测的新颖见解而研究成的。
即，本发明提供一种由抗原和与该抗原结合的IgE所组成的复合物。如果使用本发明的复合物，那么可以实现自嗜碱性粒细胞产生初始IL-4，其结果是可以将原初T细胞诱导为Th2细胞，产生次级IL-4，生成针对抗原的IgE。进而，如果使用本发明的复合物，那么可以实现Th2疾病治疗剂的筛选和Th2型疾病模型动物的制作。
一般而言，由于由抗原和其抗体所组成的免疫复合物可以在抗体大量存在的条件下形成，因此在生物体内可以观察到血药浓度非常高的IgG或IgM。IgE是一种免疫球蛋白，其与IgG和IgM相比，血药浓度极低。因此，关于在生物体内与抗原结合的IgE，其已经介由其Fc区域而与嗜碱性粒细胞或肥胖细胞发生了结合。即，在生物体内，血液中并不存在抗原-IgE复合物，而是以抗原-IgE-细胞的复合物的形式存在，抗原-IgE-细胞的复合物与过敏性反应有关。
本发明的复合物由抗原和与该抗原结合的IgE组成，该IgE的Fc区域未与细胞(例如嗜碱性粒细胞和肥胖细胞)结合。就该观点而言，本发明的复合物也可以称为游离复合物。
如此，由IgE和其抗原所组成的复合物在该领域中尚未被识别。此外，至今为止尚无知晓这种复合物承担了致使从嗜碱性粒细胞产生初始IL-4的作用，而且本领域的技术人员完全无法预料。
此外，如上所述，为了促进需被摄入到嗜碱性粒细胞中的抗原-IgE复合物的形成，抗原也可以与半抗原连结。于此情况下，IgE可以是抗半抗原IgE，在本说明书中，抗半抗原IgE也包括在与抗原结合的IgE的范畴内。
进而，本发明提供一种用来形成所述游离复合物的组合物和试剂盒。由于本发明的组合物和试剂盒可以形成所述游离复合物，所以能够致使自嗜碱性粒细胞产生初始IL-4，其结果是可以将原初T细胞诱导为Th2细胞，生成次级IL-4，生成针对抗原的IgE。进而，如果使用本发明的组合物和试剂盒，那么可以实现Th2疾病治疗剂的筛选和Th2型疾病模型动物的制作。
即，本发明的组合物和试剂盒可以是如下的组合物和试剂盒：用来致使自嗜碱性粒细胞产生初始IL-4的组合物和试剂盒、用来将原初T细胞诱导为Th2细胞的组合物和试剂盒、用来生成次级IL-4的组合物和试剂盒、用来生成针对抗原的IgE的组合物和试剂盒、用来筛选Th2疾病治疗剂的组合物和试剂盒、以及用来制作Th2型疾病模型动物的组合物和试剂盒。
本发明的组合物的特征在于含有抗原和与该抗原结合的IgE。由于意在形成由抗原和与该抗原结合的IgE作组成的复合物，所以本发明的组合物优选不含能与IgE的Fc区域结合的细胞(例如嗜碱性粒细胞)。本发明的组合物所含有的抗原和IgE可以为复合物状态，也可以不为复合物状态。即使是非复合物状态，在组合物这种被限定的空间内存在两者的状态下向生物体提供时，组合物中的IgE在与生物体内的细胞结合之前与组合物中的抗原发生结合的机率非常高，其结果是可以有效地发挥本发明的效果。此外，本发明的组合物可以是独立具备抗原和与该抗原结合的IgE的试剂盒形态，以在限定的空间内存在两者的状态来向生物体提供即可。即，本发明的组合物只要是能够在生物体内产生IgE-细胞的结合之前产生抗原-IgE复合物的形态即可。
本发明的试剂盒的特征在于：具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。此外，由于意在形成所述游离复合物，所以本发明的试剂盒独立具备IgE与细胞即可，其形态既可以为独立具备有抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞，也可以为独立具备嗜碱性粒细胞、以及含有抗原和与该抗原结合的IgE的组合物。此外，本发明的试剂盒能够以在限定空间内存在抗原和与该抗原结合的IgE这两者的状态，来供于生物体即可，即，本发明的试剂盒是能够在生物体内发生IgE-细胞的结合之前，使抗原-IgE复合物得以产生的形态即可。
此外，阅读了本说明书的本领域技术人员基于所述“嗜碱性粒细胞及其利用”栏目中所记载的内容，可容易地理解到能够实施如下方法：使用本发明的游离复合物(抗原-IgE复合物)的将原初T细胞诱导为Th2细胞的方法、生成IL-4的方法、生成IgE的方法、筛选针对Th2疾病的治疗剂的方法、制作Th2型疾病的模型动物的方法。
(3：进一步的利用)
如上所述，本发明者们揭示出内源性嗜碱性粒细胞的抗原提呈对于初期Th2应答的诱导非常重要。进而，也证实了通过清除生物体内的嗜碱性粒细胞可以阻碍Th2细胞的诱导。即，本发明提供一种处置Th2型疾病的技术。在本说明书中，术语“处置”是指减轻或消除症状，包括预防(发病前)或治疗(发病后)中的任一情况。所谓“处置Th2型疾病”是指抑制或阻止Th2细胞诱导。优选将Th2细胞的诱导抑制在Th2型疾病的症状缓解的程度，更优选将Th2细胞的诱导抑制在Th2型疾病的症状消除(即疾病治愈)的程度。
本发明提供一种用来处置Th2型疾病的组合物。如上所述，能够通过从被试验体中清除嗜碱性粒细胞，来处置Th2型疾病。即，本发明的组合物含有清除嗜碱性粒细胞的物质即可。这种物质优选是针对FcεR1的抗体。另外，针对FcεR1的抗体是阻碍FcεR1的功能(例如阻碍FcεR1的结合)的物质。即，本发明的组合物含有阻碍FcεR1的功能的物质即可。本发明的组合物的形态优选是能够在血液或外周组织中清除嗜碱性粒细胞的形态，即，优选是能够注入的形态，但不限定于该形态。此外，本发明的组合物也可以以上述的试剂盒形态来提供。即，本发明提供一种用来处置Th2型疾病的试剂盒。无论是组合物形态还是试剂盒形态，本领域技术人员都可以适宜选择本发明的有效成分以外的其他成分。
本发明还提供一种处置Th2型疾病的方法。本发明的方法可以是使用上述组合物的方法，即，本发明的方法包括从被试验体中清除嗜碱性粒细胞的步骤、或向被试验体投予阻碍FcεR1的功能的物质的步骤即可。本发明的方法既可以用于预防，也可以用于治疗。另外，投予形态或投予途径也没有特别限定。
本发明并不限定于上述各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，适宜组合不同实施方式各自所揭示的技术方案而获得的实施方式也包括在本发明的技术范围内。
另外，本说明书中所记载的学术文献和专利文献均作为参考而引用在本说明书中。
[实施例]
(1.材料和方法)
(小鼠)
自美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买BALB/c小鼠。在日本兵库医科大学的动物设施中，在SPF条件下使识别OVA323-339(DO11.10)的αβTCR的转基因小鼠、和BALB/c G4纯合性(IL-4缺损)小鼠交配。全部动物实验是依据日本兵库医科大学实验动物管理委员会(the Institutional Animal CareCommittee of Hyogo College of Medicine)的指南而进行的。
(细胞纯化)
依据以前的报告(Kondo，Y.et al.Int Immunol 20，791-800(2008)和Yoshimoto，T.et al.Proc Natl Acad Sci U S A 96，13962-6(1999))，制备了源于小鼠骨髓的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞。经纯化的细胞群的纯度超过96％。人类嗜碱性粒细胞和小鼠CD4+CD62L+休眠T细胞的详细信息和纯化步骤如下。
(体外培养)
在5×105个/mL的惯用APC(经照射的清除了T细胞的BALB/c脾细胞)、经照射的脾脏树突状细胞、经照射的纯化嗜碱性粒细胞或纯化肥胖细胞的存在下，在48孔板中，利用IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)和OVA323-339(1μM)或DNP-OVA(6.25～100μg/mL)刺激来自DO11.10小鼠的原初脾脏CD4+CD62L+T细胞(1×105个/mL)7天。为了诱导Th2细胞，向培养物中进一步添加IL-4(1000U/mL)。开始引发(prime)后，清洗细胞，进而与PMA(50ng/mL)和钙离子载体(500ng/mL)一同培养4小时，对细胞胞液质的IL-4和IFN-γ进行FACS分析。在若干实验中，在开始引发(prime)后，在经照射的惯用APC(1×105个)的存在下，在96孔板中，利用IL-2(100pM)、OVA323-339(1μM)再次刺激CD4+T细胞(1×105个/0.2mL孔)48小时。回收上清液，利用ELISA试剂盒(美国安迪生物科技有限公司，R&D Systems)或Bio-Plex system(美国伯乐生命医学产品有限公司，BioRad)对细胞因子产生进行了试验。
(寄生虫)
对BALB/c小鼠皮下注射委内瑞拉类圆线虫(S.venezuelensis)的3期幼虫(5000只)，以开始完全感染。
(统计)
数据是表示为平均±SEM。通过利用GraphPad Instat Software所实施的双样本学生t检验(paired Student′s t-test)，进行2个实验群的统计学比较。将P值(＜0.05)视为存在显著差异。
(抗体和试剂)
在本发明者们的研究室中，将抗小鼠IL-4(11B11)纯化。自美国碧迪生物公司(BD Biosciences)购买了PE-抗小鼠CD4、FITC-抗小鼠CD62L、FITC-抗小鼠I-Ad、FITC-抗小鼠CD40、FITC-抗小鼠CD80、FITC-抗小鼠CD86、FITC-抗小鼠CD11c、PE-抗小鼠c-kit、FITC-抗小鼠c-kit、FITC-抗小鼠DX5、FITC-抗人类HLA-DR、及APC-抗人类CD203a。自eBioscience购买了FITC-抗小鼠T1/ST2(DJ8)、生物素抗小鼠Fcε1α(MAR1)、链霉亲和素-PE、及链霉亲和素-APC。自美国碧迪生物公司购买了以下的PE标记抗人类mAb：抗CD3、抗CD7、抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD19、抗CD36、抗CD45RA及抗CD235a。自美国安迪生物科技有限公司购买了重组小鼠IL-2、IL-3、IL-4及人类IL-3。自MBL购买了IL-18。在本发明者们的研究室中纯化了重组人类IL-33。自西格玛公司(Sigma)购买抗DNP IgE mAB、OVA(V级)、来自明尼苏达沙门氏菌Re-595或E大肠杆菌055:B5的LPS、及来自金黄色葡萄球菌的PGN。依据Eisen，H.N.et al.J Immunol 73，296-308(1954)的方法制备了OVA-DNP。
(流式细胞仪和细胞纯化)
为了制备源于骨髓的嗜碱性粒细胞，在补充有10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)、2-ME(50μM)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的RPMI1640中，将骨髓细胞与IL-3(10U/mL)一同培养14天，并清洗2次。首先，使用抗FcγRII/III(10μg/mL)在4℃下刺激细胞30分钟，使用生物素抗小鼠FcεR1α(5μg/mL)，在染色缓冲液(PBS、1％FBS)中且在4℃下处理1小时。清洗2次后，利用链霉亲和素-APC和PE-抗小鼠c-kit将细胞染色30分钟。利用FACS Calibur(美国碧迪生物公司)分析样本，并利用荧光细胞分选仪(FACS Aria，美国碧迪生物公司)分离为FcεR1+/c-kit-细胞(嗜碱性粒细胞)与FcεR1+/c-kit+细胞(肥胖细胞)。进而利用FITC标记抗体对各细胞群的剩余部分进行染色，以分析表面标记物。为了制备脾脏嗜碱性粒细胞，针对来自BALB/c小鼠的脾细胞，首先利用MACS system(德国美天旎生物技术有限公司，Miltenyi Biotec)清除Thy1.2+T细胞和B220+细胞，接着对剩余的细胞进行染色，利用FACS Aria分离为FcεR1+/c-kit-细胞与FcεR1+/c-kit+细胞。各细胞群的纯度超过96％。为了制备脾脏CD4+CD62L+休眠T细胞，且为了对细胞内细胞因子进行染色，而进行了以下步骤。
在知情同意后，取得来自正常志愿者的人类外周血和临产的正常人的脐带血，并进行了处理。研究所的伦理委员会同意了该实验计划。通过Ficoll密度梯度离心分离，从外周血和脐带血中分离出了单核细胞。使用针对CD3、CD7、CD14、CD15、CD16、CD19、CD36、CD45RA及CD235a的被进行了PE标记的抗人类单克隆(monoclonal)抗体的混合物以及抗PE微球(德国美天旎生物技术有限公司，Miltenyi Biotec)，对外周血的单核细胞进一步清除了T细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、血小板、树突状细胞及红细胞。使用微球，使脐带血的单核细胞富化为CD34+细胞。将该些CD34+前体细胞以5×105个/mL的细胞密度接种到12孔板中，并在补充有10％FBS、2-ME(50μM)、L-谷氨酰胺(0.5mM)、青霉素(50U/mL)及链霉素(50μg/mL)以及人类IL-3(10ng/mL)的STEM PRO-34无血清培养基(美国GIBCO)中培养7天。
(电子显微镜)
利用2％多聚甲醛和1.25％戊二醛，将经分拣的源于小鼠骨髓的细胞(FcεR1+/c-kit-细胞和FcεR1+/c-kit+细胞)及人类细胞(CD203c+HLA-DR细胞)固定，利用1％OsO4进行后固定，并包埋在Epon中。利用醋酸铀酰和柠檬酸铅对超薄切片进行二重染色，并利用JEM 1220透射电子显微镜(JEOL)进行了观察。
(增殖分析)
在2.5×105个/mL的惯用APC或经纯化的嗜碱性粒细胞的存在下，且在针对DNP IgE的单克隆抗体(10μg/mL)的存在下或非存在下，利用IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)及OVA323-339(1μM)或DNP-OVA(6.25～100μg/mL)，在96孔板中刺激来自DO11.10小鼠的初始脾细胞CD4+CD62L+T细胞(5×104个/0.2mL孔)4天。最后的16小时期间中，通过添加1μCi的[3H]胸苷测定了DNA合成。
(ELISA分析)
利用小鼠OVA-IgE ELISA试剂盒(大日本住友制药股份有限公司，DainipponSumitomo Pharma Co.，Ltd.)测定了OVA特异性血清IgE。利用小鼠OVA-IgG1ELISA试剂盒(AKRIE-04，日本Shibayagi公司)测定了OVA特异性血清IgG1。
(小鼠的体内处理)
将源于骨髓的或经FACS分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞(各5×105个/mL)与IL-3(20U/mL)、DNP-OVA(100μg/mL)及抗DNP IgE mAb(10μg/mL)在48孔板中一同培养16小时。引发(prime)后，将嗜碱性粒细胞或肥胖细胞(2.5～5×105个/小鼠)经由尾静脉注射到BALB/c小鼠体内(每组5只)。再构建的4天后或1周后，利用PBS中的OVA蛋白质(100μg)对小鼠进行静脉内激发。在若干实验中，对BALB/c小鼠(每组5只)静脉内注入DNP-OVA(100μg/小鼠)和抗DNP IgE mAb(200μg/小鼠)的混合物。注入后，使用FACS随时间经过，对作为IL-4的报告基因的GFP的表达进行了测定，由此测定了嗜碱性粒细胞中的IL-4的表达。嗜碱性粒细胞的体内清除是依据Denzel等人的方法来进行的。通过腹腔内投予注入5μg的抗小鼠FcεR1α(MAR-1)或对照仓鼠IgG(eBioscience)，1天2次共3天。令小鼠休息2天，接着对小鼠注入DNP-OVA和抗DNP IgE mAb的混合物，接着对该些小鼠注入MAR-1或仓鼠IgG，注入为1天2次共3天。在注入DNP-OVA和抗DNP IgE 4天后，在经照射的惯用的APC(1×105个)的存在下，利用IL-2(100pM)、OVA(100μg/mL)，在96孔板中刺激脾脏CD4+T细胞(1×105细胞/0.2mL孔)5天。利用经PVA激活的APC刺激脾脏CD4+T细胞5天。
(TLR mRNA的表达分析)
使用Trizol试剂，自经分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞提取总RNA，利用DNaseI进行处理，并使用Superscript II RT和oligo(dT)12-18引物(美国英杰生命技术有限公司，Invitrogen)进行逆转录。全部TLR的阳性对照是使用自总脾脏细胞提取的RNA。为了分析TLR mRNA的表达，而通过改变标准RT-PCR扩增次序对mRNA进行了扩增。设计了特异性TLR引物序列和各自的退火温度。将在95℃下30秒钟、在55℃下30秒钟、在72℃下30秒钟、进而在72℃下延伸10分钟设为一个循环，将cDNA扩增35个循环。在35个循环后，将样本保存在4℃直至分析为止。扩增后，利用1.7％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，并通过照射UV光使之可视化。
(2.结果和考察)
此次，本发明者们通过IL-4的产生和MHC-II型/肽复合物在原初CD4+细胞上的提呈，揭示了嗜碱性粒细胞有助于体外和体内的Th2/IgE应答。
首先，针对产生Th2细胞因子并在体外使原初CD4+T细胞发育为Th2细胞的脾脏嗜碱性粒细胞的能力进行了试验。关于来自初次接受试验的小鼠的非T细胞功能和非B细胞功能，虽然含有0.20％的FcεR1+/c-kit-细胞，但感染了委内瑞拉类圆线虫(Strongyloides venezuelensis)的小鼠与感染了寄生虫巴西日圆线虫(Nippostrrongylus brasiliensis)的小鼠的报告相同，该比例显着增加(5.84％，图1(a))。从初次接受试验的小鼠和感染小鼠的脾脏纯化了FcεR1+/c-kit-细胞(嗜碱性粒细胞)。在IL-3的存在下培养了24小时的来自感染小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞虽然产生了大量的IL-4、IL-6及IL-13，但未产生IL-12。另一方面，来自初次接受试验的小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞应答IL-3而产生了少量的IL-4、IL-6及IL-13。该等情况提示：感染小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞获得了在含有IL-2的培养过程中大量产生IL-4、IL-6及IL-13的能力(图1(b))。
在OVA肽(OVA323-339)、IL-2及IL-3的存在下，对诱导自OVA特异性原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育的、来自感染小鼠的嗜碱性粒细胞的能力进行了试验。另外，在OVA323-339和IL-2的存在下，将原初CD4+T细胞与惯用APC(清除了T细胞的脾脏细胞)一同进行了培养。来自被委内瑞拉类圆线虫感染的小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞具有显着的、在IL-4非存在下诱导自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育的能力(图1(c))。作为对照，如其他报告所示，惯用APC在Th0条件(仅有OVA323-339和IL-2)下未诱导Th2细胞的发育(图1(c))。经发育的Th2细胞表达作为Th2标记物的IL-33Rα(图1(d))，在OVA激发时产生Th2细胞因子，在抗原和IL-33的激发时还增加了IL-4以外者的产生。
为了避免DC潜在地夹杂于脾脏嗜碱性粒细胞中，而对经高度纯化的骨髓嗜碱性粒细胞的在体外诱导Th2细胞的发育的能力进行了试验(图6(a)、图6(b))。首先，对MHC-II型分子和刺激辅助分子CD80及CD86的表达进行了试验。进而，同时对在肥胖细胞和惯用APC中的该些表达进行了试验(图2(a))。源于骨髓的嗜碱性粒细胞和惯用APC明显表达了II型分子、CD80及CD86，但未表达CD11c。作为对照，肥胖细胞仅轻度表达了该些分子(图2(a)、图2(b))。脾脏嗜碱性粒细胞表达CD62L(淋巴结归巢分子)。该情况提示脾脏嗜碱性粒细胞会优先侵入淋巴组织。源于脐带血或外周血的人类嗜碱性粒细胞(CD203c+/c-kit-)也会表达HLA-DR(图2(c)、图6(c)、图6(d))。
正如预计，源于骨髓的嗜碱性粒细胞与来自委内瑞拉类圆线虫感染小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞相同，即使完全不存在专职APC，在Th0条件(OVA323-339、IL-2及IL-3的存在、且IL-4非存在)下也具有诱导自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育的能力(20.7％)(图3(a))。
对嗜碱性粒细胞如何诱导Th2细胞的发育的机制进行了调查。在利用OVA323-339、惯用APC(ΔT脾脏)、IL-2及IL-4(Th2条件下)刺激原初CD4+T细胞的情况下，原初CD4+T细胞发育为Th2细胞(19.1％)(图3(a))。同样地，在利用OVA323-339、肥胖细胞、IL-2、IL-3及IL-4(Th2条件下)刺激原初CD4+T细胞的情况下，原初CD4+T细胞发育为Th2细胞(17.2％)(图3(a))。作为对照，进一步的IL-4刺激(Th2条件下)仅中等程度地增强了该嗜碱性粒细胞依赖性的Th2细胞的发育(25.2％，图3(a))。进而，来自清除了IL-4的小鼠的嗜碱性粒细胞几乎完全消除了该Th2的发育(3.1％)，野生型嗜碱性粒细胞虽然在Th0条件下将原初CD4+T细胞诱导为Th2细胞，但专职APC未诱导(图3(b))。该等结果显示：嗜碱性粒细胞产生IL-4，提呈OVA肽，并且诱导自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育。
接着，使用DNP-复合化OVA(DNP-OVA)作为抗原，以代替OVA肽(OVA323-339)。在IL-3和DNP-OVA的存在下且IL-4的非存在下，将OVA特异性原初CD4+T细胞与嗜碱性粒细胞一同培养，由此诱导获得了OVA特异性Th2细胞(图3(c))。该等结果提示：嗜碱性粒细胞摄取初始的OVA，将其加工为OVA323-339，与MHC-II型一同提呈肽片段，而具有产生IL-4的能力。接着，对添加抗DNP IgE单克隆抗体是否可上调嗜碱性粒细胞的APC能力进行了试验(图3(d))。在100μg/ml、25μg/ml或者6.2μg/ml的DNP-结合OVA的存在下且在10μg/ml的抗DNP-IgE单克隆抗体的存在下，将OVA特异性原初CD4+T细胞与嗜碱性粒细胞一同培养7天。培养完毕后，充分清洗细胞，并在PMA+离子霉素(ionomycine)的存在下培养4小时后，利用FACS测定了细胞质内的IL-4与IFN-γ的表达。数字是在CD4+T细胞中，细胞质内具有IL-4或者IFN-γ的细胞的比例。经低用量(6.2μg/mL)的DNP-OVA激活的嗜碱性粒细胞，中等程度地诱导了Th2细胞(3.2％)。另一方面，经高用量(100μg/mL)的DNP-OVA激活的嗜碱性粒细胞显著地诱导了Th2细胞(11.3％)。添加抗DNP IgE单克隆抗体而显著地诱导了Th2细胞(与无抗IgE的情况下的3.2％、4.2％、11.3％相比，在有抗IgE时为10.5％、12.5％、16.8％；图3(d))。因此，抗DNP-IgE单克隆抗体对嗜碱性粒细胞诱导性的Th2发育的增强效果在利用最低浓度的DNP-OVA来激活嗜碱性粒细胞的情况下较明显。进而，与专职APC相比，少数嗜碱性粒细胞在使用抗DNP-IgE单克隆抗体的Th2条件下，会诱导自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育(图3(d))。
接着，对抗DNP IgE单克隆抗体如何表现出上述上调效果进行了试验。关于在抗DNP-IgE的存在下经DNP-OVA激活的嗜碱性粒细胞，其尤其在嗜碱性粒细胞经低浓度的DNP-OVA激活的情况下增加了对OVA特异性T细胞的增殖进行诱导的能力(图7)。作为对照，在抗DNP-IgE抗体的存在下被激活的惯用APC未增加诱导T细胞增殖的能力(图7)。进而，正如至今为止的报告所示，在抗DNP-IgE抗体的存在下利用DNP-OVA被激活时，仅嗜碱性粒细胞显著增加了产生IL-4的能力(图8(a)、图8(b))。经DNP-OVA/抗DNP IgE激活的肥胖细胞虽然产生IL-13，但未产生IL-4(图8(b))。进而，仅嗜碱性粒细胞在利用IL-3、及IL-18、IL-33、PGN或LPS进行刺激的情况下，产生了IL-4(图8(c)、图8(d))。
为了对经OVA激活的嗜碱性粒细胞是否可在体内诱导Th2应答进行试验，而与DNP-OVA/抗DNP IgE一同培养，由此尝试利用OVA肽强力激活嗜碱性粒细胞。另外，同时利用该抗原/抗体复合物对肥胖细胞进行了处理。接着，将该些嗜碱性粒细胞或肥胖细胞经由尾静脉注射到正常小鼠体内。4天后，使用溶解在PBS中的完整的OVA蛋白质激发小鼠。激发2天后，制备脾脏CD4+T细胞，利用经OVA激活的APC(ΔT-脾脏)刺激该些细胞，并测定培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的含量。在该脾脏中，仅有经OVA激活的嗜碱性粒细胞迅速且强力地诱导了Th2细胞，且中等程度地诱导了Th1细胞(图4(a))。接着，对利用经OVA激活的嗜碱性粒细胞而进行了免疫的小鼠的，在OVA静脉内激发时产生IgE和IgG1的能力进行了试验。不使用佐剂的该全身性的OVA投予在初次接受试验的小鼠体内未诱导IgE应答。作为对照，在用经OVA激活的嗜碱性粒细胞进行了引发(prime)的小鼠中，应答OVA激发而产生了IgE和IgG1(图4(b))。该些小鼠在脾脏内发育出CD4+CD62LlowIL33Rα+Th2细胞(图4(c)、图4(d))。由于CD62L分子是Th2细胞再循环的所需标记物，所以经OVA激活的嗜碱性粒细胞呈专职APC样态，诱导OVA特异性Th2细胞。此外，该OVA特异性Th2细胞有助于经OVA活化的B细胞在体内产生IgG1和IgE。
最后，为了揭示内源性的嗜碱性粒细胞的抗原提呈对于诱导体内的初期Th2应答非常重要的直接证据，而将DNP-OVA/抗DNP IgE复合物注入初次接受试验的小鼠以及清除了嗜碱性粒细胞的小鼠。为了清除嗜碱性粒细胞，而依据Denzel等人的方法，向小鼠腹腔内投予针对FcεR1α的抗体(MAR-1)，1天投予2次，共投予了3天。在最终投予MAR-1(并非对照的仓鼠IgG)2天后，成功地完全清除了脾脏和肝脏的嗜碱性粒细胞(图9)。在注入DNP-OVA(100μg)/抗DNP IgE(200μg)后随时间经过使用FACS对作为IL-4的报告基因的GFP的表达进行了测定，由此测定了嗜碱性粒细胞中的IL-4的表达，结果是，注入的12小时后或24小时后的嗜碱性粒细胞中显著产生了IL-4。进而，注入的4天后，制备了脾脏CD4+T细胞，利用经OVA激活的APC刺激该些细胞，并测定培养上清液中的IL-4、IL-13及IFN-γ的含量。在将DNP-OVA/抗DNP IgE复合物注入初次接受试验的小鼠体内(不是清除了嗜碱性粒细胞的小鼠)的情况下，在脾脏中可见Th2细胞被迅速地诱导(图4(c))。
证实了独特的专职APC在体外和体内均优先诱导Th2细胞。嗜碱性粒细胞与惯用APC同样地表达MHC-II型、CD80及CD86，且进行抗原蛋白质的摄取和加工，而与MNHCII型一同表达肽(图2(a)、图3)。作为对照，肥胖细胞中该等分子的表达极少(图2(a))。进而，经OVA肽强力激活的嗜碱性粒细胞强力地诱导了自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育，而经OVA激活的肥胖细胞未诱导自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育。该情况提示：在体内，Th2应答的诱导存在较大差异(图4(a))。正如至今为止的报告所示，Th2细胞使脾脏和淋巴结中的嗜碱性粒细胞的数量显著增加，在嗜碱性粒细胞的水平与Th2细胞的水平之间似乎存在正反馈调节。
因此，下调嗜碱性粒细胞是控制处置Th2/IgE应答的重要对策。IgE也是重要的靶分子。其原因在于，IgE会引发嗜碱性粒细胞与Th2细胞之间的正反馈调节。嗜碱性粒细胞一般仅被认为是生成IL-4并将抗原转移到进行实际的抗原提呈的树突状细胞中的细胞。嗜碱性粒细胞自身的潜在性APC功能的识别，对于理解对单一过敏原的具阳性反应的患者如何利用同一抗原强力显示阳性的这一机制、如何诱发针对多种过敏原的阳性反应的这一机制，是较为重要的。推测经多株抗体致敏的嗜碱性粒细胞摄取对应过敏原，并提呈多个T细胞抗原决定基，由此诱导多个Th2细胞克隆体。如果使人类脐带血细胞在含有IL-3的培养基中增殖后输入人类体内，则混有嗜碱性粒细胞，这会表达MHC-II型分子，因此提示出了接受脐带血细胞输血的患者有诱导Th2/IgE应答的危险性。
如以上所述，本发明揭示了嗜碱性粒细胞是诱导优先Th2的免疫应答的抗原提呈细胞。另外，揭示了通过利用各种方法控制嗜碱性粒细胞，可以控制过敏性疾病。
本发明者们揭示了：嗜碱性粒细胞表达MHC-II型分子和CD80/86，在各种刺激下产生IL-4。该情况表明嗜碱性粒细胞会诱导在专职抗原提呈细胞(APC)的非存在下的、自原初CD4+T细胞向Th2细胞的发育。
在IL-3存在下且在IL-4非存在下与嗜碱性粒细胞、OVA肽或DNP-OVA一同培养的卵白蛋白(OVA)特异性原初CD4+细胞发育成了Th2细胞。这种嗜碱性粒细胞的Th2诱导作用在IL-4缺损嗜碱性粒细胞中完全未见。该情况提示：由经OVA激活的嗜碱性粒细胞所释放的IL-4对于Th2细胞的发育是必不可少的。进而，与DNP-OVA和抗DNP-IgE一同培养的嗜碱性粒细胞与仅与DNP-OVA一同培养的嗜碱性粒细胞相比，摄取更多的OVA，更多地进行加工，因此显示出强于仅与DNP-OVA一同培养的嗜碱性粒细胞的APC活性。
经OVA强力激活的嗜碱性粒细胞的静脉内投予会强力且迅速地诱导Th2细胞，但经OVA激活的肥胖细胞却未引起Th2细胞的诱导。在利用嗜碱性粒细胞诱导Th2细胞后，经OVA刺激的B细胞会产生OVA特异性IgE抗体，而Th2细胞会强力地促进该过程。该情况提示：通过使嗜碱性粒细胞摄取IgE依赖性抗原，会控制Th2/IgE应答的正反馈。
(3.关于附图)
图1(a)～图1(d)中揭示了由寄生虫诱发的、脾脏嗜碱性粒细胞的抗原提呈。图1(a)中揭示了：从BALB/c小鼠、或感染委内瑞拉类圆线虫的3期幼虫10天的BALB/c小鼠制备的新鲜的脾脏的非B非T细胞，并利用流式细胞仪分析FcεR1和c-kit的表达而获得的结果。利用FACS Aria，将来自感染或未感染委内瑞拉类圆线虫的小鼠的脾脏的非B非T细胞进一步分离为FcεR1+/c-kit-细胞。以数字表示FcεR1+/c-kit-细胞的比例。
图1(b)中，将图1(a)所示的经分拣的嗜碱性粒细胞(1×105个/0.2mL孔)与IL-3(20U/mL)在96孔板中一同培养24小时，回收其上清液，利用Bio-Plex系统试验细胞因子含量，将所获得的结果，以来自每组3只小鼠的嗜碱性粒细胞的、通过2次独立实验而获得的平均+SEM，来进行了表示。
图1(c)中揭示了：在5×105个/mL的经照射的清除了T细胞的BALB/c脾细胞(ΔT脾脏)、或经照射的来自委内瑞拉类圆线虫感染小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞(寄生虫诱导性嗜碱性粒细胞)(无IL-4(Th0条件))的存在下，利用IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)及OVA323-339(1μM)，在48孔板中刺激来自DO11.10的原初CD4+CD62L+T细胞(1×105个/mL)7天，开始引发(prime)后，清洗细胞，且与PMA(50ng/mL)和钙离子载体(500ng/mL)一同再次培养4小时，并利用FACS分析细胞质IL-4和IFN-γ而获得的结果。针对CD4+T细胞，以数字表示IL-4+细胞或IFN-γ+细胞的比例。
图1(d)揭示了，图1(c)中利用流式细胞仪所示的与ΔT脾脏或寄生虫诱导性嗜碱性粒细胞一同培养了7天的CD4+T细胞上的IL-33Rα链的表达。以百分比表示CD4+细胞中的IL-33Rα链+细胞的比例。
图2(a)～图2(c)中揭示了嗜碱性粒细胞上的MHC-II型分子的表达。图2(a)中揭示了，利用图中所示的表面标记物对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞(示于图6)、以及清除了T细胞的脾细胞(ΔT脾脏)进行染色而获得的结果。图中的阴影区域表示经标记物染色的细胞，白色区域表示未经染色的细胞。
图2(b)中揭示了，利用流式细胞仪对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞和肥胖细胞分析MHC-II型(I-A)和FcεR1的表达而获得的结果。以百分比表示FcεR1+I-A+细胞的比例。图中表示有4次独立实验的代表性结果。
图2(c)中揭示了，利用流式细胞仪对与人类IL-3(10ng/mL)一同培养7天的CD34+脐带血细胞分析c-kit和CD203c(左)、以及CD203c+c-kit-细胞中的HLA-DR(右)的表达而获得的结果。图中表示有3次独立实验的代表性结果。
图3(a)～图3(d)中揭示了源于骨髓的嗜碱性粒细胞的抗原提呈的结果。在经照射的清除了T细胞的BALB/c脾细胞(ΔT脾脏)(5×105个/mL)、经照射的源于骨髓的纯化嗜碱性粒细胞(WT：野生型小鼠，G4/G4：IL-4缺损小鼠)、肥胖细胞或脾脏DC的存在下，在48孔板中，在总容量为1mL的培养基中刺激来自DO11.10小鼠的原初脾脏CD4+CD62L+T细胞(1×105个/mL)7天(Th0条件)。刺激时，使用IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)及OVA323-339(1μM)(图3(a)和图3(b))、DNP-OVA(100μg/mL)(图3(c))、以及抗DNP IgE mAb(10μg/mL)的存在下或非存在下，使用了DNP-OVA(6.25～100μg/mL)(图3(d))。为了诱导Th2细胞，而向培养物中进而添加了IL-4(1000U/mL)(Th2条件)。开始引发(prime)后，清洗细胞，与PMA(50ng/mL)和钙离子载体(500ng/mL)一同再次培养4小时，并利用FACS分析了细胞质内的IL-4和IFN-γ的表达。针对CD4+T细胞，以数字表示IL-4+细胞或IFN-γ+细胞的比例。图中表示有3次独立实验的代表性结果。
图4(a)～图4(i)中揭示了由嗜碱性粒细胞诱导的体内的抗原特异性Th2应答。在图4(a)～图4(d)中，是在48孔板中，将源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞(各5×105个/mL)与IL-3(20U/mL)、DNP-OVA(100μg/mL)及抗DNP IgE mAb(10μg/mL)一同培养16小时。在引发(prime)后，以各2.5×105个/小鼠，经由尾静脉对BALB/c小鼠(每组5只)注射嗜碱性粒细胞或肥胖细胞。利用OVA蛋白质(100μg/小鼠)，经由静脉对注射4天后(图4(a))或1周后(图4(b)～图4(d))的小鼠进行激发。对对照小鼠仅注入OVA蛋白质(100μg)。激发(第0天)后，回收血清，利用ELISA确定OVA特异性IgE抗体和IgG1抗体(图4(b))。激发2天后(图4(a))或2周后(图4(c))，在经照射的ΔT脾脏(2×105个/0.2mL孔)的存在下，在96孔板中利用OVA蛋白质(100μg/mL)再次刺激来自各小鼠的脾脏CD4+T细胞(2×105个/0.2mL孔)。
在图4(e)～图4(g)中，是以图中所示的浓度，对BALB/c小鼠(每组5只)注入OVA-DNP和抗DNP IgE抗体的混合物(免疫复合物I.C)。为了清除嗜碱性粒细胞，而在投予I.C前后，以1天2次，连续3天向小鼠腹腔内投予5μg的抗FcεR1α(MAR-1)。投予I.C 4天后，在经照射的ΔT脾脏(2×105个/0.2mL孔)的存在下，利用OVA蛋白质(100μg/mL)再次刺激来自各小鼠的脾脏CD4+T细胞(2×105个/0.2mL孔)。在体外刺激5天后，回收上清液，利用ELISA对IL-4、IL-13及IFN-γ的产生进行了试验(图4(a)、图4(c)、图4(f)、图4(g))。以每组5只的平均+SEM，表示了2个独立实验的代表例的结果。
在图4(a)中，“**”表示：与被移植肥胖细胞并被注入了OVA的小鼠进行比较的学生t检验的结果是P＜0.0001。在图4(b)～图4(d)中，“*”表示P＜0.01，
Figure BPA00001392926900281
表示P＜0.05，
Figure BPA00001392926900282
表示P＜0.005(以上均是与仅注入OVA的对照组进行比较)。在图4(b)中，作为与清除了嗜碱性粒细胞的组进行比较的学生t检验的结果，“*”表示P＝0.191，
Figure BPA00001392926900283
表示P＜0.005。
在图4(h)～图4(i)中，是以图中所示的用量对BALB/c小鼠(每组5只)注入了OVA-DNP和抗DNP IgE抗体的混合物(I.C)。利用OVA蛋白质(100μg/小鼠)，静脉内激发被投予I.C 4天后的小鼠，回收血清，利用ELISA确定了OVA特异性IgE抗体和IgG1抗体。为了减少或增加嗜碱性粒细胞的数量，而对小鼠注入了抗FcεR1α(MAR-1)或IL-3。作为与对照组进行比较的学生t检验的结果，“*”表示P＜0.001，表示P＜0.05。
图5中揭示了由嗜碱性粒细胞驱动的自Th2细胞的细胞因子产生。在5×105个/mL的经照射的清除了T细胞的BALB/c脾细胞(ΔT脾脏)、或经照射的来自委内瑞拉类圆线虫感染小鼠的脾脏嗜碱性粒细胞(寄生虫诱导性嗜碱性粒细胞)(无IL-4(Th0条件))的存在下，利用IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)及OVA323-339(1μM)，在48孔板中刺激来自DO11.10的原初CD4+CD62L+T细胞(1×105个/mL)7天。开始引发(prime)后，在经照射的清除了T细胞的BALB/c脾细胞(1×105个)的存在下，且在IL-33(100ng/mL)的存在或非存在下，在96孔板中，利用IL-2(100pM)、OVA323-339(1μM)再次刺激CD4+T细胞(1×105个/0.2mL孔)48小时。回收上清液，利用Bio-Plex系统对细胞因子产生进行了试验。图中表示有3次独立实验的代表性结果。
图6(a)～图6(d)中揭示了源于小鼠骨髓的嗜碱性粒细胞和人类外周血嗜碱性粒细胞的纯化以及免疫学性试验的结果。图6(a)中揭示了：将来自BALB/c小鼠的骨髓细胞与IL-3(10U/mL)一同培养10天，利用流式细胞仪分析FcεR1和c-kit的表达，接着利用FACS Aria分拣为FcεR1+/c-kit-(嗜碱性粒细胞)的细胞群与FcεR1+/c-kit+(肥胖细胞)的细胞群而获得的结果。图中表示有所分选的细胞群中的细胞的百分比。
图6(b)中揭示了利用电子显微镜观察经分拣的FcεR1+/c-kit-(嗜碱性粒细胞)和FcεR1+/c-kit+(肥胖细胞)的细胞群而获得的观察结果。比例尺为1μm。
图6(c)是：在分选后立即对通过阴性分选所浓缩的人类外周血单核细胞(CD3-、CD7-、CD14-、CD15-、CD16-、CD19-、CD36-、CD45RA-及CD235a-)的HLA-DR与CD203c的表达进行测定而获得的结果(左)；以及对在人类IL-3(10ng/mL)存在下培养24小时后的HLA-DR与CD203c的表达进行测定而获得的结果(右)。图中表示有HLA-DR+细胞相对于CD203c+细胞的细胞群百分比。
图6(d)中揭示了经分拣的CD203c+/HLA-DR+细胞群的吉姆萨(Giemsa)染色(左：100×)下的电子显微镜观察(右)的结果。比例尺为1μm。
图7中揭示了嗜酸性粒细胞诱导性的抗原特异性T细胞增殖。在IL-2(100pM)、IL-3(20U/mL)及OVA323-339(1μM)、或者抗DNP IgE mAb(10μg/mL)的存在下或非存在下，用DNP-OVA(6.25～100μg/mL)，并在经照射的ΔT脾脏或经纯化的嗜碱性粒细胞(2.5×105个/mL)的存在下，在96孔板中对来自DO11.10小鼠的原初脾脏CD4+CD62L+T细胞(5×104个/mL)刺激了4天。通过添加1μCi的[3H]，测定了最终16小时中的DNA合成。
图8(a)～图8(d)中揭示了源于骨髓的嗜碱性粒细胞和来自肥胖细胞的Th2细胞因子产生。图8(a)中揭示了：在OVA323-339(1μM)、或者抗DNP IgEmAb(10μg/mL)的存在下或非存在下，用DNP-OVA(100μg/mL)，并在经照射的ΔT脾脏或经纯化的嗜碱性粒细胞(5×105个/mL)的存在下，在48孔板中对来自DO11.10小鼠的原初脾脏CD4+CD62L+T细胞(1×105个/mL)刺激24小时而获得的结果。
图8(b)中，在IL-3(20U/mL)、或者抗DNP IgE mAb(10μg/mL)的存在下或非存在下，用DNP-OVA(100μg/mL)，在96孔板中对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞(各1×105个/0.2mL孔)再次刺激16小时，回收上清液，并利用ELISA对IL-4或IL-13的产生进行了试验，并将获得的结果以平均+SEM进行了表示。图中表示有5次独立实验的代表例。nd表示未能检测到。
图8(c)中揭示了利用RT-PCR，对自源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞所提取的mRNA，分析TLR基因和β-肌动蛋白的表达而获得的结果。作为TLR mRNA的阳性对照(posi.)，使用的是自小鼠脾脏细胞提取的mRNA。
图8(d)中，利用IL-3(20U/mL)和IL-18(50ng/mL)、IL-33(100ng/mL)、LPS(1μg/mL)或PGN(10μg/mL)，分别在96孔板中对源于骨髓的经FACS分拣的嗜碱性粒细胞或肥胖细胞(各1×105个/0.2mL孔)再次刺激24小时，回收上清液，利用ELISA对IL-4、IL-6或IL-13的产生进行试验，将实验结果以平均+SEM表示。图中表示有5次独立实验的代表例。
图9(a)～图9(e)中揭示了具有抗FcεR1α的嗜碱性粒细胞的清除。在图9(a)～图9(d)中表示有：以1天2次，共3天于腹腔内投予了5μg的抗小鼠Fcε1α(MAR-1(+))或PBS(MAR-1(-))的BALB/c小鼠的、嗜碱性粒细胞(FcεR1+/c-kit-细胞或FcεR1+/DX5+细胞)的流式细胞记数和频率。在最终投予的2天后，对嗜碱性粒细胞的数量进行了定量(图9(a)：脾脏，图9(b)：肝脏)。接着，将DNP-OVA和抗DNP IgE的混合物与MAR-1或PBS一同注入小鼠体内，1天注入2次，共注入了3天。利用OVA进行腹腔内激发后，在投予I.C 4天后，进而利用MAR-1或PBS对小鼠进行处理，每周连续处理5天，持续处理了2周。在OVA激发1周或2周后，对血液(图9(c))或脾脏(图9(d))中的嗜碱性粒细胞的数量进行了定量。
图9(e)中揭示了，来自用渗透泵注入了IL-3(0～10μg/体重/2周)的BALB/c小鼠的嗜碱性粒细胞(FcεR1+/DX5+细胞)的频率的代表性实验数据。图中表示有5次独立实验的代表例。图中以百分比表示FcεR1+/c-kit-细胞或FcεR1+/DX5+细胞相对于脾脏的非B非T细胞的比例。
图10揭示了经抗原激活的嗜碱性粒细胞在体内的Th2/IgE诱导的示意图。如果将抗原A(例如OVA)投予正常动物，那么首先抗原A会被嗜碱性粒细胞摄取(图中1)。经OVA激活的嗜碱性粒细胞循环到外周淋巴器官(例如脾脏)，在此对OVA特异性原初CD4+T细胞进行IL-4刺激与抗原肽/MHC-II型刺激。接着，无需来自DC的辅助作用，仅通过来自嗜碱性粒细胞的抗原刺激和IL-4刺激，使OVA特异性原初CD4+T细胞分化为Th2细胞(即，嗜碱性粒细胞依赖性的Th2细胞诱导期；图中2)。同时，投予到生物体内的OVA也会循环到外周淋巴器官。在此，OVA与OVA特异性B细胞的抗原受体结合。由于经OVA激活的B细胞会刺激OVA特异性Th2细胞，所以经刺激的Th2细胞会产生CD40配体和IL-4。所产生的CD40配体和IL-4刺激经OVA激活的B细胞，而诱导OVA特异性IgE的产生(即，Th2依赖型的B细胞活化期；图中3)。一旦产生OVA特异性IgE，那么由OVA与抗OVA特异性IgE抗体构成的IgE免疫复合物会与嗜碱性粒细胞上的FcεR1结合(即，嗜碱性粒细胞被IgE致敏；图中4)。通过被致敏的嗜碱性粒细胞的刺激，记忆Th2细胞受到刺激而增殖(图中5)。进而，经OVA刺激的记忆B细胞受到记忆Th2细胞的刺激，而产生对OVA的结合亲和性高的IgE抗体(图中6)。
[工业上的可利用性]
由于本发明明确了至今为止所不明的Th2型免疫应答的机制、尤其是初始IL-4产生的作用机制，所以本发明能够较好地用于针对Th2型疾病的新颖治疗药、治疗方法的开发等。即，本发明可以用在以医疗领域、医药品领域为首的广泛领域中。

Claims (29)

1.一种复合物，其特征在于：
由抗原和与该抗原结合的IgE组成。
2.一种组合物，其特征在于：
用于将原初T细胞诱导为Th2细胞；含有抗原和与该抗原结合的IgE。
3.一种试剂盒，其特征在于：
用于将原初T细胞诱导为Th2细胞；具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
4.一种将原初T细胞诱导为Th2细胞的方法，其特征在于包括：
第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；
第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；
第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养。
5.一种组合物，其特征在于：
用于生成IL-4；含有抗原和与该抗原结合的IgE。
6.一种试剂盒，其特征在于：
用于生成IL-4；具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
7.一种IL-4的生成方法，其特征在于包括：
第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；
第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞。
8.根据权利要求7所述的生成方法，其特征在于：
还包括将原初T细胞与通过所述第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤。
9.一种组合物，其特征在于：
用于生成IgE；含有抗原和与该抗原结合的IgE。
10.一种试剂盒，其特征在于：
用于生成IgE；具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
11.一种IgE的生成方法，其特征在于包括：
第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；
第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；
第3步骤，将原初T细胞与通过第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养；以及
第4步骤，在所述抗原和抗原提呈细胞的存在下将B细胞与第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养。
12.根据权利要求11所述的生成方法，其特征在于：
还包括在所述第4步骤中所生成的IgE的存在下培养所述抗原、所述Th2细胞及B细胞的第5步骤。
13.一种组合物，其特征在于：
用于筛选针对Th2型疾病的治疗剂；含有抗原和与该抗原结合的IgE。
14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于：
所述疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群体。
15.一种试剂盒，其特征在于：
用于筛选针对Th2型疾病的治疗剂；具备抗原、与该抗原结合的IgE、嗜碱性粒细胞。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于：
所述疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群体。
17.一种针对Th2型疾病的治疗剂的筛选方法，其特征在于包括：
第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；
第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞。
18.根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于：
在候选物质的存在下或非存在下进行所述第2步骤，并测定第2步骤后的嗜碱性粒细胞的细胞表面上所提呈的MHC-II型分子或CD80分子的量。
19.根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于：
还包括将原初T细胞与通过所述第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞一同培养的第3步骤；并且
在候选物质的存在下或非存在下进行第2步骤或第3步骤，并测定第3步骤中所诱导的Th2细胞的量。
20.根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于：
还包括在所述抗原和抗原提呈细胞的存在下将B细胞与所述第3步骤中所诱导的Th2细胞一同培养而生成IgE的第4步骤；并且
在候选物质的存在下或非存在下进行所述第2步骤～第4步骤的至少1个步骤，并测定第4步骤中所生成的IgE的量。
21.根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于：
还包括在所述第4步骤中所生成的IgE的存在下培养所述抗原、Th2细胞及B细胞的第5步骤；并且
在候选物质的存在下或非存在下进行所述第2步骤～第5步骤的至少1个步骤，并测定第5步骤中所生成的IgE的量。
22.根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于：
是针对Th2型疾病的治疗剂的筛选方法，
还包括：
将通过所述第2步骤进行培养后的嗜碱性粒细胞投予动物而制作模型动物的步骤；
向所述模型动物投予候选物质的步骤；以及
测定被投予了所述候选物质后的模型动物中有无针对Th2型疾病的改善效果的步骤。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的筛选方法，其特征在于：
所述疾病选自由花粉症、支气管哮喘、异位性皮炎、过敏性肠炎、过敏性结膜炎及过敏性鼻炎所组成的群体。
24.一种Th2型疾病的模型动物的制作方法，其特征在于包括：
第1步骤，形成由抗原和与该抗原结合的IgE组成的复合物；
第2步骤，在所述复合物的存在下培养嗜碱性粒细胞；以及
将在所述复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞投予动物的步骤。
25.根据权利要求24所述的制作方法，其特征在于：
所述疾病为支气管哮喘；
包括将在所述游离复合物的存在下进行培养后的嗜碱性粒细胞，经鼻投予。
26.一种组合物，其特征在于：
用于处置Th2型疾病；含有清除嗜碱性粒细胞的物质或、阻碍FcεR1的功能的物质。
27.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于：
含有针对FcεR1的抗体。
28.一种处置Th2型疾病的方法，其特征在于包括：
从被试验体中清除嗜碱性粒细胞的步骤；或
向被试验体投予阻碍FcεR1的功能的物质的步骤。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于：
包括对被试验体投予针对FcεR1的抗体的步骤。
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