JP5854432B2 - アレルギー反応検出法 - Google Patents
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Description
さらに、マウス好塩基球の表面に発現するCD200R1の発現量が、活性化されていない好塩基球におけるCD200R1の発現量に対して多い場合に、CD200R1の発現は上昇したと判定し、その好塩基球が活性化されていると判定することを指標として、マウス好塩基球の免疫グロブリンE(IgE)に依存した活性化を併せて検出する方法が好ましい。
前記マウス好塩基球については、能動感作又は受動感作して得られたものを利用することができる。
前記被検物質のアレルゲン活性の評価方法には、被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含んでいてもよい。
本開示に係るCD200R3の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のIgGに依存した活性化の検出をすることを特徴とするアレルギー反応の検出方法では、マウス好塩基球の表面に存在するCD200R3の発現低下を指標として用い、IgGに依存したマウス好塩基球の活性化の検出に基づきアレルギー反応を検出する。
本開示に係る、CD200R3の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のIgGに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法で用いる好塩基球は、感作されたものが好ましく、好塩基球の感作は、能動感作であってもよく、受動感作であってもよい。
本開示に係る、CD200R3の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のIgGに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法においては、上述したIgGに依存した活性化の検出に加え、マウス好塩基球のIgEに依存した活性化の検出を行うことが好ましい。
本開示に係る好塩基球の活性化の検出方法を利用した具体例として、アレルゲン活性の評価方法と抗アレルギー活性の評価方法について、以下に説明する。
図1は、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法のフローチャートである。アレルゲン活性の評価方法には、被検物質の混合手順S1、CD200R3の測定手順S2及び被検物質の評価手順S3が含まれる。各手順について、フローチャートに則して説明する。
図3は、本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法のフローチャートである。抗アレルギー活性の評価方法には、被検物質とアレルゲンとの混合手順S1、CD200R3の測定手順S2、被検物質の評価手順S3の各手順が含まれる。このうち、(1)において述べたCD200R3の測定手順S2以外の、被検物質とアレルゲンとの混合手順S1と被検物質の評価手順S3について説明する。
(1)CD200R3の発現低下を指標として、マウス好塩基球のIgGに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法。
前記発現低下とは、活性化されていないマウス好塩基球におけるCD200R3の発現量を基準とし、該基準未満のこととした場合、
前記基準は、前記活性化されていないマウス好塩基球におけるCD200R3の発現量の中央値±65%が好適であることが好ましい。
前記発現低下は、前記中央値の45%未満が好適であり、2〜35%がより好適である。
前記発現低下は、前記マウス好塩基球の11%以上で発現低下が見られることとすることが好ましい。
(2)さらに、CD200R1の発現上昇を指標として、マウス好塩基球のIgEに依存した活性化を検出する、上記(1)記載の方法。
前記発現上昇とは、活性化されていないマウス好塩基球におけるCD200R1の発現量を基準とし、該基準を超えることとした場合、
前記基準は、前記活性化されていないマウス好塩基球におけるCD200R1の発現量の中央値±55%が好適である。
前記発現上昇は、前記基準の155%以上の範囲とすることが好適であり、160〜830%の範囲とすることがより好適である。
前記発現上昇は、前記マウス好塩基球の6%以上で発現上昇が見られることとすることが好ましい。
(3)前記マウス好塩基球が能動感作又は受動感作して得られたものである、上記(1)又は(2)記載の方法。
(4)上記(1)から(3)の何れかに記載の方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法。
(5)被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含む、上記(4)記載のアレルゲン活性の評価方法。
前記低下とは、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を基準とし、該基準未満のこととした場合、
前記基準は、前記CD200R3の発現量の中央値±65%が好適である。
前記低下は、前記中央値の35%未満が好適であり、2〜35%がより好適である。
前記低下は、前記マウス好塩基球の11%以上で前記発現量の低下が見られることとすることが好ましい。
(6)被検物質と、マウス好塩基球と、マウス好塩基球に対するアレルゲンと、を混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量に比して上昇している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されていないと判定し、前記被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順と、を含む、(4)記載の抗アレルギー活性の評価方法。
前記上昇とは、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を基準とし、該基準を超えることとした場合、
前記基準は、前記CD200R3の発現量の中央値±65%が好適である。
前記上昇は、前記中央値の1.65倍を超えることが好適であり、3〜50倍がより好適である。
前記上昇は、前記マウス好塩基球の11%以上で前記発現量の上昇が見られることとすることが好ましい。
1.マウス好塩基球のIgG依存的活性化におけるCD200R3の発現量の変化
マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3について、IgG受容体を介したマウス好塩基球への刺激により、発現量に変化が生じるか検証した。
本試験例に使用するマウスの血液は、BALB/cマウス(メス)から得た。市販の6週齢のマウス(日本クレア社)を用意し、乳原料を含まない飼料(MRストック、日本農業工業社)を用いて飼育した。14週齢のマウスおいて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。採取した血液に、抗マウスFcγRIII/II抗体(BD Biosciences社製)を1μg/mlになるように添加して好塩基球を刺激し、試験群1とした。また、対照群1には、抗マウスFcγRIII/II抗体溶液の代わりにPBSを添加した。試験群1及び対照群1を37℃で1時間保温し、その後、2mM EDTAを添加して、氷上で10分間静置した。
本試験例の結果を図4A〜Cに示す。図4A〜Cは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムであり、右側のパネルは試験群を、左側のパネルは試験群は対照群を示す。図4Aの横軸は、細胞の前方散乱光(FSC)の強度であり、縦軸は、側方散乱光(SSC)の強度である。FSCの強度は細胞の大きさに関連し、SSCの強度は細胞内部の構造に関連する。FSCとSSCの測定結果に基づいて、図4A中P1で示される領域を、好塩基球が含まれる領域とした。
2.マウス好塩基球における IgGによるCD200R3の発現量低下の誘導
好塩基球におけるCD200R3の発現低下が、IgGにより誘導されるか検証した。
本試験例で用いるα−カゼイン抗血清の作製方法について、簡単に説明する。牛乳成分除去食で飼育したBALB/c(メス、6週齢)に、α−カゼイン(SIGMA社)をフロイント系アジュバント(初回はフロイント完全アジュバント、2度目以降はフロイント不完全アジュバントを使用)と共に2週間間隔で腹腔内投与した。3度目の投与から1週間後に、全身麻酔下で心臓より血液を採取した。血液から血清を調製し、α−カゼイン抗血清とした。
本試験例の結果を図5に示す。図5の横軸は、α−カゼイン抗血清の濃度であり、縦軸は、CD200R3の発現量の減少が見られた細胞の割合である。図5に示すように、試験群2では、CD200R3の発現低下が見られた細胞は、抗血清の濃度にかかわらず少なかった。一方、対照群2では、抗血清の濃度が高い場合には、ほぼ全ての好塩基球についてCD200R3の発現低下が見られ、発現低下が見られた好塩基球の割合は、抗血清の濃度に依存的であった。表2に、抗血清の各濃度におけるCD200R3の発現低下が見られた好塩基球の割合を示す。
3.マウス好塩基球のIgE依存的活性化におけるCD200R3の発現量の変化
マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3について、IgE受容体を介したマウス好塩基球への刺激によっても、発現量に変化が生じるか検証した。
本試験例では、上述した試験例2において作製したα‐カゼイン抗血清を用いた。また、IgE不活性化抗血清として、α−カゼイン抗血清を56℃で6時間保温したものを用意した。
本試験例の結果を図6に示す。図6Aは、試験群3及び対照群3においてCD200R3の発現低下が見られた好塩基球の割合を示す。一方、図6Bは、試験群3及び対照群3においてCD200R1の発現上昇が見られた好塩基球の割合を示す。また、図6A及び図6Bの各々のグラフに示す好塩基球の割合(%)を、表3にまとめた。
4.好塩基球におけるCD200R3の発現低下とCD200R1の発現上昇との関連
IgG受容体を介した刺激によってCD200R3の発現低下が見られる好塩基球において、CD200R1の発現上昇についても見られるか検証した。
本試験例に使用するマウスの血液は、試験例1、2、3と同様に、BALB/cマウス(メス)から得た。市販の6週齢のマウスを用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。16週齢のマウスについて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。得られた血液に抗マウスFcγRIII/II抗体(濃度1μg/ml)、もしくはヤギ抗マウスIgE抗体(Bethyl社、濃度0.5μg/ml)を添加し、前者を試験群4、後者を試験群5とした。また、対照群4として、血液にPBSを加えたものを用意した。
本試験例の結果を図7に示す。図7A〜Cは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムであり、右側のパネルから順に試験群4、試験群5、対照群4を示す。図7Aの横軸は、FSCの強度であり、縦軸は、SSCの強度ある。FSCの強度とSSCの強度に基づいて、図7A中P1で示される領域を好塩基球が含まれる領域と判定した。図7Bの横軸は、抗マウスIgE抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗CD49b抗体に由来する蛍光強度である。図7A中P1領域内の細胞から、CD49bとIgEの染色について陽性と判断された細胞(図7B、P2参照。)を選別し、好塩基球と判定した。
5.能動感作されたマウスにおける好塩基球の活性化の検出
能動感作マウスの血液を用い、好塩基球表面のCD200R1とCD200R3の発現変化から感作の状態を評価した。
本試験例では、マウス好塩基球について、能動感作した後に回収した。能動感作の手順を具体的に説明する。市販の3週齢のBALB/cマウス(メス)を用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。4週齢時から2週間毎に、水酸化アルミニウムゲルと共にカゼインをマウスの腹腔内へ投与した(n=10)。4回目の投与から1週間後にマウスから採血した。得られた血液にカゼインを1μg/mlとなるように添加し、これを本試験例の試験群(試験群6〜15)とした。また、カゼインを加えない血液を対照群(対照群6〜15)とした。試験群及び対照群については、37℃で2時間保温した後、血液に2mMEDTAを添加して、氷上で10分間放置した。試験群及び対照群については、10%ウマ血清でブロッキングした後、APC標識−抗マウスCD49b抗体、FITC標識‐抗マウスCD200R3抗体、PE標識−抗マウスCD200R1抗体の各抗体を用いて標識した。溶血処理により試験群及び対照群から赤血球を除去した後、フローサイトメトリーを行った。
本試験例の結果を図8に示す。図8A〜Cは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムである。左側のパネルは個体1についての試験群(試験群6)と対照群(対照群6)の結果を示し、右側のパネルは個体2についての試験群(試験群7)と対照群(対照群7)の結果を示す。図8Aの横軸はFSCの強度であり、縦軸はSSCの強度である。FSCの強度とSSCの強度に基づいて、図8A中P1で示される領域を好塩基球が含まれる領域と判定した。図8Bの横軸は、抗CD200R3抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗CD49b抗体に由来する蛍光強度である。図8A中P1領域内の細胞から、CD49bとCD200R3の染色について陽性と判断された細胞(図8B、P2参照。)を選別し、好塩基球と判定した。
Claims (6)
- マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量が、活性化されていない好塩基球におけるCD200R3の発現量に対して低い場合に、CD200R3の発現は低下したと判定し、その好塩基球が活性化されていると判定することを指標として、マウス好塩基球のIgGに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法。
- さらに、マウス好塩基球の表面に発現するCD200R1の発現量が、活性化されていない好塩基球におけるCD200R1の発現量に対して多い場合に、CD200R1の発現は上昇したと判定し、その好塩基球が活性化されていると判定することを指標として、マウス好塩基球のIgEに依存した活性化を検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記マウス好塩基球が能動感作又は受動感作して得られたものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1から3の何れか一項に記載の方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法。
- 被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、
前記マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を測定する手順と、
前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含む、
請求項4に記載のアレルゲン活性の評価方法。 - 被検物質と、マウス好塩基球と、マウス好塩基球に対するアレルゲンと、を混合する手順と、
前記マウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量を測定する手順と、
前記発現量が、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するCD200R3の発現量に比して上昇している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されていないと判定し、前記被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順と、を含む、
請求項4に記載の抗アレルギー活性の評価方法。
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