TWI810145B - 具有病患衍生之異種移植物之非ｈｌａ配對的人源化ｎｓｇ小鼠模式 - Google Patents

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Abstract

本文中所敘述之本發明提供具有病患衍生之異種移植物(PDX)之非HLA配對的人源化小鼠模式(例如NSG小鼠模式)，以及其製造及使用之方法。

Description

具有病患衍生之異種移植物之非HLA配對的人源化NSG小鼠模式 相關申請案之交叉引用
本申請案依據美國專利法35 USC 119(e)主張2015年6月23日提交之美國臨時專利申請案第62/183,386號之權益，該臨時申請案以引用之方式全文併入本文中。
本申請係關於人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病小鼠、製造具有病患衍生之異種移植物之該小鼠之方法、利用該小鼠預測對於治療腫瘤之多種抗腫瘤藥劑之療效排序之方法、利用該小鼠測試以兩種或更多種候選藥劑治療腫瘤之聯合治療之方法，以及利用該小鼠測試以藥劑治療腫瘤之給藥方案的療效及/或安全性之方法。
脊椎動物之免疫系統極其複雜且免疫系統之疾患也同樣地複雜。脊椎動物免疫系統包括先天性免疫系統及適應性免疫系統。先天性免疫系統亦稱為非專一性免疫系統，其包括以非專一性之方法防禦微生物之細胞。 先天性免疫系統與適應性免疫系統之間的區別在於適應性免疫系統會專一性地辨識抗體並提供長期保護。先天性免疫系統之特徵在於與抗體無關之反應，且先天性免疫系統之顯露並不會造成免疫性記憶。先天性免疫系統之細胞包括樹狀細胞、肥大細胞、巨噬細胞、自然殺手細胞、嗜中性白血球以及嗜伊紅血球。
由於脊椎動物免疫系統之複雜性，要確認及治療疾病與缺陷往往是困難的。對於可單離免疫反應之態樣以提供有用的方法及組合物，例如確認免疫系統之疾病及缺陷之有效的醫藥及藥物治療的動物模式係有持續的需求。
免疫缺陷之小鼠常常作為正常及不正常的異種細胞之生長及分化的模式。免疫缺陷之小鼠之特徵在於具有一個或多個下列者：缺乏功能性免疫細胞，諸如T細胞及B細胞；DNA修復缺陷；在淋巴細胞編碼抗原-專一性受體之基因的重組缺陷；以及缺乏免疫功能性分子，諸如IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。
免疫缺陷之小鼠之特徵可在於具有一個或多個參與免疫功能之基因(諸如Rag1和Rag2)的缺陷(Oettinger,M.A et al.,Science,248：1517-1523,1990，及Schatz,D.G.et al.,Cell,59：1035-1048,1989)。免疫缺陷之小鼠可具有任何該等或在小鼠內造成不正常的免疫功能之其他缺陷。
特別有用的免疫缺陷之小鼠品系為詳細敘 述於Shultz et al.,J.Immunol.,174：6477-6489,2005之NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 /SzJ，其通常被稱為NOD scid加瑪(NSG)小鼠；以及NOD.Cg-Rag1tm1Mom I12rg tm1Wj1 /SzJ,Shultz et al.,Clin.Exp.Immunol.,154(2)：270-284,2008，其通常被稱為NRG小鼠。
在一些具體例中，該免疫缺陷之小鼠品系可藉由將部分的人類免疫系統植入免疫缺陷之小鼠內，以進行人源化。該人源化小鼠模式係具體地作為強有力的研究工具。雖然在齧齒動物，諸如小鼠，已完成大部分的實驗研究，但是藉由小鼠研究而預測的結果總是無法代表人類的實際結果。建立人源化小鼠模式可在小鼠內研究人類特異性感染及治療，因此可使人類細胞、組織及免疫系統能夠進行臨床上相關的活體實驗，免除使病患處於危險之中的缺點。
雖然可取得各種免疫缺陷之小鼠品系，但是各品系在使用時具有缺點以及限制。尤其，有效的植入諸如異種的造血幹細胞(hematopoietic stem cell,HSC)之異種的幹細胞，在免疫缺陷之小鼠中必須以輻射線照射接受者小鼠或藉由服用諸如硫酸布他卡因(bisulfau)之類放射性藥物。輻射線照射新生小鼠會造成小鼠體型小、體弱、以及一些輻射線照射之小鼠過早死亡。另外，必須顧慮輻射線照射對經處理之動物之造血發育之影響。參見，例如，Nielsen et al.,Blood,110(3)：1076-1077,2007。
因此，對於將異種的造血幹細胞植入免疫缺陷之小鼠品系之方法及組合物以及其使用係有持續的需求的。
在本發明之一態樣提供一種人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic,NOD)，其中該小鼠：(1)scid突變為同合子；(2)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(3)植入有CD34+人類造血幹細胞(HSC)；(4)接種衍生自人類病患的異種移植物(PDX)；其中HSC及PDX為非HLA配對(例如，僅部分配對或不配對)。
在某些具體例中，scid突變為Cg-Prkdc scid 。
在某些具體例中，IL-2受體加瑪鏈缺陷為諸如I12rg tm1Wji 之基因無效突變。在其他具體例中，IL-2受體加瑪鏈缺陷為在IL-2R加瑪鏈之截斷式突變(例如，結合(latch)胞外或胞內結構域)。
在某些具體例中，小鼠為NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 /SzJ(即NOD scid加瑪(NSG))。
在某些具體例中，小鼠為進一步手術植入人類胸腺及肝片段之雌性NSG小鼠，例如，hu-BLT NSGTM小鼠(BLT小鼠或BLT人源化小鼠)。
在某些具體例中，小鼠係植入人類周邊血液單核細胞，例如，hu-PBMC NSGTM小鼠(或PBMC人源化小鼠)。
在某些具體例中，小鼠進一步包含組成性表現人類介白素(IL-3)、人類顆粒細胞/巨噬細胞-刺激因子(GM-CSF)，以及/或人類Steel因子(SF)之轉基因。
在某些具體例中，CD34+人類HSC之植入係透過尾靜脈注射(較佳地，該小鼠為雌性)、臉部靜脈注射、心內注射，或肝內注射。
在某些具體例中，CD34+人類HSC係植入年齡為2至4週之小鼠，例如，約2週、3週或4週。
在某些具體例中，CD34+人類HSC係植入年齡為24至72小時之小鼠，例如，約24小時、36小時、48小時、60小時、72小時或90小時。
在某些具體例中，CD34ig.+人類HSC係植入全身經輻射線照射後之小鼠(例如，以約1、2、3、4、5、10、20、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、或1300cGy之劑量或界於本文所列舉之任何兩個劑量之間(諸如100至300cGy或700至1300cGy等等)。
在某些具體例中，人類PDX係接種至已植入CD34+人類HSC約2週之小鼠。在某些具體例中，人類PDX係接種至已植入CD34+人類HSC約12週之小鼠。在某些具體例中，人類PDX係接種至已植入CD34+人類HSC約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週(或由任兩個數值所限定之範圍)之小鼠。
在某些具體例中，人類PDX係來自於原始病患樣本。在某些具體例中，人類PDX係來自於已繼代至少一世代之異種移植物之歸檔腫瘤樣本。在某些具體例 中，人類PDX具有低繼代數，例如已繼代為異種移植物或培養為不超過5、4、3、2或1世代者。在某些具體例中，人類PDX保留從人類癌症所衍生之基因型及/或表型異質性。在某些具體例中，人類PDX係來自於從未治療過的病患。在某些具體例中，人類PDX係來自於難治性病患。
在某些具體例中，人類PDX係來自於腫瘤維持之PDX LIVETM之任何一個或多個PDX，且其可從傑克孫實驗室(Jackson Laboratory)獲得。傑克孫實驗室提供使用較廣範圍的早期繼代數之來自於病患之異種移植物(PDX)癌症模式，以作為收集植入PDX LIVETM腫瘤的NSG小鼠。這樣的收集一應俱全，現成的，PDX腫瘤可保存於NSG小鼠背景中，且任何PDX也可在受試之非HLA配對的人源化免疫缺陷之小鼠內(例如，NSG、NSGS、BLT等等)。
例如，在某些具體例中，PDX腫瘤為乳房腫瘤，包含侵襲性乳腺管癌。典型的乳房腫瘤包括TM00089、TM00095至TM00099、TM00103以及TM 00129(TM數值代表在http：//tumor.informatics.jax.org/mtbwi/index.dot.do的小鼠腫瘤生物學資料庫(Mouse Tumor Biolody Database))。在某些具體例中，PDX腫瘤為諸如具有ALK、KRAS、TP53、EGFR或其組合之突變者的肺癌。參見TM00046、TM00186、TM00192至TM00194、TM00200、TM00202-TM00204、TM00206、TM00208、TM00213、TM00214、TM00219、TM00222、TM00226、TM00233、TM00253、TM00302、TM00355、TM00784、TM00832。在某 些具體例中，PDX腫瘤為膀胱癌(例如，TM00015)。在某些具體例中，PDX腫瘤為腦癌(例如，TM00058及TM01087)。在某些具體例中，PDX腫瘤為結腸癌(例如，TM00164及TM00165)。在某些具體例中，PDX腫瘤為卵巢癌(例如，TM00334、TM00335及TM00391)。
在某些具體例中，人類PDX係來自於卵巢癌、諸如非小細胞肺癌(NSCLC)之肺癌、膀胱癌、淋巴癌(諸如AML、CML、ALL、CLL、DLBCL(瀰漫性大型B細胞淋巴癌))、諸如三陰性乳癌(TNBC)之乳癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、大腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、胃/GIST癌、肝癌、腎臟/腎性癌、皮膚癌(諸如黑色素細胞瘤)、軟組織癌、肉瘤，或癌細胞株之異種移植物。
在某些具體例中，人類PDX係來自於表現PD-L1及/或PD-L2之腫瘤/癌之異種移植。
在某些具體例中，接種人類PDX約0.5至10×106個細胞(例如，約1至9×106個細胞、約2至8×106個細胞、約3至7×106個細胞、約4至6×106個細胞，或約5×106個細胞)。
在某些具體例中，在接種PDX後約50天(或HSC植入後約9星期)，小鼠周邊血液內之人類CD45+細胞之百分比達到約20至30%。
在某些具體例中，小鼠投予抗癌化合物。例如，抗癌化合物可為5-FU、癌思停(Avastin)、順鉑、卡鉑、吉舒達(Keytruda)、歐洲紫杉醇(docetaxel)，或其組合。 在某些具體例中，抗癌化合物為化療藥物。在某些具體例中，抗癌化合物為臨床前的藥物。在某些具體例中，抗癌化合物為免疫調變劑，諸如PD-1或其配體/受體之調變劑，或CTLA-4或其配體/受體之調變劑。在某些具體例中，抗癌化合物為抗PD-1及/或抗PD-L1藥劑，諸如抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體。
抗PD-1抗體阻斷PD-1及其配體、PD-L1及PD-L2之間的交互作用，而PD-L1抗體阻斷PD-L1及兩個PD-1與B7-1(CD80)之間的交互作用，其意味T細胞反應之向下調變。
數個PD-1及PD-L1抑制劑在臨床開發階段，且於橫跨多種癌症的早期及晚期臨床試驗。任何一個或多個PD-1及PD-L1抑制劑可作為本發明之抗癌藥劑。
代表性的抗PD-L1藥劑包含如下表1所示之藥劑，且代表性的抗PD-1藥劑包含於下表2，兩者皆修改自Dolan和Gupta,Cancer Control,21(3)：231-7,2014(引用併入)。
例如，BMS-936559/MDX-1105為抗PD-L1之完整人類、高親和性、免疫球蛋白(Ig)G4單株抗體。MPDL3280A為以PD-L1為標的之工程改造的人類單株抗體。CT-011/皮迪利蘇單抗(pidilizumab)為與PD-1結合之人源化IgG1單株抗體。BMS-936558/MDX-1106/納武單抗(Nivolumab)為抗PD-1之完整人類IgG4單株抗體。派姆單抗(Pembrolizumab)為具抗PD-1之活性的高選擇性、人源化 IgG4-kappa單株抗體。
在某些具體例中，抗癌藥劑為CTLA-4拮抗劑，諸如抗CTLA-4抗體(例如，治療黑色素細胞瘤之易普利單抗(ipilimumab)-FDA許可CTLA-4抑制劑；及曲美木單抗、早期替西里單抗(ticilimumab)或CP-675,206、由Pfizer所製造的完整人類IgG2單株抗體，且正在進行治療癌症之人類臨床試驗)。
在某些具體例中，抗癌藥劑為CTLA-4拮抗劑及PD-1拮抗劑/PD-L1拮抗劑之組合。由於CTLA-4及PD-1調控不同的免疫抑制途徑，因此相較於僅僅抑制其中一個免疫抑制途徑，同時抑制兩個免疫抑制途徑可能較為有效。
CTLA-4係T細胞上的關鍵抑制細胞表面蛋白，且癌生長可能與調控免疫反應之自然回饋機制之失衡有關。例如，腫瘤可能向下調節活化T細胞之共同刺激途徑，包括CD28、CD40、OX40，及CD137。期間或二擇一地，腫瘤可能向上調節抑制免疫檢查點途徑，包括LAG-3、CTLA-4，以及B7-H3。臨床前及/或臨床證據暗示了晚期癌症與OX40之降低的T細胞表現有關；正常免疫之腫瘤逃脫受CTLA-4免疫檢查點途徑之利用攻擊；CTLA-4之T細胞表現透過限制T細胞活性及增生來抑制抗腫瘤反應；LAG-3免疫檢查點之增強的T細胞表現(從而增加T細胞活性及功能之抑制效果)；以及可減弱T細胞媒介型免疫反應之B7-H3的腫瘤細胞表現。因此受體小鼠可用來測定是否向上調節CD28、CD40、OX40，及/或CD137共同刺激途徑， 或向下調節LAG-3、CTLA-4，及/或B7-H3抑制免疫檢查點途徑，而治療任何的PDX腫瘤。
腫瘤也可利用有別於透過CTLA-4及PD-1調控之機制來逃脫免疫反應。舉例而言，多數的骨髓生長因子在許多腫瘤之微環境內釋放，以傳遞獨特的免疫抑制能力之訊息給未成熟骨髓細胞進行擴增，其包含稱為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之骨髓細胞亞族群。在實體腫瘤內，TAM係白血球中豐富的族群，在許多環境中，例如其係藉由抑制TIL活性及增加腫瘤血管新生，以促進而非抑制腫瘤進展。
在腫瘤中，調控型T細胞(Treg)及T助手細胞2(TH2)受TAM促進，產生強大的免疫抑制作用。這些細胞通常與免疫耐受性之維持有關。
其他在腫瘤內發現的骨髓細胞包括骨髓衍生的抑制細胞(MDSC)，依其抑制T細胞增生及促進血管新生之能力所界定，其代表包括巨噬細胞、顆粒細胞，及樹突細胞之前驅物之未成熟細胞的異質群。MDSC利用免疫抑制機制之範圍來協助腫瘤逃脫免疫性，其大部分的作用在於抑制T細胞。
其他著重於腫瘤免疫性之免疫細胞族群包括樹突細胞(DC)及自然殺手(NK)細胞。DC係「專職抗原呈現細胞」，且能夠操作獨特的腫瘤專一性抗原，以活化T及B細胞。因此，在研究基點上，將DC專用於發展腫瘤疫苗及離體擴增腫瘤專一性的CTLS，以為後續授受的免疫 治療。
NK細胞具有獨特的細胞表面受體，其對於自我組織的免疫監控係重要的，且其活性係藉由結合在可見於大部分正常細胞及腫瘤之HLA第I型抗原呈現分子來調節。保有HLA第I型表現之腫瘤逃脫NK細胞媒介型細胞毒性，但是那些失去表現者則不被NC細胞辨識為「自體」，且可被殺死。促進NK細胞活化之化合物及利用外源的NK細胞之授受的免疫療法為臨床前及臨床研究之熱門領域。
在某些具體例中，抗癌藥劑為抗體(例如，單株抗體或mAb)或其抗原結合片段。在某些具體例中，抗體阻斷或增強細胞間之配體-受體的交互作用(例如，在腫瘤細胞及免疫細胞，諸如T細胞、TAM、MDSC、DC、NK細胞等等之間)。在某些具體例中，抗體作為細胞間之配體-受體交互作用之促效劑或拮抗劑(例如，在腫瘤細胞及免疫細胞，諸如T細胞、TAM、MDSC、DC、NK細胞等等之間)。在某些具體例中，抗體藉由抗體-依賴型細胞的細胞毒素(ADCC)標靶細胞破壞。在某些具體例中，抗體傳遞結合藥物有效負載至專一性的標的細胞。
在某些具體例中，抗癌藥劑為表現傳統的T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)之基因工程改造的淋巴細胞，其可用於授受的細胞傳遞免疫療法。在某些具體例中，基因工程改造的淋巴細胞為T細胞，其係表現對抗與癌症相關抗原之抗體，其中該抗體與CAR之跨膜及/或傳訊功 能域連接或融合。該T細胞可用於授受的T細胞療法。
在某些具體例中，抗癌藥劑為雙專一性的T細胞接合者(BiTE)，其包含從兩個抗體融合至單一分子來結合特異性區域，以直接地結合CTL至腫瘤細胞的抗原以增強腫瘤殺害。
在某些具體例中，抗癌藥劑為離體擴增之再融合TIL，其中TIL係經基因工程改造，以表現對獨特的腫瘤抗原具有專一性之T細胞受體(TCR)。在某些具體例中，腫瘤為子宮頸癌、淋巴癌或血癌。在某些具體例中，抗癌藥劑進一步包含免疫檢查點抑制劑，諸如抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體，或抗PD-L1抗體。
在某些具體例中，抗癌藥劑為同種異體的捐贈者淋巴球輸注(DLI)，或同種異體的NK細胞輸注。
在某些具體例中，抗癌藥劑為適應性地轉移的樹突細胞，其在適應性的轉移之前，已與腫瘤專一性抗原接觸。
在某些具體例中，抗癌藥劑為包含腫瘤專一性抗原之疫苗，其中該疫苗放大內生性的腫瘤專一性T細胞反應。
在某些具體例中，對於IL-2受體加瑪鏈缺陷，小鼠為同合子或半合子。
本發明之另一態樣提供一種製造具有病患衍生之異種移植物之人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病小鼠之方法，該方法包含：(1)將CD34+人類造血幹細胞(HSC)導入免疫缺陷之非肥胖型糖尿病小鼠內，其中該小鼠：(a)scid突變為同合子，(b)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(2)將衍生自人類病患的異種移植物(PDX)接種至該小鼠，其中該HSC與該PDX為非HLA配對。
本發明之另一態樣提供一種將異種的幹細胞植入至具有嚴重的複合式免疫缺陷之免疫缺陷的非肥胖型糖尿病小鼠內之方法，其包含將異種的幹細胞投予小鼠。
本發明之另一態樣提供一種預測對於治療腫瘤之多個抗腫瘤藥劑之療效排序之方法，該方法包含：(1)將該多個抗腫瘤藥劑中的各者作為單一藥劑投予至對象(非HLA配對的PDX)小鼠(例如，NSG小鼠)，並測定療效，其中PDX代表腫瘤；(2)將該多個抗腫瘤藥劑之各者作比較及/或排序，從而預測對於治療腫瘤之該多個抗腫瘤藥劑之療效排序。
本發明之另一態樣提供一種測試利用兩種或更多種候選藥劑以治療腫瘤之聯合治療之方法，該方法包含：(1)將該兩種或更多種候選藥劑作為單一藥劑或作組合，以投予至申請專利範圍第1項之小鼠，並測定療效，其中該PDX代表該腫瘤；(2)將組合藥劑之療效以及單一藥劑之療效進行比較，其中組合藥劑相較於單一藥劑之加成療效具有較好的療效代表組合藥劑係較優異。
本發明之另一態樣提供一種測試利用藥劑以治療腫瘤之給藥方案的療效及/或安全性之方法，該方法包含：(1)將該藥劑投予至申請專利範圍第1項之小鼠，其中該PDX代表該腫瘤，且其中該藥劑依據該給藥方案進行投予；(2)測定療效及/或安全性。
可設想的，本文所敘述的包括那些僅敘述於實例中以及僅敘述於本發明之其中一態樣內之任何一個具體例，除非明確地放棄或依本領域技術人員所了解為不適用，其可與任何一個或多個之其他具體例作結合。
第1圖顯示在人源化NSG小鼠，對於非HLA配對的腫瘤之生長曲線。
第2圖顯示在人源化NSG小鼠內(n=7)，非HLA配對的SKOV3卵巢癌細胞異種移植物的生長曲線。
第3圖顯示接種SKOV3癌細胞後50天，周邊血液內之hCD45+細胞(%)。
第4A至4C圖顯示在NSG小鼠相對於人源化NSG小鼠，非HLA配對的腫瘤(分別為BR0744、LG0977及SA0209)的生長曲線。
第5A至5C圖顯示在NSG小鼠相對於人源化NSG小鼠模式中，全部腫瘤(分別為BR0744、LG0977及SA0209)群體中的hCD45+細胞百分比。
第6A至6C圖顯示在三個非HLA配對的腫瘤PDX(分別為BR0744、LG0977及SA0209)，全部滲入的CD45+細胞中的人類淋巴細胞百分比。
第7A圖顯示在非HLA配對的人源化NSG模式中，依給藥方案之指示，透過5-FU、癌思停，及載體 對照組處理後，大腸癌CN1572P5 PDX之腫瘤體積曲線。
第7B圖顯示在3組中，於實驗第21天之平均腫瘤體積。
第8A圖顯示在非HLA配對的人源化NSG模式中，依給藥方案之指示，透過順鉑、派姆單抗(吉舒達)，及載體對照組處理後，乳癌MDA-MB-231 PDX之腫瘤體積曲線。
第8B圖顯示在派姆單抗(吉舒達)及載體組中，於實驗第20天之平均腫瘤體積。執行與第8A圖類似之實驗，且其結果顯示於第8C圖。
第9A至9D圖顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+兩者)及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的MDA-MB-231 PDX小鼠之周邊血液內。
第10A至10C圖顯示人類T細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的MDA-MB-231 PDX小鼠之腫瘤組織內。
第11A圖顯示在非HLA配對的人源化NSG模式中，依給藥方案之指示，透過順鉑、派姆單抗(吉舒達)，及載體對照組處理後，乳癌BR1126 PDX之腫瘤體積曲線。第11B圖顯示在3組中，於實驗第17天之平均腫瘤體積。執行與第11A圖類似之實驗，且其結果顯示於第11C圖。
第12A至12D圖顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+兩者)及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非 HLA配對的BR1126 PDX小鼠之周邊血液內。
第13A至13D圖顯示人類T細胞及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的BR1126 PDX小鼠之腫瘤組織內。
第13E至13H圖顯示人類T細胞及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的BR1126 PDX小鼠之脾臟內。
第14A圖顯示在非HLA配對的人源化NSG模式中，依給藥方案之指示，透過派姆單抗(吉舒達)，添加或不添加歐洲紫彬醇(decetaxol)，及載體對照處理後，肺癌LG1306 PDX之腫瘤體積曲線。第14B圖顯示在3組中，於實驗第21天之平均腫瘤體積。執行與第14A圖類似之實驗，且其結果顯示於第14C圖。
第15A至15D圖顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+兩者)及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的LG1306 PDX小鼠之周邊血液內。
第15E至15H圖顯示人類T細胞及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的LG1306 PDX小鼠之脾臟內。
第15I至15K圖顯示人類T細胞及B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的LG1306 PDX小鼠之腫瘤組織內。
第16圖顯示在經載體(對照組)、僅化療、抗PD-1(吉舒達)，以及抗CTLA4藥劑(易普利單抗)處理之 PDX樣本內，為呈現CD45+CD8+滲入的T細胞之免疫染色。數據顯示抗PD-1及抗CTLA4之療法導致滲入的T細胞強力呈現於PDX腫瘤內。
1.概述
癌症治療的傳統方法係使用對於快速分裂的細胞(諸如腫瘤/癌細胞)有毒性之廣效性化學藥劑。此種化療方法可能成功，但是也可能因多種脫靶毒性而變複雜且具有誘導抗藥性的風險。哺乳動物免疫系統已經發展出一些對於消滅包括受病原菌感染及那些已轉變為癌性之標靶細胞有效且高專一性的機制。回應中，腫瘤細胞已發展出用於逃脫免疫偵測之自主合適的機制。因此，在免疫效應細胞與腫瘤之間的交互作用獲得較佳的了解，開啟了全新對於臨床使用上促進耐久的、免疫媒介型腫瘤消退之治療策略。此種新的免疫-腫瘤學治療策略之類別非常鼓舞人心，但是本領域進一步的研究可從以對象人源化、小型動物模式為主(例如，以小鼠為主)之活體內測試平台獲得好處，其可對於人類免疫及腫瘤細胞間之交互作用有較佳的生物學了解，且可允許當其轉換為臨床應用時，具有較高成功之可能性之新治療方法的臨床前測試。
如本文中所敘述之發明，部分驚人的發現為在人類CD34+-植入的NSG小鼠內，病患衍生之異種移植物(PDX)的生長速度，並不需要在PDX與植入之人類免疫細胞之間完整的HLA-型配對。
如本文中所敘述之發明，部分驚人的發現為相對於人源化，植入癌細胞株的時機，對於異種移植物之生長無顯著的影響。另一方面，植入癌細胞株的時機對於CD45+細胞族群亦無顯著的影響。
因此，本發明之一態樣中提供一種人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，其中該小鼠：(1)scid突變為同合子；(2)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(3)植入有CD34+人類造血幹細胞(HSC)；(4)接種衍生自人類病患的異種移植物(PDX)；其中HSC及PDX為非HLA配對。
如本文中所使用，「非HLA配對」意謂不完全HLA配對，其包括僅部分HLA配對，或非HLA配對。在某些具體例中，於HSC與PDX之間，僅部分HLA配對。在某些具體例中，於HSC與PDX之間，無HLA配對。
在某些具體例中，小鼠為NSG小鼠，或密切相關之衍生者，諸如NSGS小鼠、NSG-SGM3小鼠，或植入人類CD34+之BLT小鼠。
本發明之人源化小鼠可用於廣範圍之生物、醫藥、臨床研究，其包括癌症生物學、免疫-腫瘤學、再生醫學、人類造血作用、感染病、移植、臨床前藥效測試研究，以及免疫與自體免疫，以上僅舉幾例。
舉例而言，對象人源化小鼠模式可用於研究癌症療法中、感染病治療中、基因治療之免疫回應，以及大分子藥物之免疫原性等等。
對象人源化小鼠模式也可用於臨床前之預測研究，使病患專一性之異種移植物(諸如來自腫瘤之PDX)可於植入的人類造血系統存在下之對象小鼠模式中研究。其有效性、安全性(例如，任何免疫系統相關的副作用),以及任何測試化合物或藥物之功效可藉由在一個或多個給藥方案下，將該測試化合物或藥物投予至對象小鼠模式。其在研究免疫-腫瘤學或免疫-調節子，或任何與在患病組織(例如，癌症、自體免疫疾病)與免疫系統之間的交互作用相關之研究係特別有幫助的。
對象人源化小鼠模式可在植入的人類造血系統存在下，進一步用於研究任何的PDX。其包括實施腫瘤組織學研究、體學研究或分析(蛋白質體學、基因體學、代謝體學等等)。在某些具體例中，正在研究之PDX相關資訊可從小鼠腫瘤生物學資料庫(MTB)中獲得，其設計為協助研究人員在本領域中選擇實驗的模式，檢閱在特定的癌症中突變的型態，以及識別跨越癌症的範圍中常見突變的基因。
對象人源化小鼠模式也可用來研究人類免疫系統之發展及功能，其包括發展人源化小鼠模式、分析先天性免疫細胞功能、檢視T細胞恆定性，及/或識別BLT(胎兒胸腺/胎兒肝臟)小鼠模式。
以上敘述本發明之一般態樣，本發明之特定態樣或具體例更進一步敘述於以下部分。
2.定義
除非另有說明，本文中所使用之科學的或技術的術語 具有意圖使本領域具有通常知識者能普遍理解之意義。該術語使用且定義於各標準參考文獻之上下文內，其說明性地包括J.Sambrook and D.W.Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd Ed.,2001；F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols、5th Ed.,2002；B.Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,4th Ed.,Garland,2002；D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles of Biochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman & Company,2004；Herdewijn,P.(Ed.),Oligonucleotide Synthesis：Methods and Applications,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2004；A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer(Eds.)2002,Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10：0879695919；及K.Turksen(Ed.),“Embryonic Stem Cells：Methods And Protocols in Methods,”Mol.Biol.,185：499,2002,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology,ISBN：9780470151808。
單數的術語「一(a)」、「一(an)」或「該」並非意圖限定且除非有明確地聲明或除非內文中清楚地指示，其係包括複數指示物。
術語「表現」(express,expression,expressing及expresses)係關於基因或意謂基因的轉錄作用以產生相對應的mRNA及/或mRNA的轉譯作用以產生功能性相對應 的編碼蛋白質。
術語「免疫缺陷的非人類動物」意謂非人類動物(例如，小鼠)，其特徵在於具有一個或多個：缺乏功能性免疫細胞，諸如T細胞及B細胞；DNA修復缺陷；在淋巴細胞編碼抗原-專一性受體之基因的重組缺陷；以及缺乏免疫功能性分子，諸如IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。
術語「免疫缺陷之小鼠」意謂小鼠之特徵在於具有一個或多個：缺乏功能性免疫細胞，諸如T細胞及B細胞；DNA修復缺陷；在淋巴細胞編碼抗原-專一性受體之基因的重組缺陷；以及缺乏免疫功能性分子，諸如IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。免疫缺陷之小鼠的特徵在於涉及免疫功能之基因諸如Rag1及Rag2，具有一個或多個缺陷，(Oettinger et al.,Science,248：1517-1523,1990及Schatz et al.,Cell,59：1035-1048,1989)。免疫缺陷之小鼠可具有任何這些或其他會導致小鼠不正常之免疫功能之缺陷。
特別有用的免疫缺乏之小鼠品系為詳細敘述於Shultz et al.,J.Immunol.,174：6477-6489,2005之NOD.Cg-Prkdc scid I12rgtm1 Wj1/SzJ，其通常被稱為NOD scid加瑪(NSG)小鼠；以及NOD.Cg-Rag1 tm1Mom I12rg tm1 Wj1 /SzJ,Shultz et al.,Clin.Exp.Immunol.,154(2)：270-284,2008，其通常被稱為NRG小鼠。
術語「嚴重的複合式免疫缺陷(SCID)」意謂 特徵在於T細胞不存在及缺乏B細胞功能。
SCID常見的形式包括：特徵在於在IL2RG基因的加瑪鏈基因突變且淋巴細胞表型為T(-)B(+)NK(-)之X聯結SCID；以及特徵在於Jak3基因突變且淋巴細胞表型為T(-)B(+)NK(-)、ADA基因突變且淋巴細胞表型為T(-)B(-)NK(-)、IL-7R阿爾發-鏈突變且淋巴細胞表型為T(-)B(+)NK(+)、CD3德爾塔或ε突變且淋巴細胞表型為T(-)B(+)NK(+)、RAG1/RAG2突變且淋巴細胞表型為T(-)B(-)NK(+)、Artemis基因突變且淋巴細胞表型為T(-)B(-)NK(+)、CD45基因突變且淋巴細胞表型為T(-)B(+)NK(+)之體染色體的SCID隱性基因。
依據本發明之態樣的基因改造小鼠具有嚴重的複合式免疫缺陷突變(Prkdc scid )，通常稱為scid突變。scid突變係眾所周知的且如Bosma et al.,Immunogenetics,29：54-56,1989所述，其係位於小鼠染色體16。對於scid突變之小鼠同合子之特徵在於缺乏功能性T細胞及B細胞、淋巴球減少、低球蛋白血症以及正常的造血微環境。scid突變可被偵測，例如藉由利用諸如PCR或流式細胞儀之眾所周知的方法，偵測針對scid突變之標識物。
依據本發明之態樣的基因改造小鼠具有IL2受體加瑪鏈缺陷。術語「IL2受體加瑪鏈缺陷」意謂減少的IL2受體加瑪鏈。減少的IL2受體加瑪鏈可能是由於基因缺失或突變。減少的IL2受體加瑪鏈可被偵測，例如利用眾所周知的方法藉由偵測IL2受體加瑪鏈之基因缺失 及/或偵測IL2受體加瑪鏈之表現。在某些具體例中，IL2受體加瑪鏈缺陷為IL2受體加瑪鏈基因之無效突變。在某些具體例中，具有IL2受體加瑪鏈缺陷的動物為IL2受體加瑪鏈之同合子突變體。
依據本發明之態樣提供具有scid突變或IL2受體加瑪鏈缺陷結合scid突變之基因改造的免疫缺陷之小鼠。依據本發明之態樣提供基因改造的NOD scid加瑪小鼠。
術語「NOD scid加瑪」及「NSG」在本文中可互換使用，意謂眾所周知的免疫缺陷之小鼠品系NOD.Cg-Prkdc scid NSG小鼠結合來自NOD/ShiLtJ背景的複數免疫缺陷，其為嚴重的複合式免疫缺陷(scid)突變，且完全剔除介白素-2受體加瑪鏈。其結果為缺乏成熟的T、B及NK細胞之NSG小鼠，且其細胞激素傳訊具有缺陷。NSG小鼠之特徵在於缺乏IL2R-γ(加瑪c)表現、無可偵測的血清免疫球蛋白、無溶血補體、無成熟的T淋巴細胞，以及無成熟的天然殺手細胞。
依據本發明之態樣提供具有嚴重的複合式免疫缺陷或IL2受體加瑪鏈缺陷結合嚴重的複合式免疫缺陷之基因改造的免疫缺陷之非人類動物(例如，小鼠)。
製造基因改造的免疫缺陷之非人類動物可藉由將基因標靶載體導入諸如胚胎幹(ES)細胞或誘導的多潛能幹(iPS)細胞之著床前胚胎或幹細胞而達成。
術語「基因標靶載體」意謂可有效與特定 的染色體基因座重組並顯現突變之雙股重組DNA分子，諸如藉由插入或取代標靶基因。
術語「野生型」意謂自然地發生或未突變的有機體、蛋白質或核苷酸。
視需要地，本發明之基因改造的免疫缺陷之非人類動物(例如，小鼠)係由選擇性育種所製造。具有第一預期基因型之非人類動物之第一親代株可與具有第二預期基因型之非人類動物之第二親代株進行繁殖，以製造出後代，其具有第一及第二預期基因型之基因改造的非人類動物。
本發明之基因改造的免疫缺陷之非人類動物較佳為非人類哺乳動物，尤其係諸如小鼠、大鼠或天竺鼠之齧齒動物。
依據本發明之態樣所提供之具有結合IL2受體加瑪鏈缺陷及scid突變之基因改造的免疫缺陷小鼠可為NSG小鼠、NSGS小鼠、植入人類CD34+ HSC之NSG/NSGS小鼠，或植入人類CD34+之BLT小鼠。
使用於本文之術語「異種的」係關於宿主細胞或有機體，其係指稱為「異種的」物質係衍生自宿主細胞或有機體之另一物種。
如本文中所使用，術語「造血幹細胞」意謂功能為提升免疫系統之多潛能幹細胞。來自小鼠之造血幹細胞表現c-Kit受體。c-Kit受體係本領域眾所周知的，舉例而言，其敘述於Vandenbark et al.,“Cloning and structural analysis of the human c-kit gene,”Oncogene,7(7)：1259-1266,1992以及Edling & Hallberg,“c-Kit--a hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase,”Int.J.Biochem.Cell Biol.,39(11)：1995-1998,2007。人類造血幹細胞表現CD34。CD34係眾所周知的蛋白質，舉例而言，其敘述於Simmons et al.,“Molecular cloning of a cDNA encoding CD34,a sialomucin of human hematopoietic stem cells,”J.Immunol.,148(1)：267-271,1992。
依據本發明之態樣，異種的(例如，人類)造血幹細胞投予至本發明之基因改造的免疫缺陷之非人類動物(例如，小鼠)，其中異種的造血幹細胞在基因改造的免疫缺陷之非人類動物內分化為異種的免疫細胞。
依據本發明之態樣，人類造血幹細胞投予至本發明之基因改造的免疫缺陷小鼠，其中人類造血幹細胞在基因改造的免疫缺陷小鼠內分化為人類免疫細胞。
投予至基因改造的免疫缺陷動物之造血幹細胞可從任何包含HSC之組織獲得，該包含HSC之組織如，但不限於臍帶血、骨髓、GM-CSF動員周邊血液及胎兒肝臟。
視需要地，投予至基因改造的免疫缺陷動物之造血幹細胞可在投予以擴增細胞族群之前以體外培養細胞獲得，該細胞族群得自包含HSC之一個或多個組織如，但不限於臍帶血、骨髓、GM-CSF動員周邊血液及胎兒肝臟。
HSC可透過不同的途徑的投予而投予至新生動物，該途徑如，但不限於，投予至心臟(心內注射)、肝臟(肝內注射)及/或面靜脈。HSC可透過不同的途徑投予至成年動物，該途徑如，但不限於投予至尾靜脈、股骨骨髓腔或脾臟。在進一步的具體例中，HSC如同胎兒肝臟及/或胎兒胸腺可植入腎囊(例如，在BLT小鼠內為1mm3立方組織)。
視需要地，HSC投予至條件動物。製備接受HSC之接受者動物的條件係實施去除或抑制HSC以及在接受異種的HSC之前的接受者動物內生的先驅細胞。
接受者動物之條件包括投予輻射及/或一種或多種化學藥劑，其可有效去除或抑制HSC以及在接受異種的HSC之前的接受者動物內生的先驅細胞。硫酸布他卡因係可有效去除或抑制HSC以及在接受異種的HSC之前的接受者動物內生的先驅細胞之化學藥劑的著名例子。透過輻射及/或可有效去除或抑制HSC以及在接受異種的HSC之前的接受者動物內生的先驅細胞之化學藥劑的條件可依據眾所周知的議定書來實施，以製造條件動物。
異種的HSC之植入可藉由各種方法，諸如，但不限於，流式細胞儀分析動物內之細胞來評鑑，其中在一個或多個時間點投予異種的HSC後投予HSC。
單離異種的HSC、將異種的HSC投予至宿主有機體，以及評鑑其植入之方法等例示性方法敘述於本文以及T.Pearson et al.,Curr.Protoc.Immunol., 81：15.21.1-15.21.21,2008；Ito et al.,Blood,100：3175-3182,2002；Traggiai et al.,Science,304：104-107,2004；Ishikawa et al.,Blood,106：1565-1573,2005；Shultz et al.,J.Immunol.174：6477-6489,2005；Holyoake et al.,Exp Hematol.,27(9)：1418-1427,1999中，並以全文引用之方式併入。
投予的HSC係從原始來源材料中單離以獲得富含HSC之細胞族群。經單離的HSC可能係純的，也可能係不純的。
在某些具體例中，HSC係藉由篩選諸如CD34之細胞標識物來純化。
在某些具體例中，投予的人類HSC係人類細胞之族群，其中CD34+細胞佔總細胞量約1-100%，儘管可使用CD34+細胞少於總細胞1%之人類細胞之族群。在某些具體例中，投予的人類HSC係經去除T細胞之臍帶血細胞，其中CD34+細胞佔總細胞約1-3%、去除係別細胞之臍帶血細胞，其中CD34+細胞佔總細胞約50%，或CD34+正向篩選細胞，其中CD34+細胞佔總細胞約90%。
在免疫缺陷之小鼠內，投予HSC之數量並不受限於異種的免疫系統之世代。單個HSC即可產生免疫系統之細胞。因此，當接受者為小鼠時，雖然可使用更多的細胞，但是一般投予HSC之數量的範圍為1-10×106個HSC。針對其他物種，倘若僅使用常規的實驗，該細胞數量可做調整。
一般而言，在較大的CD34+族群中，HSC係 以CD34+細胞之亞族群存在。因此，投予取自於包含HSC之任何組織，諸如，但不限於臍帶血、骨髓、GM-CSF動員周邊血液及胎兒肝臟之CD34+細胞之族群，以將HSC亞族群傳遞至欲植入的接受者動物。投予取自於包含HSC之任何組織，諸如，但不限於臍帶血、骨髓、GM-CSF動員周邊血液及胎兒肝臟以將HSC亞族群傳遞至欲植入的接受者動物之CD34+細胞之數量並不限定，且該CD34+細胞可介於1個細胞至10億個細胞之範圍內，諸如1個細胞至5億個細胞、1個細胞至1億個細胞、1個細胞至1千萬個細胞、1個細胞至5百萬個細胞、1個細胞至1百萬個細胞、1個細胞至50萬個細胞、1個細胞至10萬個細胞、1個細胞至5萬個細胞、1個細胞至1萬個細胞、1個細胞至1千個細胞。再者，投予CD34+細胞之數量係介於100個細胞至1千萬個細胞、100個細胞至5百萬個細胞、100個細胞至1百萬個細胞、100個細胞至50萬個細胞、100個細胞至10萬個細胞、100個細胞至5萬個細胞、100個細胞至1萬個細胞或100個細胞至1千個細胞之範圍內。更進一步，投予CD34+細胞之數量係介於1000個細胞至1千萬個細胞、1000個細胞至5百萬個細胞、1000個細胞至1百萬個細胞、1000個細胞至50萬個細胞、1000個細胞至10萬個細胞、100個細胞至5萬個細胞或1000個細胞至1萬個細胞之範圍內。
當大部分任何投予之非HSC細胞發生變性時，在接受者動物內，於某次可偵測到異種的HSC及分化 自HSC之細胞，表示植入係成功的。成功植入人類HSC之標記係多系別人類免疫細胞分化且回歸至骨髓、胸腺、脾臟，及PBL等等。NSG小鼠可進行多系別植入且免疫細胞可回歸至幾乎所有合適的器官及組織。在hu-CD34 NSG小鼠內所偵測之人類免疫細胞族群之完整範圍總結於Ishikawa et al.(Blood,106(5)：1565-1573,2005)及Tanaka et al.(J.Immunol.,188(12)：6145-6155,2012)中。
偵測分化的HSC細胞可藉由偵測接受者動物內之異種DNA或偵測完整的異種HSC及分化自HSC之細胞而達成。CD34+細胞連續轉移至次要接受者以及異種的造血系統，係在主要接受者內之HSC植入的進一步測試。在投予HSC後10至12週，血液內含有0.05%或更多的異種CD45+細胞時，可藉由流式細胞儀來偵測植入。
依據本發明之態樣提供包括在免疫缺陷動物內，將異種的幹細胞因子(SCF)傳遞至異種的造血幹細胞之方法。SCF可急性地或慢性地傳遞至動物。依據本發明之態樣，免疫缺陷之非人類動物可進一步包括可操作地連接於啟動子之編碼異種SCF的轉基因。更進一步地選擇，表現異種SCF的動物在投予異種的幹細胞之前，動物並未藉由投予類放射性藥劑而條件化。
依據本發明之態樣，識別免疫系統反應之調節子的方法包括提供非人類基因改造之免疫缺陷動物；將異種的造血幹細胞投予至該非人類基因改造之免疫缺陷動物，其中該異種的造血幹細胞在非人類基因改造之免疫 缺陷動物內分化以製造異種的免疫細胞；將免疫系統激活劑投予至動物；投予測試化合物至動物；分析異種的免疫細胞對免疫系統激活劑之回應；以及比較對標準品之回應，以判定測試化合物在異種的免疫細胞對激活劑之回應的功效，其中測試物質之功效識別了動物內異種的免疫系統之調節子。
使用於本發明之方法中的測試化合物可為任何的化學個體，示例性地包括合成的或自然發生的化合物或合成的或自然發生的化合物之組合、有機的或無機的小分子、蛋白質、胜肽、核酸、碳水化合物、寡醣、脂質或這些任何的組合。
本文所使用之樣本可為從非人類動物所獲得之樣本，示例性地包括脾臟、骨髓、血液、血漿及血清。
視需要地，分析免疫系統之特定的細胞族群，諸如樹突細胞、漿細胞樣樹突細胞、骨髓的樹突細胞、肥大細胞、單核白血球/巨噬細胞、自然殺手細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性白血球及嗜酸性白血球、T淋巴細胞(CD3+CD4+或CD3+CD8+T細胞)、B細胞(例如，CD19+B細胞)。
本發明提供具有經植入人類免疫系統之基因改造的免疫缺陷之非人類動物之經單離的骨髓細胞。
本發明提供基因改造的免疫缺陷之非人類動物之經單離的細胞。可於活體外培養該單離的細胞以用於各種分析。舉例而言，該經單離的細胞在評估測試物質以判定測試物質之活性的分析中，有用於作為對照組。另 一個例子，該經單離的骨髓細胞有用於在免疫系統之活性上，判定測試物質之活性。
免疫分析方法可用於分析樣本內之免疫細胞回應之標靶分析物或指示物，包括，但不限於，酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素連結免疫過濾分析法(ELIFA)、流式細胞儀、免疫墨點法、免疫沈澱法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法、發光免疫分析法(LIA)、螢光免疫分析法(FIA)，以及放射免疫分析法。分析方法可用於獲得定性及/或定量結果。樣本之定性及定量之詳細具體的合適分析方法敘述於標準參考文獻中，例示性地包括E.Harlow and D.Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；F.Breitling and S.Dubel,Recombinant Antibodies,John Wiley & Sons,New York,1999；H.Zola,Monoclonal Antibodies：Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives,Basics：From Background to Bench,BIOS Scientific Publishers,2000；B.K.C.Lo,Antibody Engineering：Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2003；F.M.Ausubel et al.,Eds.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,Wiley,2002；S.Klussman,Ed.,The Aptamer Handbook：Functional Oligonucleotides and Their Applications,Wiley,2006；Ormerod,M.G.,Flow Cytometry：A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Givan,A.L.,Flow Cytometry： First Principles,Wiley,New York,2001；Gorczyca,W.,Flow Cytometry in Neoplastic Hematology：Morphologic-Immunophenotypic Correlation,Taylor & Francis,2006；Crowther,J.R.,The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology),Humana Press,2000；Wild,D.,The Immunoassay Handbook,3rd Edition,Elsevier Science,2005；以及J.Sambrook and D.W.Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd Ed.,2001。
抗體及製備抗體之方法為本領域眾所周知的。如本文中所使用，術語「抗體」包含單株抗體、多株抗體、雙專一性抗體、多專一性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、駱駝化抗體、單域抗體、單鏈Fvs(scFv)抗體、單鏈抗體、雙硫鍵連接之Fvs(sdFv)，以及抗獨特性(anti-Id)抗體及任何以上所述之抗原結合片段。特別地，抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球球蛋白分子之免疫活性片段，即，包含抗原結合位置之分子。免疫球蛋白分子具有不同的形態，(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，或亞類。
如本文中所使用，術語「抗體片段」及「抗體結合片段」界定免疫專一性地結合至標靶分析物之抗體之片段。抗體片段可由所屬技術領域者習知之任何技術製備而成。舉例而言，Fab及F(ab’)2片段可藉由免疫球蛋白分子之蛋白酶切割製備而成，所使用之酵素諸如木瓜酵素 (以製備Fab片段)或胃蛋白酶(以製備(Fab’)2段)。抗體片段亦藉由重組DNA技術製備而成。
抗體、抗原結合片段、其生成方法以及篩選所生成之抗體，以實質地專一結合至抗原之方法係本領域所周知的，且已更詳細地敘述該抗體、抗原結合片段以及方法，例如，Antibody Engineering,Kontermann,R.and Dubel,S.(Eds.),Springer,2001；Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；F.Breitling and S.Dubel,Recombinant Antibodies,John Wiley & Sons,New York,1999；H.Zola,Monoclonal Antibodies：Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives,Basics：From Background to Bench,BIOS Scientific Publishers,2000；Ausubel,F.et al.,(Eds.),Short Protocols in Molecular Biology,Wiley,2002；J.D.Pound(Ed.)Immunochemical Protocols,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2nd ed.,1998；B.K.C.Lo(Ed.),Antibody Engineering：Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Humana Press,2003；及Kohler,G.and Milstein,C.,Nature,256：495-497(1975)。針對標靶分析物之抗體，諸如類鐸受體4或先天性免疫細胞回應之指示物，可於動物內製造、合成的、藉由重組方法製造及/或從商業上獲得。
偵測樣本內所存在之標靶分析物與結合配偶體之間的結合，係透過本領域所周知的任何各種方法而 實現的，例示性地包括偵測直接地或間接地連接至標靶分析物或結合配偶體之可偵測標記。術語「可偵測標記」意謂可藉由合適之方法，例示性地包括光譜、光學、光化學、生物化學、酵素、電子及/或免疫化學，而能夠製造可偵測標記之存在之信號指示的物質。可偵測標記之例子，例示性地包括螢光部分、化學發光部分、生物發光部分，以及電子緻密顆粒、磁性顆粒、酵素、受質、放射性同位素及發光團。
識別所使用之特定的可偵測標記或標記係取決於所使用的測定方法。該測定方法併入特定的分析形式，例示性地包括ELISA、西方墨漬法、免疫沈澱法、免疫細胞化學法、免疫螢光分析、液相色譜法、流式細胞儀、其他本領域周知之測定方法，或其組合。
結合實驗可包括將結合配偶體連接至載體。在結合實驗中使用連接有結合配偶體之載體可為固體或半固體，且可為任何各種物質，諸如玻璃、矽、紙、合成的或自然發生的聚合物，諸如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、尼龍、纖維素、瓊脂醣、葡萄糖，及聚丙烯醯胺或可使結合配偶體可穩定地連接以使用於連接實驗之任何其他物質。
使用之支持體可包括用以與結合配偶體相結合之官能基團，諸如，但不限於羧基、胺基、胺基、羧酸鹽、鹵化物、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環氧及/或甲苯磺醯基官能團。將結合配偶體連接至 支持體係透過任何的各種方法而實現，例示性地包括吸附作用及化學鍵結。在一實例中，1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、EDC或EDAC化學，可用於將結合配偶體附接至顆粒。結合配偶體可直接地或間接地鍵結至支持體之物質，舉例而言，透過鍵結至經設置於支持體的塗層或連結子。官能基團、其修飾及結合配偶體附接至支持體係本領域所所周知，例如，敘述於Fitch,R.M.,Polymer Colloids：A Comprehensive Introduction,Academic Press,1997。
該支持體可為任何形式及形狀，包括，但不限於微孔板、微量滴定孔、樞、纖維、珠粒、載片、矽晶片及膜諸如硝化纖維或PVDF膜。
任何各種光譜方法可使用於分析標靶分析物，諸如類鐸受體4或先天性免疫細胞回應之指示物，依據本發明之態樣，包括，但不限於氣相層析法、液相層析法、離子移動率光譜法、質譜法、液相層析質譜法(LC-MS或HPLC-MS)、離子移動率光譜-質譜法、串聯質譜法、氣相層析-質譜法、基質輔助脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜法、表面增強雷射脫附游離(SELDI)及核磁共振光譜，其皆為本領域技術人員所周知。
視需要地，光譜分析係用於分析標靶分析物之樣本，諸如類鐸受體4或先天性免疫細胞回應之指示物。質譜分析可用於依據本領域之態樣之分析。例如，質譜分析使用於飛行時間(TOF)質譜或傅裏葉變換離子迴旋 共振質譜。質譜技術為本領域所熟知且蛋白質及/或胜肽分析之方法例示性地詳細敘述可見於Li J.,et al.,Clin Chem.,48(8)：1296-1304,2002；Hortin,G.L.,Clinical Chemistry,52：1223-1237,2006；A.L.Burlingame,et al.(Eds.),Mass Spectrometry in Biology and Medicine,Humana Press,2000；and D.M.Desiderio,Mass Spectrometry of Peptides,CRC Press,1990。
3.帶人源化瘤之NSG小鼠
傑克孫實驗室NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 /SzJ,Stock No.005557)亦常稱為NOD scid加瑪；NSG；NOD-scid IL2Rgammanull，以及NOD-scid IL2Rgnull。它們結合了NOD/ShiLtJ背景(傑克孫實驗室庫存編號：001976)、嚴重的複合式免疫缺陷突變(scid)，及IL2受體加瑪鏈缺陷之特徵。其結果為，缺乏成熟T細胞、B細胞(因此無法產生小鼠抗體)，以及功能性NK細胞之NSG小鼠，欠缺補體系統且缺乏細胞激素之訊息傳遞，導致相較於其他已發表的小鼠品系能夠更佳地植入人類造血幹細胞(HSC)及周邊血液單核細胞(PBMC)。NSG小鼠亦具有缺陷的巨噬細胞及樹突細胞。最近的發表已證實該品系使用於胰島細胞移植、造血幹細胞及癌症幹細胞之研究係重要的。
具體地，NSG小鼠既不表現Prkdc基因，也不表現X-聯結的I12rg基因。NSG小鼠係活的、有生殖能力的、正常大小且不顯現任何嚴重的身體或行為異常。淋巴組織之組織學檢驗顯示不存在淋巴細胞及胸腺內之一些 囊腫結構、脾臟內不存在濾胞且淋巴結之細胞結構明顯地縮小。NSG小鼠缺乏成熟的T及B淋巴細胞，無法偵測血清Ig且自然殺手(NK)細胞之細胞毒活性非常地低。這些小鼠即使經由亞致死的的輻射線照射後，仍可抵抗淋巴瘤發育。其顯示了這些突變的小鼠可支持人類CD34+造血幹細胞的植入，且為優越的、長壽的(中位生存期為超過89週)模式以適合於採用異種移植策略之研究。
NSG小鼠攜帶有真正無效的介白素-2受體加瑪鏈突變，而非其他表現截斷的介白素-2受體加瑪鏈織品系(參見Ohbo et al.,Blood,87：956-967,1996)。公益研究機構在材料移轉契約(MTA)下可取得NSG小鼠，且在與NIH合約下，傑克孫實驗室會分配NSG小鼠。
為建立對象人源化NSG小鼠(HU-NSGTM)，藉由例如，尾靜脈注射、心內注射，或肝內注射，將諸如人類CD34+ HSC之造血幹細胞導入傑克孫實驗室NSG小鼠。HSC可導入約2、3，或4週齡之HSG小鼠。通常，25-量規針可用於尾靜脈注射。接種物中之細胞剪切潛在增加時，也可使用較小的量規針。
傳遞HSC之替代位置包括眼後的靜脈竇、骨髓腔本身，及脾臟。注射入眼後竇較易實施，但相較於尾靜脈注射具有較大的侵入性，且需將接受者小鼠進行麻醉。幹細胞回歸至骨髓係依賴諸如基質衍生因子1及將幹細胞從周邊血液引導至骨髓腔之幹細胞因子之分子。因此，將幹細胞傳遞至血液循環(或原位地至骨髓)增加了細 胞滯留於新宿主之骨髓的可能性。
視需要地，在導入HSC之前，NSG小鼠曝露於總體或全身輻射(TBI)，以進行骨髓淨除，其可藉由將NSG小鼠置於專門設計之輻照器內而實施，總體加瑪輻射的劑量係經設計為引起動物成為短暫或長期之免疫抑制。
在NSG小鼠的人類免疫系統的成功生存可能需要以某些方法來抑制宿主之免疫系統，以避免HVG(宿主對抗植入物)排斥。除了抑制宿主免疫系統之外，輻射照射亦有助於消損宿主前驅細胞之骨髓微環境，從而允許捐贈者幹細胞的植入空間。針對NSG小鼠，該製備通常係經由總體加瑪輻射而完成。輻照器依使用需求可有各種尺寸。小的輻照器(例如，來自於JL Shepherd and Associates,San Fernando,CA之Mark-I irradiator)之大小如同冰箱，且通常使用於輻射細胞及小數量的小鼠兩者。相反地，常用之較大的(6600 lb)加瑪輻照器(Gammacell-40,MDS Nordion,Ottawa,ON)可用於一次輻射數打小鼠。動物通常進行短時間輻射(少於15分鐘)。輻照器內之耗時量依放射性同位素衰變圖、所需之輻射量，以及游離能量(其為X射線相對於加瑪射線，即需要銫及鈷)之來源而不同。若有需要也可使用更大的輻照器，諸如Clinac 4/80直線加速器(Varian Medical Systems,Palo Alto,CA)。一般而言，輻射線小鼠並不需要進行麻醉。
通常骨髓淨除之輻射劑量係700至1300cGy，雖然在一些具體例中，可使用諸如1-100cGy(例如， 2、5，或10cGy)，或300至700cGy之較低的劑量。其可微銫或X射線輻射。
在某些具體例中，雌性NSG小鼠係手術植入人類胸腺及肝片段並注入捐贈者-配對的人類CD34+造血幹細胞(人源化BLT NSG小鼠)。該人源化BLT NSG小鼠(hu-BLT)在任何目前的人源化小鼠模式中，具有最強功能性的免疫系統，並提供明顯的優點以及改良特定研究之實施，諸如以黏膜為基礎之免疫回應。
在某些具體例中，可使用NSGS或傑克孫實驗室庫存編號為013062之NSG-SGM3小鼠(俗稱為NOD-scid IL2Rgnull-3/GM/SF之NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ)來取代NSG小鼠以進行人源化。其為結合免疫缺陷環境與支持人類骨髓細胞擴增之數個轉殖人類細胞激素之多等位基因小鼠品系，且為收容異種移植物之特別有用的模式。特別地，這些小鼠包含由人類巨細胞病毒啟動子/加強子序列所驅動之人類介白素-3(IL-3)、人類顆粒細胞/巨噬細胞-刺激因子(GM-CSF)，及人類steel因子(SF)基因之三個轉基因。這些小鼠保留了NSG(NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 /SzJ)小鼠背景，且持續性地製造人類IL-3、GM-CSF及SF之2至4ng/mL血清濃度。I12rg-/-專一的NOD.SCID背景支持人類及鼠類之造血幹細胞植入，且在移植人類骨髓或胎兒肝細胞之後，在小鼠抑制人類紅血球生成、增強人類骨髓形成，且降低人類B淋巴細胞形成。
在某些具體例中，小鼠經植入人類周邊血液單核細胞，例如hu-PBMC NSGTM小鼠(或PBMC人源化小鼠)。
為了簡單化起見，在某些具體例中，各種NSG或NSG衍生的小鼠品系統稱為NSG小鼠。
在某些具體例中，於小鼠約3週齡時，導入人類CD34+ HSC於NSG小鼠(或NSGS小鼠，或BLT-NSG小鼠)內，而成熟的人類B細胞出現在約第12週，且成熟的人類T細胞出現在約第15週。
在某些具體例中，植入人類CD34+之NSG小鼠(或NSGS小鼠，或BLT-NSG小鼠)在植入HSC之後約12週，在小鼠之周邊血液內含有至少約20%、25%、30%或更多人類CD45+細胞。
為了創造帶有病患衍生之異種移植物(PDX)之對象人源化NSG小鼠(或NSGS小鼠，或BLT-NSG小鼠)，將適量的病患衍生之細胞，諸如1-10×106人類癌細胞注入重新充填人類CD34+ HSC之NSG小鼠(或NSGS小鼠，或BLT-NSG小鼠)。來自人類之癌細胞可藉由Ki67染色來確認。在某些具體例中，在植入HSC後約2週，將PDX導入小鼠。在某些具體例中，在植入HSC後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15週，將PDX導入小鼠。在某些具體例中，在植入人類免疫細胞(例如，人類B或T細胞或NK細胞)出現之前，將PDX導入小鼠。
在某些具體例中，PDX之HLA類型與捐贈 者人類HSC之HLA類型不配對。
[實施例]
本說明書內所敘述之任何專利或文獻以引用之方式併入本文中，其全文如同將各文獻特別地且個別地以引用之方式併入。
如本文中所敘述之本發明之非人類動物(例如，小鼠)、組合物，及方法係以某些說明性的具體例、例示性的具體例呈現，並不意欲限制本發明之範圍。本領域技術人員可將其改變並做其他使用。該改變及其他使用並不脫離如申請專利範圍所描述之範圍。
實施例1：小鼠
NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1 Wj1 /SzJ(NOD-scid IL2r γnull,NSG)小鼠係從傑克孫實驗室(Bar Harbor,ME)所發育並保存之群體而獲得。所有的動物收容於特殊無病菌之設施內、隔離飼育籠內，並給予滅菌之食物及持續給予磺胺甲噁唑-曲美普林藥水(Goldline Laboratories,Ft.Lauderdale,Fla.)以及隔週給予酸化的滅菌水。
實施例2：以人類造血幹細胞(HSC)植入小鼠
如同敘述於Pearson at al.(Curr.Protoc.Immunol.81：15.21.1-15.21.21,2008)，將24至72小時大(新生)之NSG小鼠之組別，以100cGy輻射線照射。如同敘述於Brehm et al.(Clinic.Immunol.135(1)：84-98,2010)，經由心內注射，將體積為25-50μl之包含3×104CD34+造血幹細胞(HSC)之 去除CD3 T細胞的人類臍帶血(UCB)注射入經輻照之小鼠。12週後，利用HSC接受者之血液之流式細胞分析，量化人類免疫系統之植入。對於實驗研究，僅使用>20%之周邊人類CD45+細胞以及>5%之人類CD3+T細胞。
類似地，如同敘述於Brehm et al.(Clinic.Immunol.,135(1)：84-98,2010)，亞致死劑量照射之新生NSG小鼠也可經由肝內注射或透過臉靜脈注射注入包含3×104 CD34+造血幹細胞(HSC)之去除CD3 T細胞的人類臍帶血(UCB)。
此外，組別為約3週齡之NSG小鼠，在經由利用標準技術進行側尾靜脈注射0.2-1×106 CD34+HSC之前，可利用約200至1300cGy之劑量進行總體亞致死輻照。例如，每隻動物在注射之前先秤重，且每次注射可投予高達約動物體重1%的體積。注射之前，溫熱動物約5至10分鐘(例如，在市售的增溫箱內，或架空熱燈下，或在動物籠的下方置放循環墊)以使靜脈膨脹。之後輕微麻醉的動物置於可充電熱包或循環溫水墊上，以使動物在麻醉過程中保暖。之後，將小的量規針(28-30)朝向動物頭部方向，使針尖向下並插入靜脈，並嘗試使針及注射器與尾巴平行。針必須平順地推入靜脈。注射之後，將動物置於籠內並觀察5至10分鐘，以確定不再流血。
對於BLT(骨髓/肝/胸腺)小鼠模式，約1mm3立方體之胎兒肝臟及胎兒胸腺，如同類器官植入先前已進行總體輻照約200cGy之宿主NSG小鼠內。之後利用標準 技術，將約0.2-1×106 CD34+HSC注入側尾靜脈內。BLT小鼠模式為包括多樣的造血系別之穩健與一致的異種移植物(例如，人類)免疫系統發育，展現持續的、高濃度之T細胞發育；且T細胞由自體的胸腺組織所馴化。該小鼠模式典型地具有對病毒感染(例如，EBV及HIV)之可偵測的T及B細胞回應。
在任何合適的人源化小鼠模式中，在該人源化NSG小鼠內，在特定的時間點上，諸如於人類CD34+細胞注射後2或12週，接種病患衍生的異種移植物(PDX)或癌細胞品系。使異種移植物生長，例如約7週，並頻繁地(例如，每週兩次)監控體重及腫瘤體積。
可於研究最後收集小鼠之周邊血液，以分析人類CD45+捐贈者細胞移植之程度。較佳地，在周邊血液內，人類CD45+捐贈者細胞必須達到至少20-30%。
實施例3：預期的PDX生長速率無需HLA型配對之概述
實施NSG小鼠之人源化實質上與上述實例2相同。簡要地，在經由利用標準技術進行側尾靜脈注射約0.2-1×106 CD34+HSC之前，將約3週齡之NSG小鼠之組別進行總體輻射線照射(約200cGy)。將使用三種不同的癌樣本(乳癌細胞BR0620、肺癌細胞LG1208，及膀胱癌細胞BL0440)之PDX異種移植物與衍生自HLA不配對人類HSC捐贈者之已建立的且功能性地成熟人類免疫細胞，皮下植入於對象人源化NSG小鼠模式，即，hu-CD34 NSG小鼠，在PDX 移植後多至約55天，監控PDX移植之生長。三種腫瘤皆強勁的生長且並未觀察到排斥現象(第1圖)。
結果顯示，在對象人源化NSG小鼠模式中，預期的PDX生長速率並不需要HLA行配對。
實施例4：在Hu-CD34 NSG TM 小鼠之PDX植入的短暫評估
為了評估在非HLA配對的人源化hCD34+ NSG小鼠中PDX異種移植物腫瘤生長之短暫功效，實質上依據如上述實例2及3之敘述，在將非HLA配對的人類CD34+細胞注入NSG小鼠後2或12週，接種約×106個人類SKOV3卵巢癌細胞。使異種移植物生長約7週，並於每週兩次監控體重及腫瘤體積。於研究最後收集小鼠之周邊血液，以分析人類CD45+捐贈者細胞移植之程度。各組別含有7隻小鼠，且兩組別(2週相對於12週)之平均結果顯示於第2圖。
在植入後2週，尚未發展出人類免疫性。確實，需要至少12週方能在hu-CD34 NSG小鼠之PBL內偵測到成熟的人類T及B細胞。然而，在腫瘤植入之研究中，在兩組別中(二組皆N=7)皆100%生成腫瘤，且在2週組別中，腫瘤體積會隨著時間的增加而增加，且些微地超越12週組別(第2圖)。
結果顯示在兩組的小鼠之間並未有明顯的差異，其暗示了與人源化相關之癌細胞品系植入之時間點，對於SKOV3卵巢癌細胞之生長並不會產生顯著的(任何)影響。
在接種癌細胞後50天，測試小鼠中之人類造血嵌合體，且皆在PBL顯示25-50% huCD45+細胞，意味成功的植入(第3圖)。結果顯示在非HLA配對的人源化NSG PDX模式中，癌細胞品系植入之時間點，對於CD45+細胞族群無顯著的(任何)影響。
實施例5：人源化對於PDX生長動力學無顯著影響
在以上實驗中未提出之重要的問題為當與正常、非人源化NSG小鼠之腫瘤生長速率相比較時，人類免疫細胞存在是否影響腫瘤生長速率。
為測定是否在NSG小鼠模式中之人源化對於非HLA配對的PDX的生長動力學是否具有顯著影響，使用如同上述之實質上相同的方法，將三個新鮮的PDX腫瘤樣本：乳癌BR0744(第4A圖)、肺癌LG0977(第4B圖)，及軟組織惡性肉瘤SA0209(第4C圖)個別地平行植入NSG小鼠模式，或huCD34-人源化NSG小鼠模式，測量PDX生長曲線並依其作圖。
在NSG及人源化NSG模式中，三種腫瘤之生成率皆為100%，且腫瘤在各植入的宿主中發育。在NSG對抗hu-CD34 NSG接受者中，僅僅乳癌腫瘤之生長稍微快速(第4A圖)；其他兩個腫瘤在兩種宿主中之生長速率相同(第4B及4C圖)。但整體而言，在NSG相對hNSG模式中之PDX腫瘤在移植實驗期間後的整個40至70天，其腫瘤生長曲線並未有明顯的差異。
在所有的hNSG實驗組別中，周邊血液內之hCD45+細胞超過20%，其意味人源化係成功的。參見第5A-5C圖，其顯示在非人源化NSG小鼠並未觀察到hCD45+細胞。
於腫瘤生長研究最後，收集腫瘤並利用流式細胞儀分析TIL的存在。可偵測到包含人類CD4+及CD8+T細胞以及少量的CD19+B細胞之所有三種腫瘤(第6A-6C圖)。不欲受限於任何特定的理論，在hu-CD34 NSG接受體內，TIL減緩腫瘤生長之失效顯示了辨識腫瘤之T細胞可能變成無活動力。
整體地，這些結果證實了hu-CD34 NSG小鼠支持非HLA配對的腫瘤的生長，且人類免疫細胞之存在並不會顯著的影響腫瘤生成或生長速率。
實施例6：Hu-CD34 NSG TM PDX小鼠為評估藥物之藥效之功能性平台
如以上所證實，人源化NSG小鼠支持非HLA配對的人類腫瘤之能力，在臨床前測試平台之發展上為重要的發現。
為了測試具有非HLA配對的PDX之對象Hu-CD34 NSGTM小鼠是否可用於評估對抗PDX之藥物功效，使用臨床相關的標準護理(SOC)治療，並取得超過21天的腫瘤生長曲線以作為陰性對照/載體組，且分別利用5-FU及癌思停作為治療大腸癌CN1572P5 PDX之治療劑組別。具體而言，透過靜脈注射，利用約20mg/kg體重之劑 量，以Q7d×2(每7天，共兩劑量)劑量投予5-FU。透過腹腔注射，利用約10mg/kg體重之劑量，以一週兩次，共5劑量投予癌思停。載體(D5W)則係透過靜脈注射，投予Q7d×3。
第7A及7B圖之結果顯示在對象人源化NSG模式中，5-FU及癌思停皆可有效的對抗非HLA配對的大腸癌PDX。其證實對象非HLA配對的Hu-CD34 NSG PDX模式為評估臨床相關的標準護理(SOC)藥物之藥效的功能性平台。
實施例7：在Hu-CD34 NSG TM 之吉舒達及順鉑抑制PD-L1 + MDA-MB-231乳癌腫瘤模式之生長
程序性細胞死亡蛋白質1(亦稱為PD-1及CD279)，係人類中由PDCD1基因所編碼的蛋白質。PD-1係屬於免疫球蛋白(Ig)超家族中的CD28家族之免疫抑制細胞表面受體，且表現於T細胞、前-B細胞、單核細胞、自然殺手細胞，以及許多腫瘤-浸潤淋巴細胞(TIL)。其為抑制T細胞回應之重要的免疫「檢查點」受體，且在調控T細胞功能上扮演關鍵性的角色。PD-1與兩個配體PD-L1及PD-L2結合，已於腫瘤細胞發現該兩配體，且腫瘤細胞利用該兩配體以將PD-1受體接合於經活化T細胞，以抑制經活化T細胞之功能，從而逃脫對抗腫瘤細胞之免疫回應。因此，PD-1及其配體在藉由避免T細胞的活化而向下調控免疫系統中扮演重要的角色，其反過來向下調控對抗腫瘤的免疫回應，卻也降低了自體免疫性並提升自我耐受性。PD-1之 抑制功效被認為是在降低調節性T細胞(抑制因子T細胞)之細胞凋亡的同時，透過在淋巴結促進抗原專一性T細胞之細胞凋亡(程序性細胞死亡)之雙機制而完成。
PD-1抑制子為阻斷PD-1之藥物的新種類，其活化免疫系統以攻擊腫瘤，進而有效用於治療癌症。例如，對抗PD-1之單株抗體可推進免疫系統，因此有效用於治療癌症。此外，許多腫瘤細胞表現免疫抑制PD-1配體PD-L1。因此，在活體外抑制PD-1及PD-L1之間的交互作用，可增強T細胞回應，並調控臨床前的抗腫瘤活性。
在含有總共296個病患之臨床試驗中，納武單抗(Opdivo-Bristol Myers Squibb)之抗PD-1抗體藥物，在非小細胞肺癌、黑色素細胞瘤，以及腎性細胞癌中，產生完整的或部分的回應。納武單抗亦靶向PD-1受體，且在2014年7月被日本以及在2014年12月被美國FDA證實其可治療轉移的黑色素細胞瘤。
另一個抗PD-1抗體藥物，派姆單抗(吉舒達，MK-3475,Merck)靶向PD-1受體，且在2014年9月被FDA證實其可治療轉移的黑色素細胞瘤。在2015年3月於英國，晚期黑色素細胞瘤病患可透過UK Early Access to Medicines Scheme(EAMS)而取得派姆單抗。目前在美國其亦使用於肺癌及中皮瘤之臨床試驗。
靶向PD-1受體之其他早期開發藥物包括皮地利珠單抗(CT-011,Cure Tech)、BMS 936559(Bristol Myers Squibb)，以及MPDL328OA(Roche)。
另一方面，順鉑係目前包含鉑之抗癌化療藥物之種類的最早成員，包含鉑之抗癌化療藥物亦包括卡鉑及益樂鉑。這些鉑複合物在活體內反應，結合至DNA並引起DNA交聯，最後啟動細胞凋亡(程序性細胞死亡)。
為了測試植入的PDX腫瘤是否亦會對臨床相關的免疫臨床癌症檢查點抑制子回應，或是否該檢查點抑制子可在常駐型人類免疫細胞內再次活化抗腫瘤回應，設計一係列的實驗並執行以解決這些問題。
首先，為了測試是否檢查點抑制子派姆單抗(吉舒達)在受體非HLA配對的PDX人源化NSG小鼠模式內是有效的，依據本發明之方法建立PDX huNSG模式。具體地，透過皮下注射，每隻人源化NSG小鼠(在hNSG小鼠之周邊血液內，發現超過25%之人類CD45+細胞，其證實成功的植入huCD34)內植入5×106個非HLA配對的PD-L1陽性乳癌細胞株MDA-MB-231細胞，並接種基質膠。這些細胞株在腫瘤細胞表面上，會表現非常大量可結合至T細胞上之PD-1的PD-L1，並誘導免疫能力缺失-約有94.3% MDA-MB-231細胞表現的PD-L1。之後以載體、順鉑，或派姆單抗(Pembrolizumab)(吉舒達)處理腫瘤植入的人源化NSG小鼠。
獲得陰性對照/載體組別，以及分別利用順鉑及派姆單抗(吉舒達)對抗MDA-MB-231 PDX之兩個治療組別之超過21天的腫瘤生長曲線。具體地，以約2mg/kg體重之劑量，Q7d×2(每7天，總共2劑量)，經由靜脈注 射投予順鉑。以約5至10mg/kg體重之劑量，Q5d×4(每5天，總共4劑量)，經由腹腔注射投予派姆單抗(吉舒達)。以Q5d×4經由腹腔注射投予載體(鹽水)。
順鉑係在快速分裂的細胞中引起DNA交聯及細胞凋亡之包含鉑之化療藥物。在人源化小鼠中，順鉑治療僅些微的降低MDA-MB-231腫瘤之生長速率。相反的，在開始處理後的兩週內吉舒達會顯著地延遲腫瘤生長(第8A及8B圖)。
在生長研究終止時，收集實驗小鼠之周邊血液，並分析人類CD19+ B細胞及人類CD4+及CD8+ T細胞。第9A-9D圖顯示包括兩者CD3+CD4+及CD3+CD8+ T細胞之人類T細胞，以及CD19+ B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的MDA-MB-231 PDX小鼠之周邊血液。
收集腫瘤並分析人類CD4+及CD8+浸潤的T細胞。第10A至10C圖顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+ T細胞二者)呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的MDA-MB-231 PDX小鼠之腫瘤組織中。
因此，所有的三個治療組別皆顯示這些細胞的相似百分比而無關於治療。於吉舒達處理的腫瘤中不存在額外的TIL，顯示較慢的腫瘤生長係來自於再次活化常駐型TIL，而並非來自於從PBL或脾臟之其他的TIL浸潤刺激。
該數據證實對象非HLA配對的Hu-CD34 NSG PDX模式係評估藥物療效之功能性平台，其包括仰賴 植入的人類免疫細胞之功能之免疫調控藥物。
實施例8：在Hu-CD34 NSG TM 之吉舒達及順鉑抑制PD-L1 + TNBC BR1126乳癌腫瘤模式之生長
本實例實質上得到與實施例7相同之結果，其中非HLA配對的PD-L1陽性乳癌細胞株MDA-MB-231細胞以非HLA配對的PD-L1陽性乳癌細胞株BR1126細胞-三陰性乳癌(TNBC)細胞株取代。三陰性乳癌係具有有限的治療選項之侵襲性的乳腺癌亞型。已報導在TNBC病人中的PD-L1表現。當評估TIL中的PD-L1表現時，其與較高級別以及較大尺寸的腫瘤相關。腫瘤PD-L1表現亦與在TNBC中之T-調節性細胞之浸潤有關，該發現顯示PD-L1表現的腫瘤以及PD-1/PD-L1表現的TIL於TNBC中調控免疫回應所扮演的角色。
具體地，經由皮下接種，人源化NSG小鼠每隻鼠植入5×106個非HLA配對的PD-L1陽性乳癌細胞株BR1126細胞。其可在基質膠存在下完成。約56.9%之BR1126細胞表現PD-L1。在hNSG小鼠之周邊血液中發現超過25%的人類CD45+細胞。
獲得陰性對照/載體組別，以及分別利用順鉑及派姆單抗(吉舒達)對抗BR1126 PDX之兩個治療組別之超過21天的腫瘤生長曲線。具體地，以約2mg/kg體重之劑量，Q7d×3(每7天，總共3劑量)，經由靜脈注射投予順鉑。以約5-10mg/kg體重之劑量，Q5d×4(每5天，總共4劑量)，經由腹腔注射投予派姆單抗(吉舒達)。以Q5d×4 經由腹腔注射投予載體(鹽水)。
第11A及11B圖結果顯示相較於載體對照，在對象人源化NSG小鼠中對抗非HLA配對的PD-L1+乳癌PDX，順鉑及吉舒達兩者皆顯著地降低腫瘤生長。
第12A至12D圖進一步顯示包括CD3+CD4+及CD3+CD8+ T細胞兩者之人類T細胞，以及CD19+B細胞呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的BR1126 PDX小鼠之周邊血液中。
於研究最後收集來自經吉舒達處理的小鼠之腫瘤，並檢驗淋巴細胞浸潤。第13A-13D圖顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+ T細胞兩者)，以及CD19+B細胞皆呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的BR1126 PDX小鼠之腫瘤組織中。因此，如同在癌細胞株實驗中，腫瘤亦以人類CD4+及CD8+ T細胞，以及以人類B細胞浸潤，且相較於經載體處理之小鼠，以吉舒達處理並未增加腫瘤浸潤，再次顯示較慢的腫瘤生長係來自於再活化常駐型免疫效應細胞之結果。
第13E至13H圖進一步顯示人類T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+ T細胞兩者)，以及CD19+B細胞皆呈現於對象Hu-CD34 NSGTM非HLA配對的BR1126 PDX小鼠的脾臟中。
在類似的實驗中，對於CD45+CD8+浸潤T細胞的存在，在經僅化療、抗PD1藥劑吉舒達，以及抗CTLA4藥劑易普利單抗(ipilimumab)處理的PDX腫瘤樣本實施免 疫染色。第16圖顯示相較於僅化療，使用抗PD-1藥劑吉舒達，以及抗CTLA4藥劑易普利單抗處理，導致浸潤CD45+CD8+ T淋巴細胞的強力存在。
其再次的證實對象非HLA配對的Hu-CD34 NSG PDX模式為評估藥物藥效的功能性平台，包括可能仰賴植入的人類免疫細胞之免疫調控藥物。
實施例9：在Hu-CD34 NSG TM 之吉舒達+/-歐洲紫杉醇抑制PD-L1 + LG1306肺癌腫瘤模之生長
本實驗之實施係為了測試在人類CD34 NSG小鼠中之腫瘤的組合治療，是否相較於使用單一治療藥劑具有較好的效果。
本實例實質上與實例7及8得到相同的結果，其中非HLA配對的PD-L1陽性乳癌細胞株MDA-MB-231細胞或BR1126細胞以非HLA配對的PD-L1陽性肺癌細胞株LG1306細胞取代。
具體地，人源化NSG小鼠每隻鼠植入5×106個非HLA配對的PD-L1陽性PDX肺癌細胞株LG1306。約89.1%的LGB1306細胞表現PD-L1。在hNSG小鼠之周邊血液中發現超過20%的人類CD45+細胞。
獲得陰性對照/安慰組別，以及利用派姆單抗(吉舒達)搭配/或不搭配抗有絲分裂的化療藥劑歐洲紫杉醇，對抗LG1306 PDX之二處理組之24天的腫瘤生長曲線。具體地，以約10mg/kg體重之劑量，Q7d×4(每7天，總共4劑量)，經由靜脈注射投予歐洲紫杉醇。以約5mg/kg 體重之劑量，Q5d×6(每5天，總共6劑量)，經由腹腔注射投予派姆單抗(吉舒達)。以Q5d×6經由腹腔注射投予載體(鹽水)。
相較於來自經載體處理對照之腫瘤，來自僅以吉舒達處理之腫瘤顯示具有降低的生長，但是由於十分之一的小鼠並未對吉舒達回應，因此此回應為高度的變異。當吉舒達與歐洲紫杉醇組合使用時，腫瘤生長明顯地在處理後10天內受到抑制，且具有極少數之小鼠間(腫瘤間)的變異度。然而，將未對吉舒達回應之小鼠從統計中移除時，僅吉舒達與組合藥劑之間並未有差別。兩者皆顯示明顯的降低腫瘤生長且吉舒達組合歐洲紫杉醇並未觀察到加成效應。
因此，第14A及14B圖結果顯示在對象人源化NSG模式中，派姆單抗(吉舒達)搭配/或不搭配歐洲紫杉醇有效於對抗非HLA配對的PD-L1+乳癌PDX。
總結本文中所述之實驗，尤其實例6至9之實驗證實經植入人類腫瘤的hu-CD34 NSG小鼠可對標準護理化療回應。然而，更顯著的發現為如同衍生自病患之腫瘤在病患體中之作用情況，經植入的腫瘤出現逃避人類免疫性。此外，以TIL檢查點抑制子治療可能自無活性釋放T細胞並刺激其細胞毒素以向腫瘤釋放。
數據證實hu-CD34 NSG為針對人類免疫細胞及腫瘤間之交互作用，與試驗免疫-腫瘤學以及組合治療收集新見解之強大的平台。
整體而言，結果證實本文中所述之實例證實了將PDX腫瘤於對象人源化小鼠(例如，NSG小鼠)中之植入及生長、植入的小鼠對標準護理(SOC)治療的回應、以及以檢查點抑制子處理後之免疫媒介型腫瘤退化。這些結果支持了對象人源化小鼠(例如，NSG小鼠)作為用於免疫-腫瘤學治療之新臨床橋樑。
包括母案之所有本文中所引用的文獻以全文引用之方式併入本文中。
由於本案的圖皆為實驗數據，並非本案的代表圖。 故本案無指定代表圖。

Claims (23)

  1. 一種測定藥劑之療效及/或安全性之方法，該方法包含：(1)提供人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，其中，該小鼠：(a)scid突變為同合子；(b)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(c)係HSC經抑制之小鼠或HSC經消除之小鼠；(d)包含CD34+人類造血幹細胞(HSC)及CD45+人類捐贈者細胞；以及(c)包含衍生自人類病患的異種移植物(PDX)，其中，該人類HSC及該PDX為非HLA配對的；其中，該藥劑已被投予至該小鼠；以及(2)測定該藥劑之該療效及/或安全性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠為包含人類胸腺及肝片段之雌性NOD scid加瑪(NSG)小鼠。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠進一步包括持續表現人類介白素-3(IL-3)、人類顆粒細胞/巨噬細胞-刺激因子(GM-CSF)，及/或人類Steel因子(SF)之轉基因。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該scid突變為Cg-Prkdc scid 。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該IL-2受 體加瑪鏈缺陷為I12rg tm1Wj1 。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠係NOD.Cg-Prkdc scid I12rg tm1Wj1 /SzJ小鼠。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該小鼠係NOD scid加瑪(NSG)小鼠。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠為雌性。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該人類PDX係來自於原始病患樣本。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該人類PDX係來自於已繼代為至少一世代之異種移植物之已存檔之腫瘤樣本。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該人類PDX係來自於卵巢癌、肺癌、膀胱癌、淋巴癌、乳癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、大腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、胃/GIST癌、肝癌、腎臟/腎性癌、皮膚癌、軟組織癌、肉瘤，或癌細胞株之異種移植物。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠包含5×106個細胞的該人類PDX。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該藥劑包含抗癌化合物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中，該抗癌化合物為5-FU、癌思停、順鉑、卡鉑、吉舒達、歐洲紫杉醇，或其組合。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，對於IL-2受體加瑪鏈缺陷，該小鼠為同合子或半合子。
  16. 一種預測對於治療腫瘤之複數種抗腫瘤藥劑之療效排序之方法，該方法包含：(1)提供人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，其中，該小鼠：(a)scid突變為同合子；(b)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(c)係HSC經抑制之小鼠或HSC經消除之小鼠；(d)包含CD34+人類造血幹細胞(HSC)及CD45+人類捐贈者細胞；(e)包含衍生自人類病患的異種移植物(PDX)，其中，該人類HSC及該PDX為非HLA配對的；其中該複數種抗腫瘤藥劑已被投予至該小鼠；(2)測定療效，其中該PDX代表該腫瘤；以及(3)將該各抗腫瘤藥劑作比較及/或排序，從而預測對於治療該腫瘤之該複數種個抗腫瘤藥劑之療效排序。
  17. 一種測試兩種或更多種藥劑治療腫瘤的療效之非治療性方法，該方法包含：(1)提供人源化免疫缺陷之非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，其中，該小鼠：(a)scid突變為同合子；(b)具有IL-2受體加瑪鏈缺陷；(c)係HSC經抑制之小鼠或HSC經消除之小鼠； (d)包含CD34+人類造血幹細胞(HSC)及CD45+人類捐贈者細胞；以及(e)包含衍生自人類病患的異種移植物(PDX)，其中，該人類HSC及該PDX為非HLA配對的，且其中該PDX代表該腫瘤；其中該二種或更多種候選藥劑已被投予至小鼠；以及(2)測定該二種或更多種候選藥劑的療效。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠包含該人類PDX之約4至6×106個細胞。
  19. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中，該小鼠包含該人類PDX之約4至6×106個細胞。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該小鼠包含該人類PDX之約4至6×106個細胞。
  21. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該小鼠周邊血液內之該CD45+人類捐贈者細胞之百分比為約20至30%。
  22. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中，該小鼠周邊血液內之該CD45+人類捐贈者細胞之百分比為約20至30%。
  23. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該小鼠周邊血液內之該CD45+人類捐贈者細胞之百分比為約20至30%。
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