KR102664078B1 - 환자-유래 이종이식을 가지는 hla-비매칭의 인간화된 nsg 마우스 모델 - Google Patents

환자-유래 이종이식을 가지는 hla-비매칭의 인간화된 nsg 마우스 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자-유래 이종이식(PDX)을 가지는 HLA 비매칭(non-HLA matched) 인간화된 마우스 모델(예, NSG 마우스 모델) 및 이를 제작 및 이용하는 방법을 제공한다.

Description

환자-유래 이종이식을 가지는 HLA-비매칭의 인간화된 NSG 마우스 모델
본 출원은 환자-유래 이종이식을 가지는 HLA-비매칭의 인간화된 NSG 마우스 모델에 관한 것이다.
본 출원은 2015년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 62/183,386호와 관련하여 35 USC 119(e)에 의거하여 해당 출원일의 잇점을 주장하며, 상기 미국 가출원은 그 전체가 본 출원에 참고로 포함된다.
척추 동물의 면역 체계는 상당히 복잡하며 그 면역 체계 역시 복잡하다. 척추 동물의 면역계는 선천성 면역계와 후천적 면역계로 구성되어 있다. 선천적 면역계는 비특이적 면역계라고도 하며, 비특이적 방식으로 유기체를 방어하는 세포들을 포함한다. 선천적 면역계는 특히 항원을 인식하고 장기간 보호를 제공하는 후천적 면역계와 구별된다. 선천적 면역계는 항원-독립적 반응에 의해 특징되며 선천적 면역계에 노출되어도 면역학적 기억을 초래하지는 않는다. 선천적 면역계의 세포에는 수지상 세포, 비만 세포, 대식세포, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구 및 호산구를 포함한다.
척추 동물은 그 면역계의 복잡성으로 인해 질병 및 결함에 대한 특성을 파악하고 치료하는 것이 종종 어려울 때가 있다. 면역 반응의 양상들을 분리하여 고려할 수 있는 유용한, 예를 들어, 면역계의 질병 및 결함에 대한 효과적인 의학 및 약학적 치료를 규명할 수 있는, 방법 및 조성물을 제공할 수 있는 동물 모델에 대한 지속적인 요구가 있다.
면역결핍 마우스는 정상 및 비정상 이종 세포(xenogenic cells)의 성장 및 분화의 모델로 자주 사용된다. 면역결핍 마우스는 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: T 세포 및 B 세포와 같은 기능성 면역 세포의 결핍; DNA 복구 결함; 림프구 상에서 항원 특이적 수용체를 코딩하는 유전자들의 재배치에 있어서의 결함; 및 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 면역 기능성 분자의 결함. 면역결핍 마우스는 Rag1 및 Rag2와 같은 면역 기능에 관여하는 하나 이상의 유전자의 결핍에 의해 특징될 수 있다(Oettinger, M. A et al., Science, 248:1517-1523, 1990; 및 Schatz, D. G. et al., Cell, 59:1035-1048, 1989). 면역결핍 마우스는 마우스에서 비정상적 면역 기능을 초래할 수 있는 이들 중 어느 하나 또는 기타 다른 결함을 가질 수 있다.
특히 유용한 면역 결핍 마우스 종자(strain)는 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ 로서 통상적으로 NOD scid 감마 (NSG) 마우스를 의미하며, Shultz et al., J. Immunol., 174:6477-6489, 2005 에 자세히 기재되어 있고; NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rg tm1Wjl /SzJ는 Shultz et al., Clin. Exp. Immunol., 154(2):270-284, 2008 에 자세히 기재되어 있으며, 통상적으로 NRG 마우스를 의미한다.
일부 실험에서, 이러한 면역 결핍 마우스 종자(strain)는 인간 면역계의 일부를 면역 결핍 마우스에 접붙임(engrafting)함으로써 인간화된다. 이러한 인간화된 마우스 모델은 특히 강력한 연구 도구로 사용된다. 대부분의 실험적 연구가 마우스와 같은 설치류에서 수행된 반면, 마우스 연구에 의해 예측된 결과가 항상 인간에서의 실제 결과를 나타내는 것은 아니다. 인간화된 마우스 모델을 만들면 인간-특이적 감염 및 치료에 대한 연구를 마우스에서 수행할 수 있으며, 따라서 환자를 위험한 상황에 처하게 하는 단점을 배제하면서도 인간의 세포, 조직 및 면역계의 임상과 관련된 생체 내 연구를 수행할 수 있게 된다.
다양한 면역 결핍 마우스 종자가 이용 가능하지만, 각각은 사용상의 단점 및 제한이 있다. 특히, 면역 결핍 마우스에서 이종 조혈모세포(xenogeneic hematopoietic stem cells (HSC))와 같은 이종이식 줄기세포의 효율적 접붙임(engraftment)을 위해서는 수혜 마우스(recipient mice)에 방사선 조사(irradiation) 또는 부슬판(busulfan)과 같은 방사성 약물에 의한 컨디셔닝이 필요하다. 신생 마우스를 방사선을 조사(irradiation)하면 작고, 연약한 마우스가 되며, 조사된 마우스의 일부는 조기에 죽을 수 있다. 또한, 치료받은 동물의 조혈 발달(hematopoietic development)에 대한 방사선 조사의 효과에 대한 우려가 있다(참조, 예; Nielsen et al., Blood, 110(3):1076-1077, 2007).
따라서, 면역 결핍 마우스 스트레인에서 및 이를 사용하여 이종 조혈모세포(xenogeneic hematopoietic stem cells (HSC))의 접붙임(engraftment)을 위한 방법과 조성물에 대한 지속적 요구가 있다.
본 발명의 목적은 환자-유래 이종이식을 가지는 HLA-비매칭의 인간화된 NSG 마우스 모델을 제공하는 것이다.
일 양태에서 본 발명은 (1) scid 돌연변이에 대하여 동형접합성이고; (2) IL-2 수용체 감마 사슬 결핍을 가지고; (3) CD34+ 인간 조혈모세포(HSCs)로 이식되고; 및 (4) 인간 환자-유래 이종이식(PDX)으로 접종되며; 상기 HSCs 및 상기 PDX는 HLA가 비매칭되는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스를 제공한다(예, 단지 부분적으로 매칭되거나 또는 전혀 매칭되지 않는다).
특정 구현예들에 있어서, 상기 scid 돌연변이는 Cg-Prkdc scid 이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍은 Il2rg tm1Wjl 와 같은 유전적 삭제 돌연변이(null mutation)이다. 기타 구현예들에 있어서, 상기 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍은 IL-2R 감마 사슬에서의 절단(truncation) 돌연변이이다 (예,세포 외 또는 세포 내 영역 래칭(latching)).
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (즉, NOD scid 감마 (NSG))이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 흉선(thymus) 및 간의 단편들을 외과적으로 이식한 암컷 NSG 마우스이다 (예, 상기 hu-BLT NSG™ 마우스 (BLT 마우스 또는 BLT 인간화된 마우스).
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 인간 말초혈액 단핵세포들(peripheral blood mononuclear cells)이 추가적으로 접붙임된(engrafted) 마우스(예, 상기 hu-PBMC NSG™ 마우스 (또는 PBMC 인간화된 마우스))이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 인간 인터류킨-3 (IL-3), 인간 과립구/대식세포-자극인자 (GM-CSF) 및/또는 인간 줄기세포 인자 (SF)를 항시 발현하는 전이 유전자들을 추가로 포함한다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSCs는 꼬리 정맥 주사 (바람직하기로 상기 마우스는 암컷 마우스), 안면 정맥 주사, 심장 내 주사, 또는 간 내 주사를 통하여 접붙임된다(engrafted).
특정 구현예들에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSCs는 생후 약 2-4 주(예, 약 2 주, 3 주, 또는 4 주)의 마우스에 접붙임된다(engrafted).
특정 구현예들에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSCs는 생후 약 24-72 시간(예, 약 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 또는 90 시간)의 마우스에 접붙임된다(engrafted).
특정 구현예들에 있어서, 상기 CD34ig.+ 인간 HSCs는 상기 마우스의 전신을 조사(예, 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 cGy, 또는 100-300 cGy 또는 700-1300 cGy 등과 같이, 상기 인용된 조사량 중 임의의 두 조사량의 범위)한 후에 접붙임된다(engrafted).
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 상기 마우스에 상기 CD34+ 인간 HSCs를 접붙임(engrafted) 후 약 2주 후에 상기 마우스에 접종된다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 상기 마우스에 상기 CD34+ 인간 HSCs를 접붙임(engrafted) 후 약 12주 후에 상기 마우스에 접종된다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 상기 마우스에 상기 CD34+ 인간 HSCs를 접붙임(engrafted) 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15주 (또는 상기 수치들 중 임의의 두 수치 사이의 범위)에 상기 마우스에 접종된다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 원발성 환자(primary patient) 샘플에서 수득된다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 최소한 한 세대 동안 이종이식으로서 계승된 보관된(archived) 종양 샘플이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 낮은 계승 수(예, 5, 4, 3, 2, 또는 1 세대를 초과하지 않는 이종이식이나 배양으로 계승된)를 가진다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 상기 인간 PDX이 유래된 인간 암의 유전적 및/또는 표현형 이질성(phenotypic heterogeneity)을 보유한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 치료받은 경험이 없는(treatment-naive) 환자이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 치료 저항성(treatment-resistant)을 가진 환자이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 Jackson Laboratory에서 유지되고 이용가능한 PDX LIVETM 종양으로부터 수득한 하나 또는 그 이상의 임의의 것이다. Jackson Laboratory는, PDX LIVETM 종양이 접붙임된(engrafted) NSG 마우스의 수집으로서, 초기 계승 세대 수의 환자-유래의 이종이식(xenograft)(PDX) 암 모델에서 보다 넓은 범위의 접근을 허용한다. 이러한 쉽게 구할 수 있는, 즉시 수득 가능한(off-the-shelf) PDX 종양의 수집은 상기 NSG 마우스 배경에서 유지될 수 있으며, 임의의 상기 PDX는 또한 해당(subject) HLA가 비매칭되는 인간화된 면역결핍 마우스에 될 수 있다 (예, NSG, NSGS, BLT 등).
예를 들면, 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 침윤성 관성 유방암(invasive ductal carcinoma)을 포함한 유방암이다. 대표적 유방암은 TM00089, TM00095-TM00099, TM00103 및 TM 00129 (TM 번호들은 마우스 Tumor Biology Database at tumor dot informatics dot jax dot org slash mtbwi slash index dot do에 있는 PDX 모델의 ID를 나타낸다). 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 ALK, KRAS, TP53, EGFR, 또는 이들의 조합에 돌연변이를 가지는 폐암이다 (참조; M00046, TM00186, TM00192-TM00194, TM00200, TM00202-TM00204, TM00206, TM00208, TM00213, TM00214, TM00219, TM00222, TM00226, TM00233, TM00253, TM00302, TM00355, TM00784 및 TM00832). 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 방광암(예, TM00015)이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 뇌암(예, TM00058 및 TM01087)이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 대장암(예, TM00164 및 TM00165)이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 난소암(예, TM00334, TM00335, TM00391)이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 난소암, 비소세포성 폐암(NSCLC)과 같은 폐암, 방광암, (ML, CML, ALL, CLL, DLBCL (미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)와 같은 림프종, 삼중음성 유방암(triple-negative breast cancer)(TNBC), 뇌암, 췌장암, 전립선암, 대장암, 직장암, 자궁내막암, 위/위장관 기질암, 간세포암, 신장암, (흑색종과 같은) 피부암, 연조직 암종, 육종, 또는 암 세포주의 이종이식이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 PDX는 PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 종양/암으로부터의 이종이식이다.
특정 구현예들에 있어서, 약 0.5-10×106개 세포 (예, 약 1-9×106 개 세포, 약 2-8×106 개 세포, 약 3-7×106 개 세포, 약 4-6×106 개 세포, 또는 약 5×106 개 세포)의 인간 PDX가 접종된다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스의 말초 혈액에 있는 인간 CD45+ 세포의 백분율은 PDX 접종 후 약 50일(또는 HSCs 접붙임(engraftment) 후 약 9주 후)에 약 20 내지 30%에 이른다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 항암 화합물이 투여된다. 예를 들면, 상기 항암 화합물은 5-FU, 아바스틴(Avastin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 키트루다(keytruda), 도세탁셀(docetaxel), 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항암 화합물은 화학치료 시약이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항암 화합물은 전임상 약물이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항암 화합물은 PD-1의 조절제 또는 이의 리간드/수용체, 또는 CTLA-4 또는 이의 리간드/수용체와 같은 면역조절항암제(immuno-modulator)이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항암 화합물은 항-PD-1 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체와 같은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료제이다.
상기 항-PD-1 항체는 PD-1과 이의 리간드, PD-L1과 PD-L2의 상호작용을 차단하고, 상기 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 및 B7-1 (CD80)간의 상호작용을 차단하며, 이는 T 세포 반응의 하향 조절(down-modulation)에 관련되어 있다.
다양한 암을 대상으로 초기 및 말기암의 임상 시험에서 몇몇 PD-1과 PD-L1 억제제를 임상개발 중에 있다. 하나 또는 그 이상의 임의의 PD-1 및 PD-L1 억제제는 본 발명의 항암제로 사용될 수있다.
대표적 항-PD-L1 치료제는 하기 표 1의 치료제를 포함하고, 대표적 항-PD-1 치료제는 하기 표 2의 치료제를 포함하며, 이들 모두는 Dolan 및 Gupta, Cancer Control, 21(3):231-7, 2014 에서 채택된 것이다(참조로 인용됨).
예를 들어, BMS-936559/MDX-1105는 완전(fully) 인간형, 고 친화성을 가지는, PD-L1에 대한 면역 (Ig) G4 단일항체이다. MPDL3280A는 PD-L1를 타겟팅하는 조작된 인간 단일클론 항체이다. CT-011/pidilizumab는 PD-1에 결합하는 인간화된 IgG1 단일클론 항체이다. BMS-936558/MDX-1106/nivolumab는 PD-1에 대한 완전 인간형 IgG4 단일클론 항체이다. Pembrolizumab는 PD-1에 대하여 활성을 가지는 고도의 선택성, 인간화된 IgG4-kappa 단일클론 항체이다.
표 1. 현재 임상 시험 진행 중인 선택된 항-PD-L1 약제들
적응증 화합물 임상시험 번호 시험 시기
진행성 고형 종양
 BMS-936559 NCT00729664 1
MEDI4736 NCT01693562 1

악성 흑색종		 MPDL3280A + vemurafenib NCT01656642 1b
MEDI4736 + dabrafenib + trametinib 또는 trametinib 단독 NCT02027961 1/2
비소세포 폐암(NSCLC)




신장암(RCC)		 MPDL3280A + erlotinib NCT02013219 1b
MPDL3280A NCT01846416 2
MPDL3280A NCT02031458 2
MPDL3280A vs. docetaxel NCT01903993 2
MPDL3280A vs. docetaxel NCT02008227 3
MEDI4736 + tremelimumab NCT02000947 1b
MPDL3280A ± bevacizumab vs. sunitinib NCT01984242 2
고형 또는 혈액악성종양 MPDL3280A NCT01375842 1

고형암



 MPDL3280A ± bevacizumab 및/또는 sunitinib NCT01633970 1
MPDL3280A NCT01988896 1
MEDI4736 NCT01938612 1
MEDI4736 + tremelimumab NCT01975831 1
MSB0010718C NCT01943461 1
MSB0010718C NCT01772004 1
PD-L1 = 프로그램된 사망 리간드1, NSCLC = 비소세포 폐암, RCC = 신장암
표 2. 현재 임상 시험 진행 중인 선택된 고형암용 항-PD-1 약제들
적응증 화합물 임상시험 번호 시험 시기
진행성 암 AMP-224 NCT01352884 1
진행성 고형 종양 Nivolumab + iliolumbar (항-KIR) NCT01714739 1
난치성 전립선암, 악성 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC), 신장암(RCC) Nivolumab NCT00730639 1b
대장암 Pembrolizumab NCT01876511 2
위암, 두경부암,삼중 음성 유방암(TNBC), 요로상피 세포암종 Pembrolizumab NCT01848834 1
위암, 췌장암, 소세포 폐암, 삼중 음성 유방암(TNBC) Nivolumab ± ipilimumab NCT01928394 1/2
교모세포종 Nivolumab ± ipilimumab vs. bevacizumab NCT02017717 2
간세포 암 Nivolumab NCT01658878 1
호지킨 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종 Pembrolizumab NCT01953692 1
악성 뇌교종 Pembrolizumab NCT01952769 1/2
악성 흑색종




 Nivolumab ± ipilimumab vs. ipilimumab NCT01844505 3
Nivolumab ± ipilimumab vs. ipilimumab NCT01927419 2
Nivolumab ± ipilimumab NCT01024231 1
Nivolumab, ipilimumab와 순차적으로 NCT01783938 2
Nivolumab vs. DTIC 또는 ipilimumab 이후 carboplatin/paclitaxel NCT01721746 3
Nivolumab vs. DTIC NCT01721772 3
Nivolumab + 복수회 class 1 펩타이드들 및 montanide ISA 51 VG NCT01176461 1
Nivolumab + 복수회 class 1 펩타이드들 및 montanide ISA 51 VG NCT01176474 1
Nivolumab NCT01621490 1
Pembrolizumab vs. 항암화학요법 NCT01704287 2
Pembrolizumab vs.ipilimumab NCT01866319 3
악성 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC) Pembrolizumab NCT01295827 1
비소세포 폐암(NSCLC)





 Nivolumab ± gemcitabine/cisplatin, , pemetrexed/cisplatin, carboplatin/paclitaxel, bevacizumab, erlotinib, ipilimumab NCT01454102 1
Nivolumab vs. docetaxel NCT01673867 3
Nivolumab vs. docetaxel NCT01642004 3
Nivolumab NCT01721759 3
Nivolumab NCT01928576 2
Pembrolizumab vs. docetaxel NCT01905657 2/3
Pembrolizumab NCT02007070 1
췌장암 Pidilizumab + gemcitabine NCT01313416 2
전립선암 Pidilizumab + sipuleucel-T + cyclophosphamide NCT01420965 2
신장암(RCC)




 Nivolumab + sunitinib, pazopanib 또는 ipilimumab NCT01472081 1
Nivolumab NCT01354431 2
Nivolumab vs. everolimus NCT01668784 2
Nivolumab NCT01358721 1
Pembrolizumab + pazopanib NCT02014636 1
Pidilizumab ± 수지상 세포/신장암(RCC) 융합 세포 백신 NCT01441765 2
고형암


 항-LAG3(BMS-986016) ± nivolumab NCT01968109 1
Nivolumab NCT00836888 1
Nivolumab + interleukin-21 NCT01629758 1
AMP-554 NCT02013804 1
고형암, 비소세포 폐암(NSCLC) Pembrolizumab NCT01840579 1
PD-1 = 프로그램된 사망 1, NSCLC = 비소세포 폐암, RCC = 신장암, TNBC = 삼중음성 유방암
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 항-CTLA-4 항체 (예, 악성 흑색종 치료용 ipilimumab- FDA-승인 CTLA-4 억제제; 및 이전에 ticilimumab 또는 CP-675,206로 불리우던, Pfizer에 의해 생산되는 완전형(fully) 인간 IgG2 단일클론 항체 Tremelimumab이 현재 암치료 관련 임상 시험이 진행 중)와 같은 CTLA-4 길항제이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 CTLA-4 길항제 및 D-1 길항제/PD-L1 길항제의 조합이다. CTLA-4와 PD-1은 명백한 면역경로들을 조절하므로, 두 면역 억제 경로를 동시에 억제하는 것이 두 경로 중 하나만 단독으로 억제하는 것보다 더 효과적 일 수 있다.
CTLA-4는 T 세포의 주요 억제 세포 표면 단백질(inhibitory cell surface protein)이며 암의 성장은 면역 반응을 조절하는 자연적 피드백 메커니즘의 불균형과 관련이 있을 수 있다. 예를 들면, 종양은 CD28, CD40, OX40 및 CD137를 포함하는 T 세포의 공동자극 경로들(공동자극 경로들)을 하향조절(down-regulate)할 수 있다. 한편, 또는 다른 대안으로서, 종양은 LAG-3, CTLA-4 및 B7-H3를 포함하는 억제성 면역관문 경로들(inhibitory immune checkpoint pathways)을 상향조절(up-regulate)할 수 있다. 전임상 및/또는 임상 결과에 따르면, 진행성 암(advanced cancers)이 OX40의 감소된 T 세포 발현; 종양이 상기 CTLA-4 면역관문 경로를 이용하여 정상 면역 공격을 회피하는 것; CTLA-4의 T 세포 발현이 T 세포의 활성화 및 증식을 제한함으로써 항-종양 반응을 억제하는 것; 면역관문 LAG-3의 증가된 T 세포 발현(이에 따른 T 세포 활성화 및 기능에 대한 억제활성을 증가시킴); 및 T 세포 매개 면역 반응을 손상시킬 수 있는 B7-H3의 종양 세포 발현과 관련이 있음이 제시되었다. 따라서, D28, CD40, OX40 및/또는 CD137 공동자극 경로들을 상향조절하거나 LAG-3, CTLA-4 및/또는 B7-H3 억제성 면역관문 경로들을 하향조절함으로써 상기 PDX 종양들 중 치료가능한 종양을 결정하기 위해 해당 마우스를 사용할 수 있다.
면역 반응을 피하기 위해, 종양은 이 밖에도 CTLA-4 및 PD-1에 의해 매개되는 것 이외의 메커니즘을 사용한다. 예를 들면, 다발성 골수 성장 인자(multiple myeloid growth factors)는 많은 종양의 미세 환경 내에 분비되어, 종양주변 대식세포(tumor-associated macrophages; TAMs)로 불리는 하부집단(subpopulations)을 포함한 골수성 세포 미성숙 골수성 세포(myeloid cells)가 특유의 면역억제능을 확장할 수 있도록 신호를 보낸다. TAM는 고형암에 존재하는 풍부한 백혈구 집단으로서, 많은 경우에 있어서, TIL 활성을 억제하고 종양 신생혈관기전(tumor angiogenesis)을 증대시킴으로써 종양의 진행을 제한하기보다는 촉진시키는 경향이 있다.
TAM에 의해 촉진되는 조절 T 세포들(Treg) 및 T 조절 2 세포들(T helper 2 cells; TH2)은 종양에서 강력한 면역 억제 작용을 일으킨다. 이들 세포들은 보통 면역관용(immune tolerance)의 유지와 관련이 있다.
종양에서 발견되는 기타 골수성 세포로서 골수유래 억제세포들(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)을 들 수 있으며, 이들 세포는 T 세포 증식 억제능 및 혈관신생능에 의해 정의되는 대식세포의 전구체들, 과립구들 및 수지상 세포들을 포함하는 이질적 그룹의 미성숙 세포들을 나타낸다. MDSC는 면역 억제 메커니즘의 스펙트럼을 사용하여 종양이 면역을 회피할 수 있게 도와주며, 이들 효과의 대부분은 T 세포의 억제에 있다.
종양 면역에서 중요한 다른 면역 세포 집단은 수지상 세포 (DC) 및 자연 살해 세포(NK)를 포함한다. DC는 "전문적 항원 제공 세포"이며 T 세포 및 B 세포를 활성화시키는 특유의 종양 특이적 항원을 처리할 수 있다. 그러므로 수지상 세포(DC)는 종양 백신 개발과 후속적인 입양 면역 요법(adoptive immunotherapy)을 위한 생체 외(ex vivo) 종양 특이적 CTLS의 확대와 관련하여 연구의 중심에 있다.
NK 세포는 자기 조직의 면역 감시에 중요한 독특한 세포 표면 수용체를 가지고 있으며, 이들 수용체의 활성은 대부분의 정상 세포와 종양에서 발견되는 HLA 클래스 I 항원 제공 분자의 결합을 통해 매개된다. HLA class I 발현을 유지하는 종양은 NK 세포-매개 세포 독성을 회피하지만, 발현을 상실한 종양은 더 이상 NK 세포에 의해 "자기(self)"로 인식되지 않고 사멸된다. NK 세포 활성화를 촉진하는 화합물 및 동종이형(allogenic) NK 세포를 이용하는 입양 면역 요법은 전임상 및 임상 시험에서 활발히 진행 중인 영역이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 항체(예: 단일 클론 항체 또는 mAb) 또는 그의 항원 결합 단편이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항체는 세포들 간(예, 종양 세포와 T 세포, TAM, MDSC, DC, NK 세포 등과 같은 면역 세포들 사이)의 리간드-수용체 상호 작용을 차단 또는 강화한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항체는 세포들 간(예, 종양 세포와 T 세포, TAM, MDSC, DC, NK 세포 등과 같은 면역 세포들 사이)의 리간드-수용체 상호 작용의 작용제 또는 길항제로서 작용한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)에 의한 세포 파괴를 목표로 한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항체는 특정 표적 세포에 결합체 약물 페이로드(conjugated drug payloads)를 전달한다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 전통적인 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR)를 발현하는 유전적으로 조작된 림프구로서, 입양 세포 전달 면역 요법(adoptive cell transfer immunotherapy)에 사용할 수 있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 림프구는 암과 관련된 항원에 대항하여 항체를 발현하는 T 세포로서, 상기 항체는 CAR의 막관통(transmembrane) 및/또는 신호 도메인에 연결되거나 융합된다. 이러한 T 세포는 입양 T 세포 요법에 사용할 수 있다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 종양의 사멸을 증진시키고자 CTLs를 종양 세포 상의 항원들에 직접 결합시키기 위하여, 단일 분자에 융합된 2 개의 항체로부터 결합 특이성 영역을 포함하는 이중 특이성(bi-specific) T 세포 관여 항체 (T-cell Engager; BiTE)이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 고유 종양 항원에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 유전적으로 조작된 생체 외(ex vivo)에서 확대된 재 주입된(re-infused) TIL을 의미한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 종양은 자궁 경부암, 림프종 또는 백혈병이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 같은, 면역관문 억제제를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 동종이형(allogenic) 공여자 림프구 수액(infusion)(DLI) 또는 동종이형(allogenic) NK 세포 수액(infusion)이다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 적응적 전이(adaptive transfer) 이전에 종양 특이적 항원에 의해 초회 항원자극을 받은(primed) 적응적으로 전이된 수상 돌기 세포다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 항암제는 종양 특이적 항원을 포함하는 백신이며, 여기서 상기 백신은 내인성 종양 특이적 T 세포 반응을 증폭시킨다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍에 대하여 동형접합성(homozygous)이거나 반접합성(hemizygous)이다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자-유래 이종이식을 가지는 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스를 제작하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은: (1) 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스에 CD34+ 인간 조혈모세포(HSCs)를 주입하는 단계(여기서 상기 마우스는: (a) scid 돌연변이에 대하여 동형접합성이고; 및, (b) IL-2 수용체 감마 사슬 결핍을 가진다); 및 (2) 상기 마우스를 인간 환자-유래 이종이식(PDX)을 접종하는 단계(여기서 상기 HSC 및 상기 PDX는 HLA가 비매칭된다)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 이종(xenogeneic) 줄기세포를 마우스에 투여하는 것을 포함하는, 중증 복합성 면역결핍증(severe combined immunodeficiency)를 가지는 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스에서 이종 줄기세포를 접붙임(engraftment)하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 다수의 항종양 치료제에 대하여 약효성 순위 순서를 예측하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은: (1) 상기 다수의 항종양 치료제의 하나를 단일 치료제로서 (HLA 비매칭 PDX) 피검체 마우스(예, NSG 마우스)에 투여하여 약효성을 결정하는 단계(여기서 상기 PDX는 상기 종양을 나타낸다); 및 (2) 상기 다수의 항종양 치료제의 각각에 대하여 약효성을 비교 및/또는 순위를 정하여, 상기 종양 치료용 상기 다수의 항종양 치료제에 대한 약효성 순위 순서를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 둘 또는 그 이상의 후보 치료제를 이용하여 종양을 치료하는 병용 요법을 테스트하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은: (1) 상기 둘 또는 그 이상의 후보 치료제를, 단일 제제들 또는 병용 제제로서, 제1항의 마우스에 투여하여 약효성을 결정하는 단계(여기서, 상기 PDX는 상기 종양을 나타낸다); 및 (2) 상기 병용 제제에 대한 약효성 및 상기 단일 제제에 대한 약효성을 비교하는 단계(여기서, 상기 단일제제들의 합산적(additive) 약효성과 대비하여 병용 제제의 약효성이 높은 경우 상기 병용 제제가 우수한 것임을 나타낸다)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 제제를 이용하여 종양을 치료하는 투약 요법의 약효성 및/또는 안전성을 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은: (1) 제1항의 마우스에 상기 제제를 투여하는 단계(여기서, 상기 PDX는 상기 종양을 나타내고, 상기 제제는 상기 투약 요법에 따라 투여된다); 및 (2) 약효성 및/또는 안전성을 결정하는 단계를 포함한다.
이하 실시예 부분에 기재되었거나 또는 본 발명의 일 양태 하에서만 기재된 것을 포함하여, 본 발명에 기재된 모든 구현예들은 특별히 부인되거나 달리 부적절한 것이 아니라면 임의의 하나 이상의 다른 구현예와 결합될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
도 1은 인간화된 NSG 마우스에서 HLA 비매칭 종양의 성장 곡선을 보여주고 있다.
도 2는 인간화된 NSG 마우스에서 HLA 비매칭 SKOV3 난소암 이종이식의 성장 곡선을 보여주고 있다 (n=7).
도 3은 SKOV3 암세포 접종 후 50 일째의 말초 혈액에서의 hCD45+ 세포(%)를 보여주고 있다.
도 4A 내지 4C는 NSG vs. 인간화된 NSG 마우스에서 HLA 비매칭 종양들(BR0744, LG0977 및 SA0209 각각)의 성장 곡선을 보여주고 있다.
도 5A 내지 5C는 NSG vs. 인간화된 NSG 마우스에서 전체 종양(BR0744, LG0977 및 SA0209 각각)에 대한 hCD45+ 세포(%)를 보여주고 있다.
도 6A 내지 6C는 3 개의 HLA 비매칭 종양 PDX(BR0744, LG0977 및 SA0209 각각)에서 전체 침윤CD45+ 세포에서 인간 림프구의 백분율을 보여주고 있다.
도 7A는 표시된 투약 요법(dosing regimens)에 따라 5-FU, 아바스틴(Avastin) 및 비히클 대조군(vehicle control)으로 처리된, HLA 비매칭 인간화된 NSG 모델에서 대장암 CN1572P5 PDX의 종양 부피 곡선을 보여주고 있다. 도 7B는 3 개군에서 연구 제21일의 평균 종양 부피를 보여주고 있다.
도 8A는 표시된 투약 요법에 따라 시스플라틴(cisplatin), 펨브롤리주맙(키트루다)(pembrolizumab;Keytruda) 및 비히클 대조군(vehicle control)으로 처리된, HLA 비매칭 인간화된 NSG 모델에서 유방암 MDA-MB-231 PDX의 종양 부피 곡선을 보여주고 있다. 도 8B는 펨브롤리주맙(키트루다)(pembrolizumab;Keytruda) 및 비히클 대조군(vehicle control)에서 연구 제20일의 평균 종양 부피를 보여주고 있다. 도 8A와 유사한 실험을 수행 후 그 결과를 도 8C에 도시하였다.
도 9A 내지 9D는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 MDA-MB-231 PDX 마우스의 말초혈액에 인간 T 세포(CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 모두) 및 B 세포(CD19+)가 존재함을 보여주고 있다.
도 10A 내지 10C는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 MDA-MB-231 PDX 마우스의 종양 조직에 인간 T 세포가 존재함을 보여주고 있다.
도 11A는 표시된 투약 요법에 따라 시스플라틴(cisplatin), 펨브롤리주맙(키트루다)(pembrolizumab;Keytruda) 및 비히클 대조군(vehicle control)으로 처리된, HLA 비매칭 인간화된 NSG 모델에서 유방암 BR1126 PDX의 종양 부피 곡선을 보여주고 있다. 도 11B는 3 개군에서 연구 제17일의 평균 종양 부피를 보여주고 있다. 도 11A와 유사한 실험을 수행 후 그 결과를 도 11C에 도시하였다.
도 12A 내지 12D는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 말초혈액에 인간 T 세포(CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 모두) 및 B 세포(CD19+)가 존재함을 보여주고 있다.
도 13A 내지 13D는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 종양 조직에 인간 T 세포 및 B 세포가 존재함을 보여주고 있다. 도 13E 내지 13H는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 지라에 인간 T 세포 및 B 세포가 존재함을 보여주고 있다.
도 14A는 표시된 투약 요법에 따라 도세탁셀(Docetaxel을 포함하거나 포함하지 않은 펨브롤리주맙(키트루다)(pembrolizumab;Keytruda) 및 비히클 대조군(vehicle control)으로 처리된, HLA 비매칭 인간화된 NSG 모델에서 폐암 LG1306 PDX의 종양 부피 곡선을 보여주고 있다. 도 14B는 3개 군에서 연구 제24일의 평균 종양 부피를 보여주고 있다. 도 14A와 유사한 실험을 수행 후 그 결과를 도 14C에 도시하였다.
도 15A 내지 15D는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 LG1306 PDX 마우스의 말초혈액에 인간 T 세포(CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 모두) 및 B 세포(CD19+)가 존재함을 보여주고 있다. 도 15E 내지 15H는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 LG1306 PDX 마우스의 지라에 인간 T 세포 및 B 세포가 존재함을 보여주고 있다. 도 15I 내지 15K는 피검체 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 LG1306 PDX 마우스의 종양 조직에 인간 T 세포 및 B 세포가 존재함을 보여주고 있다.
도 16은 비히클 대조군(vehicle control), 항암화학요법 단독, 항-PD1 키트루다(Keytruda) 및 항-CTLA4 약제 (이필리무밥; ipilimumab)으로 처리된, CD45+CD8+ 침윤의 존재를 면역염색으로 확인한 결과를 보여주고 있다. 이들 결과는 항-PD1 및 항-CTLA4 치료요법이 PDX 종양들에 있어서 침윤 T세포의 뚜렷한 존재를 유도함을 보여준다.
1. 개요
암 치료에 대한 전통적인 접근법은 종양/암세포와 같이 빠르게 분열하는 세포에 독성을 갖는 광범위하게 작용하는 화학 작용제를 사용한다. 이러한 화학 요법은 성공적일 수 있지만 다양한 범위의 목표를 벗어난 독성으로 인해 복잡할 수 있으며, 또한, 약물 내성을 유발할 위험이 있다. 포유 동물의 면역 체계는 병원체에 감염된 세포 및 암이 된 세포를 포함한 표적 세포들의 제거를 위하여 다수의 효율적이고 고도로 특이성을 가진 메카니즘을 개발해 왔다. 이에 대응하여 종양 세포들은 면역 검출을 회피하기 위하여 그들만의 메카니즘을 개발해 왔다. 따라서, 면역 효과 세포와 종양 간의 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 통하여, 임상적 사용을 위해 내구성있는, 면역 매개된 종양의 퇴행을 자극하는 치료 전략의 새롭고 유망한 방법에 도달할 수 있다. 이 새로운 클래스의 면역 종양 치료 전략은 매우 희망적이지만, 이 분야에서의 추가적 연구는 생체 내 실험 플랫폼 역할을 하는 인간화된 작은 동물 모델 기반(예, 마우스 기반)인 피검체로부터 인간 면역 및 종양 세포 상호 작용에 대한 더 나은 생물학적 이해로의 통찰력을 얻게 하고, 임상적용 시 성공 확률이 높은 새로운 치료법의 전임상 시험을 가능하게 하는 잇점이 있다.
이하 기술된 본 발명은 부분적으로는 인간 CD34+-접붙임된(engrafted) NSG 마우스에서 환자-유래 이종이식(PDX)의 성장 속도가 PDX와 접붙임된 인간 면역 세포 사이의 완전한 HLA-타입 매칭을 요구하지 않는다는 사실에 기초한다.
또한, 이하 기술된 본 발명은 부분적으로는 인간화에 비해 암세포주 접붙임(engraftment) 시기(timing)이 이종이식 성장에 유의한 영향을 미치지 않는다는 놀라운 발견에 기초한다. 반면에, 암세포주 접붙임(engraftment) 시기 또한 CD45+ 세포군에 유의한 영향을 미치지 않는다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 (1) scid 돌연변이에 대하여 동형접합성이고; (2) IL-2 수용체 감마 사슬 결핍을 가지고; (3) CD34+ 인간 조혈모세포(HSC)로 이식되고; 및 (4) 인간 환자-유래 이종이식(PDX)으로 접종되며; 상기 HSCs 및 상기 PDX는 HLA가 비매칭되는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스를 제공한다 (여기서, 상기 HSC 및 PDX는 HLA가 매칭되지 않는다).
본 발명에서, "HLA 비매칭(non-HLA matched)"는 완전하지 않은 HLA 매칭, 단지 부분적인 HLA 매칭 또는 HLA 비매칭을 포함하여, 완전한 HLA 매칭이 되지 않는 것을 의미한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 HSC와 상기 PDX 사이에는 부분적인 HLA 매칭만 존재한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 HSC와 상기 PDX 사이에는 매칭이 전혀 없다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 NSG 마우스 또는 NSGS 마우스, NSG-SGM3 마우스, 또는 인간 CD34+ 접붙임된(engrafted) BLT-마우스와 같이 밀접한 관련성을 가진 파생종(derivative)이다.
본 발명의 상기 인간화된 마우스는 세포 생물학, 면역 종양학, 재생 의학, 인간 조혈, 전염병, 이식, 전임상 약물 효능 시험 연구, 면역 및자가 면역 등을 포함하는 여러 분야의 연구를 포함하는 생물학적, 의학적, 임상적 연구의 광범위한 스펙트럼에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 피검체인 인간화된 마우스 모델은 암 치료, 전염병 치료, 유전자 치료 및 대형 분자 약물의 면역원성에 대한 면역 반응을 연구하는데 사용될 수 있다.
또한, 상기 피검체인 인간화된 마우스 모델을 전임상 연구에 사용함으로써, 조혈 시스템의 존재 하에서, 환자 특이 이종이식(예를 들어, 암으로부터의 PDX)을 피검체 마우스 모델에서 연구할 수 있다. 임의의 시험 화합물 또는 약물을 피검체 마우스 모델에 하나 또는 그 이상의 투약 요법에 따라 투여함으로써, 이들 시험 화합물 또는 약물의 효과, 안전성 (예, 면역계에 대한 여하한 관련 부작용) 및 효능을 연구할 수 있다. 이러한 방법은 면역 종양학이나 면역 조절제, 또는 질병 조직(예, 암, 자가 면역 질환)과 면역계 사이의 상호 작용을 포함하는 연구에 특히 효과적이다.
상기 피검체 인간화된 마우스 모델은 접붙임된(engrafted) 인간 조혈계의 존재 하에 임의의 PDX룰 연구하는 데에도 사용될 수 있다. 여기에는 종양 조직학 연구, omic 연구 또는 프로파일링 (프로테오믹(proteomic), 게노믹(genomic, 메타블로믹(metablomic 등)이 포함된다. 특정 구현예들에 있어서, 연구 중인 PDX에 관한 정보는 마우스 종양 생물학 데이터베이스 (MTB)에서 얻을 수 있으며, 이는 실험 모델을 선택하고, 특정 암에서 돌연변이의 패턴을 검토하고, 암 스펙트럼 전반에 걸쳐 돌연변이가 통상적으로 발생하는 유전자들을 동정하는 것과 같은 분야의 연구자를 돕기 위해 고안되었다.
또한, 상기 피검체 인간화된 마우스 모델은 인간화된 마우스 모델의 개발, 선천성 면역 세포 기능 분석, T 세포의 항상성 검사 및/또는 BLT (태아 흉선/ 태아 간) 마우스 모델의 특성을 포함한, 인간 면역 시스템 개발 및 기능을 연구하는 데 사용될 수도 있다.
상기 본 발명의 일반적인 양태에 있어서, 본 발명의 특정 양상 또는 구현예들은 하기 섹션에서 추가 기술된다.
2. 정의
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 이들 용어는 정의된 것으로 발견되며 예시적으로 하기와 같은 다양한 표준 참조 문헌에서 사용된다: J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; D. L. Nelson and M. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004; A. Nagy, M.
Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer (Eds.) 2002, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879695919; 및 K. Turksen (Ed.),“Embryonic Stem Cells: Methods 및 Protocols in Methods,” Mol. Biol., 185:499, 2002, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808.
단수의 용어 "a", "an" 및 "the"는 달리 명백히 진술되거나 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않고 복수의 지시 대상을 포함할 수 있다.
유전자와 관련된 용어들인 “express(발현, 표현),”“expression,”“expressing” 및 “expresses”는 상응하는 mRNA를 생산하기 위한 유전자의 전사 및/또는 기능적으로 상응하는 암호화된 단백질을 생산하기 위한 mRNA의 번역을 의미한다.
용어 "면역결핍 비인간 동물"은 하나 또는 그 이상의 하기 목록에 의해 특징되는 비인간 동물(예, 마우스)을 의미한다: T 세포 및 B 세포와 같은 기능적 면역 세포의 결함; DNA 복구 결함; 림프구에서 항원 특이적 수용체를 코딩하는 유전자의 재배치 상의 결함; 및 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 면역 기능 분자들의 결함.
용어 "면역결핍 마우스"는 하나 또는 그 이상의 하기 목록에 의해 특징되는 마우스를 의미한다: T 세포 및 B 세포와 같은 기능적 면역 세포의 결함; DNA 복구 결함; 림프구에서 항원 특이적 수용체를 코딩하는 유전자의 재배치 상의 결함; 및 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 면역 기능 분자들의 결함. 면역결핍 마우스는 면역 기능에 관여하는 Rag1 및 Rag2와 같은 유전자의 하나 이상의 결핍에 의해 특징될 수 있다 (Oettinger et al., Science, 248:1517-1523, 1990; and Schatz et al., Cell, 59:1035-1048, 1989). 면역결핍 마우스는 마우스에서 비정상적인 면역 기능을 초래하는 이들 또는 다른 결함을 가질 수 있다.
특히 유용한 면역결핍 마우스 종자(strains)는 Shultz et al., , J. Immunol., 174:6477-6489, 2005에 상세히 기재된 바와 같이 일반적으로 NOD scid 감마 (NSG) 마우스를 의미하는 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tml Wjl /SzJ 및 일반적으로 NRG 마우스를 의미하는 NOD.Cg-Rag1 tmlMom Il2rg tml Wjl /SzJ(Shultz et al., Clin. Exp. Immunol., 154(2):270-284, 2008)가 있다.
용어 "중증 복합성 면역결핍증(severe combined immune deficiency; SCID)"는 T 세포의 부재 및 B 세포 기능의 부재를 특징으로 하는 증상을 의미한다.
SCID 의 일반적인 형태로는 다음을 들 수 있다: IL2RG 유전자 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-)에서 감마 사슬 유전자 돌연변이에 의해 특징되는 X-염색체 연관 SCID; 및 Jak3 유전자 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-), ADA 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(-), IL-7R alpha-사슬 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+), CD3 delta or epsilon 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+), RAG1/RAG2 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(+), Artemis 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(+), CD45 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+)에 의해 특징되는 상염색체 열성 SCID.
본 발명의 양태에 따라 유전자 변형 마우스는 일반적으로 scid 돌연변이로 불리우는 중증 복합성 면역결핍증(Prkdc scid )을 가진다. 상기 scid 돌연변이는 잘 알려져 있으며 문헌(Bosma et al., Immunogenetics, 29:54-56, 1989)에 기재된 바와 같이 마우스 염색체 16에 위치하고 있다. scid 돌연변이에 동형 접합체인 마우스는 기능적 T 세포 및 B 세포, 림프구 감소증, 저글로블린혈증 및 정상 조혈 미세 환경의 부재가 특징이다. 상기 scid 돌연변이는 예를 들어, PCR 또는 유동 세포 분석과 같은 잘 알려진 방법을 사용하여 scid 돌연 변이에 대한 마커의 검출을 통해 검출할 수 있다.
본 발명의 양태에 따른 유전자 변형 마우스는 IL2 수용체 감마 사슬 결핍을 가진다. "IL2 수용체 감마 사슬 결핍"이라는 용어는 감소된 IL2 수용체 감마 사슬을 의미한다. 감소된 IL2 수용체 감마 사슬은 유전자 결실 또는 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 감소된 IL2 수용체 감마 사슬은, 예를 들어, IL2 수용체 감마 사슬 유전자의 결실 또는 돌연변이의 탐색 및/또는 잘 알려진 방법을 이용하여 IL2 수용체 감마 사슬 발현의 감소의 탐색을 통해 검출할 수있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 IL2 수용체 감마 사슬 결핍은 IL2 수용체 감마 사슬 유전자의 삭제 돌연변이(null mutation)이다. 특정 구현예들에 있어서, IL2 수용체 감마 사슬 결핍을 가지는 동물은 상기 IL2 수용체 감마 사슬에 대한 동형 접합체이다.
scid 돌연변이를 가지는 유전자 변형 면역결핍 마우스 또는 상기 scid 돌연변이와 IL2 수용체 감마 사슬 결핍을 함께 가진 마우스는 본 발명의 양태에 따라 준비된다. 유전자 변형 NOD scid 감마 마우스는 본 발명의 양태에 따라 준비된다.
상기 용어들 "NOD scid 감마"와 "NSG는 상호 교환되어 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 잘 알려진 면역결핍 마우스 종인 NOD를 의미한다. Cg-Prkdc scid NSG 마우스는 NOD/ShiLtJ 를 바탕으로 한 다중 면역 결핍, 중증 복합성 면역결핍증 및 인터루킨-2 수용체 감마 사슬의 완전한 넉아웃(knockout)을 가지고 있다. 그 결과, NSG 마우스는 사이토카인 신호가 결핍되어 있다. NSG 마우스는 IL2R-γ (감마 c) 발현의 결핍, 검출 가능한 혈청 면역 글로불린의 부존재, 용혈 보체 부존재, 성숙한 T 림프구의 부존재 및 성숙한 NK 세포의 부존재로 특징된다.
중증 복합성 면역결핍증 비인간 동물 또는 중증 복합성 면역결핍증과 IL2 수용체 감마 사슬 결핍을 함께 가진 유전자 변형 면역결핍 비인간 동물(예, 마우스)은 본 발명의 양태에 따라 준비된다.
유전자 변형 면역결핍 비인간 동물은 유전자 표적 벡터를 착상 전 배아 (preimplantation embryo) 또는 배아 줄기세포(embryonic stem (ES) cells)나 유도된 다능성 줄기세포(induced pluripotent stem (iPS) cells)와 같은 줄기세포에 도입하여 제작할 수 있다.
상기 용어 "유전자 표적 벡터(gene targeting vector)"는 상기 표적 유전자를 삽입 또는 대체 등을 통하여 특정 염색체 좌(chromosomal locus)와 재조합 또는 변이에 효과적인 이중가닥 재조합 DNA 분자를 의미한다.
상기 용어 "야생형(wild-type)"은 자연 발생 또는 비변이 유기체, 단백질 또는 핵산을 말한다.
선택적으로, 본 발명의 유전자 변형 면역결핍 비인간 동물들 (예, 마우스)은 선택적 번식에 의해 생산된다. 제 1 희망 유전자형을 갖는 비인간 동물의 제 1 모 종자(parental strain)는 제 2 희망 유전자형을 갖는 비인간 동물의 제 2모 종자(parental strain)와 교배시켜 상기 제 1 및 제 2 희망 유전자형을 갖는 비인간 동물들의 후손들을 생산한다.
본 발명의 유전자 변형 면역결핍 비인간 동물들은 바람직하기로는 비인간 포유류들이며, 특히 마우스, 랫트 또는 기니아 피그와 같은 설치류이다.
본 발명의 양태에 따라 준비된 상기 scid 돌연변이와 IL2 수용체 감마 사슬 결핍을 동시에 가지는 유전자 변형 면역결핍 마우스는 SG 마우스, NSGS 마우스, 인간 CD34+ HSC 접붙임된(engrafted) NSG / NSGS 마우스, 또는 인간 CD34+ 접붙임된(engrafted) BLT-마우스일 수 있다.
본 발명에서 상기 용어 "이종이식(xenogeneic)"은 숙주 세포 또는 유기체에 대해 "이종이식"으로 불리우는 물질이 숙주 세포 또는 유기체 이외의 다른 종으로부터 유래되었음을 나타내기 위하여 사용된다.
본 발명에서 사용되는 상기 용어 "조혈모세포(hematopoietic stem cells)"는 면역계를 만드는 기능을 하는 다능성 줄기세포를 의미한다. 마우스의 조혈모세포는 c-Kit 수용체를 발현한다. c-Kit 수용체는, 예를 들어, 저널(Vandenbark et al.,“Cloning and structural analysis of the human c-kit gene,” Oncogene, 7(7): 1259-1266, 1992; and Edling & Hallberg,“c-Kit--a hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase,” Int. J. Biochem. Cell Biol., 39(11):1995-1998, 2007)에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 인간 조혈모세포는, 예를 들어, 저널(Simmons et al.,“Molecular cloning of a cDNA encoding CD34, a sialomucin of human hematopoietic stem cells,” J. Immunol., 148(1):267-271, 1992)에 기재된 바와 같이 공지의 단백질이다.
본 발명의 양태에 따르면, 이종이식(xenogeneic)(예, 인간) 조혈모세포는 본 발명의 유전자 변형 면역결핍 비인간 동물(예, 마우스)에 투여되며, 여기서 상기 이종이식 조혈모세포는 상기 유전자 변형 면역결핍 비인간 동물에서 이종이식 면역세포로 분화된다.
본 발명의 양태에 따르면, 인간 조혈모세포는 본 발명의 유전자 변형 면역결핍 마우스에 투여되며, 여기서 상기 인간 조혈모세포는 상기 유전자 변형 면역결핍 마우스에서 인간 면역세포로 분화된다.
유전자 변형 면역결핍 동물 투여용 조혈모세포는 제대혈, 골수, GM-CSF-동원된(mobilized) 말초 혈액 및 태아 간과 같은, 조혈모세포(HSC)를 포함하는 임의의 조직으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
선택적으로, 유전자 변형 면역결핍 동물 투여용 조혈모세포는 제대혈, 골수, GM-CSF-동원된(mobilized) 말초 혈액 및 태아 간과 같은, 조혈모세포(HSC)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 조직으로부터 얻은 세포군들의 확장을 위한 투여 전에 실험실 배양을 통하여 얻을 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
조혈모세포는 심장(심장내 주사; intracardiac injection), 간(간내 주사; intrahepatic injection) 및/또는 안면 정맥과 같은 다양한 경로를 통하여 신생 동물에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 조혈모세포는 꼬리 정맥, 대퇴골 골수강, 또는 지라와 같은 다양한 경로를 통하여 성장한 동물에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 추가 실시예에서, 태아 간 및/또는 태아 흉선으로서 조혈모세포는 신피막(renal capsule) 하부(예, BLT 마우스에서 1 mm3 큐브 유기물(cube organoids))로 접붙임될(engrafted) 수 있다.
선택적으로, 조혈모세포는 컨디셔닝된(conditioned) 동물에 투여된다. 조혈모세포의 수혜을 위한 수혜 동물의 컨디셔닝은, 이종 조혈모세포(xenogeneic HSCs)의 수혜 (receipt) 전에 수혜 동물의 내재적 조혈모세포 및 전구세포(progenitor cells)를 고갈 시키거나 억제하기 위해 수행된다. 수혜 동물의 컨디셔닝은, 이종 조혈모세포(xenogeneic HSCs)의 수혜 전에 수혜 동물의 내재적 조혈모세포 및 전구세포(progenitor cells)를 고갈시키거나 억제하는 데 효과적인 방사선 및/또는 하나 또는 그 이상의 화학약품을 투여하는 것을 포함한다. 부술판(busulfan)은 이종 조혈모세포(xenogeneic HSCs)의 수혜 전에 수혜 동물의 내재적 조혈모세포 및 전구세포(progenitor cells)를 고갈시키거나 억제하는 데 효과적인 화학약품중의 하나로 잘 알려져 있다. 이종 조혈모세포(xenogeneic HSCs)의 수혜 전에 수혜 동물의 내재적 조혈모세포 및 전구세포(progenitor cells)를 고갈시키거나 억제하는 데 효과적인 방사선 및/또는 하나 또는 그 이상의 화학약품을 투여함에 의한 컨디셔닝은 컨디셔닝된 동물을 제조하기 위한 공지의 프로토콜에 따라 수행된다.
이종 조혈모세포의 접붙임(Engraftment)은 조혈모세포의 투여에 이어 하나 또는 그 이상의 시점에 이종 조혈모세포(xenogeneic HSCs)가 투여되는 동물에서, 유동 세포 측정 분석(flow cytometric analysis of cells)과 같은 다양한 방법 중 임의의 방법으로 평가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이종 조혈모세포의 분리 및 이종 조혈모세포를 숙주 유기체에 투여하는 방법들 및 접붙임(Engraftment)의 분석 방법들은 본 명세서의 이하에 기재되어 있으며, 하기 문헌 모두가 참조로 인용된다: T. Pearson et al., Curr . Protoc . Immunol., 81:15.21.1-15.21.21, 2008; Ito et al., Blood, 100:3175-3182, 2002; Traggiai et al., Science, 304:104-107, 2004; Ishikawa et al., Blood, 106:1565-1573, 2005; Shultz et al., J. Immunol. 174: 6477-6489, 2005; Holyoake et al., Exp Hematol., 27(9):1418-1427, 1999.
상기 조혈모세포는 조혈모세포에 풍부한 세포 집단을 얻기 위해 원래의 원료로부터 분리된다. 상기 분리된 조혈모세포는 순도가 높을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
특정 구현예들에 있어서, 조혈모세포는 CD34와 같은 세포 마커를 선택하여 정제한다.
특정 구현예들에 있어서, 비록 CD34+ 세포가 전체 세포의 1% 미만을 차지하는 인간 세포 군이 사용될 수 있지만, 투여된 인간 조혈모세포는 CD34+ 세포가 전체 세포의 약 1-100% 를 차지하는 인간 세포 군이다. 특정 구현예들에 있어서, 투여된 인간 조혈모세포는 CD34+ 세포가 전체 세포의 약 1-3% 를 차지하는 T 세포가 고갈된 제대혈 세포들; CD34+ 세포가 전체 세포의 약 50% 를 차지하는 계대가 고갈된(lineage depleted ) 제대혈 세포들; 또는 CD34+ 세포가 전체 세포의 약 90% 를 차지하는 긍정적으로 선택된 세포들이다.
투여된 조혈모세포의 수는 면역 결핍 마우스에서 이종 면역계의 생성과 관련하여 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 단일 조혈모세포는 면역계의 세포들을 생성할 수 있다. 따라서, 투여된 조혈모세포의 수는, 더 많은 수의 세포가 사용될 수도 있지만, 일반적으로 1-10 × 106 개이며, 여기서 수혜 대상은 마우스이다. 다른 종(species)에 대해서는, 세포의 수는 필요 시 단지 반복 실험에 의해 조절가능하다.
일반적으로, 더 큰 집단의 CD34+에서 CD34+ 세포의 하부 집단(subpopulation)으로서 존재한다. 따라서, 제대혈, 골수, GM-CSF-동원된(mobilized) 말초혈액 및 태아 간과 같이 조혈모세포를 포함하는 조직들, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 조직에서 얻는 CD34+ 세포집단의 투여는 상기 조혈모세포 하부 집단을 상기 수혜 동물에게 전달하여 접붙임(engrafted)되게 한다. 제대혈, 골수, GM-CSF-동원된(mobilized) 말초혈액 및 태아 간과 같이 조혈모세포를 포함하는 조직들, 그러나 이에 제한되지 않는, 임의의 조직으로부터 얻는, 상기 조혈모세포 하부 집단을 상기 수혜 동물에게 전달하여 접붙임(engrafted)되게 하는, CD34+ 세포의 수는 1-10억 세포의 범위, 예를 들면, 1-5억 세포, 1-1억 세포, 1-1000만 세포, 1-500만 세포, 1-100만 세포, 1-50만 세포, 1-10만 세포, 1-5만 세포, 1-1만 세포, 1-1000 세포의 범위로 투여되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, CD34+ 세포의 수는 100-1000만 세포, 100-500만 세포, 100-100만 세포, 100-50만 세포, 100-10만 세포, 100-5만 세포, 100-1만 세포 또는 100-1000 세포의 범위로 투여된다. 더욱이, CD34+ 세포의 수는1000-1000만 세포, 1000-500만 세포, 1000-100만 세포, 1000-50만 세포, 1000-10만 세포, 1000-5만 세포 또는 1000-1만 세포의 범위로 투여된다.
투여된 대부분의 비-조혈모세모가 퇴행한 시점에 상기 수혜 동물에서 이종 조혈모세포 및 조혈모세포에서 분화된 세포들이 검출되는 경우, 접붙임(Engraftment)은 성공적이다. 성공적인 인간 조혈모세모 접붙임(Engraftment)의 특징은 복수-계통 인간 면역 세포 분화로서, 골수, 흉선, 지라, PBL 등에 호밍(homing)한다. NSG 마우스는 복수-계통 접붙임(Engraftment) 및 거의 모든 적합한 기관 및 조직들 속으로 호밍하는 면역 세포를 지지한다. hu-CD34 NSG 마우스에서 검출된 인간 면역 세포 집단의 전체 범위는 Ishikawa 등의 문헌((Blood, 106(5): 1565-1573, 2005); 및 Tanaka et al. (J. Immunol., 188(12): 6145-6155, 2012)에 요약되어 있다.
분화된 조혈모세포의 검출은 수혜 동물에서 이종 유전자의 검출에 의하거나 손상되지 않은(intact) 이종성 조혈모세포 및 조혈모세포로부터 분화된 세포의 검출에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들면, CD34+ 세포를 2차 수혜 대상에게 계대 전달(Serial transfer)하고 이종 조혈계를 접붙임(Engraftment)하는 것은 1차 수혜 대상의 조혈모세포 접붙임(Engraftment)에 대한 추가적 시험이 될 수 있다. 접붙임(Engraftment)은 상기 조혈모세포를 투여 후 10-12 주 시점에 혈액에서 0.05% 또는 그 이상의 이종(xenogeneic) CD34+ 세포를 유세포 분석기로 검출할 수 있다.
본 발명의 양태에 따라 제공된 방법으로서, 이종 줄기세포 인자(xenogeneic stem cell factor; SCF)를 면역결핍 동물의 이종 조혈모세포에 전달하는 것을 포함한다. 상기 이종 줄기세포 인자는 동물에 급성 또는 만성적으로 전달될 수 있다. 본 발명의 양태에 따르면, 상기 면역결핍 비인간 동물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 줄기세포 인자를 코딩하는 전이 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 추가 선택사항으로서, 상기 동물이 이종 줄기세포 인자를 발현하는 경우, 상기 동물은 이종 줄기세포의 투여 전에 방사성 약물(radiomimetic agent) 투여에 의해 컨디셔닝되지 않는다.
본 발명의 양태에 따른 면역계 반응의 조절자(modulators)를 동정하는 방법은 비인간 유전자 변형 면역결핍 동물을 제공하는 단계; 상기 비인간 유전자 변형 면역결핍 동물에 이종 조혈모세포를 투여하는 단계(여기서, 상기 조혈모세포는 상기 비인간 유전자 변형 면역결핍 동물에서 분화되어 이종 면역세포를 생성한다); 상기 동물에 면역계 자극인자(stimulator)를 투여하는 단계; 상기 면역계 자극인자(stimulator)에 대한 이종 면역 세포의 반응을 분석하는 단계; 및 상기 면역계 자극인자(stimulator)에 대한 이종 면역 세포의 반응에 대한 시험 화합물의 효과를 결정하기 위한 표준에 대한 반응을 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 시험 물질의 효과는 상기 동물에서 이종 면역계의 조절 인자를 동정한다.
본 발명의 방법에 사용되는 시험 화합물은 임의의 화학적 물질(chemical entity), 예를 들어, 합성 또는 자연 발생 화합물, 또는 합성 또는 자연 발생 화합물의 조합물, 작은 유기 및 무기 분자, 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 올리고당, 지질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 샘플은 비인간 동물에서 얻을 수 있으며, 예를 들어, 지라, 골수, 혈액, 혈장 및 혈청을 포함할 수 있다.
선택적으로, 면역계의 특정 세포 집단(예, 수지상 세포, 플라스마시토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells), 골수 수지상 세포(myeloid dendritic cells), 비만세포(mast cells), 단핵백혈구(monocytes)/대식세포, NK 세포, 호중구, 호염기구 및 호산구, T 림프구 (CD3+CD4+ or CD3+CD8+ T 세포), B 림프구(예, CD19+B 세포))을 분석할 수 있다.
본 발명은 접붙임된(engrafted) 인간 면역계를 가지는 유전자 변형 면역 결핍 비인간 동물의 분리된 골수 세포를 제공한다. 본 발명은 접붙임된(engrafted) 인간 면역계를 가지는 유전자 변형 면역 결핍 비인간 동물의 분리된 골수 세포를 제공한다.
본 발명은 유전자 변형 면역 결핍 비인간 동물의 분리된 골수 세포를 제공한다. 이러한 분리된 세포는 시험관 내에서 배양되어 다양한 분석법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 분리된 세포는 시험 물질의 활성을 결정하기 위한 시험 물질의 평가를 위한 분석에서 대조군으로서 유용하다. 또 다른 실시예에서, 이러한 분리된 골수 세포는 면역계의 활성에 미치는 시험 물질의 활성을 결정하는 데 유용하다.
면역 분석법을 사용하여 샘플 내의 표적 분석물 또는 면역 세포 반응 지표를 분석할 수 있으며, 상기 분석법은 하기와 같은 분석법을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)), 효소 결합 면역 여과 분석법(enzyme-linked immunofiltration assay (ELIFA)), 유세포 분석(flow cytometry), 면역블롯(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation, 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역세포화학(immunocytochemistry), 발광면역측정법(luminescent immunoassay (LIA)), 형광면역측정법(fluorescent immunoassay (FIA)) 및 망사면역측정법(radioimmunoassay). 분석 방법은 정량적 및/또는 정량적 결과를 얻기 위해 사용할 수 있다. 샘플의 정성 및 정량 분석을 위한 적합한 분석 방법의 특정 세부 사항은 하기와 같은 표준 참고 문헌에 기재되어 있다: E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling and S. Dubel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From background to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; B. K. C. Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; F. M. Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Wiley, 2002; S. Klussman, Ed., The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley, 2006; Ormerod, M. G., Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000; Givan, A. L., Flow Cytometry: First Principles, Wiley, New York, 2001; Gorczyca, W., Flow Cytometry in Neoplastic Hematology: Morphologic-Immunophenotypic Correlation, Taylor & Francis, 2006; Crowther, J. R., The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2000; Wild, D., The Immunoassay Handbook, 3rd Edition, Elsevier Science, 2005; and J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Ed., 2001.
항체 및 항체 제조방법은 당업계에 잘 알려져있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 모노 클론 항체, 폴리 클론 항체, 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 낙타화된(camelized) 항체, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, 디설파이드 연결 Fvs 및 항-이도티픽(Idotypic (항 -Id)) 항체 및 상기 중 임의의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편들, 즉 항원 결합 사이트를 가지는 분자들을 포함할 수 있다.
면역글로불린 분자는 임의의 타입 (예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 서브 타입일 수 있다.
본 발명에서, 상기 용어들 "항체 단편" 및 "항원-결합 단편"은 표적 분석물에 면역 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 정의한다. 항체 단편은 당업자에게 공지 된 임의의 기술에 의해 생성될 수있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편들은 파파인(Fab단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 사용하여 면역 글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
항체, 항원 결합 단편, 이들의 생성 방법 및 항원에 실질적으로 특이적으로 결합하기 위해 생성된 항체를 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이들 항체, 항원 결합 단편 및 상기 방법은 하기 문헌에 자세히 기재되어 있다: (예 in Antibody Engineering, Kontermann, R. 및 Dubel, S. (Eds.), Springer, 2001; Harlow, E. 및 Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; F. Breitling and S. Dubel, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; H. Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Basics: From 백그라운드 to Bench, BIOS Scientific Publishers, 2000; Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002; J. D. Pound (Ed.) Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2nd ed., 1998; B. K. C. Lo (Ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003; and Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)). 톨-유사(toll-like) 수용체 4와 같은 표적 분석 대상 항체 또는 선천성 면역 세포 반응의 지표는 동물에서 재조합 방법으로 생산, 합성되거나 상업적으로 획득할 수 있다.
샘플에 존재하는 표적 분석물과 결합 파트너 사이의 결합을 검출하는 것은 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 방법의 예로서, 표적 분석물 또는 결합 파트너에 직접 또는 간접적으로 부착된 검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 용어 "검출 가능한 라벨"은 임의의 적절한 방법에 의해 검출 가능한 표지의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있는 물질을 의미하며, 이러한 방법의 예로서, 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소, 전기 및/또는 면역 화학적 방법을 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 예시적으로 형광 부분, 화학 발광 부분, 생체 발광 부분, 전자 밀도 입자, 자성 입자, 효소, 기질, 방사성 동위 원소 및 발색단을 포함할 수 있다.
검출 가능한 특정 표지 또는 표지들의 정체성은 사용된 검출 공정에 따라 달라진다. 상기 검출 공정은 예를 들어 효소 면역 분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역형광측정법(immuno-fluorescence assay), 액체 크로마토그래피(liquid chromatography), 유세포 분석(flow cytometry), 기타 당업계에 공지된 검출 방법들 또는 이들의 조합을 포함하는 특정 분석 포맷에 통합된다.
결합 분석은 지지체에 부착된 결합 파트너를 포함할 수 있다. 결합 분석에 사용되는 부착된 결합 파트너를 가지는 지지체는 고체 또는 반고체 일 수 있으며, 유리, 실리콘, 종이, 합성 또는 자연 발생 중합체(예; 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, PVDF, 나일론, 셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란 및 폴리아크릴아미드) 또는 결합 분석자가 결합 분석에 사용 시 안정하게 부착될 수 있는 기타 다른 물질과 같은 다양한 물질 중 임의의 것일 수 있다.
사용되는 지지체로서는 카르복실, 아민, 아미노, 카르복실레이트, 할라이드, 에스테르, 알콜, 카르바미드, 알데히드, 클로로메틸, 황 산화물, 질소 산화물, 에폭시 및/또는 토실 기능기와 같은 결합 파트너에 결합하는 기능기들을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지는 않는다. 지지체에 대한 결합 파트너의 부착은 흡착 및 화학 결합을 포함하는 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 달성된다. 일 실시예에 있어서, 1-에틸-3- [3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염, EDC 또는 EDAC 화학은 결합 파트너를 입자에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 결합 파트너는 지지체의 재료(예; 지지체 상에 배치된 코팅 또는 링커에의 결합을 통하여)에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 기능기들, 이들의 변형 및 지지체에 대한 결합 파트너의 부착은 당업계에 공지되어 있다 (예; Fitch, R. M., Polymer Colloids: A Comprehensive Introduction, Academic Press, 1997).
이러한 지지체는 미량 정량판(microtiter plates), 미량 정량웰(microtiter wells), 핀(pins), 섬유(fibers), 비드(beads), 슬라이드, 실리콘 칩 및 멤브레인 (예; 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)를 포함하는, 그러나 이들에 제한되지 않는, 다양한 형태 및 모습을 가질 수 있다.
당업계에 공지된, 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 이온 이동도 분광법, 질량 분석법, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS 또는 HPLC-MS), 이온 이동도 분광법-질량 분석법, 탠덤 질량 분석법, 가스 크로마토그래피-질량 분석법, 매트릭스-보조 탈착 이온화 비행 시간(matrix-assisted desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF)) 질량 분석법, 표면-강화 레이저 탈착 이온화 (SELDI) 및 핵자기 공명 분광법과 같은 다양한 분광학 방법 중 임의의 것을 사용하여 본 발명의 양태에 따른 톨-유사 수용체 4 또는 선천성 면역 세포 반응의 지표와 같은 표적 분석물을 검정할 수 있다.
선택적으로, 분광 분석법은 톨-유사 수용체 4 또는 선천성 면역 세포 반응의 지시자와 같은 표적 분석물에 대한 샘플을 분석하는 데 사용된다. 질량 분석법은 본 발명의 양상에 따른 분석에 사용될 수 있다. 질량 분석법은 예를 들면 비행 시간(TOF) 또는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석법(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry)을 사용하여 수행된다. 질량 분석법은 당업계에 공지된 것으로서, 단백질 및/또는 펩타이드 분석법에 대한 그 예시적 상세한 내용은 문헌(Li J., et al., Clin Chem ., 48(8):1296-1304, 2002; Hortin, G. L., Clinical Chemistry, 52: 1223-1237, 2006; A. L. Burlingame, et al. (Eds.), Mass Spectrometry in Biology and Medicine, Humana Press, 2000; and D. M. Desiderio, Mass Spectrometry of Peptides, CRC Press, 1990)에 기재되어 있다.
3. 인간화된 종양 보유(Tumor-Bearing) NSG 마우스
Jackson Laboratory NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ, Stock No. 005557) 는 NOD scid 감마; NSG; NOD-scid IL2R감마null; 및 NOD-scid IL2Rgnull로도 알려져 있다. 이들 마우스는 중증 복합성 면역 결핍 돌연변이(scid)인 NOD/ShiLtJ 백그라운드 (Jackson Laboratory Stock No.001976) 및 IL2 수용체 감마 사슬 결핍의 특성을 결합한다. 그 결과, 상기 NSG 마우스는 성숙한 T 세포와 B 세포가 부족하고 (따라서 마우스 항체를 생성하지 않음) 및 기능성 NK 세포가 부족하며, 보체 시스템 (complement system)이 없고, 사이토카인 신호 전달이 불완전하므로, 다른 기존의 공지된 마우스 계통에 비하여 인간 조혈모세포(HSCs) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)가 보다 더 잘 접붙임(engraftment)된다. 또한, 상기 NSG 마우스는 대식세포와 수지상 세포에 결함을 가지고 있다. 최근의 발행 문헌들을 통하여 췌도 이식, 조혈모세포 및 암 줄기세포 연구에서 상기 종자(strain)의 탁월한 유용성이 입증되었다.
구체적으로, 상기 NSG 마우스는 Prkdc 유전자 또는 X-염색체 연관 Il2rg 유전자를 발현하지 않는다. NSG 마우스는 생존 가능하고, 수태가 가능하며(fertile), 정상적인 크기를 가지고, 신체적 또는 행동상의 비정상적 모습을 보이지 않는다.
림프 조직의 조직 검사 결과에 따르면, 림프성 세포의 부재와 흉선의 일부가 낭성 구조를 가지고, 지라에 모낭(follicles)이 없고 림프절의 현저한 감소가 나타난다. NSG 마우스는 성숙한 T- 및 B- 림프구가 결핍되어 있으며 혈청 Ig가 검출되지 않고 NK 세포의 세포 독성 활성이 매우 낮다. 이들 마우스는 준-치사적 조사를 통한 치료(sublethal irradiation treatment) 후에도 림프종 발생에 내성을 가진다. 이들 마우스는 인간 CD34+ 조혈모세포의 생육을 쉽게 지지하는 것으로 밝혀졌으며, 이종이식(xenotransplantation)의 전략을 이용하는 연구에 적합한 장기 생존(생존 기간 평균치가 89 주 이상)의 모델임이 밝혀졌다.
상기 NSG 마우스는 절단된 인터루킨-2 수용체 감마 사슬을 발현하는 다른 종자와 달리 진정한 null 인터루킨 -2 수용체 감마 사슬 돌연변이를 보유한다 (참조 Ohbo et al., Blood, 87:956-967, 1996). 상기 NSG 마우스는 물질 이동 협약(MTA)에 따라 비영리 연구 기관이 이용할 수 있으며, Jackson Laboratory는 미국 국립 보건원(NIH)과의 계약에 따라 NSG 마우스를 분배한다.
피검체인 인간화된 NSG 마우스 (HU-NSGTM)를 제작하기 위해 인간 CD34+ 조혈모세포와 같은 조혈모세포를, 예를 들어, Jackson Laboratory의 NSG 마우스에 꼬리 정맥 주사, 심장내 주사, 또는 간내 주사를 통하여 도입한다. 조혈모세포는 약 2 주, 3 주 또는 4 주 된 NSG 마우스에 도입될 수 있다. 통상적으로 25 게이지 바늘을 꼬리 정맥 주사에 사용할 수 있다. 작은 게이지 바늘도 사용할 수 있으며 잠재적으로 접종 세포에서 세포의 전단(shearing )이 증가 할 수 있다.
조혈모세포의 전달을 위한 대안 부위로는 후 안와 정맥동(retroorbital venous sinus), 골수강 자체 및 지라를 들 수 있다. 후 안와 정맥동 주사는 꼬리 정맥을 사용하는 것보다 수행하기는 쉽지만 침습적이며 받는 측 마우스를 마취해야 한다. 줄기세포의 골수로의 호밍은 줄기세포를 골수로 안내하는 기질 유래 인자 1(stromal-derived factor 1)과 줄기세포 인자와 같은 분자들에 의존한다. 따라서, 줄기세포를 혈액 순환 (또는 골수 내로 정위적(orthotopically))으로 전달하면 세포가 새로운 숙주의 골수에 거주할 가능성이 높아진다.
선택적으로, 조혈모세포의 도입 직전에, 상기 NSG 마우스는 골수 절제술(myeloablation)을 위해 전신 또는 전신 방사선 조사 (TBI)에 노출되며, 이를 위해 NSG 마우스에, 동물을 일시적 또는 만성적으로 면역 억제 시키도록 설계된 전신 감마선 조사량을 사용하여 NSG 마우스를 특별히 설계된 방사기에 배치함으로써 성취할 수 있다.
NSG 마우스에서 인간 면역계의 생존이 성공적으로 되려면 이식편대숙주 거부 반응(host-vs-graft(HVG) rejections)을 예방하기 위한 방편으로 숙주 면역계를 억제할 필요가 있을 수 있다. 숙주의 면역계를 억제하는 것 외에도, 방사선 조사는 또한 숙주 전구 세포의 골수 틈새(niche)를 없애는 데 도움이 되며, 이로 인해 제공 줄기세포의 접붙임(engraftment)을 위한 공간을 허용한다. NSG 마우스에 대하여 본 준비는 일반적으로 전신 감마 조사를 통해 이루어진다. 방사선 조사기는 의도하는 용도에 따라 크기가 다를 수 있다. 소형 조사기(예; Mark-I 조사기; JL Shepherd and Associates, San Fernando, CA)는 냉장고 크기를 가지며 일반적으로 양쪽 세포와 적은 수의 마우스를 조사(irradiate)하는 데 사용된다. 한편, 일반적으로 사용되는 대형 (6600 lb) 감마 조사기 (the Gammacell-40, MDS Nordion, Ottawa, ON)는 한 번에 수십 마리의 마우스를 조사하는 데 사용할 수 있다. 동물은 일반적으로 짧은 시간 (15 분 미만) 동안 조사된다. 조사기 내에 체류되는 시간은 방사성 동위 원소의 붕괴 차트, 필요한 조사량 및 이온화 에너지원(즉, X 선 대 감마선은 세슘 또는 코발트 공급원이 필요함)이다. 필요 시 Clinac 4/80 선형 가속기 (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA)와 같은 대형 조사기를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 상기 마우스는 조사를 위해 마취할 필요가 없다.
골수 제거용 방사선 조사량은 보통 700 ~ 1300 cGy이며, 일부 구현예에서, 1-100 cGy (예, 약 2, 5, 또는 10 cGy), 또는 300-700 cGy와 같이 더 낮은 조사량이 사용될 수도 있다. 세슘 또는 X 선 조사 일 수도 있다.
특정 구현예들에 있어서, 암컷 NSG 마우스는 마우스에 사람의 흉선과 간 조각을 외과적으로 이식한 후 공여자와 일치하는 인간 CD34+ 조혈 모세포 (인간화된 BLT NSG-마우스)를 주사한다. 이러한 인간화 된 BLT-마우스 (hu-BLT)는 현재의 모든 인간화된 마우스 모델의 가장 기능적인 면역계를 가지고 있으며, 점막기반의 면역 반응과 같은 특정 연구에서 뚜렷한 이점과 향상된 성능을 제공한다.
특정 구현예들에 있어서, 인간화를 위해 NSG 마우스를 사용하는 대신에 NSGS 또는 NSG-SGM3 마우스 (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ, Jackson Laboratory Stock No. 013062, 일반적으로 NOD-scid IL2Rgnull-3/GM/SF 로도 알려짐)를 사용할 수도 있다. 다중 대립형질(multi-allelic) 마우스 라인은 면역 결핍 배아 환경과 인간 골수 세포 확장(myeloid cell expansion)을 지원하는 몇 가지 형질 전환 인간 사이토카인의 존재를 결합하며 특히 이종이식의 호스팅에 유용한 모델을 나타낸다. 특히, 이들 마우스는 3 개의 전이 유전자인 인간 인터류킨-3 (IL-3), 인간 과립구 대 식세포 (GM-CSF) 및 인간 줄기 세포 인자 (SF) 유전자를 보유하며, 이들 각 유전자는 인간 사이토 메갈로 바이러스 프로모터/인핸서 서열에 의해 가동된다. 이들 마우스는 NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ) 마우스 백그라운드에 유지되며 2-4 ng/mL 혈청 수준의 인간 IL-3, GM-CSF 및 SF를 항시 생산한다. Il2rg-/- 특이적 NOD.SCID 백그라운드는 인간 및 마우스의 조혈 세포 접붙임(engraftment)을 지원하고, 인간 적혈구 생성을 억제하고, 인간의 골수 형성을 촉진하며, 인간 골수 또는 태아 간 세포 이식 후 마우스의 인간 B-림프구 형성을 감소시킨다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 마우스는 인간 말초혈액 단핵세포들 (예, 상기 hu-PBMC NSG™ 마우스 또는 PBMC 인간화된 마우스)에 접붙임된다(engrafted).
특정 구현예들에 있어서, 단순화 목적으로 다양한 NSG 또는 NSG 유래 마우스종자(strains)는 통합적으로 NSG 마우스를 의미할 수 있다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 인간 CD34+ 조혈모세포는 NSG 마우스(또는 NSGS 마우스, 또는 BLT-NSG 마우스)가 생후 약 3주 경일 때 도입될 수 있으며, 성숙한 인간 B 세포는 약 12주 차에 나타나며 성숙한 인간 T 세포는 약 15주 차에 나타난다.
특정 구현예들에 있어서, 인간 CD34+ 접붙임된(engrafted) NSG 마우스 (또는 NSGS 마우스, 또는 BLT-NSG 마우스)는 조혈모세포의 접붙임(engraftment) 후 약 12 주 경에 상기 마우스의 말초혈액에 최소한 약 20%, 25%, 30% 또는 그 이상의 인간 CD45+ 세포를 가질 수 있다.
환자-유래 이종이식 (PDX)을 가지는 피검체인 인간화된 NSG 마우스 (또는 NSGS 마우스, 또는 BLT-NSG 마우스)를 제작하기 위해, 인간 CD34+ 조혈모세포에 의해 다시 채워지는(repopulated) NSG 마우스 (또는 NSGS 마우스, 또는 BLT-NSG 마우스)에 적당한 양의 환자 유래 세포(예; 1-10 ×106 개 인간 암세포)를 주사한다. 암세포의 인간 기원은 Ki67 염색으로 확인할 수 있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 PDX는 조혈모세포 접붙임(engraftment) 후 약 2 주 경에 상기 마우스에 도입된다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 PDX는 조혈모세포 접붙임(engraftment) 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 주 경에 상기 마우스에 도입된다. 특정 구현예들에 있어서, 접붙임된(engrafted) 인간 면역 세포 (예, 인간 B 세포 또는 T 세포 또는 NK 세포)가 나타나기 전에 상기 PDX를 상기 마우스에 도입한다.
특정 구현예들에 있어서, 상기 PDX의 HLA 유형은 공여자 인간 조혈모세포의 HLA 와 매칭되지 않는다.
실시예
본 명세서에 언급된 임의의 특허 또는 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 참조로서 본 명세서에 통합된다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 비인간 동물 (예, 마우스), 조성물 및 방법은 현재 특정 예시적인 구현예들을 대표하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 명세서 상 이들의 변경 및 기타 용도로서의 사용을 당업자가 고려할 수 있다. 이러한 변경 및 기타 용도로서의 사용은 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 성취할 수 있다.
실시예 1. 마우스
NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tml Wjl /SzJ (NOD-scid IL2rγnull, NSG) 마우스를 Jackson Laboratory 에서 개발 및 보존되는 콜로니들로부터 얻었다 (Bar Harbor, ME). 모든 동물들은 특정 병원균이 없는 시설, 마이크로 분리기 케이지에 수용 후 고압 증기 멸균 식품과 설파메톡사졸-트리메토프림(sulfamethoxazole-trimethoprim) 약용 물(Goldline Laboratories, Ft. Lauderdale, Fla.) 및 산성화된 고압 증기 멸균수를 격주로 공급하였다.
실시예 2. 마우스와 인간 조혈모세포(HSCs)의 접붙임(Engraftment)
생후 24 ~ 72 시간 된 (신생 마우스) NSG 마우스 군을 Pearson 등(Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21, 2008)에 기재된 바와 같이 100cGy로 조사한다. 방사선 조사 된 마우스에 3 ×104 개의 CD34+ 조혈모세포를 포함하는 CD3 T 세포가 고갈된 인간 제대혈 (UCB)(25-50 μL)을 Brehm 등(Clinic. Immunol.135(1):84-98, 2010)에 기재된 바와 같이 심장 내 주사(intracardiac injection)로 주사하였다. 12 주 후에 조혈모세포 수혈 마우스의 혈액에 대한 유동 세포 계측법 분석을 통하여 인간의 면역계의 접붙임(Engraftment)을 정량화한다. 실험적 연구를 위해서 >20%의 말초(peripheral) 인간 CD45+ 세포와 > 5% 의 인간 CD3 + T 세포가 사용된다.
유사한 방법으로 준-치사적 조사(sublethal irradiation)에 노출된 NSG 마우스도 ×104 개의 CD34+ 조혈모세포를 포함하는 CD3 T 세포가 고갈된 인간 제대혈 (UCB)(25-50 μL)을 Brehm 등(Clinic. Immunol.135(1):84-98, 2010)에 기재된 바와 같이 간 내 주사(intrahepatic injection) 또는 안면 정맥 주사(facial vein injection)를 통하여 주사할 수 있다.
더욱이, 약 3 주된 NSG 마우스 군은, 약 0.2-1×106 개의 CD34+ 조혈모세포를 표준 기술을 사용하여 측면 꼬리에 주사하기 전에, 약 200 내지 1300 cGy의 조사량으로 전신 준-치사적 조사에 노출될 수 있다. 예를 들어, 각 동물은 주사 전에 체중을 측정하고 각 주사마다 동물의 체중의 약 1%의 부피까지 투여할 수 있다. 주사 전에, 동물들을 5-10 분간 온열을 가하여(예, 시중에서 구입할 수 있는 보온 상자 또는 머리맡 열 램프(overhead heat lamp) 아래에서 사용하거나 케이지 아래에 놓은 따뜻한 물 순환 패드를 사용함) 정맥을 확장시킨다. 약하게 마취시킨 동물은 마취된 동안 이들을 따뜻하게 유지시키고자 충전식 열 팩 또는 순환되는 따뜻한 물 패드를 이들 동물 곁에 놓는다. 그 후, 작은 게이지 (28-30) 바늘을 바늘과 주사기를 꼬리에 평행하게 유지하면서 동물 머리의 방향을 향한 정맥에 베벨을 위로 하여 삽입한다. 바늘은 정맥으로 원활하게 진입되어야 한다. 주사 후, 동물들은 케이지에 넣고 출혈 재개 여부를 확인하기 위해 5-10 분 동안 관찰한다.
BLT(골수/간/흉선) 마우스 모델의 경우 약 1 mm3 입방의 태아 간 및 태아 흉선을 유기체(organoids)로서 이미 약 200 cGy의 전신 방사선 조사를 받은 숙주 NSG 마우스로 이식한다. 이후, 약 0.2-1×106 개의 CD34+ 조혈모세포를 표준 기술을 사용하여 측면 꼬리 정맥으로 주사한다. 상기 BLT 마우스 모델은 다수의 조혈 계통을 포함하고; 지속적이고 높은 수준의 T 세포 발달을 나타내는 강력하고 일관성있는 이종이식(xenograft) 면역 체계 개발을 가능하게 하며, 상기 T 세포는자가 흉선 조직에 대해 교육을 받게 된다. 이러한 마우스 모델은 전형적으로 바이러스 감염 (예, EBV 및 HIV)에 대한 검출 가능한 T 세포 반응 및 B 세포 반응을 가진다.
인간화된 NSG 마우스와 같은 임의의 적절한 인간화 마우스 모델에서, 환자-유래 이종이식 (PDX)이나 암 세포주는 인간 CD34+ 세포 주사 후 2 또는 12 주의 특정 시점에 접종된다. 상기 이종이식은 예를 들어 체중과 종양의 부피를 자주 모니터링하면서 약 7 주 동안 성장하게 할 수 있다 (예 : 일주일에 2 회).
마우스의 말초 혈액은 인간 CD45+ 공여자 세포 접붙임(engraftment)의 정도를 분석하기 위해 연구 말미에 수집할 수 있다. 바람직하기로는, 인간 CD45+ 공여 세포는 말초 혈액에서 적어도 약 20-30 %에 도달해야 한다.
실시예 3. 예상 PDX 성장률의 리캐피튤레이션(Recapitulation)은 HLA 유형 매칭을 필요로 하지 않음
NSG 마우스의 인간화는 실질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, 약 3 주령의 NSG 마우스 군은, 약 0.2-1×106 개의 CD34+ 조혈모세포를 표준 기술을 사용하여 측면 꼬리 정맥을 통하여 주사하기 전에, 전신 조사(약 200cGy)에 노출되었다. PDX 이종이식 3가지 상이한 암 샘플들(유방암 세포 BR0620, 폐암 세포 LG1208 및 방광암 세포 BL0440)을 피검체인 인간화된 NSG 마우스 모델에 피하 이식한 것이다. 즉, 기반이 잡히고 기능적으로 성숙한 인간 면역 세포를 가진, HLA가 미스 매치된 인간 조혈모세포 공여자로부터 유래된 hu-CD34 NSG 마우스 및 PDX 접붙임(engraftments)의 성장을 PDX 접붙임(engraftments) 후 약 55일까지 모니터링하였다. 3 가지 종양 모두 강력한 성장을 보였으며 거부 반응이 분명하지 않았다 (도 1).
상기 결과는 피검체인 인간화된 NSG 마우스 모델에서 예상 PDX 성장율을 리캐피튤레이트(recapitulate)하기 위해서 HLA 유형을 매칭하는 것이 요구되지 않음을 보여준다.
실시예 4. Hu-CD34 NSG TM 마우스의 종양 성장에 대한 PDX 접붙임(Engraftment)의 일시적 평가
HLA 비매칭 인간화된 hCD34+ NSG 마우스에서 PDX 이종이식(xenograft) 종양 성장에 대한 임의의 일시적 효과를 평가하기 위하여, 상기 실시예 2 와 실시예 3에 기재된 바에 따라 HLA 비매칭 인간화된 CD34+ 주사 후 2 주 또는 12 주에 약 5×106 개의 인간 SKOV3 난소암 세포를 상기 NSG 마우스에 접종하였다. 이종이식은 체중과 종양 양을 일주일에 2 회씩 모니터링하며 약 7 주 이상 성장하게 하였다. 마우스의 말초 혈액은 인간 CD45+ 공여자 세포 접붙임(engraftment)의 정도를 분석하기 위하여 연구가 끝날 무렵에 수집하였다. 각각 7 례씩 두 그룹(2 주 vs. 12 주)의 평균 결과를 도 2에 나타내었다.
접붙임(engraftment) 후 2 주 시점에 인간 면역은 아직 발생하지 않았다. 실제로, 성숙한 T 세포와 B 세포는 적어도 12 주 이내에 hu-CD34 NSG 마우스의 PBL에서 검출 가능해야 한다. 그러나, 종양 접붙임(engraftment) 연구에 있어서, 종양 발생(tumor take)은 두 그룹 모두에서 100% 였고 (두 경우 모두 N = 7), 2 주군에서의 시간 경과에 따른 종양 체적의 증가는 12 주군보다 다소 앞섰다 (도 2).
상기 결과는 두 그룹의 마우스 간에 유의한 차이가 없음을 보여주었고 이는 인간화에 비해 암세포주 접붙임(engraftment)의 시기가 SKOV3 난소암 세포의 성장에 (혹, 있다 하더라도) 중대한 영향을 가지지 않음을 의미한다.
암세포 접종 50일 후에 상기 마우스를 인간 조혈 키메리즘(hematopoietic chimerism)에 대해 시험하였고, 모두 PBL에서 25-50 %의 huCD45+ 세포를 보임으로써 성공적 접붙임(engraftment)임을 확인하였다(도 3). 상기 결과는 암세포주 접붙임(engraftment)의 시기가 CD45+ 세포 집단, HLA 비매칭 인간화된 NSG PDX 모델에서 (혹, 있다 하더라도) 중대하지 않은 영향을 가진다는 것을 보여 주었다.
실시예 5. 인간화는 PDX 성장 동역학에 중대한 영향을 미치지 않음
상기 실험들로부터 제시된 중요한 의문점은 인간 면역 세포의 존재가 정상적이고 비인간화된 NSG 마우스에서 이들의 성장 속도와 비교할 때 종양 성장 속도에 영향을 주었는지의 여부이다.
NSG 마우스 모델에서의 인간화가 HLA 비매칭 PDX의 성장 동력에 중요한 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 3 종류의 신선한 PDX 종양 샘플들(유방암 BR0744 (도 4A), 폐암 LG0977 (도 4B) 및 연조직 육종 SA0209 (도 4C))을 각각, 상기에 기재된 방법들과 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 NSG 마우스 모델 또는 상기 huCD34-인간화된 NSG 마우스 모델에 독립적으로 나란히 접붙임(engrafted)한 후, 상기 PDX 성장 곡선을 측정 및 플롯하였다.
NSG 및 인간화된 NSG 모델 모두에서 세 가지 종양 모두에서 발생 비율(take rate)이 100 % 였고 종양이 접붙임된(engrafted) 각 숙주에서 발생했다. 유방 종양 만이 NSG 대비 hu-CD34 NSG 수용체보다 약간 빠른 속도로 성장하였고 (도 4A); 다른 두 종양은 양쪽 숙주 모두에서 동일한 성장율을 보였다 (도 4B 및 4C). 그러나, 전체적으로 상기 PDG 종양에 있어서, NSG 대비 hNSG 모델의 종양 성장 곡선은 접붙임(engraftment) 후 40-70 일간의 실험 기간 전체에 걸쳐 유의한 차이가 없었다.
모든 hNSG 실험군에서, 말초혈액 내의 hCD45+ 세포들은 20%를 초과하였으며, 이는 인간화가 성공적이었음을 제시한다. 또한, 도 5A 내지 5C를 보면, 상기 비인간화된 NSG 마우스에서 hCD45+ 세포가 관찰되지 않음을 보여 준다.
상기 종양 연구 종료 시점에, 종양들을 수집하여 종양 침윤 임파구(TILs)의 존재여부를 유세포 분석법으로 분석하였다. 세 종류의 종양 모두 인간 CD4+ 및 CD8+ 의 T 세포들을 포함하였으나, CD19+ B 세포는 거의 검출되지 않았다 (참조, 도 6A-6C). 어떤 특정 이론에 구속된 것은 아니지만, 종양 침윤 임파구(TILs)가 hu-CD34 NSG 수용체에서 종양의 성장을 지연시키지 못하는 것은 종양을 인지한 T 세포가 무력화되었음(anergic)을 시사한다.
종합적으로 볼 때, 이들 결과는 hu-CD34 NSG 마우스가 HLA 비매칭 종양의 성장을돕는다는 것과 인간 면역세포의 존재가 종양 발생(tumor take) 또는 성장율에 중요한 영향을 미치지 않음을 보여준다.
실시예 6. Hu-CD34 NSG TM PDX 마우스는 약물의 효능 평가에 기능적 플랫폼 역할을 함
상기에서 입증된 바와 같이, 상기 인간화된 NSG 마우스가 HLA 비매칭 인간 종양의 성장을 돕는다는 것은 전임상 시험 플랫폼의 개발에 있어서 중요한 발견이었다.
HLA 비매칭 PDX를 가진 피검체 Hu-CD34 NSGTM 마우스가 PDX에 대한 약물 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는지를 임상적으로 관련된 치료기준(standard-of-care; SOC)를 이용하여 확인하기 위하여, 대장암 CN1572P5 PDX에 대하여 음성군/대조군 및 두 처리군(5-FU 및 Avastin로 각각 처리)에 대하여 21일간 기간에 대해 종양 성장 곡선을 구했다. 특히, 5-FU는 20 mg/kg/체중(Q7d×2; 7일 간격으로 총 2회 투여)의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다. Avastin는 10 mg/kg/체중(주 2회, 총 5회 투여)의 투여량으로 복강내 주사로 투여하였다. 대조군(vehicle, D5W)은 Q7d×3의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다.
도 7A 및 7B의 결과는 5-FU 및 Avastin가 모두 HLA 비매칭 인간화된 NSG 모델에서 대장암 PDX에 대하여 효과적임을 보여 준다. 이는 상기 피험체 HLA 비매칭 Hu-CD34 NSG PDX 모델이 임상적으로 관련된 치료기준(standard-of-care; SOC) 약물의 효능을 평가하기 위한 기능성 플랫폼임을 입증한다.
실시예 7. 키트루다(Keytruda) 및 시스플라틴(Cisplatin)이 Hu-CD34 NSG TM 에서 유방암 종양 모델 PD-L1 + MDA-MB-231의 성장을 저해함
프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1 및 CD279로도 알려짐)은 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 (Ig) 수퍼 패밀리의 CD28 계열에 속하는 면역 저해 세포 표면 수용체로서 T 세포, 프로-B 세포, 단핵 세포, NK 세포 및 많은 종양 침윤 림프구(TILs)에서 발현된다. PD-1은 T 세포 반응을 억제하는 "관문(checkpoint)" 수용체로서, T 세포 기능을 조정하는 핵심 역할을 한다.
PD-1은 두 리간드(PD-L1 및 PD-L2)에 결합하며, 이들 모두는 종양 세포에서 발견되고, 이들 모두는 종양세포가 활성화된 T 세포 상의 PD-1 수용체에 관여하여 활성화된 T 세포의 기능을 억제하게 하고, 이로 인하여 종양세포에 대한 면역반응을 회피하게 한다. 따라서, PD-1 및 이의 리간드들은 T 세포의 활성화를 방해함으로써 면역계를 하향조절(down regulating)하는 중요한 역할을 하며, 이로 인하여 암에 대한 면역반응을 하향조절(down regulating)할 뿐 아니라, 또한 자가면역 및 자체 내성(self-tolerance)을 촉진한다. PD-1의 억제 효과는 조절 T 세포 (억제 T 세포)에서 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)를 감소시킴과 동시에 림프절의 항원 특이적 T 세포에서 세포사멸을 촉진하는 이중 메카니즘을 통해 달성되는 것으로 생각된다
PD-1를 차단하는 새로운 클라스의 약물인 PD-1 억제제들은 면역 체계를 활성화시켜 종양을 공격하므로 암 치료에 유용하다. 예를 들면, PD-1에 대한 모노클론 항체는 면역계를 증강시켜 암 치료에 유용하다. 또한, 많은 종양세포들은 면역억제 PD-1 리간드인 PD-L1를 발현한다. 따라서, PD-1 및 PD-L1사이의 상호작용을 억제하면 실험실 내 T 세포 반응을 증진시키고 전임상적 항종양 활성을 매개한다.
이러한 항-PD-1 항체 약물의 하나인 니보루맙(nivolumab; Opdivo - Bristol Myers Squibb)은 총 296명의 환자를 대상으로 한 임상연구에서, 비소세포 폐암, 악성 흑색종 및 신장세포 암에서 완전하거나 부분적인 반응을 보였다. 니보루맙(nivolumab)은 또한 PD-1 수용체들을 표적화하며, 전이적 악성 흑색종을 치료하는 약물로서 2014년 7월에 일본에서 2014년 12월에 미국 FDA에 의하여 각각 승인되었다.
또 다른 항-PD-1 항체 약물로서 펨브롤리주맙(pembrolizumab; 키트루다(Keytruda), MK-3475, Merck)은 PD-1 수용체들을 표적화하며, 전이적 악성 흑색종의 치료 약물로서 2014년 9월에 미국 FDA에 의하여 승인되었다. 펨브롤리주맙(pembrolizumab)은 영국 및 영국 조제약에 대한 조기 접근(EAMS)에서 2015년 3월에 진행성 악성 흑색종에 접근이 가능하게 되었다. 또한 폐암 및 중피종(mesothelioma)의 미국 임상 시험에도 사용되고 있다.
PD-1 수용체를 표적으로하는 초기 단계의 다른 약물로 피딜리맙(Pidilizumab;CT-011, Cure Tech), BMS 936559 (Bristol Myers Squibb) 및 MPDL328OA (Roche)가 있다.
또 한편, 시스플라틴(cisplatin)은 백금 함유 항암 화학 요법 약물의 최초 약물로서 카르보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)을 또한 포함한다. 이들 백금 복합체들은 생체 내에서 반응하여 DNA에 결합 및 가교를 야기함으로써 궁극적으로 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)를 일으킨다.
접붙임된(engrafted) PDX 종양들이, 상주(resident) 인간 면역세포에서, 임상적으로 관련된 면역-종양학 관문 억제제들(immuno-oncology checkpoint inhibitors)에도 반응하는지 또는 상기 관문 억제제들이 항-종양 반응을 재활성화시키는지의 여부를 알아보기 위하여 이들 문제를 해결하고자 일련의 실험을 디자인한 후 해당 실험을 수행하였다.
우선, 관문 억제제 펨브롤리주맙(pembrolizumab; 키트루다(Keytruda))이 상기 피검체 HLA 비매칭 PDX 인간화된 NSG 모델에서 효능이 있는 지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명의 방법들에 따라 PDX huNSG 모델을 제작하였다. 특히, 인간화된 NSG 마우스 (인간 CD45+ 세포가 상기 hNSG 마우스의 말초혈액에서 25% 이상이므로 huCD34 접붙임(engraftment)이 성공적임이 밝혀짐)를 각 마우스 당 HLA 비매칭 PD-L1-양성 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포 5×106 개를 피하 마트리젤(s.c. matrigel) 접종을 통하여 접붙임(engrafted)하였다. 상기 세포주는 종양 세포 표면에서 높은 수준의 PD-L1을 발현하며, PD-L1은 T 세포 상의 PD-1에 결합하여 면역무력화(anergy)를 유도한다(PD-L1을 발현한 MDA-MB-231 세포의 약 94.3% ). 상기 종양 접붙임된(engrafted) 인간화된 NSG 마우스는 이후 대조군, 시스플라틴, 또는 펨브롤리주맙(키트루다)로 처리된다.
상기 유방암 세포주 MDA-MB-231 PDX에 대하여 음성군/대조군 및 두 처리군(시스플라틴 및 펨브롤리주맙(키트루다)로 각각 처리)에 대하여 21일간 기간에 대해 종양 성장 곡선을 구했다. 특히, 시스플라틴은 2 mg/kg/체중(Q7d×2; 7일 간격으로 총 2회 투여)의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다. 펨브롤리주맙(키트루다)은 5-10 mg/kg/체중(Q5d×4;5일 간격, 총 4회 투여)의 투여량으로 복강내 주사로 투여하였다. 대조군(식염)은 Q5d×4의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다.
시스플라틴은 백금을 함유하는 화학요법제로서 DNA 가교와 급격히 분열하는 세포에서 세포사멸을 야기한다. 시스플라틴의 처리는 상기 인간화된 마우스에서 상기 MDA-MB-231 종양의 성장율을 단지 약간(marginally) 감소시켰다. 반면에, 키트루다는 시스플라틴 처리 후 약 2 주 이내에 상당한 종양 성장의 지연을 보여 주었다 (도 8A 및 8B).
상기 성장 연구의 종료 시점에, 실험 마우스들의 말초혈액을 수집한 후 인간 CD19+ B 세포 및 인간 CD4+ T 세포와 CD8+ 의 T 세포를 분석하였다. 도 9A 내지 9D는 CD3+CD4+ T 세포들 및 CD3+CD8+ T 세포들을 포함하는 인간 T 세포와 CD19+ B세포가 상기 피검체인 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 MDA-MB-231 PDX 마우스의 말초혈액에 존재함을 보여 주고 있다.
또한 종양들을 수집한 후 인간 CD4+ 및 CD8+ 침윤(infiltrating) T 세포들을 분석하였다. 도 10A 내지 10C는 인간 T 세포(CD3+CD4+ T 세포들 및 CD3+CD8+ T 세포들을 모두 포함)는 상기 피검체인 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 MDA-MB-231 PDX 마우스의 종양 조직에 존재함을 보여 주고 있다.
따라서 세 치료군 모두 치료에 관계없이 이들 세포가 비슷한 비율을 보였다. 키트루다로 치료한 종양에서 종양 침윤 임파구(TIL)가 없다는 것은, 종양 성장이 느려진 이유가 PBL 또는 지라에서 TIL 침윤의 추가 자극으로 인한 것이 아니라 상주하는(resident) 종양 침윤 임파구(TIL)의 재-활성화로 인한 것임을 암시한다.
상기 데이터는 상기 피검체인 Hu-CD34 NSG PDX 모델이 상기 접붙임된(engrafted) 인간 면역 세포들의 기능에 의존하는 면역 조절 약물들을 포함하여, 약물들의 효능을 평가하기 위한 기능적 플랫폼임을 입증한다.
실시예 8. 키트루다(Keytruda) 및 시스플라틴(Cisplatin)은 Hu-CD34 NSG TM 에서 유방암 종양 모델 PD-L1 + TNBC BR1126의 성장을 저해함
HLA 비매칭 PD-L1-양성 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포를 상기 HLA 비매칭 PD-L1-양성 유방암 세포주 BR1126 (3중 음성 유방암 (triple negative breast cancer; TNBC) 세포주)와 대체한 본 실시예에서는 상기 실시예 7에서 얻은 결과와 실질적으로 동일한 결과를 얻었다. 3중 음성 유방암은 제한된 치료 옵션을 가진 유방암의 공격적인 서브세트(subset)이다. TNBC 환자에서 PD-L1의 발현이 보고되어 왔다. PD-L1의 발현이 종양 침윤 임파구(TIL)에서 평가되었을 때, 이는 더 상위 급(higher grade)이며 크기가 더 큰 종양과 관련되어 있었다. 종양 PD-L1의 발현은 또한 3중 음성 유방암 (TNBC)에서 T 조절세포의 침윤과 관련되어 있음이 발견되었고, 이는 3중 음성 유방암 (TNBC)에서 면역반응 조절과 관련하여 PD-L1을 발현하는 종양들 및 PD-1/PD-L1을 발현하는 종양 침윤 임파구(TIL)의 역할을 암시한다.
특히, 각 마우스 당, 인간화된 NSG 마우스를 5×106 개의 HLA 비매칭 PD-L1-양성 유방암 세포주 BR1126 세포와 피하 접종(s.c. inoculation)을 통하여 접붙임하였다(engrafted). 상기 방법은 마트리젤(matrigel)의 존재 하에 수행할 수 있다. 상기 BR1126 세포의 약 56.9% 가 PD-L1을 발현하였다. 인간 CD45+ 세포는 상기 hNSG 마우스의 말초혈액에 25% 이상 포함되어 있음이 밝혀졌다.
상기 유방암 BR1126 PDX에 대하여 음성군/대조군 및 두 처리군(시스플라틴 및 펨브롤리주맙(키트루다)로 각각 처리)에 대하여 21일간 기간에 대해 종양 성장 곡선을 구했다. 특히, 시스플라틴은 2 mg/kg/체중(Q7d×2; 7일 간격으로 총 3회 투여)의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다. 펨브롤리주맙(키트루다)은 5-10 mg/kg/체중(Q5d×4; 5일 간격, 총 4회 투여)의 투여량으로 복강내 주사로 투여하였다. 대조군(식염)은 Q5d×4의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다.
도 11A 및 11B의 결과는 시스플라틴 및 키트루다가, 상기 피검체인 인간화된 NSG 모델의 상기 HLA 비매칭 PD-L1+ 유방암 PDX에 있어서, 비히클 대조군에 비해 현저히 종양 성장을 감소시킴을 보여 준다.
도 12A 내지 12D 는 CD3+CD4+ T 세포들 및 CD3+CD8+ T 세포들을 포함하는 인간 T 세포와 CD19+ B세포가 상기 피검체인 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 말초혈액에 존재함을 보여 주고 있다.
상기 연구의 종료 시점에 키트루다(Keytruda)로 처리된 마우스의 종양들을 수집한 후 림프구 침윤(lymphocyte infiltration)을 분석하였다. 도 13A 내지 13D는 인간 T 세포(CD3+CD4+ T 세포들 및 CD3+CD8+ T 세포들을 모두 포함)가 상기 피검체인 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 종양 조직에 존재함을 보여 주고 있다. 따라서, 암세포주 실험에서와 같이, 상기 종양들은 또한 인간 B 세포들뿐 아니라 인간 CD4+ T 세포들 및 CD8+ T 세포들을 침윤하였고, 키트루다(Keytruda) 처리는 대조군으로 처리된 마우스와 비교하여 종양의 침윤을 증가시키지 않았으므로, 종양 성장의 지연은 상주(resident) 면역 효과 세포(effector cells)의 재-활성화에 기인한 것임을 역시 암시한다.
도 13E 내지 13H 은 인간 T 세포(CD3+CD4+ T 세포들 및 CD3+CD8+ T 세포들을 모두 포함)가 상기 피검체인 Hu-CD34 NSGTM HLA 비매칭 BR1126 PDX 마우스의 지라에 존재함을 보여 주고 있다.
유사한 실험에서, 화학요법 단독 처리 및 항-PD1제 키트루다(Keytruda) 및 항-CTLA4 제 이필리무맙(ipilimumab)으로 처리된 PDX 종양 샘플들에 대하여 면역 염색을 수행하여 CD45+CD8+ 침윤 T 림프구의 존재 여부를 확인하였다. 도 16은 항-PD1제 키트루다(Keytruda) 및 항-CTLA4 제 이필리무맙(ipilimumab)을 이용한 처리는 화학요법 단독 처리와 비교하여 CD45+CD8+ 침윤 T 림프구가 더 강력히 존재함을 보여주고 있다.
이 또한 상기 피검체인 Hu-CD34 NSG PDX 모델이 상기 접붙임된(engrafted) 인간 면역 세포들의 기능에 의존하는 면역 조절 약물들을 포함하여, 약물들의 효능을 평가하기 위한 기능적 플랫폼임을 입증한다.
실시예 9. 키트루다(Keytruda) +/- 도세탁셀(Docetaxol)은 Hu-CD34 NSG TM 에서 폐암 종양 모델 PD-L1 + LG1306의 성장을 저해함
본 실험은 hu-CD34 NSG 마우스에서 종양을 각 약제를 단일 처리 요법과 대비하여 이들의 병용처리 시 더 큰 효능을 보이는 지 여부를 확인하고자 수행되었다.
HLA 비매칭 PD-L1-양성 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포 또는 BR1126 세포를 HLA 비매칭 PD-L1-양성 폐암 세포주 LG1306로 대체한 본 실시예에서는 상기 실시예 7 및 8에서 얻은 결과와 실질적으로 동일한 결과를 얻었다.
구체적으로는, 각 마우스 당 인간화된 NSG 마우스를 HLA 비매칭 PD-L1-양성 PDX 폐암 세포주 LG1306로 접붙임하였다(engrafted). 상기 LG1306 세포의 약 89.1% 가 PD-L1를 발현하였다. 인간 CD45+ 세포는 상기 hNSG 마우스의 말초혈액에 20% 이상 존재함이 밝혀졌다.
상기 폐암 LG1306 PDX에 대하여 음성군/대조군 및 두 처리군(펨브롤리주맙(키트루다) 와 항- 유사분열 화학요법제인 도세탁셀 포함 또는 미포함 처리)에 대하여 24일간 기간에 대해 종양 성장 곡선을 구했다. 특히, (적용 시) 도세탁셀은 10 mg/kg/체중(Q7d×4; 7일 간격으로 총 4회 투여)의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다. 펨브롤리주맙(키트루다)은 5 mg/kg/체중(Q5d×6; 5일 간격, 총 6회 투여)의 투여량으로 복강내 주사로 투여하였다. 대조군(식염)은 Q5d×6의 투여량으로 정맥내 주사로 투여하였다.
키트루다 단독 처리된 마우스의 종양들은 대조군으로 처리된 종양들에 비해서 감소된 성장을 보였으나, 이들 반응은 10 마리 중 1 마리는 키트루다에 대한 반응을 보이지 않는 등 그 편차가 상당히 심했다. 키트루다를 도세탁셀과 병용처리 시, 종양의 성장은 처리 후 10일 이내에 상당한 억제를 보였고, 이러한 결과는 마우스 마다 또는 종양 마다 별다른 차이가 없었다. 키트루다에 대한 반응을 보이지 않았던 마우스를 계산에서 제외하였을 때, 키트루다 및 병용 처리 수단(combination arms) 사이에 아무런 차이가 없었다. 두 수단(arms) 모두 종양 성장에 상당한 감소를 보여 주었고, 키트루다와 도세탁셀을 병용처리 시 합산적 효과는 관찰되지 않았다.
따라서, 도 14A 및 14B에서 보여주는 결과는 펨브롤리주맙(키트루다)를 도세탁셀을 포함하거나 포함하지 않고 처리하였을 경우 모두에서 상기 피검체인 인간화된 NSG 모델의 상기 HLA 비매칭 PD-L1+ 유방암 PDX에 효과적임을 나타낸다.
종합적으로, 본 명세서에 기재된 실험들, 특히 실시예 6 내지 9의 실험들은 hu-CD34 NSG 마우스에 접붙임된(engrafted) 인간 종양들은 치료 기준(SOC) 화학요법에 반응할 수 있음을 입증한다. 그러나, 보다 더 획기적인 발견은 접붙임된(engrafted) 종양들이 마치 이들이 유래된 환자들에서 이들 종양이 면역(immunity)을 회피하듯 동일하게 회피하는 것으로 보인다. 더우기, 종양 침윤 임파구(TIL) 관문 억제제로 처리 시 T 세포를 무력화(anergy)하여 이들 T 세포의 종양에 대한 세포독성을 자극하는 것으로 생각된다.
이들 데이터는 상기 hu-CD34 NSG 마우스가 인간 면역세포들과 종양 사이의 상호 작용에 대하여 면역-종양학 및 병용 처리요법의 시험을 위한 새로운 통찰력을 부여하는 강력한 플랫폼임을 입증한다.
전체적으로, 실시예에서 보여주고 있는 상기 결과들은 상기 피검체인 인간화된 마우스 (예, NSG 마우스)에서 상기 접붙임(engraftment) 및 PDX 종양들의 성장, 상기 접붙임된(engrafted) 마우스의 처리 기준(SOC)에 대한 반응들 및 관문 억제제의 처리에 따른 면역-매개 종양 퇴행(immune-mediated tumor regression)을 입증하고 있다. 이들 결과들은 상기 피검체인 인간화된 마우스(예, NSG 마우스)가 면역-종양학적 처리요법에 있어서 새로운 전임상적 가교 역할을 할 수 있음을 뒷받침한다.
본 명세서에 인용된 특허 문헌을 포함하는 모든 문헌은 참고 문헌으로 인용된다.

Claims (23)

  1. 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스에 있어서, 상기 마우스는:
    (1) scid 돌연변이에 대하여 동형접합성이고;
    (2) IL-2 수용체 감마 사슬 결핍을 가지고;
    (3) CD34+ 인간 조혈모세포(HSC)로 이식되고;
    (4) HSCs 접붙임 이후 9주 후에 말초 혈액에 20% 내지 30% 에 이르는 CD45+ 인간 공여자 세포를 포함하고;
    (5) 마우스 HSCs를 고갈시키거나 억제하도록 컨디셔닝되어 있으며,
    (6) 인간 환자-유래 이종이식(PDX)으로 접종되며;
    상기 HSCs 및 상기 PDX는 HLA가 비매칭되는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 마우스는 인간 흉선 및 간 단편들로 추가적으로 외과적으로 이식된 암컷 NSG 마우스인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 마우스는 인간 인터류킨-3 (IL-3), 인간 과립구/대식세포-자극인자 (GM-CSF) 및/또는 인간 줄기세포 인자 (SF)를 항시(constitutively) 발현하는 전이 유전자들을 추가로 포함하는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 scid 돌연변이는 Cg-Prkdc scid 인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍은 Il2rg tm1Wjl 인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍은 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (즉, NOD scid 감마 (NSG))인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSC는 꼬리 정맥 주사를 통하여 접붙임되는(engrafted) 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSC는 생후 3 주의 마우스에 이식되는(engrafted) 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 CD34+ 인간 HSC는 상기 마우스의 전신을 조사한 후에 접붙임되는(engrafted) 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 인간 PDX 는 상기 마우스에 상기 CD34+ 인간 HSCs를 이식(engrafted) 후 2주 후에 상기 마우스에 접종하는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 인간 PDX 는 상기 마우스에 상기 CD34+ 인간 HSC를 이식(engrafted) 후 12주 후에 상기 마우스에 접종하는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 인간 PDX는 1차(primary) 환자의 샘플인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 인간 PDX는 최소한 한 세대 동안 이종이식으로서 계승된 보관된 종양 샘플인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 인간 PDX는 난소암, 폐암, 방광암, 림프종, 유방암, 뇌암, 췌장암, 전립선암, 대장암, 직장암, 자궁내막암, 위/위장관 기질암, 간세포암, 신장암, 피부암, 연조직 암종, 육종, 또는 암세포주의 이종이식인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  15. 제 1항에 있어서, 5×106 개 세포의 상기 인간 PDX를 접종하는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 마우스의 말초 혈액에 있는 인간 CD45+ 세포의 백분율은 PDX 접종 후 50일 후에 20 내지 30%에 이르는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 마우스는 항암 화합물이 투여되는 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 항암 화합물은 5-FU, 아바스틴(Avastin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 키트루다(keytruda), 도세탁셀(docetaxel), 또는 이들의 조합인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 마우스는 상기 IL-2 수용체 감마 사슬 결핍에 대하여 동형접합 또는 이형접합인 것인, 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스.
  20. 환자-유래 이종이식을 가지는 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스를 제작하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (1) 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스에 CD34+ 인간 조혈모세포(HSC)를 주입하고; 여기서 상기 마우스는 :
    (a) scid 돌연변이에 대하여 동형접합성이고;
    (b) IL-2 수용체 감마 사슬 결핍을 가지며;
    (c) 마우스 HSCs를 고갈시키거나 억제하도록 컨디셔닝되어 있으며; 및
    (d) HSCs 접붙임 이후 9주 후에 말초 혈액에 20% 내지 30% 에 이르는 CD45+ 인간 공여자 세포를 포함하고
    (2) 상기 마우스를 인간 환자-유래 이종이식(PDX)을 접종하는 것을 포함하며,
    여기서 상기 HSCs 및 상기 PDX는 HLA가 비매칭되는 것인, 환자-유래 이종이식을 가지는 인간화된 면역결핍 비-비만성 당뇨병 마우스를 제작하는 방법.
  21. 다수의 항종양 치료제에 대하여 약효성 순위 순서를 예측하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (1) 상기 다수의 항종양 치료제의 하나를 단일 치료제로서 제 1항의 마우스에 투여하여 약효성을 결정하고, 여기서 상기 PDX는 종양을 나타내며;
    (2) 상기 다수의 항종양 치료제의 각각에 대하여 약효성을 비교 및/또는 순위를 정하여, 상기 종양 치료용 상기 다수의 항종양 치료제에 대한 약효성 순위 순서를 결정하는 것인,다수의 항종양 치료제에 대하여 약효성 순위 순서를 예측하는 방법.
  22. 둘 또는 그 이상의 후보 치료제를 이용하여 종양을 치료하는 병용 요법을 테스트하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (1) 상기 둘 또는 그 이상의 후보 치료제를, 단일 제제들 또는 병용 제제로서, 제 1항의 마우스에 투여하여 약효성을 결정하고, 여기서 상기 PDX는 상기 종양을 나타내며; 및
    (2) 상기 병용 제제에 대한 약효성 및 상기 단일 제제에 대한 약효성을 비교하며, 여기서, 상기 단일 제제들의 합산 약효성과 대비하여 병용 제제의 약효성이 높은 경우 상기 병용 제제가 우수한 것임을 나타내는 것인, 둘 또는 그 이상의 후보 치료제를 이용하여 종양을 치료하는 병용 요법을 테스트하는 방법.
  23. 제제를 이용하여 종양을 치료하는 투약 요법의 약효성 및/또는 안전성을 결정하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (1) 제 1항의 마우스에 상기 제제를 투여하고, 여기서 상기 PDX는 상기 종양을 나타내고, 상기 제제는 상기 투약 요법에 따라 투여되며; 및
    (2) 약효성 및/또는 안전성을 결정하는 것인, 제제를 이용하여 종양을 치료하는 투약 요법의 약효성 및/또는 안전성을 결정하는 방법.
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