KR20230074758A - 면역 세포 요법을 평가하기 위한 인간화 마우스 모델 - Google Patents

면역 세포 요법을 평가하기 위한 인간화 마우스 모델 Download PDF

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Abstract

조작된 면역 세포 요법의 투여가 시토카인 방출 증후군을 도출할 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위한 및/또는 항-질환 요법의 효능을 결정하기 위한 인간화 마우스 모델 및 방법이 본원에 제공된다. 추가로, 본원에 제공된 모델은 상이한 항-CRS 요법의 효능을 시험하는 데 사용될 수 있다.

Description

면역 세포 요법을 평가하기 위한 인간화 마우스 모델
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2020년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 63/083,003, 및 2020년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 63/083,016을 우선권 주장하며, 상기 가출원 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
입양 세포 요법 (ACT), 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역 세포 요법 (예를 들어, CAR T 세포 요법 또는 CAR-자연 살해 세포 (CAR-NK) 요법)은 혁신적인 새로운 암 치료법이 되었다. 그것은 혈액 악성종양에 대한 효과적인 새로운 치료법으로 입증되었으며 현재 고형 종양 암을 치료하기 위해 개발되고 있다. ACT는 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 재프로그래밍하고, 이는 유전자 전달을 활용하여 면역 세포 (예를 들어 T 세포, B 세포, 및/또는 자연 살해 (NK) 세포)가 질환에 걸린 세포, 예컨대 종양 세포에 특이적인 세포 표면 항원을 인식하고 표적화 (결합)하며, 추가로 상기 항원을 운반하는 질환에 걸린 세포를 제거할 수 있다. 현재, 예를 들어, 세 가지 미국 식품의약국 (FDA)-승인된 CAR T 세포 제품: B-세포 림프종 치료용으로 두 가지, 진행성 외투 세포 림프종 (MCL) 치료용으로 하나가 있다. 유사하게, NK 세포는 바이러스에 감염된 세포 및 악성 세포에 대한 신체의 일차 방어선으로서 중추적인 역할을 한다.
면역 세포 요법, 예컨대 ACT (예를 들어, CAR T 세포, CAR B 세포, 및/또는 CAR NK 세포 요법)의 가장 흔한 부작용은, 유의한 이환율 및 사망률을 야기할 수 있는 두 가지 주요 합병증 - 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및 뇌병증 증후군 (신경독성)이다. CRS는 생체내 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 활성화 및 확장 후 다수의 시토카인에 의해 유발되는 시토카인-매개 전신 염증 반응이다. 조작된 항원 수용체를 포함하는 면역 세포 (즉, 조작된 면역 세포), 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포), 및 기타 면역 세포는 시토카인을 방출하고 CRS의 유도에 기여할 수 있다. CRS의 병인과 연관된 주요 시토카인은 인터류킨 (IL) 6, IL10, 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1), 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다. 종양 괴사 인자 (TNF), IL1, IL2, IL2 수용체 알파 (IL2Rα), 및 IL8을 포함하나 이에 제한되지는 않는 몇몇 다른 시토카인이 또한 CRS 발생과 관련되어 있다. CRS의 메커니즘은 더 잘 이해되어야 하긴 하지만, 이 독성에 기여하는 몇몇 인자는 키메라 항원 수용체의 구조, 높은 종양 부담, 더 높은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 주입 용량, 및 기타 환자-특이적 인자, 예컨대 기존의 염증 상태 및 기준선 내피 활성화를 포함한다. CRS의 독성을 극복하기 위해, CRS 치료의 한 가지 접근법은 CRS 발생 초기에 항-시토카인 요법을 적용하여 생명을 위협하는 고도 CRS로 발달하는 것을 예방하는 것이다. 현재, 토실리주맙 (IL6 길항제)은 중증 또는 생명을 위협하는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 유도 CRS의 치료를 위해 FDA 승인되어 있다.
CRS의 전임상 모델은 조작된 면역 세포 (예를 들어, CAR T 세포, CAR B 세포, 또는 CAR NK 세포)의 시토카인-매개 항종양 효과를 방해하지 않는 CRS 치료에 효과적인 작용제를 확인하는 데 유용하다. 게다가, CRS의 전임상 모델은 어느 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) (예를 들어, 이는 특이적 CAR 구축물임)가 적어도 CRS를 유도하고 치료 효과를 유지하는지를 평가하는 데 도움이 된다.
보편적 동종이계 조작된 면역 세포 (예를 들어, CAR T 세포, CAR B 세포, 또는 CAR NK 세포) 요법의 발전으로부터 추가적 필요성이 발생하였으며, 여기서 동일한 조작된 면역 세포가 환자 군 또는 집단에 걸쳐 활용되고 현재 이용가능한 안전성 및 효능에 대한 어떤 사전 스크리닝도 없으나 (예를 들어, 문헌 [Zhao J et al. Journal of Hematology & Oncology 2018; 11(132)] 참조); 현재 이들 목적을 제공하기 위한 전임상 모델이 제한되어 있다. 이용가능한 것들은 종양 미세환경에서 CRS 유도에 기여하는 모든 다양한 유형의 면역 세포를 대표하지 않거나 힘든 모델 개발 및 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 생산을 필요로 한다.
본원에서 용어 "조작된 면역 세포"는 조작된 항원 수용체, 즉 관심 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 비-자연-발생 수용체를 포함하는 (예를 들어, 발현하는) 임의의 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포)를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "CAR 면역 세포" 예컨대 "CAR T 세포"는 "조작된 면역 세포"로 간주된다. 조작된 면역 세포의 다른 예는 조작된 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는 T 세포, 조작된 (예를 들어, 편집된) 종양 침윤 림프구 (eTIL) 및 조작된 조절 T 세포 (eTreg)를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은, 인간 면역 세포 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계이며, 여기서 인간 면역 세포는 질환에 걸린 인간 세포 상의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 조작된 수용체를 포함하고, 면역결핍 마우스는 질환에 걸린 인간 세포가 생착된 것인 단계; 및 CRS의 증상 및/또는 인간 면역 세포의 효능에 대해 면역결핍 마우스를 검정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 질환에 걸린 인간 세포를 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 호중구로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 게놈-변형 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 수용체는 CAR이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 조작된 CAR을 갖는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 조작된 TCR을 갖는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 조절 T 세포 (Treg)이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)이다.
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포는 혈액 세포, 근육 세포, 및 뉴런 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포는 종양 세포이다.
일부 실시양태에서, 종양 세포는 일차 종양 세포이다
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포는 암성 세포이다.
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포는 비-암성 세포이다.
일부 실시양태에서, PBMC 및 인간 면역 세포는 자가유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포, PBMC 및 인간 면역 세포는 자가유래된 것이다.
일부 실시양태에서, PBMC 및 인간 면역 세포는 동종이계이다.
일부 실시양태에서, 방법은 인간 면역 세포 및 인간 PBMC를 면역결핍 마우스에게 투여하기 전에 면역결핍 마우스에 방사선조사하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포 및 인간 PBMC는 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 면역결핍 마우스에게 검정하기 전에 CRS를 치료하기 위한 후보 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스는 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 Prkdc 유전자에서의 널 돌연변이 및 Il2rg 유전자에서의 널 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스는 NOD-Cg.-Prkdc scid IL2rg tm1wJl /SzJ 유전자형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 마우스는 기능적 주요 조직적합성 복합체 I (MHC I) 및 주요 조직적합성 복합체 II (MHC II)가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 마우스는 널 H2-Ab1 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스는 널 MHC 클래스 I H2-K1 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스는 널 MHC 클래스 I H2-D1 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스는 NOD.Cg-Prkdc scid H2-K1 tm1Bpe H2-Ab1 em1Mvw H2-D1 tm1Bpe Il2rg tm1Wjl/ SzJ 마우스 (NSG-(K b D b )null (IA null ) 마우스)이다.
일부 실시양태에서, 검정하는 것은 인터류킨 (IL)-6, IL10, 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-1, IL-2, IL-2-수용체 알파 (IL-2Rα), IL-8, IL-4, IL-18, 및 대식세포 염증성 단백질 (MIP) 4로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 순환 수준을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 다음과 같은 경우에 CRS 유도의 가능성이 높은 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다:
마우스에서의 인간 IFN-γ 수준 ≥ 1,800 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-10 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-6 수준 ≥ 25 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-2 수준 ≥ 80 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-4 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 TNFα 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-8 수준 ≥ 15 pg/ml ±10%;
마우스에서 인간 MCP-1 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 및/또는
마우스에서의 인간 GM-CSF 수준 ≥ 600 pg/ml ±10%.
일부 실시양태에서, 방법은 대식세포 활성화 증후군 (MAS)에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, MAS의 가능성은 IL-6, IL-1, 및/또는 IFN-γ의 순환 수준을 측정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 방법은 신경독성에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 신경독성의 가능성은 IFN-γ, IL-6, 및/또는 TNF-α의 순환 수준을 측정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 방법은 간-신장 기능의 혈청 생화학적 분석을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈청 생화학적 분석은 하기 마커 중 적어도 하나의 수준을 측정하는 것을 포함한다: 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알부민, 총 빌리루빈, 크레아티닌, 또는 혈액 요소 질소.
일부 실시양태에서, 방법은 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 시토카인의 순환 수준이 인간 면역 세포 및 후보 작용제가 투여된 마우스에서 후보 작용제 없이 인간 면역 세포가 투여된 마우스에 비해 30-100% 감소될 때 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는 것으로 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환에 걸린 인간 세포는 인간 종양 세포이고, 검정하는 것은 인간 종양 세포의 성장을 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 종양 세포의 성장은 시간 경과에 따라 측정된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포가 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부피 감소는 효능을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포가 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부담 감소는 효능을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 인간 종양 세포의 성장은 무진행 생존, 종양 부피 배가 시간, 상대 종양 부피, 종양 성장 억제, 또는 종양 성장 속도를 결정하는 데 사용된다.
도 1a는 방사선조사된 MHC 클래스 I/II 녹아웃 (KO) NSG™ 마우스가 CD19 CAR T 세포 치료 후 방사선조사되지 않은 대조군 마우스에 비해 증가된 시토카인 방출을 가졌다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다. 도 1b는 방사선조사되지 않은 마우스 (D10) 및 방사선조사된 마우스 (D9)가 CAR T 세포 치료시 유사한 종양 부담을 가졌다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 2a는 낮은 종양 부담을 갖는 마우스에서의 CD22 CAR T 세포 치료가 NSG™ 및 Raji-Luc NSG 클래스 I/II KO (DKO) 둘 다에서 Raji-Luc 종양 성장을 효율적으로 차단하였다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다. 도 2b는 Raji-Luc NSG™ 및 Raji-Luc NSG™ I/II KO 모델 둘 다에서 CD22 CAR T 세포 주입 후 매우 낮은 수준의 인간 시토카인 유도를 나타내는 데이터를 제공한다.
도 3a는 증가된 시토카인 수준이 Raji-Luc 모델에서 CD19 CAR T 세포 치료 후 높은 종양 부담과 상관관계가 있었다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다. 도 3b는 높은 종양 부담을 갖는 마우스에서의 CD19 CAR T 세포 치료가 효과가 좋지 않았으며, 한편 더 낮은 종양 부담을 갖는 마우스에서의 CD19 CAR T 세포 치료는 종양 진행을 예방할 수 있다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 4는 CD19 CAR T 세포 치료 단독 (PBMC 없음) 또는 PBMC 생착 단독 (CAR T 세포 없음)을 사용한 마우스와 비교하여 자가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 생착/CD19 CAR T 세포 치료 후 중등도 종양 부담 마우스로부터의 시간 경과에 따른 시토카인 방출을 나타낸다.
도 5a는 PBMC 인간화 DKO 마우스에서의 자가 CD22 CAR T 세포 치료가 Raji-Luc 종양 진행을 차단하였다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다. 도 5b는 PBMC 인간화 DKO 마우스에서의 자가 CD22 CAR T 세포 치료가 모의 T 세포 치료와 비교하여 더 높은 인간 시토카인 방출을 유도하였다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 6a는 PBMC 인간화 없이 CD19 CAR T 세포를 받은 마우스와 비교하여 CD19 CAR T 세포/PBMC 치료 후 중등도 종양 부담을 갖는 마우스로부터의 증가된 시토카인 방출을 나타내는 데이터를 제공한다. 도 6b는 종양 부담을 정량적으로 측정하기 위해 평균 방사휘도(average radiance)를 사용하는 생체내 생물발광 이미징 (BLI) 플롯을 나타낸다. 도 6c는 상이한 실험일에 이들 마우스의 생물발광 이미지를 나타낸다.
도 7a-7b는 종양 부담 (도 7a, 좌측), 마우스 체중 변화 (도 7a, 우측), 및 시토카인 방출 (도 7b)에 대한 CART 투여량의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8a-8c는 대조군 마우스와 비교하여 PBMC 인간화 마우스에서의 CAR T 세포 요법으로부터의 데이터를 나타내는 그래프이다. 종양 부담 (도 8a), 체중 (도 8b), 및 인간 인터페론 (IFN), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터류킨-10 (IL-10), 및 IL-6 (도 8c)의 수준이 제시되어 있다.
도 9a-9c는 Raji_Luc 종양을 갖는 상이한 PBMC 인간화 마우스로부터의 동종이계 CD19 CART의 효능을 나타내는 그래프이다. 종양 부담 이미징 (도 9a), CD3-CD19+ 세포 집단의 유동 분석 (도 9b), 및 체중 감소 (도 9c)가 제시되어 있다.
도 10a-10c는 2개의 시점에서 동종이계 CD19 CART 치료 후 Raji_Luc 종양을 갖는 상이한 PBMC 인간화 마우스에서의 IFN (도 10a), IL-10 (도 10b), 및 IL-6 (도 10c)의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 11a-11d는 자가 CD19 CART 치료 후 상이한 PBMC 인간화 마우스로부터의 시토카인 방출 및 독성의 변이를 나타낸다. 프로토콜은 도 11a에 개략적으로 제시되어 있다. 도 11b는 치료 후 CD3-CD19+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 11c는 시간 경과에 따른 체중을 나타내고 도 11d는 치료 후 시토카인 수준을 도시한다.
조작된 면역 세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역 세포 요법 및 기타 조작된 면역 세포 요법은 유전자 전달을 사용하여 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포)를 재프로그래밍하여 이들이 적어도 하나의 조작된 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)를 발현하도록 하여, 생성된 면역 세포가 특정한 질환 (예를 들어, 암) 또는 세포 유형에 특이적인 세포 표면 항원을 인식하고 표적화할 수 있게 한다. 예를 들어, CAR T 세포는 악성 세포를 인식하고 그들 세포에 결합한 후 제거한다. 이러한 방식으로, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법은 혈액 악성종양을 치료하는 데 사용되며 현재 고형 종양 암을 치료하기 위해 개발되고 있다. 유사하게, 조작된 면역 세포는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 심혈관 질환, 대사 질환, 또는 기타 병리학적 상태와 연관된 것들)에 특이적인 세포 표면 항원을 표적화 (예를 들어, 결합)하는 데 사용될 수 있다.
조작된 면역 세포 요법, 예컨대 조작된 T 세포 요법은, 몇몇 공지된 부작용, 예컨대 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및 T 세포-관련 뇌병증 증후군 (신경독성)을 갖는다. 합병증 중 하나 또는 둘 다 유의한 이환율 및 사망률을 야기할 수 있다.
추가적이거나 대안적인 암 면역요법은 자연 살해 세포를 재프로그래밍하는 데 사용되는 CAR의 사용을 포함한다. CAR 자연 살해 세포 (CAR NK) 요법은, NK 세포가 엄격한 인간 백혈구 항원 (HLA) 일치를 필요로 하지 않거나 이식편-대-숙주 질환의 위험을 수반하지 않기 때문에, 기성(off-the shelf) (예를 들어 보편적) 요법일 수 있다. CAR NK 요법은 일차 NK 세포 분리, 확장, 및 형질도입이 여전히 개선되고 있음에 따라 개발되고 있다.
기타 면역 세포, 예컨대 B 세포, 수지상 세포, 단핵구/대식세포, 및 호중구는 또한 적어도 하나의 조작된 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)를 발현하도록 재프로그래밍될 수 있다.
본원에 기재된 마우스 모델은 특정한 조작된 면역 세포 (예를 들어, CAR 또는 TCR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포)) 요법이 CRS 또는 기타 부작용과 연관될 가능성이 있는지 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 마우스 모델은 인간화되고 따라서 시토카인 방출에 기여할 수 있는 인간 면역 세포 (예를 들어, T 세포, 단핵구, 및 NK 세포)를 포함한다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 마우스 모델은 생체내 CRS 유도를 보다 정밀하게 나타내고 인간 시토카인 방출의 보다 정확한 평가를 가능하게 한다. 본원에 기재된 마우스 모델은 또한 조작된 면역 세포, 예컨대 CAR을 발현하는 면역 세포 (그의 치료 효과는 종종 시토카인의 방출에 의해 매개됨)의 치료 효능을 방해하지 않으면서 CRS를 치료하는 데 효과적인 작용제를 확인하는 데 유용하다. 마찬가지로, 본원에 기재된 마우스 모델은 예를 들어, CAR 구축물이 CRS를 유도하지 않으면서 특정 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 데 효과적인, 조작된 면역 세포 (예를 들어, CAR 면역 세포)를 확인하는 데 사용될 수 있다.
조작된 면역 세포 요법
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 질환에 걸린 인간 세포 상의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 조작된 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 입양 세포 요법 (ACT)에 사용될 수 있는 세포이다. 본원에 사용된 바와 같이 "입양 세포 요법" (ACT)은 수혈 전에 체외에서 확장된, 유전자 변형 여부에 관계 없이, 자가 또는 동종이계 면역 세포의 수혈과 관련된 세포-기반 면역요법을 지칭한다. 인간 면역 세포는, 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 조작된 수용체는 조작된 T 세포 수용체 (eTCR)이다. 본원에 기재된 바와 같이, "eTCR"은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시된 항원을 인식 (즉, MHC 분자의 문맥에서 항원 인식)하는 데 전형적으로 관여하는 알파-베타 또는 감마-델타 수용체를 형성하는 이량체 이종 세포 표면 신호전달 단백질을 지칭한다. 이것은 암 세포의 특이적 표면 항원에 결합하는 항체 단편이 사용되는 CAR T 세포 요법과 상이하다. 일부 실시양태에서, eTCR은 조직적합성 항원 1 (HA1) 윌름즈 종양(Wilms tumor) 1 (WT1), 시토메갈로바이러스 (CMV), 흑색종 항원 (MAGE), 당단백질 100 (gp100), MAR-1, 인간 유두종 바이러스-16 E6 단백질 (HPV-16 E6), 뉴욕 식도 편평 세포 암종 (NY-ESO-1), B형 간염 바이러스 (HBV), 단백질 53 (P53), 암배아 항원 (CEA), HPV E7, HIVgag-특이적 펩티드 SLYNTVATL (SL9), 형질전환 성장인자-베타 2 (TGFβ2), 단핵구 화학주성 단백질 (MCPγV), TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL), 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원 (PRAME), 엡슈타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) (EBV), 또는 키르슈텐 래트 육종 바이러스 (KRAS)를 표적화하거나 인식하도록 변형된다 (Zhao et al., Front. Immunol., 11 October 2019). 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 eTCR을 갖는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 조작된 종양-침윤 림프구 (TIL)를 포함한다. TIL 요법 (또는 조작된 TIL 요법, eTIL 요법)에서, TIL은 (예를 들어, 생검 또는 외과적 절제 동안) 대상체의 종양으로부터 제거되고 인터류킨-2 (IL-2) 및/또는 다른 시토카인을 사용하여 체외에서 성장 및 확장된다. 이어서, 일부 종양에 자연적으로 존재하고 암 세포를 인식하고 살해할 수 있는 TIL을 대상체에게 투여한다 (예를 들어, 주입에 의해). 일부 실시양태에서, TIL은 조작된 TIL (eTIL)이며, 이는 종양 귀소 능력, 세포독성을 증가시키고/시키거나 수명을 개선하도록 (소진을 방지하도록) 변형되었다 (Jimenez-Reinoso et al., Front. Oncol., 16 February 2021). 예를 들어, 일부 실시양태에서, eTIL은 TRAIL, IL-12, CXCL8, 및/또는 CXCR2로 형질감염될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 조절 T 세포 (Treg)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 서프레서 T 세포로도 공지된 "조절 T 세포" (Treg)는, 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 내성을 유지하며, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단이다. Treg는 면역억제성 CD4+CD25+FoxP3+이며 일반적으로 T 이펙터 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. 일부 실시양태에서, Treg의 투여는 암을 치료하거나 예방할 수 있다. 예를 들어, Treg의 투여는 염증을 하향조절하여, 박테리아-촉발 결장염 및 결장직장암의 발병을 차단하는 것으로 밝혀졌다 (Poutahidis et al., Carcinogenesis. 2007 Dec;28(12):2614-23. doi: 10.1093/carcin/bgm180. Epub 2007 Aug 27). 일부 실시양태에서, Treg는 하기에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다 (Mohseni et al., Front. Immunol., 24 July 2020). 본원에 기재된 많은 실시양태가 암을 치료하기 위한 세포 요법의 효과를 평가하는 것에 관한 것이지만, 개시내용이 이에 제한되지는 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본원에 기재된 마우스 모델은, 무수한 조작된 면역 세포 요법, 특히 CRS의 유도와 연관된 조작된 면역 세포 요법을 평가하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 CAR T 세포 (예를 들어, CD8+ 또는 CD4+ T 세포)이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 CAR B 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 CAR NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 eTCR T 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 eTIL이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역 세포는 인간 eTreg이다. 인간 면역 세포 중 임의의 하나 이상은 질환에 걸린 인간 세포 (예를 들어, 암 세포, 또는 심혈관 질환, 대사 질환, 또는 기타 병리학적 상태와 연관된 기타 세포) 상의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 조작된 수용체를 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 면역 세포 요법
"키메라 항원 수용체"는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포)에 의해 발현되는 항원을 인식하고 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭한다. 일반적으로, CAR은 T 세포용으로 설계되었으며 T 세포 수용체 (TcR) 복합체의 신호전달 도메인 및 항원-인식 도메인 (예를 들어, 항체 또는 다른 항체 단편의 단쇄 단편 (scFv))의 키메라이다 (Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505). CAR을 발현하는 T 세포는 "CAR T 세포"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 Treg (CD4+CD25+FoxP3+)이고 생성된 CAR T 세포는 "CAR Treg 세포"로 지칭된다.
CAR의 5개의 세대가 있으며, 그 각각은 상이한 구성요소를 함유한다. 제1세대 CAR은 힌지 및 막횡단 도메인을 통해 항체-유래 scFv를 T 세포 수용체의 CD3제타 (ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결한다. 제2세대 CAR은 공동자극 신호를 공급하기 위해, 추가 도메인, 예를 들어, CD28, 4-1BB (41BB), 또는 ICOS를 혼입한다. 제3세대 CAR은 TcR CD3-ζ 쇄와 융합된 2개의 공동자극 도메인을 함유한다. 제3세대 공동자극 도메인은, 예를 들어, CD3z, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS, 또는 OX40의 조합을 포함할 수 있다. CAR은, 일부 실시양태에서, 통상적으로 단쇄 가변 단편 (scFv), 힌지, 막횡단 도메인으로부터 유래된 엑토도메인 (예를 들어, CD3ζ), 및 CD3Ζ 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 1 (제1세대), 2 (제2세대), 또는 3 (제3세대) 신호전달 도메인을 갖는 엔도도메인을 함유한다 (Maude et al., Blood. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155).
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 제4세대 CAR로도 공지된 보편적 시토카인 살해 (TRUCK)을 위해 재지향된 T 세포이다. TRUCK는 표적화된 조직, 예를 들어 표적화된 종양 조직에 축적되는 트랜스제닉 시토카인 IL-12를 생산 및 방출하기 위한 비히클로서 사용되는 CAR-재지향된 T 세포이다. 트랜스제닉 시토카인은 표적의 CAR 결속시 방출된다. 이것은 표적화된 부위에서 치료 농도를 발생시키고 전신 독성을 피할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR T 세포는 제5세대 CAR 또는 차세대 CAR이다. 제5세대 CAR T 세포는 시토카인 수용체의 추가의 세포내 도메인을 갖는 제2세대 CAR을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 추가의 세포내 도메인은 전사 인자인 STAT3/5에 대한 결합 부위인 세포질 IL-2 수용체 (예를 들어, STAT3/5 결합 모티프를 갖는 IL-2Rβ)이다 (Tokarew et al., British Journal of Cancer. 2019; 120: 26-37). 결합 부위를 포함함으로써, CAR은 전체 T 세포 활성화 및 증식을 유도하기 위해 생리학적으로 필요한 모든 세 가지 상승작용적 신호를 생성할 수 있다: TCR (CD3ζ 도메인을 통해), 공동-자극 (CD28 도메인), 및 시토카인 (JAK-STAT3/5) 신호전달.
CAR은 전형적으로 그의 기능적 특성이 상이하다. T 세포 수용체의 CD3ζ 신호전달 도메인은, 결속시, T 세포의 증식을 활성화하고 유도하나 아네르기 (신체의 방어 메커니즘에 의한 반응 결여로, 말초 림프구 내성의 직접 유도를 발생시킴)를 야기할 수 있다. 림프구는 이들이 특이적 항원에 반응하지 못할 때 아네르기인 것으로 간주된다. 제2세대 CAR에 공동자극 도메인의 첨가는 변형된 T 세포의 복제 능력 및 지속성을 개선시켰다. 유사한 항종양 효과가 CD28 또는 4-1BB CAR로 시험관내에서 관찰되나, 전임상 생체내 연구는 4-1BB CAR이 우수한 증식 및/또는 지속성을 생성할 수 있음을 시사한다. 임상 시험은 이들 제2세대 CAR 둘 다 생체내에서 실질적인 T 세포 증식을 유도할 수 있으나, 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 CAR은 더 오래 지속되는 것으로 보임을 시사한다. 제3세대 CAR은 다수의 신호전달 도메인 (공동자극)을 조합하여 효능을 증대시킨다. 제4세대 CAR은 T 세포 반응을 조정하기 위해 CAR T 세포에 의해 방출되는, 트랜스제닉 시토카인에 대한 구성적 또는 유도성 발현 카세트로 추가로 변형된다. 예를 들어, 문헌 [Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505; Chmielewski and Hinrich, Expert Opinion on Biological Therapy. 2015;15(8): 1145-1154]을 참조한다. 상기에 언급한 바와 같이, 제5세대 CAR은 시토카인 수용체 도메인을 추가로 포함하고 시토카인 신호전달을 촉발할 수 있어, T 세포 증식 및 유지를 추가로 증강시킨다 (Tokarew et al., British Journal of Cancer. 2019; 120: 26-37).
기타 면역 세포는 CAR 기술을 사용하여 재프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, NK 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구/대식세포, 및 호중구는 또한 적어도 하나의 CAR을 발현하도록 재프로그래밍될 수 있다.
NK 세포는 골수로부터 유래되며 바이러스를 방어하고 암을 예방한다. 이들 세포는 세포에 치명적인 화학물질의 조합을 주사함으로써 세포 (예를 들어, 바이러스에 감염된 세포)를 살해할 수 있다. 그들은 암 면역요법에 대해 조사되었다 (Xie et al., EBioMedicine, 2020, 59: 102975; Wang et al., Cancer Letters, 2020, 472:175-180; Pfefferle et al., Cancers (Basal), 2020, 12(3): 76; Habib et al., Ochsner Journal, 2019, 19(3): 186-187).
B 세포 (B-림프구)는 조혈 줄기 세포로부터 골수에서 발생하여 항체를 생성하는 면역 세포이다. B 세포는 건강한 조직에 대해 항체를 생성하지 않도록 "훈련되며", 이들이 외래 (비-자기) 물질을 만날 경우, 이들은 형질 세포 또는 기억 세포로 성숙한다.
수지상 세포는 항원 물질을 프로세싱하여 T 세포에 그 각각의 세포 표면 상에 상기 항원 물질을 제시하는 항원-제시 세포이다. 이러한 방식으로, 그들은 선천적 면역계와 적응 면역계 사이의 연락자로서 작용한다. CAR 수지상 세포 (CAR-DC)는 항암 세포독성을 개선하기 위해 CAR T 세포와 함께 사용되어 왔다 (Suh et al., Journal of Clinical Oncology, 2018, 35(7): 144).
단핵구 (대식세포)는 모든 조직에서 발견되는 면역계의 식세포이다. 그들은 적응 면역과 선천 면역 둘 다에서 역할을 하며, 일부 경우에, 미생물을 살해하기 위해 T 세포와 협력한다. CAR 대식세포 (CAR-M)는 난소암 세포주에서 종양 세포를 감소시키거나 제거하는 것으로 나타났다 (Klichinsky et al., Nature Biotechnology, 2020, 38: 947-53).
호중구 (다형핵 백혈구, 과립구)는 또한 골수에서 발생하고, 혈류를 떠나 감염된 조직에 축적된다. 전형적으로, 감염의 급성기 동안, 호중구는 염증 부위로 이동하여, 거기서 호중구가 유기체를 섭취하여 이들을 살해한다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법은 자가유래된 것이며; 즉, 예를 들어, 대상체의 T 세포를 수집하여 나중에 대상체를 치료하는 데 사용되는 CAR T 세포를 생성하는 데 사용한다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 보편적 동종이계 조작된 면역 세포 (예를 들어, "기성" 조작된 면역 세포)이다. 동종이계 조작된 면역 세포는 공여자 면역 세포를 사용하며; 즉, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 받는 대상체 (수령자) 이외의 공급원으로부터의 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 공여자 면역 세포는 건강한 인간 (예를 들어, 성인 또는 아동)으로부터의 것이다. 동종이계 조작된 면역 세포 (예를 들어 CAR T 세포)는, 예를 들어, 조작된 면역 세포가 대상체의 세포 상에서 세포 표면 HLA 클래스 I 및 클래스 II 분자를 "비-자기"로서 인식하고 이들을 공격하는 경우, 투여 후 대상체에서 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 유발할 수 있다. T 세포와 관련하여 이 문제를 피하기 위해, CAR T 세포의 T 세포 αβ 수용체 (TCRαβ)는 유전자 편집 도구 (예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제 예컨대 이펙터 뉴클레아제, 또는 클러스러링된 규칙적 간격의 짧은 재발 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연관 단백질 9 (Cas9))를 사용하여 녹아웃될 수 있다 (Kim et al., Biomolecules. 2020; 10(2):263). 이러한 방식으로, 보편적 동종이계 CAR T 세포는 임의의 대상체 (수령자)에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 완전한 인간이다. 일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항원에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, "스페이서" 도메인 또는 "힌지" 도메인은 세포외 도메인 (항원 결합 도메인 포함) 및 CAR의 막횡단 도메인 사이, 또는 세포질 도메인과 CAR의 막횡단 도메인 사이에 위치한다. "스페이서 도메인"은 막횡단 도메인을 폴리펩티드 쇄의 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "힌지 도메인"은 CAR, 또는 그의 도메인에 유연성을 제공하거나, CAR, 또는 그의 도메인의 입체 장애를 방지하는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인 또는 힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산 (예를 들어, 10 내지 100개의 아미노산, 또는 5 내지 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 스페이서 도메인(들)은 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR은 항원 결합 도메인, 예컨대 항원 (예를 들어, 종양 항원)에 특이적인 단쇄 Fv (scFv)를 포함한다. 결합 도메인의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 유형 및 수에 따라 다르다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태, 예컨대 암, 심혈관 질환, 대사 질환, 신경생물학적 질환, 또는 자가면역 질환과 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 CAR에서 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 암 세포 및/또는 다른 형태의 질환에 걸린 세포와 연관된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV) 또는 유두종바이러스 입자의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 원하는 항원 결합 도메인을 조작함으로써 관심 종양 항원을 표적화하도록 조작된다.
표적 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 관련 기술분야에서 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 분자가 대안적 표적으로 하는 것보다 특정한 표적 항원과 더 빈번히, 더 빠르게, 더 긴 지속기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우 분자는 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 제2 표적 항원에 특이적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, "특이적 결합"이 반드시 배타적 결합을 필요로 하는 것은 아니다 (비록 그것이 포함할 수 있긴 함).
일부 실시양태에서, CAR을 발현하는 면역 세포는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포) 상의 고유한 표적 또는 항원 발현 패턴의 인식을 허용하는, 다수의 표적 또는 항원을 인식하도록 유전자 변형된다. 다수의 표적에 결합할 수 있는 CAR의 예는 다음을 포함한다: 다수의 항원을 발현하는 종양에 대한 완전한 면역 세포 활성화를 제한하는 "분할 신호 CAR"; 2개의 scFv를 갖는 엑토도메인을 함유하는 "탠덤 CAR" (TanCAR); 및 태그부착된 모노클로날 항체 (mAb)와 함께 인큐베이션된 종양 세포를 인식하기 위해 아비딘 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-특이적 scFv를 혼입하는, "보편적 엑토도메인 CAR".
일부 실시양태에서, 표적은 CD19이고; 즉, CAR은 CD19 CAR이다. 일부 실시양태에서, 표적은 CD22이고; 즉, CAR은 CD22 CAR이다. 일부 실시양태에서, 표적은 CD123이고; 즉, CAR은 CD123 CAR이다. 다른 표적은 CD20, B 세포 성숙 항원 (BCMA), C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1), 티로신-단백질 키나제 막횡단 수용체 1 (ROR-1), IL13Rα2, CD20, CD138, CD33, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD171, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 엽산 수용체 (FR), 글리피칸-3, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 뮤신 1, 세포 표면 연관 (MUC1), 메조텔린, 및 자연 살해 군 2D (NKG2D)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, CAR은 암 세포의 표면 상에서 발견되는 임의의 표적 또는 관심 항원에 특이적이다. 다른 실시양태에서, CAR은 질환에 걸린 세포의 표면 상에서 발견되는 임의의 표적 또는 관심 항원에 특이적이다.
CAR은 그것이 2개의 별개의 항원을 인식하는 (2개의 별개의 항원 인식 도메인을 가지는) 경우, "이중특이적"으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 단일 트랜스제닉 수용체 상에 나란히 존재하는 2개의 별개의 항원 인식 도메인으로 이루어진다 (TanCAR로 지칭됨; 예를 들어, 문헌 [Grada Z et al. Molecular Therapy Nucleic Acids 2013;2:e105] 참조, 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, CAR은, 예를 들어, 종양 외(off-tumor) 독성을 피하기 위해, 사용될 수 있는 항원-특이적 억제 CAR (iCAR)이다 (2013년 12월 11일에 온라인 공개되었으며, 본원에 참조로 포함된, 문헌 [Fedorov, VD et al. Sci. Transl. Med.]). iCAR은, 예를 들어, 종양외 표적 발현으로 인해 발생할 수 있는, 비특이적 면역억제를 차단하기 위해, 항원-특이적 억제 수용체를 함유한다. iCAR은, 예를 들어, 억제 분자 CTLA-4 또는 PD-1을 기반으로 하여, 면역억제를 차단하거나, CD52와 같은 범-백혈구 항원을 기반으로 하여, 백혈구 파괴를 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 iCAR은 그의 내인성 T 세포 수용체 또는 활성화 CAR에 의해 활성화된 T 세포로부터의 T 세포 반응을 차단한다.
일부 실시양태에서, CAR은 입양 세포 전달에 사용하기 위해 조작되며, 여기서 면역 세포는 대상체로부터 제거되고 이들이 항원, 예를 들어, 종양-특이적 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 이어서, 암 세포를 인식하고 살해할 수 있는 변형된 면역 세포는 대상체에게 다시 도입된다 (문헌 [Pule, et al., Cytotherapy. 2003; 5(3): 211-226; Maude et al., Blood. 2015; 125(26): 4017-4023], 상기 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨).
시토카인 방출 증후군
시토카인 방출 증후군 (CRS)은 T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포뿐만 아니라 다른 면역 세포 집단 (예를 들어, 대식세포)의 활성화와 함께 발생한다. 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포)를 추가하면, 면역 세포의 활성화는 높은 수준의 시토카인 방출과 하류 손상 및 사망 가능성을 야기할 수 있다. T 세포와 NK 세포 둘 다 특정 면역조정제에 반응하는 CRS의 공급원인 것으로 밝혀졌다 (Wing M.G. et al. (1995) Ther. Immunol. 2:183-190; Carson W.E., (1999) J Immunol 162;4943-4951). 상이한 면역조정제 및 다양한 면역 세포 집단의 활성화로, CRS는 다양한 활성화된 면역 세포 집단에 따라 달라질 수 있는 높은 수준의 시토카인 방출로 나타날 수 있다.
CRS의 병인과 연관된 주요 시토카인은 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-10 (IL-10), 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다. TNF, IL1, IL2, IL-2-수용체-a, 및 IL8을 포함한, 몇몇 다른 시토카인이 또한 CRS와 연관이 있다. 암 환자, 특히 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 받는 암 환자에서 CRS 독성에 기여하는 몇몇 인자는 다음을 포함한다: CAR의 구조, 높은 종양 부담, 더 높은 면역 세포 주입 용량, 및 기타 환자-특이적 인자 예컨대 기존의 염증 상태 및 기준선 내피 활성화.
생명을 위협하는 고도 CRS 독성을 예방하기 위한 한 가지 접근법은 CRS 발생 초기에 (예를 들어 대상체가 처음으로 CRS 증상을 나타낼 때) 항-시토카인 요법을 투여하는 것이다. 예를 들어, 토실리주맙 (IL6 길항제)은, 중증 또는 생명을 위협하는 CAR T 세포-유도 CRS의 치료를 위해 미국 식품의약국 (FDA)의 승인을 받았다. CAR T 세포-유도 CRS에 대한 다른 치료는 항-IL-6 항체 (예를 들어 실툭시맙), 코르티코스테로이드 (예를 들어 메틸프레드니손), 항-TNF-α 약물 (예를 들어 에타너셉트), IL-1R 억제제 (예를 들어, 아나킨라), GM-CSF 억제제, 및 소분자 억제제 (예를 들어 룩솔리티닙 (JAK 1/2 억제제) 및 브루턴(Bruton)의 티로신 키나제 억제제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 마우스 모델은, 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 받는 대상체에서 후보 CRS 치료와 연관된 치료 효능 및/또는 부작용을 평가하는 데 사용된다.
면역결핍 마우스 모델
본원에, 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스 모델이 제공된다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역결핍 마우스는 손상되거나 붕괴된 면역계, 예컨대 MHC 클래스 I, II 또는 둘 다의 특정 결핍, B 세포 또는 T 세포 결함, 또는 둘 다의 결함, 뿐만 아니라 시토카인, 시토카인 수용체, TLR 수용체 및 다양한 형질도입인자(transducer) 및 신호전달 경로의 전사 인자에 대한 유전자의 녹다운으로 인한 면역결핍을 갖는다. 면역결핍 마우스 모델은 단일-유전자 돌연변이 모델 예컨대 누드 마우스 (nu) 균주 및 중증 복합 면역결핍 (scid) 균주, 비-비만 당뇨병 (NOD) 균주, RAG (재조합 활성화 유전자) 균주를 포함하며 표적화된 유전자 결실 및 선천 및 적응 면역에 추가적인 결함을 갖는 이중 및 삼중 돌연변이 마우스 균주를 교배하여 기원하는 다양한 잡종을 포함한다.
자발적 및 트랜스제닉 면역결핍 마우스 모델의 비제한적 예는 하기 마우스 균주를 포함한다:
· 누드 (Nude) (nu) [Flanagan SP. Genet Res 1966; 8: 295-309]; 및 [Nehls M et al. Nature 1994; 372: 103-7];
· Scid (scid) [Bosma GC et al. Nature 1983; 301:527-30; Mosier DE et al. Nature 1988; 335: 256-9]; 및 [Greiner DL et al. Stem Cells 1998; 16: 166-77];
· NOD [Kikutani H et al. Adv Immunol 1992; 51: 285-322]; 및 [Anderson MS et al. Ann Rev Immunol 2005; 23: 447-85];
· RAG1 및 RAG2 (rag) [Mombaerts P et al. Cell 1992; 68: 869-77; Shinkai U et al. Cell 1992; 68: 855-67];
· NOD-scid [Greiner DL et al. 1998; Shultz LD et al. J Immunol 1995; 154: 180-91; Melkus MW et al. Nature Med 2006; 12: 1316-22]; 및 [Denton PW et al. PLoS Med 2008; 4(12): e357];
· IL2rgnull [DiSanto JP et al. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 377-81];
· B2mnull [Christianson SW et al. J Immunol 1997; 158: 3578-86];
· NOD-scid IL2rγnull [Shultz LD et al. Nat Rev Immunol 2007; 7: 118-30; Ito M et al. Blood 2002; 100: 3175-82; Ishikawa I et al. Blood 2005; 106: 1565-73]; 및 [Macchiarini F et al. J Exp Med 2005; 202: 1307-11];
· NOD-scid B2mnull [Shultz et al. 2007; Shultz LD et al. Transplantation 2003; 76: 1036-42; Islas-Ohlmayer MA et al. J Virol 2004; 78:13891-900]; 및 [Macchiarini et al. 2005]; 및
· HLA 트랜스제닉 마우스 [Grusby MJ et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90(9): 3913-7]; 및 [Roy CJ et al. Infect Immun 2005; 73(4): 2452-60]. 예를 들어, 문헌 [Belizario JE The Open Immunology Journal, 2009; 2:79-85] 참조.
· NSG-HLA-A2/HHD (Leonard D. Shultz et al. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(29): 13022-27).
· NSG-Tg (Hu-IL15)
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NOD (비-비만 당뇨병) 유전자형을 갖는다. NOD 마우스 (예를 들어 NOD/ShiLtJ 마우스, 잭슨 랩스(Jackson Labs) 스톡(Stock) #001976)는 고혈당증 및 췌도 세포의 백혈구 침윤인 췌도염을 특징으로 하는 자가면역 1형 당뇨병에 대한 다유전자 모델이다. NOD 마우스는 저인슐린혈증 및 고글루카곤혈증으로, 췌도 베타 세포의 선택적인 파괴를 나타낸다. NOD 마우스에서 당뇨병 감수성의 주요 구성요소는 고유한 MHC 일배체형이다. NOD 마우스는 또한 결함 있는 항원 제시 세포 면역조절 기능, T 림프구 레퍼토리의 조절 결함, 결함 있는 NK 세포 기능, 대식세포로부터의 결함 있는 시토카인 생성 (Fan et al., 2004) 및 손상된 상처 치유를 포함한 다수의 비정상적인 면역표현형을 나타낸다. 그들은 또한 용혈성 보체인 C5가 결여되어 있다. NOD 마우스는 또한 심각하게 난청이다. 면역결핍을 유발하는 다양한 돌연변이, 시토카인 유전자의 표적화된 돌연변이, 뿐만 아니라 면역 기능에 영향을 미치는 트랜스진이 NOD 근친교계 배경으로 역교배되었다.
본 개시내용의 일부 측면에서, NOD 배경을 기반으로 하여 본원에 제공된 면역결핍 마우스는 NOD-Cg.-Prkdc scid IL2rg tm1wJl /SzJ (NSG), NOD.Cg-Rag1 tm1Mom 　Il2rg tm1Wjl /SzJ (NRG), 및 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug /ShiJic로부터 선택된 유전자형을 갖는다. 예를 들어, 마우스는 NOD-Cg.-Prkdc scid IL2rg tm1wJl /SzJ (NOG) 유전자형을 가질 수 있다. 다른 면역결핍 마우스 균주가 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NSG™ 유전자형을 갖는다. NSG™ 마우스 (예를 들어 잭슨 랩스 스톡 번호: #005557)는 성숙한 T 세포, B 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포가 결여된 면역결핍 마우스로, 다중 시토카인 신호전달 경로가 결핍되어 있으며, 선천 면역에 많은 결함을 갖는다 (예를 들어, (Shultz, Ishikawa, & Greiner, 2007; Shultz et al., 2005; Shultz et al., 1995) 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨). NOD 마우스 균주 NOD/ShiLtJ로부터 유래된 NS 마우스 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 문헌 (Makino et al., 1980) 참조)는 Prkdc scid 돌연변이 ("중증 복합 면역결핍" 돌연변이 또는 "scid" 돌연변이라고도 지칭됨) 및 Il2rg tm1Wjl 표적화된 돌연변이를 포함한다. Prkdc scid 돌연변이는 인간 PRKDC 유전자의 마우스 동족체에서 기능 상실 (널) 돌연변이이다 - 이 돌연변이는 본질적으로 적응 면역을 제거한다 (예를 들어, 문헌 (Blunt et al., 1995; Greiner, Hesselton, & Shultz, 1998) 참조, 상기 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨). Il2rg tm1Wjl 돌연변이는 NK 세포 분화를 차단하는 인터류킨 2 수용체 감마 쇄 (IL2Rγ, 인간에서 IL2RG와 동족체)를 코딩하는 유전자의 널 돌연변이이며, 이로 인해 일차 인간 세포의 효율적인 생착을 방지하는 장애물을 제거한다 (Cao et al., 1995; Greiner et al., 1998; Shultz et al., 2005), 상기 문헌 각각은 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NRG 유전자형을 갖는다. NRG 마우스 (예를 들어 잭슨 랩스 스톡 #007799)는 극도로 면역결핍이다. 이 마우스는 NOD/ShiLtJ 유전자 배경에서 2개의 돌연변이; 재조합 활성화 유전자 1 (Rag1)의 표적화된 녹아웃 돌연변이 및 IL2 수용체 공통 감마 쇄의 완전한 널 대립유전자 (IL2rg null )를 갖는다. Rag1 null 돌연변이는 마우스의 B 및 T 세포 결핍을 일으키고 IL2rg null 돌연변이는 다수의 수용체를 통한 시토카인 신호전달을 방지하여, 기능적 NK 세포의 결핍을 야기한다. 중증 면역결핍은 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC) 및 환자-유래 이종이식편 (PDX)을 고효율로 생착함으로써 마우스를 인간화할 수 있게 한다. 면역결핍 NRG 마우스는 DNA 복구 효소 Prkdc에 scid 돌연변이를 갖는 마우스보다 방사선조사 및 유전독성 약물에 대한 내성이 더 강하다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NOG 유전자형을 갖는다. NOG 마우스 (Ito M et al., Blood 2002)는 NOD/scid 마우스와 IL-2 수용체-γ 쇄 녹아웃 (IL2rγKO) 마우스 (Ohbo K. et al., Blood 1996)를 조합함으로써 확립된 극히 중중 복합 면역결핍 마우스이다. NOG 마우스는 T 및 B 세포가 결여되어 있고, 자연 살해 (NK) 세포가 결여되어 있으며, 감소된 수지상 세포 기능 및 감소된 대식세포 기능을 나타내고, 보체 활성이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 NCG 유전자형을 갖는다. NCG 마우스 (예를 들어 찰스 리버(Charles River) 스톡 #572)는 NOD/Nju 마우스에서 Prkdc　및　Il2rg 유전자좌의 순차적 CRISPR/Cas9 편집에 의해 창출되어, NOD/Nju에 대해 유사유전자형인 마우스를 생성한다. NOD/Nju는 외래 조혈 줄기 세포의 생착을 할 수 있게 하는 Sirpa　(SIRP α) 유전자의 돌연변이를 보유한다. Prkdc 녹아웃은 적절한 T 세포 및 B-세포 형성이 결여된 SCID-유사 표현형을 생성한다. Il2rg 유전자의 녹아웃은 SCID-유사 표현형을 추가로 악화시키며 한편 NK 세포 생성을 추가로 감소시킨다.
또한, 본원에 사용된 표준 유전자 명명법은 상이한 설치류 균주에 대한 고유한 식별을 제공하고, 균주 기호는 사용된 균주 또는 스톡의 유형과 그 균주의 유전자 내용에 대한 기본 정보를 전달한다는 점을 이해하여야 한다. 균주 및 스톡을 기호화하기 위한 규칙은 마우스에 대한 표준화된 유전자 명명법에 관한 국제 위원회에 의해 공포되었다. 규칙은 마우스 게놈 데이터베이스 (MGD; informatics.jax.org)로부터 온라인으로 이용가능하며 인쇄본으로 출판되었다 (Lyon et al. 1996). 균주 기호는 전형적으로 실험실 등록 코드 (랩 코드)를 포함한다. 레지스트리는 워싱턴 D.C. 소재 국립 과학 아카데미(the National Academy of Sciences)의 실험실 동물 연구 연구소(Institute for Laboratory Animal Research) (ILAR)에서 유지된다. 랩 코드는 ILAR의 웹 사이트 (nas.edu/cls/ilarhome.nsf)에서 전자적으로 입수할 수 있다. 또한, [Davisson MT, Genetic and Phenotypic Definition of Laboratory Mice and Rats / What Constitutes an Acceptable Genetic-Phenotypic Definition, National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999]을 참조한다.
주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 II 녹아웃 마우스
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 면역결핍 마우스 (예를 들어, NSG, NRG, 또는 NOG 마우스)는 게놈 변형을 포함하며, 여기서 게놈 변형은 면역결핍 마우스가 주요 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 및 주요 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC II)에 결핍되게 하여, 유전자 변형된 면역결핍 마우스가 기능적 MHC I가 결여되도록 하고 기능적 MHC II가 결여되도록 한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 결핍된 유전자 변형된 면역결핍 마우스는 NOD.Cg-Prkdc scid H2-K1 tm1Bpe H2-Ab1 em1Mvw H2-D1 tm1Bpe Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG-(K b D b ) null (IA null ) 마우스로 약칭함, 예를 들어, 잭슨 랩스 스톡 #025216)이다. NSG-(K b D b ) null (IA null ) 마우스는 H2-K 및 H2-D MHC Iα 단백질 서브클래스의 동형접합 널 돌연변이 ((K b D b ) null로 약칭함)로 인해 기능적 MHC I이 결여되어 있고 MHC II의 H-2A 서브클래스의 동형접합 널 돌연변이 (IA null 로 약칭함)로 인해 기능적 MHC II가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 결핍된 유전자 변형된 면역결핍 마우스는 NO D.Cg-B2m tm1Unc 　Prkdc scid 　H2 dlAb1-Ea 　Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG-B2M null (IA IE) null 로 약칭함, 예를 들어, 잭슨 랩스 스톡 #030547) 마우스이다. NSG-B2M null (IA IE) null 마우스는 β2 마이크로글로불린의 동형접합 널 돌연변이 (B2M null 로 약칭함)로 인해 기능적 MHC I이 결여되어 있다. NSG-B2M null (IA IE) null 마우스는 MHC II의 H-2A 및 H-2E 서브클래스의 동형접합 널 돌연변이 ((IA IE) null 로 약칭함)로 인해 기능적 MHC II가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 결핍된 유전자 변형된 면역결핍 마우스는 NOD.Cg-Prkdc scid H2-K1 tm1Bpe H2-Ab1 em1Mvw H2-D1 tm1Bpe Il2rg tm1Wjl Tg(Ins2-HBEGF)6832Ugfm/Sz 트랜스제닉 마우스 (NSG-RIP-DTR (K b D b ) null (IA null )로 약칭함, 예를 들어, 잭슨 랩스 스톡 # 027976)이며, 이는 NSG™ 배경에서 래트 인슐린 프로모터의 제어 하에 디프테리아 독소 수용체를 발현한다. 래트 인슐린 프로모터의 제어 하에 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 마우스에 디프테리아 독소 (DT)의 주사는 마우스 췌장 베타 세포 사멸 및 고혈당증을 야기한다. NSG-RIP-DTR (K b D b ) null (IA null ) 균주는 마우스 췌장 베타 세포의 완전하고 구체적인 절제를 허용하여, 당뇨병유발 약물 예컨대 스트렙토조토신의 광범위한 독성 효과를 피한다.
인간화 면역결핍 마우스 모델
일부 실시양태에서, 인간화 면역결핍 마우스 모델은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 스크리닝하는 데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 마우스", "인간화 면역 결핍 마우스", "인간화 면역결핍 마우스", 및 그의 복수 형태는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로의 생착에 의해 인간화된 면역결핍 마우스를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 인간화 마우스는 면역결핍 마우스로 시작하여, 필요한 경우, 임의의 남아 있는 뮤린 면역 세포를 고갈 및/또는 억제하여 (예를 들어, 화학적으로 또는 방사선으로) 생성된다. 즉, 면역결핍 마우스에서 인간 면역계의 성공적인 생존은 GVHD (이식편-대-숙주 질환) 거부를 방지하기 위해 마우스의 면역계를 억제할 필요가 있을 수 있다. 면역결핍 마우스의 면역계가 충분히 억제된 후, 마우스는 인간 세포 (예를 들어 PBMC)로 생착된다. 본원에 사용된 바와 같이, "생착"은 인간 세포가 생체내에서 관심 기존 조직으로 이동하고 혼입하는 공정을 지칭한다. 인간화 면역결핍 마우스와 관련하여, 생착된 인간 PBMC는 기능성 성숙한 인간 세포 (예를 들어, 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포)를 제공한다. 상기 모델은 GVHD가 시작되기 전에 생착 후 4-5주의 구체적 시간 창을 갖는다. 모델의 수명을 증가시키기 위해, 상기에 기재된 바와 같이, 기능적 MHC I 및 MHC II가 결핍된 이중-녹아웃 (DKO) 마우스를 사용할 수 있다.
방사선조사
상기에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 PBMC로의 생착 전에 방사선조사된다. 면역결핍 마우스의 방사선조사는 말초 혈액, 비장, 및 골수에서 마우스 면역 세포를 파괴하여, 인간 세포, 예컨대 인간 PBMC의 생착을 촉진하고 (예를 들어, 인간 PBMC 생존 인자를 증가함으로써), 뿐만 아니라 면역 세포, 그리고 궁극적으로, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포)의 확장을 촉진하는 것으로 여겨진다. 방사선조사는 또한 마우스 모델을 "인간화"하는 데 필요한 인간 면역 세포의 필요한 수를 축적하는 데 걸리는 시간을 단축한다.
면역결핍 마우스 (예를 들어, NSG™ 마우스)의 경우, 이 준비는 통상적으로 전신 감마선 조사를 통해 완수된다. 방사선조사기는 그의 의도된 사용에 따라 크기가 다를 수 있다. 동물은 일반적으로 단시간 (15분 미만) 동안 방사선조사된다. 방사선조사기 내부에서 소요되는 시간의 양은 방사성동위원소 붕괴 차트, 필요한 방사선조사량, 및 이온화 에너지의 공급원 (즉, 세슘 또는 코발트 공급원이 필요한 X선 대 감마선)에 따라 다르다.
골수절제 방사선조사 선량은 대개 700 내지 1300 cGy이지만, 일부 실시양태에서는 더 낮은 선량 예컨대 1-100 cGy (예를 들어, 약 2, 5, 또는 10 cGy), 또는 300-700 cGy이 사용될 수 있다.
예로서, 마우스는 100 cGy X-선 (또는 75 cGy - 125 cGy X-선)으로 방사선조사된다. 일부 실시양태에서, 선량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 1300 cGy, 또는 본원에 인용된 두 선량 중 임의의 것 사이, 예컨대 100-300 cGy, 200-500 cGy, 600-1000 cGy, 또는 700-1300 cGy이다. 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 PBMC 및 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 세포주로부터 또는 환자-유래 이종이식편으로부터)로의 생착 전 약 15분, 30분, 45분, 1시간, 또는 그 초과에 방사선조사된다. 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 방사선조사 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18일에 PBMC로 생착된다.
PBMC 생착
상기에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 방사선조사된 면역결핍 마우스는 마우스를 인간화하는 PBMC로 생착된다. PBMC는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 방사선조사 후 및 생착 전, 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 방사선조사 및 생착 후 및 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여되기 전에, 또는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 투여와 병용하여 생착될 수 있다.
용어 "말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)"는 둥근 핵을 갖는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 이들 단핵 혈액 세포는 조직과 혈액 사이를 재순환하며 감염과 싸우고 침입자에 적응하는 면역계에서 중대한 구성요소이다. 단핵 세포의 두 가지 주요 유형, 림프구와 단핵구가 있다. PBMC의 림프구 집단은 전형적으로 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함한다.
PBMC는, 예를 들어 전혈 샘플 (예를 들어 피콜(Ficoll) 구배)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 가능한 투여를 위해 고려되고 있는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)로부터의 PBMC가 사용될 수 있다.
면역결핍 마우스를 PBMC로 생착하여 인간화 마우스 모델을 산출하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 복강내 또는 정맥내 주사를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Shultz et al., J Immunol, 2015, 174:6477-6489; Pearson et al., Curr Protoc Immunol. 2008; 15-21; Kim et al., AIDS Res Hum Retrovirus, 2016, 32(2): 194-2020; Yaguchi et al., Cell & Mol Immunol, 2018, 15:953-962). 일부 실시양태에서, 마우스는 0.5-3.0x107개 PBMC로 생착된다. 예를 들어, 마우스는 0.5 x107, 0.6 x107, 0.7 x107, 0.8 x107, 0.9 x107, 1.0 x107, 1.1 x107, 1.2 x107, 1.3 x107, 1.4 x107, 1.5 x107, 1.6 x107, 1.7 x107, 1.8 x107, 1.9 x107, 2.0 x107, 2.5 x107, 3.0 x107개 또는 그 초과의 PBMC로 생착된다. 일부 실시양태에서, 마우스는 0.5-0.75 x107, 0.5-1.0 x107, 0.5-1.1 x107, 0.5-1.2 x107, 0.5-1.3 x107, 0.5-1.4 x107, 0.5-1.5 x107, 0.5-1.6 x107, 0.5-1.7 x107, 0.5-1.8 x107, 0.5-1.9 x107, 0.5-2.0 x107, 0.5-2.25 x107, 0.5-2.5 x107, 0.5-3.0 x107, 0.75-1.0 x107, 0.75-1.1 x107, 0.75-1.2 x107, 0.75-1.3 x107, 0.75-1.4 x107, 0.75-1.5 x107, 0.75-1.6 x107, 0.75-1.7 x107, 0.75-1.8 x107, 0.75-1.9 x107, 0.75-2.0 x107, 0.75-2.25 x107, 0.75-2.5 x107, 0.75-3.0 x107,1.0-1.1 x107, 1.0-1.2 x107, 1.0-1.3 x107, 1.0-1.4 x107, 1.0-1.5 x107, 1.0-1.6 x107, 1.0-1.7 x107, 1.0-1.8 x107, 1.0-1.9 x107, 1.0-2.0 x107, 1.0-2.25 x107, 1.0-2.5 x107, 1.0-2.75 x107, 1.0-3.0 x107, 1.1-1.2 x107, 1.1-1.3 x107, 1.1-1.4 x107, 1.1-1.5 x107, 1.1-1.6 x107, 1.1-1.7 x107, 1.1-1.8 x107, 1.1-1.9 x107, 1.1-2.0 x107, 1.1-2.25 x107, 1.1-2.5 x107, 1.1-2.75 x107, 1.1-3.0 x107, 1.2-1.3 x107, 1.2-1.4 x107, 1.2-1.5 x107, 1.2-1.6 x107, 1.2-1.7 x107, 1.2-1.8 x107, 1.2-1.9 x107, 1.2-2.0 x107, 1.2-2.25 x107, 1.2-2.5 x107, 1.2-2.75 x107, 1.2-3.0 x107, 1.3-1.4 x107, 1.3-1.5 x107, 1.3-1.6 x107, 1.3-1.7 x107, 1.3-1.8 x107, 1.3-1.9 x107, 1.3-2.0 x107, 1.3-2.25 x107, 1.3-2.5 x107, 1.3-2.75 x107, 1.3-3.0 x107, 1.4-1.5 x107, 1.4-1.6 x107, 1.4-1.7 x107, 1.4-1.8 x107, 1.4-1.9 x107, 1.4-2.0 x107, 1.4-2.25 x107, 1.4-2.5 x107, 1.4-2.75 x107, 1.4-3.0 x107, 1.5-1.6 x107, 1.5-1.7 x107, 1.5-1.8 x107, 1.5-1.9 x107, 1.5-2.0 x107, 1.5-2.25 x107, 1.5-2.5 x107, 1.5-2.75 x107, 1.5-3.0 x107, 1.6-1.7 x107, 1.6-1.8 x107, 1.6-1.9 x107, 1.6-2.0 x107, 1.6-2.25 x107, 1.6-2.5 x107, 1.6-2.75 x107, 1.6-3.0 x107, 1.7-1.8 x107, 1.7-1.9 x107, 1.7-2.0 x107, 1.7-2.25 x107, 1.7-2.5 x107, 1.7-2.75 x107, 1.7-3.0 x107, 1.8-1.9 x107, 1.8-2.0 x107, 1.8-2.25 x107, 1.8-2.5 x107, 1.8-2.75 x107, 1.8-3.0 x107, 1.9-2.0 x107, 1.9-2.25 x107, 1.9-2.5 x107, 1.9-2.75 x107, 1.9-3.0 x107, 2.0-2.25 x107, 2.0-2.5 x107, 2.0-2.75 x107, 2.0-3.0 x107, 2.25-2.5 x107, 2.25-2.75 x107, 2.25-3.0 x107, 2.5-2.75 x107, 2.5-3.0 x107, 또는 2.75-3.0 x107개로 생착된다. 일부 실시양태에서, 마우스는 2x107개의 PBMC로 생착된다. 일부 실시양태에 따르면, 마우스는 4.5-5.5x107 (4.5-5.0x107, 5.0-5.5x107)개의 PBMC로 생착된다.
일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 방사선조사 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 또는 그 초과에 생착된다. 일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 방사선조사 후 1-2시간, 1-3시간, 1-4시간, 1-5시간, 1-6시간, 1-7시간, 1-8시간, 1-9시간, 1-10시간, 1-12시간, 1-14시간, 1-16시간, 1-18시간, 1-20시간, 1-22시간, 1-24시간, 2-3시간, 2-4시간, 2-5시간, 2-6시간, 2-7시간, 2-8시간, 2-9시간, 2-10시간, 2-12시간, 2-14시간, 2-16시간, 2-18시간, 2-20시간, 2-22시간, 2-24시간, 3-4시간, 3-5시간, 3-6시간, 3-7시간, 3-8시간, 3-9시간, 3-10시간, 3-12시간, 3-14시간, 3-16시간, 3-18시간, 3-20시간, 3-22시간, 3-24시간, 4-5시간, 4-6시간, 4-7시간, 4-8시간, 4-9시간, 4-10시간, 4-12시간, 4-14시간, 4-16시간, 4-18시간, 4-20시간, 4-22시간, 4-24시간, 5-6시간, 5-7시간, 5-8시간, 5-9시간, 5-10시간, 5-12시간, 5-14시간, 5-16시간, 5-18시간, 5-20시간, 5-22시간, 5-24시간, 6-7시간, 6-8시간, 6-9시간, 6-10시간, 6-12시간, 6-14시간, 6-16시간, 6-18시간, 6-20시간, 6-22시간, 6-24시간, 7-8시간, 7-9시간, 7-10시간, 7-12시간, 7-14시간, 7-16시간, 7-18시간, 7-20시간, 7-22시간, 7-24시간, 8-9시간, 8-10시간, 8-12시간, 8-14시간, 8-16시간, 8-18시간, 8-20시간, 8-22시간, 8-24시간, 9-10시간, 9-12시간, 9-14시간, 9-16시간, 9-18시간, 9-20시간, 9-22시간, 9-24시간, 10-12시간, 10-14시간, 10-16시간, 10-18시간, 10-20시간, 10-22시간, 10-24시간, 12-14시간, 12-16시간, 12-18시간, 12-20시간, 12-22시간, 12-24시간, 14-16시간, 14-18시간, 14-20시간, 14-22시간, 14-24시간, 16-18시간, 16-20시간, 16-22시간, 16-24시간, 18-20시간, 18-22시간, 18-24시간, 20-22시간, 20-24시간, 또는 22-24시간에 생착된다.
질환에 걸린 세포 생착
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 방사선조사 후에 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 세포주 또는 환자-유래 이종이식편으로부터)로 투여/생착된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환에 걸린 세포"는 질환에 걸린 대상체 (예를 들어, 질환 또는 암을 포함한, 병리학적 상태를 앓고 있는 개인)에서 발견되고 건강한 대상체 (예를 들어, 질병 또는 병태를 앓고 있지 않은 개인)에서 발견되는 생리학적 세포의 특징인 구조, 기능, 대사, 및 게놈을 갖는 세포와 비교하여 그의 구조 및/또는 기능 및/또는 대사 및/또는 게놈 측면에서 비정상적인 세포를 지칭한다. 질환에 걸린 세포의 예는 암 또는 종양 세포 (하기에 논의함), 질환에 걸린 혈관 평활근 세포, 질환에 걸린 내피 세포 (예를 들어 죽상동맥경화증의 경우에), 및 바이러스와 같은 병원체에 의해 감염된 질환 (예를 들어, 감염성 질환의 경우), 및 섬유증을 겪고 있는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 섬유성 질환의 경우)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 질환에 걸린 세포의 표현형, 물리적 측면 또는 특성은 질환 또는 병태 (예를 들어, 암, 죽상동맥경화증, 섬유성 질환 및 감염성 질환 등)에 따라 달라질 수 있으며 표준 기술 및 지식 (예를 들어, 질환-특이적 마커 사용)을 질환 또는 병태에 따라 질환에 걸린 세포를 질환이 없는 세포 또는 건강한 세포와 구별하는 데 사용된다.
질환에 걸린 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 정맥내 (예를 들어, 꼬리 정맥내 주사), 피하, 대퇴골내, 뇌실내, 심장내, 복강내 투여 경로 등을 사용하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 경로는 정맥내 주입이다.
환자-유래 이종이식편 (PDX) 세포
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포)를 포함하는 환자-유래 이종이식편 (PDX)으로 투여/생착된다. PDX는 인간으로부터 제거된 조직이다. 일부 실시양태에서, PDX는 종양 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 혈액 악성종양, 에컨대 성인 급성 골수성 백혈병 (AML)으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 예컨대 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 간암, 흑색종, 중피종, 비-세포폐암, 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포폐암, 및 갑상선암으로부터의 것들이다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스에 적절한 수의 인간-유래 세포, 예컨대 0.1-10 × 106개 인간의 질환에 걸린 (예를 들어, 암) 세포 (예를 들어, 0.1-5.0×106개 인간의 질환에 걸린 세포)를 주사한다. 일부 실시양태에서, PDX 세포의 적절한 양은 0.1-0.2×106, 0.1-0.3×106, 0.1-0.4×106, 0.1-0.5×106, 0.1-0.6×106, 0.1-0.7×106, 0.1-0.8×106, 0.1-0.9×106, 0.1-1.0×106, 0.1-1.25×106, 0.1-1.5×106, 0.1-1.75×106, 0.1-2.0×106, 0.2-0.3×106, 0.2-0.4×106, 0.2-0.5×106, 0.2-0.6×106, 0.2-0.7×106, 0.2-0.8×106, 0.2-0.9×106, 0.2-1.0×106, 0.2-1.25×106, 0.2-1.5×106, 0.2-1.75×106, 0.2-2.0×106, 0.3-0.4×106, 0.3-0.5×106, 0.3-0.6×106, 0.3-0.7×106, 0.3-0.8×106, 0.3-0.9×106, 0.3-1.0×106, 0.3-1.25×106, 0.3-1.5×106, 0.3-1.75×106, 0.3-2.0×106, 0.4-0.5×106, 0.4-0.6×106, 0.4-0.7×106, 0.4-0.8×106, 0.4-0.9×106, 0.4-1.0×106, 0.4-1.25×106, 0.4-1.5×106, 0.4-1.75×106, 0.4-2.0×106, 0.5-0.6×106, 0.5-0.7×106, 0.5-0.8×106, 0.5-0.9×106, 0.5-1.0×106, 0.5-1.25×106, 0.5-1.5×106, 0.5-1.75×106, 0.5-2.0×106, 0.6-0.7×106, 0.6-0.8×106, 0.6-0.9×106, 0.6-1.0×106, 0.6-1.25×106, 0.6-1.5×106, 0.6-1.75×106, 0.6-2.0×106, 0.7-0.8×106, 0.7-0.9×106, 0.7-1.0×106, 0.7-1.25×106, 0.7-1.5×106, 0.7-1.75×106, 0.7-2.0×106, 0.8-0.9×106, 0.8-1.0×106, 0.8-1.25×106, 0.8-1.5×106, 0.8-1.75×106, 0.8-2.0×106, 0.9-1.0×106, 0.9-1.25×106, 0.9-1.5×106, 0.9-1.75×106, 0.9-2.0×106, 1.0-1.25×106, 1.0-1.5×106, 1.0-1.75×106, 1.0-2.0×106, 1.25-1.5×106, 1.25-1.75×106, 1.25-2.0×106, 1.5-1.75×106, 1.5-2.0×106, 1.75-2.0×106개의 암 세포 (예를 들어, 0.1×106, 0.15×106, 0.2×106, 0.25×106, 0.3×106, 0.35×106, 0.4×106, 0.45× 106, 0.5× 06, 0.6×106, 0.7× 106, 0.8×106, 0.9×106, 1.0×106, 1.1×106 1.2×106 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106 , 1.6.0×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2.0×106개 또는 그 초과의 세포이다.
일부 실시양태에서, PDX는 PBMC가 생착되고 인간 면역 세포 (예를 들어 인간 B- 또는 T 세포 또는 NK 세포)가 나타나기 전에 마우스에 도입된다. 일부 실시양태에서, PDX는 방사선조사 직후에 마우스에 도입된다. 일부 실시양태에서, PDX는 방사선조사 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 또는 그 초과에 도입된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 방사선조사 후 1-2시간, 1-3시간, 1-4시간, 1-5시간, 1-6시간, 1-7시간, 1-8시간, 1-9시간, 1-10시간, 1-12시간, 1-14시간, 1-16시간, 1-18시간, 1-20시간, 1-22시간, 1-24시간, 2-3시간, 2-4시간, 2-5시간, 2-6시간, 2-7시간, 2-8시간, 2-9시간, 2-10시간, 2-12시간, 2-14시간, 2-16시간, 2-18시간, 2-20시간, 2-22시간, 2-24시간, 3-4시간, 3-5시간, 3-6시간, 3-7시간, 3-8시간, 3-9시간, 3-10시간, 3-12시간, 3-14시간, 3-16시간, 3-18시간, 3-20시간, 3-22시간, 3-24시간, 4-5시간, 4-6시간, 4-7시간, 4-8시간, 4-9시간, 4-10시간, 4-12시간, 4-14시간, 4-16시간, 4-18시간, 4-20시간, 4-22시간, 4-24시간, 5-6시간, 5-7시간, 5-8시간, 5-9시간, 5-10시간, 5-12시간, 5-14시간, 5-16시간, 5-18시간, 5-20시간, 5-22시간, 5-24시간, 6-7시간, 6-8시간, 6-9시간, 6-10시간, 6-12시간, 6-14시간, 6-16시간, 6-18시간, 6-20시간, 6-22시간, 6-24시간, 7-8시간, 7-9시간, 7-10시간, 7-12시간, 7-14시간, 7-16시간, 7-18시간, 7-20시간, 7-22시간, 7-24시간, 8-9시간, 8-10시간, 8-12시간, 8-14시간, 8-16시간, 8-18시간, 8-20시간, 8-22시간, 8-24시간, 9-10시간, 9-12시간, 9-14시간, 9-16시간, 9-18시간, 9-20시간, 9-22시간, 9-24시간, 10-12시간, 10-14시간, 10-16시간, 10-18시간, 10-20시간, 10-22시간, 10-24시간, 12-14시간, 12-16시간, 12-18시간, 12-20시간, 12-22시간, 12-24시간, 14-16시간, 14-18시간, 14-20시간, 14-22시간, 14-24시간, 16-18시간, 16-20시간, 16-22시간, 16-24시간, 18-20시간, 18-22시간, 18-24시간, 20-22시간, 20-24시간, 또는 22-24시간에 도입된다.
세포 및 세포주
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 일차 세포로 생착된다. 인간의 일차 세포는 조직으로부터 직접 단리되며 원래 그의 조직의 형태학적 및 기능적 특성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 일차 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 일차 세포는 뉴런 세포가다. 일부 실시양태에서, 일차 세포는 대사 세포이다. 일부 실시양태에서, 일차 세포는 심장 세포이다. 다른 일차 세포가 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 줄기 세포로 생착된다. iPSC는 체세포로부터 직접 생성될 수 있는 만능 줄기 세포의 한 유형이다 (예를 들어, 문헌 [Takahashi K et al. Cell. 2006; 126 (4): 663-76] 참조).
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 불멸화 세포 (불멸화 세포주)로 생착된다. 불멸화 세포주는 무기한 증식하도록 조작되어 장기간 배양될 수 있는 세포이다. 통상적으로 사용되는 불멸화 세포주의 비제한적 예는 3T3 세포, HeLa 세포, COS 세포, 293/293T/HEK-293T 세포, MDCK 세포, CHO 세포, S2 세포, PC12 세포, Neuro-2a/N2a 세포, 및 SH-SY5Y를 포함한다. 다른 불멸화 세포가 본원에서 고려되고 하기에 기재된다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스는 종양 세포주로부터의 종양 세포로 이식된다. 종양 세포주는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, ATCC 또는 다른 컬렉션을 통해 공개적으로 접근가능하다. 일부 실시양태에서, 세포주는 인간 종양으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 인간 B 세포 림프종과 연관된 세포주인 Raji가 사용된다. 일부 실시양태에서, 인간 외투 세포 림프종과 연관된 세포주인 Jeko-1이 사용된다. 종양 세포주의 예는 인간 폐 암종 세포주, 예컨대 A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774), SW900 (SRCC775), H522 (SRCC832), 및 H810 (SRCC833)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 폐 종양, 예컨대 SRCC724 (선암종, "AdenoCa"로 약칭함) (LT1), SRCC725 (편평 세포 암종, "SqCCa로 약칭함) (LT1a), SRCC726 (선암종) (LT2), SRCC727 (선암종) (LT3), SRCC728 (선암종) (LT4), SRCC729 (편평 세포 암종) (LT6), SRCC730 (선/편평 세포 암종) (LT7), SRCC731 (선암종) (LT9), SRCC732 (편평 세포 암종) (LT10), SRCC733 (편평 세포 암종) (LT11), SRCC734 (선암종) (LT12), SRCC735 (선/편평 세포 암종) (LT13), SRCC736 (편평 세포 암종) (LT15), SRCC737 (편평 세포 암종) (LT16), SRCC738 (편평 세포 암종) (LT 17), SRCC739 (편평 세포 암종) (LT18), SRCC740 (편평 세포 암종) (LT19), SRCC741 (폐 세포 암종, "LCCa"로 약칭함) (LT21), SRCC811 (선암종)(LT22), SRCC825(선암종) (LT8), SRCC886 (선암종) (LT25), SRCC887 (편평 세포 암종) (LT26), SRCC888 (선-BAC 암종) (LT27), SRCC889 (편평 세포 암종) (LT28), SRCC890 (편평 세포 암종) (LT29), SRCC891 (선암종) (LT30), SRCC892 (편평 세포 암종) (LT31), SRCC894 (선암종) (LT33)와 연관된다. 또한, SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129 [HF-000643], SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC1227 [HF-001291], SRCC1229 [HF-001293], SRCC1230 [HF-001294], SRCC1231 [HF-001295], SRCC1232 [HF-001296], SRCC1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299], 및 SRCC1236 [HF-001300]로 지정된 인간 폐 종양이 포함된다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 결장암과 연관된다. 결장암 세포주의 예는 SW480 (선암종, SRCC776), SW620 (결장 선암종의 림프절 전이, SRCC777), Colo320 (암종, SRCC778), HT29 (선암종, SRCC779), HM7 (ATCC 결장 선암종 세포주의 높은 뮤신 생성 변이체, SRCC780), CaWiDr (선암종, SRCC781), HCT116 (암종, SRCC782), SKCO1 (선암종, SRCC783), SW403 (선암종, SRCC784), LS174T (암종, SRCC785), Colo205 (암종, SRCC828), HCT15 (암종, SRCC829), HCC2998 (암종, SRCC830), 및 KM12 (암종, SRCC831)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 원발성 결장 종양은 CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), CT19 (선암종, SRCC906), CT20 (선암종, SRCC907), CT21 (선암종, SRCC908), CT22 (선암종, SRCC909), CT23 (선암종, SRCC910), CT24 (선암종, SRCC911), CT25 (선암종, SRCC912), CT26 (선암종, SRCC913), CT27 (선암종, SRCC914),CT28 (선암종, SRCC915), CT29 (선암종, SRCC916), CT30 (선암종, SRCC917), CT31 (선암종, SRCC918), CT32(선암종, SRCC919), CT33 (선암종, SRCC920), CT35 (선암종, SRCC921), 및 CT36 (선암종, SRCC922)으로 지정된 결장 선암종을 포함한다. 또한, SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] 및 SRCC1148[HF-000811]로 지정된 인간 결장 종양이 포함된다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 유방암과 연관된다. 인간 유방 암종 세포주의 예는, 예를 들어, HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766), 및 SKBR3 (SRCC767), 및 SRCC1057 [HF-000545]로 지정된 인간 유방 종양 센터를 포함한다. 또한, SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101로 지정된 인간 유방암, 및 SRCC893 [LT 32]로 지정된 인간 유방-met-폐-NS 종양이 포함된다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 신장암과 연관된다. 인간 신장 종양 세포주의 예는 SRCC989 [HF-000611] 및 SRCC1014 [HF-000613]를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 고환암과 연관된다. 인간 고환 종양 센터의 예는 SRCC1001 [HF-000733] 및 고환 종양 변연(margin) SRCC999 [HF-000716]을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포주는 인간 부갑상선 암과 연관된다. 인간 부갑상선 종양 세포주의 예는 SRCC1002 [HF-000831] 및 SRCC1003 [HF-000832]을 포함한다.
다른 인간 종양 세포주가 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스에 암 세포주로부터의 적합한 양의 종양 세포를 주사한다. 일부 실시양태에서, 면역결핍 마우스에 0.25 ×106개의 암 세포를 주사한다. 일부 실시양태에서, 적절한 양의 종양 세포는 0.1-0.2×106, 0.1-0.3×106, 0.1-0.4×106, 0.1-0.5×106, 0.1-0.6×106, 0.1-0.7×106, 0.1-0.8×106, 0.1-0.9×106, 0.1-1.0×106, 0.1-1.25×106, 0.1-1.5×106, 0.1-1.75×106, 0.1-2.0×106, 0.2-0.3×106, 0.2-0.4×106, 0.2-0.5×106, 0.2-0.6×106, 0.2-0.7×106, 0.2-0.8×106, 0.2-0.9×106, 0.2-1.0×106, 0.2-1.25×106, 0.2-1.5×106, 0.2-1.75×106, 0.2-2.0×106, 0.3-0.4×106, 0.3-0.5×106, 0.3-0.6×106, 0.3-0.7×106, 0.3-0.8×106, 0.3-0.9×106, 0.3-1.0×106, 0.3-1.25×106, 0.3-1.5×106, 0.3-1.75×106, 0.3-2.0×106, 0.4-0.5×106, 0.4-0.6×106, 0.4-0.7×106, 0.4-0.8×106, 0.4-0.9×106, 0.4-1.0×106, 0.4-1.25×106, 0.4-1.5×106, 0.4-1.75×106, 0.4-2.0×106, 0.5-0.6×106, 0.5-0.7×106, 0.5-0.8×106, 0.5-0.9×106, 0.5-1.0×106, 0.5-1.25×106, 0.5-1.5×106, 0.5-1.75×106, 0.5-2.0×106, 0.6-0.7×106, 0.6-0.8×106, 0.6-0.9×106, 0.6-1.0×106, 0.6-1.25×106, 0.6-1.5×106, 0.6-1.75×106, 0.6-2.0×106, 0.7-0.8×106, 0.7-0.9×106, 0.7-1.0×106, 0.7-1.25×106, 0.7-1.5×106, 0.7-1.75×106, 0.7-2.0×106, 0.8-0.9×106, 0.8-1.0×106, 0.8-1.25×106, 0.8-1.5×106, 0.8-1.75×106, 0.8-2.0×106, 0.9-1.0×106, 0.9-1.25×106, 0.9-1.5×106, 0.9-1.75×106, 0.9-2.0×106, 1.0-1.25×106, 1.0-1.5×106, 1.0-1.75×106, 1.0-2.0×106, 1.25-1.5×106, 1.25-1.75×106, 1.25-2.0×106, 1.5-1.75×106, 1.5-2.0×106, 1.75-2.0×106개의 암 세포 (예를 들어, 0.1×106, 0.15×106, 0.2×106, 0.25×106, 0.3×106, 0.35×106, 0.4×106, 0.45× 106, 0.5× 06, 0.6×106, 0.7× 106, 0.8×106, 0.9×106, 1.0×106, 1.1×106 1.2×106 1.3×106, 1.4×106, 1.5×106 , 1.6.0×106, 1.7×106, 1.8×106, 1.9×106, 2.0×106개 또는 초과의 종양 세포)이다.
일부 실시양태에서, 암 세포는 PBMC가 생착되고 인간 면역 세포 (예를 들어, 인간 B 세포 또는 T 세포 또는 NK 세포)가 나타나기 전에 마우스에 도입된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 방사선조사 직후에 도입된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 방사선조사 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 또는 그 초과에 도입된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 방사선조사 후 1-2시간, 1-3시간, 1-4시간, 1-5시간, 1-6시간, 1-7시간, 1-8시간, 1-9시간, 1-10시간, 1-12시간, 1-14시간, 1-16시간, 1-18시간, 1-20시간, 1-22시간, 1-24시간, 2-3시간, 2-4시간, 2-5시간, 2-6시간, 2-7시간, 2-8시간, 2-9시간, 2-10시간, 2-12시간, 2-14시간, 2-16시간, 2-18시간, 2-20시간, 2-22시간, 2-24시간, 3-4시간, 3-5시간, 3-6시간, 3-7시간, 3-8시간, 3-9시간, 3-10시간, 3-12시간, 3-14시간, 3-16시간, 3-18시간, 3-20시간, 3-22시간, 3-24시간, 4-5시간, 4-6시간, 4-7시간, 4-8시간, 4-9시간, 4-10시간, 4-12시간, 4-14시간, 4-16시간, 4-18시간, 4-20시간, 4-22시간, 4-24시간, 5-6시간, 5-7시간, 5-8시간, 5-9시간, 5-10시간, 5-12시간, 5-14시간, 5-16시간, 5-18시간, 5-20시간, 5-22시간, 5-24시간, 6-7시간, 6-8시간, 6-9시간, 6-10시간, 6-12시간, 6-14시간, 6-16시간, 6-18시간, 6-20시간, 6-22시간, 6-24시간, 7-8시간, 7-9시간, 7-10시간, 7-12시간, 7-14시간, 7-16시간, 7-18시간, 7-20시간, 7-22시간, 7-24시간, 8-9시간, 8-10시간, 8-12시간, 8-14시간, 8-16시간, 8-18시간, 8-20시간, 8-22시간, 8-24시간, 9-10시간, 9-12시간, 9-14시간, 9-16시간, 9-18시간, 9-20시간, 9-22시간, 9-24시간, 10-12시간, 10-14시간, 10-16시간, 10-18시간, 10-20시간, 10-22시간, 10-24시간, 12-14시간, 12-16시간, 12-18시간, 12-20시간, 12-22시간, 12-24시간, 14-16시간, 14-18시간, 14-20시간, 14-22시간, 14-24시간, 16-18시간, 16-20시간, 16-22시간, 16-24시간, 18-20시간, 18-22시간, 18-24시간, 20-22시간, 20-24시간, 또는 22-24시간에 도입된다.
면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법의 효능 평가 방법
일부 실시양태에서, 방법은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 효능을 평가하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, PBMC 인간화 마우스 질환 모델은 방사선조사된 면역결핍 마우스를 질환에 걸린 세포 (예를 들어, PDX로부터의 세포)로 생착함으로써 확립될 수 있다. 질환에 걸린 세포가 생체내에서 충분한 시간 동안 성장한 후, 마우스는 예상된 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 및 PBMC로 치료된다. 일부 실시양태에서, PBMC 인간화 마우스 암 모델은 방사선조사된 면역결핍 마우스를 종양 세포 (예를 들어, 종양 세포주 또는 PDX로부터의 세포)로 생착함으로써 확립될 수 있다. 종양이 생체내에서 충분한 시간 동안 성장한 후, 마우스는 예상된 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 및 PBMC로 치료된다. "충분한 시간"이란 종양이 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 효과를 연구하는 데 필요한 종양 세포의 크기 또는 수를 갖는다는 것을 의미하거나, 비-암 질환 마우스 모델의 경우에, "충분한 시간"이란 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 효과를 연구하는 데 필요한 질환에 걸린 세포의 수를 수득하는 데 필요한 시간을 의미한다.
암 마우스 모델과 관련하여, 종양 세포는 마우스에서 성장하여 다양한 종양 부담을 확립할 수 있다 (예를 들어 마우스를 치료하지 않은 기간이 길수록, 종양 부담이 높아짐). 본원에서 사용된 바와 같이, "종양 부담"은 모델 마우스에서 암 세포의 총 수 또는 종양(들)의 총 크기를 지칭한다. 종양 부담은 낮거나 중간이거나 높을 수 있으며, 마우스의 전체 체중의 백분율로서 표시될 수 있다. 높은 종양 부담은 마우스 체중의 >5%이다 (예를 들어, 5%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%, 6% 또는 그 초과). 일부 실시양태에서, 높은 종양 부담은 5-5.2%, 5-5.3%, 5-5.4%, 5-5.5%, 5-5.6%, 5-5/8%, 5-5.8%,5-5.9%, 5-2%, 5.5-5.2%, 5.5-5.3%, 5.5-5.4%, 5.5-5.5%, 5.5-5.6%, 5.5-5.7%, 5.5-5.8%, 5.5-5.9%, 5.5-2%, 5.2-5.3%, 5.2-5.4%, 5.2-5.5%, 5.2-5.6%, 5.2-5.7%, 5.2-5.8%, 5.2-5.9%, 5.2-2%, 5.3-5.4%, 5.3-5.5%, 5.3-5.6%, 5.3-5.7%, 5.3-5.8%, 5.3-5.9%, 5.3-2%, 5.4-5.5%, 5.4-5.6%, 5.4-5.7%, 5.4-5.8%, 5.4-5.9%, 5.4-2%, 5.5-5.6%, 5.5-5.7%, 5.5-5.8%, 5.5-5.9%, 5.5-6%, 5.6-5.7%, 5.6-5.8%, 5.6-5.9%, 5.6-2%, 5.7-5.8%, 5.7-5.9%, 5.7-2%, 5.8-5.9%, 5.8-2%, 또는 5.9-6%이다. 중등도 종양 부담은 마우스 체중의 1<5% (예를 들어, 1%, 1.25%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 1.95%, 1.96%, 1.97%, 1.98%, 1.99%, 2%, 2.25%, 2.5%, 2.75%, 3%, 3.25%, 3.5%, 3.75%, 4%, 4.25% 4.5%, 4.75%)이다. 일부 실시양태에서, 중등도 종양 부담은 1.5-1.6%, 1.5-1.7%, 1.5-1.8%, 1.5-1.9%, 1.6-1.7%, 1.6-1.8%, 1.6-1.9%, 1.7-1.8%, 1.7-1.9%, 또는 1.8-1.9%이다. 일부 실시양태에서, 중등도 종양 부담은 1-2%, 1-2.25%, 1-2.5%, 1-2.75%, 1-3%, 1-3.25%, 1-3.5%, 1-3.75%, 1-4%, 1-4.25%, 1-4.5%, 1-4.75%, 2-2.25%, 2-2.5%, 2-2.75%, 2-3%, 2-3.25%, 2-3.5%, 2-3.75%, 2-4%, 2-4.25%, 2-4.5%, 2-4.75%, 2.5-2.75%, 2.5-3%, 2.5-3.25%, 2.5-3.5%, 2.5-3.75%, 2.5-4%, 2.5-4.25%, 2.5-4.5%, 2.5-4.75%, 3-3.25%, 3-3.5%, 3-3.75%, 3-4%, 3-4.25%, 3-4.5%, 3-4.75%, 3.5-3.75%, 3.5-4%, 3.5-4.25%, 3.5-4.5%, 3.5-4.75%, 4-4.25%, 4-4.5%, 4-4.75%, 또는 4.5-4.75%이다. 낮은 종양 부담은 마우스 체중의 1% 미만 (예를 들어, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.45%, 0.46%, 0.47%, 0.48%, 또는 0.49%)이다. 일부 실시양태에서, 낮은 종양 부담은 0.1-0.2%, 0.1-0.3%, 0.1-0.4%, 0.2-0.3%, 0.2-0.4%, 또는 0.3-0.4%이다
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법은 마우스에 질환에 걸린 세포 (예를 들어, 종양 세포)를 주사한 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 (예를 들어, 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 1-7일, 1-8일, 1-9일, 1-10일, 1-11일, 1-12일, 1-13일, 1-14일, 2-3일, 2-4일, 2-5일, 2-6일, 2-7일, 2-8일, 2-9일, 2-10일, 2-11일, 2-12일, 2-13일, 2-14일, 3-4일, 3-5일, 3-6일, 3-7일, 3-8일, 3-9일, 3-10일, 3-11일, 3-12일, 3-13일, 3-14일, 4-5일, 4-6일, 4-7일, 4-8일, 4-9일, 4-10일, 4-11일, 4-12일, 4-13일, 4-14일, 5-6일, 5-7일, 5-8일, 5일 내지 9일, 5-10일, 5-11일, 5-12일, 5-13일, 5-14일, 6-7일, 6-8일, 6-9일, 6-10일, 6-11일, 6-12일, 6-13일, 6-14일, 7-8일, 7-9일, 7-10일, 7-11일, 7-12일, 7-13일, 7-14일, 8-9일, 8-10일, 8-11일, 8-12일, 8-13일, 8-14일, 9-10일, 9-11일, 9-12일, 9-13일, 9-14일, 11-12일, 11-13일, 11-14일, 12-13일, 12-14일, 또는 13-14일)에 투여한다. 임의로, 인간 PBMC는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법과 함께 (예를 들어, 동일한 용량 또는 상이한 용량으로 동시에) 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 구축물 중 임의의 것을 포함할 수 있는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법은 1-20×106 개의 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 세포, 예를 들어 1-2×106, 1-3×106, 1-4×106, 1-5×106, 1-6×106, 1-7×106, 1-8×106, 1-9×106, 1-10×106, 1-12×106, 1-14×106, 1-16×106, 1-18×106, 1-20×106, 2-3×106, 2-4×106, 2-5×106, 2-6×106, 2-7×106, 2-8×106, 2-9×106, 2-10×106, 2-12×106, 2-14×106, 2-16×106, 2-18×106, 2-20×106, 3-4×106, 3-5×106, 3-6×106, 3-7×106, 3-8×106, 3-9×106, 3-10×106, 3-12×106, 3-14×106, 3-16×106, 3-18×106, 3-20×106, 4-5×106, 4-6×106, 4-7×106, 4-8×106, 4-9×106, 4-10×106, 4-12×106, 4-14×106, 4-16×106, 4-18×106, 4-20×106, 5-6×106, 5-7×106, 5-8×106, 5-9×106, 5-10×106, 5-12×106, 5-14×106, 5-16×106, 5-18×106, 5-20×106, 6-7×106, 6-8×106, 6-9×106, 6-10×106, 6-12×106, 6-14×106, 6-16×106, 6-18×106, 6-20×106, 7-8×106, 7-9×106, 7-10×106, 7-12×106, 7-14×106, 7-16×106, 7-18×106, 7-20×106, 8-9×106, 8-10×106, 8-12×106, 8-14×106, 8-16×106, 8-18×106, 8-20×106, 9-10×106, 9-12×106, 9-14×106, 9-16×106, 9-18×106, 9-20×106, 10-12×106, 10-14×106, 10-16×106, 10-18×106, 10-20×106, 12-14×106, 12-16×106, 12-18×106, 12-20×106, 14-16×106, 14-18×106, 14-20×106, 16-18×106, 16-20×106, 18-20×106개의 조작된 면역 세포의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스에 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 10×106, 11×106, 12×106, 13×106, 14×106, 15×106, 16×106, 17×106, 18×106, 19×106, 20×106개, 또는 그 초과의 조작된 면역 세포의 용량을 투여한다. 일부 실시양태에서, 마우스에 1회 용량의 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 투여한다. 일부 실시양태에서, 마우스에 1-2, 1-3,1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, 또는 4-5회 용량 (예를 들어, 2, 3, 4, 5회, 또는 그 초과의 용량)의 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 투여한다. 일부 실시양태에서, 초기 용량은 부작용의 위험을 완화하기 위해 2개 이상의 더 작은 용량으로 분할된다 (예를 들어, 1회의 초기 용량을 투여하는 대신에, 초기 용량의 절반을 2회 투여함). 투여 사이의 시간은, 예를 들어, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 그 초과가 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 사이의 시간은 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 1-5일, 1-6,일, 1-7일, 1-8일, 1-9일, 1-10일, 2-3일, 2-4일, 2-5일, 2-6일, 2-7일, 2-8일, 2-9일, 2-10일, 3-4일, 3-5일, 3-6일, 3-7일, 3-8일, 3-9일, 3-10일, 4-5일, 4-6일, 4-7일, 4-8일, 4-9일, 4-10일, 5-6일, 5-7일, 5-8일, 5일 내지 9일, 5-10일, 6-7일, 6-8일, 6-9일, 6-10일, 7-8일, 7-9일, 7-10일, 8-9일, 8-10일, 또는 9-10일이다.
일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 조작된 면역 세포 중 임의의 하나의 효능 및/또는 독성을 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 5, 또는 6가지 상이한 유형의 조작된 면역 세포 요법이 동시에 평가된다.
일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 전에 생착된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 직전에 생착된다. 일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여되기 전 0.5-6일, 예를 들어, 0.5일, 1일, 1.5일, 2일, 2.5일, 3일, 3.5일, 4일, 4.5일, 5일, 5.5일, 또는 6일에 생착된다. 일부 실시양태에서, 인간 PBMC는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여되기 전에 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 2-3일, 2-4일, 2-5일, 2-6일, 3-4일, 3-5일, 3-6일, 4-5일, 4-6일, 또는 5-6일에 투여된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법은 임의의 적용가능한 투여 경로를 사용하여 PBMC 인간화 마우스에게 투여될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내 (예를 들어, 꼬리 정맥을 통해), 피하, 대퇴골내, 심실내, 심장내, 복강내 투여 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 투여 경로는 꼬리 정맥을 통한 정맥내 주사이다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 위한 PBMC 및 면역 세포는 동일한 대상체로부터의 것이다 (두 세포 유형은 자가유래된 것임). 다른 실시양태에서, PBMC 및 면역 세포는 상이한 대상체로부터의 것이다 (두 세포 유형은 동종이계임). 예를 들어, 본원에 기재된 모델은 보편적인 동종이계 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC, 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포), 및 종양 세포는 동일한 대상체로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, PBMC, 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포), 및 종양 세포는 2개 이상의 대상체로부터의 것이다 (예를 들어, PBMC 및 면역 세포는 하나의 대상체로부터의 것이고 종양 세포는 상이한 대상체로부터의 것이거나; PBMC와 종양 세포는 한 대상체로부터의 것이고 면역 세포는 상이한 대상체로부터의 것이거나; 면역 세포와 종양 세포는 한 대상체로부터의 것이고 PBMC는 상이한 대상체로부터의 것임). 일부 실시양태에서, PBMC 및/또는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포)가 수득되는 대상체는 인간 대상체이다. 다른 포유동물이 본원에서 고려된다.
조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 투여 후, CRS 치료 (예를 들어, 항-시토카인 치료)의 치료에 효과적인 후보 작용제가 투여될 수 있다 (예를 들어, CRS의 효과를 예방하거나 감소시키기 위해). 일부 실시양태에서, 마우스 모델은 후보 CRS 치료가 본원에 기재된 바와 같이 특이적으로 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법에 대한 반응으로 CRS를 제거하거나 감소시킬 것인지 여부를 결정하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법과 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여된 후 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 그 초과에 투여된다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여된 후 1-5분, 1-10분, 1-15분, 1-20분, 1-30분, 1-45분, 1-60분, 2-5분, 2-10분, 2-15분, 2-20분, 2-30분, 2-45분, 2-60분, 3-5분, 3-10분, 3-15분, 3-20분, 3-30분, 3-45분, 3-60분, 4-5분, 4-10분, 4-15분, 4-20분, 4-30분, 4-45분, 4-60분, 5-10분, 5-20분, 5-30분, 5-45분, 5-60분, 10-20분, 10-30분, 10-40분, 10-50분, 10-60분, 15-30분, 15-45분, 15-60분, 30-45분, 30-60분, 1-2시간, 1-3시간, 1-4시간, 1-5시간, 1-6시간, 1-7시간, 1-8시간, 1-9시간, 1-10시간, 1-11시간, 1-12시간, 2-3시간, 2-4시간, 2-5시간, 2-6시간, 2-7시간, 2-8시간, 2-9시간, 2-10시간, 2-11시간, 2-12시간, 3-4시간, 3-5시간, 3-6시간, 3-7시간, 3-8시간, 3-9시간, 3-10시간, 3-11시간, 3-12시간, 4-5시간, 4-6시간, 4-7시간, 4-8시간, 4-9시간, 4-10시간, 4-11시간, 4-12시간, 5-6시간, 5-7시간, 5-8시간, 5-9시간, 5-10시간, 5-11시간, 5-12시간, 6-7시간, 6-8시간, 6-9시간, 6-10시간, 6-11시간, 6-12시간, 7-8시간, 7-9시간, 7-10시간, 7-11시간, 7-12시간, 8-9시간, 8-10시간, 8-11시간, 8-12시간, 9-10시간, 9-11시간, 9-12시간, 10-11시간, 10-12시간, 11-12시간, 12-16시간, 12-18시간, 12-20시간, 12-24시간, 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 1-7일, 1-8일, 1-9일, 1-10일, 1-11일, 1-12일, 2-3일, 2-4일, 2-5일, 2-6일, 2-7일, 2-8일, 2-9일, 2-10일, 2-11일, 2-12일, 3-4일, 3-5일, 3-6일, 3-7일, 3-8일, 3-9일, 3-10일, 3-11일, 3-12일, 4-5일, 4-6일, 4-7일, 4-8일, 4-9일, 4-10일, 4-11일, 4-12일, 5-6일, 5-7일, 5-8일, 5일 내지 9일, 5-10일, 5-11일, 5-12일, 6-7일, 6-8일, 6-9일, 6-10일, 6-11일, 6-12일, 7-8일, 7-9일, 7-10일, 7-11일, 7-12일, 8-9일, 8-10일, 8-11일, 8-12일, 9-10일, 9-11일, 9-12일, 10-11일, 10-12일, 또는 11-12일에 투여된다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여되기 전, 예컨대 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 또는 4일에 예방적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 투여되기 전, 1-5분, 1-10분, 1-15분, 1-20분, 1-30분, 1-45분, 1-60분, 2-5분, 2-10분, 2-15분, 2-20분, 2-30분, 2-45분, 2-60분, 3-5분, 3-10분, 3-15분, 3-20분, 3-30분, 3-45분, 3-60분, 4-5분, 4-10분, 4-15분, 4-20분, 4-30분, 4-45분, 4-60분, 5-10분, 5-20분, 5-30분, 5-45분, 5-60분, 10-20분, 10-30분, 10-40분, 10-50분, 10-60분, 15-30분, 15-45분, 15-60분, 30-45분, 30-60분, 1-2시간, 1-3시간, 1-4시간, 1-5시간, 1-6시간, 1-7시간, 1-8시간, 1-9시간, 1-10시간, 1-11시간, 1-12시간, 2-3시간, 2-4시간, 2-5시간, 2-6시간, 2-7시간, 2-8시간, 2-9시간, 2-10시간, 2-11시간, 2-12시간, 3-4시간, 3-5시간, 3-6시간, 3-7시간, 3-8시간, 3-9시간, 3-10시간, 3-11시간, 3-12시간, 4-5시간, 4-6시간, 4-7시간, 4-8시간, 4-9시간, 4-10시간, 4-11시간, 4-12시간, 5-6시간, 5-7시간, 5-8시간, 5-9시간, 5-10시간, 5-11시간, 5-12시간, 6-7시간, 6-8시간, 6-9시간, 6-10시간, 6-11시간, 6-12시간, 7-8시간, 7-9시간, 7-10시간, 7-11시간, 7-12시간, 8-9시간, 8-10시간, 8-11시간, 8-12시간, 9-10시간, 9-11시간, 9-12시간, 10-11시간, 10-12시간, 11-12시간, 12-16시간, 12-18시간, 12-20시간, 12-24시간, 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 2-3일, 2-4일, 또는 3-4일에 투여된다.
PBMC 인간화 마우스에 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 (및 임의로, CRS 치료)을 투여한 후, 마우스를 관찰하여 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 효능을 평가한다. 본원에 사용된 바와 같이, "효능"은 대상체에서 치료 효과를 생성하기 위해 대상체에게 투여된 요법의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 요법은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 요법은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 및 항-시토카인 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 모델은 후보 CRS 치료가 본원에 기재된 바와 같이 특이적 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법에 대한 반응으로 CRS를 제거하거나 감소시킬 것인지 여부를 결정하기 위해 사용된다. "제거하다"란, CRS 치료가 마우스에서 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 치료 후 순환 시토카인 수준을 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 투여하기 전에 마우스에 존재하는 순환 시토카인의 수준 또는 조작된 면역 세포를 받지 않은 대조군 마우스의 순환 시토카인의 수준 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 수준으로 감소시키는 것을 의미한다. "감소하다"란, CRS 치료가 마우스에서 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 후 순환 시토카인의 수준을 CRS 치료 없이 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 투여한 마우스에서 발견되는 것보다 더 낮은 수준으로 감소시키는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, CRS 치료는 순환 시토카인 수준 (예를 들어, 하나 이상의 시토카인의 시토카인 수준)을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 마우스에서 순환 시토카인 수준 (예를 들어, 하나 이상의 시토카인)은 10-20%, 10-30%, 10-40%, 10-50%, 10-60%, 10-70%, 10-80%, 10-90%, 10-100%, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-100%, 80-90%, 80-100%, 또는 90-100% 감소된다.
조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 효능을 결정하기 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 생체내 생물발광 이미징 (BLI), 게놈 연구, 조직학 연구를 사용하여, 또는 종양의 부피를 측정하거나 근사화하는 임의의 다른 방법을 사용하여 종양 성장을 모니터링할 수 있다. 효능은 고형 종양의 반응 평가 기준 (RECIST) 기준, 3-카테고리 방법, 4-반응 mRECIST 기준, 및 5-카테고리 방법을 사용함으로써 결정될 수 있다 (Eisenhauer et al., Eur J Cancer, 2009, 45(2): 228-247; Bertotti et al., Nature. 2015;526(7572):263-7; Gao et al., Nat Med. 2015;21(11):1318-25; Houghton et al., Pediatr Blood Cancer. 2007; 49(7):928-40). 효능의 다른 측정은 종양 부피와 관련되며 무진행 생존, 종양 부피 배가 시간, 상대 종양 부피 (RTV), 종양 성장 억제 (초기 종양 부피에 대한 종양 부피의 변화), 및 종양 성장 속도를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 무진행 생존은 대상체가 질환을 가지나, 악화되지 않는 치료 동안 및 이후의 시간의 길이 (예를 들어, 종양이 성장하지 않는, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 동안 및 이후의 시간의 양)이다. 종양 부피 배가 시간 (DT)은 종양 부피가 두 배가 되는 데 걸리는 시간 (더 빠른 배가 시간은 더 악성 종양을 나타냄)이며 전형적으로 DT에 필적하거나 그보다 더 짧은 측정 시간 간격으로 두 부피 추정으로부터 결정된다. 상대 종양 부피는 시간 경과에 따른 상대적인 종양 부피이며 다음과 같이 계산된다: (X일차에 절대 종양 부피) x (0일차에 100/절대 종양 부피). 0일차는 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 시작되는 날이다. 유사하게, 백분율로서 표시되는 종양 성장 억제 (TGI)는 하기 방정식을 사용하여 초기 종양 부피에 대한 종양 부피의 변화를 조사한다: (1 - (치료된 종양의 평균 부피)/(대조군 종양의 평균 부피)) × 100%. 상이한 모델을 사용하여 종양 성장 속도를 추정한다. 기하급수적으로 성장하는 종양의 경우, 성장 속도는 그의 부피에 비례한다: (1/V)x(dV/dt), 여기서 V는 종양의 부피이고, dV 및 dt는 각각 부피 및 시간의 변화이다.
종양 부피는 시간 경과에 따라 실험 전체에 걸쳐 몇번이고 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과) 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 부피는 1-2회, 1-3회, 1-4회, 1-5회, 1-6회, 1-7회, 1-8회, 1-9회, 1-10회, 2-4회, 2-6회, 2-8회, 2-10회, 3-6회, 3-8회, 3-10회, 4-6회, 4-8회, 4-10회, 5-8회, 5-10회, 6-8회, 6-10회, 7-10회, 8-10회, 또는 9-10회 측정된다. 종양 부피는 시간 경과에 따라, 예를 들어, 종양 세포로의 생착 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21일 또는 그 초과일에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 부피는 1-2일, 1일 내지 3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 1-7일, 1-8일, 1-9일, 1-10일, 1-11일, 1-12일, 2-3일, 2-4일, 2-5일, 2-6일, 2-7일, 2-8일, 2-9일, 2-10일, 2-11일, 2-12일, 3-4일, 3-5일, 3-6일, 3-7일, 3-8일, 3-9일, 3-10일, 3-11일, 3-12일, 4-5일, 4-6일, 4-7일, 4-8일, 4-9일, 4-10일, 4-11일, 4-12일, 5-6일, 5-7일, 5-8일, 5일 내지 9일, 5-10일, 5-11일, 5-12일, 6-7일, 6-8일, 6-9일, 6-10일, 6-11일, 6-12일, 7-8일, 7-9일, 7-10일, 7-11일, 7-12일, 8-9일, 8-10일, 8-11일, 8-12일, 9-10일, 9-11일, 9-12일, 10-11일, 10-12일, 10-14일, 10-16일, 10-18일, 10-20일, 10-21일, 12-14일, 12-16일, 12-18일, 12-20일, 12-21일, 14-16일, 14-18일, 14-20일, 14-21일, 15-16일, 15-18일, 15-20일, 15-21일, 16-18일, 16-20일, 16-21일, 17-19일, 17-21일, 18-19일, 18-20일, 18-21일, 19-20일, 19-21일, 또는 20-21일에 측정된다.
일부 실시양태에서, 종양 부피의 변화는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 (및, 임의로, CRS 치료)의 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법으로 치료된 마우스에서의 종양 부피는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법으로 치료되지 않은 마우스에서의 종양 부피와 비교될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 부피는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 받지 않은 마우스에 비해 또는 이전 시점에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과로 감소한다. 일부 실시양태에서, 종양 부피는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법을 받지 않은 마우스에 비해 또는 이전 시점에 비해 10-20%, 10-30%, 10-40%, 10-50%, 10-60%, 10-70%, 10-80%, 10-90%, 10-100%, 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-100%, 80-90%, 80-100%, 또는 90-100% 감소된다.
CRS 유도는 또한 체중 측정을 통해 모니터링할 수 있는데, 이는 급성 독성이 유의한 마우스 체중 감소와 관련되기 때문이다. 추가로, 임상 관찰은 CRS를 나타낼 수 있다. CRS와 관련된 임상 관찰의 예는, 발끝으로 구부린 자세/비정상적인 보행, 활동 감소 (예를 들어 자극을 받지 않으면 움직이지 않음), 및/또는 접촉에 대한 무반응을 포함한다. 생존율 (및 지속기간)은 또한 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 (및/또는 항-CRS 치료)의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
시토카인-유도 간 및 신장 손상을 조사함으로써 효능을 또한 평가할 수 있다. 이는, 예를 들어, 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알부민, 총 빌리루빈, 크레아티닌 및 혈액 요소 질소의 수준을 측정하는 것과 같은, 간-신장 기능의 혈청 생화학적 분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전임상 마우스 모델의 간 중량 변화는 인간 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 (및, 임의로, CRS 치료)의 효능을 나타낸다. 건강한 마우스의 간 중량은 그의 체중의 대략 5%이다. 종양 세포 (예를 들어 Raji_Luc 세포)의 주사는 종양 세포가 간에 보급되어, 간 중량 증가를 야기한다. 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 (및/또는 항-CRS 치료) 후 간의 중량을 측정함으로써, 치료가 효과적으로 종양 세포 축적을 제거하거나 감소시켰는지 여부를 결정할 수 있다.
CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법의 부작용 평가를 위한 방법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 가능한 부작용을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 가능한 부작용은 시토카인 방출 증후군 (CRS), 대식세포 활성화 증후군 (MAS), 신경독성 (뇌병증 증후군), 종양 용해 증상 (TLS), 아나필락시스, 온-타깃, 종양 외 독성, 및 B 세포 무형성증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CRS와 관련하여, 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 및/또는 CRS 치료의 투여 후 PBMC 인간화 마우스 모델로부터의 혈액 샘플에서 특정 시토카인을 측정할 수 있다. 예를 들어, 시토카인은 IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-2, IL-4, 및 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 측정된 시토카인의 수준은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 면역독성의 중증도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 다음과 같은 경우에 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법의 면역독성의 중증도가 높은 것 (예를 들어, CRS 유도 가능성이 높은 것)으로 결정하는 것을 추가로 포함한다: 마우스의 IFN-γ 수준 ≥ 1,800 pg/ml ±10%; 마우스의 IL-10 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 마우스의 IL-6 수준 ≥ 25 pg/ml ±10%; 마우스의 IL-2 수준 ≥ 80 pg/ml ±10%; 마우스의 IL-4 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 마우스의 TNFα 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 마우스의 MCP-1 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 마우스의 GM-CSF 수준 ≥ 600 pg/ml ±10%; 마우스의 IL8 수준 ≥ 15 pg/ml ±10%.
대식세포 활성화 증후군 (MAS) 또는 혈구탐식성 림프조직구증식증 (HLH)은 임상적으로 간 기능장애, 페리틴 수준 증가, 및, 일부 경우에, 피브리노겐 수준 감소로 나타나며, 본원에 기재된 마우스 모델을 사용하여 또한 조사할 수 있다. 대식세포는 IL-6, IL-1, 및 IFN-γ를 포함한 시토카인의 주요 생산을 매개하며, 그의 활성화 (MAS)는 CRS에서 역할을 하는 것으로 생각된다 (Hao et al., Experimental Hematology & Oncology, 2020, 9:15). 따라서, 마우스 모델에서 세 가지 시토카인의 상승된 수준은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 MAS를 야기할 수 있음을 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 마우스에 MAS 치료를 투여하여 치료가 인간 대상체에서 MAS를 예방하거나 감소시키는지 여부를 결정할 수 있다. MAS 치료의 예는 글루코코르티코이드 (예를 들어, 메틸프레드니손, 덱사메타손), 시클로스포린 A, 에토포시드, 면역글로불린, 및 시클로포스파미드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
신경독성 (뇌병증 증후군), 또는 면역 이펙터 세포-연관 신경독성 증후군 (ICANS)은 인간에서 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법 후 대략 5-17일 후에 발생할 수 있다 (Herlopian et al., Neurology, 2018, 91(5): 227-229). 이는 전반적인 뇌병증, 실어증, 발작/발작-유사 활동, 둔감, 떨림/간대성 근경련, 및 환각을 특징으로 한다. 신경독성을 갖는 대상체는 또한 높은 수준의 IFN-γ, IL-6, 및 TNF-α를 갖는다. 마우스 모델에서 세 가지 시토카인의 상승된 수준은 조작된 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 NK 세포) 요법이 신경독성을 발생시킬 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 치료가 인간 대상체에서 신경독성을 예방하거나 감소시킬 것인지 여부를 결정하기 위해 마우스에 신경독성 치료를 투여할 수 있다. 신경독성 치료의 예는 코르티코스테로이드 (예를 들어 덱사메타손, 프레드니손), 항-IL-6 항체 (예를 들어 실툭시맙), 및 혈소판 과다수혈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가적 실시양태
본 개시내용의 사용과 관련된 추가적 실시양태는 하기 번호가 매겨진 단락에서 제공된다:
1. 면역결핍 마우스를 종양 세포로 생착하는 것;
상기 마우스를 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 생착하는 것;
상기 마우스에게 종양 세포 상의 세포 표면 항원을 특이적으로 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 인간 면역 세포 (인간 CAR 면역 세포)를 투여하는 것; 및
시토카인 방출 증후군 (CRS)의 유도 및/또는 종양 세포를 치료하기 위한 인간 CAR 면역 세포의 효능에 대해 상기 마우스를 검정하는 것
을 포함하는 방법.
2. 단락 1에 있어서, 마우스를 종양 세포를 포함하는 환자 유래 이종이식편 (PDX)으로 생착하는 것을 포함하는 방법.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 마우스가 0.1-5.0x106개의 종양 세포로 생착되는 것인 방법.
4. 단락 3에 있어서, 마우스가 0.25-0.5x106개의 종양 세포로 생착되는 것인 방법.
5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 종양 세포가 종양 세포주 또는 환자-유래 이종이식편 (PDX)으로부터의 것인 방법.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스에 방사선조사하는 것을 추가로 포함하는 방법.
7. 단락 6에 있어서, 마우스가 마우스에 방사선조사한 직후에 종양 세포로 생착되는 것인 방법.
8. 단락 6에 있어서, 마우스가 마우스에 방사선조사한 후 4-24시간에 종양 세포로 생착되는 것인 방법.
9. 단락 1 내지 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 0.5-3.0x107개의 PBMC로 생착되는 것인 방법.
10. 단락 9에 있어서, 마우스가 1.5x107개의 PBMC로 생착되는 것인 방법.
11. 단락 6 내지 단락 10 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 마우스에 방사선조사한 직후에 PBMC로 생착되는 것인 방법.
12. 단락 6 내지 단락 10 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 마우스에 방사선조사한 후 4-24시간에 PBMC로 생착되는 것인 방법.
13. 단락 1 내지 단락 10 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 PBMC로 생착되고 인간 CAR 면역 세포가 동시에 투여되는 것인 방법.
14. 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스에게 종양 세포 생착 후 6일 내지 12일에 CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법을 투여하는 것인 방법.
15. 단락 1 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스에게 1.0-5.0x106개의 인간 CAR 면역 세포를 투여하는 것인 방법.
16. 단락 1 내지 단락 15 중 어느 한 단락에 있어서, PBMC 및 인간 CAR 면역 세포가 상이한 공여자 대상체로부터의 것인 방법.
17. 단락 1 내지 단락 15 중 어느 한 단락에 있어서, PBMC 및 인간 CAR 면역 세포가 동일한 공여자 대상체로부터의 것인 방법.
18. 단락 17에 있어서, 종양 세포, PBMC, 및 인간 CAR 면역 세포가 동일한 공여자 대상체로부터의 것인 방법.
19. 단락 1 내지 단락 18 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스에게 시토카인 방출 증후군 (CRS)의 치료에 효과적인 후보 작용제를 투여한 다음에 CRS 유도 및 종양 세포를 치료하기 위한 인간 CAR 면역 세포의 효능에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
20. 단락 19에 있어서, CRS의 치료에 효과적인 후보 작용제가 인간 CAR 면역 세포가 투여된 직후 내지 투여된 후 12일에 투여되는 것인 방법.
21. 단락 20에 있어서, CRS의 치료에 효과적인 후보 작용제가 인간 CAR 면역 세포가 투여된 후 5일 내지 9일에 투여되는 것인 방법.
22. 단락 20에 있어서, CRS의 치료에 효과적인 후보 작용제가 인간 CAR 면역 세포가 투여되기 1일 내지 3일 전에 투여되는 것인 방법.
23. 단락 20 내지 단락 22 중 어느 한 단락에 있어서, 후보 작용제가 IL-6 길항제, 항-IL-6 항체, 코르티코스테로이드, 항-TNF-α 약물, IL-1R 억제제, GM-CSF 억제제, 및 소분자 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
24. 단락 23에 있어서, IL-6 길항제가 토실리주맙인 방법.
25. 단락 1 내지 단락 24 중 어느 한 단락에 있어서, 종양 세포, PBMC 및 인간 CAR 면역 세포가 꼬리 정맥내 주사를 통해 마우스에게 투여되는 것인 방법.
26. 단락 6 내지 단락 25 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 100-1300 cGy로 방사선조사되는 것인 방법.
27. 단락 1 내지 단락 26 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스인 방법.
28. 단락 1 내지 단락 27 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 Prkdc 유전자의 널 돌연변이 및 Il2rg 유전자의 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
29. 단락 28에 있어서, 마우스가 NOD-Cg.-PrkdcscidIL2rgtm1wJl/SzJ 유전자형을 갖는 것인 방법.
30. 단락 28 또는 단락 29에 있어서, 마우스가 기능적 주요 조직적합성 복합체 I (MHC I) 및 주요 조직적합성 복합체 II (MHC II)가 결여되어 있는 것인 방법.
31. 단락 30에 있어서, 마우스가 널 H2-Ab1 유전자를 포함하는 것인 방법.
32. 단락 30 또는 단락 31에 있어서, 마우스가 널 MHC 클래스 I H2-K1 유전자를 포함하는 것인 방법.
33. 단락 30 내지 단락 32 중 어느 한 단락에 있어서, 마우스가 널 MHC 클래스 I H2-D1 유전자를 포함하는 것인 방법.
34. 단락 33에 있어서, 마우스가 NOD.Cg-Prkdcscid H2-K1tm1Bpe H2-Ab1em1Mvw H2-D1tm1Bpe Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스 (NSG-(K b D b )널 (IA 널 ) 마우스)인 방법.
35. 단락 1 내지 단락 34 중 어느 한 단락에 있어서, CRS 유도에 대해 마우스를 검정하는 것이 인터류킨 (IL)-6, IL10, 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-1, IL-2, IL-2-수용체 알파 (IL-2Rα), IL-8, IL-4, IL-18, 및 대식세포 염증성 단백질 (MIP) 4로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 순환 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
36. 단락 31에 있어서, 다음과 같은 경우에 CRS 유도의 가능성이 높은 것으로 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법:
마우스에서의 인간 IFN-γ 수준 ≥ 1,800 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-10 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-6 수준 ≥ 25 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-2 수준 ≥ 80 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-4 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 TNFα 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
마우스에서의 인간 IL-8 수준 ≥ 15 pg/ml ±10%;
마우스에서 인간 MCP-1 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 및/또는
마우스에서의 인간 GM-CSF 수준 ≥ 600 pg/ml ±10%.
37. 단락 1 내지 단락 36 중 어느 한 단락에 있어서, 대식세포 활성화 증후군 (MAS)에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
38. 단락 37에 있어서, MAS의 가능성이 IL-6, IL-1, 및/또는 IFN-γ의 순환 수준을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
39. 단락 1 내지 단락 38 중 어느 한 단락에 있어서, 신경독성에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
3640. 단락 39에 있어서, 신경독성의 가능성이 IFN-γ, IL-6, 및/또는 TNF-α의 순환 수준을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
41. 단락 1 내지 단락 40 중 어느 한 단락에 있어서, 간-신장 기능의 혈청 생화학적 분석을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 단락 41에 있어서, 혈청 생화학적 분석이 하기 마커 중 적어도 하나의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법: 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알부민, 총 빌리루빈, 크레아티닌, 또는 혈액 요소 질소.
43. 단락 19 내지 단락 42 중 어느 한 단락에 있어서, CRS 치료에 효과적인 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
44. 단락 43에 있어서, 하나 이상의 시토카인의 순환 수준이 인간 CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법 및 후보 작용제가 투여된 마우스에서 후보 작용제 없이 인간 CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법이 투여된 마우스에 비해 30-100% 감소될 때 CRS 치료에 효과적인 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는지를 결정하는 것을 포함하는 방법.
45. 단락 1 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 종양 세포를 치료하기 위한 인간 CAR 면역 세포의 효능에 대해 마우스를 검정하는 것이 종양 세포의 성장을 측정하는 것을 포함하는 방법.
46. 단락 45에 있어서, 종양 세포의 성장이 시간 경과에 따라 측정되는 것인 방법.
47. 단락 45 또는 단락 46에 있어서, 인간 CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법이 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부피 감소가 효능을 나타내는 것인 방법.
48. 단락 45 또는 단락 46에 있어서, 인간 CAR 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 요법이 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부담 감소가 효능을 나타내는 것인 방법.
49. 단락 45 내지 단락 48 중 어느 한 단락에 있어서, 종양 세포의 성장이 무진행 생존, 종양 부피 배가 시간, 상대 종양 부피, 종양 성장 억제, 또는 종양 성장 속도를 결정하는 데 사용되는 것인 방법.
50. 단락 1 내지 단락 49 중 어느 한 단락에 있어서, 인간 CAR 면역 세포가 보편적 동종이계 인간 CAR 면역 세포인 방법.
51. 면역결핍 마우스에 방사선조사하는 것;
상기 마우스를 종양 세포로 생착하는 것;
상기 마우스를 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 생착하는 것;
상기 마우스에게 종양 세포 상의 세포 표면 항원을 특이적으로 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 보편적 동종이계 인간 면역 세포 (보편적 동종이계 인간 CAR 면역 세포)를 투여하는 것; 및
시토카인 방출 증후군 (CRS)의 유도 및/또는 종양 세포를 치료하기 위한 보편적 동종이계 인간 CAR 면역 세포의 효능에 대해 상기 마우스를 검정하는 것
을 포함하는 방법.
52. 단락 1 내지 단락 51 중 어느 한 단락에 있어서, 인간 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
53. 단락 52에 있어서, 인간 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 호중구 중 적어도 2개를 포함하는 것인 방법.
실시예
실시예 1
CAR T19 치료 후 시토카인 방출에 대한 방사선조사의 효과를 조사하였다. 6주 내지 7주령의 암컷 MHC 클래스 I/II KO NSG™ 마우스는 100 cGy 방사선조사를 받았다. 이어서, 방사선조사되지 않은 및 방사선조사된 MHC 클래스 I/II KO NSG™는 방사선조사 후 적어도 4시간에 Raji_Luc 0.25x106/마우스의 IV 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 다음으로, 방사선조사된 마우스 및 방사선조사되지 않은 마우스는 10x106 CD19 CAR T 또는 10x106 모의 T CAR T를 받았다. 마우스는 유사한 종양 부담을 갖는 것으로 밝혀졌다. CAR T 치료 후 2일에에 마우스를 채혈하고 순환 시토카인 농도를 BD 세포측정 비드 검정 (CBA) Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. CAR T 치료 후 일일 체중 및 임상 관찰을 취하였다. CAR T 효능에는 어떤 유의한 차이도 없었지만, 방사선조사된 마우스는 CAR T 유도 시토카인 방출에 더 민감하였다. 이 데이터는 방사선조사된 MHC 클래스 I/II KO NSG™ 마우스가 CAR T19 치료 후 방사선조사되지 않은 대조군 마우스와 비교하여 시토카인 방출이 증가하였다는 것을 입증하였다 (도 1a-1b).
실시예 2
낮은 종양 부담을 갖는 마우스에 대한 CD22 CAR T 세포 요법의 효과를 조사하였다. 방사선조사된 DKO NSG™ 및 NSG™ 마우스는 0.25x106 Raji_Luc 세포 (0일차, D0)로 생착된 후, D6에 3x106 CD22 CAR T 치료를 받았다. 도 2a에 도시된 바와 같이, CD22 CAR T는 종양 부담을 정량적으로 측정하기 위해 평균 방사휘도를 사용하여 생성된 생체내 생물발광 이미징 (BLI) 플롯에 의해 입증된 바와 같이, DKO 마우스 및 NSG™ 마우스 둘 다에서 유사한 효능을 갖는다. DKO 및 NSG™ 마우스 둘 다 CAR T 치료시 매우 적은 양의 시토카인 방출을 갖는 것으로 밝혀졌다. CAR T 치료 후 2일에 마우스를 채혈하고 순환 시토카인 농도를 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다 (도 2b). 이 데이터는 낮은 종양 부담을 갖는 마우스에 대한 CD22 CAR T 치료가 양호한 효능을 갖고 매우 낮은 수준의 인간 시토카인을 유도한다는 것을 입증하였다 (도 2a-2b).
실시예 3
높은 종양 부담을 갖는 마우스에 대한 CD19 CAR T 세포 요법의 효과를 조사하였다. 방사선조사된 DKO NSG™는 0.25x106 Raji_Luc 세포 (D0)로 생착된 후, D9 또는 D11에 5x106 CD19 CAR T 또는 5x106 모의 T 치료를 받았다. CAR T/모의 T 치료 후 2일에 마우스 혈청을 수집하였다. Raji_Luc 종양 성장을 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 더 높은 종양 부담을 갖는 마우스 (D11)는 CD19 CAR T 치료 후 상대적으로 낮은 종양 부담을 갖는 마우스와 비교하여 인간 시토카인 (INF-γ, TNFα, IL10, IL6, 및 IL4)이 증가하였다 (도 3a). 낮은 Raji-Luc 종양 부담을 갖는 DKO 마우스에 대한 CD19 CAR T 치료는 종양 성장을 유의하게 억제하고 마우스 체중 감소를 예방하였으며; 높은 종양 부담을 갖는 DKO 마우스에 대한 CD19 CAR T 치료는 불량한 효능을 발생시킨다 (도 3b). CAR T 치료군 둘 다 PBS 치료군과 비교하여 마우스 체중 감소를 예방하였다. 군당 5마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로 제시하였다. 이 데이터는 더 높은 종양 부담을 갖는 마우스에 대한 CD19 CAR T 치료가 불량한 효능 및 높은 CRS 유도를 갖는다는 것을 입증하였다 (도 3a-3b).
실시예 4
자가 PBMC/CD19 CAR T 치료 후 중등도 종양 부담으로부터 시간 경과에 따른 시토카인 방출이 착수되었다. NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.5x106/마우스의 IV 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 마우스를 9일차부터 시작하여 PBS 또는 5 x106 CD19 CAR T, 15 x106 PBMC 또는 5 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC로 정맥내 치료하였다. CD19 CAR T 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 유래되었다. 마우스 혈청을 CAR T/PBMC 치료 후 상이한 날 (D1, D2, D3)에 수집하였다. 순환 시토카인 농도는 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. CD19 CAR T 뱃치 1 및 PBMC는 동일한 공여자로부터의 것이었다. 군당 4마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로 제시하였다. PBMC/CAR T 공동-치료된 마우스는 CD19 CAR T를 단독으로 받은 마우스와 비교하여 인간 IFN-γ, TNF 및 IL6가 증가하였다 (도 4). 이 데이터는 CAR T 세포 요법이 PBMC를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 PBMC 인간화 마우스에서 더 높은 수준의 인간 시토카인을 유도한다는 것을 입증하였다.　
실시예 5
종양 진행 및 시토카인 수준에 대한 PBMC 인간화 DKO 마우스에 대한 자가 CD22 CAR T 치료의 효과를 조사하였다. CD22 CAR T 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 유래하였다. MHC 클래스 I/II KO NSG 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.5x106/마우스의 IV 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. Raji_Luc 생착 후 2일에, 마우스는 15M PBMC를 받았다. Raji_Luc 생착 후 6일에, 마우스는 1) PBS; 2) 5x106 CD19 CAR T; 또는 3) 5x106 모의 T를 받았다. CAR T/모의 치료 후 2일에 마우스를 채혈하고 순환 시토카인 농도를 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. CAR T 치료 후 일일 체중 및 임상 관찰을 수행하였다. 도 5a의 상부에 나타낸 바와 같이, 생체내 생물발광 이미징 (BLI)은 종양 부담을 정량적으로 측정하기 위해 평균 방사휘도를 사용하여 플롯팅되었다. 도 5a의 하부는 각각의 마우스에 대한 배측(dorsal) (D) 및 복측(ventral) (V) 이미지를 제공한다. 군당 4-5마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시하였다. CAR T 효능은 PBS 또는 모의 CAR T 치료로 나타난 것에 비해 결정되었다. PBMC 인간화를 사용한 자가 CD22 CAR T 치료는 PBMC 인간화 마우스에서 모의 T 치료와 비교하여 더 높은 인간 시토카인 ((INF-γ, TNFα, IL10, IL6, IL4 및 IL2)을 유도하였다 (도 5b). 이 데이터는 PBMC 인간화 DKO 마우스에 대한 자가 CD22 CAR T 치료가 모의 T 치료와 비교하여 Raji_Luc 종양 진행을 차단하고 더 높은 인간 시토카인을 유도하였다는 것을 입증한다 (도 5a-5b). 따라서, CAR T 세포 약물 용량 범위는, 일부 경우에, 시토카인 유도 및 독성이 더 적은 효과적인 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 데이터는, 일부 경우에, 대상체가 시토카인 유도를 감소시키는 약물로 사전에 치료될 수 있도록 치료 전에, 개인에 대한 독성을 예측할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 6
PBMC 인간화 DKO 마우스 모델을 사용하여 효능 및 시토카인 방출을 조사하였다. PBMC 인간화 마우스 또는 대조군 (PBMC 없음) 마우스를 Raji_Luc (마우스당 0.25x106) 후 6일에 PBS 또는 5 x106 CD19 CAR T 세포 또는 5 x106 모의 T 세포로 IV 치료하였다. CD19 CAR T 세포 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 유래되었다. CAR T/PBMC 치료 후 2일에 혈청을 수집하고 시토카인 수준 (D8)을 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 분석하였다. 군당 5마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시하였다. PBMC 인간화 없이 CD19 CAR T를 받은 마우스와 비교하여 CD19 CAR T/PBMC 치료 후 중등도 종양 부담 마우스로부터 시토카인 방출이, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 증가되었다. 도 6b는 종양 부담을 정량적으로 측정하기 위해 평균 방사휘도를 사용하여 플롯팅된 생체내 생물발광 이미징 (BLI)을 나타낸다. CAR T 효능은 PBMC 인간화 유무에 관계없이 나타났으나 12일차에 PBMC 인간화로 완전한 반응이 분명하였다. 상이한 실험일에 이들 마우스의 생물발광 이미지는 도 6c에 나타냈다. 모든 마우스는 동일한 카메라 설정으로 촬영되었다. 각각의 마우스에 대해 배측 (D) 및 복측 (V) 이미지를 나타냈다. 군당 5마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시하였다. 이 데이터는 PBMC 인간화 DKO 마우스 모델이 효능 (이미징) 및 시토카인 방출 둘 다를 평가하기 위한 고유한 플랫폼을 제공한다는 것을 입증한다 (도 6a-6c).
실시예 7
자가 PBMC/CD19 CAR T 치료 후 중등도 종양 부담으로부터 효능 및 시토카인 방출을 조사하였다. DKO NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.25x106/마우스의 정맥내 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 마우스를 PBS 또는 15 x106 PBMC 또는 1 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC, 3 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC 또는 5 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC로 8일차부터 시작하여 정맥내 치료하였다. CD19 CAR T 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 유래되었다. CAR T/PBMC 치료 후 2일에 마우스 혈청을 수집하였다. 순환 시토카인 농도는 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. 군당 5마리의 마우스가 있었고 데이터는 도 7a-7b에 평균 ± SEM으로서 제시하였다. PBMC/CAR T 공동-치료된 마우스는 인간 IFN-γ의 용량-의존적으로 증가된 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 7b). 높은 CART 용량은 낮은 CART 용량 치료와 비교하여 개선된 효능 (종양 부담)을 가졌으며 (도 7a, 좌측 그래프), 한편 두 CART 용량 모두 Raji_Luc 종양 성장으로 인한 마우스 체중 감소를 구제하는 것으로 관찰되었다. (도 7a, 우측 그래프). 이 데이터는 CAR T 세포 요법이 용량-의존적 방식으로 PBMC 인간화 마우스에서 더 높은 수준의 인간 시토카인을 유도하였다는 것을 입증하였다.
실시예 8
자가 PBMC/CD19 CAR T 치료 후 PBMC를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 PBMC 인간화 마우스에서 인간 시토카인 수준에 대한 CAR T 세포 요법의 효과를 조사하였다. CD19 CART 세포는 새로운 CD19 CAR 구축물 및 새로운 PBMC 공여자 (공여자 9534)를 사용하여 생성되었다. DKO NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.25x106/마우스의 정맥내 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 마우스를 PBS 또는 15 x106 PBMC 또는 5x106 CD19 CAR T 단독, 또는 5 x 106 CD19 CAR T 플러스 15 x 106 PBMC로 8일차부터 시작하여 정맥내 치료하였다. CD19 CAR T 및 PBMC는 동일한 공여자로부터 유래되었다. CAR T/PBMC 치료 후 2일에 마우스 혈청을 수집하였다. 순환 시토카인 농도는 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. 군당 5마리의 마우스가 있었고 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시하였다. PBMC/CAR T 공동-치료된 마우스 및 CART 단독 처리된 마우스는 종양 부담이 감소하였고 (도 8a) 유의한 체중이 감소되지 않았다 (도 8b). 더욱이, PBMC/CART 공동-치료된 마우스는 CART 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 높은 수준의 인간 IFN 및 TNF 방출을 가졌다 (도 8c).
실시예 9
Raji_Luc 종양을 갖는 상이한 PBMC 인간화 마우스로부터의 동종이계 CD19 CART 치료의 효능을 조사하였다. 동종이계 CD19 CART 세포는 변형된 CD19 CAR 구축물 및 새로운 PBMC 공여자를 사용하여 생성되었다. DKO NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.25x106/마우스의 정맥내 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장을 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 마우스를 PBS 또는 15 x106 PBMC 또는 5x106 CD19 CAR T 단독, 또는 5 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC로 8일차부터 시작하여 정맥내 치료하였다. 두 개의 상이한 공여자의 PBMC (PBMC 8058 또는 PBMC 9601)를 인간화에 사용하였다. 동종이계 CART는 종양 부담 이미징 (도 9a) 및 유동 분석 CD3-CD19+ 세포 집단 (도 9b)을 통해 어느 정도 수준의 효능을 나타냈다. 동종이계 CD19 CART 치료는 Raji-Luc 종양 발달에 의해 유도된 체중 감소를 차단하였다 (도 9c).
실시예 10
동종이계 CD19 CART 치료 후 Raji_Luc 종양을 갖는 상이한 PBMC 인간화 마우스로부터의 시토카인 방출의 변이를 조사하였다. 새로운 동종이계 CD19 CART 세포는 새로운 CD19 CAR 구축물 및 새로운 PBMC 공여자를 사용하여 생성되었다. DKO NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) 0.25x106/마우스의 정맥내 주사로 생착되었다. Raji_Luc 종양 성장은 생체내 생물발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링하였다. 마우스를 PBS 또는 15 x106 PBMC 또는 5x106 CD19 CAR T 단독, 또는 5 x106 CD19 CAR T 플러스 15 x106 PBMC로 8일차부터 시작하여 정맥내 치료하였다. 두 가지 상이한 PBMC 공여자 (PBMC 8058 또는 PBMC 960)1를 인간화에 사용하였다. 마우스 혈청을 CAR T/PBMC 치료 후, 상이한 날 (D2, D3)에 수집하였다. 순환 시토카인 농도는 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. CD19 CART/PBMC 9601 치료된 마우스는 CD19 CART/PBMC 8508 치료된 마우스와 비교하여 더 높은 수준의 IL10 및 IL6 방출을 가졌는데 (도 10a-10c), 이는 공여자-특이적 용량 반응을 입증하는 것이다.
실시예 11
자가 CD19 CART 치료 후 상이한 PBMC 인간화 마우스로부터의 시토카인 방출 및 독성의 변이를 조사하였다. 자가 CD19 CART 세포는 PBMC 공여자 9534 또는 PBMC 공여자 9531로부터 새로운 CD19 CAR 구축물 (실시예 8에서 사용됨)을 사용하여 생성되었다. DKO NSG™ 마우스는 방사선조사 후 (D0) PBMC 15x106/마우스의 정맥내 주사로 생착되었다. 마우스를 PBS 또는 5x106 모의 T, 또는 5 x106 자가 CD19 CAR T로 6일차부터 시작하여 정맥내 치료하였다. 마우스 혈청을 CAR T/PBMC 치료 후 상이한 날에 수집하였다 (도 11a). 순환 시토카인 농도를 BD CBA Th1/Th2 II 키트에 의해 측정하였다. CART 치료 후 6일, CD3-CD19+ 집단의 유동 분석을 위해 모든 마우스로부터 전혈 및 비장을 수집하였다. 자가 CD19 CART 샘플 둘 다는 상응하는 PBS 대조군 및 모의 T 치료된 마우스와 비교하여 양호한 효능을 나타냈고 CD3-CD19+ 집단을 감소시켰다 (도 11b). 대조적으로, PBMC 9534-인간화 마우스는 자가 CART 치료 후 PBMC 9531-인간화 마우스와 비교하여 유의한 체중 감소 (도 11c) 및 유의하게 더 높은 수준의 IL-10 및 IL-4 (도 11d)를 가졌는데, 이는 공여자-특이적 반응을 나타내는 것이다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 그것이 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 용어 "하나"는 분명하게 달리 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 분명하게 달리 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에서 청구되는 임의의 방법에서, 방법 단계 또는 작용의 순서가 반드시 그 방법 단계 또는 작용이 언급되는 순서로 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
상기한 명세서에서 뿐만 아니라 청구범위에서, "포함하는", "포함한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "구성되는" 등과 같은 모든 전환 어구들은 개방-종료형인 것, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures) 섹션 2111.03에 제시되어 있는 바와 같이, "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 전환 어구만이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전환 구일 수 있다.
숫자 값에 선행하는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 언급되는 숫자 값의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우에는, 범위의 상단과 하단 사이의 각각의 값은 본원에서 구체적으로 고려되고 설명되어 있다.

Claims (44)

  1. 인간 면역 세포 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계이며, 여기서 인간 면역 세포는 질환에 걸린 인간 세포 상의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 조작된 수용체를 포함하고, 면역결핍 마우스는 질환에 걸린 인간 세포가 생착된 것인 단계; 및
    시토카인 방출 증후군 (CRS)의 증상 및/또는 인간 면역 세포의 효능에 대해 면역결핍 마우스를 검정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포를 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 면역 세포가 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 호중구로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 인간 면역 세포가 게놈-변형 면역 세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 인간 면역 세포가 조작된 CAR을 갖는 T 세포인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 수용체가 T 세포 수용체 (TCR)인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인간 면역 세포가 조작된 TCR을 갖는 T 세포인 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역 세포가 조절 T 세포 (Treg)인 방법.
  10. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역 세포가 종양-침윤 림프구 (TIL)인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포가 혈액 세포, 근육 세포, 및 뉴런 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포가 종양 세포인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 종양 세포가 일차 종양 세포인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포가 암성 세포인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포가 비-암성 세포인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PBMC 및 인간 면역 세포가 자가유래된 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포, PBMC 및 인간 면역 세포가 자가유래된 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PBMC 및 인간 면역 세포가 동종이계인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역 세포 및 인간 PBMC를 면역결핍 마우스에게 투여하기 전에 면역결핍 마우스에 방사선조사하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역 세포 및 인간 PBMC가 동시에 투여되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 전에 CRS를 치료하기 위한 후보 작용제를 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 Prkdc 유전자에서의 널 돌연변이 및 Il2rg 유전자에서의 널 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 마우스가 NOD-Cg.-Prkdc scid IL2rg tm1wJl /SzJ 유전자형을 갖는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 기능적 주요 조직적합성 복합체 I (MHC I) 및 주요 조직적합성 복합체 II (MHC II)가 결여되어 있는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 널 H2-Ab1 유전자를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 널 MHC 클래스 I H2-K1 유전자를 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 널 MHC 클래스 I H2-D1 유전자를 포함하는 것인 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 NOD.Cg-Prkdc scid H2-K1 tm1Bpe H2-Ab1 em1Mvw H2-D1 tm1Bpe Il2rg tm1Wjl/ SzJ 마우스 (NSG-(K b D b )null (IA null ) 마우스)인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 검정하는 것이 인터류킨 (IL)-6, IL10, 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-1, IL-2, IL-2-수용체 알파 (IL-2Rα), IL-8, IL-4, IL-18, 및 대식세포 염증성 단백질 (MIP) 4로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 순환 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 다음과 같은 경우에 CRS 유도의 가능성이 높은 것으로 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법:
    마우스에서의 인간 IFN-γ 수준 ≥ 1,800 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 IL-10 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 IL-6 수준 ≥ 25 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 IL-2 수준 ≥ 80 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 IL-4 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 TNFα 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%;
    마우스에서의 인간 IL-8 수준 ≥ 15 pg/ml ±10%;
    마우스에서 인간 MCP-1 수준 ≥ 120 pg/ml ±10%; 및/또는
    마우스에서의 인간 GM-CSF 수준 ≥ 600 pg/ml ±10%.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대식세포 활성화 증후군 (MAS)에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, MAS의 가능성이 IL-6, IL-1, 및/또는 IFN-γ의 순환 수준을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 신경독성에 대해 마우스를 검정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 신경독성의 가능성이 IFN-γ, IL-6, 및/또는 TNF-α의 순환 수준을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 간-신장 기능의 혈청 생화학적 분석을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 혈청 생화학적 분석이 하기 마커 중 적어도 하나의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법: 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알부민, 총 빌리루빈, 크레아티닌, 또는 혈액 요소 질소.
  38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 시토카인의 순환 수준이 인간 면역 세포 및 후보 작용제가 투여된 마우스에서 후보 작용제 없이 인간 면역 세포가 투여된 마우스에 비해 30-100% 감소될 때 후보 작용제가 하나 이상의 순환 시토카인의 수준을 감소시키는 것으로 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 질환에 걸린 인간 세포가 인간 종양 세포이고, 검정하는 것이 인간 종양 세포의 성장을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 인간 종양 세포의 성장이 시간 경과에 따라 측정되는 것인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 인간 면역 세포가 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부피 감소가 효능을 나타내는 것인 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 면역 세포가 투여되지 않은 대조군 마우스에 비해 20% 이상의 종양 부담 감소가 효능을 나타내는 것인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 종양 세포의 성장이 무진행 생존, 종양 부피 배가 시간, 상대 종양 부피, 종양 성장 억제, 또는 종양 성장 속도를 결정하는 데 사용되는 것인 방법.
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