CN113264996A - 一种人源化的非人动物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人源化的非人动物的构建方法，IL2RB基因和/或IL2基因人源化的非人动物，多基因修饰的非人动物的构建方法，以及获得的IL2RB和/或IL2基因和/或IL2RA人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物，及其在靶向人IL2通路抗体的筛选、药效评价中的应用。

Description

一种人源化的非人动物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是人源化改造的转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。更具体的，涉及包含人白介素2(IL2)及其配体亚基IL2RA、IL2RB基因序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。
背景技术
白细胞介素2(Interleukin 2，IL-2)是白细胞介素的一种，在机体免疫系统中起重要作用，主要负责调节白细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的免疫活性。IL-2通过与淋巴细胞表面的IL-2受体结合来发挥作用。白细胞介素-2受体(IL-2R)由α、β、γ三条链组成，主要表达于T细胞表面，通过诱导T细胞活化来调节机体的免疫机能。IL-2家族细胞因子一直在治疗应用中备受关注，可以为治疗肿瘤性疾病、病毒感染和免疫缺陷提供支持免疫应答的工具，阻断这一通路可能有助于实现免疫抑制，用于治疗移植排斥反应，以及炎症、自身免疫和过敏性疾病。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发病机制、开发防治技术及药物是不可缺少的研究工具。由于人IL2及IL2RA、IL2RB序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人IL2RB和小鼠IL2RB蛋白序列的一致性仅为57％，识别人IL2RB蛋白的抗体通常无法识别小鼠IL2RB，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL2及其配体亚基IL2RA、IL2RB药物的药效。鉴于IL2家族相关药物全球研发进展及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期试验更有效并使研发失败率最小化，本领域急需开发人源化IL2家族相关的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化IL2RB蛋白，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
进一步优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白胞外区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白还包含非人动物IL2RB蛋白的部分，优选为非人动物IL2RB蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白包含信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区，其中，胞外区包含人IL2RB蛋白胞外区的全部或部分。
优选的，为保证人源化IL2RB蛋白包含结合抗人抗体的人IL2RB蛋白胞外区，又不影响人源化IL2RB蛋白包含的其他区域的正常功能。故对于胞外区可以适当在N端和/或C端减少几个氨基酸。进一步优选的，胞外区的氨基酸序列包含N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RB蛋白胞外区。优选的，所述的人IL2RB蛋白胞外区的部分包含至少100个氨基酸，例如至少100、120、150、160、170、180、190、200、205、206、207、208、209、210、214个氨基酸的与人IL2RB蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含209个氨基酸的人IL2RB蛋白胞外区，最为优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含与SEQ ID NO：32的第29-237位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：32的第29-237位所示氨基酸序列一致；信号肽、跨膜区和胞质区来源于非人动物。
优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB基因的1号至10号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至8号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
优选的，为保证人源化IL2RB蛋白包含结合抗人抗体的人IL2RB蛋白胞外区，又不影响人源化IL2RB蛋白包含的其他区域的正常功能。故对于胞外区可以适当在N端和/或C端减少几个氨基酸。进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中2号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含2号外显子中编码末尾1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，至少包含2号外显子中编码末尾1个氨基酸的核苷酸序列，8号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含8号外显子中编码第1至第10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含8号外显子中编码第1至第3个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2RB蛋白还包含非人动物IL2RB基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物IL2RB基因9号、10号外显子，更优选还包括2号外显子编码的信号肽的核苷酸序列和/或8号外显子编码跨膜区、胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白选自下列组中的一种：
a)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的全部或部分；
b)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
d)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)为SEQ ID NO：32的第29-237位氨基酸序列的全部或部分；
B)与SEQ ID NO：32的第29-237位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32的第29-237位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：32的第29-237位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白选自下列组中的一种：
a)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：30所示氨基酸序列的部分；
b)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：30所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：30所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
d)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
I)为SEQ ID NO：38氨基酸序列的全部或部分；
II)与SEQ ID NO：38氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
III)与SEQ ID NO：38所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
IV)与SEQ ID NO：38所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种人源化IL2RB基因，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的部分，所述的人源化IL2RB基因编码上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的人源化IL2RB基因包含编码人IL2RB蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人IL2RB蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，包含编码N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RB蛋白胞外区的核苷酸序列。优选的，所述的人IL2RB蛋白胞外区的部分包含至少100个氨基酸，例如至少100、120、150、160、170、180、190、200、205、206、207、208、209、210、214个氨基酸的与人IL2RB蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含209个氨基酸的人IL2RB蛋白胞外区，最为优选的，包含编码与SEQ ID NO：32的第29-237位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ IDNO：32的第29-237位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2RB基因包含编码人IL2RB胞外区的核苷酸序列以及非人动物IL2RB信号肽、胞质区、胞外区和跨膜区的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL2RB基因编码上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、10、20、50、70、100、110、120、121bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含4bp的核苷酸序列；2号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含2号外显子中编码末尾1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，至少包含2号外显子中编码末尾1个氨基酸的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、70、100、110、115bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含8bp的核苷酸序列；8号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含8号外显子中编码第1至第10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含8号外显子中编码第1至第3个氨基酸的核苷酸序列。优选的，所述的人源化IL2RB基因还包含非人动物IL2RB基因的1号至2号外显子、9号至10号外显子，优选还包含8-9号内含子，进一步还包含3号外显子编码第1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的核苷酸序列以及8号外显子编码胞质区和跨膜区的核苷酸序列，优选还包含编码胞外区N端的1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2RB基因包含与SEQ ID NO：36具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB基因包含下列组中的一种：
(A)为SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)与SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(C)与SEQ ID NO：35所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
(D)具有SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RB基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
(i)为SEQ ID NO：37所示核苷酸序列的全部或部分；
(ii)与SEQ ID NO：37所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(iii)与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
(iv)与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2RB基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
本发明的第三方面，提供了一种IL2RB靶向载体，所述的IL2RB靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人IL2RB基因的部分。
优选的，所述的供体DNA序列包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分；更进一步优选的，包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、10、20、50、70、100、110、120、121bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含4bp的核苷酸序列；2号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含2号外显子中编码末尾1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、70、100、110、115bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含8bp的核苷酸序列；8号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含8号外显子中编码第1至第10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列。最为优选的，包含与SEQ ID NO：35具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：35所述核苷酸序列一致。
优选的，所述的IL2RB靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90％同源性的核苷酸。最为优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：33至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：33所示。
优选的，所述的IL2RB靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90％同源性的核苷酸。最为优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：34至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：34所示。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
优选的，所述的IL2RB靶向载体的待改变的转换区位于非人动物IL2RB基因座上。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL2RB基因的1号至10号外显子上。再进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL2RB基因的2号至8号外显子上。最为优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL2RB基因的3号至8号外显子上。
优选的，所述的IL2RB靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述IL2RB靶向载体的细胞，优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第五方面，提供了上述IL2RB靶向载体或者上述的细胞在IL2RB基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第六方面，提供了一种IL2RB基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源IL2RB蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物体内包含人IL2RB基因的部分，优选包含上述的人源化IL2RB基因。
优选的，所述的人IL2RB基因的部分或者人源化IL2RB基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2蛋白，所述的人源化IL2蛋白包含人IL2基因的1号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。优选的，所述的人源化IL2蛋白包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的非人动物体内内源IL2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物体内包含人IL2基因的部分。优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子的最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含从4号外显子的第一个核苷酸开始至终止密码子。再进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列。最为优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RA蛋白，其体内内源IL2RA蛋白表达降低或缺失，其中，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RA蛋白胞外区。最为优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含与SEQ ID NO：51具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ IDNO：51所示氨基酸序列一致。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号外显子的部分、3-5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号外显子，其中，所述2号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含去除N端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列，所述6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含C端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列。
最为优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码上述人源化IL2RA蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第七方面，提供了一种IL2RB基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人IL2RB核苷酸序列的部分导入非人动物IL2RB基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物选自上述的IL2RB基因人源化的非人动物。
优选的，所述的人源化IL2RB蛋白为上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人源化IL2RB基因，所述的人源化IL2RB基因为上述的人源化IL2RB基因。
优选的，所述的人IL2RB基因的部分或人源化IL2RB基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。
优选的，包括用包含编码人IL2RB蛋白的核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。进一步优选的，用包含编码人IL2RB蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。更进一步优选的，用包含人IL2RB蛋白胞外区至少100个氨基酸，例如至少100、120、150、160、170、180、190、200、205、206、207、208、209、210、214个与人IL2RB蛋白胞外区一致氨基酸导入非人动物IL2RB基因座，进一步优选的，包含209个氨基酸的人IL2RB蛋白胞外区导入非人动物IL2RB基因座，编码N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RB蛋白胞外区的核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。最为优选的，用包含编码SEQ ID NO：32的第29-237位的核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。
优选的，包括用包含人IL2RB基因的部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。进一步优选的，用包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。更进一步优选的，用包含1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。再进一步优选的，用包含2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座。最为优选的，用包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座上，其中2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、10、20、50、70、100、110、120、121bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含4bp的核苷酸序列；2号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含2号外显子中编码末尾1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，至少包含2号外显子中编码末尾1个氨基酸的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、70、100、110、115bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含8bp的核苷酸序列；8号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含8号外显子中编码第1至第10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸的核苷酸序列，更优选至少包含8号外显子中编码第1至第3个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含SEQ ID NO：35所示核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座上。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人IL2RB蛋白的cDNA序列导入非人动物IL2RB基因座上。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化IL2RB蛋白的核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座上。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化IL2RB基因的核苷酸序列导入非人动物IL2RB基因座上。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的插入或替换的位点为IL2RB基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL2RB基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源IL2RB基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL2RB蛋白不能正常表达。
优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL2RB基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化IL2RB蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
优选的，使用上述的IL2RB靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，所述的非人动物体内表达人IL2蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RA蛋白，其体内内源IL2RA蛋白表达降低或缺失，其中，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区至少50个氨基酸，例如至少50、70、100、120、150、160、170、180、190、200、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219个氨基酸的与人IL2RA蛋白胞外区一致，更优选的，包含213个氨基酸的人IL2RA蛋白胞外区，再进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RA蛋白胞外区。最为优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含与SEQ ID NO：51具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQID NO：51所示氨基酸序列一致。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号外显子的部分、3-5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号外显子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、120、150、170、180、181、182、183、184、185、190、192bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含184bp的核苷酸序列；所述2号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含去除N端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70、72bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含56bp的核苷酸序列；所述6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含C端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列。
最为优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码上述人源化IL2RA蛋白的核苷酸序列。
本发明的第八方面，提供了一种IL2RB基因敲除的非人动物，所述的非人动物缺失IL2RB基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物缺失IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，缺失2号至8号外显子的核苷酸序列。再进一步优选的，缺失3号至8号外显子的核苷酸序列。最为优选的，缺失编码胞外区的核苷酸序列。
本发明的第九方面，提供了一种IL2RB基因敲除的非人动物的构建方法，包括采用sgRNA进行非人动物的构建。优选的，所述的sgRNA靶向非人动物IL2RB基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL2RB基因上的靶序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL2RB基因的1号外显子至10号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL2RB基因的1-2号内含子至9-10号内含子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL2RB基因的1-2号内含子至2-3号内含子和/或7-8号内含子至8-9号内含子上。
本发明的第十方面，提供了一种人源化IL2蛋白，所述的人源化IL2蛋白包含人IL2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL2蛋白包含人IL2基因的1号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2蛋白包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL2蛋白还包含非人动物IL2蛋白的部分。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2蛋白选自下列组中的一种：
1)所述的人源化IL2蛋白中来源于人IL2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；
2)所述人源化IL2蛋白中来源于人IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
3)所述人源化IL2蛋白中来源于人IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
4)所述人源化IL2蛋白中来源于人IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2蛋白选自下列组中的一种：
1)所述人源化IL2蛋白中来源于非人动物IL2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的部分；
2)所述人源化IL2蛋白中来源于非人动物IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
3)所述人源化IL2蛋白中来源于非人动物IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
4)所述人源化IL2蛋白中来源于非人动物IL2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种人源化IL2基因，所述的人源化IL2基因包含人IL2基因的部分。
优选的，所述的人源化IL2基因包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、110、120、130、140、145、146、147、148、149、150、170、200、202bp的核苷酸序列，优选的，包含147bp的核苷酸序列；进一步优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子的最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、150、200、250、300、350、370、390、393bp的核苷酸序列，优选的，包含108bp的核苷酸序列；进一步优选的，4号外显子的部分至少包含从4号外显子的第一个核苷酸开始至终止密码子；更进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2基因还包含非人动物IL2基因的部分。
优选的，所述的人源化IL2基因包含与SEQ ID NO：8具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2基因包含下列任一组：
A：为SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的全部或部分；
B：与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C：与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
D：具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
I：为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；
ii：与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
iii：与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
iv：与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL2基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
本发明的第十二方面，提供了一种IL2靶向载体，所述的IL2靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人IL2基因的部分。优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、110、120、130、140、145、146、147、148、149、150、170、200、202bp的核苷酸序列，优选的，包含147bp的核苷酸序列；进一步优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子的最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、150、200、250、300、350、370、390、393bp的核苷酸序列，优选的，包含108bp的核苷酸序列；进一步优选的，4号外显子的部分至少包含从4号外显子的第一个核苷酸开始至终止密码子。再进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列。最为优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。
优选的，所述的IL2靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物IL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：5所示。
优选的，所述的IL2靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物IL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：6所示。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
优选的，所述的IL2靶向载体的待改变的转换区位于非人动物IL2基因座上。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL2基因的1号至4号外显子上。
优选的，所述的IL2靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
本发明的第十三方面，提供了一种包含上述IL2靶向载体的细胞，优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第十四方面，提供了上述IL2靶向载体或者上述的细胞在IL2基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十五方面，提供了一种IL2基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2蛋白。
优选的，所述的非人动物内源IL2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化IL2蛋白选自上述的人源化IL2蛋白。
优选的，所述的非人动物体内包含人IL2基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物体内包含上述的人源化IL2基因。
优选的，所述的人IL2基因的部分或人源化IL2基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RB蛋白。进一步优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物内源IL2RB蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物体内包含人IL2RB基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物体内包含上述的人源化IL2RB基因。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RA蛋白，其体内内源IL2RA蛋白表达降低或缺失，其中，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RA蛋白胞外区。最为优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含与SEQ ID NO：51具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ IDNO：51所示氨基酸序列一致。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号至6号外显子的全部或部分。最为优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号外显子的部分、3-5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号外显子，其中，所述2号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含去除N端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列，所述6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含C端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十六方面，提供了一种IL2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人IL2核苷酸序列的部分导入非人动物IL2基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2蛋白。
优选的，所述的非人动物为上述的IL2基因人源化的非人动物。
优选的，所述的人源化IL2蛋白为上述的人源化IL2蛋白。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人源化IL2基因，所述的人源化IL2基因为上述的人源化IL2基因。
优选的，所述的人IL2基因的部分或人源化IL2基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。
优选的，包括用包含人IL2基因的部分导入非人动物IL2基因座。进一步优选的，用包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分导入非人动物IL2基因座。更进一步优选的，用包含人IL2基因的1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分导入非人动物IL2基因座。最为优选的，用包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分导入非人动物IL2基因座，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、110、120、130、140、145、146、147、148、149、150、170、200、202bp的核苷酸序列，优选的，包含147bp的核苷酸序列；进一步优选的，1号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至1号外显子的最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、150、200、250、300、350、370、390、393bp的核苷酸序列，优选的，包含108bp的核苷酸序列；进一步优选的，4号外显子的部分至少包含从4号外显子的第一个核苷酸开始至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列导入非人动物IL2基因座。
优选的，用包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列导入非人动物IL2基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人IL2蛋白的cDNA序列导入非人动物IL2基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化IL2蛋白的核苷酸序列导入非人动物IL2基因座上。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化IL2基因的核苷酸序列导入非人动物IL2基因座上。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的插入或替换的位点为IL2基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL2基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源IL2基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL2蛋白不能正常表达。
优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL2蛋白不能正常表达。
优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL2基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化IL2蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，使用上述的sgRNA进行非人动物的构建。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化IL2RB蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RA蛋白，其体内内源IL2RA蛋白表达降低或缺失，其中，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含人IL2RA蛋白胞外区至少50个氨基酸，例如至少50、70、100、120、150、160、170、180、190、200、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219个氨基酸的与人IL2RA蛋白胞外区一致，更优选的，包含213个氨基酸的人IL2RA蛋白胞外区，再进一步优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含N端和/或C端去除1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的人IL2RA蛋白胞外区。最为优选的，所述的人源化IL2RA蛋白包含与SEQ ID NO：51具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQID NO：51所示氨基酸序列一致。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL2RA基因的2号外显子的部分、3-5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号外显子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、50、70、100、120、150、170、180、181、182、183、184、185、190、192bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含184bp的核苷酸序列；优选的，所述2号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含去除N端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、50、55、56、57、58、59、60、70、72bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含56bp的核苷酸序列；优选的，所述6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，优选至少包含C端1-10个优选为1-4、1-3或1-2个氨基酸残基的胞外区核苷酸序列。
最为优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码上述人源化IL2RA蛋白的核苷酸序列。
本发明的第十七方面，提供了一种IL2基因敲除的非人动物，所述的非人动物缺失IL2基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物缺失IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，缺失IL2基因编码区的核苷酸序列。
本发明的第十八方面，提供了一种IL2基因敲除的非人动物的构建方法，包括采用sgRNA进行非人动物的构建。优选的，所述的sgRNA靶向非人动物IL2基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL2基因上的靶序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL2基因的1号外显子至4号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于IL2基因的1号外显子和/或4号外显子序列上。
本发明的第十九方面，提供了一种IL2RB基因和IL2基因人源化的非人动物的构建方法，包括：
将上述IL2RB基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的IL2RB基因人源化的非人动物与上述IL2基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的IL2基因人源化的非人动物交配或体外受精；
或者，对上述IL2RB基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的IL2RB基因人源化的非人动物采用上述IL2基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑；
或者，对上述IL2基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的IL2基因人源化的非人动物采用上述IL2RB基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑。
本发明的第二十方面，提供了一种IL2RA基因与IL2RB基因人源化的非人动物的构建方法，包括采用上述IL2RB基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的IL2RB基因人源化的非人动物与IL2RA基因人源化的非人动物交配、体外授精；或者直接对上述IL2RB基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的IL2RB基因人源化的非人动物的IL2RA基因进行编辑；或者直接在IL2RA基因人源化的非人动物的IL2RB基因采用上述IL2RB基因人源化的非人动物的构建方法构建。
本发明的第二十一方面，提供了一种IL2RA基因与IL2基因人源化的非人动物的构建方法，包括采用上述IL2基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的IL2基因人源化的非人动物与IL2RA基因人源化的非人动物交配、体外授精；或者直接对上述IL2基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的IL2基因人源化的非人动物的IL2RA基因进行编辑；或者直接在IL2RA基因人源化的非人动物的IL2基因采用上述IL2基因人源化的非人动物的构建方法构建。
本发明的第二十二方面，提供了一种IL2RB、IL2和IL2RA基因人源化的非人动物的构建方法，包括将上述的IL2RB基因人源化的非人动物、上述的IL2基因人源化的非人动物或IL2RA基因人源化的非人动物中的任意两个交配或体外授精，再与第三个基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑；或者，对同一非人动物或其子代直接进行基因编辑，优选采用本发明所述的构建方法。
本发明的第二十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
(一)提供上述的IL2RB基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得IL2RB基因人源化的非人动物、上述的IL2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得IL2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得IL2RB基因和IL2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得IL2RA基因与IL2RB基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得IL2RA基因与IL2基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得IL2RB、IL2和IL2RA基因人源化的非人动物；
(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-L1或PD-1人源化的非人动物。进一步优选的，所述的多基因修饰的非人动物包括PD-1与IL2RB基因修饰的非人动物，PD-1与IL2基因修饰的非人动物，或者IL2、PD-1与IL2RB基因修饰的非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
本发明的第二十四方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
本发明的第二十五方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型，所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。
本发明的第二十六方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述的IL2RB和/或IL2基因人源化的非人动物，IL2RB和/或IL2基因敲除的非人动物，IL2RB、IL2和IL2RA基因人源化的非人动物，IL2RA基因与IL2基因人源化的非人动物，IL2RA基因与IL2RB基因人源化的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代的步骤。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第二十七方面，提供了上述的IL2RB和/或IL2基因人源化的非人动物，IL2RB和/或IL2基因敲除的非人动物，IL2RB、IL2和IL2RA基因人源化的非人动物，IL2RA基因与IL2基因人源化的非人动物，IL2RA基因与IL2RB基因人源化的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物的荷瘤或炎症模型中的应用。
本发明的第二十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
本发明的第二十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
本发明的第三十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
本发明的第三十一方面，提供了一种IL2RB和/或IL2基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化IL2RB蛋白，或者，人或人源化IL2蛋白；优选的，所述的细胞表达上述的人源化IL2RB蛋白或者上述的人源化IL2蛋白。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
优选的，所述细胞中内源IL2RB和/或IL2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人IL2RB和/或IL2基因的部分。优选的，所述的细胞包含上述的人源化IL2RB基因或上述的人源化IL2基因。
本发明的第三十二方面，提供了一种IL2RB和/或IL2基因敲除的细胞，所述的细胞缺失IL2RB和/或IL2基因的全部或部分。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
优选的，缺失IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失IL2RB基因的2号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失IL2RB基因的3号至8外显子的全部或部分。最为优选的，缺失编码胞外区的核苷酸序列。
优选的，缺失IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失IL2基因的编码区的核苷酸序列。
本发明的第三十三方面，提供了一种表达上述的人源化IL2RB蛋白或者上述的人源化IL2蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含上述的人源化IL2RB基因和/或人源化IL2基因。
本发明的第三十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第三十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。
本发明的第三十六方面，提供了来源于上述的人源化IL2RB蛋白、上述的人源化IL2RB基因、上述的人源化IL2蛋白、上述的人源化IL2基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究IL2通路功能、人IL2通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
优选的，在制备治疗肿瘤、病毒感染、炎症、自身免疫缺陷、过敏、移植排斥反应等的药物中的应用。
优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
本发明的第三十七方面，提供了一种人IL2RB和/或IL2特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述人IL2RB和/或IL2特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十八方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。
优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十九方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人IL2RB和/或IL2特异性调节剂中的用途。
本发明的第四十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。
本发明所述的IL2RB和/或IL2基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化IL2RB和/或IL2蛋白，可用于针对人IL2通路靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病、炎症和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化XXX蛋白”，包含来源于人XXX蛋白的部分和非人XXX蛋白的部分。例如人源化IL2RB蛋白、人源化IL2蛋白或人源化IL2RA蛋白。
其中，所述的“人源化IL2RB蛋白”包含连续或间隔的5-238个氨基酸序列与人IL2RB蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10-208个，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、208、210、220、230、238个氨基酸序列与人IL2RB蛋白的氨基酸序列一致。
所述的“人源化IL2蛋白”包含连续或间隔的5-153个氨基酸序列与人IL2蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10-153个，更优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、153个氨基酸序列与人IL2蛋白的氨基酸序列一致。
所述的“人源化IL2RA蛋白”包含连续或间隔的5-237个氨基酸序列与人IL2RA蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔的10-213个，更优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、213个氨基酸序列与人IL2RA蛋白的氨基酸序列一致。
本发明所述的“人源化XXX基因”，包含来源于人XXX基因的部分和非人XXX基因的部分。例如人源化IL2RB基因或人源化IL2基因。
其中，所述的“人源化IL2RB基因”包含连续或间隔的20bp-30kb个核苷酸序列与人IL2RB基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20-8654个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、627、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、8654、9000、9500、10000、20000、30000bp个核苷酸序列与人IL2RB基因的核苷酸序列一致。
本发明所述的“人源化IL2基因”包含连续或间隔的20-7016bp个核苷酸序列与人IL2基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20-4686个，更优选为20、50、100、200、300、400、459、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、4000、4500、4686、5000、5500、6000、6500、7000或7016bp个核苷酸序列与人IL2基因的核苷酸序列一致。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至4号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子和4号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“IL2RA基因人源化的非人动物”，为表达人或人源化IL2RA蛋白的非人动物，且其体内的基因组中包含人IL2RA基因的部分。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL2RB基因座”表示IL2RB基因1号至10号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IL2RB基因座可以是IL2RB基因1号至10号外显子上的任选一段的DNA片段。例如所述的“IL2基因座”表示IL2基因1号至4号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IL2基因座可以是IL2基因1号至4号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“三个以上”包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个等。
本发明所述的“连续三个以上”包括但不限于连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个、连续八个、连续九个或连续十个等。其中“1号至10号外显子的连续三个以上”包括连续三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个外显子，还包括期间的内含子核苷酸序列。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述人源化非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：鼠IL2基因座和人IL2基因座对比示意图(非按比例)；
图2：IL2基因人源化小鼠基因座示意图(非按比例)；
图3：IL2基因打靶策略及IL2靶向载体设计示意图；
图4：采用Neo探针进行Southern Blot鉴定的结果图，其中，WT为野生型C57BL/6小鼠，2-E02、2-F09、2-G07、2-H03、3-A01、3-A02、3-G07、3-G11和3-H10为克隆编号；
图5：采用IL2-5’探针(A)和IL2-3’探针(B)进行Southern Blot鉴定的结果图，其中，WT为野生型C57BL/6小鼠，2-E02、2-F09、2-G07、2-H03、3-A01、3-A02、3-G07和3-H10为克隆编号；
图6：IL2基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，IL2-F1-1、IL2-F1-2、IL2-F1-3、IL2-F1-6和IL2-F1-8为F1代小鼠编号，WT为野生型小鼠，M为Marker，PC为未去Neo的阳性克隆细胞，H2O为水对照，图(A)为使用引物对IL2-WT-F和IL2-WT-R扩增小鼠内源的野生型IL2基因片段；图(B)为使用引物对IL2-WT-F和IL2-Mut-R扩增修饰后的IL2基因片段，用以验证IL2靶向载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(C)为使用引物对IL2-Frt-F和IL2-Frt-R扩增Neo片段，用以验证抗性基因是否去除；图(D)为使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；
图7：ELISA蛋白检测结果；
图8：鼠IL2RB基因和人IL2RB基因对比示意图(非按比例)；
图9：IL2RB基因人源化小鼠基因座示意图(非按比例)；
图10：IL2RB基因打靶策略及IL2RB靶向载体设计示意图；
图11：采用IL2RB-5’探针、IL2RB-3’探针和Neo探针进行Southern Blot鉴定的结果图，其中，WT为野生型C57BL/6小鼠，1-A05、1-A10、1-E02、1-F12、2-B09、2-F06、2-G02、2-G08、3-A03、3-B07、3-E08和3-H02为克隆编号；
图12：IL2RB基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，IL2RB-F1-11为F1代鼠尾编号，WT为野生型小鼠，M为Marker，PC为阳性杂合小鼠，H2O为水对照，图(A)为使用引物对IL2RB-WT-F和IL2RB-WT-R扩增小鼠内源的野生型IL2RB基因片段；图(B)为使用引物对IL2RB-WT-F和IL2RB-Mut-R扩增修饰后的IL2RB基因片段，用以验证IL2RB靶向载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(C)为使用引物对IL2RB-Frt-F和IL2RB-Frt-R用以扩增Neo片段以验证抗性基因是否去除；图(D)为使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；
图13：经CD3刺激后小鼠体内脾脏细胞中T细胞上IL2RB蛋白表达流式分析结果，其中H/+为IL2RA基因人源化杂合子小鼠，WT为野生型C57BL/6小鼠，图(A)为采用mIL2RB进行细胞标记的WT小鼠，图(B)为采用mIL2RB进行细胞标记的H/+小鼠，图(C)为采用hIL2RB进行细胞标记的WT小鼠；图(D)为采用hIL2RB行细胞标记的H/+小鼠；
图14：经CD3刺激后小鼠体内脾脏细胞中NK细胞上IL2RB蛋白表达流式分析结果，其中H/+为IL2RA基因人源化杂合子小鼠，WT为野生型C57BL/6小鼠，图(A)为采用mIL2RB进行细胞标记的WT小鼠，图(B)为采用mIL2RB进行细胞标记的H/+小鼠，图(C)为采用hIL2RB进行细胞标记的WT小鼠；图(D)为采用hIL2RB行细胞标记的H/+小鼠；
图15：经CD3刺激后小鼠体内脾脏细胞中CD4+T细胞上IL2RB蛋白表达流式分析结果，其中H/+为IL2RA基因人源化杂合子小鼠，WT为野生型C57BL/6小鼠，图(A)为采用mIL2RB进行细胞标记的WT小鼠，图(B)为采用mIL2RB进行细胞标记的H/+小鼠，图(C)为采用hIL2RB进行细胞标记的WT小鼠；图(D)为采用hIL2RB行细胞标记的H/+小鼠；
图16：经CD3刺激后小鼠体内脾脏细胞中CD8+T细胞上IL2RB蛋白表达流式分析结果，其中H/+为IL2RA基因人源化杂合子小鼠，WT为野生型C57BL/6小鼠，图(A)为采用mIL2RB进行细胞标记的WT小鼠，图(B)为采用mIL2RB进行细胞标记的H/+小鼠，图(C)为采用hIL2RB进行细胞标记的WT小鼠；(D)为采用hIL2RB行细胞标记的H/+小鼠；
图17：鼠IL2RA基因座和人IL2RA基因座对比示意图(非按比例)；
图18：IL2RA基因人源化小鼠基因座示意图(非按比例)；
图19：将小鼠结肠癌细胞MC38植入IL2RA基因人源化纯合子小鼠体内，并利用2种IL2RA抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，G1-G3各组实验动物平均体重增长无显著差异；
图20：将小鼠结肠癌细胞MC38植入IL2RA基因人源化纯合子小鼠体内，并利用2种IL2RA抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，G1-G3各组实验动物体重变化无显著差异；
图21：将小鼠结肠癌细胞MC38植入IL2RA基因人源化纯合子小鼠体内，并利用2种IL2RA抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，G2和G3治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组，且具有显著差异。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下述实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
NdeI、DraIII、BglII、XbaI和AseI酶购自NEB，货号分别为R0111S、R3510S、R0144M、R0145M和R0526M；
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
InVivoMAb anti-mouse CD3ε(mCD3)来源BioXCell，货号BE0001-1；
InVivoMAb anti-mouse CD28(mCD3)来源BioXCell，货号37.51；
IL-2Mouse Uncoated ELISA Kit来自eBioscience，货号为88-7024-88；
IL-2Human Uncoated ELISA Kit with Plates来自eBioscience，货号为88-7025-22；
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody(mTCRβ-PerCP/Cy5.5)来源Biolegend，货号109228；
Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45 Antibody(mCD4-BV605)来源Biolegend，货号103138；
PE-CyTM 7Mouse Anti-Mouse NK-1.1(mNK1.1-PE/Cy7)来源BD Pharmingen，货号552878；
Brilliant Violet 605TM anti-mouse CD4 Antibody(mCD4-BV605)来源Biolegend，货号100451；
Brilliant Violet 711TM anti-mouse CD8a Antibody(mCD8-BV711)来源Biolegend，货号100759；
APC anti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody(mIL2RB)来源Biolegend，货号105911；
PE anti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody(hIL2RB)来源Biolegend，货号339005；
Zombie NIRTM Fixable Viability Kit来源Biolegend，货号423106；
Purifiedanti-mouse CD16/32来源Biolegend，货号101302。
实施例1 IL2基因人源化小鼠的构建
小鼠IL2基因(NCBI Gene ID：16183，Primary source：MGI：96548，UniProtKB：P04351，位于3号染色体NC_000069.6的第37120713至37125954位，基于转录本NM_008366.3(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_032392.1(SEQ ID NO：2))和人IL2基因(NCBI Gene ID：3558，Primary source：HGNC:6001，UniProtKB：P60568，位于4号染色体NC_000004.12的第122449479至122456725位，基于转录本NM_000586.3(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_000577.2(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。
本实施例计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人IL2蛋白的核酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化IL2蛋白。为了达到该目的，可在小鼠内源IL2基因座引入编码人IL2蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化IL2蛋白。可以采取在小鼠内源IL-2基因座上直接插入含有人IL-2的基因序列的方法，例如含有人IL-2的DNA序列或cDNA序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的小鼠内源IL-2基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL-2基因座上直接用人IL-2的基因序列(例如，人IL-2的DNA序列或cDNA序列)进行替换。本实施例将以DNA序列的原位替换的策略来阐述如何对小鼠IL-2基因进行人源化改造。
具体而言，可以采用任何基因编辑系统或制备方法获得IL2基因人源化小鼠，包括但不限于基于锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)技术或其他分子生物学技术。
本实施例采用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源IL2基因座上用人IL2基因的序列替换特定小鼠IL2基因序列。在小鼠IL2基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠IL2基因的1号至4号外显子的4803bp的序列用对应的人IL2基因1号至4号外显子4686bp的序列替换，得到小鼠人源化IL2基因座示意图如图2所示。
进一步的，设计如图3所示的打靶策略。其中图3所示的IL2靶向载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：5)、3’同源臂(SEQ ID NO：6)、人IL2 DNA片段以及非人动物3’UTR，其中5’同源臂与NCBI登录号为NC_000069.6的第37129822至37125907位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号为NC_000069.6的第37119956至37116682位核苷酸序列相同；人IL2 DNA片段(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000004.12的第122456440至122451755位核苷酸序列相同。其中，人IL2 DNA片段上游与5’同源臂直接连接，其下游与鼠基因座的连接设计为5’-ATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTAACTATGTACCTCCTGCTTACAACACATAAGGCTCTCTATTTATTTAAA-3’(SEQ ID NO：8)其中序列“GACT”的“T”是人序列的最后一个核苷酸，序列“TAAC”的“T”是小鼠序列的第一个核苷酸。
改造后的人源化小鼠IL2的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示。
IL2靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒上游与小鼠IL2基因座的连接设计为5’-CTGGGCCATAATACAATTATTATACACCAACTCTACCATTACCTACCCATATGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCT-3’(SEQ ID NO：10)，其中序列“CCTACC”的最后一个“C”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“CATAT”的“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒下游与小鼠IL2基因座的连接设计为5’-TATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCCACCATGTGACTTTCACACCATCACACTGGGAACCACTTTCTATCCCATGA-3’(SEQ ID NO：11)，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，“CACCATG”的第一个“C”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在IL2靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
IL2靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。小鼠和人IL2DNA分别获自细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-279O10和CH17-476A7。构建好的IL2靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的IL2靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测，确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用NdeI或DraIII或BglII消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，结果如图4-5所示，检测结果表明PCR鉴定为阳性的多个克隆中，有5个克隆(2-E02、2-H03、3-A01、3-A02和3-G07)为阳性杂合克隆且无随机插入。PCR引物及目的条带大小如表1所示。
表1
Figure BDA0003046685600000351
Southern Blot探针及片段大小如表2所示，具体检测包括如下探针引物：
IL2-5’探针(IL2-5’Probe)：
F：5’-ACTTCTCCGTTTGGGTGCTGTTAGT-3’(SEQ ID NO：16)
R：5’-TGCAGCAGTTGTACAGCAACAGAGA-3’(SEQ ID NO：17)
IL2-3’探针(IL2-3’Probe)：
F：5’-GTTGAAAGGAATGAAACACACAGT-3’(SEQ ID NO：18)
R：5’-TCCATGTCTCCTTCATGTCACCTA-3’(SEQ ID NO：19)
Neo探针(Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：20)
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：21)
表2
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
NdeI IL2-5’探针(IL2-5’Probe) 8.8kb 12.4kb
DraIII IL2-3’探针(IL2-3’Probe) 18.1kb 14.3kb
BglII Neo探针(Neo Probe) -- 6.2kb
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到表达人IL2蛋白的IL2基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为IL2-F1-1、IL2-F1-2、IL2-F1-3、IL2-F1-6和IL2-F1-8的小鼠为阳性杂合小鼠。PCR引物及目的条带大小如表3所示。
表3
Figure BDA0003046685600000352
Figure BDA0003046685600000361
其中，WT为野生型小鼠，Mut为IL2人源化小鼠。
可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人IL2蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法，选取野生型C57BL/6小鼠和IL2基因人源化小鼠杂合子各2只(9-13周龄)，先给小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠CD3抗体(mCD3)和4μg抗鼠CD28抗体(mCD28)，2h后取血清，分别稀释30倍和60倍后用试剂盒检测鼠IL2蛋白水平和人IL2蛋白水平。检测结果(见图7)显示，在野生型C57BL/6小鼠体内未检测到人或人源化IL2蛋白的表达，在IL2基因人源化小鼠杂合子体内可检测到鼠IL2蛋白和人IL2蛋白的表达。
以上实验表明通过本方法，构建了可稳定传代、无随机插入且可在小鼠体内表达人IL2蛋白的IL2基因人源化小鼠。
实施例2 IL2RB基因人源化小鼠的构建
小鼠IL2RB基因(NCBI Gene ID：16185，Primary source：MGI:96550，UniProtKB：P16297，位于15号染色体NC_000081.6的第78479256至78511621位，基于转录本NM_008368.4(SEQ ID NO：29)及其编码蛋白NP_032394.1(SEQ ID NO：30))和人IL2RB基因(NCBI Gene ID：3560，Primary source：HGNC:6006，UniProtKB：P14784，位于22号染色体NC_000022.11的第37125838至37175118位，基于转录本NM_000878.5(SEQ ID NO：31)及其编码蛋白NP_000869.1(SEQ ID NO：32所示))对比示意图如图8所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL2RB基因座引入编码人IL2RB蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL2RB蛋白。可以采取在小鼠内源IL2RB基因座上直接插入含有人IL2RB的基因序列的方法，例如含有人IL2RB的DNA序列或cDNA序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的小鼠内源IL2RB基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL2RB基因座上直接用人IL2RB的基因序列(例如，人IL2RB的DNA序列或cDNA序列)进行替换。本实施例将以DNA序列的原位替换策略来阐述如何对小鼠IL2RB基因进行人源化改造。
具体而言，可以采用任何基因编辑系统或制备方法获得IL2RB基因人源化小鼠，包括但不限于基于锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)技术或其他分子生物学技术。
本实施例采用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源IL2RB基因座上用人IL2RB基因的序列替换特定小鼠IL2RB基因序列。在小鼠IL2RB基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠IL2RB基因的部分2号至部分8号外显子的6730bp的序列用对应的人基因序列8654bp替换，得到小鼠人源化IL2RB基因座示意图如图9所示。
进一步的，设计如图10所示的打靶策略。其中图10所示的IL2RB靶向载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：33)、3’同源臂(SEQ ID NO：34)以及人IL2RB DNA片段，其中5’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第78495191至78491766位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第78484605至78479760位核苷酸序列相同；人IL2RB DNA片段(SEQID NO：35)与NCBI登录号为NC_000022.11的第37144088至37135435位核苷酸序列相同。其中，人IL2RB DNA片段上游与5’同源臂直接连接，其下游与鼠基因座的连接设计为
Figure BDA0003046685600000371
Figure BDA0003046685600000372
(SEQ ID NO：36)，其中序列“TTGGG”的最后一个“G”是人序列的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003046685600000373
Figure BDA0003046685600000374
的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。
改造后的人源化小鼠IL2RB的mRNA序列如SEQ ID NO：37所示，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO：38所示。
IL2RB靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。
其中，Neo盒上游与小鼠IL2RB基因座的连接设计为
Figure BDA0003046685600000375
Figure BDA0003046685600000376
Figure BDA0003046685600000377
其中序列“TCCCC”的最后一个“C”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003046685600000378
的“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒下游与小鼠IL2RB基因座的连接设计为
Figure BDA0003046685600000379
Figure BDA00030466856000003710
Figure BDA00030466856000003711
其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，
Figure BDA00030466856000003712
的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在IL2RB靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
使用常规方法构建IL2RB靶向载体，如通过酶切连接、直接合成等构建用人IL2RB基因替换小鼠基因的IL2RB靶向载体。小鼠和人IL2RB DNA分别获自细菌人工染色体(BAC)克隆P23-185F1和RP11-90I17。构建好的IL2RB靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的IL2RB靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和SouthernBlot技术进行检测，确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用XbaI或AseI或NdeI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，结果如图11所示，检测结果表明PCR鉴定为阳性的多个克隆中，有5个克隆(2-B09、2-F06、2-G02、3-B07、3-E08)为阳性杂合克隆且无随机插入。PCR引物及目的条带大小如表4所示。
表4
Figure BDA0003046685600000381
Southern Blot检测包括如下探针引物：
IL2RB-5’探针(IL2RB-5’Probe)：
F：5’-TGCCATTGTAGGAAGCCACCTT-3’(SEQ ID NO：45)
R：5’-AGCTACAGACTCATCCCTGGAC-3’(SEQ ID NO：46)
IL2RB-3’探针(ILRB2-3’Probe)：
F：5’-GGCCTGATCTAGCCAAGTAGGG-3’(SEQ ID NO：47)
R：5’-AATGCCATGCACAGATCATTGAAA-3’(SEQ ID NO：48)
Neo探针(Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：20)
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：21)
表5
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
XbaI IL2RB-5’探针(IL2RB-5’Probe) 13.2kb 10.0kb
AseI IL2RB-3’探针(ILRB2-3’Probe) 8.9kb 7.2kb
NdeI Neo探针(Neo Probe) -- 7.7kb
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到表达人源化IL2RB蛋白的IL2RB基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图12，其中，编号为IL2RB-F1-11的小鼠为阳性杂合小鼠。其中，PCR引物及目的条带大小如表6所示。
表6
Figure BDA0003046685600000391
其中，WT为野生型小鼠，Mut为IL2RB人源化小鼠。
通过流式(如流式细胞仪)方法确认小鼠体内人源化IL2RB蛋白的表达情况。选取6周龄的野生型C57BL/6小鼠和IL2RB基因人源化杂合小鼠各1只，腹腔注射7.5μg/200μL的mCD3，24小时后取脾脏细胞进行流式检测。染色方案如下：用PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody(mTCRβ-PerCP/Cy5.5)、Brilliant Violet 605TM anti-mouseCD4Antibody(mCD4-BV605)、Brilliant Violet 711TM anti-mouse CD8a Antibody(mCD8-BV711)标记T细胞，PE-CyTM 7Mouse Anti-Mouse NK-1.1(mNK1.1-PE/Cy7)标记NK细胞，再用抗鼠IL2RB抗体APC anti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody(mIL2RB)、或抗人IL2RB抗体PEanti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody(hIL2RB)识别染色后进行流式检测。流式分析结果(见图13-16)表明，与野生型C57BL/6小鼠相比，抗人IL2RB抗体可以检测到人源化小鼠脾脏内表达人源化IL2RB蛋白的细胞，而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化IL2RB蛋白的细胞。
实施例3 IL2RA基因人源化小鼠
小鼠IL2RA基因(NCBI Gene ID：16184，Primary source：MGI:96549，UniProtKB：P01590，位于2号染色体NC_000068.7的第11642792至11693194位，基于转录本NM_008367.3(SEQ ID NO：55)及其编码蛋白NP_032393.3(SEQ ID NO：56))和人IL2RA基因(NCBI GeneID：3559，Primary source：HGNC:6008，UniProtKB：P01589，位于10号染色体NC_000010.11的第6010689至6062367位，基于转录本NM_000417.2(SEQ ID NO：57)及其编码蛋白NP_000408.1(SEQ ID NO：58所示))对比示意图如图17所示。
在小鼠内源IL2RA基因座将小鼠IL2RA基因的2号至6号外显子的8807bp的序列用对应的人基因序列替换，改造后的人源化小鼠IL2RA基因座示意图如图18所示，其mRNA序列及其编码的蛋白质序列分别如SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：51所示。
取IL2RA基因人源化纯合子小鼠(6-7周龄)，按体重随机分为对照组和治疗组(n＝5/组)，分组后第二天所有小鼠皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×105个)。对照组注射同型对照抗体(Isotype)，治疗组随机选择两种抗人IL2RA单克隆抗体(AB1和AB2，使用常规方法免疫小鼠得到，参见Janeway'sImmunobiology(9thEdition))中的一种，给药剂量为10mg/kg。给药方式：腹腔注射，分组当天开始给药，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。
整个实验过程中小鼠健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重均出现一定程度的增长。所有治疗组(G2、G3)和对照组小鼠(G1)体重(图19)在整个实验周期内均无显著区别，整体呈现增长趋势(图20)；从肿瘤体积测量结果上看(图21)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小，可见在使用抗人IL2RA抗体AB1或AB2治疗后，可以抑制小鼠体内的肿瘤生长。表明这2种抗人IL2RA抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。
表7中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组后第10天、分组后21天时、实验结束时(分组后第28天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(TumorGrowth Inhibition Value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
表7
Figure BDA0003046685600000401
Figure BDA0003046685600000411
从表7可见，对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点时均存活，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对抗人IL2RA抗体AB1和AB2耐受良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为2635±297mm3，AB1抗体治疗组(G2)为195±58mm3，AB2抗体治疗组(G3)为833±307mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(P≤0.05)，TGITV分别为92.2％和66.7％。表明在相同的给药剂量和频次下，抗人AB1抗体与抗人AB2抗体在体内都具有明显的抑制肿瘤生长上的效果(TGITV＞60％)，且抗人AB1抗体在治疗和抑制肿瘤生长能力优于抗人AB2抗体。由此证明不同的抗人IL2RA抗体在IL2RA人源化小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力和不同的疗效，且均未对动物产生明显毒副作用，安全性较好。
上述研究结果证明人源化IL2RA动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于IL2RA相关调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人IL2RA信号通路的抗体的有效性及治疗效果等。
实施例4双基因和多基因人源化小鼠及其应用
利用实施例1制得的IL2和/或实施例2制得的IL2RB小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，可选择PD-1基因人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到PD-1人源化与IL2或IL2RB基因修饰的双基因人源化小鼠。也可将本方法得到的IL2和/或IL2RB小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到IL2和/或IL2RB人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
以双重人源化IL2/IL2RB小鼠的生成为例。由于鼠IL2与IL2RB基因分别均位于3号和15号染色体上，选择实施例1制备的IL2基因人源化小鼠与实施例2制备的IL2RB基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化IL2/IL2RB小鼠。
以双重人源化IL2RA/IL2RB小鼠的生成为例。由于鼠IL2RA与IL2RB基因分别均位于2号和15号染色体上，选择实施例3制备的IL2RA基因人源化小鼠与实施例2制备的IL2RB基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化IL2RA/IL2RB小鼠。
以双重人源化PD-1/IL2RB小鼠的生成为例。由于鼠PD-1与IL2RB基因分别均位于1号和15号染色体上，选择PD-1基因人源化小鼠与IL2RB基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化PD-1/IL2RB小鼠。
以三基因人源化IL2/IL2RA/IL2RB小鼠的生成为例。选择实施例1制备的IL2基因人源化小鼠、实施例2制备的IL2RB基因人源化小鼠与实施例3制备的IL2RA基因人源化小鼠为材料。由于鼠IL2、L2RA与IL2RB基因分别均位于3号、2号和15号染色体上，可先选择将其中两种小鼠交配后，再与第三种基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化IL2/IL2RA/IL2RB小鼠。
实施例5动物模型体内药效验证
利用本方法制备的含有IL2和/或IL2RB人源化的小鼠建立疾病模型后可用于验证抗人抗体的药效。以IL2RB/PD-1双基因人源化小鼠及肿瘤模型为例，先在IL2RB/PD-1人源化小鼠皮下接种小鼠肿瘤细胞(例如结肠癌细胞MC38)，待肿瘤生长达到规定体积后随机分为对照组或治疗组。治疗组使用抗人PD-1、抗人IL2RB抗体及两种抗体联用，对照组注射空白溶剂。通过测量肿瘤体积并称量小鼠的体重可以评估待测抗体的毒性、药效及联用方案的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司
<120> 一种人源化的非人动物及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 955
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
tatcaccctt gctaatcact cctcacagtg acctcaagtc ctgcaggcat gtacagcatg 60
cagctcgcat cctgtgtcac attgacactt gtgctccttg tcaacagcgc acccacttca 120
agctccactt caagctctac agcggaagca cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180
cagcagcacc tggagcagct gttgatggac ctacaggagc tcctgagcag gatggagaat 240
tacaggaacc tgaaactccc caggatgctc accttcaaat tttacttgcc caagcaggcc 300
acagaattga aagatcttca gtgcctagaa gatgaacttg gacctctgcg gcatgttctg 360
gatttgactc aaagcaaaag ctttcaattg gaagatgctg agaatttcat cagcaatatc 420
agagtaactg ttgtaaaact aaagggctct gacaacacat ttgagtgcca attcgatgat 480
gagtcagcaa ctgtggtgga ctttctgagg agatggatag ccttctgtca aagcatcatc 540
tcaacaagcc ctcaataact atgtacctcc tgcttacaac acataaggct ctctatttat 600
ttaaatattt aactttaatt tatttttgga tgtattgttt actatctttt gtaactacta 660
gtcttcagat gataaatatg gatctttaaa gattcttttt gtaagcccca agggctcaaa 720
aatgttttaa actatttatc tgaaattatt tattatattg aattgttaaa tatcatgtgt 780
aggtagactc attaataaaa gtatttagat gattcaaata taaataagct cagatgtctg 840
tcatttttag gacagcacaa agtaagcgct aaaataactt ctcagttatt cctgtgaact 900
ctatgttaat cagtgttttc aagaaataaa gctctcctct aaaaaaaaaa aaaaa 955
<210> 2
<211> 169
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu
35 40 45
Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu
85 90 95
Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val
115 120 125
Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp
130 135 140
Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys
145 150 155 160
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
165
<210> 3
<211> 822
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60
caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120
tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180
gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 240
taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 300
actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 360
cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 420
attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 480
taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 540
acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 600
gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 660
gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 720
tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 780
taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 822
<210> 4
<211> 153
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 5
<211> 3916
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtctatca tcgctgtcag atgattatac tcagccacaa gaaacagtat gtgacctaac 60
atacaggtct ctattgggaa tcctcagggc ttgaaaggac agtcacacag atacaggtac 120
agaaaagctg gtgtgggtgg gttgtagttg ctctgatggg ggggaagtgc ctactgtgca 180
aaccccaaaa ctgcataatg gggcaggtta gctctctcag acagaggtct ctgtaggaat 240
gtcctgaggc atcaaggagg aggcggcggc tgtggttgct agttatcgtg cacactggtc 300
tgtcatttga aaacccttgt acttggagca gaggaaggct tttggcaatt ctttgagcct 360
ggcagaggga aggctgaggt actggagtcc ttgatatagc tctgcactaa actttcagtc 420
aggactgcat ctgcttccac actaggcttt gtagccacta atggaatgga gctattccag 480
ggtccaagga ctcccaaagc tgctcagatg aggcactgtc catgcaggga gccttgcctg 540
aattccctag ccaccgctgg caggctggag tgagatggaa cagctgcaga gttgacttca 600
gcctgtctta aagggacttc agcttcactg tccttcactt gataaacaga tgggacgaga 660
gagaggagca ggaagaaatc tacaacccca ccacaactga gaacagaatc acagagtcac 720
tcaacctccc caaacatcag gtttcccatc cattaaatgt gattcagtga gatgatgaat 780
tcgaaaactt ttaaacatta aaaataccaa agaaataaaa actgtttcca tgctgaaggt 840
cataaacttt aaaacttgcc tggtgaggac caagtcggag tcagctgtca caaatttctg 900
agtgtttgtg agaaactgaa ataatatacg ataaataaaa tttaaaagat gaagttggag 960
catcacccca aggaaattcg gatttcatgg atgaacaaat gacatgctcc actttcaaag 1020
gacaagtaca gggtctgaac tgaaagccaa acaactagta acaagagatg aattcacact 1080
ggcctcacac cagactaaac tgtagcttta atcccatgaa agatcaggca aaagaaactc 1140
ttgtgggagg tggagttctc agtagtttgc atgagtggac catgtaagca acaggtgaca 1200
ggttccccgg gcagcatctc tagggtctgg gcctgccttc acttctagga gcagctggaa 1260
cagctaatac tgagcagtag agctctgtgg cttatgacac atgtggtagt caggcagcga 1320
ctgattacat cacctctcca gccagaaacc ccagctgctg tgtcaaggat gttaaaaatg 1380
gaaagtgcac cacagctgtt ggtagctttc tccccaagca tcttaagaaa ctgggaggcc 1440
aacctttgta atgctgccaa ttatgcaatg ctctgtaggg gtgaaccttg gccccaggaa 1500
ctcattctac aggcttttag aaacgcggcc atgtaaattt ctctaatgga aacagctgga 1560
gaaatagaga tgttgagccc atgaggacat caaaggcccc actgtgtgga aaagccccca 1620
cacaggaaaa tgtgtgggcc tgactccttc cattctggaa ggggaggcct gagttgcttg 1680
ggctgggatg agatgctgaa gatctgagaa gagagacaag agcattgagg ctgagagtta 1740
ttaggtagat gcccctcacg atggcatgct taatctgaag gcacagaagg tgatgatgac 1800
taggagattt gtccccatcc tgctttcctt cagacatgcc aacagggcca ctatgatacc 1860
agaagttgtc aagcttactg caagatacat gcagagtttt ttgttgtttt ctagaatact 1920
gtccaatgat tggagaacta tcccagaacc attctctgtt ctttgtgaga gactttaggc 1980
caacattcct tacattgctt agtcttcctg ctttcactat tccccagcat caaaattaca 2040
cttaaagtaa ctatctcaaa actctttaca ttgcccaaca tccaacattt ctaggatgtt 2100
atctgtctcc atccaaggat caggtcaata ggaagacaga tggtgtgaga gtagattctg 2160
gagtcagaac attctagttt cgaatcttca ccctaccctt tactggcaat aaggctgagt 2220
aacctcaatg atttatctaa tctacccaca gtgtgcatgt agcagtcaaa gacaacttgt 2280
ggagtcagtg agaactgact tccaccttta tgtaagttca gggatcagag agcaaggttt 2340
gtatagcaag ccccttagtc atctcatcac cctacatcct cagttttcaa atctacaaaa 2400
tggggtaggt gtgtggtgag gcttatgtta atctgtgtat ttgcacatat tttctccctt 2460
tctatgtacc ccaggatgtt ttagatggta gataaatgtc tgcataaaga ctagaccagt 2520
acaagttatt agaaatgggg acaccacagg caagctccct aagaaagacc ccgtctctac 2580
cagttgattt ggaactatgt tcctactcca tcacgcagcc agtgtactac acggaggata 2640
aggaatccaa tgtatcctat tcaggtgacc cactgagaac acgtgggata gtccctagct 2700
attactctca gagtgcccag gtacttttag gataaaccca aatctactga attaggggga 2760
agaaggttgg caagatggct cagtggtaaa ggctaggtag aggctagtag cagaggtagg 2820
cacacagact ggatgacttt tgtgtttaga tttctgagtc acacaaggtg acaggagaga 2880
agttactagc aagagttggt ctctgacctc cacaggtgta ctgtggcaca cacacacaca 2940
cacactcata atacatgtgc acaaatgcat gtacacatac atacacacat gcatacatgc 3000
acacacacac actcatatac acacgcacat aaacatgctc acacacacat acatgtgcac 3060
gcacatgcac atactcatac acacatgaac acatgtgtgt gtacacacgt gaaaatattt 3120
tttaaaaatg aaagtgcaac tagagacata taaaataaca ccaacatcct tagatgcaac 3180
ccttcctgag aatttgttgg acatcatact ctttttaaaa agcataataa acatcaagac 3240
acttacacaa aatatgttaa attaaattta aaacaacaac gacaaaatag tacctcaagc 3300
tcaacaagca ttttaggtgt ccttagctta ctatttctct ggctaactgt atgaagccat 3360
ctatcaccct gtgtgcaatt agctcattgt gtagataaga aggtaaaacc atcttgaaac 3420
aggaaaccaa tatccttcct gtctaatcaa caaatctaaa agatttattc ttttcatcta 3480
tctcctcttg cgtttgtcca ccacaacagg ctgcttacag gttcaggatg gttttgacaa 3540
agagaacatt ttcatgagtt acttttgtgt ctccacccca aagaggaaaa tttgtttcat 3600
acagaaggcg ttcattgtat gaattaaaac tgccacctaa gtgtgggcta acccgaccaa 3660
gagggatttc acctaaatcc attcagtcag tgtatggggg tttaaagaaa ttccagagag 3720
tcatcagaag aggaaaaaca aaggtaatgc tttctgccac acaggtagac tctttgaaaa 3780
tatgtgtaat atgtaaaaca tcgtgacacc cccatattat ttttccagca ttaacagtat 3840
aaattgcctc ccatgctgaa gagctgccta tcacccttgc taatcactcc tcacagtgac 3900
ctcaagtcct gcaggc 3916
<210> 6
<211> 3275
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actttcacac catcacactg ggaaccactt tctatcccat gaggttttga ggaataaatc 60
atagcacatc tcacagaata atgtgccctc tatagtttag cactgatgtc tgcatttaaa 120
agcctcacct ggataaataa aaatcctctc cttctctttt gtttttaatt gggtgctgac 180
aaagtcgact aagatgcaga aaaagagctc cctgccttta gctgtgtctc ttgaccacag 240
aacttgcctt ctctcaaggt ggctctgtgg ttacattttc tttgtggatc ttacctttcc 300
ttccacatct ccttgtaagg tggtggaact cgtttggtgc cagctctagg gtacctgtgc 360
tatcctttac agactccttg ttgcttgacc aaaactttat aaatgatccc ttcttcttgg 420
ggatgccatc tgttttctgc taggactcaa atgtagtcat tgtatcagaa ataccaccag 480
aaaatatacc cccatatagg actctggaat tgtactgatt atatattgaa tgaaaacagt 540
agtagctgtg catgtcttgg tatgtggtat gtcttgattt catggtatga caataccatt 600
catataacta tttatataat ctgatgtcta cttaaaatta ctttaaatag aagaatgaac 660
acttgaatgg gaaatagcac atgctacaca agtcctaacc ctgagcaaca actccaacag 720
aacagaacat aaactatagg tagccagagc agaccttaaa gcaagaagga cagagattgg 780
tcatggtttt atactgatca cgttcattcc acaaaaacat accggtacta aatgtgatcc 840
agagcttcca agtacacaga cagaggcttg tgcacctagc cttgatagag catgggacca 900
gagtggactc ttatggctat ccatgaaaat gagactctga actacaggca ggacatgtga 960
ctagaaacgg atacagctga gcttccacag aaagcactgt agttttgatg acttaaagaa 1020
acagaggtta gagtttcggt ttactaaagt agccttgtaa gaatgtaagc cacagtaata 1080
gaaagaaggc aactataaga atagctacag gagtatcaat aaaatctaat tttatttttt 1140
attttttact gtgcaacaag catttttagg tactaaaatc tacaacaaag aataacagtc 1200
agagaaagaa tgtgcactgg aacaccagac cctcaaaacc taataattct gcaaaactgg 1260
aaggtatcca ggttcaatag atcagaaact ctaatagatt ggactacccc aggttaggtg 1320
ctacaaatca agaagactgt gtcttagagg gaagaacagt ctagcttcac aaacctagag 1380
taggagcact ctaaatctga gtatatagac tgtgctgggt ctgctctaag agctttaaag 1440
cagccggcaa gacagctcag cagtgaagga aatagctacc aagcctgatg gtttggtggt 1500
agaagaagaa aactgactcc tgcaagttgt cctatgatct ccacaagagg accatgtgta 1560
gcaagacagt atgtcaatac atagtttagc ttgcctttca tgttcatctt gtctcttgct 1620
ctttagtgct gggttacaag tatgttacca ccttgctgga tttagcacca tttttgcaca 1680
atggcataac atgggtttaa acaagtatgg tgactaagga gagagacagg ggaggattga 1740
aaggaatatg ctaaatttgt actcacagat gtgtaaagga aaggtctgtc atgaaagaat 1800
cttggattaa tgggtgagct gaataggatt attagtaata tggttaatat atatggggtc 1860
atttgtattt ttatttgtca gtatctcaga gaatgtattt taaaataata ctatttacag 1920
cagaacccca aacaccaggt atttgggaat aattgtaata aatatatgcc tgttaaaata 1980
agaaaataca tagactttaa gagctaagta gatggttcta aagatttagt tgcaaaattt 2040
gatatcttaa gatgttaata ctccctaaga ttaatacaat cacactgaat tttcagtcga 2100
ttttctttgg aagtatatga caaaggctca ggcattggta ttagatatga tagtggcctc 2160
aataactagg ctttttgggt aaaatcctgt aaggaaggta tgctggttaa agcaagccta 2220
ctgataatta gacaagatga tgtaaaagta agggctttta gtagattacc cttttttttc 2280
cagatgtctc gttcatcatt aaagctgtga ttcctgagca cataaaaatg tatagctttg 2340
aagaatgtgt gtgtgtgtat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2400
gtacagatgt gaaggaaagc tagagagggt tgatttacac ctacagttac tattataagg 2460
cctaattggc tggatgtgca aaatgttaaa aattttcaaa atatcatttt agtaattgca 2520
tagatggctg tgaacagtgt ggttaatgag ccaagacata aatactataa tagtactatt 2580
atttcatgaa gattaaaatc agattattaa gaagattgct tcaactacta cagaacttga 2640
atgagaggag ggctgagatg gggtagtggg tctctgtggt taatgggagt cagaggtgga 2700
gggtaaattg tgctgatttt cctagggctg caattagaag gtctaggaga ggaattaagt 2760
tgatgttgtg aggaaaaaaa tatttgttga agttctcagg agttgatgtt tacaaaggat 2820
catgtctaaa atgaatccaa tgtctccaat gtgattatac aatattgctt ggagggctgc 2880
actatttgct gataaaaaaa tgatatacct atgccttccc agctaataaa gttggttgaa 2940
gcaaagataa tgaatgtgat taaaaataaa ggaggtattt gataaaatag tctaggagaa 3000
gtaggagtgt acagatcgtg aagaaaactc tatggttgat aaagccatga gtagagagag 3060
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gtccttagta attaagtgtg tcagaacagt agaatgatat tagggttaat aggctaagaa 3180
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<210> 7
<211> 4686
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaatgta agtatatttc ctttcttact aaaattatta 180
catttagtaa tctagctgga gatcatttct taataacaat gcattatact ttcttagaat 240
tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acatttaagt tttacatgcc caagaaggta 300
agtacaatat tttatgttca atttctgttt taataaaatt caaagtaata tgaaaatttg 360
cacagatggg actaatagca gctcatctga ggtaaagagt aactttaatt tgtttttttg 420
aaaacccaag tttgataatg aagcctctat taaaacagtt ttacctatat ttttaatata 480
tatttgtgtg ttggtggggg tgggaagaaa acataaaaat aatattctca ctttatcgat 540
aagacaattc taaacaaaaa tgttcattta tggtttcatt taaaaatgta aaactctaaa 600
atatttgatt atgtcatttt agtatgtaaa ataccaaaat ctatttccaa ggagcccact 660
tttaaaaatc ttttcttgtt ttaggaaagg tttctaagtg agaggcagca taacactaat 720
agcacagagt ctggggccag atatctgaag tgaaatctca gctctgccat gtcctagctt 780
tcatgatctt tggcaaatta cctactctgt ttgtgattca gtttcatgtc tacttaaatg 840
aataactgta tatacttaat atggctttgt gagaattagt aagtaaatgt aaagcactca 900
gaaccgtgtc tggcataagg taaataccat acaagcatta gctattatta gtagtattaa 960
agataaaatt ttcactgaga aatacaaagt aaaattttgg actttatctt tttaccaata 1020
gaacttgaga tttataatgc tatatgactt attttccaag attaaaagct tcattaggtt 1080
gtttttggat tcagatagag cataagcata atcatccaag ctcctaggct acattaggtg 1140
tgtaaagcta cctagtagct gtgccagtta agagagaatg aacaaaatct ggtgccagaa 1200
agagcttgtg ccagggtgaa tccaagccca gaaaataata ggatttaagg ggacacagat 1260
gcaatcccat tgactcaaat tctattaatt caagagaaat ctgcttctaa ctacccttct 1320
gaaagatgta aaggagacag cttacagatg ttactctagt ttaatcagag ccacataatg 1380
caactccagc aacataaaga tactagatgc tgttttctga agaaaatttc tccacattgt 1440
tcatgccaaa aacttaaacc cgaatttgta gaatttgtag tggtgaattg aaagcgcaat 1500
agatggacat atcaggggat tggtattgtc ttgacctacc tttcccacta aagagtgtta 1560
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aaaccaaaag taatgataaa ctctattcat ttgttcattt aaccctcatt gcacatttac 1680
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gaaaagtaaa aatttaagac atatttaaaa atgtgtcttg ctcaaggcta tattgagagc 2100
cactactaca tgattattgt tacctagtgt aaaatgttgg gattgtgata gatggcatcc 2160
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cataggtact tgagccctag tttttccagt tttataatgt aaactctact ggtccatctt 2460
tacagtgaca ttgagaacag agagaatggt aaaaactaca tactgctact ccaaataaaa 2520
taaattggaa attaatttct gattctgacc tctatgtaaa ctgagctgat gataattatt 2580
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caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa ggtaaggcat tactttattt gctctcctgg 2760
aaataaaaaa aaaaaagtag ggggaaaagt accacatttt aaagtgacat aacatttttg 2820
gtatttgtaa agtacccatg catgtaatta gcctacattt taagtacact gtgaacatga 2880
atcatttcta atgttaaatg attaactggg gagtataagc tactgagttt gcacctacca 2940
tctactaatg gacaagcctc atcccaaact ccatcacctt tcatattaac acaaaactgg 3000
gagtgagaga aggtactgag ttgagtttca cagaaagcag gcagatttta ctatatattt 3060
ttcaattcct tcagatcatt tactggaata gccaatactg attacctgaa aggcttttca 3120
aatggtgttt ccttatcatt tgatggaagg actacccata agagatttgt cttaaaaaaa 3180
aaaactggag ccattaaaat ggccagtgga ctaaacaaac aacaatcttt ttagaggcaa 3240
tccccacttt cagaatctta agtattttta aatgcacagg aagcataaaa tatgcaaggg 3300
actcaggtga tgtaaaagag attcactttt gtctttttat atcccgtctc ctaaggtata 3360
aaattcatga gttaataggt atcctaaata agcagcataa gtatagtagt aaaagacatt 3420
cctaaaagta actccagttg tgtccaaatg aatcacttat tagtggactg tttcagttga 3480
attaaaaaaa tacattgaga tcaatgtcat ctagacattg acagattcag ttccttatct 3540
atggcaagag ttttactcta aaataattaa catcagaaaa ctcattctta actcttgata 3600
caaatttaag acaaaaccat gcaaaaatct gaaaactgtg tttcaaaagc caaacacttt 3660
ttaaaataaa aaaatcccaa gatatgacaa tatttaaaca attatgctta agaggataca 3720
gaacactgca acagtttttt aaaagagaat acttatttaa agggaacact ctatctcacc 3780
tgcttttgtt cccagggtag gaatcacttc aaatttgaaa agctctcttt taaatctcac 3840
tatatatcaa aatatttcct ccttagctta tcaactagag gaagcgttta aatagctcct 3900
ttcagcagag aagcctaatt tctaaaaagc cagtccacag aacaaaattt ctaatgttta 3960
aacttttaaa agttggcaaa ttcacctgca ttgatactat gatggggtag ggataggtgt 4020
aagtatttat gaagatgttc ttcacacaaa tttatcccaa acagaagcat gtcctagctt 4080
actctagtgt agttctgttc tgctttgggg aaaatataag gagattcact taagtagaaa 4140
aataggagac tctaatcaag atttagaaaa gaagaaagta taatgtgcat atcaattcat 4200
acatttaact tacacaaata taggtgtaca ttcagaggaa aagcgatcaa gtttatttca 4260
catccagcat ttaatatttg tctagatcta tttttattta aatctttatt tgcacccaat 4320
ttagggaaaa aatttttgtg ttcattgact gaattaacaa atgaggaaaa tctcagcttc 4380
tgtgttacta tcatttggta tcataacaaa atatgtaatt ttggcattca ttttgatcat 4440
ttcaagaaaa tgtgaataat taatatgttt ggtaagcttg aaaataaagg caacaggcct 4500
ataagacttc aattgggaat aactgtatat aaggtaaact actctgtact ttaaaaaatt 4560
aacatttttc ttttataggg atctgaaaca acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca 4620
gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg attacctttt gtcaaagcat catctcaaca 4680
ctgact 4686
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tatcaccctt gctaatcact cctcacagtg acctcaagtc ctgcaggcat gtacaggatg 60
caactcctgt cttgcattgc actaagtctt gcacttgtca caaacagtgc acctacttca 120
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 180
ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca ggatgctcac atttaagttt 240
tacatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt gtctagaaga agaactcaaa 300
cctctggagg aagtgctaaa tttagctcaa agcaaaaact ttcacttaag acccagggac 360
ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg gatctgaaac aacattcatg 420
tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt 480
tgtcaaagca tcatctcaac actgacttaa ctatgtacct cctgcttaca acacataagg 540
ctctctattt atttaaatat ttaactttaa tttatttttg gatgtattgt ttactatctt 600
ttgtaactac tagtcttcag atgataaata tggatcttta aagattcttt ttgtaagccc 660
caagggctca aaaatgtttt aaactattta tctgaaatta tttattatat tgaattgtta 720
aatatcatgt gtaggtagac tcattaataa aagtatttag atgattcaaa tataaataag 780
ctcagatgtc tgtcattttt aggacagcac aaagtaagcg ctaaaataac ttctcagtta 840
ttcctgtgaa ctctatgtta atcagtgttt tcaagaaata aagctctcct ctaaaaaaaa 900
aaaaaaa 907
<210> 10
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgggccata atacaattat tatacaccaa ctctaccatt acctacccat atggtcgacg 60
gtatcgataa gcttgatatc gaattccgaa gttcct 96
<210> 11
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tataggaact tcatcagtca ggtacataat ggtggatccc accatgtgac tttcacacca 60
tcacactggg aaccactttc tatcccatga 90
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggacatag cgttggctac 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggatctcct gggagctctg t 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacacataga gaaagtggct ggat 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgggcttg gattcaccct g 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acttctccgt ttgggtgctg ttagt 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgcagcagtt gtacagcaac agaga 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttgaaagga atgaaacaca cagt 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccatgtctc cttcatgtca ccta 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagaagaact cgtcaagaag gcg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctaacccga ccaagaggga ttt 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aacacagaaa ctcactcacc tgc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcatcctgg tgagtttggg att 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtcccacac aatctgaccc a 21
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccaggtgagg cttttaaatg caga 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 29
<211> 2712
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 29
agtctgttgc tggcctagct gttgtctgct acctaagctg cggagcagga gatggccgtg 60
gacccaacct ccagcaggac tgcagggaac atctcgacac aactccatgt tgcagccagg 120
gtttgcatcc tcagctcctc tcagctgtga tggctaccat agctcttccc tggagcctgt 180
ccctctacgt cttcctcctg ctcctggcta caccttgggc atctgcagca gtgaaaaact 240
gttcccatct tgaatgcttc tacaactcaa gagccaatgt ctcttgcatg tggagccatg 300
aagaggctct gaatgtcaca acctgccacg tccatgccaa gtcgaacctg cgacactgga 360
acaaaacctg tgagctaact cttgtgaggc aggcatcctg ggcctgcaac ctgatcctcg 420
ggtcgttccc agagtcccag tcactgacct ccgtggacct ccttgacata aatgtggtgt 480
gctgggaaga gaagggttgg cgtagggtaa agacctgcga cttccatccc tttgacaacc 540
ttcgcctggt ggcccctcat tccctccaag ttctgcacat tgatacccag agatgtaaca 600
taagctggaa ggtctcccag gtctctcact acattgaacc atacttggaa tttgaggccc 660
gtagacgtct tctgggccac agctgggagg atgcatccgt attaagcctc aagcagagac 720
agcagtggct cttcttggag atgctgatcc ctagtacctc atatgaggtc caggtgaggg 780
tcaaagctca acgaaacaat accgggacct ggagtccctg gagccagccc ctgacctttc 840
ggacaaggcc agcagatccc atgaaggaga tcctccccat gtcatggctc agataccttc 900
tgctggtcct tggttgtttt tctggcttct tctcctgcgt ctacattttg gtcaagtgcc 960
ggtaccttgg gccatggctg aagacagttc tcaagtgcca catcccagat ccttctgagt 1020
tcttctccca gctgagctcc cagcatgggg gagaccttca gaaatggctc tcctcgcctg 1080
tccccttgtc cttcttcagc cccagtggcc ctgcccctga gatctctccg ctggaagtgc 1140
tcgacggaga ttccaaggcc gtgcagctgc tcctgttaca gaaggactct gcccctttac 1200
cctcgcccag cggccactca caggccagct gcttcaccaa ccagggctac ttcttcttcc 1260
atctgcccaa tgccttggag atcgaatcct gccaggtgta cttcacctat gacccctgtg 1320
tggaagagga ggtggaggag gatgggtcaa ggctgcccga gggatctccc cacccacctc 1380
tgctgcctct ggctggagaa caggatgact actgtgcctt cccgcccagg gatgacctgc 1440
tgctcttctc cccgagcctc agcaccccca acactgccta tgggggcagc agagcccctg 1500
aagaaagatc tccactctcc ctgcatgagg gacttccctc cctagcatcc cgtgacctga 1560
tgggcttaca gcgccctctg gagcggatgc cggaaggtga tggagagggg ctgtctgcca 1620
atagctctgg ggagcaggcc agtgtcccag aaggcaacct tcatgggcaa gatcaggaca 1680
gaggccaggg ccccatcctg accctgaaca ccgatgccta tctgtctctt caagaactac 1740
aggcccaaga ttcagtccac ctaatatagc aggtggccag gactgggatc cagctgcctg 1800
gatcaggtca ggcttgagga agactgctta agaggtctct tgaggacagt ccactgctga 1860
ggactgtcct ggctatccct gccccccccc tccaaactta atcatccact tctgaactcc 1920
atttgctact tcctggtcta accagggttt ggtggagggt ggggagtggg ggagcggtgg 1980
tcagctccac tgccctattt agtcatgagg tcactagctt cctgtacctg cctccttccc 2040
tcctgcttgc cttcacaggg cagctagaac ttgcttcccc caatacaaac ataaccttgc 2100
tcctcattta tccctgagct tgctggggct ccttacttcc ctctgcccca tttcctgtct 2160
caactcttgc cctgccagca cggctgtgga acagctgtcc tcaggttgtg atgtggctgt 2220
acactgtctt aaaatcagag cagctttgac aacccaaacg aagaggtcct gataagactg 2280
aatgcagcct gttgactatg gagggtccct cgtagaagga ggggttggga agggtcatca 2340
gtcatcacct gagatcgtag ccactctcct gcaccccatc ctcagctatt ctgctcctgg 2400
agcatgagtt attttatgtg ttcttgggcg atgctggtct atgtaagggg tgggggcgcg 2460
gggttgattg aagtgagggc tccttctatg ttgctttggg gaccttgtct attctggggt 2520
gggtttttct gtgaagcagc ttctttgggg taacctagcc cccttgtcag taagcctaag 2580
agagtcaaag gaccaccgag ctggacttga gtgtacgcct acttttgatg caacatctgg 2640
gaaaagtact ttttttgtta atgtatcctt gaagctaaga aaagcttaca ccacaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aa 2712
<210> 30
<211> 539
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 30
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Lys Asn Cys Ser
20 25 30
His Leu Glu Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Val Ser Cys Met Trp
35 40 45
Ser His Glu Glu Ala Leu Asn Val Thr Thr Cys His Val His Ala Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Arg His Trp Asn Lys Thr Cys Glu Leu Thr Leu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ser Phe Pro Glu Ser
85 90 95
Gln Ser Leu Thr Ser Val Asp Leu Leu Asp Ile Asn Val Val Cys Trp
100 105 110
Glu Glu Lys Gly Trp Arg Arg Val Lys Thr Cys Asp Phe His Pro Phe
115 120 125
Asp Asn Leu Arg Leu Val Ala Pro His Ser Leu Gln Val Leu His Ile
130 135 140
Asp Thr Gln Arg Cys Asn Ile Ser Trp Lys Val Ser Gln Val Ser His
145 150 155 160
Tyr Ile Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu Gly
165 170 175
His Ser Trp Glu Asp Ala Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Arg Gln Gln
180 185 190
Trp Leu Phe Leu Glu Met Leu Ile Pro Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln
195 200 205
Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn Asn Thr Gly Thr Trp Ser Pro Trp
210 215 220
Ser Gln Pro Leu Thr Phe Arg Thr Arg Pro Ala Asp Pro Met Lys Glu
225 230 235 240
Ile Leu Pro Met Ser Trp Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Val Leu Gly Cys
245 250 255
Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys Val Tyr Ile Leu Val Lys Cys Arg Tyr
260 265 270
Leu Gly Pro Trp Leu Lys Thr Val Leu Lys Cys His Ile Pro Asp Pro
275 280 285
Ser Glu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Gln His Gly Gly Asp Leu Gln
290 295 300
Lys Trp Leu Ser Ser Pro Val Pro Leu Ser Phe Phe Ser Pro Ser Gly
305 310 315 320
Pro Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp Gly Asp Ser Lys
325 330 335
Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp Ser Ala Pro Leu Pro Ser
340 345 350
Pro Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
355 360 365
Phe Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile Glu Ser Cys Gln Val Tyr
370 375 380
Phe Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu Val Glu Glu Asp Gly Ser
385 390 395 400
Arg Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ala Gly
405 410 415
Glu Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro Arg Asp Asp Leu Leu Leu
420 425 430
Phe Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ala Tyr Gly Gly Ser Arg
435 440 445
Ala Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu His Glu Gly Leu Pro Ser
450 455 460
Leu Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln Arg Pro Leu Glu Arg Met
465 470 475 480
Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ser Gly Glu Gln
485 490 495
Ala Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly Gln Asp Gln Asp Arg Gly
500 505 510
Gln Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln
515 520 525
Glu Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu Ile
530 535
<210> 31
<211> 4034
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 31
agagctcagc agggccctgg agagatggcc acggtcccag caccggggag gactggagag 60
cgcgcgctgc caccgcccca tgtctcagcc agggcttcct tcctcggctc caccctgtgg 120
atgtaatggc ggcccctgct ctgtcctggc gtctgcccct cctcatcctc ctcctgcccc 180
tggctacctc ttgggcatct gcagcggtga atggcacttc ccagttcaca tgcttctaca 240
actcgagagc caacatctcc tgtgtctgga gccaagatgg ggctctgcag gacacttcct 300
gccaagtcca tgcctggccg gacagacggc ggtggaacca aacctgtgag ctgctccccg 360
tgagtcaagc atcctgggcc tgcaacctga tcctcggagc cccagattct cagaaactga 420
ccacagttga catcgtcacc ctgagggtgc tgtgccgtga gggggtgcga tggagggtga 480
tggccatcca ggacttcaag ccctttgaga accttcgcct gatggccccc atctccctcc 540
aagttgtcca cgtggagacc cacagatgca acataagctg ggaaatctcc caagcctccc 600
actactttga aagacacctg gagttcgagg cccggacgct gtccccaggc cacacctggg 660
aggaggcccc cctgctgact ctcaagcaga agcaggaatg gatctgcctg gagacgctca 720
ccccagacac ccagtatgag tttcaggtgc gggtcaagcc tctgcaaggc gagttcacga 780
cctggagccc ctggagccag cccctggcct tcaggacaaa gcctgcagcc cttgggaagg 840
acaccattcc gtggctcggc cacctcctcg tgggcctcag cggggctttt ggcttcatca 900
tcttagtgta cttgctgatc aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga 960
agtgtaacac cccagacccc tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag 1020
acgtccagaa gtggctctct tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg 1080
cacctgagat ctcgccacta gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctcctgc 1140
agcaggacaa ggtgcctgag cccgcatcct taagcagcaa ccactcgctg accagctgct 1200
tcaccaacca gggttacttc ttcttccacc tcccggatgc cttggagata gaggcctgcc 1260
aggtgtactt tacttacgac ccctactcag aggaagaccc tgatgagggt gtggccgggg 1320
cacccacagg gtcttccccc caacccctgc agcctctgtc aggggaggac gacgcctact 1380
gcaccttccc ctccagggat gacctgctgc tcttctcccc cagtctcctc ggtggcccca 1440
gccccccaag cactgcccct gggggcagtg gggccggtga agagaggatg cccccttctt 1500
tgcaagaaag agtccccaga gactgggacc cccagcccct ggggcctccc accccaggag 1560
tcccagacct ggtggatttt cagccacccc ctgagctggt gctgcgagag gctggggagg 1620
aggtccctga cgctggcccc agggagggag tcagtttccc ctggtccagg cctcctgggc 1680
agggggagtt cagggccctt aatgctcgcc tgcccctgaa cactgatgcc tacttgtccc 1740
tccaagaact ccagggtcag gacccaactc acttggtgta gacagatggc cagggtggga 1800
ggcaggcagc tgcctgctct gcgccgagcc tcagaaggac cctgttgagg gtcctcagtc 1860
cactgctgag gacactcagt gtccagttgc agctggactt ctccacccgg atggccccca 1920
cccagtcctg cacacttggt ccatccattt ccaaacctcc actgctgctc ccgggtcctg 1980
ctgcccgagc caggaactgt gtgtgttgca ggggggcagt aactccccaa ctccctcgtt 2040
aatcacagga tcccacgaat ttaggctcag aagcatcgct cctctccagc cctgcagcta 2100
ttcaccaata tcagtcctcg cggctctcca gggctccctg ccctgacctc ttccctgggt 2160
tttctgcccc agcctcctcc ttccctcccc tccccgtcca cagggcagcc tgagcgtgct 2220
ttccaaaacc caaatatggc cacgctcccc ctcggttcaa aaccttgcac aggtcccact 2280
gccctcagcc ccacttctca gcctggtact tgtacctccg gtgtcgtgtg gggacatccc 2340
cttctgcaat cctccctacc gtcctcctga gccactcaga gctccctcac accccctctg 2400
ttgcacatgc tattccctgg ggctgctgtg cgctccccct catctaggtg acaaacttcc 2460
ctgactcttc aagtgccggt tttgcttctc ctggagggaa gcactgcctc ccttaatctg 2520
ccagaaactt ctagcgtcag tgctggaggg agaagctgtc agggacccag ggcgcctgga 2580
gaaagaggcc ctgttactat tcctttggga tctctgaggc ctcagagtgc ttggctgctg 2640
tatctttaat gctggggccc aagtaagggc acagatcccc ccacaaagtg gatgcctgct 2700
gcatcttccc acagtggctt cacagaccca caagagaagc tgatggggag taaaccctgg 2760
agtccgaggc ccaggcagca gccccgccta gtggtgggcc ctgatgctgc caggcctggg 2820
acctcccact gccccctcca ctggaggggt ctcctctgca gctcagggac tggcacactg 2880
gcctccagaa gggcagctcc acagggcagg gcctcattat ttttcactgc cccagacaca 2940
gtgcccaaca ccccgtcgta taccctggat gaacgaatta attacctggc accacctcgt 3000
ctgggctccc tgcgcctgac attcacacag agaggcagag tcccgtgccc attaggtctg 3060
gcatgccccc tcctgcaagg ggctcaaccc cctaccccga cccctccacg tatctttcct 3120
aggcagatca cgttgcaatg gctcaaacaa cattccaccc cagcaggaca gtgaccccag 3180
tcccagctaa ctctgacctg ggagccctca ggcacctgca cttacaggcc ttgctcacag 3240
ctgattgggc acctgaccac acgcccccac aggctctgac cagcagccta tgagggggtt 3300
tggcaccaag ctctgtccaa tcaggtaggc tgggcctgaa ctagccaatc agatcaactc 3360
tgtcttgggc gtttgaactc agggagggag gcccttggga gcaggtgctt gtggacaagg 3420
ctccacaagc gttgagcctt ggaaaggtag acaagcgttg agccactaag cagaggacct 3480
tgggttccca atacaaaaat acctactgct gagagggctg ctgaccattt ggtcaggatt 3540
cctgttgcct ttatatccaa aataaactcc cctttcttga ggttgtctga gtcttgggtc 3600
tatgccttga aaaaagctga attattggac agtctcacct cctgccatag ggtcctgaat 3660
gtttcagacc acaaggggct ccacaccttt gctgtgtgtt ctggggcaac ctactaatcc 3720
tctctgcaag tcggtctcct tatcccccca aatggaaatt gtatttgcct tctccacttt 3780
gggaggctcc cacttcttgg gagggttaca ttttttaagt cttaatcatt tgtgacatat 3840
gtatctatac atccgtatct tttaatgatc cgtgtgtacc atctttgtga ttatttcctt 3900
aatatttttt ctttaagtca gttcattttc gttgaaatac atttatttaa agaaaaatct 3960
ttgttactct gtaaatgaaa aaacccattt tcgctataaa taaaaggtaa ctgtacaaaa 4020
taagtacaat gcaa 4034
<210> 32
<211> 551
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 32
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr
225 230 235 240
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
245 250 255
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
260 265 270
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe
275 280 285
Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu
325 330 335
Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn
340 345 350
His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His
355 360 365
Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro
385 390 395 400
Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp
405 410 415
Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro
420 425 430
Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro
450 455 460
Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro
465 470 475 480
Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala
485 490 495
Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
500 505 510
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg
515 520 525
Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
530 535 540
Gln Asp Pro Thr His Leu Val
545 550
<210> 33
<211> 3426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aggagatctt atcagtgcta ggtgtgtgtg gagtttcagg ctacctcatc accccccatc 60
tctccacctc ccattgggcc ttgcccctca tcctctatac aggaagtggg ctcgccttgg 120
gtttcagtct gttgctggcc tagctgttgt ctgctaccta agctgcggag caggagatgg 180
ccgtggaccc aacctccagc aggactgcag ggaacatctc gacacaactc catgttgcag 240
ccaggtgatg cccctgtgtg gtcccctggg agccctgggc accccactac ctcttgctgg 300
tcctcccaag ggacagggag ctgggagggg gcgctcatct ctaacttggt tccctttgta 360
gtttgtatct gggctttgat gattaacctt gtcttaggat tccctgggga agggggtagc 420
ctggctgtca tggtttctcc tttaagaata aaccccttcc aatgtcaggg cacagtggct 480
tcttcccagt ctactctgtg ggaagctgtg tgccattttc gctaggaggg acttccctgg 540
atcctgtgtg gggatgtctt agcccagaag ggtggaggaa aagatttgta gctcgtcagt 600
attgggaggt ggcatggcgt gtatgggaca ggtgggattc aacgctgacg cctgtggagt 660
tcatctcagc ctggagaatt ctccttagtg agaaagagag aaggaatctc cccctgggac 720
ctggctgtcc agtcagctat gttgattgac aggtttctga gggccctagg ctggaggtca 780
gaggtagagt tctagcttag atttgtctct gacattaccg agtggctaga gaggttaagg 840
acatcgccag gcatggggct ccgtctccga ggctgcctga ggtaggagct tcccaccgtt 900
agctgtgttt acagtacttc agggccaagg tgggtggctg aggaaggcag aactaccttt 960
gaaggtcccc tttctttcac acactcctca gctgaactga acagcaagag gtgaacagtg 1020
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtctttgt gaatgtgtgt gtctctggag 1080
aggtggccag agaaaggatc tctgaggtca aaggccacca gatctgacag acaagctctt 1140
gcttgccgtc cgtcctccct cagtcgaccc tgtacctcac agacctgtga ggccttggac 1200
tgccccagca ctggaacctt tatcctggga aacaggctgc tttaggccct gatcttccca 1260
tagggaagga gcagtcagtc acagaacctg ctcttgtgct gtgagacctc tctgtgacat 1320
gtgtgggtca gtctgacgca gggagtgtga cacgactgtc actcatggct gaccctcctc 1380
ctccgtcagc atcaccactg tactggaaat caggtgaccc agttagagca gcctgggtct 1440
gtgggatgac agaccttttc agggcctcag cggagacata tatgagtcag ggagatgaac 1500
gtctggtggt tgcgaagggc atacgtgggt gagcctcagg gggacagtgc ctgggactct 1560
gagattcttg ggctgtactc actctgcccg aggctggcct tgtgctgtgt ggttttggag 1620
tggttttctt agtctcccag agattcagtt tccctcttgc cgaaggaagc tgcaaccacc 1680
atgactgctt gaagctaccc tgccccccag cctgaccctt ccagaacctt ccatatgctc 1740
ttccgtctaa ccctgtccat gatgggtgga tgcttttgtg cctcttcagc caggggtggg 1800
gagcaggttt gagtgccttt tcttaggcat tctctgtttt tggctgtggc ttgtggcccg 1860
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<400> 35
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ctgtctccga cccaggaggc ccccctgctg actctcaagc agaagcagga atggatctgc 7740
ctggagacgc tcaccccaga cacccagtat gagtttcagg tgcgggtcaa gcctctgcaa 7800
ggcgagttca cgacctggag cccctggagc cagcccctgg ccttcaggac aaagcctgca 7860
ggtactggtg ggcggcaagg gtgagagggg gctcaggcag gagggggcgg ctggaggagg 7920
agctgctcca ttctctccct gcctggggtg agggtatagc agtcagctcc atccctcact 7980
tgctgtaacc ctgcaggggg ctcgcttttc agacaggaac aggggttcag tgaggggacg 8040
gggcttgcca tgggccttgt gagttgggga ggggtcgaaa ggctgttttc actcttctcc 8100
accctgaaat ctccaactcc tggtttcttc tggggctggg ggtggctgct ttcacctctc 8160
ggcctgatct gtgaaatggg tacagtgacc gtgaggcaga gctgctgtga ggaaggcgtg 8220
tgatgtcccg gcagcctggc cctcagcagg tctgctgggc gcctgtccct catcgcacca 8280
catttcgagt tcaagcccaa gcaagacctg gggtcctcta agtggtgctt ggagggaggt 8340
ggagagaggg gtgcagccag ctggagccca ggctgctgtg ggggtggtgg ggggctgtag 8400
gctcaccagg ggggcccatg ggatctgtct ggagctggag gagctcttag aatgccaccg 8460
tgtcatttct ttttagcatg aaatctggct tcccagagga tgggcttagc agaaccctgt 8520
ccccagcccc ccagacgcag gcctgcgtgg cagggccctg gatgggggtg ttggggtgac 8580
cgacccaggg tgagtgaggg cacttctcta acccctctcc ttgctgtttc tcccacccct 8640
gggcagccct tggg 8654
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctctccttgc tgtttctccc acccctgggc agcccttggg aaggagatcc tccccatgtc 60
atggctcaga 70
<210> 37
<211> 2709
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agtctgttgc tggcctagct gttgtctgct acctaagctg cggagcagga gatggccgtg 60
gacccaacct ccagcaggac tgcagggaac atctcgacac aactccatgt tgcagccagg 120
gtttgcatcc tcagctcctc tcagctgtga tggctaccat agctcttccc tggagcctgt 180
ccctctacgt cttcctcctg ctcctggcta caccttgggc atctgcagca gtgaatggca 240
cttcccagtt cacatgcttc tacaactcga gagccaacat ctcctgtgtc tggagccaag 300
atggggctct gcaggacact tcctgccaag tccatgcctg gccggacaga cggcggtgga 360
accaaacctg tgagctgctc cccgtgagtc aagcatcctg ggcctgcaac ctgatcctcg 420
gagccccaga ttctcagaaa ctgaccacag ttgacatcgt caccctgagg gtgctgtgcc 480
gtgagggggt gcgatggagg gtgatggcca tccaggactt caagcccttt gagaaccttc 540
gcctgatggc ccccatctcc ctccaagttg tccacgtgga gacccacaga tgcaacataa 600
gctgggaaat ctcccaagcc tcccactact ttgaaagaca cctggagttc gaggcccgga 660
cgctgtcccc aggccacacc tgggaggagg cccccctgct gactctcaag cagaagcagg 720
aatggatctg cctggagacg ctcaccccag acacccagta tgagtttcag gtgcgggtca 780
agcctctgca aggcgagttc acgacctgga gcccctggag ccagcccctg gccttcagga 840
caaagcctgc agcccttggg aaggagatcc tccccatgtc atggctcaga taccttctgc 900
tggtccttgg ttgtttttct ggcttcttct cctgcgtcta cattttggtc aagtgccggt 960
accttgggcc atggctgaag acagttctca agtgccacat cccagatcct tctgagttct 1020
tctcccagct gagctcccag catgggggag accttcagaa atggctctcc tcgcctgtcc 1080
ccttgtcctt cttcagcccc agtggccctg cccctgagat ctctccgctg gaagtgctcg 1140
acggagattc caaggccgtg cagctgctcc tgttacagaa ggactctgcc cctttaccct 1200
cgcccagcgg ccactcacag gccagctgct tcaccaacca gggctacttc ttcttccatc 1260
tgcccaatgc cttggagatc gaatcctgcc aggtgtactt cacctatgac ccctgtgtgg 1320
aagaggaggt ggaggaggat gggtcaaggc tgcccgaggg atctccccac ccacctctgc 1380
tgcctctggc tggagaacag gatgactact gtgccttccc gcccagggat gacctgctgc 1440
tcttctcccc gagcctcagc acccccaaca ctgcctatgg gggcagcaga gcccctgaag 1500
aaagatctcc actctccctg catgagggac ttccctccct agcatcccgt gacctgatgg 1560
gcttacagcg ccctctggag cggatgccgg aaggtgatgg agaggggctg tctgccaata 1620
gctctgggga gcaggccagt gtcccagaag gcaaccttca tgggcaagat caggacagag 1680
gccagggccc catcctgacc ctgaacaccg atgcctatct gtctcttcaa gaactacagg 1740
cccaagattc agtccaccta atatagcagg tggccaggac tgggatccag ctgcctggat 1800
caggtcaggc ttgaggaaga ctgcttaaga ggtctcttga ggacagtcca ctgctgagga 1860
ctgtcctggc tatccctgcc ccccccctcc aaacttaatc atccacttct gaactccatt 1920
tgctacttcc tggtctaacc agggtttggt ggagggtggg gagtggggga gcggtggtca 1980
gctccactgc cctatttagt catgaggtca ctagcttcct gtacctgcct ccttccctcc 2040
tgcttgcctt cacagggcag ctagaacttg cttcccccaa tacaaacata accttgctcc 2100
tcatttatcc ctgagcttgc tggggctcct tacttccctc tgccccattt cctgtctcaa 2160
ctcttgccct gccagcacgg ctgtggaaca gctgtcctca ggttgtgatg tggctgtaca 2220
ctgtcttaaa atcagagcag ctttgacaac ccaaacgaag aggtcctgat aagactgaat 2280
gcagcctgtt gactatggag ggtccctcgt agaaggaggg gttgggaagg gtcatcagtc 2340
atcacctgag atcgtagcca ctctcctgca ccccatcctc agctattctg ctcctggagc 2400
atgagttatt ttatgtgttc ttgggcgatg ctggtctatg taaggggtgg gggcgcgggg 2460
ttgattgaag tgagggctcc ttctatgttg ctttggggac cttgtctatt ctggggtggg 2520
tttttctgtg aagcagcttc tttggggtaa cctagccccc ttgtcagtaa gcctaagaga 2580
gtcaaaggac caccgagctg gacttgagtg tacgcctact tttgatgcaa catctgggaa 2640
aagtactttt tttgttaatg tatccttgaa gctaagaaaa gcttacacca caaaaaaaaa 2700
aaaaaaaaa 2709
<210> 38
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Met Ala Thr Ile Ala Leu Pro Trp Ser Leu Ser Leu Tyr Val Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Pro Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Glu Ile
225 230 235 240
Leu Pro Met Ser Trp Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Val Leu Gly Cys Phe
245 250 255
Ser Gly Phe Phe Ser Cys Val Tyr Ile Leu Val Lys Cys Arg Tyr Leu
260 265 270
Gly Pro Trp Leu Lys Thr Val Leu Lys Cys His Ile Pro Asp Pro Ser
275 280 285
Glu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Gln His Gly Gly Asp Leu Gln Lys
290 295 300
Trp Leu Ser Ser Pro Val Pro Leu Ser Phe Phe Ser Pro Ser Gly Pro
305 310 315 320
Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp Gly Asp Ser Lys Ala
325 330 335
Val Gln Leu Leu Leu Leu Gln Lys Asp Ser Ala Pro Leu Pro Ser Pro
340 345 350
Ser Gly His Ser Gln Ala Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe
355 360 365
Phe His Leu Pro Asn Ala Leu Glu Ile Glu Ser Cys Gln Val Tyr Phe
370 375 380
Thr Tyr Asp Pro Cys Val Glu Glu Glu Val Glu Glu Asp Gly Ser Arg
385 390 395 400
Leu Pro Glu Gly Ser Pro His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ala Gly Glu
405 410 415
Gln Asp Asp Tyr Cys Ala Phe Pro Pro Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe
420 425 430
Ser Pro Ser Leu Ser Thr Pro Asn Thr Ala Tyr Gly Gly Ser Arg Ala
435 440 445
Pro Glu Glu Arg Ser Pro Leu Ser Leu His Glu Gly Leu Pro Ser Leu
450 455 460
Ala Ser Arg Asp Leu Met Gly Leu Gln Arg Pro Leu Glu Arg Met Pro
465 470 475 480
Glu Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ser Gly Glu Gln Ala
485 490 495
Ser Val Pro Glu Gly Asn Leu His Gly Gln Asp Gln Asp Arg Gly Gln
500 505 510
Gly Pro Ile Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu
515 520 525
Leu Gln Ala Gln Asp Ser Val His Leu Ile
530 535
<210> 39
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
actcttgtct aaccctcctt agagattccc ccatatgccg aagttcctat tctctagaaa 60
gtataggaac ttc 73
<210> 40
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggtggatc 60
caccacacca gtcatacatc ctgacccttg aggg 94
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgagatgtag cggggaagag tag 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agttcctaca ggcaaactaa ggc 23
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gttgagagac accctacttg gc 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgccattgta ggaagccacc tt 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agctacagac tcatccctgg ac 22
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggcctgatct agccaagtag gg 22
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aatgccatgc acagatcatt gaaa 24
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tccttctcca cttagggttt gc 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
caggaagatg gatacctgcc ct 22
<210> 51
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Met Glu Pro Arg Leu Leu Met Leu Gly Phe Leu Ser Leu Thr Ile Val
1 5 10 15
Pro Ser Cys Arg Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Ser Cys Leu Phe Leu Leu Ile Ser Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln His Arg Trp Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tacaggcaaa ctaaggcaag gc 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aaagctcacc tggaagagtc cc 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acgtggacat atctaaccgg aga 23
<210> 55
<211> 4428
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 55
aagttcctgc tgagcagatc agcctaatgc ttaaatagaa caactcctgg ctgtcattga 60
cattgtctaa aagccaagat gacagactga gaggcctgag cccttgttct ggcattctcc 120
caggaagatg cagtaaaggg gttgacccaa tatactgcag agaatttcat ccagttccct 180
cctccatcct gatcccatgt gccaggaaga tggagccacg cttgctgatg ttggggtttc 240
tctcattaac catagtaccc agttgtcggg cagaactgtg tctgtatgac ccacccgagg 300
tccccaatgc cacattcaaa gccctctcct acaagaacgg caccatccta aactgtgaat 360
gcaagagagg tttccgaaga ctaaaggaat tggtctatat gcgttgctta ggaaactcct 420
ggagcagcaa ctgccagtgc accagcaact cccatgacaa atcgagaaag caagttacag 480
ctcaacttga acaccagaaa gagcaacaaa ccacaacaga catgcagaag ccaacacagt 540
ctatgcacca agagaacctt acaggtcact gcagggagcc acctccttgg aaacatgaag 600
attccaagag aatctatcat ttcgtggaag gacagagtgt tcactacgag tgtattccgg 660
gatacaaggc tctacagaga ggtcctgcta ttagcatctg caagatgaag tgtgggaaaa 720
cggggtggac tcagccccag ctcacatgtg tagatgaaag agaacaccac cgatttctgg 780
ctagtgagga atctcaagga agcagaaatt cttctcccga gagtgagact tcctgcccca 840
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tcctgagcgg gctcacctgg caacacagat ggaggaagag cagaagaacc atctagcaag 1020
ctagaaaagt cagagcccag gcaagcggat gggaatcaca aagctcaagc caaatctgag 1080
acgccaagca ttcacctaac ggctgtttcc ttctgatccc tgggtttcta gaacattctg 1140
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atctaaccac ttcagcacag cagttctaaa gctttaatgg gagagagggc ccaacagtgc 1260
tctgtgtgtt ttgtttttgt gtatatctgt tgatgggagc tgagatggtg tggtcacttt 1320
tcatgtaaca tatagtatag aaaaagtagc tttaggttga cttcattgtt acaacccagt 1380
ttggaaagcc caagtaaaac tcagcactaa tgtaaataat tcctcctcct cctcctctct 1440
cttttcatcc tccgctccat cttcctcttc ttcctcctcc ttttccacct cctctgtccc 1500
tacccacccc cacccatcca ctttccttct tcctttctgc tctcacaagc tcatcctagc 1560
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catcacttac tgatcagcct ttaaaactct gagctggcaa agatgactct atctatgttc 1680
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ctgaaggaag tcccaggacg tggacttaga tgctttccca gcaggccact ctaagcgctg 1920
gtttctttgg gacagctgtc aattgtacgc tcaatttagc ctgcactaat ctgatgctta 1980
caggtgaaca ctcaaggcac aggtatggac ttggtacata ccgtgaaaac actggaaaga 2040
aaagaatact ttcaagttta cagaaggaag gaaggaaaaa ggaagcagag gtggtgatta 2100
tacaaaagat tagctgtaga ctggatatcc caggcatcct cggataatgc ccccgcccca 2160
gcaccctgat ccaggtcacc aaagccttgt gagatcagac tgcagagcca gtctgtctct 2220
gagtcagtaa atgtagaatt tggatttctc acaagttcct ggcggtgtct tttttttttt 2280
taatattttt tattaggtat tttcctcatt tacatttcca atgctatccc aaaagtcccc 2340
cataccctcc cccacactcc cctacccacc cactcccact ttttggccct ggtgttcccc 2400
tgtactgggg catataaagt ttgcaagtcc tggtggtgtc tttatgctga tctctagccc 2460
acactttgtg aggcactggg ctatcccagt gtgctctcct cttccacaga taccaaaagc 2520
acctgggttt gatgctcaga cttctgagca cgttcttgtt caatctcttg cgtaagattt 2580
cctctcagat gagttgagtc agattctcat gtttaacagt gttttagggg attcacagaa 2640
gcccaaacta tcagttttca tttctgaaaa ggctggaaaa ttttatgaaa aactttcaaa 2700
ggtcagacag agccattttg agtcttttat gtgaccaagt atgaaccaga tctttcctat 2760
ctatggtctc ccctttccaa aatatatctt ttgtggggac acggcaagga ggaaagttaa 2820
atagaatctc aagctactaa ttttagaaaa gaaaaaaata ttaaactctt actaaagagc 2880
tgtgggtagt ggtacacacc tgtaagccca gctctcagga gactgaggca ggaggattgc 2940
agtgagtcag agatcagctt cacctacaag caaaaccctg ccttacccct caacctttcc 3000
ataaaaacag tcttacttgt gtaaaattaa tttttaatac atatttgtgc acgatgtgtg 3060
tgcctggtgc ccagggaagc caaaaaaata tgttcaatgt ccctggaata ggtggttatg 3120
agctgccatg gaggtgatgg gatttaaacc cctgttctct gaaaaagcag ctagttctct 3180
taaccactga gccatctcta cagccccatt aaattgaatt ttattgtcat tactcaatat 3240
gggagatggg gtaatgataa caattttttt tttataatac taagatgttt agctatttta 3300
ctctccttca caagtgtaga gtagaatttt ctagaagcta catgcatgat attatcgctc 3360
tggtgttaac acataatgga tttatcttgt taataaaaga attagtaaat aatattttaa 3420
attttttctt tgttttagtt ttaagatgat taatatctat agatactagt gtacattaag 3480
aaagcctttg ggatcctcaa tcattttgca tggttttagt aattttttaa taacataaag 3540
aaggtctgac agattatgct aaagagctat tgtggtatgg attagaaatg gcccccacag 3600
gctcctgtgt tcaaacatca gctagcagtg ctgctttggg ttttggaacc tttaagaggt 3660
ggggccttgc ttaaggagat aggtcactgg aggtgaacca gacttgcttc cagtctccct 3720
ctctgctgtc ccaggaagcc atcatatgag gagtttcaca acatacttct gctgccacag 3780
agtccctcca gtaaggcacg tactggccac tgtgtagtgt accctctaaa actgagctag 3840
agctcccctc tcctccctac actatctctg ttgatgcttt gtcacggtga tgaagaacat 3900
aagtaaggca aagacaagac atagtttgga gactcacgtg agcatctcag ccagactcag 3960
gcacagctgc gatgtgggaa ttatcaagca tgagatgcaa agcaatggaa aatgaatcgt 4020
tatgacagaa gcctacatct agtcttccct tcttcccatt agtaataata gcccgtgttt 4080
tagaagaaca catctttttg gtgttctagg tagcttatat tgcaaatgtg gcacaatcta 4140
agagaaatct gggatgaggg aacctcagtg aaagattctc cttgatcaga ttgtcccact 4200
gatgattgat atgggaaggc ccaacccact gtgaaaggca ccacccattg gcaggatgac 4260
tggggttata gaagcaaaca ggctgagcat gagccagtga gcaagccagt aagcagtggc 4320
ttctctttgg aagaagcatg gctttcttcc gtggcttctg tttgatctct ctcaatgata 4380
gattgtgacc tagaagtata agctaaaata aaccatttct tacccata 4428
<210> 56
<211> 268
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 56
Met Glu Pro Arg Leu Leu Met Leu Gly Phe Leu Ser Leu Thr Ile Val
1 5 10 15
Pro Ser Cys Arg Ala Glu Leu Cys Leu Tyr Asp Pro Pro Glu Val Pro
20 25 30
Asn Ala Thr Phe Lys Ala Leu Ser Tyr Lys Asn Gly Thr Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Leu Lys Glu Leu Val Tyr Met
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Asn Ser Trp Ser Ser Asn Cys Gln Cys Thr Ser Asn
65 70 75 80
Ser His Asp Lys Ser Arg Lys Gln Val Thr Ala Gln Leu Glu His Gln
85 90 95
Lys Glu Gln Gln Thr Thr Thr Asp Met Gln Lys Pro Thr Gln Ser Met
100 105 110
His Gln Glu Asn Leu Thr Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Lys
115 120 125
His Glu Asp Ser Lys Arg Ile Tyr His Phe Val Glu Gly Gln Ser Val
130 135 140
His Tyr Glu Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Ala Leu Gln Arg Gly Pro Ala
145 150 155 160
Ile Ser Ile Cys Lys Met Lys Cys Gly Lys Thr Gly Trp Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Leu Thr Cys Val Asp Glu Arg Glu His His Arg Phe Leu Ala Ser
180 185 190
Glu Glu Ser Gln Gly Ser Arg Asn Ser Ser Pro Glu Ser Glu Thr Ser
195 200 205
Cys Pro Ile Thr Thr Thr Asp Phe Pro Gln Pro Thr Glu Thr Thr Ala
210 215 220
Met Thr Glu Thr Phe Val Leu Thr Met Glu Tyr Lys Val Ala Val Ala
225 230 235 240
Ser Cys Leu Phe Leu Leu Ile Ser Ile Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr
245 250 255
Trp Gln His Arg Trp Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265
<210> 57
<211> 3216
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 57
ggcagtttcc tggctgaaca cgccagccca atacttaaag agagcaactc ctgactccga 60
tagagactgg atggacccac aagggtgaca gcccaggcgg accgatcttc ccatcccaca 120
tcctccggcg cgatgccaaa aagaggctga cggcaactgg gccttctgca gagaaagacc 180
tccgcttcac tgccccggct ggtcccaagg gtcaggaaga tggattcata cctgctgatg 240
tggggactgc tcacgttcat catggtgcct ggctgccagg cagagctctg tgacgatgac 300
ccgccagaga tcccacacgc cacattcaaa gccatggcct acaaggaagg aaccatgttg 360
aactgtgaat gcaagagagg tttccgcaga ataaaaagcg ggtcactcta tatgctctgt 420
acaggaaact ctagccactc gtcctgggac aaccaatgtc aatgcacaag ctctgccact 480
cggaacacaa cgaaacaagt gacacctcaa cctgaagaac agaaagaaag gaaaaccaca 540
gaaatgcaaa gtccaatgca gccagtggac caagcgagcc ttccaggtca ctgcagggaa 600
cctccaccat gggaaaatga agccacagag agaatttatc atttcgtggt ggggcagatg 660
gtttattatc agtgcgtcca gggatacagg gctctacaca gaggtcctgc tgagagcgtc 720
tgcaaaatga cccacgggaa gacaaggtgg acccagcccc agctcatatg cacaggtgaa 780
atggagacca gtcagtttcc aggtgaagag aagcctcagg caagccccga aggccgtcct 840
gagagtgaga cttcctgcct cgtcacaaca acagattttc aaatacagac agaaatggct 900
gcaaccatgg agacgtccat atttacaaca gagtaccagg tagcagtggc cggctgtgtt 960
ttcctgctga tcagcgtcct cctcctgagt gggctcacct ggcagcggag acagaggaag 1020
agtagaagaa caatctagaa aaccaaaaga acaagaattt cttggtaaga agccgggaac 1080
agacaacaga agtcatgaag cccaagtgaa atcaaaggtg ctaaatggtc gcccaggaga 1140
catccgttgt gcttgcctgc gttttggaag ctctgaagtc acatcacagg acacggggca 1200
gtggcaacct tgtctctatg ccagctcagt cccatcagag agcgagcgct acccacttct 1260
aaatagcaat ttcgccgttg aagaggaagg gcaaaaccac tagaactctc catcttattt 1320
tcatgtatat gtgttcatta aagcatgaat ggtatggaac tctctccacc ctatatgtag 1380
tataaagaaa agtaggttta cattcatctc attccaactt cccagttcag gagtcccaag 1440
gaaagcccca gcactaacgt aaatacacaa cacacacact ctaccctata caactggaca 1500
ttgtctgcgt ggttcctttc tcagccgctt ctgactgctg attctcccgt tcacgttgcc 1560
taataaacat ccttcaagaa ctctgggctg ctacccagaa atcattttac ccttggctca 1620
atcctctaag ctaaccccct tctactgagc cttcagtctt gaatttctaa aaaacagagg 1680
ccatggcaga ataatctttg ggtaacttca aaacggggca gccaaaccca tgaggcaatg 1740
tcaggaacag aaggatgaat gaggtcccag gcagagaatc atacttagca aagttttacc 1800
tgtgcgttac taattggcct ctttaagagt tagtttcttt gggattgcta tgaatgatac 1860
cctgaatttg gcctgcacta atttgatgtt tacaggtgga cacacaaggt gcaaatcaat 1920
gcgtacgttt cctgagaagt gtctaaaaac accaaaaagg gatccgtaca ttcaatgttt 1980
atgcaaggaa ggaaagaaag aaggaagtga agagggagaa gggatggagg tcacactggt 2040
agaacgtaac cacggaaaag agcgcatcag gcctggcacg gtggctcagg cctataaccc 2100
cagctcccta ggagaccaag gcgggagcat ctcttgaggc caggagtttg agaccagcct 2160
gggcagcata gcaagacaca tccctacaaa aaattagaaa ttggctggat gtggtggcat 2220
acgcctgtag tcctagccac tcaggaggct gaggcaggag gattgcttga gcccaggagt 2280
tcgaggctgc agtcagtcat gatggcacca ctgcactcca gcctgggcaa cagagcaaga 2340
tcctgtcttt aaggaaaaaa agacaagatg agcataccag cagtccttga acattatcaa 2400
aaagttcagc atattagaat caccgggagg ccttgttaaa agagttcgct gggcccatct 2460
tcagagtctc tgagttgttg gtctggaata gagccaaatg ttttgtgtgt ctaacaattc 2520
ccaggtgctg ttgctgctgc tactattcca ggaacacact ttgagaacca ttgtgttatt 2580
gctctgcacg cccacccact ctcaactccc acgaaaaaaa tcaacttcca gagctaagat 2640
ttcggtggaa gtcctggttc catatctggt gcaagatctc ccctcacgaa tcagttgagt 2700
caacattcta gctcaacaac atcacacgat taacattaac gaaaattatt catttgggaa 2760
actatcagcc agttttcact tctgaagggg caggagagtg ttatgagaaa tcacggcagt 2820
tttcagcagg gtccagattc agattaaata actattttct gtcatttctg tgaccaacca 2880
catacaaaca gactcatctg tgcactctcc ccctccccct tcaggtatat gttttctgag 2940
taaagttgaa aagaatctca gaccagaaaa tatagatata tatttaaatc ttacttgagt 3000
agaactgatt acgacttttg ggtgttgagg ggtctataag atcaaaactt ttccatgata 3060
atactaagat gttatcgacc atttatctgt ccttctctca aaagtgtatg gtggaatttt 3120
ccagaagcta tgtgatacgt gatgatgtca tcactctgct gttaacatat aataaattta 3180
ttgctattgt ttataaaaga ataaatgata tttttt 3216
<210> 58
<211> 272
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 58
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 59
<211> 4440
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aagttcctgc tgagcagatc agcctaatgc ttaaatagaa caactcctgg ctgtcattga 60
cattgtctaa aagccaagat gacagactga gaggcctgag cccttgttct ggcattctcc 120
caggaagatg cagtaaaggg gttgacccaa tatactgcag agaatttcat ccagttccct 180
cctccatcct gatcccatgt gccaggaaga tggagccacg cttgctgatg ttggggtttc 240
tctcattaac catagtaccc agttgtcggg cagaactgtg tgacgatgac ccgccagaga 300
tcccacacgc cacattcaaa gccatggcct acaaggaagg aaccatgttg aactgtgaat 360
gcaagagagg tttccgcaga ataaaaagcg ggtcactcta tatgctctgt acaggaaact 420
ctagccactc gtcctgggac aaccaatgtc aatgcacaag ctctgccact cggaacacaa 480
cgaaacaagt gacacctcaa cctgaagaac agaaagaaag gaaaaccaca gaaatgcaaa 540
gtccaatgca gccagtggac caagcgagcc ttccaggtca ctgcagggaa cctccaccat 600
gggaaaatga agccacagag agaatttatc atttcgtggt ggggcagatg gtttattatc 660
agtgcgtcca gggatacagg gctctacaca gaggtcctgc tgagagcgtc tgcaaaatga 720
cccacgggaa gacaaggtgg acccagcccc agctcatatg cacaggtgaa atggagacca 780
gtcagtttcc aggtgaagag aagcctcagg caagccccga aggccgtcct gagagtgaga 840
cttcctgcct cgtcacaaca acagattttc aaatacagac agaaatggct gcaaccatgg 900
agacgtccat atttacaaca gagtataagg tagcagtggc cagctgcctc ttcctgctca 960
tcagcatcct cctcctgagc gggctcacct ggcaacacag atggaggaag agcagaagaa 1020
ccatctagca agctagaaaa gtcagagccc aggcaagcgg atgggaatca caaagctcaa 1080
gccaaatctg agacgccaag cattcaccta acggctgttt ccttctgatc cctgggtttc 1140
tagaacattc tgaagtcaca ggacataaca gcaactctat cactaaactg gactttgcca 1200
ttgaagaata ggatctaacc acttcagcac agcagttcta aagctttaat gggagagagg 1260
gcccaacagt gctctgtgtg ttttgttttt gtgtatatct gttgatggga gctgagatgg 1320
tgtggtcact tttcatgtaa catatagtat agaaaaagta gctttaggtt gacttcattg 1380
ttacaaccca gtttggaaag cccaagtaaa actcagcact aatgtaaata attcctcctc 1440
ctcctcctct ctcttttcat cctccgctcc atcttcctct tcttcctcct ccttttccac 1500
ctcctctgtc cctacccacc cccacccatc cactttcctt cttcctttct gctctcacaa 1560
gctcatccta gctacacgtg catggctggc tcctttttca acctctgttt gcctaactgg 1620
ctcttctgat ttcatcactt actgatcagc ctttaaaact ctgagctggc aaagatgact 1680
ctatctatgt tcttggctca gtcccagaag gaaaccccct tttcatgaag cttcagtttt 1740
gacatcctga agaacagaaa ctgtggcaga acaatcttca gataacatca aaacaaagtg 1800
gagaagccac gggaactgtg gagctctggt attcagaagc ctgtgtctag ggtctgcgcc 1860
aggagcagaa ggctgaagga agtcccagga cgtggactta gatgctttcc cagcaggcca 1920
ctctaagcgc tggtttcttt gggacagctg tcaattgtac gctcaattta gcctgcacta 1980
atctgatgct tacaggtgaa cactcaaggc acaggtatgg acttggtaca taccgtgaaa 2040
acactggaaa gaaaagaata ctttcaagtt tacagaagga aggaaggaaa aaggaagcag 2100
aggtggtgat tatacaaaag attagctgta gactggatat cccaggcatc ctcggataat 2160
gcccccgccc cagcaccctg atccaggtca ccaaagcctt gtgagatcag actgcagagc 2220
cagtctgtct ctgagtcagt aaatgtagaa tttggatttc tcacaagttc ctggcggtgt 2280
cttttttttt tttaatattt tttattaggt attttcctca tttacatttc caatgctatc 2340
ccaaaagtcc cccataccct cccccacact cccctaccca cccactccca ctttttggcc 2400
ctggtgttcc cctgtactgg ggcatataaa gtttgcaagt cctggtggtg tctttatgct 2460
gatctctagc ccacactttg tgaggcactg ggctatccca gtgtgctctc ctcttccaca 2520
gataccaaaa gcacctgggt ttgatgctca gacttctgag cacgttcttg ttcaatctct 2580
tgcgtaagat ttcctctcag atgagttgag tcagattctc atgtttaaca gtgttttagg 2640
ggattcacag aagcccaaac tatcagtttt catttctgaa aaggctggaa aattttatga 2700
aaaactttca aaggtcagac agagccattt tgagtctttt atgtgaccaa gtatgaacca 2760
gatctttcct atctatggtc tcccctttcc aaaatatatc ttttgtgggg acacggcaag 2820
gaggaaagtt aaatagaatc tcaagctact aattttagaa aagaaaaaaa tattaaactc 2880
ttactaaaga gctgtgggta gtggtacaca cctgtaagcc cagctctcag gagactgagg 2940
caggaggatt gcagtgagtc agagatcagc ttcacctaca agcaaaaccc tgccttaccc 3000
ctcaaccttt ccataaaaac agtcttactt gtgtaaaatt aatttttaat acatatttgt 3060
gcacgatgtg tgtgcctggt gcccagggaa gccaaaaaaa tatgttcaat gtccctggaa 3120
taggtggtta tgagctgcca tggaggtgat gggatttaaa cccctgttct ctgaaaaagc 3180
agctagttct cttaaccact gagccatctc tacagcccca ttaaattgaa ttttattgtc 3240
attactcaat atgggagatg gggtaatgat aacaattttt tttttataat actaagatgt 3300
ttagctattt tactctcctt cacaagtgta gagtagaatt ttctagaagc tacatgcatg 3360
atattatcgc tctggtgtta acacataatg gatttatctt gttaataaaa gaattagtaa 3420
ataatatttt aaattttttc tttgttttag ttttaagatg attaatatct atagatacta 3480
gtgtacatta agaaagcctt tgggatcctc aatcattttg catggtttta gtaatttttt 3540
aataacataa agaaggtctg acagattatg ctaaagagct attgtggtat ggattagaaa 3600
tggcccccac aggctcctgt gttcaaacat cagctagcag tgctgctttg ggttttggaa 3660
cctttaagag gtggggcctt gcttaaggag ataggtcact ggaggtgaac cagacttgct 3720
tccagtctcc ctctctgctg tcccaggaag ccatcatatg aggagtttca caacatactt 3780
ctgctgccac agagtccctc cagtaaggca cgtactggcc actgtgtagt gtaccctcta 3840
aaactgagct agagctcccc tctcctccct acactatctc tgttgatgct ttgtcacggt 3900
gatgaagaac ataagtaagg caaagacaag acatagtttg gagactcacg tgagcatctc 3960
agccagactc aggcacagct gcgatgtggg aattatcaag catgagatgc aaagcaatgg 4020
aaaatgaatc gttatgacag aagcctacat ctagtcttcc cttcttccca ttagtaataa 4080
tagcccgtgt tttagaagaa cacatctttt tggtgttcta ggtagcttat attgcaaatg 4140
tggcacaatc taagagaaat ctgggatgag ggaacctcag tgaaagattc tccttgatca 4200
gattgtccca ctgatgattg atatgggaag gcccaaccca ctgtgaaagg caccacccat 4260
tggcaggatg actggggtta tagaagcaaa caggctgagc atgagccagt gagcaagcca 4320
gtaagcagtg gcttctcttt ggaagaagca tggctttctt ccgtggcttc tgtttgatct 4380
ctctcaatga tagattgtga cctagaagta taagctaaaa taaaccattt cttacccata 4440

Claims (29)

1.一种人源化IL2RB蛋白，其特征在于，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白的全部或部分。
2.根据权利要求1所述的人源化IL2RB蛋白，其特征在于，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含人IL2RB蛋白胞外区的全部或部分，其中，所述的人IL2RB蛋白胞外区的部分包含至少100个氨基酸，
优选的，所述的人源化IL2RB蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)为SEQ ID NO：32的第29-237位氨基酸序列的全部或部分；
B)与SEQ ID NO：32的第29-237位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32的第29-237位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：32的第29-237位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人源化IL2RB蛋白，其特征在于，所述的人源化IL2RB蛋白选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：38氨基酸序列的全部或部分；
b)与SEQ ID NO：38氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：38所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
d)与SEQ ID NO：38所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
e)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的全部或部分；
f)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
h)所述人源化IL2RB蛋白中来源于人IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
i)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的部分；
j)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
k)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
l)所述人源化IL2RB蛋白中来源于非人动物IL2RB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
4.一种人源化IL2RB基因，其特征在于，所述的人源化IL2RB基因编码权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白。
5.根据权利要求4所述的人源化IL2RB基因，其特征在于，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的部分，优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，
优选的，所述的人源化IL2RB基因包含下列组中的一种：
(A)为SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)与SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(C)与SEQ ID NO：35所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
(D)具有SEQ ID NO：35所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的人源化IL2RB基因，其特征在于，所述的人源化IL2RB基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
(i)为SEQ ID NO：37所示核苷酸序列的全部或部分；
(ii)与SEQ ID NO：37所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(iii)与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
(iv)与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
7.一种IL2RB靶向载体，其特征在于，所述的IL2RB靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人IL2RB基因的部分，优选的，所述的供体DNA序列包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分；优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，更进一步优选的，包含与SEQ ID NO：35具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：35所述核苷酸序列一致。
8.根据权利要求7所述的IL2RB靶向载体，其特征在于，所述的IL2RB靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物IL2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：33至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：33所示；和/或，所述的IL2RB靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物IL2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：34至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：34所示。
9.一种IL2RB基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含人IL2RB核苷酸序列的部分导入非人动物IL2RB基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RB蛋白。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL2RB蛋白如权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白。
11.根据权利要求9或10所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL2RB基因，所述的人源化IL2RB基因如权利要求4-6任一所述的人源化IL2RB基因。
12.根据权利要求9-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入的人IL2RB核苷酸序列的部分包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列；更优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分核苷酸序列，其中，2号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：35所示核苷酸序列。
13.根据权利要求9-12任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求7-8任一所述的IL2RB靶向载体进行非人动物的构建。
14.根据权利要求10-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内还表达人或人源化IL2RA蛋白和/或人IL2蛋白。
15.一种人源化IL2基因，其特征在于，所述的人源化IL2基因包含人IL2基因的部分，优选的，所述的人源化IL2基因包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分；优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的人源化IL2基因，其特征在于，所述的人源化IL2基因包含下列任一组：
A：为SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的全部或部分；
B：与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C：与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
D：具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的人源化IL2基因，其特征在于，所述的人源化IL2基因转录的mRNA选自下列组中的一种：
I：为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；
ii：与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
iii：与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
iv：与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
18.一种IL2靶向载体，其特征在于，所述的IL2靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人IL2基因的部分；优选的，包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列；再进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的IL2靶向载体，其特征在于，所述的IL2靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物IL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：5所示；和/或，所述的IL2靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物IL2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：6所示。
20.一种IL2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含人IL2核苷酸序列的部分导入非人动物IL2基因座，所述的非人动物体内表达人IL2蛋白。
21.根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含如权利要求15-17任一所述的人源化IL2基因。
22.根据权利要求20或21所述的构建方法，其特征在于，所述的导入的人IL2核苷酸序列的部分包含人IL2基因的1号至4号外显子的全部或部分；优选的，包含人IL2基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部以及4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列；进一步优选的，包含编码人IL2蛋白的核苷酸序列；更优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。
23.根据权利要求20-22任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求18-19任一所述的IL2靶向载体进行非人动物的构建。
24.根据权利要求20-23任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内还表达人或人源化IL2RA蛋白和/或权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白。
25.一种多基因修饰非人动物的构建方法，其特征在于，所述的多基因修饰包括多基因人源化，所述多基因包括IL2RB基因以及其他基因，优选的，所述的其他基因包括IL2、IL2RA、PD-1、PD-L1中的一种或多种，
所述的构建方法包括将IL2RB基因人源化的非人动物与其他基因人源化的非人动物交配或体外授精；
或者直接对IL2RB基因人源化的非人动物或其他基因人源化的非人动物进行基因编辑获得多基因修饰非人动物。
26.根据权利要求25所述的构建方法，其特征在于，所述的多基因修饰的非人动物包括IL2RB基因和IL2基因修饰的非人动物，IL2RA基因和IL2RB基因修饰的非人动物，IL2RA基因和IL2基因修饰的非人动物，IL2RB和IL2和IL2RA基因修饰的非人动物，PD-1与IL2RB基因修饰的非人动物，PD-1与IL2基因修饰的非人动物，或者IL2、PD-1与IL2RB基因修饰的非人动物。
27.一种IL2RB基因和/或IL2基因人源化的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求4-6任一所述的人源化IL2RB基因和/或权利要求15-17任一所述的人源化IL2基因，所述的细胞、组织或者器官表达权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白和/或人IL2蛋白。
28.来源于权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白、权利要求4-6任一所述的人源化IL2RB基因、权利要求15-17任一所述的人源化IL2基因、权利要求9-14和20-24、25-26任一所述的构建方法获得的非人动物、或权利要求27所述的细胞、组织或器官在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究IL2通路功能、人IL2通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
29.根据权利要求1-3任一所述的人源化IL2RB蛋白、权利要求7-8任一所述的IL2RB靶向载体、权利要求18-19任一所述的IL2靶向载体、权利要求9-14和20-24、25-26任一所述的构建方法获得的非人动物或权利要求27所述的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。
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