CN111057721A

CN111057721A - 人源化IL-4和/或IL-4Rα改造动物模型的制备方法及应用

Info

Publication number: CN111057721A
Application number: CN201910967671.8A
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 郭雅南; 白阳; 黄蕤; 周小飞; 尚诚彰; 张美玲; 姚佳维; 郭朝设
Original assignee: Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd; Beijing Biocytogen Co Ltd
Current assignee: Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd; Beijing Biocytogen Co Ltd
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: WO2020074005A1; CN111057721B; US20210045367A1; US11154041B2; US20220000086A1

Abstract

本发明涉及包含IL‑4和/或IL‑4Rα基因的人源化非人动物的构建方法，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及表达人源化IL‑4和/或IL‑4Rα蛋白的动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化IL-4和/或IL-4Rα改造动物模型的制备方法及应用

技术领域

本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化IL-4和/或IL-4Rα基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility ofgenetically humanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。

人白细胞介素4(IL4，IL-4)，又称BCGF-1、BCGF1、BSF-1、BSF1等，主要由活化的T细胞产生，参与体液免疫和适应性免疫，是诱导初始辅助性T细胞向Th2细胞分化的细胞因子。人IL-4基因定位于5q31.1，由4个外显子和3个内含子组成，约10kb。成熟人IL-4分子由129个氨基酸残基组成，分子量为15kDa，含2个糖基化点。IL-4的所有生物学功能都是通过效应细胞表面的白介素4受体(IL-4R)介导的，IL4R由a和γ亚单元组成，IL-4与IL-4R通过结合IL-4Rα链进行信号传导(Kruse,Susanne,et al.International Immunology11.12(1999):1965-1970.)。人IL-4Rα定位于16p12.1区域，该区域基因及其多态性与哮喘、过敏性皮炎相关。

在机体免疫反应中，IL-4/IL-4R是重要促炎症因子，可通过调节T细胞分化，抑制B淋巴细胞凋亡，参与多种生物学过程，包括控制B淋巴细胞从分泌IgM转向分泌IgE、与Th2细胞因子共同参与过敏性哮喘患者的气道炎症发生、与IL-13共同参与慢性利什曼血吸虫感染、M2巨噬细胞极化等。此外IL-4/IL-4R还可能参与了肝细胞肝癌、乳腺癌和糖尿病等疾病发生过程。

目前针对IL-4/IL-4R开发的抗体药在临床上的适应症主要为过敏、特应性皮炎、哮喘和癌症等，一些生物制药大公司已经对IL-4/IL-4R抗体进行研发，包括安进、阿斯利康、史克必成、赛诺菲和再生元等。其中再生元和赛诺菲研发的单克隆抗体Dupixent(dupilumab、IL-4R)已经分别于2017年4月19日和2017年9月27日获FDA和EMA的批准。

由于人IL-4蛋白和IL-4R蛋白序列与啮齿类，如小鼠IL-4蛋白和IL-4Rα蛋白序列的一致性分别为53％和41％，存在显著差异。所以，一般情况下识别人IL-4或IL-4R蛋白的抗体，无法识别小鼠IL-4或IL-4R，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL-4或IL-4R药物的药效。鉴于IL-4/IL-4R在疾病发生过程中的广泛参与性和巨大的应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发涉及IL-4和/或IL-4R的非人动物模型。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，涉及了一种包含IL-4Rα基因的人源化非人动物的构建方法，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人源化非人动物体内可表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人或人源化IL-4Rα蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6或外显子7中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4至外显子7的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列、外显子5的全部序列、外显子6的全部序列和外显子7的全部或部分序列。

优选的，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控。进一步优选的，所述的内源性调控元件包括启动子。

优选的，所述的人源化IL-4Rα蛋白包括胞外区、跨膜区及胞内参与信号传导的区域，其中，所述的胞外区包括人IL-4Rα蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区及胞内参与信号传导的区域来源于非人动物IL-4Rα蛋白。

进一步优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人IL-4Rα胞外区序列相同，优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：42第30-216位所示氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的胞外区序列连续5-187个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。进一步优选的，所述的胞外区序列连续10-100个氨基酸与人TNFR2胞外区序列一致。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括内源IL-4Rα基因的外显子1的全部序列、外显子2的全部序列、外显子3的全部序列、外显子4的部分序列、外显子7的部分序列及其后所有外显子的全部序列。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中的IL-4Rα基因是纯合的或杂合的。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物表达由内源IL-4基因编码的内源IL-4蛋白。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因，该人源化非人动物表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列；优选的，所述的人IL-4基因通过内源性调控元件调控或所述的人IL-4基因通过人源的调控元件调控。

进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少8.5kb。

进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少10.0kb。

本发明使用基因编辑技术进行人源化非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。

在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠IL-4Rα的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：39中的全部或部分片段所示，所述小鼠IL-4Rα的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：40中的全部或部分片段所示。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述人IL-4Rα的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：41中的全部或部分片段所示，所述人IL-4Rα的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：42中的全部或部分片段所示。

本发明所述的构建方法，包括将编码胞外区全部或部分的内源IL-4Rα基因替换为人的编码胞外区全部或部分的人IL-4Rα基因。

优选的，使用sgRNA靶向技术实现将内源IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列替换为人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列；更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：65-71任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：72-79任一项所示；进一步优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：78。

优选的，利用胚胎干细胞的基因打靶技术，使用靶向载体将内源IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列替换为人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列；所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。

本发明所述的人源化IL-4Rα蛋白为嵌合IL-4Rα蛋白，所述的嵌合IL-4Rα蛋白选自下列组中的一种：

a)嵌合IL-4Rα蛋白序列为SEQ ID NO：44所述氨基酸序列的部分或全部；

b)嵌合IL-4Rα蛋白序列与SEQ ID NO：44所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)编码嵌合IL-4Rα蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：44所示蛋白的核苷酸序列杂交；

d)嵌合IL-4Rα蛋白序列与SEQ ID NO：44所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

e)嵌合IL-4Rα蛋白序列具有SEQ ID NO：44所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4Rα基因，所述的嵌合IL-4Rα基因编码上述的嵌合IL-4Rα蛋白，或所述的嵌合IL-4Rα基因选自下列组中的一种：

a)嵌合IL-4Rα基因的mRNA序列为SEQ ID NO：43所示的序列的部分或全部；

b)嵌合IL-4Rα基因序列与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)嵌合IL-4Rα基因的序列在严格条件下，与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列杂交；

d)嵌合IL-4Rα基因的序列与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

e)嵌合IL-4Rα基因序列具有SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

f)嵌合IL-4Rα基因中来源于人IL-4Rα基因的部分为SEQ ID NO：47所示的序列的部分或全部；

g)嵌合IL-4Rα基因中来源于人IL-4Rα基因的部分为与SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

h)嵌合IL-4Rα基因中来源于人IL-4Rα基因的部分在严格条件下，与SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列杂交；

i)嵌合IL-4Rα基因中来源于人IL-4Rα基因的部分为与SEQ ID NO：47所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

j)嵌合IL-4Rα基因中来源于人IL-4Rα基因的部分为具有SEQ ID NO：47所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

k)嵌合IL-4Rα基因中含有SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：49所示序列的全部或部分；

l)嵌合IL-4Rα基因中含有与SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

m)嵌合IL-4Rα基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列杂交；

n)嵌合IL-4Rα基因中含有与SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：49所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

o)嵌合IL-4Rα基因中含有具有SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：49所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4基因，所述的嵌合IL-4基因编码人IL-4蛋白，所述的嵌合IL-4基因选自下列组中的一种：

a)嵌合IL-4基因的mRNA序列为SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的序列的部分或全部；

b)嵌合IL-4基因的mRNA序列与SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)嵌合IL-4基因的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交；

d)嵌合IL-4基因的mRNA序列与SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

e)嵌合IL-4基因的mRNA序列具有SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

f)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示的序列的部分或全部；

g)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分为与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

h)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分在严格条件下，与SEQ ID NO：7或SEQID NO：22所示的核苷酸序列杂交；

i)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分为与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

j)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分为具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或

k)嵌合IL-4基因中含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQ ID NO：9所示序列的全部或部分；

l)嵌合IL-4基因中含有与ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

m)嵌合IL-4基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQID NO：9所示的核苷酸序列杂交；

n)嵌合IL-4基因中含有与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQ ID NO：9所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

o)嵌合IL-4基因中含有具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明的第二方面，涉及采用上述包含IL-4Rα基因的人源化非人动物的构建方法构建的IL-4Rα基因的人源化非人动物或其后代。

本发明的第三方面，涉及一种IL-4Rα基因敲除非人动物的方法，具体为将非人动物IL-4Rα基因的外显子4至外显子7全部或部分敲除，使得内源IL-4Rα蛋白失活。

优选的，使用sgRNA序列靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：65-71任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：72-78任一项所示；进一步优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：78。

本发明的第四方面，涉及一种包含IL-4Rα基因的人源化非人动物，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控；该人源化非人动物体内可表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化IL-4Rα蛋白的组成胞外区、跨膜区及胞内参与信号传导的区域，其中，所述的胞外区为人IL-4Rα蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区及胞内参与信号传导的区域为非人动物IL-4Rα蛋白的跨膜区及胞内参与信号传导的区域。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，所述的人IL-4基因长度至少8.5kb，所述的人IL-4基因通过内源性调控元件调控或人源调控元件调控。

本发明所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。所述的人源化IL-4Rα蛋白为嵌合IL-4Rα蛋白，所述的嵌合IL-4Rα蛋白选自下列组中的一种：

优选的，所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4Rα基因，所述的嵌合IL-4Rα基因编码上述的嵌合IL-4Rα蛋白，或所述的嵌合IL-4Rα基因选自下列组中的一种：

或

本发明的第五方面，涉及一种包含IL-4基因的人源化非人动物的构建方法，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人或人源化IL-4蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少8.5kb。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少10.0kb。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中的IL-4基因是纯合的或杂合的。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人IL-4基因通过人源调控元件调控。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的人IL-4基因通过内源性调控元件调控。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物表达由内源IL-4Rα基因编码的内源IL-4Rα蛋白。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因，该人源化非人动物表达人或人源化IL-4Rα蛋白，所述的人或人源化IL-4Rα蛋白结合靶向人特定抗原的抗体，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控。进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列、外显子5的全部序列、外显子6的全部序列和外显子7的全部或部分序列。

本发明所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。

在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠IL-4的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：1中的全部或部分片段所示，所述小鼠IL-4的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：2中的全部或部分片段所示。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述人IL-4的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：3中的全部或部分片段所示，所述人IL-4的蛋白序列的全部或部分片段如SEQID NO：4中的全部或部分片段所示。

本发明所述的构建方法，用人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列替换非人动物的相应区域。

在本发明的一个具体实施方式中，利用胚胎干细胞的基因打靶技术，使用靶向载体将内源IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列替换为人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，其中所述的人IL-4基因长度至少为8.5kb；优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53622826-53618607位核苷酸，所述的3’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53612065-53607981位核苷酸。

在本发明的另一个具体实施方式中，利用胚胎干细胞的基因打靶技术，使用靶向载体将内源IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列替换为人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，其中所述的人IL-4基因长度至少为10.0kb；优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53625623-53620071位核苷酸，所述的3’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53612200-53607005位核苷酸。

优选的，所述的包含IL-4基因的人源化非人动物的基因组中包括嵌合IL-4基因，所述的嵌合IL-4基因编码人IL-4蛋白。

优选的，所述的包含IL-4基因的人源化非人动物的基因组中包括嵌合IL-4Rα基因。

本发明的第六方面，涉及采用上述包含IL-4基因的人源化非人动物的构建方法构建的IL-4基因的人源化非人动物或其后代。

本发明的第七方面，涉及一种包含IL-4基因的人源化非人动物，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，所述的人IL-4基因长度至少8.5kb；该人源化非人动物体内可表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少10.0kb。

本发明的一个具体实施方式中，所述的人IL-4基因通过人源调控元件调控。

本发明的另一个具体实施方式中，所述的人IL-4基因通过内源性调控元件调控。

本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物表达由内源IL-4Rα基因编码的内源IL-4Rα蛋白。

本发明的另一个具体实施方式中，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因，该人源化非人动物表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控。进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列、外显子5的全部序列、外显子6的全部序列和外显子7的全部或部分序列。

本发明的第八方面，涉及一种IL-4Rα基因的靶向载体，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。

优选的，所述的待改变的转换区位于IL-4Rα基因的外显子4至外显子7。

优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：45所示；或者，所述3’臂序列如SEQ ID NO：46所示。

优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：47所示。

本发明所述的IL-4基因或Il-4Rα基因的靶向载体还包括可选择的基因标记。

优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第九方面，涉及一种特异的靶向IL-4Rα基因的sgRNA序列，所述的sgRNA序列在非人动物IL-4Rα基因的靶位点位于非人动物IL-4Rα基因的外显子4或外显子7上；所述的sgRNA序列的靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：65-71任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：72-79任一项所示；优选的，sgRNA序列的靶向的5’端靶位点序列为SEQ IDNO：65，sgRNA序列的靶向的3’端靶位点序列为SEQ ID NO：78。

本发明的第十方面，涉及一种编码上述所述的sgRNA序列的DNA分子。

本发明的第十一方面，涉及一种构建人源化非人动物的载体，所述的载体产生上述的sgRNA序列，用于敲除或替换IL-4Rα基因的外显子4至外显子7的部分或全部。

本发明的第十二方面，涉及所述构建人源化非人动物的载体的制备方法，包括如下步骤：

1)将序列如SEQ ID NO：65-71所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：72-79所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体；

3)分别合成步骤1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2)所述的pT7-sgRNAG2载体的双链；

4)将步骤3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNAG2载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

本发明的第十三方面，涉及一种IL-4Rα基因敲除非人动物的制备方法，包括如下步骤：

a)按照上述制备sgRNA载体的方法步骤1)-4)，获得sgRNA载体；

b)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；

c)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的IL-4Rα基因被敲除，获得IL-4Rα基因敲除阳性小鼠；

d)将步骤c)筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的IL-4Rα基因敲除小鼠。

本发明的第十四方面，涉及一种IL-4Rα基因人源化非人动物的制备方法，包括如下步骤：

第一步：按照上述制备sgRNA载体的步骤1)-4)，获得sgRNA载体；

第二步：将sgRNA载体的体外转录产物、上述的IL-4Rα基因的靶向载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至雌性动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体动物的输卵管中发育，得到F0代动物；

第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的IL-4Rα基因人源化非人动物。

本发明的第十五方面，涉及一种IL-4基因人源化非人动物的制备方法，包括如下步骤：

第一步：按照上述制备sgRNA载体的步骤1)-4)，获得sgRNA载体；

第二步：将上述的IL-4基因的靶向载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至雌性动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体动物的输卵管中发育，得到F0代动物；

本发明的第十六方面，涉及一种上述的靶向IL-4Rα的靶向载体、上述的sgRNA序列或上述的载体在敲除或替换IL-4Rα基因的外显子4至外显子7的部分或全部的应用。

本发明的第十七方面，涉及一种IL-4基因的靶向载体，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸。

优选的，所述的待改变的转换区位于IL-4基因的包含外显子1至外显子4的至少8.5kb或至少10kb的区域。

优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：5所示；或者，所述3’臂序列如SEQ ID NO：6所示。进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：20所示；或者，所述3’臂序列如SEQ ID NO：21所示。进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：22所示。

本发明的第十八方面，涉及一种上述的靶向IL-4的靶向载体在敲除或替换IL-4基因的外显子1至外显子4的部分或全部中的应用。

本发明的第十九方面，涉及一种包含IL-4Rα基因的人源化细胞株，所述的人源化细胞株的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控；该人源化细胞株表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

本发明的第二十方面，涉及一种IL-4Rα基因缺失的细胞株，使用上述特异的靶向IL-4Rα基因的sgRNA序列或上述的DNA分子敲除外显子4至外显子7的部分或全部序列制备获得。

本发明的第二十一方面，涉及一种包含IL-4基因的人源化细胞株，所述的人源化细胞株的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列；该人源化细胞株表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人IL-4基因长度至少8.5kb。

优选的，所述的人IL-4基因长度至少10.0kb。

本发明所述的人源化细胞株或基因缺失的细胞株均不是动物品种，所述的人源化细胞株或基因缺失的细胞株不会发育为个体。

本发明的第二十二方面，涉及一种包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物，所述的非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控，该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失；和，所述的非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，所述的人IL-4基因长度至少8.5kb；该人源化非人动物体内可表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

本发明的第二十三方面，涉及一种包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物的制备方法，所述的方法包括将上述构建方法构建的IL-4Rα基因人源化的非人动物与上述构建方法构建的IL-4基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物。

本发明的第二十四方面，涉及一种制备多基因人源化非人动物的方法，包括如下步骤：

(a)采用上述的构建方法构建人源化非人动物或上述的制备方法制备包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物；

(b)将步骤(a)制备获得的非人动物与其他人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。

优选的，所述多基因人源化非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的其他人源化动物选自基因PD-1(201710505554.0，PCT/CN2017/090320)、PD-L1(201710757022.6，PCT/CN2017/099574)、CTLA-4(201710757917.X，PCT/CN2017/099577)、LAG-3(201711103245.7，PCT/CN2017/110435)、BTLA(201710948551.4，PCT/CN2017/106024)、CD27(201711402264.X，PCT/CN2017/117984)、CD28(201710465217.3)、CD47(201810295709.7，PCT/CN2018/081628)、CD137(201711473251.1，PCT/CN2017/120388)、CD154(201710464564.4，201710872886.2)、OX40(201710757005.2，PCT/CN2017/099575)、SIRPα(201810296193.8，PCT/CN2018/081629)、TIGIT(201710757916.5，PCT/CN2017/099576)、TIM-3(201711103773.2，PCT/CN2017/110494)、CD40(201710464564.4，201710872886.2)或GITR(201710465493.X，201710872122.3)人源化动物中的一种或两种以上的组合。

本发明的第二十五方面，涉及一种上述的方法制备获得的多基因人源化非人动物或其后代。

本发明的第二十六方面，涉及一种荷瘤动物模型的制备方法，所述荷瘤动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建人源化非人动物、上述的方法制备IL-4Rα基因敲除非人动物、上述的制备方法制备包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物或者上述的方法制备多基因人源化非人动物的步骤。

优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第二十七方面，涉及一种免疫系统疾病的动物模型的制备方法，所述的免疫系统疾病的动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建人源化非人动物、上述的方法制备IL-4Rα基因敲除非人动物、上述的制备方法制备包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物或者上述的方法制备多基因人源化非人动物的步骤。

本发明所述的免疫系统疾病包括但不限于炎症、自身免疫疾病或者过敏。优选的，所述的免疫系统疾病包括但不限于哮喘、皮炎、特异性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、气道炎症、炎性肠病、多发性硬化、关节炎、过敏性鼻炎或者嗜酸细胞性食管炎。

进一步优选的，所述免疫系统疾病的动物模型为哮喘动物模型。

优选的，所述的免疫系统疾病的动物模型的制备方法还包括致敏和/或雾化激发的步骤。

本发明的第二十八方面，涉及一种非人动物在制备荷瘤或者免疫系统疾病的动物模型中的应用，所述非人动物选自上述的构建方法构建的人源化非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物或者上述的方法制备的多基因人源化非人动物。

本发明的第二十九方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述构建方法构建的人源化非人动物、上述方法制备的IL-4Rα基因敲除非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、上述方法制备的多基因人源化非人动物或其后代或上述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。

本发明的第三十方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述构建方法构建的人源化非人动物、上述方法制备的IL-4Rα基因敲除非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、上述方法制备的多基因人源化非人动物或其后代或上述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。

本发明的第三十一方面，涉及一种嵌合IL-4Rα蛋白，所述嵌合IL-4Rα蛋白包括胞外区、跨膜区及胞内参与信号传导的区域，其中，所述的胞外区包括人IL-4Rα蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区及胞内参与信号传导的区域来源于非人动物IL-4Rα蛋白。

优选的，所述的嵌合IL-4Rα蛋白选自下列组中的一种：

本发明的第三十二方面，涉及一种编码上述的嵌合IL-4Rα蛋白的嵌合IL-4Rα基因，所述的嵌合IL-4Rα基因选自下列组中的一种：

或

本发明的第三十三方面，涉及一种编码人IL-4蛋白的嵌合IL-4基因，所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4基因，所述的嵌合IL-4基因编码人IL-4蛋白，所述的嵌合IL-4基因选自下列组中的一种：

b)嵌合IL-4基因序列的mRNA与SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

或

本发明的第三十四方面，涉及一种表达上述的嵌合IL-4Rα蛋白的构建体。

本发明的第三十五方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第三十六方面，涉及一种包含上述细胞的组织。

本发明的第三十七方面，涉及来源于上述构建方法构建的人源化非人动物、上述方法制备的IL-4Rα基因敲除非人动物、上述制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、上述方法制备的多基因人源化非人动物或上述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。

或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。

或在筛选、验证、评价或研究IL-4和/或IL-4R基因功能、针对IL-4和/或IL-4R靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗免疫系统疾病的药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。

基于上述的技术方案，本申请产生了良好的技术效果，包括：采用本发明制备的人源化动物体内正常表达人或人源化IL-4蛋白和/或人或人源化IL-4Rα蛋白，并且该人或人源化蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。本发明制备的人源化动物可以模拟疾病模型，在临床前研究中用于筛选、评估抗人IL4/IL4Ra抗体的体内药效，并可用于表征抗人IL4和/或IL4Ra抗体特性。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

参考书籍:格林等.分子克隆实验指南:第4版.科学出版社,2013，《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)。

本发明计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该动物体内包含编码人IL-4和/或IL-4Rα蛋白的基因序列，以使其体内表达人或人源化IL-4和/或IL-4Rα蛋白。可通过各种基因编辑系统和制备方法得到表达人IL-4和/或IL-4Rα蛋白的非人哺乳动物，包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因打靶技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)技术或其他分子生物学技术。本发明实施例主要以ES细胞的基因同源重组技术为例，阐述如何通过构建特异靶向小鼠IL-4或IL-4Rα基因靶向载体实现序列替换得到所述人源化小鼠。鉴于人或小鼠IL-4和/或IL-4Rα具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.in chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠和人IL-4基因对比示意图(非按比例)；

图2：人源化小鼠IL-4基因示意图(非按比例)；

图3：人源化小鼠IL-4基因示意图(非按比例)；

图4：IL-4人源化小鼠(短片段替换)打靶策略示意图(非按比例)；

图5：(A)重组载体酶切结果图，图中1、2、3分别指3个载体质粒，ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；(B)Marker分子量说明；

图6：细胞PCR鉴定结果，其中，+为阳性对照，WT为野生型对照，M为Marker，H₂O为对照；图中标记克隆号的泳道的鉴定结果为阳性，其余未标明克隆号的泳道对应的细胞为阴性；

图7：细胞Southern blot结果，其中WT为野生型；

图8：IL-4人源化小鼠(长片段替换)打靶策略示意图(非按比例)；

图9：(A)重组载体酶切结果图，其中ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker，左边三个泳道为1个质粒分别经过BamHI、EcoRI或ScaI 3组酶处理；(B)Marker分子量说明；

图10：细胞PCR鉴定结果，其中，M为Marker，+为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为对照，图中标记克隆号1-G9的泳道的鉴定结果为阳性，其余未标明克隆号的泳道对应的细胞为阴性；

图11：细胞Southern blot结果，其中WT为野生型；

图12：FRT重组过程示意图(非按比例)；

图13：F1代(短片段替换)鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F和WT-R用于扩增野生型小鼠IL-4基因4号外显子片段；图(B)使用引物对Mut-F和WT-R用于扩增改造后的小鼠IL-4基因4号外显子片段，用以验证重组载体是否存在并正确插入基因组位点；图(C)使用引物对Frt-F和Frt-R用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；图(D)使用引物对Flp-F和Flp-R用以确认Flp片段的存在；其中，M为Marker，WT为野生型，H₂O为对照，+为阳性对照；

图14：IL-4人源化小鼠ELISA检测结果，选择野生型C57BL/6小鼠和两种IL-4人源化杂合子各1只，其中，+/+代表野生型C57BL/6小鼠；B-hIL4(V1)H/+代表短片段替换得到的IL-4人源化小鼠杂合子，B-hIL4(V2)H/+代表长片段替换得到的IL-4人源化小鼠杂合子，其中图(A)为鼠IL-4蛋白的检测结果，图(B)为人IL-4蛋白的检测结果；

图15：小鼠和人IL-4Rα基因对比示意图(非按比例)；

图16：人源化小鼠IL-4Rα基因示意图(非按比例)；

图17：IL-4Rα人源化小鼠打靶策略示意图(非按比例)；

图18：(A)重组载体酶切结果图，图中1、2、3、4分别指4个载体质粒，ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；(B)Marker分子量说明；

图19：细胞PCR鉴定结果，其中，+为阳性对照，WT为野生型对照，M为Marker，H₂O为水对照；图(A)使用引物对F1/R1引物检测结果，(B)使用引物对F2/R2引物检测结果；

图20：细胞Southern blot结果，其中WT为野生型；

图21：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F2和WT-R2用于扩增野生型小鼠IL-4Rα基因7号外显子片段；图(B)使用引物对Mut-F2和WT-R2用于扩增改造后的小鼠IL-4Rα基因7号外显子片段，用以验证重组载体是否存在并正确插入基因组位点；其中，WT为野生型，+为阳性对照，H₂O为水对照，M为Marker；

图22：IL-4Rα小鼠人源化F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；图(B)使用引物对Frt-F2和Frt-R2用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，H₂O为水对照；

图23：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠(图A、B、D、E)和IL-4Rα基因人源化杂合子小鼠(图C、F)，将图B、C、E、F用抗鼠CD3抗体刺激，再用抗鼠IL-4Rα抗体mIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19FITC(图A、B、C)或抗人IL-4Rα抗体hIL4RA APC和抗鼠CD19抗体mCD19FITC(图D、E、F)进行细胞标记；

图24：sgRNA的活性检测结果，其中Con.为阴性对照，PC为阳性对照；(A)为sgRNA1-sgRNA7活性检测结果；(B)为sgRNA8-sgRNA15活性检测结果；

图25：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子ELISA检测结果，选择野生型C57BL/6小鼠和双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子(B-hIL4/IL4R mice)各3只，其中图A为未经刺激的小鼠血清中鼠IL-4蛋白的检测结果，图B为未经刺激的小鼠血清中人IL-4蛋白的检测结果，图C为经刺激的小鼠血清中鼠IL-4蛋白的检测结果，图D为经刺激的小鼠血清中人IL-4蛋白的检测结果；

图26：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠(图A、E、C、G)和双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子(图B、F、D、H)各3只，将图C、D、G、H用抗鼠CD3抗体刺激，再用抗鼠IL-4Rα抗体mIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19APC-Cy7或抗人IL-4Rα抗体hIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19 APC-Cy7进行细胞标记；

图27：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠流式分析结果，其中，与对照组相比(图A、B)，抗人IL-4RA抗体Dupilumab能很好的结合双重人源化纯合子体内表达的IL-4Rα(图C)；

图28：LPS诱导脾淋巴细胞增殖试验结果，其中，G1只用LPS诱导，G2使用LPS和mIL4，G3使用LPS和hIL4，结果可见，双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠体内的IgE水平与野生型C57BL/6小鼠相当，且野生型小鼠的淋巴细胞只能被mIL4诱导产生IgE，双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的淋巴细胞只能被hIL4诱导的IgE；

图29：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的淋巴细胞中hIL4诱导的IgE产生可被抗人IL-4RA抗体Dupilumab阻断；

图30：单基因或双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导哮喘模型的实验方案；

图31：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的血清IgE检测结果，其中，OVA诱导组小鼠体内血清IgE水平明显高于PBS对照组；

图32：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的肺组织切片染色结果，其中，OVA诱导组小鼠相比PBS对照组深染区免疫更大，反映其炎症细胞浸润程度更高，呈现明显的哮喘病理学特征；

图33a：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性粒细胞(Eos)数量；其中OVA诱导后Eos高于PBS对照组，纵坐标为Eos细胞总数；

图33b：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)分析结果，其中，图A为嗜酸性粒细胞占mCD45+细胞的百分比(Eos％)，图B为中性粒细胞(Neutrophils，Neu)占mCD45+细胞的百分比(Neu％)，结果表明OVA诱导组小鼠相比PBS对照组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显增多，呈现过敏表型；

图34：在双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型中评估抗人IL-4RA抗体Dupilumab治疗功效的实验方案，其中，G3、G4分别为表2中G3组合G4组的给药方案，其中Ip代表腹腔注射，Q3D代表每3天一次，QD代表每1天一次，x2：共2次；

图35A：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+)的数量；其中OVA诱导组(G2)中略高于对照组(G1)和给药组(G3、G4)，纵坐标为mCD45+细胞总数；

图35B：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(Eos)的数量；其中OVA诱导组(G2)的数量最多，给药组(G3、G4)中略高于对照组(G1)，纵坐标为Eos细胞总数；

图35C：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞占白细胞的百分比(Eos％)结果；其中对照组(G2)OVA诱导组的比例最高，给药组(G3)最低，给药组(G4)略低于对照组(G1)组；

图36：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的血清IgE检测结果，其中，只能在OVA诱导组(G2)组中检测到较高的血清IgE水平；

图37：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的气道组织切片染色结果，其中，对照组(G1)小鼠的气道未显示炎症，而OVA诱导组(G2)小鼠的支气管周围和血管周围炎症显著增多，且粘液分泌水平增加，给药组(G3、G4)小鼠与G2组相比均可观察到炎性浸润和粘液分泌减少；

图38：在双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型中评估抗人IL-4RA抗体Dupilumab治疗功效的实验方案；

图39A：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+)的数量；其中OVA诱导组(G2、G4)的数量明显高于对照组(G1)和给药组(G3)；

图39B：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(Eosinophils)的数量；其中OVA诱导组(G2、G4)的数量明显高于对照组(G1)和给药组(G3)；

图39C：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞(Neu)的数量；其中OVA诱导组(G2、G4)的数量明显高于对照组(G1)和给药组(G3)；

图40：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的血清IgE检测结果，其中OVA诱导组(G2、G4)的数量明显高于对照组(G1)和给药组(G3)；

图41：双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的气道组织切片染色结果，其中，对照组(G1)小鼠的气道未显示炎症，而OVA诱导组G2和G4小鼠的支气管周围和血管周围炎症显著增多，且粘液分泌水平增加，给药组(G3)小鼠与OVA诱导组相比可观察到炎性浸润和粘液分泌减少；

图42A：双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+)的数量；其中同型对照组(G2)的数量高于给药组(G3)，且均明显高于对照组(G1)；

图42B：双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(Eos)的数量；其中同型对照组(G2)的数量高于给药组(G3)，且均明显高于对照组(G1)；

图43A：双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的血清IgE检测结果，其中同型对照组(G2)的数量明显高于给药组(G3)和对照组(G1)；

图43B：双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠经卵白蛋白联合氢氧化铝诱导的哮喘模型和对照组的支气管肺泡灌洗液(BALF)中IgE检测结果，其中同型对照组(G2)的数量明显高于给药组(G3)和对照组(G1)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

鉴于人IL-4、IL-4R或小鼠IL-4、IL-4Rα具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；

鼠IL-4ELISA试剂盒来源RayBiotech,Inc，货号ELM-IL4-1；

人IL-4ELISA试剂盒来源RayBiotech,Inc，货号ELH-IL4-5；

BamHI、HindIII、XhoI、EcoRI、EcoRV、NotI、NdeI、SacI、BglII、AseI、MfeI、SmaI酶购自NEB，货号分别为：R3136M、R3104M、R0146S、R3101M、R0195S、R3189M、R3193M、R3156M、R0144M、R0526M、R3589S、R0141S；

含有鼠IL-4、IL-4R基因的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)、含有人IL-4、IL-4R基因的BAC菌均订购自invitrogen，货号分别为：RPCI23.C、RPCI11.C；

Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e(mCD3)购自BD公司，货号为553057；

FITC anti-mouse CD19Antibody(mCD19FITC)购自Biolegend，货号为115506；

APC anti-human CD124(IL-4Rα)Antibody(hIL4RA APC)Biolegend，货号为355006；

PE anti-mouse CD124(IL-4Rα)Antibody(mIL4RA PE)购自Biolegend，货号为144804；

APC/Cy7anti-mouse CD19Antibody(mCD19 APC-Cy7)购自Biolegend，货号为115530；

PE anti-human CD124(IL-4Rα)Antibody(hIL4RA PE)购自Biolegend，货号为355003；

Alexa

647AffiniPure F(ab')₂Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific(anti-hIgG-AF647)购自Jackson ImmunoResearch Inc.，货号为109-606-170；

In vivo Grade Human IgG4kappa Isotype Control–CrownVivo^TMAntibody(anti-IgG4-kappa hIgG-APC)购自中美冠科生物技术有限公司，货号为C0004。

实施例1 IL-4基因人源化小鼠

小鼠IL-4基因(Gene ID：16189)(NCBI Gene ID：16189，Primary source：MGI：96556，UniProt ID：P07750，基于转录本NM_021283.2(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_067258.1(SEQ ID NO：2))和人IL-4基因(NCBI Gene ID：3565，Primary source：HGNC：6014，UniProt ID：P05112，基于转录本NM_000589.3(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_000580.1(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在内源小鼠IL-4基因座引入编码人IL-4蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人IL-4蛋白。用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在内源小鼠IL-4基因座上用某些人IL-4基因序列替换特定小鼠IL-4基因序列，在小鼠或人IL-4调节元件的控制下，如将至少包含小鼠ATG至TGA的～8.5kb序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL-4基因座，实现对小鼠IL-4基因不同程度的人源化改造(得到的人源化小鼠中嵌合IL-4基因的mRNA序列如SEQ ID NO：80所示)。其中一种人源化策略得到的人源化IL-4基因座示意图如图2所示，另一种IL-4小鼠人源化策略是在IL-4基因座附近进行更大范围的序列替换，得到的小鼠人源化IL-4基因座示意图如图3所示。

分别用细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)RP23-464K4和RP11-17K19获得小鼠和人IL-4DNA。如图4所示的打靶策略示意图中，显示了重组载体上含有小鼠IL-4上游和下游的同源臂序列(内源IL-4基因ATG上游4220bp和TGA下游4085bp的小鼠DNA)，以及8537bp人IL-4序列(从外显子1中的ATG延伸至外显子4中的终止密码子TGA)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000077.6的第53622826-53618607位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000077.6的第53612065-53607981位核苷酸序列相同；人IL-4的DNA片段序列(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000005.10的第132674051-132682587位核苷酸序列相同。其中，含有人IL-4基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为在5’-ACTTTAACTCTATATATAGAGAGACCTCTGCCAGCATTGCATTGTTAGCATCTCTTGATAAACTTAATTGTCTCTCGTCACTGACGGCACAGAGCTATTGATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGA-3’(SEQ ID NO：8)内，其中序列“TATTG”的“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“ATGGG”的“A”是人序列的第一个核苷酸。含有人IL-4基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为在5’-TGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAATATTCAAAGTGTTCGAGCTGATACTGAGCCACCATGCTTTAACTTATGAATTTTTAATGGTTTTATTTTTAATATTTATATATTTATAATTCATAAAATAAAATA-3’(SEQ ID NO：9)内，其中序列“GCTGA”的“A”是人的最后一个核苷酸，序列“TACTG”的第一个“T”是鼠序列的第一个核苷酸。

打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neocassette)。其中Neo盒5’端与小鼠IL-4基因座的连接设计为5’-ACATGCCTGTAGGCAAGACACCCACACACATAAAAACAAAATAAAATAAGGATAGAAAGGCCAGGGGGATGAATCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGGTCT-3’(SEQ ID NO：10)内，其中序列“GAATC”的“C”是鼠的最后一个核苷酸，序列“CTCGA”的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠IL-4基因座的接合设计为5’-AGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCATTAATCAGAGGTAGAAGAAAACTTATTCC-3’(SEQ ID NO：11)内，其中序列“TTAAT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CAGAG”的“C”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。

载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的重组载体可通过酶切进行初步验证，验证结果见图5，使用3组酶进行酶切验证，其中，EcoRI+NotI应出现634bp+1678bp+5953bp+16413bp，EcoRV+NdeI应出现587bp+2637bp+8928bp+12526bp，BglII+XhoI应出现1183bp+5178bp+6292bp+12025bp，酶切结果均符合预期，其中质粒1、2经测序公司测序验证正确。将构建正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，部分克隆PCR和Southern Blot(分别用EcoRI或AseI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)的检测结果见图6、图7。如图7所示，检测结果表明12个经PCR验证为阳性的克隆，均确定为阳性杂合克隆且无随机插入。

PCR测定包括下述引物：

F：5’-GACAACTTTCAGGGAGGGAGTCAG-3’(SEQ ID NO：12)，

R：5’-ATCGCACTTGTGTCCGTGGAC-3’(SEQ ID NO：13)。

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

F：5’-GCCTCTCTCAACCCAGTATAAC-3’(SEQ ID NO：14)，

R：5’-CTTGGAGTCAACCACCTCTG-3’(SEQ ID NO：15)；

3’探针(3’Probe)：

F：5’-GATCTTTCACTGAAACTTGACTG-3’(SEQ ID NO：16)，

R：5’-CTCCAACTACATCTACTTTCTG-3’(SEQ ID NO：17)；

Neo探针(Neo Probe)：

F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：18)，

R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：19)。

另一种IL-4小鼠人源化策略是在IL-4基因座附近进行更大范围的序列替换，得到的小鼠人源化IL-4基因座示意图如图3所示，打靶策略见图8所示。其中所示的重组载体上含有小鼠IL-4基因座上游5553bp和下游5196bp的同源臂序列(内源IL-4基因上游和下游的小鼠DNA)，以及10573bp的包含人IL-4的序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQID NO：20)与NCBI登录号为NC_000077.6的第53625623-53620071位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：21)与NCBI登录号为NC_000077.6的第53612200-53607005位核苷酸序列相同；人IL-4序列(SEQ ID NO：22)与NCBI登录号为NC_000005.10的第132672342-132682914位核苷酸序列相同。其中，含有人IL-4基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为在5’-TGGGGTATGGTGGCTTATATCTGTAACTTCAACACTTGAGAGGTGGAGGCAGGAGAGTGACCATGAATCTGAGGGCTTCCAGAATAAATTCATAGGGAGGCCCAGGCACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGG-3’(SEQ ID NO：23)内，其中序列“GAGGG”的最后一个“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“CTTCC”的第一个“C”是人序列的第一个核苷酸。含有人IL-4基因的序列下游与Neo盒连接，连接设计为在5’-GGGGTTCCCTCTCGAGTTAGGGACATAACACACAAGATAATTAAAGAACACAAGGCCATACAAGATGTAAATAAGACACCTTGGGTCCAAGAGTGCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCAGCCAAGC-3’(SEQID NO：24)内，其中序列“GAGTGC”的“C”是人的最后一个核苷酸，序列“GTCGA”的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒下游与鼠连接，连接设计为在5’-TGCGGAACCCTTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCTAACTCAAGTTCTGGGGGAGCTGATGCTCTCCTCTGGCCTCCTGTGGAGGTACACAGACCACATGCCTGTAGGCAA-3’(SEQ ID NO：25)内，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TAACT”的第一个“T”是鼠的第一个核苷酸。此外，重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。构建好的重组载体酶切验证结果见图9，其中，BamHI应出现9938bp+6990bp+5266bp+3577bp+2930bp，EcoRI应出现9606bp+6558bp+5432bp+4470bp+2178bp+457bp，ScaI应出现10389bp+7026bp+5739bp+2818bp+2074bp+655bp，酶切结果均符合预期。该质粒经测序公司测序验证正确。对转染、筛选后的C57BL/6小鼠的胚胎干细胞利用PCR和Southern Blot技术进行检测，部分克隆PCR和Southern Blot(分别用MfeI、BamHI或EcoRV消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)的检测结果见图10、图11。如图11所示，检测结果表明12个经PCR验证为阳性的克隆中除1-E11、2-F2外，其余10个克隆确定为阳性杂合克隆且无随机插入。

PCR测定包括下述引物：

F：5’-CTGTGATCATGGTTCCTTATCTGG-3’(SEQ ID NO：26)，

R：5’-CCTCCCCGAGTAGCTGGGACTAC-3’(SEQ ID NO：27)。

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

F：5’-CCACTAGGGGTCCACAGCTAGTCAT-3’(SEQ ID NO：28)，

R：5’-CTTCAGTGAAACCTCCTGAGCCTGG-3’(SEQ ID NO：29)；

3’探针(3’Probe)：

F：5’-AGTCAGAGCTACAGAAGTGGAGGGT-3’(SEQ ID NO：30)，

R：5’-CTGCTCTGCAGGAAGTAAGGGTTCC-3’(SEQ ID NO：31)；

Neo探针(Neo Probe)：F：SEQ ID NO：18，R：SEQ ID NO：19。

将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图12)后，再通过互相交配即可得到表达人IL-4蛋白的IL-4基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图13，其中，编号为1、2的小鼠为阳性杂合小鼠；。PCR测定包括下述引物：

WT-F：5’-ccacatcactgaaagacttcctgg-3’(SEQ ID NO：32)，

WT-R：5’-gatcaagtagacaggcaggcaagac-3’(SEQ ID NO：33)；

Mut-F：5’-ctgtgatcatggttccttatctgg-3’(SEQ ID NO：34)

WT-R：(SEQ ID NO：33)；

Frt-F：5’-agggacagatgcaggctggg-3’(SEQ ID NO：35)；

Frt-R：5’-gagatgcgtgttagaggttttggga-3’(SEQ ID NO：36)；

Flp-F：5’-tcagcgatattaagaacgttgatccg-3’(SEQ ID NO：37)；

Flp-R：5’-tgaagaattgccggtcctatttactcg-3’(SEQ ID NO：38)。

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化IL-4蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法，先给小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠CD3抗体(mCD3)，1.5h后取血清，稀释5倍后检测鼠IL-4和人IL-4蛋白水平，鉴定结果见图14，图14A结果显示，在野生型C57BL/6小鼠和两种IL-4人源化杂合子体内均可检测到鼠IL-4蛋白的表达，图14B表明在野生型C57BL/6小鼠体内未检测人IL-4蛋白的表达，表明两种IL-4人源化小鼠体内均可检测到人IL-4蛋白的表达，而野生型C57BL/6小鼠体内未检测人IL-4蛋白的表达。

实施例2 IL-4Rα基因人源化小鼠

小鼠IL-4Rα基因(NCBI Gene ID：16190，Primary source：MGI:105367，UniProtID：P16382，基于转录本NM_001008700.3(SEQ ID NO：39)及其编码蛋白NP_001008700.1(SEQ ID NO：40))和人IL-4Rα基因(NCBI Gene ID：3566，Primary source：HGNC:6015，UniProt ID：P24394，基于转录本NM_000418.3(SEQ ID NO：41)及其编码蛋白NP_000409.1(SEQ ID NO：42))对比示意图如图15所示。

根据人IL-4Rα和小鼠IL-4Rα基因的特点，对内源性小鼠的IL-4Rα基因的胞外区序列用人IL-4Rα基因序列进行替换，其中一种替换方式是将小鼠IL-4Rα基因座胞外区的外显子4到外显子7的4.4kb的序列用人IL-4Rα基因座上从外显子4到外显子7的约10.5kb的序列替换，这种人源化策略得到的小鼠人源化IL-4Rα基因座示意图如图16所示。改造后的人源化小鼠IL-4Rα的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示。

分别用细菌人工染色体RP23-261H16和RP11-16E24获得小鼠和人IL-4RαDNA。如图17所示的打靶策略示意图中，显示了重组载体上含有小鼠IL-4Rα上游和下游的同源臂序列(内源IL-4Rα基因外显子4上游4264bp和外显子7下游4525bp的小鼠DNA)，以及10537bp人IL-4Rα序列(从部分4号外显子延伸至外显子7中的终止密码子TGA)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：45)与NCBI登录号为NC_000073.6的第125562909-125567172位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：46)与NCBI登录号为NC_000073.6的第125572100-125576624位核苷酸序列相同；人IL-4Rα的DNA片段序列(SEQ ID NO：47)与NCBI登录号为NC_000016.10的第27342138-27352674位核苷酸序列相同。其中，含有人IL-4Rα基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为在5’-CCTCCCTCTGACCTTAGTGGTGGGAGCCCCTGACCATGCCACCACTGATCTGGCCGTTCTGTCTCTGCAGGGAGCATCAAGGTCCTGCAGGAGCCCACCTGCGTCTCCGACTACATGAGCATCTCTACTTGCGAGTGGAAGATGAATGGTCCCACCAATTGCAGCACCGAGCTCCGCCTGTTG-3’(SEQ ID NO：48)内，其中序列“TCCTG”的“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“CAGGA”的“C”是人序列的第一个核苷酸。含有人IL-4Rα基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为在5’-CAGCACCCTGAAGTCTGGGATTTCCTACAGGGCACGGGTGAGGGCCTGGGCTCAGTGCTATAACACCACCTGGAGTGAGTGGAGCCCTAGCATCACGTGGTACAACCGTGAGTATCAGGGTCGTAGGCTGTGAGGATCTCTACAGCCGTGTATATTCTCTGTTCAGAAATTCCCTCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO：49)内，其中序列“GGAGC”的“C”是人的最后一个核苷酸，序列“CCTAG”的第一个“C”是鼠序列的第一个核苷酸。

打靶载体上Neo盒5’端与小鼠IL-4Rα基因座的连接设计为5’-AGGCCCGGAGTTTAAATCCCCAGAGCCCACGTAAAAGCCTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(SEQ ID NO：50)内，其中序列“AGCCT”的“T”是鼠的最后一个核苷酸，序列“GATAT”的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠IL-4Rα基因座的接合设计为5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCAAGCTTTGCGCAGTAGCACGCATGCGTAATCCTGATGGAGCAATTAGGAGAAGCCGGTGGCCGGCTAGCCTGTGCAGACTGTGAAAACAGAGCATCTGAAGCTGTGTGAAAGGCTAGCTCGC-3’(SEQ ID NO：51)内，其中序列“AGCTT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TGCGC”的“T”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。构建好的重组载体酶切初步验证结果见图18，使用3组酶进行酶切验证，其中，HindIII+EcoRV应出现1866bp+2513bp+10385bp+12455bp，XhoI+SmaI应出现481bp+1375bp+2818bp+3815bp+5670bp+13060bp，BglII应出现754bp+1610bp+1856bp+3705bp+19294bp，所有质粒酶切结果均符合预期，质粒3经测序公司测序验证正确。将构建正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆(部分克隆的检测结果见图19(A)、19(B))再进行Southern Blot(分别用SacI、HindIII或BglII消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，图20中检测结果表明4个克隆(1-A9、1-D10、1-F4、A-G5)均为阳性杂合克隆且无随机插入。

PCR测定包括下述引物：

F1：5’-GGGAGGGTGAGTGGAGTCCCA-3’(SEQ ID NO：81)；

R1：5’-CAGCGCAGGCTTACTCGGAGAG-3’(SEQ ID NO：82)；

F2：5’-CGCATTGTCTGAGTAGGTGTC-3’(SEQ ID NO：52)；

R2：5’-GCTGTTCAATGAATGGCCTCTGTG-3’(SEQ ID NO：53)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

F：5’-GTGGCCACCGTTTCTGGGAAC-3’(SEQ ID NO：54)；

R：5’-TCAACAATCTAAGCACGGACCT-3’(SEQ ID NO：55)；

3’探针(3’Probe)：

F：5’-GTGCTGAGGCCAGGGTTCCTC-3’(SEQ ID NO：56)；

R：5’-GCTGTTCAATGAATGGCCTCTGTG-3’(SEQ ID NO：57)；

Neo探针(Neo Probe)：

F：SEQ ID NO：18，R：SEQ ID NO：19。

将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术(如，《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法)将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图参考图12)后，再通过互相交配即可得到表达人IL-4Rα蛋白的IL-4Rα基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图21、22；同时结合图20的结果可见，编号为F1-1至F1-7的小鼠均为阳性杂合小鼠。

PCR测定包括下述引物：

WT-F2：5’-gacacacgtgtctgccagctctgt-3’(SEQ ID NO：58)，

WT-R2：5’-cacggtcagccagagggaatttctg-3’(SEQ ID NO：59)；

Mut-F2：5’-gtggggtcagctaacgacagcaac-3’(SEQ ID NO：60)；

Frt-F2：5’-cgtgtcaaaagcagaaacgcaggag-3’(SEQ ID NO：61)，

Frt-R2：5’-gcgtatgtcaggatctgaggagcac-3’(SEQ ID NO：62)；

Flp-F2：5’-gacaagcgttagtaggcacatatac-3’(SEQ ID NO：63)；

Flp-R2：5’-gctccaatttcccacaacattagt-3’(SEQ ID NO：64)。

通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化IL-4Rα蛋白的表达情况，例如可用抗鼠IL-4Rα抗体mIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19FITC或抗人IL-4Rα抗体hIL4RA APC和抗鼠CD19抗体mCD19FITC对小鼠的脾脏细胞识别染色后进行流式检测IL-4Rα蛋白表达。流式分析结果(见图23)显示，可在经过mCD3抗体刺激的IL-4Rα基因人源化杂合子小鼠脾脏内，检测到表达鼠IL-4Rα蛋白(图C)和人源化IL-4Rα蛋白(图F)的细胞；而在野生型C57BL/6小鼠的脾脏内，无论是否经过mCD3抗体刺激，都只能检测到表达鼠IL-4Rα蛋白(图A、B)，未检测到表达人或人源化IL-4Rα蛋白的细胞(图D、E)。

此外，还可以引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，从而得到IL-4Rα基因人源化小鼠。该系统中靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率，因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA15)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于IL-4Rα基因第4号外显子和第7号外显子上，各sgRNA在IL-4Rα上的靶位点序列如下：

sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：65)：5’-AACATAGACTGGCGTTCACCTGG-3’

sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：66)：5’-TCCGCACTTCCACGTGTGAGTGG-3’

sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：67)：5’-GTGGTTCCTGGATAGCGCTGTGG-3’

sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：68)：5’-ATCCAGGAACCACTCACACGTGG-3’

sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：69)：5’-TATGTTGTGCTGTATGCTTGTGG-3’

sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：70)：5’-CTCAGCTCTGCCTACACTACAGG-3’

sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：71)：5’-AGAACATCAGCCTGTAGTGTAGG-3’

sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：72)：5’-CTACTATACGGCGCGTGTGAGGG-3’

sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：73)：5’-GATGTCAGGGGTCTACTATACGG 3’

sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO：74)：5’-TATAGTAGACCCCTGACATCAGG-3’

sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO：75)：5’-ACGTGTGTCGGTTCCCAGCCTGG-3’

sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO：76)：5’-CTGACATCAGGATGTTGATCGGG-3’

sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO：77)：5’-GTTGATCGGGAAGCTCAGCCTGG-3’

sgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO：78)：5’-ATGTGACCTACAAGGAACCCAGG-3’

sgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO：79)：5’-AGTCTATAATGTGACCTACAAGG-3’

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，其中，sgRNA2、sgRNA6活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA2、sgRNA6的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA2、sgRNA6是具有活性的，并且活性满足基因打靶实验要求，检测结果参见图24和表1。从中优先选择2个(分别是sgRNA1和sgRNA14)进行后续实验。在打靶载体转染C57BL/6小鼠的胚胎干细胞的同时转入sgRNA1、sgRNA14和Cas9mRNA，也筛选得到了正确的阳性克隆细胞。此外，由于Cas9的切割造成基因组DNA的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，本方法还可同时得到IL-4Rα蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。

表1 sgRNA的活性检测结果

实施例3双重或多重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠

利用前述制得的IL-4人源化小鼠和/或IL-4Rα人源化小鼠还可以制备IL-4/IL-4Rα双人源化或包含IL-4和/或IL-4Rα的多人源化小鼠模型。如，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，即，IL-4小鼠和/或IL-4Rα小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到IL-4小鼠和/或IL-4Rα小鼠人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将IL-4小鼠和/或IL-4Rα小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到IL-4小鼠和/或IL-4Rα小鼠人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。

以双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠为例，由于小鼠IL-4与IL-4Rα基因分别位于11号和7号染色体上，选择IL-4人源化小鼠(V1)和IL-4Rα人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，得到双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠。进一步的对双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的表达情况进行检测。取本方法得到的双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子和野生型C57BL/6小鼠各3只，先内眦取血，然后给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3(mCD3)抗体，刺激1.5小时后分别取血清和脾脏，选用ELISA和流式方法分别检测样品中IL-4和IL-4Rα的蛋白水平。ELISA结果表明在未经刺激的双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子和野生型C57BL/6小鼠体内均未检测到鼠或人或人源化IL-4蛋白的表达(图25A、B)；但可在经mCD3刺激的双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子体内检测到人IL-4蛋白的表达，未检测到鼠IL-4蛋白的表达，可在经mCD3刺激的野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠IL-4蛋白的表达，未检测人或人源化IL-4蛋白的表达(图25C、D)。

选用抗鼠IL-4Rα抗体mIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19 APC-Cy7或抗人IL-4Rα抗体hIL4RA PE和抗鼠CD19抗体mCD19 APC-Cy7对小鼠的脾脏细胞识别染色后进行流式检测IL-4Rα蛋白表达，检测结果显示双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠体内可检测到人源化IL-4Rα蛋白的表达，未检测到鼠IL-4Rα蛋白的表达，野生型C57BL/6小鼠体内未检测到人或人源化IL-4Rα蛋白的细胞，检测结果见图26。

对双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子表达的人源化IL-4Rα与抗人IL-4Rα抗体的结合情况进行检测，选择经mCD3刺激的双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠纯合子的脾细胞，将样品分为3组，随机选择其中一组中加入抗人IL4RA抗体Dupilumab/anti-hIgG-AF647和抗鼠CD19抗体mCD19 APC-Cy7进行染色，对照组加入anti-IgG4-kappa hIgG-APC/anti-hIgG-AF647或只加入anti-hIgG-AF647和抗鼠CD19抗体mCD19 APC-Cy7进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。结果表明，与对照组(图27A或27B)相比，抗人IL4RA抗体Dupilumab能很好的结合双重人源化纯合子体内表达的IL-4Rα(图27C)。

对来自未经刺激双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的脾细胞进行进一步分析，对其中淋巴细胞分群并与野生型C57BL/6进行对比，并对双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠进行血常规、血生化等检测，均未发现明显异常。

此外，对双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠和野生型C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞用LPS诱导增殖，其中G1组培养时只用LPS，G2组培养时加入mIL4，G3组加入hIL4(50ng/mL)，于第6天测定各组的IgE水平，结果见图28，表明双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的脾脏淋巴细胞体外诱导的IgE水平与野生型C57BL/6小鼠相当，验证了双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠分离的脾脏细胞具有IL-4/IL-4Rα信号通路传导途径。在另一个实验中，将双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠脾脏淋巴细胞与不同剂量的抗人IL4RA抗体Dupilumab(0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL)先孵育0.5小时后，再加入LPS和入hIL4(50ng/mL)，第6天测定各组的IgE水平，结果见图29，表明在各个测试浓度下，hIL4对双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠的B细胞体外IgE产生的诱导均可被抗人IL4RA抗体Dupilumab有效阻断。

实施例4卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝诱导的哮喘模型

选择单基因或双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠(5-8周)，其中人源化IL-4小鼠为短片段替换(V1)，采用卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝腹腔注射致敏3次，首次注射3周后使用2％OVA连续雾化5天激发可诱导制作哮喘模型(建模方案见图30)，对照组用PBS替换OVA，在第26天获得样品用于分析。在使用双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠建模时，与对照组(PBS)相比，该模型小鼠具有增高的血清IgE水平和肺组织学病理特征等典型症状(图31、32)，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的浸润细胞分析提示嗜酸性粒细胞(Eosinophils，Eos)总数(图33a)和占CD45+细胞的比例均有增加(图33b)，表明双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠体内具有IL-4/IL-4Rα信号通路传导途径。使用抗人IL-4抗体或抗人IL-4Rα抗体进行治疗，实验结束时可以通过常规方法，如气道反应性检测、苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin，HE)或免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)病理检测、炎症细胞和IgE检测评估抗人抗体的药效。

将多只双重人源化IL-4/IL-4Rα小鼠随机分为4组(见表2)，按照上述方法诱导哮喘模型，其中G3和G4组为给药组，在注射致敏后按照不同给药方案腹腔注射抗人IL-4RA抗体Dupilumab(25mg/kg)(给药方案见图34)。检测结果显示，支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+细胞)和嗜酸性粒细胞(Eos)的数量在OVA诱导组(G2)中略高于对照组(G1)和给药组(G3、G4)，嗜酸性粒细胞(Eos)占CD45+细胞的比例OVA诱导组(G2)组最高，给药组(G3)最低，给药组(G4)略低于对照组(G1)组(图35A、图35B、图35C)；只能在OVA诱导组(G2)组中检测到较高的血清IgE水平(图36)；H&E染色结果表明对照组(G1)(PBS)小鼠的气道未显示炎症，而(OVA诱导组(G2)小鼠的支气管周围和血管周围炎症显著增多，且粘液分泌水平增加，给药组(G3、G4)小鼠中均可观察到(与G2组相比)炎性浸润和粘液分泌减少，参见图37。

表2分组及给药情况

在另一组分开的实验中，选用了C57BL/6野生型小鼠和人源化IL-4/IL-4Rα小鼠按照类似方案，具体分组情况见表3，给药组(G3)给药方案见图38。在第26天进行检测，结果与之前一致，支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+细胞)、嗜酸性粒细胞(Eos)和中性粒细胞的数量在OVA诱导组(G2、G4)中较高，对照组(G1)和给药组(G3)中较低(见图39A、39B、39C)；可在OVA诱导组(G2、G4)中检测到较高的血清IgE水平(图40)；H&E染色结果表明对照组(G1)(PBS)小鼠的气道未显示炎症，而OVA诱导组G2和G4小鼠的支气管周围和血管周围炎症显著增多，且粘液分泌水平增加，给药组(G3)小鼠与OVA诱导组相比可观察到炎性浸润和粘液分泌减少，参见图41。

表3分组及给药情况

以上实验表明，抗人IL-4RA抗体Dupilumab在人源化IL-4/IL-4Rα小鼠体内可阻断IL-4/IL-4Rα信号通路，从而减少支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞(Eos)数量，减少血清中致病性介质IgE水平，并可减轻炎性特征，且部分分析结果表明预防性给药策略的治疗效果优于治疗性给药策略的效果。

另一个实验中，将IL-4人源化小鼠(V2)和IL-4Rα人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，可得到双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠。对该小鼠进行了类似的蛋白表达情况和表型分析，均未发现异常。选双重人源化IL-4(V2)/IL-4Rα小鼠随机分为三组，按照图34的G3组方案诱导哮喘模型和给药，具体分组、给药情况见表4。在第26天检测，结果显示支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(CD45+细胞)和嗜酸性粒细胞(Eos)的数量在建模组(G2、G3)较高，且同型对照组(G2)高于给药组(G3)，对照组(G1)中明显较低(见图42)；可在同型对照组(G2)中检测到较高的血清IgE水平，而对照组(G1)和给药组(G4)与之相比血清IgE水平明显降低(图43)，此外H&E染色结果也与之前表现一致。

表4分组及给药情况

这表明本方法制备的人源化IL-4/IL-4Rα小鼠可以模拟疾病模型，在临床前研究中用于筛选、评估抗人IL-4/IL-4Rα抗体的体内药效，并可用于表征抗人IL-4和/或IL-4Rα抗体特性。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

百奥赛图江苏基因生物技术有限公司

<120> 人源化IL-4和/或IL-4Rα改造动物模型的制备方法及应用

<130> 1

<160> 82

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 605

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 60

tgggtctcaa cccccagcta gttgtcatcc tgctcttctt tctcgaatgt accaggagcc 120

atatccacgg atgcgacaaa aatcacttga gagagatcat cggcattttg aacgaggtca 180

caggagaagg gacgccatgc acggagatgg atgtgccaaa cgtcctcaca gcaacgaaga 240

acaccacaga gagtgagctc gtctgtaggg cttccaaggt gcttcgcata ttttatttaa 300

aacatgggaa aactccatgc ttgaagaaga actctagtgt tctcatggag ctgcagagac 360

tctttcgggc ttttcgatgc ctggattcat cgataagctg caccatgaat gagtccaagt 420

ccacatcact gaaagacttc ctggaaagcc taaagagcat catgcaaatg gattactcgt 480

agtactgagc caccatgctt taacttatga atttttaatg gttttatttt taatatttat 540

atatttataa ttcataaaat aaaatatttg tataatgtaa cagaaaaaaa aaaaaaaaaa 600

aaaaa 605

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Gly Leu Asn Pro Gln Leu Val Val Ile Leu Leu Phe Phe Leu Glu

1 5 10 15

Cys Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu

20 25 30

Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr

35 40 45

Glu Met Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu

50 55 60

Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Lys His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met

85 90 95

Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile

100 105 110

Ser Cys Thr Met Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu

115 120 125

Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser

130 135 140

<210> 3

<211> 642

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 3

tgcatcgtta gcttctcctg ataaactaat tgcctcacat tgtcactgca aatcgacacc 60

tattaatggg tctcacctcc caactgcttc cccctctgtt cttcctgcta gcatgtgccg 120

gcaactttgt ccacggacac aagtgcgata tcaccttaca ggagatcatc aaaactttga 180

acagcctcac agagcagaag actctgtgca ccgagttgac cgtaacagac atctttgctg 240

cctccaagaa cacaactgag aaggaaacct tctgcagggc tgcgactgtg ctccggcagt 300

tctacagcca ccatgagaag gacactcgct gcctgggtgc gactgcacag cagttccaca 360

ggcacaagca gctgatccga ttcctgaaac ggctcgacag gaacctctgg ggcctggcgg 420

gcttgaattc ctgtcctgtg aaggaagcca accagagtac gttggaaaac ttcttggaaa 480

ggctaaagac gatcatgaga gagaaatatt caaagtgttc gagctgaata ttttaattta 540

tgagtttttg atagctttat tttttaagta tttatatatt tataactcat cataaaataa 600

agtatatata gaatctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 642

<210> 4

<211> 153

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 4

Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln

20 25 30

Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys

35 40 45

Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr

50 55 60

Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln

85 90 95

Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala

115 120 125

Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met

130 135 140

Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser

145 150

<210> 5

<211> 4220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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cccatcagcc cgtgtccctt ccacctcgac tcgcctacaa agcccagaga ggtctgtttc 3840

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gtggaatact tgaagacagg tctgtagttg agcaaactca cctccatttg tcctcctgga 5580

aagaagaaat caagaggaaa aatctctctc ccatcctcca aatggagctg gcacattgct 5640

atctgtggca tttgtctttc cagaacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga 5700

ctgtgctccg gcagttctac agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg 5760

cacagcagtt ccacaggcac aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc 5820

tctggggcct ggcgggcttg gtaagctgca ctgtattcct ggcaagccgg ccgcgtggct 5880

cctggtggac agcagcctca cttctaaaca ctccttagga gctgcagcac ccttggtcaa 5940

cccattcatt cattcactca ttcaataagt atttgctgaa gttccacaag tgctgggtgt 6000

ggttctaggt gctgaggacg tgtcactaaa gacacgcagg ccgagtccct gttctcatgg 6060

aatgttctaa tgggagagtt agaaaaacaa acatgtaaaa tgatggccag cagtgatacg 6120

tgctacaaag aaaaacatag aaataaagaa cataagagtc atgggggagg gggctgactt 6180

aggagctggt gacattatct gagcagatat ttgaattgag ggagcaggcc acatgactaa 6240

ctagggagac cattccaggc agaaggagga ggtatgcaaa ggccttagga tggaaatgaa 6300

ctaacttcct gtatttaaag accagtagga aggccagtgt ggctggatca gagtgagtga 6360

ggggtagttt ccaggacagc agatcacaca aggcctttag attccaccac gagtatggca 6420

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gatggcctgt tgggaggcta ccacagtaaa ccaggctaga gatgatggtg gcgtggacag 6600

aatgaagcaa gatggcctgt tgggaggcta ccacagtaaa ccaggctaga gacgatggtg 6660

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ttttgtacat cgtacatgta aggtggctct tggatagcca agtgaaggtg ttgagaagat 7020

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cccagcatgt taatgcacct gggggaatgg tccagtggag caggaagaac tgaagagagc 7620

agaaagagga agaatcatta gggggcagaa gtccttgtag cccagagtgg atgttatcta 7680

atatcgagtg gaggaattaa ttggctttag aggagaacaa ggacatgtat cccctctctg 7740

ggcctatcac cttgtagaca atgggatagg tcatgggata ggaacttggc acaacacatg 7800

ttctctcttt taattctctc cattatctta tgaagcaggc aagtaggcaa acaattgtcc 7860

caactttaca aaagaaactg aagcttttat aaattaagta gtacatccta agcaatacaa 7920

ttaataaatg gtagagctga gattcaaact gaagcagtgg cctgggggta gcatctggaa 7980

tccttcccac ctttagggct gctgtgctgc ggtgctgctg tttaatggca caggagggcc 8040

acatgactga atctctctca gcagtccagg cagtcatgca gaaggcccag tagagcaccg 8100

ggcaggtctg agccagcatc ttcaagttcc accctctgag caagcaccta gctgtgacac 8160

acctctccag agactgcact cccccccgcg ccacccaccc caaaagcaga taggtaatgg 8220

tatacagtaa ccatttctag aagtgtaagt agtatgcacc caaaataggc aaaacctgct 8280

ggcctagtga tagagacaac tcccagtcag gctagactgg aggccttggt tttataagtg 8340

ttcaggtgac aagtgccaca gtaggcttga tcaagtagac aggcaggcaa gacaaatgct 8400

taccaatgca agctaatgaa atgtttcttt tgcagaattc ctgtcctgtg aaggaagcca 8460

accagagtac gttggaaaac ttcttggaaa ggctaaagac gatcatgaga gagaaatatt 8520

caaagtgttc gagctga 8537

<210> 8

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actttaactc tatatataga gagacctctg ccagcattgc attgttagca tctcttgata 60

aacttaattg tctctcgtca ctgacggcac agagctattg atgggtctca cctcccaact 120

gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg tgccggcaac tttgtccacg gacacaagtg 180

cgatatcacc ttacaggaga 200

<210> 9

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggaaaactt cttggaaagg ctaaagacga tcatgagaga gaaatattca aagtgttcga 60

gctgatactg agccaccatg ctttaactta tgaattttta atggttttat ttttaatatt 120

tatatattta taattcataa aataaaata 149

<210> 10

<211> 155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acatgcctgt aggcaagaca cccacacaca taaaaacaaa ataaaataag gatagaaagg 60

ccagggggat gaatcctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attccgaagt 120

tcctattctc tagaaagtat aggaacttca ggtct 155

<210> 11

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agaaagtata ggaacttcat cagtcaggta cataatggtg gatccattaa tcagaggtag 60

aagaaaactt attcc 75

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacaactttc agggagggag tcag 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcgcacttg tgtccgtgga c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcctctctca acccagtata ac 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttggagtca accacctctg 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatctttcac tgaaacttga ctg 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctccaactac atctactttc tg 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagaagaact cgtcaagaag gcg 23

<210> 20

<211> 5553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctcagggatt cactgcagcc ttaccaggta ccacggatct ggttcctgag cacagcaagg 60

ttaggttaca tccagtgaga cagtgagaca acatagagca acagcacaga ggtgccaggc 120

acctcggaag ccacagagga gaagccactg gccagtggtt ggggcagagc acaggaagcc 180

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attctatgtt tgtgtagagg atgaatgtct gtgtacaaca tgtagaggca gatgagaagg 720

tcaagtatct cccttcttct gaagacagtg tctctcacgg agcctggagc taggctggca 780

gccagcgatc ccagtcactc ttctgtcccc atctccacag tgagggggtt cccaggtgcc 840

tgtgggacca cgttggcttt tttatatggg tgctggggat ctgaacccag ccctcacgct 900

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tgccctggcc ccaaatcagt ttttgttttg ttttgttttt gttttttaaa agtgtgtgtg 1260

tgtgtgtgtg tgtgtgtgca atgcccccaa aggccaggag agggcatccg atccctggga 1320

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attctaaaaa tgtcaaatat ttacaaaata cccctgagga acccattacc cagcctcaat 1500

ggttagcatg tgagggtcga tttgtctcat ctctaccttc cttattcccc tagtgacaat 1560

gactggatcc agagtctagg tgagagcaga agctgggtgg ggtggatgta gcctgtgagg 1620

tctggacaca ctacgtgtga gaaacctgag ctccagtatg ccatcaaagc tggattgtgg 1680

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gagagaaggg aaggcaagtc tgggctgggg caagcaggct gtagggacag acagccaggc 3180

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gtgggctatg aggacaccaa gtttccttct ggaatgactc ggcaggttga aaggtcatca 3420

cagctgcatc tcagcatcgt gtcacccaag ctccaggccc ttctcagagt cctaggcaca 3480

gtgtgcgcac acccactccc acagccctct caacactcca cctgcatcca cctccctttc 3540

ctgaatgaag tgcccatggt gtatcatggt cagcttcctc tgctatccag gttcataaat 3600

ctaaggactg aaacccaaca ctgaaactcc tcagaaacaa gtgtggggac caaagcgtga 3660

atgtccagac ttgagtatta tagtcattca gccaaccaaa atgtgatgag taatgaagta 3720

cccactgcgt gcagggtgct taactaagta cctgaactta gtacttagaa caacctcaca 3780

agacaagtac aactgtcact cctcagtttc gggactgagg ttgagtgtat gcccaaagtc 3840

acatgagagg acacagaaca gctaggtctg acaagcagcg ggggtggggg tggggtgggg 3900

tggggtgtag agtctttttc cttagtcttg tcgcaatggt atatcaggtg actcaggcta 3960

agtgctttct ccatagatct cagacttgtg gtcacaggag ccccagggga gggggtgcac 4020

agctttctcc tcactgtgta gaaacccggc cacaagcccc tgccttctgg actccacact 4080

ctggtacaca aaactgctca atggctctcg gctcacaaag ggctggagag ggtctatgac 4140

agtcactttc ctgccctgtc cctccactga ccaccactgg ctggctgaca ctcttcatcc 4200

cacttttcca gcctctgcct tatctgctcc attcacagat aatgtgaatc tgtcacttgg 4260

ggtggccttg gacgtccttt ctagtctttg ggaagacttg gagtctggga ctattcagac 4320

tcttttctct gactccttcc aaccactgaa acaagcaaga caaacggaac tttgcttctg 4380

agcggagttg ccttactcta tccctttctg actatcatct tcccacagag cccagcagtt 4440

aaggtgctga gaggaaaacc tgaatggtct attctttgct ccagggacac tgtgggatcc 4500

agccctcccc ttccctaggt gtccttctgt gccccttctt agcaggattc ttccagctat 4560

ggatgacaag ttcctgctgg atctcagcca ctcgatgccc caccctggct ctcgcgcaag 4620

gtcaacccca gccaagctca actgaggcgg gatagttgct tctcctagag gcgaccgacc 4680

tttcaaatgc ttctagagaa gcccaccctc ggttaagagc actggctgct cttccagagg 4740

acgctaattc agttctcagt acctacaaga aggctcacaa ccacctgtaa cttcagtgtc 4800

aggggtctca acactctctt ccggacccca gaggcatcgg gtatatgttt ggtacacaca 4860

tgaaagcaaa ataatcagat gtataaaatt aataattcta aaaaaaaaaa aaagccaaat 4920

tgaaacaaag aatactcctc tacctgtaca gcgaaggatc agcttcagag ccagagagat 4980

gctcatcggg gagacgctcg ctcaccatgt ggctgagtgg atctgtagga catcacagaa 5040

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gggattaaag gtgtgcgcca ccactgctca gcttaatctt tttttttttt cttgtaatga 5280

acccctttca cccaaagaga gctcaggcct ttaccctggc tcgtcgccca ggggaacaga 5340

cttgaaattt gcctcgttgc ttatcatcag tggctggaag gtaacagttt cccaagaatt 5400

gactgtgtcc ctaggcctac agaacatgac tgtgtccaac tttacaacag tcacagttaa 5460

tatatatata tttgtaagtg gggtatggtg gcttatatct gtaacttcaa cacttgagag 5520

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<210> 21

<211> 5196

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taactcaagt tctgggggag ctgatgctct cctctggcct cctgtggagg tacacagacc 60

acatgcctgt aggcaagaca cccacacaca taaaaacaaa ataaaataag gatagaaagg 120

ccagggggat gaatccagag gtagaagaaa acttattccc tggaattgtc ctctgactcc 180

cctcccaaaa cctctaacac gcatctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 240

ctctcacaca cacatacaca cacacataca cacacacaca cacaaatgag gggtatgcat 300

atatacacat gtatacacat acatacacac aaatgagatg gtatgcatac tcacacatgt 360

gcacacacac agatgaggag tatgtacaca cacacacatg cacacacact aagtaaataa 420

aacagagaag aacagaggca tggcactaca ccctaccttc catggggagg gattactgag 480

acaacagagc ctgcggcttg tgaaacaaga accagaaatc aaaaaataat tttttgaaag 540

gacaaggaat cggtagcact tacctacaat ccagtttgaa gcaggccagc atgcatcccc 600

agaatccaca taaaagtgga aagagaaaat caactctaca aagatgtgtt ctgacctcca 660

catacgcatc atacatacac acagtcatca tatatatata tatatatata tatatatata 720

tatatatata tatatatata ttagagaaaa tcaagagatt taagtgttta aaactgctaa 780

cacagtagaa ctacaaaact tgactacaaa acatgtcata gggaagccac acatgtgggt 840

gtggcctgag acctgtgggg gactgtggtg gattgaacga aaatggccgc catagaccca 900

tatgcttgaa tacttggtcc accgttggtg gaactgtttg ggaaggatta ggaggtgtgg 960

ccccgttgga ggaggagtgt cactggggca ggctttgagg tttcaaaagc ccaggctatt 1020

cccagtgtgt tctctctgcc cccagctttc agatcaagac atgagctctg acacagtgcc 1080

tctgttctgc catcatgtac tctaaaccca gaaacctata gtcccaaatt aaacacttcc 1140

ttttataagt tgctttggtc atggtgtctt gtccattaag agcagtaact aagacagggc 1200

agggagactg tttaaagaac aggagtaatt ggttaggtgt ggtggagtac acttttaatt 1260

ccagcacttg ggaagcacag gcaggggtag ctctgtgagt ctgaagccag cctggtcggt 1320

atattgagct ccaggccagc cagagctaca taatgagaac ctgtttctaa agtggggggg 1380

tggggggtgt gagttgctgg gcaggaatga tggctcagtg gctaagacca cctgctgctc 1440

ttggttgttt ccaagcaacc acatactggc tcacaattat ctgtagctcc aggggatttg 1500

acacctctgg cttctgtggg cactgaactc acatgcacat atccatgtgc agacacacac 1560

atctacacat aacttacaga aaaaaaaatt acatatatat atatatatat atatacatat 1620

acatatatat atatatacac atatacatat atatacatat atatatatat atatatatat 1680

gtatgtaaag ttgataatta aaaatatagc taaggatagt cacgaattgg ggctggagag 1740

acagctcagt ggttatgagc accaactgct cttccagagg accctggttc aagtcccagc 1800

aaccacatgg tggatcacaa ccatctgtaa ctccagttct tgggcatctg acaccatttc 1860

ctgacctctg tgagtacttc gtgcagaaca cagacatgca tgcagtcaat gccctcacac 1920

acacaaaagc aatttgaaca aatctcaatc ttaattaacg ctgttattaa aagggaagga 1980

atcgagagga gagaacccaa cggagctcca cactgtcaag cttgcccgtc agaagatgct 2040

ctatgcagtc tcttctacta gagggatcta gtaacagtga cttggcactc ttctgaccct 2100

caatcacatg catgtgacaa aaattaacac caacactgac atcaccccaa aaatacatac 2160

caacttttta accccttcaa aataagggga aaaaaatcaa aagcttaaaa tctcaccctg 2220

accacaggca gtttcaccct gcccacatga aataccagca tgccaagggc aatagcggct 2280

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ttgcacttgg tatatgaggc tgagatgata aaggaacggc tgtcaaaaag aaagacctaa 2460

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cagaacacac taactctttt gtttgcctcc acatagggag ccctagactc tggacttaaa 2580

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acgcgtggat taagggaact tgaggattaa gtaagtcgtg aggcttgtga ctggagcagt 2700

tactgaggcc accagccaca gtcagtgctc agtggagtgt gttcgccaca gatggtgaag 2760

gtggaactgt taactctctc tcccatgatg cacatgggct ctgcttttgc cctcagccag 2820

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cctaacaaaa ccatatatag ctgtgtcttg cattcttggg gagccgggaa gaaatgctgg 2940

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gagatggaac tcaggccttg aggttgtgca gcaagtgtct tttacccgct gagccatctc 3600

cccggcatgc ggtcccctcc cttctgatta gctcttcctg ccagtttctt cccagtgcaa 3660

gctgcggaag ggacctgttc cttcttgggg agaacctcct gtgtactgtg aggaagcatc 3720

cgtcacctgt caataaagct ggcggttggt ctattaactg aggcaggaaa tggggtggaa 3780

gttccagtag ggagagagga actctgggat aggcaggttt aggaagacat tctcccggga 3840

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aaatggttaa ttaaggtact gggtagtcaa ggagtgggcc aaagcttgtg gtctaggtgt 3960

ttattcataa acagtaagtc tcagagtcac tgttttgggc actagggtgt cagtggaaaa 4020

gcctgaggtt aaaccttctt gttctgtatt ggccagtgtt aaagcagaca aagtctgctt 4080

tcatgctgtg ggcccagtgc atgcccagtg tccatttgac actacatttg aaagacatgt 4140

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<210> 22

<211> 10573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cttccagaat aaattcatag ggaggcccag gcacagtggc tcacgcctgt aatcccagca 60

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<212> DNA

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<400> 37

tcagcgatat taagaacgtt gatccg 26

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgaagaattg ccggtcctat ttactcg 27

<210> 39

<211> 5122

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 39

cttctcgcag gaaagccccg cgcggcgcgt ggagcctgaa ctcgcaggtt ctggctggac 60

ttctcgaagc tgaggagaag cagagggacc tggcttctga ttttggatct gcgtgcttgc 120

tggttctggc gcctgctggt cttgttcctg taacctagga ctcggggctt gcacatgctt 180

tttttttgaa gttgctggag agggagccca ggaccttgtg caggcacctt ttgtgtcccc 240

aatggggcgg ctttgcacca agttcctgac ctctgtgggc tgtctgattt tgctgttggt 300

gactggatct gggagcatca aggtcctggg tgagcccacc tgcttctctg actacatccg 360

cacttccacg tgtgagtggt tcctggatag cgctgtggac tgcagttctc agctctgcct 420

acactacagg ctgatgttct tcgagttctc tgaaaacctc acatgcatcc cgaggaacag 480

tgccagcact gtgtgtgtgt gccacatgga aatgaatagg ccggtccaat cagacagata 540

ccagatggaa ctgtgggctg agcacagaca gctgtggcag ggctccttca gccccagtgg 600

taatgtgaag cccctagctc cagacaacct cacactccac accaatgtgt ccgacgaatg 660

gctgctgacc tggaataacc tgtacccatc gaacaactta ctgtacaaag acctcatctc 720

catggtcaac atctccagag aggacaaccc tgcagaattc atagtctata atgtgaccta 780

caaggaaccc aggctgagct tcccgatcaa catcctgatg tcaggggtct actatacggc 840

gcgtgtgagg gtcagatccc agatactcac tggcacctgg agtgagtgga gtcctagcat 900

cacgtggtac aaccacttcc agctgcccct gatacagcgc cttccactgg gggtcaccat 960

ctcctgcctc tgcatcccgt tgttttgcct gttctgttac ttcagcatta ccaagattaa 1020

gaagatatgg tgggaccaga ttcccacccc agcacgcagt cccttggtgg ccatcatcat 1080

tcaggatgca caggtgcccc tctgggataa gcagacccga agccaggagt caaccaagta 1140

cccgcactgg aaaacttgtc tagacaagct gctgccttgc ttgctgaagc acagagtaaa 1200

gaagaagaca gacttcccga aggctgcccc aaccaagtct ctccagagtc ctggaaaggc 1260

aggctggtgt cccatggagg tcagcaggac cgtcctctgg ccagagaatg ttagtgtcag 1320

tgtggtgcgc tgtatggagc tgtttgaggc cccagtacag aatgtggagg aggaagaaga 1380

tgagatagtc aaagaggacc tgagcatgtc acctgagaac agcggaggct gcggcttcca 1440

ggagagccag gcagacatca tggctcggct cactgagaac ctgttttccg acttgttgga 1500

ggctgagaat gggggccttg gccagtcagc cttggcagag tcatgctccc ctctgccttc 1560

aggaagtggg caggcttctg tatcctgggc ctgcctcccc atggggccca gtgaggaggc 1620

cacatgccag gtcacagagc agccttcaca cccaggccct ctttcaggca gcccagccca 1680

gagtgcacct actctggctt gcacgcaggt cccacttgtc cttgcagaca atcctgccta 1740

ccggagtttt agtgactgct gtagcccggc cccaaatcct ggagagctgg ctccagagca 1800

gcagcaggct gatcatctgg aagaagagga gcctccaagc ccggctgacc cccattcttc 1860

agggccacca atgcagccag tggagagctg ggagcagatc cttcacatga gtgtcctgca 1920

gcatggggca gctgctggct ccaccccagc ccctgccggt ggctaccagg agtttgtgca 1980

ggcagtgaag cagggtgccg cccaggatcc tggggtgcct ggtgtcaggc cttctggaga 2040

ccccggttac aaggccttct cgagcctgct cagcagcaat ggcatccgcg gggacacagc 2100

agcagcgggg actgacgatg ggcatggagg ctacaagccc ttccagaatc ctgttcctaa 2160

ccagtcccct agctccgtgc ccttatttac tttcggacta gacacggagc tgtcacccag 2220

tcctctgaac tcagacccac ccaaaagccc cccagaatgc cttggtctgg agctggggct 2280

caaaggaggt gactgggtga aggcccctcc tcctgcagat caggtgccca agccctttgg 2340

ggatgacctg ggctttggta ttgtgtactc gtccctcact tgccacttgt gtggccacct 2400

gaagcaacac cacagccagg aggaaggtgg ccagagcccc atcgttgcta gccctggctg 2460

tggctgctgc tacgatgaca gatcaccatc cctggggagc ctctcggggg ccttggaaag 2520

ctgtcctgag ggaataccac cagaagccaa cctcatgtca gcacccaaga caccctcaaa 2580

cttgtcaggg gagggcaagg gccctggtca ctctcctgtt cccagccaga cgaccgaggt 2640

gcctgtgggc gccctgggca ttgctgtttc ttaggtgagt gagtgtgctg ttgttgctga 2700

ggtctgtgct gaggccaggg ttcctccaag ccagggaagt acttcctggg agacagccca 2760

gctggcaggt ttcccagaaa tccagagaat ggtgaattga agatgtaaac ttggcctgac 2820

cctggacgct cggagcctgg ctgtctcctc ttccactggc ctgggctctc ctccctccca 2880

agggatacag gggctcactg tgcttggtcc cacagcagtg ctgacgttcc taagtcctgg 2940

gctttcctag ctgatgttgt cctacctact cagtcccatt ttgtccaccg aatagacctg 3000

tcactcaagg ctctcagcgg tcctgccata gctgctggac gctcccagct ggaagctggg 3060

cctagaaact cacagatggc ctggcagtgg catgggaggc cctaaaaatt agtggaaatt 3120

ttgagagagg acaggtattg ccccacagag gccattcatt gaacagccag gactgggact 3180

agaggcagag cctgctgtcc tccgctcagt tgtagaaagc aacaaggaca caaacttgat 3240

tgcccaaagt cactgccagt tacccacata tgaccagaag ccagggctcc tgggatgtgg 3300

aagataaaca aacacagttg ccgggtggca gggcccagcg ggcacgataa ctggcagtca 3360

aggcgatacc tcgagggaac tgtggggctg gtcctggttg gtggtcaggt ggtagggata 3420

gcagatggca gactttggtg agtgagtgag tctgactgtg ttctggaaga tgggaccggg 3480

ctcagcactg tctgctcacg tccccactgt tgcaacacct agtctgtttg caaggaggac 3540

aggacaggtc acatggagct ttatgtcaat aaagtcttta tcttgtcagg tttcctttac 3600

tatacacacg ccgagcccac agtgcacgaa agctgaaatg tgcaggcagg gggttgggga 3660

agtggggaga caaggcccca gcagttggtt taagggaatg acttgggaat ggggcagagc 3720

tgtggctact ccatctctca tccttaccct cctgctacca cagcttgtgc ccatgtgtgc 3780

ctgctcaggg gaggggtcct cctctttccc tctcctttag gcagagtgct agaggtgttg 3840

gatgctcctt agcacgcaga gggcgtgaca ctggctgcta agtgttgttg aatgtgtcaa 3900

ggcattgaca tcagtaggcc ccacatctta ggcaggggat ttggggtgtg gcaacctgcc 3960

aggccagcag agaacttgaa tatgatgttc agaaggaaag acagagacag gtcacttagg 4020

gaggcttgaa ggaggccact tttgagatga gcccgtggta tctgcaaaaa agcctggaag 4080

aactcagaac atgcagcaga tggctcatgt ctgaagtttg aggcacaggg atctggtgtg 4140

gtcacagcat cagagagaag ggtcctggca tgatggggac tggtgtgcag ttggatactg 4200

gtattctgcc ttagttctgc ctcttgagag gtggtccagt agaagccagc ctcagacttt 4260

cacatctcag aacagtcttt tcaaagacaa ggtctcagtg tggctcagac gggcctctag 4320

catcactcgg tctcctgagt gctgggatca caggtgtgtg ctactacacc cagcttccca 4380

gagcagtctt accacagccc ctaagcaggg gaggagagga aacggagcca tccaagatct 4440

acctcctgtg ggcatccctc ctgcctggct gaaggagaag tctgggttta aaatccccat 4500

tgctcagatt tgtatcctgg agggaagtga ctcccacagg aatgaactga ctgtcccagg 4560

aaattcttcc cgctgtgcct ttagaacttc ctctgtaaag tacctccctt cagctggtgg 4620

tgcctgtctt taacagtggc tgacagccag ggagtttgag gctagcctag gctttgacag 4680

tgagatcctg ttcaataaac gcagcttccc agtccggcac ttgaccttca agctctgacc 4740

tctggattag cccaggattt cttcactggt cctccacctt ccaccccctt ccactgctta 4800

tacccgctcc catcatttcc aacccaggaa gctgctaaga tctatgtggt agccctggct 4860

ccattaccac cctctcccca tctcctgggt gactgaggga actaaggtac aagcccgagg 4920

aacttgggat tccctgccct gctgttacct tgcctcctgt ctgccatcat taacatagga 4980

ggtgccagcc tgtgccgtcc tggctcccat actcactacc taaggctacc tgttgggaat 5040

tccaaccctc accagtccca tctcttcatt ctattaaaat tacttatcaa gcaaaaaaaa 5100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 5122

<210> 40

<211> 810

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 40

Met Gly Arg Leu Cys Thr Lys Phe Leu Thr Ser Val Gly Cys Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Thr Gly Ser Gly Ser Ile Lys Val Leu Gly Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Phe Ser Asp Tyr Ile Arg Thr Ser Thr Cys Glu Trp Phe Leu

35 40 45

Asp Ser Ala Val Asp Cys Ser Ser Gln Leu Cys Leu His Tyr Arg Leu

50 55 60

Met Phe Phe Glu Phe Ser Glu Asn Leu Thr Cys Ile Pro Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ala Ser Thr Val Cys Val Cys His Met Glu Met Asn Arg Pro Val Gln

85 90 95

Ser Asp Arg Tyr Gln Met Glu Leu Trp Ala Glu His Arg Gln Leu Trp

100 105 110

Gln Gly Ser Phe Ser Pro Ser Gly Asn Val Lys Pro Leu Ala Pro Asp

115 120 125

Asn Leu Thr Leu His Thr Asn Val Ser Asp Glu Trp Leu Leu Thr Trp

130 135 140

Asn Asn Leu Tyr Pro Ser Asn Asn Leu Leu Tyr Lys Asp Leu Ile Ser

145 150 155 160

Met Val Asn Ile Ser Arg Glu Asp Asn Pro Ala Glu Phe Ile Val Tyr

165 170 175

Asn Val Thr Tyr Lys Glu Pro Arg Leu Ser Phe Pro Ile Asn Ile Leu

180 185 190

Met Ser Gly Val Tyr Tyr Thr Ala Arg Val Arg Val Arg Ser Gln Ile

195 200 205

Leu Thr Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Ile Thr Trp Tyr Asn

210 215 220

His Phe Gln Leu Pro Leu Ile Gln Arg Leu Pro Leu Gly Val Thr Ile

225 230 235 240

Ser Cys Leu Cys Ile Pro Leu Phe Cys Leu Phe Cys Tyr Phe Ser Ile

245 250 255

Thr Lys Ile Lys Lys Ile Trp Trp Asp Gln Ile Pro Thr Pro Ala Arg

260 265 270

Ser Pro Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Val Pro Leu Trp

275 280 285

Asp Lys Gln Thr Arg Ser Gln Glu Ser Thr Lys Tyr Pro His Trp Lys

290 295 300

Thr Cys Leu Asp Lys Leu Leu Pro Cys Leu Leu Lys His Arg Val Lys

305 310 315 320

Lys Lys Thr Asp Phe Pro Lys Ala Ala Pro Thr Lys Ser Leu Gln Ser

325 330 335

Pro Gly Lys Ala Gly Trp Cys Pro Met Glu Val Ser Arg Thr Val Leu

340 345 350

Trp Pro Glu Asn Val Ser Val Ser Val Val Arg Cys Met Glu Leu Phe

355 360 365

Glu Ala Pro Val Gln Asn Val Glu Glu Glu Glu Asp Glu Ile Val Lys

370 375 380

Glu Asp Leu Ser Met Ser Pro Glu Asn Ser Gly Gly Cys Gly Phe Gln

385 390 395 400

Glu Ser Gln Ala Asp Ile Met Ala Arg Leu Thr Glu Asn Leu Phe Ser

405 410 415

Asp Leu Leu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ser Ala Leu Ala

420 425 430

Glu Ser Cys Ser Pro Leu Pro Ser Gly Ser Gly Gln Ala Ser Val Ser

435 440 445

Trp Ala Cys Leu Pro Met Gly Pro Ser Glu Glu Ala Thr Cys Gln Val

450 455 460

Thr Glu Gln Pro Ser His Pro Gly Pro Leu Ser Gly Ser Pro Ala Gln

465 470 475 480

Ser Ala Pro Thr Leu Ala Cys Thr Gln Val Pro Leu Val Leu Ala Asp

485 490 495

Asn Pro Ala Tyr Arg Ser Phe Ser Asp Cys Cys Ser Pro Ala Pro Asn

500 505 510

Pro Gly Glu Leu Ala Pro Glu Gln Gln Gln Ala Asp His Leu Glu Glu

515 520 525

Glu Glu Pro Pro Ser Pro Ala Asp Pro His Ser Ser Gly Pro Pro Met

530 535 540

Gln Pro Val Glu Ser Trp Glu Gln Ile Leu His Met Ser Val Leu Gln

545 550 555 560

His Gly Ala Ala Ala Gly Ser Thr Pro Ala Pro Ala Gly Gly Tyr Gln

565 570 575

Glu Phe Val Gln Ala Val Lys Gln Gly Ala Ala Gln Asp Pro Gly Val

580 585 590

Pro Gly Val Arg Pro Ser Gly Asp Pro Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser

595 600 605

Leu Leu Ser Ser Asn Gly Ile Arg Gly Asp Thr Ala Ala Ala Gly Thr

610 615 620

Asp Asp Gly His Gly Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asn Pro Val Pro Asn

625 630 635 640

Gln Ser Pro Ser Ser Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly Leu Asp Thr Glu

645 650 655

Leu Ser Pro Ser Pro Leu Asn Ser Asp Pro Pro Lys Ser Pro Pro Glu

660 665 670

Cys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Leu Lys Gly Gly Asp Trp Val Lys Ala

675 680 685

Pro Pro Pro Ala Asp Gln Val Pro Lys Pro Phe Gly Asp Asp Leu Gly

690 695 700

Phe Gly Ile Val Tyr Ser Ser Leu Thr Cys His Leu Cys Gly His Leu

705 710 715 720

Lys Gln His His Ser Gln Glu Glu Gly Gly Gln Ser Pro Ile Val Ala

725 730 735

Ser Pro Gly Cys Gly Cys Cys Tyr Asp Asp Arg Ser Pro Ser Leu Gly

740 745 750

Ser Leu Ser Gly Ala Leu Glu Ser Cys Pro Glu Gly Ile Pro Pro Glu

755 760 765

Ala Asn Leu Met Ser Ala Pro Lys Thr Pro Ser Asn Leu Ser Gly Glu

770 775 780

Gly Lys Gly Pro Gly His Ser Pro Val Pro Ser Gln Thr Thr Glu Val

785 790 795 800

Pro Val Gly Ala Leu Gly Ile Ala Val Ser

805 810

<210> 41

<211> 3710

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 41

gggtctccgc gcccaggaaa gccccgcgcg gcgcgggcca gggaagggcc acccaggggt 60

cccccacttc ccgcttgggc gcccggacgg cgaatggagc aggggcgcgc agataattaa 120

agatttacac acagctggaa gaaatcatag agaagccggg cgtggtggct catgcctata 180

atcccagcac ttttggaggc tgaggcgggc agatcacttg agatcaggag ttcgagacca 240

gcctggtgcc ttggcatctc ccaatggggt ggctttgctc tgggctcctg ttccctgtga 300

gctgcctggt cctgctgcag gtggcaagct ctgggaacat gaaggtcttg caggagccca 360

cctgcgtctc cgactacatg agcatctcta cttgcgagtg gaagatgaat ggtcccacca 420

attgcagcac cgagctccgc ctgttgtacc agctggtttt tctgctctcc gaagcccaca 480

cgtgtatccc tgagaacaac ggaggcgcgg ggtgcgtgtg ccacctgctc atggatgacg 540

tggtcagtgc ggataactat acactggacc tgtgggctgg gcagcagctg ctgtggaagg 600

gctccttcaa gcccagcgag catgtgaaac ccagggcccc aggaaacctg acagttcaca 660

ccaatgtctc cgacactctg ctgctgacct ggagcaaccc gtatccccct gacaattacc 720

tgtataatca tctcacctat gcagtcaaca tttggagtga aaacgacccg gcagatttca 780

gaatctataa cgtgacctac ctagaaccct ccctccgcat cgcagccagc accctgaagt 840

ctgggatttc ctacagggca cgggtgaggg cctgggctca gtgctataac accacctgga 900

gtgagtggag ccccagcacc aagtggcaca actcctacag ggagcccttc gagcagcacc 960

tcctgctggg cgtcagcgtt tcctgcattg tcatcctggc cgtctgcctg ttgtgctatg 1020

tcagcatcac caagattaag aaagaatggt gggatcagat tcccaaccca gcccgcagcc 1080

gcctcgtggc tataataatc caggatgctc aggggtcaca gtgggagaag cggtcccgag 1140

gccaggaacc agccaagtgc ccacactgga agaattgtct taccaagctc ttgccctgtt 1200

ttctggagca caacatgaaa agggatgaag atcctcacaa ggctgccaaa gagatgcctt 1260

tccagggctc tggaaaatca gcatggtgcc cagtggagat cagcaagaca gtcctctggc 1320

cagagagcat cagcgtggtg cgatgtgtgg agttgtttga ggccccggtg gagtgtgagg 1380

aggaggagga ggtagaggaa gaaaaaggga gcttctgtgc atcgcctgag agcagcaggg 1440

atgacttcca ggagggaagg gagggcattg tggcccggct aacagagagc ctgttcctgg 1500

acctgctcgg agaggagaat gggggctttt gccagcagga catgggggag tcatgccttc 1560

ttccaccttc gggaagtacg agtgctcaca tgccctggga tgagttccca agtgcagggc 1620

ccaaggaggc acctccctgg ggcaaggagc agcctctcca cctggagcca agtcctcctg 1680

ccagcccgac ccagagtcca gacaacctga cttgcacaga gacgcccctc gtcatcgcag 1740

gcaaccctgc ttaccgcagc ttcagcaact ccctgagcca gtcaccgtgt cccagagagc 1800

tgggtccaga cccactgctg gccagacacc tggaggaagt agaacccgag atgccctgtg 1860

tcccccagct ctctgagcca accactgtgc cccaacctga gccagaaacc tgggagcaga 1920

tcctccgccg aaatgtcctc cagcatgggg cagctgcagc ccccgtctcg gcccccacca 1980

gtggctatca ggagtttgta catgcggtgg agcagggtgg cacccaggcc agtgcggtgg 2040

tgggcttggg tcccccagga gaggctggtt acaaggcctt ctcaagcctg cttgccagca 2100

gtgctgtgtc cccagagaaa tgtgggtttg gggctagcag tggggaagag gggtataagc 2160

ctttccaaga cctcattcct ggctgccctg gggaccctgc cccagtccct gtccccttgt 2220

tcacctttgg actggacagg gagccacctc gcagtccgca gagctcacat ctcccaagca 2280

gctccccaga gcacctgggt ctggagccgg gggaaaaggt agaggacatg ccaaagcccc 2340

cacttcccca ggagcaggcc acagaccccc ttgtggacag cctgggcagt ggcattgtct 2400

actcagccct tacctgccac ctgtgcggcc acctgaaaca gtgtcatggc caggaggatg 2460

gtggccagac ccctgtcatg gccagtcctt gctgtggctg ctgctgtgga gacaggtcct 2520

cgccccctac aacccccctg agggccccag acccctctcc aggtggggtt ccactggagg 2580

ccagtctgtg tccggcctcc ctggcaccct cgggcatctc agagaagagt aaatcctcat 2640

catccttcca tcctgcccct ggcaatgctc agagctcaag ccagaccccc aaaatcgtga 2700

actttgtctc cgtgggaccc acatacatga gggtctctta ggtgcatgtc ctcttgttgc 2760

tgagtctgca gatgaggact agggcttatc catgcctggg aaatgccacc tcctggaagg 2820

cagccaggct ggcagatttc caaaagactt gaagaaccat ggtatgaagg tgattggccc 2880

cactgacgtt ggcctaacac tgggctgcag agactggacc ccgcccagca ttgggctggg 2940

ctcgccacat cccatgagag tagagggcac tgggtcgccg tgccccacgg caggcccctg 3000

caggaaaact gaggcccttg ggcacctcga cttgtgaacg agttgttggc tgctccctcc 3060

acagcttctg cagcagactg tccctgttgt aactgcccaa ggcatgtttt gcccaccaga 3120

tcatggccca cgtggaggcc cacctgcctc tgtctcactg aactagaagc cgagcctaga 3180

aactaacaca gccatcaagg gaatgacttg ggcggccttg ggaaatcgat gagaaattga 3240

acttcaggga gggtggtcat tgcctagagg tgctcattca tttaacagag cttccttagg 3300

ttgatgctgg aggcagaatc ccggctgtca aggggtgttc agttaagggg agcaacagag 3360

gacatgaaaa attgctatga ctaaagcagg gacaatttgc tgccaaacac ccatgcccag 3420

ctgtatggct gggggctcct cgtatgcatg gaacccccag aataaatatg ctcagccacc 3480

ctgtgggccg ggcaatccag acagcaggca taaggcacca gttaccctgc atgttggccc 3540

agacctcagg tgctagggaa ggcgggaacc ttgggttgag taatgctcgt ctgtgtgttt 3600

tagtttcatc acctgttatc tgtgtttgct gaggagagtg gaacagaagg ggtggagttt 3660

tgtataaata aagtttcttt gtctctttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3710

<210> 42

<211> 825

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 42

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser

210 215 220

Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser

225 230 235 240

Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr

245 250 255

Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser

260 265 270

Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu

275 280 285

Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn

290 295 300

Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg

305 310 315 320

Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser

325 330 335

Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp

340 345 350

Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro

355 360 365

Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe

370 375 380

Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu

385 390 395 400

Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly

405 410 415

Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu

420 425 430

Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe

435 440 445

Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro

450 455 460

Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp

465 470 475 480

Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala

485 490 495

Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu

500 505 510

Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro

515 520 525

Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln

530 535 540

Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln

545 550 555 560

His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln

565 570 575

Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val

580 585 590

Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser

595 600 605

Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala

610 615 620

Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly

625 630 635 640

Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly

645 650 655

Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser

660 665 670

Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp

675 680 685

Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val

690 695 700

Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu

705 710 715 720

Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr

725 730 735

Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser

740 745 750

Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly

755 760 765

Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly

770 775 780

Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly

785 790 795 800

Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser

805 810 815

Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser

820 825

<210> 43

<211> 5119

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cttctcgcag gaaagccccg cgcggcgcgt ggagcctgaa ctcgcaggtt ctggctggac 60

ttctcgaagc tgaggagaag cagagggacc tggcttctga ttttggatct gcgtgcttgc 120

tggttctggc gcctgctggt cttgttcctg taacctagga ctcggggctt gcacatgctt 180

tttttttgaa gttgctggag agggagccca ggaccttgtg caggcacctt ttgtgtcccc 240

aatggggcgg ctttgcacca agttcctgac ctctgtgggc tgtctgattt tgctgttggt 300

gactggatct gggagcatca aggtcctgca ggagcccacc tgcgtctccg actacatgag 360

catctctact tgcgagtgga agatgaatgg tcccaccaat tgcagcaccg agctccgcct 420

gttgtaccag ctggtttttc tgctctccga agcccacacg tgtatccctg agaacaacgg 480

aggcgcgggg tgcgtgtgcc acctgctcat ggatgacgtg gtcagtgcgg ataactatac 540

actggacctg tgggctgggc agcagctgct gtggaagggc tccttcaagc ccagcgagca 600

tgtgaaaccc agggccccag gaaacctgac agttcacacc aatgtctccg acactctgct 660

gctgacctgg agcaacccgt atccccctga caattacctg tataatcatc tcacctatgc 720

agtcaacatt tggagtgaaa acgacccggc agatttcaga atctataacg tgacctacct 780

agaaccctcc ctccgcatcg cagccagcac cctgaagtct gggatttcct acagggcacg 840

ggtgagggcc tgggctcagt gctataacac cacctggagt gagtggagcc ctagcatcac 900

gtggtacaac cacttccagc tgcccctgat acagcgcctt ccactggggg tcaccatctc 960

ctgcctctgc atcccgttgt tttgcctgtt ctgttacttc agcattacca agattaagaa 1020

gatatggtgg gaccagattc ccaccccagc acgcagtccc ttggtggcca tcatcattca 1080

ggatgcacag gtgcccctct gggataagca gacccgaagc caggagtcaa ccaagtaccc 1140

gcactggaaa acttgtctag acaagctgct gccttgcttg ctgaagcaca gagtaaagaa 1200

gaagacagac ttcccgaagg ctgccccaac caagtctctc cagagtcctg gaaaggcagg 1260

ctggtgtccc atggaggtca gcaggaccgt cctctggcca gagaatgtta gtgtcagtgt 1320

ggtgcgctgt atggagctgt ttgaggcccc agtacagaat gtggaggagg aagaagatga 1380

gatagtcaaa gaggacctga gcatgtcacc tgagaacagc ggaggctgcg gcttccagga 1440

gagccaggca gacatcatgg ctcggctcac tgagaacctg ttttccgact tgttggaggc 1500

tgagaatggg ggccttggcc agtcagcctt ggcagagtca tgctcccctc tgccttcagg 1560

aagtgggcag gcttctgtat cctgggcctg cctccccatg gggcccagtg aggaggccac 1620

atgccaggtc acagagcagc cttcacaccc aggccctctt tcaggcagcc cagcccagag 1680

tgcacctact ctggcttgca cgcaggtccc acttgtcctt gcagacaatc ctgcctaccg 1740

gagttttagt gactgctgta gcccggcccc aaatcctgga gagctggctc cagagcagca 1800

gcaggctgat catctggaag aagaggagcc tccaagcccg gctgaccccc attcttcagg 1860

gccaccaatg cagccagtgg agagctggga gcagatcctt cacatgagtg tcctgcagca 1920

tggggcagct gctggctcca ccccagcccc tgccggtggc taccaggagt ttgtgcaggc 1980

agtgaagcag ggtgccgccc aggatcctgg ggtgcctggt gtcaggcctt ctggagaccc 2040

cggttacaag gccttctcga gcctgctcag cagcaatggc atccgcgggg acacagcagc 2100

agcggggact gacgatgggc atggaggcta caagcccttc cagaatcctg ttcctaacca 2160

gtcccctagc tccgtgccct tatttacttt cggactagac acggagctgt cacccagtcc 2220

tctgaactca gacccaccca aaagcccccc agaatgcctt ggtctggagc tggggctcaa 2280

aggaggtgac tgggtgaagg cccctcctcc tgcagatcag gtgcccaagc cctttgggga 2340

tgacctgggc tttggtattg tgtactcgtc cctcacttgc cacttgtgtg gccacctgaa 2400

gcaacaccac agccaggagg aaggtggcca gagccccatc gttgctagcc ctggctgtgg 2460

ctgctgctac gatgacagat caccatccct ggggagcctc tcgggggcct tggaaagctg 2520

tcctgaggga ataccaccag aagccaacct catgtcagca cccaagacac cctcaaactt 2580

gtcaggggag ggcaagggcc ctggtcactc tcctgttccc agccagacga ccgaggtgcc 2640

tgtgggcgcc ctgggcattg ctgtttctta ggtgagtgag tgtgctgttg ttgctgaggt 2700

ctgtgctgag gccagggttc ctccaagcca gggaagtact tcctgggaga cagcccagct 2760

ggcaggtttc ccagaaatcc agagaatggt gaattgaaga tgtaaacttg gcctgaccct 2820

ggacgctcgg agcctggctg tctcctcttc cactggcctg ggctctcctc cctcccaagg 2880

gatacagggg ctcactgtgc ttggtcccac agcagtgctg acgttcctaa gtcctgggct 2940

ttcctagctg atgttgtcct acctactcag tcccattttg tccaccgaat agacctgtca 3000

ctcaaggctc tcagcggtcc tgccatagct gctggacgct cccagctgga agctgggcct 3060

agaaactcac agatggcctg gcagtggcat gggaggccct aaaaattagt ggaaattttg 3120

agagaggaca ggtattgccc cacagaggcc attcattgaa cagccaggac tgggactaga 3180

ggcagagcct gctgtcctcc gctcagttgt agaaagcaac aaggacacaa acttgattgc 3240

ccaaagtcac tgccagttac ccacatatga ccagaagcca gggctcctgg gatgtggaag 3300

ataaacaaac acagttgccg ggtggcaggg cccagcgggc acgataactg gcagtcaagg 3360

cgatacctcg agggaactgt ggggctggtc ctggttggtg gtcaggtggt agggatagca 3420

gatggcagac tttggtgagt gagtgagtct gactgtgttc tggaagatgg gaccgggctc 3480

agcactgtct gctcacgtcc ccactgttgc aacacctagt ctgtttgcaa ggaggacagg 3540

acaggtcaca tggagcttta tgtcaataaa gtctttatct tgtcaggttt cctttactat 3600

acacacgccg agcccacagt gcacgaaagc tgaaatgtgc aggcaggggg ttggggaagt 3660

ggggagacaa ggccccagca gttggtttaa gggaatgact tgggaatggg gcagagctgt 3720

ggctactcca tctctcatcc ttaccctcct gctaccacag cttgtgccca tgtgtgcctg 3780

ctcaggggag gggtcctcct ctttccctct cctttaggca gagtgctaga ggtgttggat 3840

gctccttagc acgcagaggg cgtgacactg gctgctaagt gttgttgaat gtgtcaaggc 3900

attgacatca gtaggcccca catcttaggc aggggatttg gggtgtggca acctgccagg 3960

ccagcagaga acttgaatat gatgttcaga aggaaagaca gagacaggtc acttagggag 4020

gcttgaagga ggccactttt gagatgagcc cgtggtatct gcaaaaaagc ctggaagaac 4080

tcagaacatg cagcagatgg ctcatgtctg aagtttgagg cacagggatc tggtgtggtc 4140

acagcatcag agagaagggt cctggcatga tggggactgg tgtgcagttg gatactggta 4200

ttctgcctta gttctgcctc ttgagaggtg gtccagtaga agccagcctc agactttcac 4260

atctcagaac agtcttttca aagacaaggt ctcagtgtgg ctcagacggg cctctagcat 4320

cactcggtct cctgagtgct gggatcacag gtgtgtgcta ctacacccag cttcccagag 4380

cagtcttacc acagccccta agcaggggag gagaggaaac ggagccatcc aagatctacc 4440

tcctgtgggc atccctcctg cctggctgaa ggagaagtct gggtttaaaa tccccattgc 4500

tcagatttgt atcctggagg gaagtgactc ccacaggaat gaactgactg tcccaggaaa 4560

ttcttcccgc tgtgccttta gaacttcctc tgtaaagtac ctcccttcag ctggtggtgc 4620

ctgtctttaa cagtggctga cagccaggga gtttgaggct agcctaggct ttgacagtga 4680

gatcctgttc aataaacgca gcttcccagt ccggcacttg accttcaagc tctgacctct 4740

ggattagccc aggatttctt cactggtcct ccaccttcca cccccttcca ctgcttatac 4800

ccgctcccat catttccaac ccaggaagct gctaagatct atgtggtagc cctggctcca 4860

ttaccaccct ctccccatct cctgggtgac tgagggaact aaggtacaag cccgaggaac 4920

ttgggattcc ctgccctgct gttaccttgc ctcctgtctg ccatcattaa cataggaggt 4980

gccagcctgt gccgtcctgg ctcccatact cactacctaa ggctacctgt tgggaattcc 5040

aaccctcacc agtcccatct cttcattcta ttaaaattac ttatcaagca aaaaaaaaaa 5100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 5119

<210> 44

<211> 809

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Met Gly Arg Leu Cys Thr Lys Phe Leu Thr Ser Val Gly Cys Leu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Thr Gly Ser Gly Ser Ile Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Ile Thr Trp Tyr Asn His

210 215 220

Phe Gln Leu Pro Leu Ile Gln Arg Leu Pro Leu Gly Val Thr Ile Ser

225 230 235 240

Cys Leu Cys Ile Pro Leu Phe Cys Leu Phe Cys Tyr Phe Ser Ile Thr

245 250 255

Lys Ile Lys Lys Ile Trp Trp Asp Gln Ile Pro Thr Pro Ala Arg Ser

260 265 270

Pro Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Val Pro Leu Trp Asp

275 280 285

Lys Gln Thr Arg Ser Gln Glu Ser Thr Lys Tyr Pro His Trp Lys Thr

290 295 300

Cys Leu Asp Lys Leu Leu Pro Cys Leu Leu Lys His Arg Val Lys Lys

305 310 315 320

Lys Thr Asp Phe Pro Lys Ala Ala Pro Thr Lys Ser Leu Gln Ser Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Gly Trp Cys Pro Met Glu Val Ser Arg Thr Val Leu Trp

340 345 350

Pro Glu Asn Val Ser Val Ser Val Val Arg Cys Met Glu Leu Phe Glu

355 360 365

Ala Pro Val Gln Asn Val Glu Glu Glu Glu Asp Glu Ile Val Lys Glu

370 375 380

Asp Leu Ser Met Ser Pro Glu Asn Ser Gly Gly Cys Gly Phe Gln Glu

385 390 395 400

Ser Gln Ala Asp Ile Met Ala Arg Leu Thr Glu Asn Leu Phe Ser Asp

405 410 415

Leu Leu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ser Ala Leu Ala Glu

420 425 430

Ser Cys Ser Pro Leu Pro Ser Gly Ser Gly Gln Ala Ser Val Ser Trp

435 440 445

Ala Cys Leu Pro Met Gly Pro Ser Glu Glu Ala Thr Cys Gln Val Thr

450 455 460

Glu Gln Pro Ser His Pro Gly Pro Leu Ser Gly Ser Pro Ala Gln Ser

465 470 475 480

Ala Pro Thr Leu Ala Cys Thr Gln Val Pro Leu Val Leu Ala Asp Asn

485 490 495

Pro Ala Tyr Arg Ser Phe Ser Asp Cys Cys Ser Pro Ala Pro Asn Pro

500 505 510

Gly Glu Leu Ala Pro Glu Gln Gln Gln Ala Asp His Leu Glu Glu Glu

515 520 525

Glu Pro Pro Ser Pro Ala Asp Pro His Ser Ser Gly Pro Pro Met Gln

530 535 540

Pro Val Glu Ser Trp Glu Gln Ile Leu His Met Ser Val Leu Gln His

545 550 555 560

Gly Ala Ala Ala Gly Ser Thr Pro Ala Pro Ala Gly Gly Tyr Gln Glu

565 570 575

Phe Val Gln Ala Val Lys Gln Gly Ala Ala Gln Asp Pro Gly Val Pro

580 585 590

Gly Val Arg Pro Ser Gly Asp Pro Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser Leu

595 600 605

Leu Ser Ser Asn Gly Ile Arg Gly Asp Thr Ala Ala Ala Gly Thr Asp

610 615 620

Asp Gly His Gly Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asn Pro Val Pro Asn Gln

625 630 635 640

Ser Pro Ser Ser Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly Leu Asp Thr Glu Leu

645 650 655

Ser Pro Ser Pro Leu Asn Ser Asp Pro Pro Lys Ser Pro Pro Glu Cys

660 665 670

Leu Gly Leu Glu Leu Gly Leu Lys Gly Gly Asp Trp Val Lys Ala Pro

675 680 685

Pro Pro Ala Asp Gln Val Pro Lys Pro Phe Gly Asp Asp Leu Gly Phe

690 695 700

Gly Ile Val Tyr Ser Ser Leu Thr Cys His Leu Cys Gly His Leu Lys

705 710 715 720

Gln His His Ser Gln Glu Glu Gly Gly Gln Ser Pro Ile Val Ala Ser

725 730 735

Pro Gly Cys Gly Cys Cys Tyr Asp Asp Arg Ser Pro Ser Leu Gly Ser

740 745 750

Leu Ser Gly Ala Leu Glu Ser Cys Pro Glu Gly Ile Pro Pro Glu Ala

755 760 765

Asn Leu Met Ser Ala Pro Lys Thr Pro Ser Asn Leu Ser Gly Glu Gly

770 775 780

Lys Gly Pro Gly His Ser Pro Val Pro Ser Gln Thr Thr Glu Val Pro

785 790 795 800

Val Gly Ala Leu Gly Ile Ala Val Ser

805

<210> 45

<211> 4264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gaggagattt ccacccagct ttcccccacc acactgctgc ccccacctcc ctgtaccaga 60

catggattga gtccttataa ctatgtagca agtgcttttc ccactgagca tctcctcagc 120

tcctccctgt gttgctttct tacacatttg tagagagtta caggcagggt actggccctg 180

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cctggacatg attctgttag ctaggctgct ctgaggagct ggaggtacgt ggccccgggt 480

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aggaatgact ccagccacag agtgtggagg gtggcccagt ccacatcagc agcccaagac 600

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cattccctat aggagggggt ctttactact gtgtccacac ctgggggtca gaggacccct 720

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ccatgataaa gctgggttaa gtggtgggaa gggacagagg gagagatgat cagaagaaaa 1020

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gggacctggc ttctgatttt ggatctgcgt gcttgctggt tctggcgcct gctggtcttg 1740

ttcctgtaac ctaggactcg gggcttgcac atgctttttt tttgaagttg ctggagaggg 1800

agcccaggac cttgtgcagg tgagccaggt atcctgacac tgcaggattg ttcatggcat 1860

gagacactgg tggctggaac tggatgcgtg tatgactggg tgtccacctt gggcattact 1920

tcctctctgc agctctgccg ggcccagcct gacagacagg tccacgaagc agaaggaggc 1980

agaactccag aggctgaaga acccagctgt agactcacag ctgctcggag gcaaaatggg 2040

tctgggactg acccatttag atacagcctc cagataatga ggggagcggg ggactgagga 2100

ctgacccatt gcaggggggt cactgaggac tgacccattg ctgcaggggg ggggtactgg 2160

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agcacacagc tccccatttg cagggcttct ctctctccca tcctccctcc caatttcttt 2340

tctttgcttt gatcctcttc ctcccgaatg ctgggggttg gaacccagga cctggaacat 2400

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ccacagctct cctgggacag gcgaatagag gtatgctcgc gtgctctgtg tgcagagggc 2640

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aggacgtgtc gcagggtcat tgagtcagaa gaccttgcag agtctgatca gaggaattga 3300

gtgaaggcca gggtcgctca gtgatctgga aagagagttt ctagatcaat ctagaaggtc 3360

agcatgaaga cacgtgggaa ttgacctgaa ggtttctcat ccatgtggcc aggtgtggct 3420

tacacctgtc agcctagcac ttgggagact gaggcaggag gattgtgagt ttgagcccag 3480

cctgggctac aagttactgt aaaaaaacaa aacaaaagaa aaaaacaaaa aaaaaaaaaa 3540

ccaaatggac acacaaattc taccccaagc ccagacaagg gtggattatt ctgtatgacg 3600

ggaaaaccca gggtagctgt tgaaggagag ggttcaggag gttagaattt tgtttgctgt 3660

atgaaaactt cctgcatggt ggaccacacc cgctggcatg tgtattgtga ctttgtctgg 3720

acagtggcca tgtagggctt gggtcaaaaa gctcttgagg gtcccacact cactggctgt 3780

tacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacatact cacacacaca ccacatctga 3840

attcctggca gggagctgat gggtaagtgt ctgtcccctc ctccttccct tccctctttc 3900

ctgctcttcc attggctaag cctcttgggt accaaagggt cagagcctga gcctgagccg 3960

tacagattgc agagtcaatc tcttgcctca gtggagaagg gaggtaggga aggagatgtg 4020

ggagtggggg gcgggatggg gggtggggcg cggtggacaa cactgtagga cactgcccct 4080

tcctccctgt gctttaacgt ggtgcttctg agggagagtg gcacctaggt aggtgtgtgc 4140

gtgtgcaggc atgtgtgtca tgatcctgat gcactagcct ccctctgacc ttagtggtgg 4200

gagcccctga ccatgccacc actgatctgg ccgttctgtc tctgcaggga gcatcaaggt 4260

cctg 4264

<210> 46

<211> 4525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgcgcagtag cacgcatgcg taatcctgat ggagcaatta ggagaagccg gtggccggct 60

agcctgtgca gactgtgaaa acagagcatc tgaagctgtg tgaaaggcta gctcgcctgt 120

gctcctcaga tcctgacata cgccatctcg agcaaaagat taacaatcga ttaaaaccca 180

cacatgaaaa caaagaaacc agttagctcc agataaaagc aaatgccagg aaggaaagga 240

ggcagagggc aggggtggag gagcaggtgg gagaggatga cgtcagagaa atctcagtgg 300

ccgtgaacaa ggaagatatt ccagggcttg ttctgaatgt gtgatctttt aaaccatgtg 360

gccctcttag cctgtgagaa aagtccattt ctagccctgc tgaacagaga agcccagggg 420

agcaaccaac tggccttcgg tcactcagca aggacctagt agaggctggc tttgaacttg 480

agccctccag ggcacttgac ctctgagctt tgggaaaaca agcgaggcag cttcacgctg 540

ttgtgatctg gacttggatc agggccagtg aggacaggga cagggatggg tgtgataagg 600

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tccccattca tgactgtttt tctccttgca gacttccagc tgcccctgat acagcgcctt 780

ccactggggg tcaccatctc ctgcctctgc atcccgttgt tttgcctgtt ctgttacttc 840

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

cctccctctg accttagtgg tgggagcccc tgaccatgcc accactgatc tggccgttct 60

gtctctgcag ggagcatcaa ggtcctgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120

atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180

ttg 183

<210> 49

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cagcaccctg aagtctggga tttcctacag ggcacgggtg agggcctggg ctcagtgcta 60

taacaccacc tggagtgagt ggagccctag catcacgtgg tacaaccgtg agtatcaggg 120

tcgtaggctg tgaggatctc tacagccgtg tatattctct gttcagaaat tccctctggc 180

tga 183

<210> 50

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

aggcccggag tttaaatccc cagagcccac gtaaaagcct gatatcgaat tccgaagttc 60

ctattctcta gaaagtatag gaacttc 87

<210> 51

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggtggatc 60

caagctttgc gcagtagcac gcatgcgtaa tcctgatgga gcaattagga gaagccggtg 120

gccggctagc ctgtgcagac tgtgaaaaca gagcatctga agctgtgtga aaggctagct 180

cgc 183

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

cgcattgtct gagtaggtgt c 21

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gctgttcaat gaatggcctc tgtg 24

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gtggccaccg tttctgggaa c 21

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tcaacaatct aagcacggac ct 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gtgctgaggc cagggttcct c 21

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gctgttcaat gaatggcctc tgtg 24

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gacacacgtg tctgccagct ctgt 24

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cacggtcagc cagagggaat ttctg 25

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

gtggggtcag ctaacgacag caac 24

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

cgtgtcaaaa gcagaaacgc aggag 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gcgtatgtca ggatctgagg agcac 25

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aacatagact ggcgttcacc tgg 23

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tccgcacttc cacgtgtgag tgg 23

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gtggttcctg gatagcgctg tgg 23

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

atccaggaac cactcacacg tgg 23

<210> 69

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

tatgttgtgc tgtatgcttg tgg 23

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

ctcagctctg cctacactac agg 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

agaacatcag cctgtagtgt agg 23

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ctactatacg gcgcgtgtga ggg 23

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gatgtcaggg gtctactata cgg 23

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

tatagtagac ccctgacatc agg 23

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acgtgtgtcg gttcccagcc tgg 23

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ctgacatcag gatgttgatc ggg 23

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

gttgatcggg aagctcagcc tgg 23

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

atgtgaccta caaggaaccc agg 23

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

agtctataat gtgacctaca agg 23

<210> 80

<211> 644

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 60

tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 120

ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 180

tcacagagca gaagactctg tgcaccgagt tgaccgtaac agacatcttt gctgcctcca 240

agaacacaac tgagaaggaa accttctgca gggctgcgac tgtgctccgg cagttctaca 300

gccaccatga gaaggacact cgctgcctgg gtgcgactgc acagcagttc cacaggcaca 360

agcagctgat ccgattcctg aaacggctcg acaggaacct ctggggcctg gcgggcttga 420

attcctgtcc tgtgaaggaa gccaaccaga gtacgttgga aaacttcttg gaaaggctaa 480

agacgatcat gagagagaaa tattcaaagt gttcgagctg atactgagcc accatgcttt 540

aacttatgaa tttttaatgg ttttattttt aatatttata tatttataat tcataaaata 600

aaatatttgt ataatgtaac agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 644

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

gggagggtga gtggagtccc a 21

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

cagcgcaggc ttactcggag ag 22

Claims

1.一种包含IL-4Rα基因的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人源化非人动物体内可表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列、外显子5的全部序列、外显子6的全部序列和外显子7的全部或部分序列；优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括内源IL-4Rα基因的外显子1的全部序列、外显子2的全部序列、外显子3的全部序列、外显子4的部分序列和外显子7的部分序列及其后所有外显子的全部序列。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控；所述的人或人源化IL-4Rα蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL-4Rα蛋白包括胞外区、跨膜区及胞内参与信号传导的区域，其中，所述的胞外区包括人IL-4Rα蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区及胞内参与信号传导的区域来源于非人动物IL-4Rα蛋白。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的胞外区氨基酸序列至少50个与人IL-4Rα胞外区序列相同，优选的，所述的胞外区序列包含SEQ ID NO：42第30-216位所示氨基酸序列的全部或部分。

6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因，该人源化非人动物表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列。

8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少8.5kb；优选的，所述的人IL-4基因长度至少10.0kb。

9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行人源化非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

10.根据权利要求1-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。

11.根据权利要求1-10任一所述的构建方法，其特征在于，将编码胞外区全部或部分的内源IL-4Rα基因替换为人的编码胞外区全部或部分的人IL-4Rα基因。

12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，使用sgRNA靶向技术实现将内源IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列替换为人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：65-71任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：72-79任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：65和/或SEQ ID NO：78。

13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，利用胚胎干细胞的基因打靶技术，使用靶向载体将内源IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列替换为人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列至外显子7的全部或部分序列；

所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。

14.根据权利要求1-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL-4Rα蛋白为嵌合IL-4Rα蛋白，所述的嵌合IL-4Rα蛋白选自下列组中的一种：

15.根据权利要求1-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4Rα基因，所述的嵌合IL-4Rα基因编码权利要求14所述的嵌合IL-4Rα蛋白，或所述的嵌合IL-4Rα基因选自下列组中的一种：

或

16.根据权利要求1-15任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4基因，所述的嵌合IL-4基因编码人IL-4蛋白，所述的嵌合IL-4基因选自下列组中的一种：

或

h)嵌合IL-4基因中来源于人IL-4基因的部分在严格条件下，与SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：22所示的核苷酸序列杂交；

或

m)嵌合IL-4基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：23，和/或SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列杂交；

17.一种包含IL-4基因的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

18.根据权利要求17所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少8.5kb，优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4基因长度至少10.0kb。

19.根据权利要求17或18所述的构建方法，其特征在于，所述的人或人源化IL-4蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。

20.根据权利要求17-19任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因，该人源化非人动物表达人或人源化IL-4Rα蛋白，所述的人或人源化IL-4Rα蛋白结合靶向人特定抗原的抗体，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

21.根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控。

22.根据权利要求21所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4的全部或部分序列、外显子5的全部序列、外显子6的全部序列和外显子7的全部或部分序列。

23.根据权利要求17-22任一所述的构建方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行人源化非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

24.根据权利要求17-23任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠。

25.根据权利要求17-24任一所述的构建方法，其特征在于，用人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列替换非人动物的相应区域。

26.根据权利要求17-25任一所述的构建方法，其特征在于，利用胚胎干细胞的基因打靶技术，使用靶向载体将内源IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列替换为人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列，其中所述的人IL-4基因长度至少为8.5kb，优选为至少10.0kb；

所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；

优选的，所述的5’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53622826-53618607位或第53625623-53620071位核苷酸，所述的3’臂选自与NCBI登录号为NC_000077.6的第53612065-53607981位或第53612200-53607005位核苷酸。

27.根据权利要求17-26任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物基因组中包括嵌合IL-4基因，所述的嵌合IL-4基因编码人IL-4蛋白，所述的嵌合IL-4基因选自下列组中的一种：

或

28.一种IL-4Rα基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。

29.根据权利要求28所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于IL-4Rα基因的外显子4至外显子7。

30.根据权利要求28或29所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQ ID NO：45所示；或者，所述3’臂序列如SEQ ID NO：46所示。

31.根据权利要求28-30任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：47所示。

32.一种特异的靶向IL-4Rα基因的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列在非人动物IL-4Rα基因的靶位点位于非人动物IL-4Rα基因的外显子4或外显子7上；所述的sgRNA序列的靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：65-71任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ IDNO：72-79任一项所示；优选的，sgRNA序列的靶向的5’端靶位点序列为SEQ ID NO：65，sgRNA序列的靶向的3’端靶位点序列为SEQ ID NO：78。

33.一种构建人源化非人动物的载体，其特征在于，所述的载体产生如权利要求32所述的sgRNA序列，用于敲除或替换IL-4Rα基因的外显子4至外显子7的部分或全部。

34.一种权利要求28-31任一所述的靶向载体、权利要求32所述的sgRNA序列或权利要求33所述的载体在敲除或替换IL-4Rα基因的外显子4至外显子7的部分或全部的应用。

35.一种IL-4基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸。

36.根据权利要求35所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于IL-4基因的包含外显子1至外显子4的至少8.5kb或至少10kb的区域。

37.根据权利要求35或36所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20所示；或者，所述3’臂序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21所示。

38.根据权利要求35-37任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：22所示。

39.一种权利要求35-38任一所述的靶向载体在敲除或替换IL-4基因的外显子1至外显子4的部分或全部中的应用。

40.一种包含IL-4Rα基因的人源化细胞株，其特征在于，所述的人源化细胞株的基因组中包括人IL-4Rα基因的外显子4、外显子5、外显子6和/或外显子7，所述的人IL-4Rα基因通过内源性调控元件调控；该人源化细胞株表达人或人源化IL-4Rα蛋白，同时内源IL-4Rα蛋白表达降低或缺失。

41.一种包含IL-4基因的人源化细胞株，其特征在于，所述的人源化细胞株的基因组中包括人IL-4基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子4的终止密码子的连续序列；该人源化细胞株表达人或人源化IL-4蛋白，同时内源IL-4蛋白表达降低或缺失。

42.一种包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求1-5和9-15任一所述构建方法构建的IL-4Rα基因人源化非人动物与权利要求17-19和23-27任一所述构建方法构建的IL-4基因人源化非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物。

43.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)采用权利要求1-27任一所述的构建方法构建人源化非人动物或权利要求42所述的制备方法制备包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物；

44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述的其他人源化动物选自基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3或GITR人源化动物中的一种或两种以上的组合。

45.一种荷瘤或免疫系统疾病的动物模型的制备方法，其特征在于，所述动物模型的制备方法包括通过权利要求1-27任一所述的构建方法构建人源化非人动物、权利要求42所述的制备方法制备包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物或者权利要求43所述的方法制备多基因人源化非人动物的步骤。

46.一种非人动物在制备荷瘤或者免疫系统疾病的动物模型中的应用，其特征在于，所述非人动物选自权利要求1-27任一所述的构建方法构建的人源化非人动物、权利要求42所述的制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物或者权利要求43所述的方法制备的多基因人源化非人动物。

47.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-27任一所述构建方法构建的人源化非人动物、权利要求42所述制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、权利要求43所述方法制备的多基因人源化非人动物或权利要求45所述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。

48.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求1-27任一所述构建方法构建的人源化非人动物、权利要求42所述制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、权利要求43所述方法制备的多基因人源化非人动物或权利要求45所述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。

49.一种嵌合IL-4Rα蛋白，其特征在于，所述嵌合IL-4Rα蛋白包括胞外区、跨膜区及胞内参与信号传导的区域，其中，所述的胞外区包括人IL-4Rα蛋白胞外区的全部或部分，所述的跨膜区及胞内参与信号传导的区域来源于非人动物IL-4Rα蛋白。

50.根据权利要求49所述的嵌合IL-4Rα蛋白，其特征在于，所述的嵌合IL-4Rα蛋白选自下列组中的一种：

51.一种编码权利要求49或50所述嵌合IL-4Rα蛋白的基因序列，其特征在于，所述的基因序列为嵌合IL-4Rα基因，所述的嵌合IL-4Rα基因选自下列组中的一种：

或

52.一种编码人IL-4蛋白的嵌合IL-4基因，其特征在于，所述的嵌合IL-4基因选自下列组中的一种：

或

53.一种表达权利要求49或50所述的嵌合IL-4Rα蛋白的构建体。

54.一种包含权利要求53所述构建体的细胞。

55.一种包含权利要求54所述细胞的组织。

56.来源于权利要求1-27任一所述构建方法构建的人源化非人动物、权利要求42所述制备方法制备的包含IL-4Rα基因人源化和IL-4基因人源化的非人动物、权利要求43所述方法制备的多基因人源化非人动物或权利要求45所述制备方法制备的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或在筛选、验证、评价或研究IL-4Rα和/或IL-4基因功能、IL-4Rα和/或IL-4抗体、针对IL-4Rα和/或IL-4靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗免疫系统疾病的药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。