CN112501203A

CN112501203A - Il17rb基因人源化的非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN112501203A
Application number: CN202110157090.5A
Authority: CN
Inventors: 赵磊; 刘畅
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2041-02-05
Also published as: CN112501203B

Abstract

本发明提供了一种IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人IL17RB蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人源化IL17RB蛋白，可以作为人IL17RB信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化IL17RB蛋白、一种人源化IL17RB基因、一种IL17RB基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。

Description

IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL17RB基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

白细胞介素（Interleukin，IL）17细胞因子（简称IL17）家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的Th17细胞分泌。IL17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17E和IL17F。IL17受体（简称IL17R）也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL17RE。IL17通过与受体结合，启动其下游信号通路（包括MAP激酶途径、NF-kB途径、mRNA稳定信号途径、ERK信号途径以及JAK/STAT信号途径等），刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。

IL17RB在机体许多器官组织表面均有表达，通过与IL17B和IL17E结合，激活Jun激酶（JNK）、p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）和核因子-κB（NF-κB）、嗜酸细胞产物如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、IL6和IL8的表达，参与先天和适应性免疫应答。近年来的研究发现，IL17RB与肿瘤（例如乳腺癌、胃癌、胰腺癌等）和自身免疫性疾病（例如哮喘、过敏性鼻炎等）等密切相关。例如，IL-17RB可通过NF-kB通路介导抗凋亡，促进乳腺肿瘤的发生；胃癌组织IL17RB蛋白表达水平高于癌旁组织，对胃癌的发生发展具有一定作用；利用IL17RB中和抗体能够有效抑制胰腺癌的生长；IL17RB在肠道炎症反应中表达水平上调；IL17RB遗传性变异可能在Th2介导的哮喘免疫反应中发挥着重要的作用。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。但是，并不是任何基因或者替换任何基因的任何区域，都可以成功实现人源化动物模型的制备。在该领域，最重要的也是最具挑战性的是根据实际需求，对特定非人动物基因的特定序列，选择相应人源基因的特定区域进行插入或替换，从而获得可以表达人源化蛋白且具有抗体筛选等功能的人源化动物模型。

因此，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上IL17RB基因的复杂性，如何能构建出“有效”的IL17RB人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

发明内容

鉴于IL17/IL17R各配体及受体复杂的作用机制，以及在肿瘤和自身免疫性疾病治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发更多IL17/IL17R相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。具体的，

本发明的第一方面，提供了一种IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包含人IL17RB基因的全部或部分。优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。更进一步优选的，包含人IL17RB基因的2号至10号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含人IL17RB基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’-5’的长度为18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp或25bp的核苷酸序列，10号外显子的部分至少包含从10号外显子5’-3’的长度为10bp、11、12、13、14、15bp、20bp、30bp或40bp的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物包含人源化IL17RB基因。所述的人源化IL17RB基因包含人IL17RB基因的全部或部分。优选包含人IL17RB基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子。

优选的，所述的构建方法包括用包含人IL17RB基因的1号至11号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物IL17RB基因座。进一步优选的，包括用包含人IL17RB基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合插入或替换至非人动物IL17RB基因座。更进一步优选的，包括用包含人IL17RB基因的2号至10号外显子插入或替换至非人动物IL17RB基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IL17RB基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，插入或替换至非人动物IL17RB基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人源化IL17RB基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL17RB基因座。

本发明的第二方面，提供了一种IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL17RB蛋白。

所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白的全部或部分。优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL17RB蛋白还包含人IL17RB蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。

优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白胞外区至少200个氨基酸，例如至少200、210、220、230、240、250、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、280、285个氨基酸，优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白胞外区266个氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白胞外区的从N端第1-10（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）个氨基酸开始至C端1-15（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15）个氨基酸为止。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人IL17RB蛋白的胞外区的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL17RB基因座。进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码人IL17RB蛋白胞外区的从N端第1-10（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）个氨基酸开始至C端1-15（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15）个氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL17RB基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人源化IL17RB蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL17RB基因座。

本发明的第三方面，提供了一种IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第22-287位的核苷酸序列替换至非人动物IL17RB基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列替换至非人动物IL17RB基因座。

优选的，所述的插入或替换的位点为内源调控元件之后。

优选的，所述的插入首先破坏非人动物内源IL17RB基因的编码框或者所述的插入步骤即可实现内源IL17RB基因编码框不表达的目的。

优选的，所述的替换为相应位置的替换。

优选的，所述的替换至非人动物IL17RB基因座为替换非人动物IL17RB基因中编码SEQ ID NO：1第22-284位的核苷酸序列，或者替换非人动物与NCBI登录号为NC_000080.7的第29720048至29728828位所示序列相同的核苷酸序列。

所述的非人动物为小鼠或大鼠。

优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL17RB蛋白。优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含SEQ ID NO：2第22-287位的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物内源IL17RB蛋白的表达降低或缺失。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL17RB蛋白包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：10具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸，或者，包含具有SEQ ID NO：10所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL17RB基因。所述的人源化IL17RB基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL17RB基因转录的mRNA包含SEQID NO：9所示的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸，或者，包含具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人IL17RB基因、人源化IL17RB基因、人源化IL17RB蛋白或者编码人IL17RB蛋白的核苷酸序列通过IL17RB内源性调控元件调控。

本发明使用基因编辑技术进行IL17RB基因人源化的非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建。

所述的靶向载体包含人IL17RB基因的全部或部分。优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。更进一步优选的，包含人IL17RB基因的2号至10号外显子。再进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL17RB基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’-5’的长度为18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp或25bp的核苷酸序列，10号外显子的部分至少包含从10号外显子5’-3’的长度为10bp、11、12、13、14、15bp、20bp、30bp或40bp的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第22-287位的核苷酸序列或包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

其中，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000080.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为3000-4500bp。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。优选的，其选自与NCBI登录号为NC_000080.7至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的，其长度为4000-5000bp。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL17RB基因的2号至10号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL17RB基因人源化的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向IL17RB基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物IL17RB基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL17RB基因上的靶序列上。优选的，所述的sgRNA的靶位点位于IL17RB基因的2号和/或10号外显子上。

本发明的第四方面，提供了一种上述的构建方法获得的IL17RB基因人源化的非人动物。

本发明的第五方面，提供了一种IL17RB基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括敲除内源IL17RB基因的1号至11号外显子的全部或部分。优选敲除1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。进一步优选包含2号至10号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，包含2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子。

本发明的第六方面，提供了一种上述构建方法获得的IL17RB基因缺失的非人动物。

本发明的第七方面，提供了一种IL17RB基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人IL17RB基因的全部或部分。优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人IL17RB基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。更进一步优选的，包含人IL17RB基因的2号至10号外显子。再进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL17RB基因的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或9-10号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含从2号外显子3’-5’的长度为18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp或25bp的核苷酸序列，10号外显子的部分至少包含从10号外显子5’-3’的长度为10bp、11、12、13、14、15bp、20bp、30bp或40bp的核苷酸序列。

所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

优选的，所述的靶向载体还包含可选择的基因标记。

优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。

优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第八方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第九方面，提供了一种上述靶向载体或者包含靶向载体的细胞在IL17RB基因修饰中的应用。

本发明的第十方面，提供了一种人源化IL17RB蛋白，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB蛋白胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL17RB蛋白还包含人IL17RB蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。

优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含人IL17RB基因2号至10号外显子编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含人IL17RB基因2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL17RB蛋白包含SEQ ID NO：2第22-287位氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL17RB蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：10所示，或者，与SEQ ID NO：10具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸，或者，具有SEQ ID NO：10所示的包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第十一方面，提供了一种编码上述人源化IL17RB蛋白的人源化IL17RB基因。优选的，所述的人源化IL17RB基因包含人IL17RB基因的全部或部分。进一步优选包含人IL17RB基因的1号至11号外显子中的任一个或两个以上的组合。更进一步优选的，所述的人源化IL17RB基因包含人IL17RB的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分。

优选的，所述的人源化IL17RB基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL17RB基因转录的mRNA包含SEQID NO：9所示的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一性的核苷酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸，或者，包含具有SEQ ID NO：9所示。

本发明的第十二方面，提供了一种表达上述人源化IL17RB蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含上述人源化IL17RB基因。

本发明的第十三方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第十四方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第十五方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：

（a）应用上述的构建方法制备获得非人动物；

（b）将步骤（a）制备获得的非人动物与除IL17RB外的其他基因修饰的动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化修饰的非人动物。

优选的，所述多基因人源化修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的除IL17RB外的其他基因修饰的动物选自基因PD-1、PD-L1、IL17A、IL17F、IL17RA或IL17RC等修饰的动物中的一种或两种以上的组合。

本发明的第十六方面，提供了一种荷瘤动物模型，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法制备动物的步骤。

优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十七方面，提供了一种IL17RB基因修饰的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官采用上述IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法或多基因修饰的非人动物的构建方法获得，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述构建的IL17RB基因人源化的非人动物或者上述构建的多基因修饰的非人动物，或者上述的荷瘤动物模型。

本发明的第十八方面，提供了上述的构建方法获得的IL17RB基因人源化的非人动物、上述的人源化IL17RB蛋白或者上述的人源化IL17RB基因的应用，所述的应用为非疾病诊断、非疾病治疗目的，所述的应用包括：

A）涉及人类细胞的与IL17RB相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与IL17RB相关的模型系统中的应用；

C）涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与IL17RB相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D）在体内研究人IL17RB信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E）研究IL17RB基因功能，研究针对人IL17RB靶位点的药物、药效，研究与IL17RB相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的第十九方面，提供了一种上述的构建方法获得的IL17RB基因人源化的非人动物、上述构建方法获得的IL17RB基因缺失的非人动物、上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的荷瘤动物模型在制备治疗或预防肿瘤、免疫相关疾病或炎症的药物中的应用。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自乳腺癌、胃癌或胰腺癌。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“细胞”可以为任何来源于动物或人的细胞，包括但不限于淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、CD34+胸腺细胞、神经元或者肿瘤细胞。

本发明所述的“人源化IL17RB蛋白”，包含来源于人IL17RB蛋白的部分和非人动物IL17RB蛋白的部分。

本发明所述的“人源化IL17RB基因”包含来源于人IL17RB基因的部分和非人动物IL17RB基因的部分。

本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“xx号至xx号外显子”或者“xx号外显子至xx号外显子”包含外显子及其期间的内含子。例如“3号至9号外显子”包含3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子和9号外显子的核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子至xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子至3号外显子之间的内含子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL17RB基因座”表示IL17RB基因上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IL17RB基因座可以是IL17RB基因2号外显子至10号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物，优选啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir andC.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠IL17RB基因和人IL17RB基因座对比示意图（非按比例）。

图2：小鼠IL17RB基因人源化改造示意图（非按比例）。

图3：IL17RB基因打靶策略及靶向载体设计示意图（非按比例）。

图4：IL17RB重组后细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照。

图5：IL17RB基因人源化小鼠FRT重组过程示意图（非按比例）。

图6：IL17RB基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照。

图7：C57BL/6野生型小鼠（WT）和IL17RB基因人源化纯合子小鼠（IL17RB）胸腺组织中IL17RB mRNA检测结果，其中M为Marker，H₂O为水对照，WT为野生型对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

AseI、NdeI、BamHI酶购自NEB，货号分别为R0526M、R0111S、R0136M；

C57BL/6小鼠、Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA，货号6110A；

TRIzol™ Reagent购自Invitrogen，货号15596018；

Zombie NIR™ Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号B245952；

RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒购自天根，货号DP430；

Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，型号AttuneNxt；

Heraeus™ Fresco™ 21 Microcentrifuge购自Thermo Fisher，型号Fresco 21；

BioTek Epoch Microplate Reader购自BioTeK，型号EPOCH。

实施例1 IL17RB基因人源化小鼠

小鼠IL17RB基因（NCBI Gene ID：50905，Primary source：MGI：1355292，UniProt：Q9JIP3，位于14号染色体NC_000080.7的第29718125至29730853位，基于转录本NM_019583.3及其编码蛋白NP_062529.2（SEQ ID NO：1））和人IL17RB基因（NCBI Gene ID：55540，Primary source：HGNC:18015，UniProt ID：Q9NRM6，位于3号染色体NC_000003.12的第53846550至53867388位，基于转录本NM_018725.4及其编码蛋白NP_061195.2（SEQ IDNO：2））对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL17RB基因座引入编码人IL17RB蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化IL17RB蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠IL17RB基因调节元件的控制下，用包含人IL17RB基因的2号外显子部分序列至10号外显子部分序列替换小鼠2号外显子的部分序列至10号外显子的部分序列，得到人源化IL17RB基因座示意图如图2所示，实现对小鼠IL17RB基因的人源化改造。

设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠IL17RB基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL17RB序列的A片段。其中，上游同源臂序列（5’同源臂，SEQID NO：3）与NCBI登录号为NC_000080.7的第29728829至29732752位核苷酸序列相同，下游同源臂序列（3’同源臂，SEQ ID NO：4）与NCBI登录号为NC_000080.7的第29715472至29719566位核苷酸序列相同。A片段上人IL17RB的核苷酸序列（SEQ ID NO：5）与NCBI登录号为NC_000003.12的第53848667至53860143位核苷酸序列相同；人IL17RB序列下游与小鼠的连接设计为5’-aggtgaataagctttgttttttccagacaaaagcaagccgggaggctggctgcctctcttcctggtgctgctggtggctgtgtgg-3’（SEQ ID NO：6），其中序列“agccg”的最后一个“g”是人的最后一个核苷酸，序列“ggagg”的第一个“g”是小鼠序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒（Neo cassette）。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为5’-tttctacatagtcttgctgtggtgcacagggtgtggctgaacttcataggGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGG-3’（SEQ ID NO：7），其中序列“atagg”的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“GATAT”的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为5’-TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCggtagaagaaccctaccacctgcagggagaaaatggtacaaatcacagtt-3’（SEQ ID NO：8），其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“ggtag”的第一个“g”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因（白喉毒素A亚基的编码基因（DTA））。改造后的人源化小鼠IL17RB的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：10所示。

鉴于人IL17RB具有多种亚型或转录本，本文所述方法可应用于其它亚型或转录本。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot（分别用NdeI或BamHI或AseI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示）检测，结果如图4所示，检测结果表明12个经PCR验证为阳性的克隆，经测序进一步验证发现除均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1-C07、1-C10、1-G08、2-B10、2-D04、2-D09、2-F02、2-F07、2-H06、3-A08、3-D07、3-E04。

表1：具体探针及目的片段长度

其中，PCR测定包括下述引物：

F1：5’-GGCCTTGCTTGCATATTGTTCCAC-3’（SEQ ID NO：11），

R1：5’-GTCTGGTCTTCGATGACCTATTGCC-3’（SEQ ID NO：12）；

F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’（SEQ ID NO：13），

R2：5’-TAGTTAGGAGCTAAAGCGGTCAGGC-3’（SEQ ID NO：14）；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针（5’Probe）：

5’Probe-F：5’-TGAACCCCTGGACATGAAGGTT-3’（SEQ ID NO：15），

5’Probe-R：5’-AGGCCAGTGATGACAGGCTTA-3’（SEQ ID NO：16）；

3’探针（3’Probe）：

3’Probe-F：5’-GCTACATGACACGTTCATCAGGATG-3’（SEQ ID NO：17），

3’Probe-R：5’-TGTAAATCCTGGCTTGGTTGCTG-3’（SEQ ID NO：18）；

Neo探针（Neo Probe）：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’（SEQ ID NO：19），

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’（SEQ ID NO：20）。

将筛选出的正确阳性克隆细胞（黑色鼠）按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中（白色鼠），得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠（白色鼠）的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠（黑白相间）。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因（该过程示意图见图5）后，再通过互相交配即可得到IL17RB基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型（引物如表2所示），示例性的F1代小鼠（已去除Neo标记基因）的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04、F1-05的5只小鼠均为阳性杂合小鼠。

表2：引物名称及具体序列

这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的IL17RB基因人源化小鼠。

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化IL17RB mRNA的表达情况，例如RT-PCR等。具体来说，分别取6周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的IL17RB基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取胸腺组织，研磨制备细胞悬液，按照TRIzol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测，检测结果如图7所示。从图7中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠胸腺中检测到鼠IL17RBmRNA（图7A），没有检测到人源化IL17RBmRNA（图7B）；在IL17RB基因人源化纯合子小鼠胸腺组织中仅检测到人源化IL17RBmRNA（图7B），没有检测到鼠IL17RBmRNA（图7A）。

RT-PCR引物序列包括：

mIL17RB-F：5’-TCGTCAAGACAAGTGTGGCA-3’（SEQ ID NO：28）

mIL17RB-R：5’-CGACAGACGGTGTGATGGAA-3’（SEQ ID NO：29）

hIL17RB-F：5’-ACACAGTCTATTTCATTGGGGC-3’（SEQ ID NO：30）

hIL17RB-R：5’-CAGGCACTGTCACAAAGGGT-3’（SEQ ID NO：31）

GAPDH-F：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’（SEQ ID NO：32）

GAPDH-R：5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’（SEQ ID NO：33）

实施例2 双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的IL17RB小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、IL17A、IL17F、IL17RA、IL17RC等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化IL17RB小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得IL17RB与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的IL17RB小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IL17RB与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人IL17RB和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 499

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Leu Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Ala Ser Cys Arg Ser Ala Leu

1 5 10 15

Pro Arg Glu Pro Thr Ile Gln Cys Gly Ser Glu Thr Gly Pro Ser Pro

20 25 30

Glu Trp Met Val Gln His Thr Leu Thr Pro Gly Asp Leu Arg Asp Leu

35 40 45

Gln Val Glu Leu Val Lys Thr Ser Val Ala Ala Glu Glu Phe Ser Ile

50 55 60

Leu Met Asn Ile Ser Trp Ile Leu Arg Ala Asp Ala Ser Ile Arg Leu

65 70 75 80

Leu Lys Ala Thr Lys Ile Cys Val Ser Gly Lys Asn Asn Met Asn Ser

85 90 95

Tyr Ser Cys Val Arg Cys Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Gln Ser Gln Thr

100 105 110

Arg Pro Ser Gly Gly Lys Trp Thr Phe Ser Tyr Val Gly Phe Pro Val

115 120 125

Glu Leu Ser Thr Leu Tyr Leu Ile Ser Ala His Asn Ile Pro Asn Ala

130 135 140

Asn Met Asn Glu Asp Ser Pro Ser Leu Ser Val Asn Phe Thr Ser Pro

145 150 155 160

Gly Cys Leu Asn His Val Met Lys Tyr Lys Lys Gln Cys Thr Glu Ala

165 170 175

Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asp Ile Thr Ala Cys Lys Lys Asn Glu Lys

180 185 190

Met Val Glu Val Asn Phe Thr Thr Asn Pro Leu Gly Asn Arg Tyr Thr

195 200 205

Ile Leu Ile Gln Arg Asp Thr Thr Leu Gly Phe Ser Arg Val Leu Glu

210 215 220

Asn Lys Leu Met Arg Thr Ser Val Ala Ile Pro Val Thr Glu Glu Ser

225 230 235 240

Glu Gly Ala Val Val Gln Leu Thr Pro Tyr Leu His Thr Cys Gly Asn

245 250 255

Asp Cys Ile Arg Arg Glu Gly Thr Val Val Leu Cys Ser Glu Thr Ser

260 265 270

Ala Pro Ile Pro Pro Asp Asp Asn Arg Arg Met Leu Gly Gly Trp Leu

275 280 285

Pro Leu Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Val Trp Val Leu Ala Ala Gly

290 295 300

Ile Tyr Leu Thr Trp Arg Gln Gly Arg Ser Thr Lys Thr Ser Phe Pro

305 310 315 320

Ile Ser Thr Met Leu Leu Pro Leu Ile Lys Val Leu Val Val Tyr Pro

325 330 335

Ser Glu Ile Cys Phe His His Thr Val Cys Arg Phe Thr Asp Phe Leu

340 345 350

Gln Asn Tyr Cys Arg Ser Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp Gln Lys Lys

355 360 365

Lys Ile Ala Glu Met Gly Pro Val Gln Trp Leu Thr Thr Gln Lys Gln

370 375 380

Ala Ala Asp Lys Val Val Phe Leu Leu Pro Ser Asp Val Pro Thr Leu

385 390 395 400

Cys Asp Ser Ala Cys Gly His Asn Glu Gly Ser Ala Arg Glu Asn Ser

405 410 415

Gln Asp Leu Phe Pro Leu Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser Asp Phe Ser

420 425 430

Ser Gln Thr His Leu His Lys Tyr Leu Val Val Tyr Leu Gly Gly Ala

435 440 445

Asp Leu Lys Gly Asp Tyr Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro Gln Tyr His

450 455 460

Leu Met Lys Asp Ala Thr Ala Phe His Thr Glu Leu Leu Lys Ala Thr

465 470 475 480

Gln Ser Met Ser Val Lys Lys Arg Ser Gln Ala Cys His Asp Ser Cys

485 490 495

Ser Pro Leu

<210> 2

<211> 502

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Ser Leu Val Leu Leu Ser Leu Ala Ala Leu Cys Arg Ser Ala Val

1 5 10 15

Pro Arg Glu Pro Thr Val Gln Cys Gly Ser Glu Thr Gly Pro Ser Pro

20 25 30

Glu Trp Met Leu Gln His Asp Leu Ile Pro Gly Asp Leu Arg Asp Leu

35 40 45

Arg Val Glu Pro Val Thr Thr Ser Val Ala Thr Gly Asp Tyr Ser Ile

50 55 60

Leu Met Asn Val Ser Trp Val Leu Arg Ala Asp Ala Ser Ile Arg Leu

65 70 75 80

Leu Lys Ala Thr Lys Ile Cys Val Thr Gly Lys Ser Asn Phe Gln Ser

85 90 95

Tyr Ser Cys Val Arg Cys Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Gln Thr Gln Thr

100 105 110

Arg Pro Ser Gly Gly Lys Trp Thr Phe Ser Tyr Ile Gly Phe Pro Val

115 120 125

Glu Leu Asn Thr Val Tyr Phe Ile Gly Ala His Asn Ile Pro Asn Ala

130 135 140

Asn Met Asn Glu Asp Gly Pro Ser Met Ser Val Asn Phe Thr Ser Pro

145 150 155 160

Gly Cys Leu Asp His Ile Met Lys Tyr Lys Lys Lys Cys Val Lys Ala

165 170 175

Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Ala Cys Lys Lys Asn Glu Glu

180 185 190

Thr Val Glu Val Asn Phe Thr Thr Thr Pro Leu Gly Asn Arg Tyr Met

195 200 205

Ala Leu Ile Gln His Ser Thr Ile Ile Gly Phe Ser Gln Val Phe Glu

210 215 220

Pro His Gln Lys Lys Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Pro Val Thr

225 230 235 240

Gly Asp Ser Glu Gly Ala Thr Val Gln Leu Thr Pro Tyr Phe Pro Thr

245 250 255

Cys Gly Ser Asp Cys Ile Arg His Lys Gly Thr Val Val Leu Cys Pro

260 265 270

Gln Thr Gly Val Pro Phe Pro Leu Asp Asn Asn Lys Ser Lys Pro Gly

275 280 285

Gly Trp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Thr Trp Val

290 295 300

Leu Val Ala Gly Ile Tyr Leu Met Trp Arg His Glu Arg Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Ser Phe Ser Thr Thr Thr Leu Leu Pro Pro Ile Lys Val Leu Val

325 330 335

Val Tyr Pro Ser Glu Ile Cys Phe His His Thr Ile Cys Tyr Phe Thr

340 345 350

Glu Phe Leu Gln Asn His Cys Arg Ser Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp

355 360 365

Gln Lys Lys Lys Ile Ala Glu Met Gly Pro Val Gln Trp Leu Ala Thr

370 375 380

Gln Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Val Phe Leu Leu Ser Asn Asp Val

385 390 395 400

Asn Ser Val Cys Asp Gly Thr Cys Gly Lys Ser Glu Gly Ser Pro Ser

405 410 415

Glu Asn Ser Gln Asp Leu Phe Pro Leu Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser

420 425 430

Asp Leu Arg Ser Gln Ile His Leu His Lys Tyr Val Val Val Tyr Phe

435 440 445

Arg Glu Ile Asp Thr Lys Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro

450 455 460

Lys Tyr His Leu Met Lys Asp Ala Thr Ala Phe Cys Ala Glu Leu Leu

465 470 475 480

His Val Lys Gln Gln Val Ser Ala Gly Lys Arg Ser Gln Ala Cys His

485 490 495

Asp Gly Cys Cys Ser Leu

500

<210> 3

<211> 3924

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcatcctt gcctgagtat tctcccatat cttccacccc tttctacccc cttcacccaa 60

ctcttcctct ctcctttgcc accagattct tctccgggat aagaaaccca actagctgcc 120

ctgagccatt tctcaaaaca agccaatcaa gtacccaatt ccttatgttt gtcccacctc 180

cccttgccaa ggtcaggaga ggtcgctcca gtttctgtgt gcatgtgaca tcaagaactt 240

tcctgcccgc ctttctgtct caggggccaa gaaatggctg acttgtccct ggacctgacc 300

tctctatccc tgctgtccca aagccccttg ccttttgcct tgagctgact acagcaggct 360

gtgttctgcc agagcagccc agggactggc actcagctac tcaccgagta aacacgtgtt 420

ggcaatcggc tgtgacttgc tcagctgaga gggagtgctc tctacttgct ctgcacagcc 480

ccatgggctg tttttcaaaa ctggaaactg attgttatct aaacatctgc ctggctcctc 540

agccccatag ggcaaagttc tcagatagaa gctggaaaac aaggccgtct ccattttgtc 600

ttcccaccag ggcaggtact ctggccttgc atgttcctgt cacagtgctc agctccatgc 660

caagagcatg cacctttgca ccctggtagc aggcaagggt ttaccggtca gaaaggctgc 720

tatgaaagct tattgttccc aggaaccact gagcctgaac ggctcgctga ggttgagtgg 780

gagcccagga tggcccagtt ccaggcgagg gtggggctac aacctccctt ctgtcaatct 840

ccttggtcag gcaccagaac aagtttctca ggaaactatt ccttgcaatc caacagaggc 900

tagggacgga gccttctcca ggtgaatcaa aaccagaatc ttcacctgaa gtctgtctca 960

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cccttccacc tgctcagatg ctagcaccac ccacctgtgg ccatggggat cctaagaacc 7080

ttctgtttgg attagcaaac attcgaggtg ggagtgtgag ttcgctaaag gactggccca 7140

caattacgct ctcaatttgt gtcctcaaag aggatcactt ttcacaggct agtgaatttt 7200

accccttgaa ttttgtagta atccccttta ggattattag tccctagtgc ccagtttcca 7260

agggtttgtg taaatttctg agtaatatag tgttggaatg ctaatgaggc tagtggtatt 7320

tggatcagcc cagaactctt aggcaccctt cactgcacaa ggcatccctg gtaccctttc 7380

agacagccgt ccatgctgtc cttgctagaa ggcagatttg gacgctgagc ttcccaccaa 7440

gggtacagag aacactgcag gtgtgaggag gtcagagggc cttgaagtca gtcctgaacc 7500

tgaactccta aagacagttc tgagccaggg cctcaaatgg tctcctcggt ggagaagata 7560

atttctgctg ttatacattg ttgttcctgg aaatcagtcc agtccttatt tgcaagtcac 7620

atgaatgaaa cgactgactt tttctgccag agcagaccta tcagggtata tcctctaagc 7680

tacgagccat ttccttcttt ctttgcatct agtgaagctg gcagaatggt ctgatggatg 7740

aagctcctgg aacacaaaat attctagtgg ttgtagtcct gattgtgagt tcacttgctc 7800

tataatctta gacatgtttt ccaacctgta gctctttctc cccatcctgg gaagtagaaa 7860

atactgaccc tatcccttaa ctcaaaagag aggttgaaaa cagcagtgag tagcagaacc 7920

aatccgtgcc tcccaccata ctcagcccag ggaagctgtt tttagcaaag cagcgatgta 7980

cggatcccca aactgtcttg ggcagcaagt actttgagac tttggaaaca atgataaaaa 8040

gttcactatg tagcagcgtc cctatctctt ggacattgtt cctgagaact tgggtttgtt 8100

tccataaagc cctgtgggga acttaaatga gggaagagtt agcaagttca tctacatggt 8160

tctctctcaa ctcacaggaa gcctgtggga tccgaacatc actgcttgta agaagaatga 8220

ggagacagta gaagtgaact tcacaaccac tcccctggga aacagataca tggctcttat 8280

ccaacacagc actatcatcg ggttttctca ggtgtttgag gtactttttc tcttcgtccc 8340

cttcacctcg tcctccagct ttccttagtg tgttgaagga aaatggggac agtgttgtcc 8400

aaacgtgctg ggctactttg atgaattcaa cagataaaaa caagtccctg tgggcatcct 8460

gagaggtgtc actgtgaacc tcaaaccata gaaagaagga agtctccgaa gcaggaaatg 8520

agcccttctt tacacatggt ctagtgaaag gagtcctttt gggaagcaaa gctgctttgc 8580

tggaagcctc gaaatctgct cactcctgtg cctcataatt tttggggggc ggaggttgac 8640

acagggtctc actctgtcat ccaggctgga atgcagtggc acaatcacag cttagtgcag 8700

cctccacctc ccgggctcaa gtgatcctcc cacctcagcc tccccagata gctgggatta 8760

caggcatgtg ccaccatgcc gagctaattt tttcatcttt agtagagacg gtttcgccat 8820

gttgcccagg ctggtctcaa aatactgggc tcaagccatc tgcctgcctt ggcctcccaa 8880

agtgttggga ttacaggggt gagccagtgc acctggcacc tcataattct tgactctctc 8940

tctcttaagc cacaccagaa gaaacaaacg cgagcttcag tggtgattcc agtgactggg 9000

gatagtgaag gtgctacggt gcaggtaaag ttcagtgagc tgctctgggg agggaaggga 9060

catagaagac tgttccatca ttcattgctt ttaaggatga gttctctctt gtcaaatgca 9120

cttctgccag cagacaccag ttaagtggcg ttcatggggg ctctttcgct gcagcctcca 9180

ccgtgctgag gtcaggaggc cgacgtggca gttgtggtcc cttttgcttg tattaatggc 9240

tgctgacctt ccaaagcact ttttattttc attttctgtc acagacactc agggatagca 9300

gtaccatttt acttccgcaa gcctttaact gcaagatgaa gctgcaaagg gtttgaaatg 9360

ggaaggtttg agttccaggc agcgtatgaa ctctggagag gggctgccag tcctctctgg 9420

gccgcagcgg acccagctgg aacacaggaa gttggagcag taggtgctcc ttcacctctc 9480

agtatgtctc tttcaactct agtttttgag gtggggacac aggaggtcca gtgggacaca 9540

gccactcccc aaagagtaag gagcttccat gcttcattcc ctggcataaa aagtgctcaa 9600

acacaccaga gggggcaggc accagccagg gtatgatggc tactaccctt ttctggagaa 9660

ccatagactt cccttactac agggacttgc atgtcctaaa gcactggctg aaggaagcca 9720

agaggatcac tgctgctcct tttttctaga ggaaatgttt gtctacgtgg taagatatga 9780

cctagccctt ttaggtaagc gaactggtat gttagtaacg tgtacaaagt ttaggttcag 9840

accccgggag tcttgggcac gtgggtctcg ggtcactggt tttgacttta gggctttgtt 9900

acagatgtgt gaccaagggg aaaatgtgca tgacaacact agaggtatgg gcgaagccag 9960

aaagaaggga agttttggct gaagtaggag tcttggtgag attttgctct gatgcatggt 10020

gtgaactttc tgagcctctt gtttttcctc agctgactcc atattttcct acttgtggca 10080

gcgactgcat ccgacataaa ggaacagttg tgctctgccc acaaacaggc gtccctttcc 10140

ctctggataa cagtaagtgc ccagtaactt caaccagatg atcaaagtgg ctcacacaca 10200

gtcactgccc cccactcagt atgtggaagg gttgtgtgta tgtgggcagt gcaaggggtc 10260

gctgcctgtg tacactgaac tggggtgcag agaaagccaa cagtgctgtc ccagagaacc 10320

tagaatctga gtaagaacag gctttatttg taaaaccact cgtgactctt tacaaagcag 10380

gatacacaga agggaaaaaa atacacagtg caaaatggat gttctgagtg ccacaaggat 10440

ctgctgaaaa aagccaaaga tgtaagatgg ctgggtatat atgagaatga atatttcact 10500

atattctgat tcaattacca gtctcagtgg cccaggatga gcttttggtg tggtcacatg 10560

gccaacattt ggataacaaa tgaggaataa tggtaccgcc tcactagtgc ctgagaacag 10620

catgttctgg aaaatgtctc tggagttaga gatgtgttag ctttttcatt acagatggag 10680

aaatacaatg tttacacaac agtccagggg tggggtcaaa agttggaagg tgtcattaga 10740

cgcagccaaa taaagtgaag acaacccagg tgactggcag ccctgacttg tgcgtgggcg 10800

aagccttaca gattcctggg cactctgtgc ctgagcttac ctgatgttct tgtgaggcgg 10860

gtggcactat cctccatgta tgtcagtcta acaagacggc ctgtaaaaat gtcatctata 10920

tgtgctatgt atgtaagcag ttgtacccag aataacatta attccttaaa gaaccaaaaa 10980

aactggacag aaaccctagt tcctactgtg aaaatgccgg tgcatatcag gacaaagaag 11040

ccaaagagat tttaggactg ttcttaactt cctgggtccc atatcccttt tgagaatcta 11100

atgcaagacc tgcacactct agggaaaaag atatgattgg cagactctct aaagagcttc 11160

tgactgatgg ttttaaaggg atctaaatct ctacaaagtg gctgggcgcg gtgacacatg 11220

cctgtaatcc cagctactca ggaggctgag gcagcattgc ttgaacccgg gagacggagg 11280

ctgcagtgaa ccgagattgc gccactgcac tccagcctag gcaacaaagc gagactctgt 11340

ctcaaaacta aaaaataata aaaaataaat aaacctctat aaagtatacc aagtcttagt 11400

ttttaaatta agagataagt gtggatttgt tttccaaagg tgaataagct ttgttttttc 11460

cagacaaaag caagccg 11477

<210> 6

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtgaataa gctttgtttt ttccagacaa aagcaagccg ggaggctggc tgcctctctt 60

cctggtgctg ctggtggctg tgtgg 85

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttctacata gtcttgctgt ggtgcacagg gtgtggctga acttcatagg gatatcgaat 60

tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcagg 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctctagaaa gtataggaac ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc ggtagaagaa 60

ccctaccacc tgcagggaga aaatggtaca aatcacagtt 100

<210> 9

<211> 2070

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgggaggcg gagcccggag aactgcggcg ggcgcctgga taagaggacc ctggacctct 60

ggccccagct ccgcgtggtg gtgggcggtg gccagtggcc gggccatgtt gctagtgttg 120

ctgatcttgg ctgcatcgtg caggagcgcc ctgcctcgag agccgactgt tcaatgtggc 180

tctgaaactg ggccatctcc agagtggatg ctacaacatg atctaatccc cggagacttg 240

agggacctcc gagtagaacc tgttacaact agtgttgcaa caggggacta ttcaattttg 300

atgaatgtaa gctgggtact ccgggcagat gccagcatcc gcttgttgaa ggccaccaag 360

atttgtgtga cgggcaaaag caacttccag tcctacagct gtgtgaggtg caattacaca 420

gaggccttcc agactcagac cagaccctct ggtggtaaat ggacattttc ctacatcggc 480

ttccctgtag agctgaacac agtctatttc attggggccc ataatattcc taatgcaaat 540

atgaatgaag atggcccttc catgtctgtg aatttcacct caccaggctg cctagaccac 600

ataatgaaat ataaaaaaaa gtgtgtcaag gccggaagcc tgtgggatcc gaacatcact 660

gcttgtaaga agaatgagga gacagtagaa gtgaacttca caaccactcc cctgggaaac 720

agatacatgg ctcttatcca acacagcact atcatcgggt tttctcaggt gtttgagcca 780

caccagaaga aacaaacgcg agcttcagtg gtgattccag tgactgggga tagtgaaggt 840

gctacggtgc agctgactcc atattttcct acttgtggca gcgactgcat ccgacataaa 900

ggaacagttg tgctctgccc acaaacaggc gtccctttcc ctctggataa caacaaaagc 960

aagccgggag gctggctgcc tctcttcctg gtgctgctgg tggctgtgtg ggtgctggca 1020

gctgggatct acctaacttg gaggcaagga aggagcacga agacgtcctt tcctatttcc 1080

accatgctcc tgcccctcat taaggtcctg gtggtttatc cttctgagat atgtttccat 1140

cacaccgtct gtcgcttcac tgactttctt caaaactact gcagaagtga ggtcatcctt 1200

gaaaaatggc agaaaaagaa aatcgccgag atggggccgg tacagtggct gaccactcag 1260

aagcaagcgg cagataaagt ggtcttcctt cttcccagtg acgtcccgac cctttgtgac 1320

agtgcctgtg gccacaatga gggcagcgcc agggagaact ctcaggatct gttccctctt 1380

gcctttaacc tcttttgtag tgatttcagc agccagacgc atctgcacaa atacctggtg 1440

gtctatcttg ggggagcaga cctcaaaggc gactataatg ccctgagtgt ctgcccccaa 1500

tatcatctca tgaaggacgc cacagctttc cacacagaac ttctcaaggc tacgcagagc 1560

atgtcagtga agaaacgctc acaagcctgc catgatagct gttcaccctt gtagtccacc 1620

cgggggaata gagactctga agccttccta ctctcccttc cagtgacaaa tgctgtgtga 1680

cgactctgaa atgtgtggga gaggctgtgt ggaggtagtg ctatgtacaa acttgcttta 1740

aaactggagt ttgcaaagtc aacctgagca tacacgcctg aggctagtca ttggctggat 1800

ttatgaagac aacacagtta cagacaataa tgagtgggac ctacatttgg gatataccca 1860

aagctgggta atgattatca ctgagaacca cgcactctgg ccatgaggta atacggcact 1920

tccctgtcag gctgtctgtc aggttgggtc tgtcttgcac tgcccatgct ctatgctgca 1980

cgtagaccgt tttgtaacat tttaatctgt taatgaataa tccgtttggg aggctctcac 2040

taatgtgtag cttcctaaga gaagaagcct 2070

<210> 10

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Leu Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Ala Ser Cys Arg Ser Ala Leu

1 5 10 15

Pro Arg Glu Pro Thr Val Gln Cys Gly Ser Glu Thr Gly Pro Ser Pro

20 25 30

Glu Trp Met Leu Gln His Asp Leu Ile Pro Gly Asp Leu Arg Asp Leu

35 40 45

Arg Val Glu Pro Val Thr Thr Ser Val Ala Thr Gly Asp Tyr Ser Ile

50 55 60

Leu Met Asn Val Ser Trp Val Leu Arg Ala Asp Ala Ser Ile Arg Leu

65 70 75 80

Leu Lys Ala Thr Lys Ile Cys Val Thr Gly Lys Ser Asn Phe Gln Ser

85 90 95

Tyr Ser Cys Val Arg Cys Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Gln Thr Gln Thr

100 105 110

Arg Pro Ser Gly Gly Lys Trp Thr Phe Ser Tyr Ile Gly Phe Pro Val

115 120 125

Glu Leu Asn Thr Val Tyr Phe Ile Gly Ala His Asn Ile Pro Asn Ala

130 135 140

Asn Met Asn Glu Asp Gly Pro Ser Met Ser Val Asn Phe Thr Ser Pro

145 150 155 160

Gly Cys Leu Asp His Ile Met Lys Tyr Lys Lys Lys Cys Val Lys Ala

165 170 175

Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Ala Cys Lys Lys Asn Glu Glu

180 185 190

Thr Val Glu Val Asn Phe Thr Thr Thr Pro Leu Gly Asn Arg Tyr Met

195 200 205

Ala Leu Ile Gln His Ser Thr Ile Ile Gly Phe Ser Gln Val Phe Glu

210 215 220

Pro His Gln Lys Lys Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Pro Val Thr

225 230 235 240

Gly Asp Ser Glu Gly Ala Thr Val Gln Leu Thr Pro Tyr Phe Pro Thr

245 250 255

Cys Gly Ser Asp Cys Ile Arg His Lys Gly Thr Val Val Leu Cys Pro

260 265 270

Gln Thr Gly Val Pro Phe Pro Leu Asp Asn Asn Lys Ser Lys Pro Gly

275 280 285

Gly Trp Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Val Trp Val Leu

290 295 300

Ala Ala Gly Ile Tyr Leu Thr Trp Arg Gln Gly Arg Ser Thr Lys Thr

305 310 315 320

Ser Phe Pro Ile Ser Thr Met Leu Leu Pro Leu Ile Lys Val Leu Val

325 330 335

Val Tyr Pro Ser Glu Ile Cys Phe His His Thr Val Cys Arg Phe Thr

340 345 350

Asp Phe Leu Gln Asn Tyr Cys Arg Ser Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp

355 360 365

Gln Lys Lys Lys Ile Ala Glu Met Gly Pro Val Gln Trp Leu Thr Thr

370 375 380

Gln Lys Gln Ala Ala Asp Lys Val Val Phe Leu Leu Pro Ser Asp Val

385 390 395 400

Pro Thr Leu Cys Asp Ser Ala Cys Gly His Asn Glu Gly Ser Ala Arg

405 410 415

Glu Asn Ser Gln Asp Leu Phe Pro Leu Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser

420 425 430

Asp Phe Ser Ser Gln Thr His Leu His Lys Tyr Leu Val Val Tyr Leu

435 440 445

Gly Gly Ala Asp Leu Lys Gly Asp Tyr Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro

450 455 460

Gln Tyr His Leu Met Lys Asp Ala Thr Ala Phe His Thr Glu Leu Leu

465 470 475 480

Lys Ala Thr Gln Ser Met Ser Val Lys Lys Arg Ser Gln Ala Cys His

485 490 495

Asp Ser Cys Ser Pro Leu

500

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggccttgctt gcatattgtt ccac 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtctggtctt cgatgaccta ttgcc 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctcgactag agcttgcgga 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagttaggag ctaaagcggt caggc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaacccctg gacatgaagg tt 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggccagtga tgacaggctt a 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctacatgac acgttcatca ggatg 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtaaatcct ggcttggttg ctg 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggacagtcac ttgctacaca cgtt 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagtgaccac cacccttacc ttg 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctgaggcag cattgcttga ac 22

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gggagttatt cctatgtcat ggcca 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaatcagcct tcatagtcaa gccct 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcgtcaagac aagtgtggca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgacagacgg tgtgatggaa 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acacagtcta tttcattggg gc 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caggcactgt cacaaagggt 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tcaccatctt ccaggagcga ga 22

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gaaggccatg ccagtgagct t 21

Claims

1.一种IL17RB基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第22-287位的核苷酸序列替换至非人动物IL17RB基因座。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列替换至非人动物IL17RB基因座。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的替换至非人动物IL17RB基因座为替换非人动物IL17RB基因中编码SEQ ID NO：1第22-284位的核苷酸序列，或者替换非人动物与NCBI登录号为NC_000080.7的第29720048至29728828位所示序列相同的核苷酸序列，所述的非人动物为小鼠或大鼠。

4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人源化IL17RB蛋白，同时内源IL17RB蛋白的表达降低或缺失，所述的人源化IL17RB蛋白包含SEQID NO：10所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL17RB基因，所述的人源化IL17RB基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第22-287位的核苷酸序列或包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.一种IL17RB基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第22-287位的核苷酸序列或包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQID NO：4所示。

8.一种人源化IL17RB蛋白，其特征在于，所述的人源化IL17RB蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：10所示。

9.一种编码权利要求8所述人源化IL17RB蛋白的人源化IL17RB基因，其特征在于，所述的人源化IL17RB基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

10.权利要求1-6任一所述的构建方法获得的IL17RB基因人源化的非人动物、权利要求8所述的人源化IL17RB蛋白或者权利要求9所述的人源化IL17RB基因的应用，其特征在于，所述的应用为非疾病诊断、非疾病治疗目的，所述的应用包括：