CN113388640A

CN113388640A - Ccr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN113388640A
Application number: CN202110655448.7A
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 郭朝设; 张美玲; 黄蕤; 白阳; 赵磊
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113388640B

Abstract

本发明提供了一种CCR4基因人源化的非人动物的构建方法和在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CCR4蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CCR4蛋白，可以作为人CCR4信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化CCR4基因、一种人源化CCR4蛋白、一种靶向载体。

Description

CCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

CC趋化因子受体4(C-C Motif Chemokine Receptor 4，CDR4)是GPCR家族成员之一，近来被命名为CD194，主要配体有胸腺激活调节趋化因子(TARC/CCL17)、巨噬细胞的趋化因子(MDC/CCL22)、RANTES、MCP-1和MIP-1α。CCR4主要表达在T细胞的几个亚群中如Th2、Treg、Th17和Th22，同时在血小板表面也有表达。和CCR4相关的疾病主要是自身免疫病如哮喘、皮炎和T细胞淋巴瘤。在研的CCR4的拮抗剂包括小分子化合物和抗体，其中协和麒麟的CCR4抗体药Mogamulizumab(强ADCC)于2012年在日本首次被批准用于治疗其它恶性血液肿瘤，并于2014年被批准用于治疗CTCL(Lymphoma,cutaneous T cell)。CCR4抗体治疗肿瘤主要有2种方式：肿瘤表达CCR4，利用抗体的ADCC效应直接杀伤肿瘤；肿瘤表达CCR4配体，招募表达CCR4的Treg，利用抗体清除Treg解除免疫抑制。CCR4在肿瘤或哮喘等自身免疫病中可以作为诊断的生物标记，或可作为肿瘤细胞的靶点。

正常机体内CCR4主要表达在辅助性Th2细胞表面，单核细胞和成熟DC细胞表面也有表达。肿瘤细胞，特别是成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞，可能为CCR4阳性。肿瘤细胞表达CCR4与皮肤相关联。一些T细胞恶性肿瘤典型地定位在皮肤上。例如，在皮肤T细胞淋巴瘤病变中发现高水平的CCR4。最近，已经发现一些实体瘤(如宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌)同样表达CCR4。因此，血液癌细胞和非血液癌细胞都可以表达CCR4。因此，CCR4可以认为是抗肿瘤药物作用的重要靶点，并且可以作为肿瘤预后指标辅助临床用药，为治疗该方案确定、疗效评估和预后提供重要依据。

鉴于CCR4信号通路在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域亟需开发涉及CCR4信号通路的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CCR4基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR4蛋白。

优选的，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4基因2号外显子编码的氨基酸的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的胞外区的全部或部分。其中，所述的人源化CCR4蛋白包含一个或两个以上单次跨膜结构中的胞外区的全部或部分。所述的两个以上包含两个、三个或四个以上。

优选的，所述的非人动物的内源CCR4蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物包含人源化CCR4基因。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的部分。进一步优选的，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含1号外显子和/或2号外显子。再进一步优选的，包含2号外显子的部分，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含与SEQ ID NO：8或9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8或9所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含编码人CCR4蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR4基因包含编码人CCR4蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。其中，所述的人源化CCR4蛋白包含一个或两个以上单次跨膜结构中的胞外区的全部或部分。所述的两个以上包含两个、三个或四个以上。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含编码与SEQ ID NO：4具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列一致的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR4基因还包含非人动物CCR4基因的部分。优选为1号外显子。更优选还包含2号外显子的非编码区。

优选的，人CCR4基因的部分或者人源化CCR4基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)所述人源化CCR4蛋白中来源于人CCR4蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

b)所述人源化CCR4蛋白中来源于人CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)所述人源化CCR4蛋白中来源于人CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)所述人源化CCR4蛋白中来源于人CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3第99-1181位所示核苷酸序列的全部或部分；

B)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3第99-1181位所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3第99-1181位所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

D)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3第99-1181位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

a)所述人源化CCR4蛋白中来源于非人动物CCR4蛋白的氨基酸序列包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的部分；

b)所述人源化CCR4蛋白中来源于非人动物CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ IDNO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)所述人源化CCR4蛋白中来源于非人动物CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ IDNO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)所述人源化CCR4蛋白中来源于非人动物CCR4蛋白的氨基酸序列包含与SEQ IDNO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

A)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的全部或部分；

B)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

D)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ IDNO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

(i)包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)包含与SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)包含与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(iv)包含与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含人PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2基因中的一种或两种以上的组合。

本发明的第二方面，提供了一种上述的CCR4基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR4蛋白。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CCR4基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。进一步优选的，用包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上。更进一步优选的，用包含人CCR4基因的1号外显子和/或2号外显子插入或替换至非人动物CCR4基因座上。再进一步优选的，用包含人CCR4基因的2号外显子的部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。最为优选的，用包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含人源化CCR4基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CCR4基因的cDNA序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化CCR4蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。进一步优选的，用包含编码与SEQ ID NO：4具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者编码包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因。

优选的，所述的插入或替换的位点为CCR4基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CCR4基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源CCR4基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CCR4基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源CCR4蛋白不能正常表达。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CCR4基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CCR4蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人CCR4基因的部分。

优选的，所述的供体DNA序列包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含人CCR4基因的1号外显子和/或2号外显子核苷酸序列。更进一步优选的，包含人CCR4基因的2号外显子的部分核苷酸序列，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。再进一步优选的，包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂(5’同源臂)，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。和/或，优选的，所述的CCR4基因靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂(3’同源臂)，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者包含SEQID NO：6所示的核苷酸序列。

优选的，所述靶向载体的待改变的转换区位于非人动物CCR4基因座上。进一步优选的，位于非人动物CCR4基因的1号至2号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物CCR4基因的2号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CCR4基因人源化的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向CCR4基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CCR4基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CCR4基因上的靶序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCR4基因的1号外显子至2号外显子序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCR4基因的1号外显子、1-2号内含子和/或2号外显子序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCR4基因的2号外显子序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向CCR4基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CCR4基因人源化的非人动物。

本发明的第三方面，提供了一种人源化CCR4蛋白，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4基因2号外显子编码的氨基酸的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

本发明的第四方面，提供了一种人源化CCR4基因，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的部分。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号外显子和/或2号外显子。更进一步优选的，包含2号外显子的部分，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。

优选的，所述的人源化CCR4基因包含编码人CCR4蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码上述的人源化CCR4蛋白的核苷酸序列。

(i)包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

优选的，所述的人源化CCR4基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第五方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人CCR4基因的部分。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。和/或，优选的，所述的CCR4基因靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第六方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CCR4基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CCR4基因上的靶序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCR4基因的2号外显子序列上。

本发明的第七方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

本发明的第八方面，提供了一种包含上述sgRNA或者上述DNA分子的sgRNA载体。

本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体、sgRNA、DNA分子和/或sgRNA载体的细胞。

本发明的第十方面，提供了上述靶向载体，sgRNA，DNA分子，sgRNA载体或者上述的包含靶向载体、sgRNA、DNA分子或sgRNA载体的细胞在CCR4基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第十一方面，提供了一种多基因修饰的非人动物，所述的非人动物为上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，且所述的非人动物基因组中包含基因PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2中的一种或两种以上的组合的修饰。

本发明的第十二方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

(一)提供上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十三方面，提供了一种上述构建方法获得的多基因修饰的非人动物或其子代。

本发明的第十四方面，提供了一种CCR4基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失CCR4基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物缺失CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分包含从2号外显子的起始密码子开始至终止密码子为止。

在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建CCR4基因缺失的非人动物。

本发明的第十五方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型，所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十六方面，提供一种动物的荷瘤或炎症模型的构建方法，所述的构建方法包含获得上述的非人动物的步骤。

本发明的第十七方面，提供上述非人动物、上述构建方法获得的非人动物在制备动物的荷瘤或炎症模型中的应用。

本发明的第十八方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。

本发明的第十九方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或炎症模型。

本发明的第二十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或上述的荷瘤或炎症模型。

本发明的第二十一方面，提供一种CCR4基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CCR4蛋白。优选的，所述的细胞表达上述的人源化CCR4蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CCR4基因的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化CCR4基因。

优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。

本发明的第二十二方面，提供一种CCR4基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CCR4基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分包含从2号外显子的起始密码子开始至终止密码子为止。

在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建CCR4基因缺失的细胞。

优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。

本发明的第二十三方面，提供了一种表达上述的人源化CCR4蛋白的构建体。

本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。

本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的人源化CCR4蛋白、上述的人源化CCR4基因、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR4通路功能、人CCR4通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

本发明的第二十七方面，提供了一种人CCR4特异性调节剂的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自权利要求1-13和42任一所述的非人动物、权利要求14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物或者权利要求45所述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人CCR4特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十八方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十九方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人CCR4特异性调节剂中的用途。

本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途。

本发明所述的CCR4基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化CCR4蛋白，可用于针对人CCR4通路靶位点的药物筛选、药效评估、自身免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CCR4蛋白”，包含来源于人CCR4蛋白的部分和非人CCR4蛋白的部分。其中，所述的“人源化CCR4蛋白”包含连续或间隔的5-360个氨基酸序列与人CCR4蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化CCR4基因”，包含来源于人CCR4基因的部分和非人CCR4基因的部分。其中，所述的“人源化CCR4基因”包含连续或间隔的20-4794bp个核苷酸序列与人CCR4基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20-3025、20-1178或20-1083bp个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1083、1100、1178、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或3025bp个核苷酸序列与人CCR4基因的核苷酸序列一致。

本发明所述的“1号至2号外显子”或“1号至2号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，即1号外显子、1-2号内含子和2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CCR4基因座”表示CCR4基因1号至2号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CCR4基因座可以是CCR4基因1号至2号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

项1，一种CCR4基因人源化的非人动物，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR4蛋白。

项2，根据项1所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的全部或部分。

项3，根据项1或2所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4基因2号外显子编码的氨基酸的全部或部分。

项4，根据项1-3任一所述的非人动物，其特征在于，所述的非人动物的内源CCR4蛋白表达降低或缺失。

项5，根据项1-4任一所述的非人动物，其特征在于，所述的非人动物包含人源化CCR4基因，优选的，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的部分；进一步优选的，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分；更进一步优选的，包含1号外显子和/或2号外显子；再进一步优选的，包含2号外显子的部分，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。

项6，根据项5所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含与SEQ IDNO：8或9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8或9所示的核苷酸序列。

项7，根据项5或6所述的非人动物，其特征在于，人CCR4基因的部分或者人源化CCR4基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。

项8，根据项1-7任一所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

项9，根据项5-8任一所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

项10，根据项1-9任一所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

项11，根据项5-10任一所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

项12，根据项1-11任一所述的非人动物，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

项13，根据项5-12任一所述的非人动物，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

项14，一种项1-13任一所述的CCR4基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR4蛋白。

项15，根据项14所述的构建方法，其特征在于，包括用包含人CCR4基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上；优选的，用包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上；进一步优选的，用包含人CCR4基因的2号外显子的部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；再进一步优选的，用包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

项16，根据项14或15所述的构建方法，其特征在于，包括用包含人源化CCR4基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

项17，根据项14-16任一所述的构建方法，其特征在于，包括用包含人CCR4基因的cDNA序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上。

项18，根据项14-17任一所述的构建方法，其特征在于，包括用包含编码人或人源化CCR4蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上；优选的，用包含编码SEQID NO：4所示氨基酸具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者用编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因。

项19，根据项14-18任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人CCR4基因的部分；优选的，包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含人CCR4基因的2号外显子的部分核苷酸序列，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；再进一步优选的，包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

项20，根据项19所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQID NO：5至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；和/或，所述的CCR4基因靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

项21，根据项14-20任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

项22，一种人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4蛋白的全部或部分。

项23，根据项22所述的人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白包含人CCR4基因2号外显子编码的氨基酸的全部或部分。

项24，根据项22或23所述的人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

项25，根据项22-24任一所述的人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的人源化CCR4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

项26，根据项22-25任一所述的人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

项27，一种人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的部分。

项28，根据项27所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分；优选的，包含1号外显子和/或2号外显子；进一步优选的，包含2号外显子的部分，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止。

项29，根据项27或28所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含编码人CCR4蛋白的核苷酸序列。

项30，根据项27-29任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含与SEQ ID NO：8或9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8或9所示的核苷酸序列。

项31，根据项27-30任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

项32，根据项27-31任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

项33，根据项32所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

项34，根据项27-33任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

项35，一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人CCR4基因的部分。

项36，根据项35所述的靶向载体，其特征在于，所述靶向载体包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含人CCR4基因的1号外显子和/或2号外显子核苷酸序列；进一步优选的，包含人CCR4基因的2号外显子的部分核苷酸序列，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；更进一步优选的，包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

项37，根据项35或36所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：5至少具有90％同源性，或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；和/或，所述的CCR4基因靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：6至少具有90％同源性，或者包含SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。

项38，根据项37所述的靶向载体，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

项39，根据项35-38任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含标记基因。

项40，一种包含项35-39任一所述靶向载体的细胞。

项41，项35-39任一所述靶向载体或者项40所述的细胞在CCR4基因修饰中的应用。

项42，一种多基因修饰的非人动物，其特征在于，所述的非人动物为项1-13任一所述的非人动物或项14-21任一所述的构建方法获得的非人动物，且所述的非人动物基因组中包含基因PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2中的一种或两种以上的组合的修饰。

项43，一种多基因修饰的非人动物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)提供项1-13任一所述的非人动物或项14-21任一所述的构建方法获得的非人动物；

项44，根据项43所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

项45，一种动物的荷瘤或炎症模型，其特征在于，所述的荷瘤或炎症模型来源于项1-13和42任一所述的非人动物或项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物。

项46，一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于项1-13和42任一所述的非人动物、项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物或项45所述的荷瘤或炎症模型。

项47，一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于项1-13和42任一所述的非人动物、项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物或项45所述的荷瘤或炎症模型。

项48，一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织来源于项1-13和42任一所述的非人动物、项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物或项45所述的荷瘤或炎症模型。

项49，一种CCR4基因人源化的细胞，其特征在于，所述的细胞表达人或人源化CCR4蛋白；优选的，所述的细胞表达项22-26任一所述的人源化CCR4蛋白。

项50，根据项49所述的细胞，其特征在于，所述的细胞的基因组中包含人CCR4基因的部分；优选的，所述的细胞包含项27-34任一所述的人源化CCR4基因。

项51，一种表达项22-26任一所述的人源化CCR4蛋白的构建体。

项52，一种包含项51所述构建体的细胞。

项53，一种包含项52所述细胞的组织。

项54，来源于项1-13和42任一所述的非人动物、项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物、项22-26任一所述的人源化CCR4蛋白、项27-34任一所述的人源化CCR4基因、项45所述的荷瘤或炎症模型、项46所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、项47所述的组织或器官或其培养物、项48所述的荷瘤后的瘤组织、项49-50任一所述的细胞、项51所述的构建体、项52所述的细胞或项53所述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR4通路功能、人CCR4通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

项55，一种人CCR4特异性调节剂的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自项1-13和42任一所述的非人动物、项14-21和43-44任一所述的构建方法获得的非人动物或者项45所述的荷瘤或炎症模型。

项56，根据项55所述的筛选方法，其特征在于，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。

项57，一种人源化CCR4蛋白，其特征在于，所述的蛋白由项27-34任一项所述的基因编码。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠CCR4基因座和人CCR4基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠CCR4基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3：CCR4基因打靶策略及靶向A片段设计示意图(非按比例)；

图4：CCR4重组后Southern blot结果，其中WT为野生型对照，1-A01、1-G02、2-B05、2-D04为细胞编号；

图5：人源化CCR4小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图6：CCR4人源化小鼠F1代基因型鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照；

图7：流式检测CCR4基因人源化纯合小鼠体内CCR4蛋白的表达；

图8：CCR4基因的RT-PCT检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

NdeI、EcoRI、BglII酶购自NEB，货号分别为R0111、R0101、R0144；

Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4购自Sigma，货号L2630；

Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，型号AttuneNxt；

PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA，型号6110A；

Heraeus^TMFresco^TM21Microcentrifuge购自Thermo Fisher，型号Fresco 21；

PE/Cy^TM7anti-mouse/ratFoxp3(mFOXP3-PE-Cy7)购自eBioscience，货号25-5773-82；

PE anti-human CD194(CCR4)Antibody(hCCR4-R-PE)购自eBioscience，货号359411；

PE anti-mouse CD194(CCR4)Antibody(mCCR4-R-PE)购自eBioscience，货号131203。

实施例1 CCR4基因人源化小鼠

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人或人源化CCR4蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化CCR4蛋白。小鼠CCR4基因(NCBI Gene ID：12773，Primary source：MGI：107824，UniProt ID：P51680；位于9号染色体NC_000075.6的第114490316至114505476位，基于转录本NM_009916.2(SEQ IDNO：1)及其编码蛋白NP_034046.2(SEQ ID NO：2))和人CCR4基因(NCBI Gene ID：1233，Primary source：HGNC:1605，UniProt ID：P51679，位于3号染色体NC_000003.12的第32951555至32956349位，基于转录本NM_005508.5(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_005499.1(SEQ ID NO：4))，小鼠CCR4基因座与人CCR4基因座对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CCR4基因座引入编码人CCR4蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CCR4蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术将小鼠CCR4基因的2号外显子1083bp核苷酸序列用对应的人CCR4基因的2号外显子1083bp核苷酸序列替换，得到人源化CCR4基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠CCR4基因的人源化改造。

其中，本实施例以人CCR4基因的SEQ ID NO：7替换小鼠相应区域，但是事实上来源于人CCR4基因的核苷酸序列还可以包含SEQ ID NO：7两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的核苷酸序列，所述的相同或相似的核苷酸序列可以来自非编码区，获得的人源化改造小鼠依然可以表达人源化CCR4蛋白，且该人源化CCR4蛋白具有结合人相应抗体的功能。

如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠CCR4基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CCR4核苷酸序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000075.6的第114492996至114496144位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000075.6的第114486610至114489960位核苷酸序列相同；A片段上包含人CCR4基因的2号外显子部分序列的基因组DNA序列(SEQ ID NO：7)，该DNA序列与NCBI登录号为NC_000003.12的第32953423至32954505位核苷酸序列相同；A片段中人CCR4 DNA片段上游与小鼠CCR4基因的连接设计为

(SEQ ID NO：8)，其中序列“CAAAG”中的“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“

”中的第一个“a”是人的第一个核苷酸；人CCR4 DNA片段下游与小鼠CCR4基因的连接设计为

(SEQ ID NO：9)，其中序列“tgtag”中的最后一个“g”是人的最后一个核苷酸，序列“

”中的第一个“

”是小鼠的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为

(SEQ ID NO：10)，其中序列“GTTGT”中的最后一个“T”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“

”中的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为

(SEQ IDNO：11)，其中序列“AATTC”中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“

”中的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CCR4的mRNA序列如SEQ IDNO：12所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用NdeI或EcoRI或BglII消化细胞DNA并使用4个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果如图4所示，检测结果表明4个经PCR验证为阳性的克隆，经测序发现4个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1-A01、1-G02、2-B05、2-D04。

表1：具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				NdeI	5’Probe	10.9kb	8.3kb
EcoRI	3’Probe	6.8kb	5.1kb
				BglII	Neo Probe(3’)	—	6.2kb

其中，PCR测定包括下述引物：

F1：5’-TCCGGGTGTTAGAAATTGAAGCCGT-3’(SEQ ID NO：13)，

Mut-R：5’-AAGGCTTGGGGATACTTTCATACAGA-3’(SEQ ID NO：14)；

F2：5’-CAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’(SEQ ID NO：15)，

R2：5’-AGCCCAGTTCCATCTCCTTTTGTGT-3’(SEQ ID NO：16)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-TTTTGTCAAGAAGCCCCACATGGGT-3’(SEQ ID NO：17)，

5’Probe-R：5’-GGGCACTTACATATTTGCAGGCAAAAC-3’(SEQ ID NO：18)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-CTGAGATGACAGGTCGTATCCACTG-3’(SEQ ID NO：19)，

3’Probe-R：5’-GGGTTTAGAGGTGTGTGTTTCTGTC-3’(SEQ ID NO：20)；

Neo探针(Neo Probe(3’))：

Neo Probe(3’)-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：21)，

Neo Probe(3’)-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：22)。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化CCR4基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01的小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化CCR4基因工程小鼠。

表2：引物名称及具体序列

提取野生型C57BL/6小鼠和人源化CCR4纯合小鼠脾，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，利用引物mCCR4-RT-PCR-F：5’-TGACTTCCGTGACGCTTTGT-3’(SEQIDNO：30)和mCCR4-RT-PCR-R：5’-CTACGCTTGTAACCAGGCTT-3’(SEQIDNO：31)扩增大小为380bp的鼠CCR4片段；

利用引物hCCR4-RT-PCR-F：5’-TTGGGGCTACTATGCAGCAG-3’(SEQIDNO：32)，和hCCR4-RT-PCR-R：5’-TGCGTGTAAGATGAGCTGGG-3’(SEQIDNO：33)扩增大小为765bp的人CCR4片段。

利用引物hGAPDH-RT-PCR-F：5’-TTGGGGCTACTATGCAGCAG-3’(SEQIDNO：34)，和hGAPDH-RT-PCR-R：5’-TGCGTGTAAGATGAGCTGGG-3’(SEQIDNO：35)扩增大小为123bp的GAPDH片段。

实验结果显示(见图8)，野生型C57BL/6小鼠中仅检测到鼠CCR4 mRNA表达，人源化CCR4纯合子小鼠中可检测到人CCR4的mRNA表达。

实施例2 CCR4基因人源化小鼠体内CCR4蛋白表达检测

分别选取6周龄野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的CCR4基因人源化纯合小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏，用抗鼠CCR4抗体mCCR4-R-PE、抗鼠FOXP3抗体mFOXP3-PE-Cy7或抗人CCR4抗体hCCR4-R-PE识别染色后进行流式检测。结果如图7所示，在野生型C57BL/6小鼠体内能够检测到鼠CCR4蛋白，检测不到人CCR4蛋白；在CCR4基因人源化纯合小鼠体内，只检测到人CCR4蛋白，不能检测到鼠CCR4蛋白。

实施例3双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的CCR4小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CCR4小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CCR4与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CCR4小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化CCR4与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CCR4和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CCR4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

<130> 1

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2787

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggcattgctt catagactgt cctcaggatc actttcagaa gagcaaggca gctcaactgt 60

tctcattggc ttctcctgct ggtacccgga gcgcgacgat tccaaagatg aatgccacag 120

aggtcacaga caccacccag gatgaaactg tgtacaatag ttattacttc tacgaaagca 180

tgccaaagcc ttgcaccaag gaaggtatca aggcatttgg ggaggtcttc ctgcctcctc 240

tctactcctt ggtcttcttg ttgggtctgt ttggaaattc tgttgtggtt ctggtcctgt 300

tcaaatacaa gaggctcaag tccatgacgg acgtgtacct gctgaacctg gccatctcgg 360

atttgctgtt cgtcctgtcc ctcccattct ggggctacta cgccgccgac cagtgggttt 420

ttggactagg tctgtgcaag atcgtttcat ggatgtacct ggtgggcttc tacagcggca 480

tcttcttcat catgctcatg agcatagaca gatacctggc catcgtgcac gcggtattct 540

ccttgaaggc aaggaccctg acctatggcg tcatcaccag cctgatcacg tggtcagtgg 600

ctgtgtttgc ctccctccca ggcctcttgt tcagcacttg ctacacagag cacaaccaca 660

cgtactgcaa aacccagtac tcggtcaact cgacgacgtg gaaagtcctc agctccctgg 720

agatcaacgt cctggggctg cttatccccc tgggcatcat gctgttttgt tattccatga 780

tcattaggac tctgcaacac tgcaagaatg agaagaagaa cagagcagtg cgcatgatct 840

tcgccgtggt ggtcctcttc ctcggcttct ggacgccgta caacgtggtg cttttcctgg 900

agacgctggt ggagcttgaa gtccttcagg actgcacctt ggagaggtac ctagactacg 960

ccatccaggc tacagaaacc ctggccttca ttcactgctg ccttaacccc gtcatttact 1020

tctttctcgg ggagaaattc cgcaagtaca tcacccaact cttcagaaca tgccggggtc 1080

ccctcgtgct ctgcaaacac tgtgacttcc tccaggtcta ctcggctgac atgtccagct 1140

cctcttacac gcagtccact gtggatcatg acttccgtga cgctttgtaa ggtgtgagtg 1200

ggggtaacat ggcgttaaca agctccacac acccagcacc tgctcgcctt gtttcagtca 1260

gggtgccctg aacagggctc tgaggaagaa aacaagtaaa accaagacca tggcaagatg 1320

gcttctcacc ctgcaggtgg ctcccaagag gttcagagcc ctgctgggtg gaggaaatca 1380

ccccttcatg acaatgagcc cttgagtgga tctctagttt tgttgaacta cctagaattc 1440

ttggacatgc tgtattccat aaagccagat gtctggagaa atgaggatct gacatcttga 1500

ttctcttatt atagaggatg cttcattgaa gcctggttac aagcgtagag ataagggtgt 1560

tgggacaatc ccttctccac ttaacacaag gtgtgtagaa cacacatcgg ttgaaatgtc 1620

cgtgcagttt ggctttctgg tatgttttaa ttgtgatagg tgtttgttca gcttgtagaa 1680

gaagctcgtc ggtgcagaga agggtgaaat gcccttgtaa ttctagctac tccggggata 1740

aggccaagag atcttagatt caaggatggc ctggacaata cagtgaaagc ctgtccccaa 1800

accaaaccaa accaaaccca aacccaaatc aaaaccaaat gaaaggcaag caatacccca 1860

aaagttagct ctgaaatgct cttgtgagca ccctaagttc atctttcttt tcattttctt 1920

ttatttacgc cttctctttc cttctccttc ttctttctcc ttcttcttgt cctccttctt 1980

tcttctcctc cttctttctt cttttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 2040

tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttctaactg ttattgggta 2100

ttgggcatgg tggaggcaga ggcaggagta tctctgagtt cgaggccagc ctggtctaca 2160

aatctagttc caggacagat agggctacac agagaaaccc tgtcttgcag aaacaaacaa 2220

acaaacaagc aagcaaacaa acaaatgtaa actggatgag cctgtggtgg gcacaccttt 2280

aatcccagcg ctcgacaggc caggcaggtg gatttctgta agtcgaggcc agcctggtct 2340

acagagctag ttccagacca gccaaggcta tttagtgaga ctttgtcttg aaaagaaagg 2400

aggaaagaaa gaaaatagta aatgtattaa taaagtatga caatattcct ttaatcactt 2460

taaagggtca tgtcaactac tgagacacaa ataatcactt aaaaatcatt ataggtaggg 2520

tgttaaaata actatcaaat tatgaagttg taaaaaacat cctttgtaaa atattggctc 2580

cagtttctga atattagttg tattaaaagt tagaacagtt agggcatgac ggtactcacc 2640

tttaatttca gcactccaga ggccagggga ggagttcaag tctcgcctgg tctacagcat 2700

gagctccagg acagataaca ttagaacagt tattcttacg ttatcttaat tgtttaatgt 2760

gttagatcat taaagttatt tgctaag 2787

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Asn Ala Thr Glu Val Thr Asp Thr Thr Gln Asp Glu Thr Val Tyr

1 5 10 15

Asn Ser Tyr Tyr Phe Tyr Glu Ser Met Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu

20 25 30

Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Val Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu

35 40 45

Val Phe Leu Leu Gly Leu Phe Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu

50 55 60

Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn

65 70 75 80

Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ser Leu Pro Phe Trp Gly

85 90 95

Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Ile

100 105 110

Val Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Ile

115 120 125

Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe

130 135 140

Ser Leu Lys Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ile

145 150 155 160

Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Leu Leu Phe Ser

165 170 175

Thr Cys Tyr Thr Glu His Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Gln Tyr Ser

180 185 190

Val Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Val

195 200 205

Leu Gly Leu Leu Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met

210 215 220

Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Arg Ala

225 230 235 240

Val Arg Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr

245 250 255

Pro Tyr Asn Val Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val

260 265 270

Leu Gln Asp Cys Thr Leu Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala

275 280 285

Thr Glu Thr Leu Ala Phe Ile His Cys Cys Leu Asn Pro Val Ile Tyr

290 295 300

Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Thr Gln Leu Phe Arg

305 310 315 320

Thr Cys Arg Gly Pro Leu Val Leu Cys Lys His Cys Asp Phe Leu Gln

325 330 335

Val Tyr Ser Ala Asp Met Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Val

340 345 350

Asp His Asp Phe Arg Asp Ala Leu

355 360

<210> 3

<211> 3025

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ggcattgcct cacagacctt cctcagagcc gctttcagaa aagcaagctg cttctggttg 60

ggcccagacc tgccttgagg agcctgtaga gttaaaaaat gaaccccacg gatatagcag 120

acaccaccct cgatgaaagc atatacagca attactatct gtatgaaagt atccccaagc 180

cttgcaccaa agaaggcatc aaggcatttg gggagctctt cctgccccca ctgtattcct 240

tggtttttgt atttggtctg cttggaaatt ctgtggtggt tctggtcctg ttcaaataca 300

agcggctcag gtccatgact gatgtgtacc tgctcaacct tgccatctcg gatctgctct 360

tcgtgttttc cctccctttt tggggctact atgcagcaga ccagtgggtt tttgggctag 420

gtctgtgcaa gatgatttcc tggatgtact tggtgggctt ttacagtggc atattctttg 480

tcatgctcat gagcattgat agatacctgg caattgtgca cgcggtgttt tccttgaggg 540

caaggacctt gacttatggg gtcatcacca gtttggctac atggtcagtg gctgtgttcg 600

cctcccttcc tggctttctg ttcagcactt gttatactga gcgcaaccat acctactgca 660

aaaccaagta ctctctcaac tccacgacgt ggaaggttct cagctccctg gaaatcaaca 720

ttctcggatt ggtgatcccc ttagggatca tgctgttttg ctactccatg atcatcagga 780

ccttgcagca ttgtaaaaat gagaagaaga acaaggcggt gaagatgatc tttgccgtgg 840

tggtcctctt ccttgggttc tggacacctt acaacatagt gctcttccta gagaccctgg 900

tggagctaga agtccttcag gactgcacct ttgaaagata cttggactat gccatccagg 960

ccacagaaac tctggctttt gttcactgct gccttaatcc catcatctac ttttttctgg 1020

gggagaaatt tcgcaagtac atcctacagc tcttcaaaac ctgcaggggc ctttttgtgc 1080

tctgccaata ctgtgggctc ctccaaattt actctgctga cacccccagc tcatcttaca 1140

cgcagtccac catggatcat gatctccatg atgctctgta gaaaaatgaa atggtgaaat 1200

gcagagtcaa tgaactttcc acattcagag cttacttaaa attgtatttt agtaagagat 1260

tcctgagcca gtgtcaggag gaaggcttac acccacagtg gaaagacagc ttctcatcct 1320

gcaggcagct ttttctctcc cactagacaa gtccagcctg gcaagggttc acctgggctg 1380

aggcatcctt cctcacacca ggcttgcctg caggcatgag tcagtctgat gagaactctg 1440

agcagtgctt gaatgaagtt gtaggtaata ttgcaaggca aagactattc ccttctaacc 1500

tgaactgatg ggtttctcca gagggaattg cagagtactg gctgatggag taaatcgcta 1560

ccttttgctg tggcaaatgg gccctctaat taatttcttg cttttgcgga acaatataga 1620

taactgtttt tctaataaca tatctcaggc aaagtatatt ccattgagcc agatgtatga 1680

agaaacaatt agcgaagtga tgaaaccaga tctcaattat ttattgtaaa ggattatctg 1740

ttaattgaaa ccaaactttt tatactgata taagggtaag gatatgaaga cattagccaa 1800

ggtctgcttt ccaaacgtga actacaaggc attcaaaatc caaacatatt tatgaaaatt 1860

caaacacagt ttctcacttg tttgtggaca tgttttgttc taattttaac agaggaatat 1920

taaaaaattt taaataggct gggcacggtg gcctgtaatc ccagcactgt gggaggccaa 1980

ggtgggcgga tcacctgagg tcaggagttc gagaccagcc tggccaacat ggagaaaccc 2040

tgtctctact aaaaaataca aaattagcca ggtgtggtgg cgcatgcctg taatcccagc 2100

tactcaggag gctgaggctg gagaataact tgaatccggg aggtggaggt tgcggtgagc 2160

cgagatcgcg ccattgtact ccaacctggg caaaaagagc gaaactctgt ctcaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa attaaataat acataggcca agaatacatt tatttgaggt catttacttg 2280

tttttttttt tttttttttt tttgagatgg aatcttgctc tgtcacccag tctggagtgc 2340

agtggcgcga tctcggctca ctgcaagctc tgcctcacgg gttcgcacca ttctcctgcc 2400

tcagcctccc aagtaggtgg gactacaggc acctgccccc atgcctggct aattttttgt 2460

attttcagta gagatggggt ttcaccatgt tagcaaggat ggttttaatc tcctgacctc 2520

gtgatccacc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgagc catcacgccc 2580

ggccacttgt ttatttttta ttttatttta ttttattttt gagatggagt ctcactctgt 2640

cacccaagct ggagtgcagt ggcactcggt tcactgcaaa gtctgcctcc caggttcaag 2700

cgattctcct gcctcagctt ctcaagcagc tgggattaga ggtgtgcacc actacgccag 2760

gctaattttt gtatttttag tagagatggg gtttcaccat attggccagg ctagtcttga 2820

actcctgacc tcaggtgatc tgcctgcttc agcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt 2880

gagccacctc gcccagccaa ggtcttttac ttgtttataa acagtctctt cataattaaa 2940

attaaggatt aataaagtat gacaatacct ccttaatcat tttgaagtgc ctgctatcaa 3000

ttgaaataaa aacaatcaac taaaa 3025

<210> 4

<211> 360

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr

1 5 10 15

Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu

20 25 30

Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu

35 40 45

Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu

50 55 60

Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn

65 70 75 80

Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly

85 90 95

Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met

100 105 110

Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val

115 120 125

Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe

130 135 140

Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala

145 150 155 160

Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser

165 170 175

Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser

180 185 190

Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile

195 200 205

Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met

210 215 220

Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala

225 230 235 240

Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr

245 250 255

Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val

260 265 270

Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala

275 280 285

Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr

290 295 300

Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys

305 310 315 320

Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln

325 330 335

Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met

340 345 350

Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu

355 360

<210> 5

<211> 3149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttcacactc aggcttctta atcttgctgg tgctggcctc tgtcttggag aacacacact 60

tcctacctgt ctgcaggcag gccgcctgag gcttcaccag ccaggcatcc attccggact 120

cggctcacgc cctcaagtct gacgaggact gcaaactttt ctgcttgttc cagcaaggaa 180

tatcacatac ccaggaatta cggcatcgta ggtgacttac ttacttaatt agtaattttc 240

ttttgaaatg tattttatta catttcttta tgtagtgcag gtatatatgg atgtgtgtgt 300

gtgcctatat acggagggtg cgtgtcagag ggtaatttgc gggagtctgt ttttttttct 360

accatgtgag accaaggaat taaactcagg gttaggcaga tgtctccatt tgcagagcat 420

cctcttggcc tcacttggtt ttgagagtca gatacagtgc aggctggcct caccctcagt 480

gttgctgagc atggccttga acttctggcc ttcctgcctg tgcctcagcc tctcaaatgc 540

tggcatatat atatgggcca gtagactgga ctatcctttt tgtttggcgg tttgttcttc 600

tgagcctatc ttcattcttc tgttttactg aaattttttt ccccctttaa actttactgg 660

taaaatgata gcaacacaag acagttgtta gtcactgaca agcctcccag gagactctcc 720

catgtgacaa gtcttcatca tgcttttcca aggggaaaaa aaaaaaaaaa ccaaagaaat 780

aaaatctctt ttgaaaaaac accaggggta ggggtgatgg ttcagtgggc aatgcgttcg 840

tacctaaaac acagggcctt gagctctcca gaaggtgagc aaaagccagg agtggctgtg 900

cacgcctagg acctcatagc cctccccctc ggtggagaca ccgtggagac ggataaatgg 960

gaggttcctt ggccagcctg tcttcccaaa acagagagtc ctggtattga gactgtatct 1020

caaaaaacaa ggtagagagt gatagcaaaa gacacctctg gcctccatta acacaggcac 1080

agctgaatga ccgcacacac agatgtgtgc acacgtgtac accgcatact catagaaaca 1140

gtagagtgtt caggcgtgca gaactgaagc tatggggaga gattagatgt gaattactga 1200

acaaagtgag aagggtttaa cagggactga caggatgcca cagagacagg aatcaggaag 1260

caaggggggt ggtcctgggt cgggaaatcg ctcatgccac atgtcccagg tgagtctgtg 1320

agtgagcaac tgttaaaaaa cattttcaca tgtgtatcca tgactaatgc attcattttt 1380

aaacttgatc atctacctgt gtgtctgtct atttgatttt ttttttgttt gttttttgtt 1440

ttttgttttt ttttttttga gacagggttt ctctgtgtag ccctggctgt cctggaactc 1500

actctgtaga ccaggctggc ctcgaactca gaaatccgcc tgcctctgcc tcccgagtgc 1560

tgggattaaa ggcgtgcgcc accacgcccg gcttgtctgt ctatttgaaa aagggtttct 1620

ctgtgtagct ctggctgtcc tggaactcac actgtagacc aggatggcct tggactcaga 1680

aatctgtctg cctttgcctg ggatcaaagg cgtgtggcac cacctttggc tatttattta 1740

ttttttaact aaaaaaaaaa aaaggcatat tgtatgtgtg tgtgcgcgcg cgcacacaca 1800

cacacaccac agtgccagtg tggacatcaa atgacaagag tggcacctgg ctcccacctt 1860

tttttttttt taaagattta tttatttatt atatgtaagt acactgtagc tgtcttcaca 1920

cactccagaa gagggcgtca gatcttgtta cagatggttg tgagccacca tgtggttgct 1980

gggatttgaa ctctggacct tcggaagaac agtcgggtgc tcttacccac tgagccatct 2040

caccagccct ggctcccacc ttttatcctg tgaggagtcc aagagattga atgcagattc 2100

tcaggcatag tgacaggtat cctagcccac tgacccatgt cttctgccta agttttttgt 2160

ttgtttgttt gttttaaatt tttatttatt tgtttaattt tatgtgtagg gtagttaggc 2220

tgcttgcttt gtgcatggtg ccttaggaga ccataagggg gcatcggatc ccctgaaact 2280

ggagttatag atgattgtaa gctacagtgt aggaactggg aaccaaatct gggtcctctg 2340

gggggggaag agcacccagg attcctaacc actgagccac ctctctaatc ctatctgttc 2400

cttttttgag acgaggtcta tctatataga cctggctgac ctggaactct ctataaatat 2460

aaggctggcc tcaaactcgc agagttctgc ctgtctctgc ctcctgagtg ctggattttc 2520

cttcaattct gtggtttcca ggggtcagtg aggctcagtg tcaagtgtct ttacctgata 2580

ggtcatcccg ctggccacag agaccatcca ttggaaaccc attataaact gtaccgccgg 2640

gctggtgaga tggctcagtg ggtaagagca cccgactgct cttccaaagg tccagagttc 2700

aaatcccagc aaccacatgg tggctcacaa ccatccctaa cgagatctga ctccctcttc 2760

tggagtgtct gaagacagct acagtgtact tacatataat aaataaataa atcttaaaaa 2820

aaaaaaaata aaaaaaaaaa aataaactgt accgcctcgg agggttcggg gtttctatcc 2880

ccatctatcc atgagtgacg tgagcttccc agcagaaagg cagaagtcca gattgtgagc 2940

aacccatctg tgtgactccc aaagccgaca tgatttctac ttgaccttta gctcccttct 3000

ggacagggac tatgacaatt tggggcgaca tcgcgtgcag ctagctatac cctgcattta 3060

gcactcttga cttatttcca ccctcacagg cagctcaact gttctcattg gcttctcctg 3120

ctggtacccg gagcgcgacg attccaaag 3149

<210> 6

<211> 3351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagatgtcat gtgggtgctg ggaattgaac ccccgtcatc tggaagaaca gctggttaag 60

agcatctccc cagccccttg ttctgttttt gagatgtccc actctgtggc acagattgcc 120

ttggcaatct gtgtagccaa actggccttg actcttttcc aatcctcttg cttcagcccc 180

tcgagtgctg ggattgaggc tgcgtagcca tgactgccca gaaactctta cagagcttgt 240

gagagccgat ccctccctcc tggagagtac cgagttcaaa gttcccctta agcctgtaca 300

gtgtagcact gctgccttta tgaagaatgc atttctagac gtttactttc tttttttttc 360

aattttttaa ttagatattt tctttatcta atacatttca aatgttatcc cctttcctgg 420

ttggcgttta actttctgaa gaggggcttt aagaggaaaa tttgatatcg cctttacaga 480

aaacaaataa agttgtgatt agctgtgcta agccttttcc tgatcgtgtc tgtgtgtgat 540

cttctggtgt gggtagaggc agaattgctg acccacccaa ggtttagcca tgtggtccaa 600

gtccatggac gaacacatga gctgataact acattcacat gggagctggc attatggctc 660

acctggcaaa ggtgcttgct gacaagcatg gtgacctgag tttaatcact ggaacccacg 720

tggggagaac tgactcgcaa aagttgtcct ccatatcttt gccatggcac acaagaatgt 780

gtggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtccacaca gatccagttg ggtcaagagg 840

agaccttgtg ttgcacactg ggagatgagg gaatataaag caagagcagc ccctaacttg 900

tatatgtgta tatgtgtatg tgtatatatg tgtatatgtg tatatagata tgaagcactg 960

cttcctctcc cagaaaatga tcagcctctg tatccacaga tataaggtca ttacgcactg 1020

tattcatata ttagattatc attcccataa atgtgtacac acatcctaca cctgtccaaa 1080

acacagcaga agacagtgta ggcttggttc aggttttttc tttttctttt tttttttttt 1140

ttttactttt ttggtttttt gagacagagt ttctctgtgt aacccaggct gtcctggaac 1200

tcactctgaa gaccaggttg gcctcgaact cagggatctt cctgctctgg tctcccaggt 1260

gctaggatta aagacatgca ccactgtggc ctggcttagg aggggctcac ccttgagggc 1320

agctttctta gaaaacttta cctcatgagg ttcctacaga ggatgtggca tgtgctcagc 1380

cagaggctgg ctccctgttc ctggtaaacc ctagctcatt tctgcatggt gacactggag 1440

cttggtggaa gccaaagggt ctgctatcta tcggttcctc agcacacata aggctgagca 1500

acggtgagct gtggcccatg gctcccatcc ttgtacccat ggtggctccc gtatcacctc 1560

cactcactca caaaggaggc agctgtacag ttacttgcaa gctgccatcc tgcagtggcc 1620

ccaaagatgg gacacctgcc tgtccactcc acccctgctt aggacagaag cacttactct 1680

actattgatt aggctattgg cagccaacag ctctgagcca ctctttcttt catgggccaa 1740

cttctgggga cagtttgtaa ctcttgacta ctctaagagt agagacaagc atttgcctcc 1800

tcactcagct gtgggacgac tccgaaggat cctggcgggg ttgagtcctc taagatcacg 1860

tgaggctgct gccacgcccc tcacggtcag cctgtgttcc tggccaagct tgtggccctc 1920

atgtccacac aggtgttccg gagaaggcgc catgagacgc cctgcacgct gctttgggag 1980

tctcaggctg attccacgca gtgtgtgact gacatcctgg gggtgacttg acgtgcggga 2040

ttcccttctc tccttcctcc acacgggtcc tgggagaaaa ctcaggttgt taggtttagt 2100

cctctcccca gcccacaatg cgtgactgct tcaaagttca tcacagttcc aaattccccc 2160

ttcagaacac cagaaatcca ccaagtactt tcgcaagttg cgactcattt cagactttca 2220

ggaaggagat gtggtcactt ttatgattcc aagaactgag gttcagagtc ctgtgggacg 2280

cagctcggta ggcagagtgc tcgactagca ggagtggaga cccaggcgtg gcctcttcct 2340

ctggtactaa ataaaaaggg cgtggcatca cgtgcccagg agtggaggcc agagaatcac 2400

tttaaaacaa caacaccaaa gctctttgtt acatttattg gtgtagtgta tgtgtgtgtg 2460

tgtgtatcta tgtctgtgct tgtctttatg tgtgtgtgtc tatgtgtgtg tatgtctgtg 2520

agtatctgtg tgtgtatctg tgtatgtctg tgtgtatatg tgtttctctg tgtgtctgtg 2580

tgtgtgtgtc tatgttggta tgtgtgtgtg tgtctgtgtg tccgtgccat agcacatatg 2640

tggtattcag aagacaacga gcaggagtca gttctctgct tccttcatgt tgcaagggtg 2700

ggattcaggt cactaggcta ggcagcgcac agttaccagg tgagcgatct ctctagccca 2760

gaggtcagga gttgaaggtc ataggcacct acagatcgag ttcaaggcca gcctgggcta 2820

cataagatga tagaaaacaa acaaacaaac aaacatacaa attgaggttc aggggaacaa 2880

cattctacat atgaactgaa ctaactgcac caacagtagc ccctgcgtcc aggcgtagtg 2940

cactgtataa acagttggtt ggtttttatt gggtgaatga gctcctcctg tctgcctaag 3000

gcctctctgc tctagaaagc ccagtttctg tttaagtgta cagagtctct gattcttatc 3060

tctgaaattt cccacttttg tctctaataa aacttgatgt ccccaggttc aaagactaac 3120

cagattgttc tagaagcagc gggtggattt agggtaaaaa aaaaatagat taccccatgg 3180

agacttttga taggaacaga agtgtgagcg ctgagtctgt agtttcacct cttggaaatt 3240

gtaaaataac atcaagaaga ataaacttaa aagccataaa ttcctgtttc ttatttgttg 3300

agacaggatc tcaactaatg gataagctag ccttgaactc acgaacctgc c 3351

<210> 7

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaacccca cggatatagc agacaccacc ctcgatgaaa gcatatacag caattactat 60

ctgtatgaaa gtatccccaa gccttgcacc aaagaaggca tcaaggcatt tggggagctc 120

ttcctgcccc cactgtattc cttggttttt gtatttggtc tgcttggaaa ttctgtggtg 180

gttctggtcc tgttcaaata caagcggctc aggtccatga ctgatgtgta cctgctcaac 240

cttgccatct cggatctgct cttcgtgttt tccctccctt tttggggcta ctatgcagca 300

gaccagtggg tttttgggct aggtctgtgc aagatgattt cctggatgta cttggtgggc 360

ttttacagtg gcatattctt tgtcatgctc atgagcattg atagatacct ggcaattgtg 420

cacgcggtgt tttccttgag ggcaaggacc ttgacttatg gggtcatcac cagtttggct 480

acatggtcag tggctgtgtt cgcctccctt cctggctttc tgttcagcac ttgttatact 540

gagcgcaacc atacctactg caaaaccaag tactctctca actccacgac gtggaaggtt 600

ctcagctccc tggaaatcaa cattctcgga ttggtgatcc ccttagggat catgctgttt 660

tgctactcca tgatcatcag gaccttgcag cattgtaaaa atgagaagaa gaacaaggcg 720

gtgaagatga tctttgccgt ggtggtcctc ttccttgggt tctggacacc ttacaacata 780

gtgctcttcc tagagaccct ggtggagcta gaagtccttc aggactgcac ctttgaaaga 840

tacttggact atgccatcca ggccacagaa actctggctt ttgttcactg ctgccttaat 900

cccatcatct acttttttct gggggagaaa tttcgcaagt acatcctaca gctcttcaaa 960

acctgcaggg gcctttttgt gctctgccaa tactgtgggc tcctccaaat ttactctgct 1020

gacaccccca gctcatctta cacgcagtcc accatggatc atgatctcca tgatgctctg 1080

tag 1083

<210> 8

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgttctcat tggcttctcc tgctggtacc cggagcgcga cgattccaaa gatgaacccc 60

acggatatag cagacaccac cctcgatgaa agcatataca g 101

<210> 9

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcatctta cacgcagtcc accatggatc atgatctcca tgatgctctg tagggtgtga 60

gtgggggtaa catggcgtta acaagctcca cacacccag 99

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agggcattgg atcccctgca actggaatta cagatggttg tagatctcat atggatatcg 60

aattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc 100

<210> 11

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggtggatc 60

caagcttgaa ttcaagatgt catgtgggtg ctgggaattg aacccc 106

<210> 12

<211> 2787

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcattgctt catagactgt cctcaggatc actttcagaa gagcaaggca gctcaactgt 60

tctcattggc ttctcctgct ggtacccgga gcgcgacgat tccaaagatg aaccccacgg 120

atatagcaga caccaccctc gatgaaagca tatacagcaa ttactatctg tatgaaagta 180

tccccaagcc ttgcaccaaa gaaggcatca aggcatttgg ggagctcttc ctgcccccac 240

tgtattcctt ggtttttgta tttggtctgc ttggaaattc tgtggtggtt ctggtcctgt 300

tcaaatacaa gcggctcagg tccatgactg atgtgtacct gctcaacctt gccatctcgg 360

atctgctctt cgtgttttcc ctcccttttt ggggctacta tgcagcagac cagtgggttt 420

ttgggctagg tctgtgcaag atgatttcct ggatgtactt ggtgggcttt tacagtggca 480

tattctttgt catgctcatg agcattgata gatacctggc aattgtgcac gcggtgtttt 540

ccttgagggc aaggaccttg acttatgggg tcatcaccag tttggctaca tggtcagtgg 600

ctgtgttcgc ctcccttcct ggctttctgt tcagcacttg ttatactgag cgcaaccata 660

cctactgcaa aaccaagtac tctctcaact ccacgacgtg gaaggttctc agctccctgg 720

aaatcaacat tctcggattg gtgatcccct tagggatcat gctgttttgc tactccatga 780

tcatcaggac cttgcagcat tgtaaaaatg agaagaagaa caaggcggtg aagatgatct 840

ttgccgtggt ggtcctcttc cttgggttct ggacacctta caacatagtg ctcttcctag 900

agaccctggt ggagctagaa gtccttcagg actgcacctt tgaaagatac ttggactatg 960

ccatccaggc cacagaaact ctggcttttg ttcactgctg ccttaatccc atcatctact 1020

tttttctggg ggagaaattt cgcaagtaca tcctacagct cttcaaaacc tgcaggggcc 1080

tttttgtgct ctgccaatac tgtgggctcc tccaaattta ctctgctgac acccccagct 1140

catcttacac gcagtccacc atggatcatg atctccatga tgctctgtag ggtgtgagtg 1200

ggggtaacat ggcgttaaca agctccacac acccagcacc tgctcgcctt gtttcagtca 1260

gggtgccctg aacagggctc tgaggaagaa aacaagtaaa accaagacca tggcaagatg 1320

gcttctcacc ctgcaggtgg ctcccaagag gttcagagcc ctgctgggtg gaggaaatca 1380

ccccttcatg acaatgagcc cttgagtgga tctctagttt tgttgaacta cctagaattc 1440

ttggacatgc tgtattccat aaagccagat gtctggagaa atgaggatct gacatcttga 1500

ttctcttatt atagaggatg cttcattgaa gcctggttac aagcgtagag ataagggtgt 1560

tgggacaatc ccttctccac ttaacacaag gtgtgtagaa cacacatcgg ttgaaatgtc 1620

cgtgcagttt ggctttctgg tatgttttaa ttgtgatagg tgtttgttca gcttgtagaa 1680

gaagctcgtc ggtgcagaga agggtgaaat gcccttgtaa ttctagctac tccggggata 1740

aggccaagag atcttagatt caaggatggc ctggacaata cagtgaaagc ctgtccccaa 1800

accaaaccaa accaaaccca aacccaaatc aaaaccaaat gaaaggcaag caatacccca 1860

aaagttagct ctgaaatgct cttgtgagca ccctaagttc atctttcttt tcattttctt 1920

ttatttacgc cttctctttc cttctccttc ttctttctcc ttcttcttgt cctccttctt 1980

tcttctcctc cttctttctt cttttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 2040

tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttctaactg ttattgggta 2100

ttgggcatgg tggaggcaga ggcaggagta tctctgagtt cgaggccagc ctggtctaca 2160

aatctagttc caggacagat agggctacac agagaaaccc tgtcttgcag aaacaaacaa 2220

acaaacaagc aagcaaacaa acaaatgtaa actggatgag cctgtggtgg gcacaccttt 2280

aatcccagcg ctcgacaggc caggcaggtg gatttctgta agtcgaggcc agcctggtct 2340

acagagctag ttccagacca gccaaggcta tttagtgaga ctttgtcttg aaaagaaagg 2400

aggaaagaaa gaaaatagta aatgtattaa taaagtatga caatattcct ttaatcactt 2460

taaagggtca tgtcaactac tgagacacaa ataatcactt aaaaatcatt ataggtaggg 2520

tgttaaaata actatcaaat tatgaagttg taaaaaacat cctttgtaaa atattggctc 2580

cagtttctga atattagttg tattaaaagt tagaacagtt agggcatgac ggtactcacc 2640

tttaatttca gcactccaga ggccagggga ggagttcaag tctcgcctgg tctacagcat 2700

gagctccagg acagataaca ttagaacagt tattcttacg ttatcttaat tgtttaatgt 2760

gttagatcat taaagttatt tgctaag 2787

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tccgggtgtt agaaattgaa gccgt 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaggcttggg gatactttca tacaga 26

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caggacatag cgttggctac 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcccagttc catctccttt tgtgt 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttttgtcaag aagccccaca tgggt 25

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gggcacttac atatttgcag gcaaaac 27

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgagatgac aggtcgtatc cactg 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gggtttagag gtgtgtgttt ctgtc 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtgactccc aaagccgaca tgatt 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagaatggga gggacaggac gaaca 25

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaggcttggg gatactttca tacaga 26

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caccgcccag ctaccaagtt tgttt 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggggctgaag caagaggatt ggaaa 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tgacttccgt gacgctttgt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ctacgcttgt aaccaggctt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttggggctac tatgcagcag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgcgtgtaag atgagctggg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttggggctac tatgcagcag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgcgtgtaag atgagctggg 20

Claims

1.一种CCR4基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR4蛋白。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括用包含人CCR4基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上；优选的，用包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上；进一步优选的，用包含人CCR4基因的2号外显子的部分插入或替换至非人动物CCR4基因座上，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；再进一步优选的，用包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上；或，包括用包含编码人或人源化CCR4蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因座上；优选的，用包含与编码SEQID NO：4所示氨基酸具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者用编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物CCR4基因。

3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含人CCR4基因的部分；优选的，包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含人CCR4基因的2号外显子的部分核苷酸序列，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；再进一步优选的，包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；和/或，所述的CCR4基因靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列包含SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列；

任选地，所述非人动物为至少包含人或人源化PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A和CCR2基因中至少一种的人源化的非人动物。

4.一种人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含人CCR4基因的部分，优选的，包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含2号外显子的部分，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；或者，所述的人源化CCR4基因包含编码人CCR4蛋白的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因包含与SEQ ID NO：8或9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8或9所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4-5任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：3第99-1181位所示核苷酸序列的全部或部分；

B)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQID NO：3第99-1181位所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQID NO：3第99-1181位所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

D)所述人源化CCR4基因中来源于人CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3或SEQID NO：3第99-1181位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列；

和/或，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的全部或部分；

B)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

D)所述人源化CCR4基因中来源于非人动物CCR4基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。

7.根据权利要求4-6任一所述的人源化CCR4基因，其特征在于，所述的人源化CCR4基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(i)包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

8.一种人源化CCR4蛋白，所述的蛋白是由权利要求4-7任一所述的基因编码的。

9.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人CCR4基因的部分。

10.根据权利要求9所述的靶向载体，其特征在于，所述靶向载体包含人CCR4基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含人CCR4基因的2号外显子的部分核苷酸序列，所述的2号外显子的部分包含从起始密码子开始至终止密码子为止；更进一步优选的，包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求9-10任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；和/或，所述的CCR4基因靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物CCR4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

12.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-3任一所述的构建方法获得的非人动物；和/或，所述的细胞的基因组中包含人CCR4基因的部分；优选的，所述的细胞包含权利要求4-7任一所述的人源化CCR4基因。

13.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求1-3任一所述的构建方法获得的非人动物，和/或，所述的组织或器官或其培养物包含权利要求12所述的细胞。

14.一种瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织来源于权利要求1-3任一所述的构建方法获得的非人动物。

15.来源于权利要求1-3任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求4-7任一所述的人源化CCR4基因、权利要求8所述的蛋白、权利要求12所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求13所述的组织或器官或其培养物、权利要求14所述的瘤组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR4通路功能、人CCR4通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

16.一种人CCR4特异性调节剂的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自权利要求1-3任一所述的构建方法获得的非人动物。

17.根据权利要求16所述的筛选方法，其特征在于，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。

18.根据权利要求1-3任一所述的构建方法、权利要求4-7任一所述的人源化基因、权利要求8所述的蛋白、权利要求12所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求13所述的组织或器官或其培养物、权利要求14所述的瘤组织、权利要求15所述的应用、权利要求16-17任一所述的筛选方法，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。