CN111926038B

CN111926038B - Csf2rb基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN111926038B
Application number: CN202010938846.5A
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 白阳; 姚佳维; 郭雅南; 尚诚彰
Original assignee: Beijing Biocytogen Co Ltd
Current assignee: Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN111926038A

Abstract

本发明提供了一种CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法、一种人源化CSF2RB蛋白、一种人源化CSF2RB基因、一种CSF2RB基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将部分编码人CSF2RB蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该非人动物体内能正常表达人源化CSF2RB蛋白，可以用于人CSF2RB信号机理研究、炎症、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colonystimulatingfactor，GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是一种具有细胞因子功能的单体糖蛋白。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环并迁移到组织中，然后它们成熟为巨噬细胞和树突状细胞。因此，其是免疫/炎症级联反应的一部分，通过这种级联反应，少量巨噬细胞的激活可以迅速导致其数量的增加，这是对抗感染至关重要的过程。

集落刺激因子2受体β(Colony Stimulating Factor2Receptor,Beta，CSF2RB)是一种跨膜蛋白，以β链的形式构成细胞因子IL-3、IL-5和GM-CSF受体的侧链。共同β链(hβc)，即CSF2RB，在高亲和的配体结合及信号转导中是必需的。CSF2RB表达在嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的细胞中，多效细胞因子白细胞介素(IL)-3(IL-3)、IL-5和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在髓系细胞的分化和功能中起关键的和重叠的作用。它们是宿主防御和先天免疫的重要介质，同时也可以显著促进炎症病理的发展和演进，所述炎症病理包括炎症性气道疾病如哮喘、慢性鼻-鼻窦炎伴或不伴鼻息肉(CRSwNP，CRSsNP)、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘-COPD重叠综合征(ACOS)。研究发现，CSF2RB主要在血液系统疾病中研究较多，既促进造血细胞增殖又促进分化，在维持造血细胞增殖、分化、自我更新的平衡中具有重要作用。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人CSF2RB氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，一致性仅为56％，因此，识别人CSF2RB蛋白的抗体通常无法识别小鼠CSF2RB，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向CSF2RB药物的药效。为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化CSF2RB相关的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CSF2RB核苷酸序列的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，进一步优选的，包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，更优选的，包含2-10号外显子之间的任一内含子；其中，所述人CSF2RB核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从编码信号肽的核苷酸序列开始至2号外显子最后1个核苷酸序列为止，10号外显子的部分至少包含从10号外显子第一个核苷酸开始至编码10号外显子最后1-5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列为止。

优选的，所述的构建方法包括插入、翻转、敲除或替换。优选为原位替换。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CSF2RB核苷酸序列的2号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物CSF2RB基因座上，进一步优选的，用包含人CSF2RB核苷酸序列的2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分核苷酸序列插入或替换到非人动物CSF2RB基因座上，更优选的，包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，更进一步优选的，包含2-10号外显子之间的任一内含子；其中，所述人CSF2RB基因的2号外显子的部分至少包含从编码信号肽的核苷酸序列开始至2号外显子最后1个核苷酸序列为止，10号外显子的部分至少包含从10号外显子第一个核苷酸开始至编码10号外显子最后1-5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列为止。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列替换至非人动物CSF2RB基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列替换至非人动物CSF2RB基因的相应区域。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CSF2RB核苷酸序列的2号至10号外显子全部或部分替换非人动物CSF2RB核苷酸序列的2号至10号外显子的全部或部分；其中，所述非人动物CSF2RB核苷酸序列包含编码非人动物2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部、10号外显子的部分核苷酸序列，优选的，包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，进一步优选的，包含2-10号外显子之间的任一内含子，其中，所述非人动物CSF2RB核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从编码信号肽的核苷酸序列开始至2号外显子最后1个核苷酸为止，10号外显子的部分至少包含从10号外显子第一个核苷酸开始至编码10号外显子最后1-5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列为止。

优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化CSF2RB基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物CSF2RB基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化CSF2RB蛋白的核苷酸序列插入或替换到非人动物CSF2RB基因座上。

优选的，所述的插入或替换位点为CSF2RB基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CSF2RB基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可在内源CSF2RB基因处造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

优选的，所述的非人动物中人源化CSF2RB基因是纯合或杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CSF2RB基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CSF2RB蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，使用靶向载体进行CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人CSF2RB的2号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，更优选的，包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，更进一步优选的，包含2-10号外显子之间的任一内含子，其中，所述人CSF2RB的核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从编码信号肽开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，10号外显子的部分至少包含从10号外显子第一个核苷酸开始至编码10号外显子最后1-5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列为止，更进一步优选的，所述靶向载体包含编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CSF2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO.3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CSF2RB基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000081.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO.4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF2RB基因座上。进一步优选的，位于非人动物CSF2RB基因的2号外显子至10号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得非人动物模型。

优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CSF2RB蛋白,同时内源CSF2RB蛋白的表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白包含人CSF2RB蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含信号肽的全部和胞外区的部分，更优选的，所述的胞外区的部分包含C端去除0-15（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15）个氨基酸的人CSF2RB蛋白胞外区，更进一步优选的，包含与SEQ ID NO.2第1至435位或SEQ ID NO.7具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO.2第1至435位或SEQ ID NO.7所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白还包含非人动物CSF2RB蛋白的部分，优选为非人动物CSF2RB蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF2RB蛋白包含下列组中的一种：

a）SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.2第1至435位所示氨基酸序列的部分或全部；

b）与SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.2第1至435位所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；

c）与SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.2第1至435位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

d）具有SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.2第1至435位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化CSF2RB基因，所述的人源化CSF2RB基因编码人源化CSF2RB蛋白。

优选的，所述的人源化CSF2RB基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列,进一步优选的，所述的非人动物中包含的CSF2RB基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF2RB基因包含下列组中的一种：

a）人源化CSF2RB基因的mRNA序列为SEQ ID NO.6所示的序列的部分或全部；

b）人源化CSF2RB基因的mRNA序列与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；

c）人源化CSF2RB基因的mRNA序列与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

d）人源化CSF2RB基因的mRNA序列具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种CSF2RB基因人源化改造的非人动物，所述的非人动物采用上述构建方法获得。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人CSF2RB核苷酸序列的部分，优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列或者SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

优选的，所述的人CSF2RB核苷酸序列的部分包含人CSF2RB的2号至10号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至9号外显子的全部和10号外显子的部分，更优选的，包含2-3号内含子和/或9-10号内含子，更进一步优选的，包含2-10号外显子之间的任一内含子，其中，所述人CSF2RB的核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从编码信号肽开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，10号外显子的部分至少包含从10号外显子第一个核苷酸开始至编码10号外显子最后1-5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列为止。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF2RB基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF2RB基因2号至10号外显子上。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在CSF2RB基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于翻转、敲除、插入或替换。

本发明的第六方面，涉及一种CSF2RB基因改造的人源化细胞，所述的人源化CSF2RB基因改造细胞的基因组中包括人CSF2RB基因的2号外显子至10号外显子。优选的，所述的人CSF2RB基因编码SEQ ID NO.2第1至435位氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，其通过内源性CSF2RB调控元件调控；该人源化CSF2RB基因改造细胞体内表达人或人源化CSF2RB蛋白，同时内源CSF2RB蛋白的表达降低或缺失。优选的，所述的人CSF2RB基因通过内源性CSF2RB调控元件调控。

本发明的第七方面，涉及一种CSF2RB基因缺失的细胞，所述的CSF2RB基因缺失的细胞缺失内源CSF2RB基因的2号外显子至10号外显子。

本发明的第八方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的人源化CSF2RB基因改造非人动物的构建方法制备动物的步骤。

优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的人源化基因改造动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第九方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物在制备荷瘤动物模型中的应用。

本发明的第十方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法获得的CSF2RB基因人源化改造的非人动物、上述的CSF2RB基因人源化改造的非人动物或上述的荷瘤动物模型。

本发明的第十一方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法获得的CSF2RB基因人源化改造的非人动物、上述的CSF2RB基因人源化改造的非人动物或上述的荷瘤动物模型。

优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。

本发明的第十二方面，提供了一种人源化CSF2RB蛋白，所述的人源化CSF2RB蛋白包含人CSF2RB蛋白的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白包含人CSF2RB蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含信号肽的全部和胞外区的部分，更优选的，所述的胞外区的部分包含C端去除0-15（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15）个氨基酸的人CSF2RB蛋白胞外区，。

优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白包含与SEQ ID NO.2第1至435位或SEQ ID NO.7具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO.2第1至435位或SEQ ID NO.7所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白还包含非人动物CSF2RB蛋白的部分，优选为非人动物CSF2RB蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区。

优选的，所述的人源化CSF2RB蛋白包含人CSF2RB基因的2号外显子至10号外显子编码的氨基酸序列，和非人动物CSF2RB蛋白的氨基酸序列。

本发明的第十三方面，提供了一种编码上述人源化CSF2RB蛋白的人源化CSF2RB基因，所述的人源化CSF2RB基因包含人CSF2RB基因的2号外显子至10号外显子，和非人动物CSF2RB基因的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF2RB基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF2RB基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF2RB基因中包含的人CSF2RB核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：

（A）包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的全部或部分；

（B）包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；

（C）包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；

（D）具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF2RB基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

（a）包含SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的全部或部分；

（b）包含与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；

（c）包含与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或

（d）包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

本发明的第十四方面，涉及一种表达上述的人源化CSF2RB蛋白的构建体。

本发明的第十五方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第十六方面，涉及一种包含上述细胞的组织。

本发明的第十七方面，涉及了一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化CSF2RB蛋白或上述的人源化CSF2RB基因在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明的第十八方面，涉及一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化CSF2RB蛋白或上述的人源化CSF2RB基因在CSF2RB基因或蛋白中相关研究中的应用，所述的应用包括：

A）涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用；

B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；

C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发诊断策略或用于开发治疗策略中的应用；

D）在体内研究人CSF2RB信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，

E）研究CSF2RB基因功能，研究人CSF2RB抗体，研究针对人CSF2RB靶位点的药物、药效，研究免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或炎症药物方面的用途。

优选的，所述应用包括在制备药物组合物或者检测试剂盒中的用途。

优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括B或T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)、鼻咽癌、肺癌。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的一个具体实施方式中。所述的免疫相关疾病为类风湿性关节炎。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。

本发明所述的CSF2RB基因人源化的非人动物体内可以正常表达人或人源化CSF2RB蛋白。可用于针对人CSF2RB靶位点的药物筛选、药效评估、免疫相关疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究CSF2RB蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CSF2RB蛋白”，包含来源于人CSF2RB蛋白的部分和非人CSF2RB蛋白的部分。其中，所述的“人CSF2RB蛋白”同“人CSF2RB蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CSF2RB蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CSF2RB蛋白的部分”，为连续或间隔的5-897个（优选为10-435个）氨基酸序列与人CSF2RB蛋白的氨基酸序列一致或与人CSF2RB蛋白的氨基酸序列具有70%以上同源性。

本发明所述的“人CSF2RB蛋白的信号肽的全部”或“人CSF2RB蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人CSF2RB蛋白的信号肽或胞外区的全长氨基酸序列一致。

本发明所述的“人CSF2RB蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5-427个（优选为5-419个）氨基酸序列与人CSF2RB蛋白的胞外区氨基酸序列一致，或与人CSF2RB蛋白的胞外区氨基酸序列具有70%以上同源性。

本发明所述的“人源化CSF2RB基因”，包含来源于人CSF2RB核苷酸序列的部分和非人CSF2RB基因的部分。其中，所述的“人CSF2RB核苷酸序列”同“人CSF2RB核苷酸序列的全部”，即其核苷酸序列与人CSF2RB核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人CSF2RB核苷酸序列的部分”为连续或间隔的20-26876bp（优选为20-11777bp）个核苷酸序列与人CSF2RB核苷酸序列一致或与人CSF2RB核苷酸序列具有70%以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至10号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子、9号外显子、9-10号内含子、10号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CSF2RB核苷酸序列的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-248bp个，优选10-76bp个核苷酸序列与人CSF2RB核苷酸序列的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化CSF2RB基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子编码信号肽的核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸序列为止。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CSF2RB基因座”表示CSF2RB基因1号至15号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子、9号外显子、10号外显子、11号外显子、12号外显子、13号外显子、14号外显子、15号外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分，更优选为CSF2RB基因的2号至10号外显子上。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols. 154and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″ (D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：人和小鼠CSF2RB基因对比示意图（非按比例）；

图2：人源化CSF2RB基因座示意图（非按比例）；

图3：CSF2RB打靶策略示意图，其中，靶向载体包含5’同源臂、3’同源臂以及含有人CSF2RB DNA片段的A片段,（非按比例）；

图4：阳性克隆PCR检测结果,其中，+为阳性对照组，WT为野生型小鼠，M为Marker组，H₂O为水；

图5：采用5’探针、3’探针-A和Neo（3’）探针进行Southern Blot鉴定的结果图，其中，WT为野生型小鼠；

图6：去Neo示意图；

图7：CSF2RB人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图A使用引物对WT-F和WT-R用于扩增小鼠内源的野生型CSF2RB基因片段；图B使用引物对WT-F和Mut-R用于扩增修饰后的CSF2RB基因片段，用以验证靶向载体是否正确插入小鼠基因组位点，图C使用引物对Frt-F和Frt-R用于扩增去Neo后的CSF2RB基因片段，其中编号为F1-001、F1-002、F1-003的小鼠为阳性杂合小鼠，PC为阳性对照组，WT为野生型小鼠，M为Marker组，H₂O为水；

图8：CSF2RB基因人源化F1杂合小鼠RT-PCR检测结果，其中WT为野生型小鼠，H/+为CSF2RB基因人源化杂合子小鼠，H₂O为水对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

EcoRI、BclI、AseI酶购自NEB，货号分别为R3101V、R3160V、R0526V；

C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354。

实施例1 CSF2RB基因人源化小鼠的制备

小鼠CSF2RB基因（NCBI Gene ID：12983，位于15号染色体NC_000081.6的第78325800至 78351001位，基于转录本NM_007780.4及其编码蛋白NP_031806.3（SEQ IDNO.1））和人CSF2RB基因（NCBI Gene ID：1439，位于22号染色体NC_000022.11的第36913574至36940449位，基于转录本NM_000395.3 及其编码蛋白NP_000386.1（SEQ ID NO.2））对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CSF2RB基因座引入编码人CSF2RB蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人源化CSF2RB蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源CSF2RB基因座上用人CSF2RB基因的序列替换特定小鼠CSF2RB基因序列，如将至少包含小鼠CSF2RB基因的2号外显子部分至10号外显子部分序列替换小鼠2号外显子部分至10号外显子部分，得到人源化CSF2RB基因座（示意图如图2所示），实现对小鼠CSF2RB基因的人源化改造。

进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中的靶向载体上含有5’同源臂、3’同源臂以及包含人CSF2RB的DNA序列（人DNA片段）的A片段。其中，5’同源臂（SEQ ID NO.3）与NCBI登录号与NC_000081.6第78330587至78335206位核苷酸序列相同；3’同源臂（SEQ IDNO.4）与NCBI登录号与NC_000081.6的第78345850 至78349934位核苷酸序列相同；人CSF2RBDNA的序列（人DNA片段，SEQ ID NO.5）与NCBI登录号为NC_000022.11的第36922208至36933984位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒（Neo cassette）。其中Neo盒5’端与小鼠的连接设计为5’-AGTCTATCTATGTACACAGATAAATTGGAAGGTTGGTGGGACCCATTCGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGA-3’（SEQ ID NO.8）内，其中序列“TTCG”的“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“GTCG”中的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠的连接设计为5’- CTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCAATATTTCCTGCTGATTTCCCTTCCCTTGAACCCTGCAGTCAGTGCTGGTGTGTCC -3’（SEQ ID NO.9）内，其中序列“ATATT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TCCTG”的第一个“T”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因（白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。改造后的人源化小鼠CSF2RB的mRNA序列及其蛋白序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示。

实施例2 阳性克隆筛选

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入野生型小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR检测,PCR检测使用引物序列:

D-F（SEQ ID NO.10）:5’-AGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTC-3’；

D-R（SEQ ID NO.11）:5’-TGGATTGTCAAGAGGGTGGTGATGG-3’；

将PCR检测结果为阳性的克隆进行Southern Blot（分别使用EcoRI、BclI、AseI消化细胞）检测，筛选出正确的阳性克隆细胞，Southern检测包括如下探针引物：

5’探针（5’Probe）：

5’Probe-F（SEQ ID NO.12）：5’- AACCTGGGCAAGAAACAGAGCATCA-3’；

5’Probe-R（SEQ ID NO.13）：5’- AGCAACAACGTGTCTCACACATGGA-3’；

3’探针（3’Probe-A）：

3’Probe-A-F（SEQ ID NO.14）：5’- ATCTCTTGCTGTTCACCTCCTTGGC-3’；

3’Probe-A-R（SEQ ID NO.15）：5- ACCACTTCTCTTGCTTACTTCAATGCT-3；

Neo探针（Neo（3’） Probe）：

Neo Probe（3’）-F（SEQ ID NO.16）：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’，

Neo Probe（3’）-R（SEQ ID NO.17）：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’。

PCR检测结果见图4，表明D01、D02、D03和D04全部为阳性克隆，Southern检测进一步确认D01为阳性克隆且无随机插入（图5）。

实施例3 CSR2RB基因人源化F1代小鼠表达检测

将筛选出的正确阳性克隆细胞（黑色鼠）按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中（白色鼠），得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠（白色鼠）的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠（黑白相间）。将F0代嵌合鼠与野生型小鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到CSF2RB基因人源化纯合子小鼠（图7）。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型。示例性的F1代小鼠（已去除Neo标记基因）的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-001、F1-002、F1-003为阳性杂合小鼠。PCR检测引物序列如下表：

表1 CSF2RB人源化F1小鼠检测引物

将获得的阳性小鼠进行RT-PCR检测，PCR检测引物如下，从图8检测结果可以

看出，使用小鼠的CSF2RB基因检测引物既可以在野生型小鼠中检测到目的条带，也可以在F1杂合小鼠中检测到目的条带，使用人CSF2RB基因检测引物只能在F1杂合小鼠中检测到目的条带，说明在CSF2RB基因人源化F1小鼠内有表达人源化CSF2RB。

RT-PCR检测引物如下:

hCSF2RB-F2（SEQ ID NO.23）：5’-CTCTCAGGACGTCCCAGCAA-3’;

hCSF2RB-R2（SEQ ID NO.24）：5’-AGCAAGGTGAGGATGAGAAAGAC-3’;

mCSF2RB-F1（SEQ ID NO.25）：5’-TGGACCAGCAAATGGCACT-3’;

mCSF2RB-R1（SEQ ID NO.26）：5’-GGTGTAGACACTGGCCCC-3’;

GAPDHF1（SEQ ID NO.27）:5’-CTCAGGAGAGTGTTTCCTCGTC-3’;

GAPDHR1（SEQ ID NO.28）:5’-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3’。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120> CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用

<130> 1

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 896

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Asp Gln Gln Met Ala Leu Thr Trp Gly Leu Cys Tyr Met Ala Leu

1 5 10 15

Val Ala Leu Cys Trp Gly His Gly Val Thr Glu Ala Glu Glu Thr Val

20 25 30

Pro Leu Lys Thr Leu Gln Cys Tyr Asn Asp Tyr Thr Asn His Ile Ile

35 40 45

Cys Ser Trp Ala Asp Thr Glu Asp Ala Gln Gly Leu Ile Asn Met Thr

50 55 60

Leu Tyr His Gln Leu Glu Lys Lys Gln Pro Val Ser Cys Glu Leu Ser

65 70 75 80

Glu Glu Leu Met Trp Ser Glu Cys Pro Ser Ser His Arg Cys Val Pro

85 90 95

Arg Arg Cys Val Ile Pro Tyr Thr Arg Phe Ser Ile Thr Asn Glu Asp

100 105 110

Tyr Tyr Ser Phe Arg Pro Asp Ser Asp Leu Gly Ile Gln Leu Met Val

115 120 125

Pro Leu Ala Gln Asn Val Gln Pro Pro Leu Pro Lys Asn Val Ser Ile

130 135 140

Ser Ser Ser Glu Asp Arg Phe Leu Leu Glu Trp Ser Val Ser Leu Gly

145 150 155 160

Asp Ala Gln Val Ser Trp Leu Ser Ser Lys Asp Ile Glu Phe Glu Val

165 170 175

Ala Tyr Lys Arg Leu Gln Asp Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Ser Leu His

180 185 190

Thr Ser Lys Phe Gln Val Asn Phe Glu Pro Lys Leu Phe Leu Pro Asn

195 200 205

Ser Ile Tyr Ala Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ser Pro Gly Ser Ser

210 215 220

Leu Ser Gly Arg Pro Ser Arg Trp Ser Pro Glu Val His Trp Asp Ser

225 230 235 240

Gln Pro Gly Asp Lys Ala Gln Pro Gln Asn Leu Gln Cys Phe Phe Asp

245 250 255

Gly Ile Gln Ser Leu His Cys Ser Trp Glu Val Trp Thr Gln Thr Thr

260 265 270

Gly Ser Val Ser Phe Gly Leu Phe Tyr Arg Pro Ser Pro Val Ala Pro

275 280 285

Glu Glu Lys Cys Ser Pro Val Val Lys Glu Pro Pro Gly Ala Ser Val

290 295 300

Tyr Thr Arg Tyr His Cys Ser Leu Pro Val Pro Glu Pro Ser Ala His

305 310 315 320

Ser Gln Tyr Thr Val Ser Val Lys His Leu Glu Gln Gly Lys Phe Ile

325 330 335

Met Ser Tyr Asn His Ile Gln Met Glu Pro Pro Thr Leu Asn Leu Thr

340 345 350

Lys Asn Arg Asp Ser Tyr Ser Leu His Trp Glu Thr Gln Lys Met Ala

355 360 365

Tyr Ser Phe Ile Glu His Thr Phe Gln Val Gln Tyr Lys Lys Lys Ser

370 375 380

Asp Ser Trp Glu Asp Ser Lys Thr Glu Asn Leu Asp Arg Ala His Ser

385 390 395 400

Met Asp Leu Ser Gln Leu Glu Pro Asp Thr Ser Tyr Cys Ala Arg Val

405 410 415

Arg Val Lys Pro Ile Ser Asn Tyr Asp Gly Ile Trp Ser Lys Trp Ser

420 425 430

Glu Glu Tyr Thr Trp Lys Thr Asp Trp Val Met Pro Thr Leu Trp Ile

435 440 445

Val Leu Ile Leu Val Phe Leu Ile Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Arg

450 455 460

Phe Gly Cys Val Ser Val Tyr Arg Thr Tyr Arg Lys Trp Lys Glu Lys

465 470 475 480

Ile Pro Asn Pro Ser Lys Ser Leu Leu Phe Gln Asp Gly Gly Lys Gly

485 490 495

Leu Trp Pro Pro Gly Ser Met Ala Ala Phe Ala Thr Lys Asn Pro Ala

500 505 510

Leu Gln Gly Pro Gln Ser Arg Leu Leu Ala Glu Gln Gln Gly Glu Ser

515 520 525

Tyr Ala His Leu Glu Asp Asn Asn Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu Asp

530 535 540

Pro Asn Ile Ile Arg Val Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro Ala

545 550 555 560

Ala Ser Ser Glu Ser Thr Glu Gln Leu Pro Asn Val Gln Val Glu Gly

565 570 575

Pro Thr Pro Asn Arg Pro Arg Lys Gln Leu Pro Ser Phe Asp Phe Asn

580 585 590

Gly Pro Tyr Leu Gly Pro Pro Gln Ser His Ser Leu Pro Asp Leu Pro

595 600 605

Asp Gln Leu Gly Ser Pro Gln Val Gly Gly Ser Leu Lys Pro Ala Leu

610 615 620

Pro Gly Ser Leu Glu Tyr Met Cys Leu Pro Pro Gly Gly Gln Ala Gln

625 630 635 640

Leu Val Pro Leu Ser Gln Val Met Gly Gln Gly Gln Ala Met Asp Val

645 650 655

Gln Cys Gly Ser Ser Leu Glu Thr Ser Gly Ser Pro Ser Val Glu Pro

660 665 670

Lys Glu Asn Pro Pro Val Glu Leu Ser Met Glu Glu Gln Glu Ala Arg

675 680 685

Asp Asn Pro Val Thr Leu Pro Ile Ser Ser Gly Gly Pro Glu Gly Ser

690 695 700

Met Met Ala Ser Asp Tyr Val Thr Pro Gly Asp Pro Val Leu Thr Leu

705 710 715 720

Pro Thr Gly Pro Leu Ser Thr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Gly Leu Pro

725 730 735

Ser Ala Gln Ser Pro Ser Leu Cys Leu Lys Leu Pro Arg Val Pro Ser

740 745 750

Gly Ser Pro Ala Leu Gly Pro Pro Gly Phe Glu Asp Tyr Val Glu Leu

755 760 765

Pro Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Lys Ser Pro Pro Gly His Pro Ala

770 775 780

Pro Pro Val Ala Ser Ser Pro Thr Val Ile Pro Gly Glu Pro Arg Glu

785 790 795 800

Glu Val Gly Pro Ala Ser Pro His Pro Glu Gly Leu Leu Val Leu Gln

805 810 815

Gln Val Gly Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu Gly Pro Gly Ser Leu

820 825 830

Ser Pro His Ser Lys Pro Pro Ser Pro Ser Leu Cys Ser Glu Thr Glu

835 840 845

Asp Leu Val Gln Asp Leu Ser Val Lys Lys Phe Pro Tyr Gln Pro Met

850 855 860

Pro Gln Ala Pro Ala Ile Gln Phe Phe Lys Ser Leu Lys His Gln Asp

865 870 875 880

Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Asp Asn Ser Gln Ser Gly Lys Val Cys

885 890 895

<210> 2

<211> 897

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Val Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Met Ala Leu Leu Ala Leu Cys

1 5 10 15

Trp Glu Arg Ser Leu Ala Gly Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr

20 25 30

Leu Arg Cys Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser His Ile Thr Cys Arg Trp Ala

35 40 45

Asp Thr Gln Asp Ala Gln Arg Leu Val Asn Val Thr Leu Ile Arg Arg

50 55 60

Val Asn Glu Asp Leu Leu Glu Pro Val Ser Cys Asp Leu Ser Asp Asp

65 70 75 80

Met Pro Trp Ser Ala Cys Pro His Pro Arg Cys Val Pro Arg Arg Cys

85 90 95

Val Ile Pro Cys Gln Ser Phe Val Val Thr Asp Val Asp Tyr Phe Ser

100 105 110

Phe Gln Pro Asp Arg Pro Leu Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Leu Thr

115 120 125

Gln His Val Gln Pro Pro Glu Pro Arg Asp Leu Gln Ile Ser Thr Asp

130 135 140

Gln Asp His Phe Leu Leu Thr Trp Ser Val Ala Leu Gly Ser Pro Gln

145 150 155 160

Ser His Trp Leu Ser Pro Gly Asp Leu Glu Phe Glu Val Val Tyr Lys

165 170 175

Arg Leu Gln Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Thr

180 185 190

Ser Gln Ala Thr Leu Gly Pro Glu His Leu Met Pro Ser Ser Thr Tyr

195 200 205

Val Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ser Arg Leu Ser Gly

210 215 220

Arg Pro Ser Lys Trp Ser Pro Glu Val Cys Trp Asp Ser Gln Pro Gly

225 230 235 240

Asp Glu Ala Gln Pro Gln Asn Leu Glu Cys Phe Phe Asp Gly Ala Ala

245 250 255

Val Leu Ser Cys Ser Trp Glu Val Arg Lys Glu Val Ala Ser Ser Val

260 265 270

Ser Phe Gly Leu Phe Tyr Lys Pro Ser Pro Asp Ala Gly Glu Glu Glu

275 280 285

Cys Ser Pro Val Leu Arg Glu Gly Leu Gly Ser Leu His Thr Arg His

290 295 300

His Cys Gln Ile Pro Val Pro Asp Pro Ala Thr His Gly Gln Tyr Ile

305 310 315 320

Val Ser Val Gln Pro Arg Arg Ala Glu Lys His Ile Lys Ser Ser Val

325 330 335

Asn Ile Gln Met Ala Pro Pro Ser Leu Asn Val Thr Lys Asp Gly Asp

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Arg Trp Glu Thr Met Lys Met Arg Tyr Glu His Ile

355 360 365

Asp His Thr Phe Glu Ile Gln Tyr Arg Lys Asp Thr Ala Thr Trp Lys

370 375 380

Asp Ser Lys Thr Glu Thr Leu Gln Asn Ala His Ser Met Ala Leu Pro

385 390 395 400

Ala Leu Glu Pro Ser Thr Arg Tyr Trp Ala Arg Val Arg Val Arg Thr

405 410 415

Ser Arg Thr Gly Tyr Asn Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser Glu Ala Arg

420 425 430

Ser Trp Asp Thr Glu Ser Val Leu Pro Met Trp Val Leu Ala Leu Ile

435 440 445

Val Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu Leu Ala Leu Arg Phe Cys Gly

450 455 460

Ile Tyr Gly Tyr Arg Leu Arg Arg Lys Trp Glu Glu Lys Ile Pro Asn

465 470 475 480

Pro Ser Lys Ser His Leu Phe Gln Asn Gly Ser Ala Glu Leu Trp Pro

485 490 495

Pro Gly Ser Met Ser Ala Phe Thr Ser Gly Ser Pro Pro His Gln Gly

500 505 510

Pro Trp Gly Ser Arg Phe Pro Glu Leu Glu Gly Val Phe Pro Val Gly

515 520 525

Phe Gly Asp Ser Glu Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu Asp Pro Lys His

530 535 540

Val Cys Asp Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro Ala Ala Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Ser Pro Gln Pro Gly Pro Pro Ala Ala

565 570 575

Ser His Thr Pro Glu Lys Gln Ala Ser Ser Phe Asp Phe Asn Gly Pro

580 585 590

Tyr Leu Gly Pro Pro His Ser Arg Ser Leu Pro Asp Ile Leu Gly Gln

595 600 605

Pro Glu Pro Pro Gln Glu Gly Gly Ser Gln Lys Ser Pro Pro Pro Gly

610 615 620

Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Gly Gly Gln Val Gln Leu Val

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Pro Leu Ala Gln Ala Met Gly Pro Gly Gln Ala Val Glu Val Glu Arg

645 650 655

Arg Pro Ser Gln Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ser Leu Glu Ser Gly Gly

660 665 670

Gly Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Gly Gly Gln Asp Gln

675 680 685

Lys Asp Ser Pro Val Ala Ile Pro Met Ser Ser Gly Asp Thr Glu Asp

690 695 700

Pro Gly Val Ala Ser Gly Tyr Val Ser Ser Ala Asp Leu Val Phe Thr

705 710 715 720

Pro Asn Ser Gly Ala Ser Ser Val Ser Leu Val Pro Ser Leu Gly Leu

725 730 735

Pro Ser Asp Gln Thr Pro Ser Leu Cys Pro Gly Leu Ala Ser Gly Pro

740 745 750

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Lys Ser Gly Phe Glu Gly Tyr Val Glu

755 760 765

Leu Pro Pro Ile Glu Gly Arg Ser Pro Arg Ser Pro Arg Asn Asn Pro

770 775 780

Val Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Val Leu Asn Pro Gly Glu Arg Pro

785 790 795 800

Ala Asp Val Ser Pro Thr Ser Pro Gln Pro Glu Gly Leu Leu Val Leu

805 810 815

Gln Gln Val Gly Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu Gly Pro Gly Pro

820 825 830

Leu Ser Leu Arg Ser Lys Pro Ser Ser Pro Gly Pro Gly Pro Glu Ile

835 840 845

Lys Asn Leu Asp Gln Ala Phe Gln Val Lys Lys Pro Pro Gly Gln Ala

850 855 860

Val Pro Gln Val Pro Val Ile Gln Leu Phe Lys Ala Leu Lys Gln Gln

865 870 875 880

Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Glu Val Asn Lys Pro Gly Glu Val

885 890 895

Cys

<210> 3

<211> 4620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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cactctcagg tgtccttcct taggtacaga atatcttctt cttgagacag ggtttctcat 120

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<212> DNA

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgctgg cccaggggct gctctccatg gccctgctgg ccctgtgctg ggagcgcagc 60

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ttccagcact gcaggcttgt cttgaagaaa accgttctca ccactcactt agaaacctac 4260

caagttagaa aactctgtcc gcttagttgt ttcatctcat ctctgaagca acccatttcc 4320

tggatgtggc ccttgaggcc caggaggtca gatgcctcct ctgaagtccc acagctgagc 4380

agtaatgaca gagatggggt cagccttccc gggggcttcc tgcatggtag acagggagct 4440

tgtctcctcg ctgccctgga ggaggggccc cggtgtgggc cgaaatccca cagtggtcca 4500

tgaagccatc tgtggtctag ggtggggtag atgattattt tatgtagtta ggttttattt 4560

gcctctatat tagaaagaaa tataacctgc acttcgaagt cctggattca aggaaatggt 4620

tgcttagaat gaagctaaac ctgaaaaggg acacgtttta tgaaagtttt cgttgacgtg 4680

gcaaaaaccc atgctggtgg caggctggta ggaggtactg caggctgtca ttgggagtct 4740

cagaaccacg gcaggcttgg tgctgttatt ggtgcctttg gctgctgctg aaacggagac 4800

agagggaggt gactagtcca aggcctctct actgctgctg gcagagctga gatccagtgc 4860

aggatggtct gagtccccgg tcctaaccac cgaaccacct ggtgctcttt gcaagggtca 4920

cacggaaggg gctctgacca tggcttcctg cccttttttg ccacaacatc ataaagccac 4980

tgccagagga ggggatcagt taggccacca ggagtccatc agaagcaaca tttccacaca 5040

tgggtttgat ggacacgaga gtcccttcct tcccgaatgg agctcagggg gcccaggctg 5100

gagggagggg aaacactgta tgccgtccac cgtgagaact tactgacagt ggcgggtggg 5160

tgcctcatgc agggggtaaa gggcagggcc cctgggagat cagaacaggc ttcccagagg 5220

gaagagcttt gcaactcaga tctgaagggt agacaggagg ggagggcagt aagagcctct 5280

ctggcagggt aacagctgtg cagaggctgg gggatcagaa gggcatgggc agctggggaa 5340

cctgctcacc attgtgtcca gggagcatca gcttcaaggg ctggacagcg gtgggaagaa 5400

gcaggagaca caggtaagga cctgtccctg gagaggcttc tgtctcctgc agtctcaggt 5460

agaggggacc ctctaggcat ggagagcact gaggggaaat gacatgatca gatgtggatg 5520

tgagaatgct ggggacaggg gacttacagg gtagattgga ggagcattag ttgggaaaga 5580

agttgaaatt caggctgtgg cctaaagcac tcattcctag aaatgatgag gacacaactg 5640

gctaggagat ggggacatga gggcatgcaa atcatagttc agatatacac acaattcatt 5700

cattcaacct tctttccttg agcgcctaca taagccaacg aagcagtcaa caaaccagcc 5760

agcaaccctg cccttggagc ttacagcctg gaaacaagga aggtttctaa ggcgatggag 5820

acaacttaga tatagggaga gaagtgtggc ccttggcctc ctggagcctg tgttgagtag 5880

cgaggtaggg tccagcctaa tgcagattag caatgaatca aggatgctgg gaggtactgg 5940

gcaggcgaca ggcatgcatc tgatctgctc tgagtctcca tgtttggaga ccttggacat 6000

tttacttcct ctatgagttt ctccgtctgt gaaatgagct ggtggactca agaggtttct 6060

cttgagttgg ctgagcaggt ttctgatggg gctcccagtc tgcgcagttt gtggcagctt 6120

ccgagagggc tctgccggga agagctcccc ctccatgaca gcctcggggg ctgggagtgc 6180

agtgacccat gagggacgcc tgtcctggct gtgggtgagg aggggcggtt cccctgctgt 6240

gtgtctgccg ttctgggttg atggttcctg acatgctcta gcatgccata acccatgtcc 6300

agcagagagc acttacatcc tatgtgtgag gatgttttcg tttgaaagcc atccctcagc 6360

aagcagacac cagaaaccag aaatcaggtg ccgtgtcttc attctgcatt ttcttgaaca 6420

acccagagtt cccaggagat agatgcttgc cttgtggctg caaggatttc atgagaagcc 6480

ccaaagttgc ttacgcgtat ttgttcattc attcactcat tcaccttgcc ccataattca 6540

ctgagaagcc gcatctcagc ctggaggtag ggaagggggt caggaccaat cccacccacc 6600

cccatctcct cacaccttag gggaggcaga cacagaagca taggaatccc tcagctgtgg 6660

taaggccctg gtggagggaa ttccactgag ctatggtgaa atgagagaag gaatgaggga 6720

ttccgcctgg agatgcagat ccgaggatgt tcctagagcc ggaggcattt gcccggggca 6780

ctgacaacag gaaggaccct gggcaggagg aagggagctt ggacagcagg aggggggagg 6840

ccgctgaacc gcaggcccct ctgctagcag gagccaccca ggccgcagcg tgggcagtgg 6900

ggagcctcag gacagaggag gctccaatga gtttcctcgc cagcgctttt tatggagttc 6960

gggtcacgtg cgcattgcaa tctgcacggc tttccattgc tttcatgttg aaaccctaca 7020

gttttgcaga tgaagggctg aggctcacag aggagacggg tcttgctcaa ggtccctcag 7080

ctgctggggg caggggtggc ctggaacccc ctgtgtccac acaaaaggcc atgcaggccc 7140

tgactgcccc ccagcggtcc agcccttagg tgcccttcac ttcctcccct ccagtccagc 7200

ctcctgagcc cagggacctg cagatcagca ccgaccagga ccacttcctg ctgacctgga 7260

gtgtggccct tgggagtccc cagagccact ggttgtcccc aggggatctg gagtttgagg 7320

tggtctacaa gcggcttcag gactcttggg aggtaggaac cacggccagc tctgccccag 7380

cccgaaggga tgggcagcac ccctcctcca gcacccactg tctcctgaca ggacgcagcc 7440

atcctcctct ccaacacctc ccaggccacc ctggggccag agcacctcat gcccagcagc 7500

acctacgtgg cccgagtacg gacccgcctg gccccaggtt ctcggctctc aggacgtccc 7560

agcaagtgga gcccagaggt ttgctgggac tcccagccag gtaatgttgc cagagcccag 7620

gaaatgcccc gtggtgggag ggcaggctca tcaggagctc ctggcacagc agggttcctg 7680

ggctccacct gggggcttcc cagatctcct gctgccatct ttccagtagc gtccctgggc 7740

cgtcccacct ctactgtgac cactgaccag taggactctg catctgttca ctttgggttt 7800

ccagttttct gcacgttctc tgccaatggc aattacaata ataacaacaa cagtgctatt 7860

agcagctgtg tgttaatgga ggctacagga tgctcagggc ttacccacat ttttcagttc 7920

aatccccaaa cactgaaact tagatactat ttccattctc ccgggagggc gtgcaggtgc 7980

acagaactct ctctctctct ctcggagctg ttggacacac agctggcagg ttcaggctga 8040

agtttcagcc ctggtctttt ggccccagag ctcatgacct ctgtgtgatg aatcacacgg 8100

tgggcaccca ctgagagcta tgggagggat gaatgacgga gtacatgagg acctgtctcc 8160

aacccagggg atgaggccca gccccagaac ctggagtgct tctttgacgg ggccgccgtg 8220

ctcagctgct cctgggaggt gaggaaggag gtggccagct cggtctcctt tggcctattc 8280

tacaagccca gcccagatgc agggtgagca tcttttttct ccatcccctc ccctcctctt 8340

ggccttgctc tctccaagct tcctcctgtc cctggggccc cagcagaagc cacagcccac 8400

cctaagctct cctccctccc gtgtgccctc cctctccctg ccctcagctc tgctgtgctc 8460

ctcagggagg aagagtgctc cccagtgctg agggaggggc tcggcagcct ccacaccagg 8520

caccactgcc agattcccgt gcccgacccc gcgacccacg gccaatacat cgtctctgtt 8580

cagccaagga gggcagagaa acacataaag agctcagtga acagtgagtt tgctcctagc 8640

ccgctgtggg gatggtctgg gaccagcaca ccctcattgt gtaacccgaa tcagttcagg 8700

gttcctcctg gccccgtctt catgtttgtc actttcaaag agatgcagtc cagtgaccaa 8760

aagtgaacag agaagcaatg aaaccacgac ggcagtggcc aaaaacagga gcagatcttt 8820

aaaacctctg atctcttgtc cttttcttct gcttccctct cccatcctgc agctctctaa 8880

atctccactg ctagccacac cctcctggtc ctgtcaccaa aaccttccct ttcattcctc 8940

attggatttt cctctttctg atatccgaaa ttccccaccg actgatattc tatctttaat 9000

gtaattgatc tatgatgtac ttttcaactg gagcctgtgg tgtgtacaaa tagtgttgat 9060

ccttggaggt taacatccct cgtttctgtg atgtaacaag gaccccagtg caatggaacc 9120

tctcacgttg tttcatgatg accaagttct tccatccagt ctttagcata tgtgaagggc 9180

agaggccaat ttgtcttaat tacctgggtt tgaatttacc attaactctc ttgggatcct 9240

cactggaaaa aggaattctg attgttcaaa agcacaggat atattaaggg cctcatataa 9300

tgcctggcac ataagagacc tcagcaaatt acgggcattc atattatgtt tatacagtga 9360

aggcatcaag gttataagca ttctcttttt tcttttgggt agactgaagc tcagagaggt 9420

tgagtggctt acttaaagct gcacagctat tagtaggcag atcaagatta gagttcagaa 9480

cttctcactc cctgcccagt ttctgctttc tttacccttt gcctctttca agttgtgggt 9540

ctgccggcca ggtgggaggt gctgtctgca aagggcttcc ctttctcttt ggccactatc 9600

tggctgggga gaggcctcac ctagatgttg ttgaaggcct gttacagccg ctttattggg 9660

gattttctgg cgatgagaac gtgtgaatgt cctggccttt agtcaactcc ctacacctct 9720

gagagtgtca gacaagagag cccatcacac tggtgggatt gcaatctttg cctctaccac 9780

tgcttagctg cctttcctta gggcaagtta cttaatggtt ctgtgactca gtttccctgt 9840

ttgtgaaaag tgaaggttaa tagtacccac catatagggc tgttagaatg gagtggaata 9900

attcatgtag aataagtatg tataacagtg gctaaaacat agtcaggctg ggcgcggtgg 9960

ctcacgcctg taatcccagc actttgggag gccaaggcat gtggatcacg tgaggtcagg 10020

agctcaagac cagcctggcc aacatggtga aaccccgtct ccactgaaaa tacaaaaatt 10080

agctgggctt ggtggcgggt gcctgtaatc ccagctactc gggaggctga ggcaggagaa 10140

tcacttgaac ccaggaggca gaggttgcag ttagccaaga tcacaccact gcactccagc 10200

ctgggcaaca gagtgagact ccgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatag ccagttgcct 10260

agaatagaac caactaacag tggttttatt tttactgcaa aaaataaaaa taaaaatagg 10320

agtagtgcaa gcactgggcc acatcactac aaaacaagtg tatctcagca tctcccacga 10380

gaataccact caggtcaaaa catgatatag tgaagtgggg atgaaaagga tccaaccatg 10440

ggcagaacct ggggtctggt gccagtggag acagccccag tgtctagcat gagacacggg 10500

gaatgttccg ttggagggtg ggtatgatga ctctcctgaa agcttccctc cctccagtcc 10560

agatggcccc tccatccctc aacgtgacca aggatggaga cagctacagc ctgcgctggg 10620

aaacaatgaa aatgcgatac gaacacatag accacacatt tgagatccag tacaggaaag 10680

acacggccac gtggaaggtg agggcctttg cccagggagg ggagaaacac tggggagggc 10740

gggagaaggg aaagcaacca gaggcattcc acctgcaagg cgtcgggccc ttggcaggtg 10800

accagtgaga ggtagccact gggacgtggt gatcactagg ctgtgtggtc agcaggtcac 10860

tgtcctgtct cttggtgaag taactgaggt ttggaaaagt ggcgtggctt ggccaacgtg 10920

aacagctgac cctgagtccc caggcaacag aagaccctct gggcagggag gggttgaaag 10980

gccactggga agaaggtttt caaaagtcat gaaagtttgg ggttatttcc tcagaggaat 11040

ctcatctgga cacacatgga ggctcagaca gagctgcttc taatgagtcg ggggtgcgcc 11100

caggccaggg ctcggtcccc tgcctccaca gagcccagaa cagaaaccac agaaccaacc 11160

ccacaccttc agtctagaaa tggggcaact gaggctagga gggaggtggg ccagtggtgg 11220

agccaggagc gggccctggg gtcctgaacc cccattctca gggtccagag tccagtcggc 11280

ctgcactgcg ttcctaaaaa ggccacaata tgggtgcaag ctgccccaga agggctggga 11340

gctgagaagg ctcaaaatag ggtgggacag gtggcttcag ggttctgggc ctcagtgttg 11400

tcaatgtcag gggctgcact gacaggtgga gtccccggtg ccatccgaag tgctgtccgt 11460

gggtgggccc tcagggagga tccacggtgg tgagagagaa gccgcagcag gcctggggta 11520

tggcaggagc taggagccag cgaagccgag ggtccaggtg ggagggattt gcagctgctc 11580

ccacgggcac cgggccaggc ctcaccctca gtgccaaccc acaggacagc aagaccgaga 11640

ccctccagaa cgcccacagc atggccctgc cagccctgga gccctccacc aggtactggg 11700

ccagggtgag ggtcaggacc tcccgcaccg gctacaacgg gatctggagc gagtggagtg 11760

aggcgcgctc ctgggac 11777

<210> 6

<211> 4776

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatctgctct ctgtttcctc cagatggggc acagataaat aggaagagcc tgcaactcac 60

tggcacttgg aggctcccga aggaggctgc ctgtcgccca agcacagagc cacaaaggat 120

gcagtctagg agggaagaat cacaagccct gtaagatgag tggagccaaa cccccagcca 180

agcaccaata cagaaccccg ggacaatgag gacacccccc tgcccatagc ttccagtgca 240

gccaccaaaa gtgccaaaat ggtgctggcc caggggctgc tctccatggc cctgctggcc 300

ctgtgctggg agcgcagcct ggcaggggca gaagaaacca tcccgctgca gaccctgcgc 360

tgctacaacg actacaccag ccacatcacc tgcaggtggg cagacaccca ggatgcccag 420

cggctcgtca acgtgaccct cattcgccgg gtgaatgagg acctcctgga gccagtgtcc 480

tgtgacctca gtgatgacat gccctggtca gcctgccccc atccccgctg cgtgcccagg 540

agatgtgtca ttccctgcca gagttttgtc gtcactgacg ttgactactt ctcattccaa 600

ccagacaggc ctctgggcac ccggctcacc gtcactctga cccagcatgt ccagcctcct 660

gagcccaggg acctgcagat cagcaccgac caggaccact tcctgctgac ctggagtgtg 720

gcccttggga gtccccagag ccactggttg tccccagggg atctggagtt tgaggtggtc 780

tacaagcggc ttcaggactc ttgggaggac gcagccatcc tcctctccaa cacctcccag 840

gccaccctgg ggccagagca cctcatgccc agcagcacct acgtggcccg agtacggacc 900

cgcctggccc caggttctcg gctctcagga cgtcccagca agtggagccc agaggtttgc 960

tgggactccc agccagggga tgaggcccag ccccagaacc tggagtgctt ctttgacggg 1020

gccgccgtgc tcagctgctc ctgggaggtg aggaaggagg tggccagctc ggtctccttt 1080

ggcctattct acaagcccag cccagatgca ggggaggaag agtgctcccc agtgctgagg 1140

gaggggctcg gcagcctcca caccaggcac cactgccaga ttcccgtgcc cgaccccgcg 1200

acccacggcc aatacatcgt ctctgttcag ccaaggaggg cagagaaaca cataaagagc 1260

tcagtgaaca tccagatggc ccctccatcc ctcaacgtga ccaaggatgg agacagctac 1320

agcctgcgct gggaaacaat gaaaatgcga tacgaacaca tagaccacac atttgagatc 1380

cagtacagga aagacacggc cacgtggaag gacagcaaga ccgagaccct ccagaacgcc 1440

cacagcatgg ccctgccagc cctggagccc tccaccaggt actgggccag ggtgagggtc 1500

aggacctccc gcaccggcta caacgggatc tggagcgagt ggagtgaggc gcgctcctgg 1560

gacacttgga agactgactg ggtgatgccc acgctgtgga tagtcctcat cctggtcttt 1620

ctcatcctca ccttgctcct gatccttcgc tttggctgtg tctctgtata caggacgtac 1680

aggaagtgga aggaaaagat ccccaacccc agcaagagcc tcctgttcca ggatggaggt 1740

aaaggtctct ggcctcctgg cagcatggca gccttcgcca ctaagaaccc cgctctccag 1800

gggccacaga gcaggcttct tgctgagcaa cagggggagt catatgcaca tttggaagac 1860

aacaacgtgt cacctctcac tatagaggac cctaatataa ttcgagttcc accatccggg 1920

cctgatacaa ccccagctgc ctcatccgaa tccacagagc aacttcccaa tgttcaagta 1980

gagggaccaa ctcctaacag acctaggaag caattaccca gctttgactt caatgggccc 2040

tacctggggc ctccccaatc ccactctctg cctgatctcc cagaccagct gggttccccc 2100

caggtgggtg ggagcctgaa gccagcactg ccaggctcct tggagtacat gtgtctgccc 2160

cctggaggtc aagcgcaact ggttccattg tcccaggtga tggggcaggg ccaggctatg 2220

gatgtgcagt gtgggtccag cctggagacc tcagggagcc cttctgtgga gccaaaggag 2280

aaccctccag ttgagctgag catggaggaa caggaggcac gggacaaccc agtgactctg 2340

cccataagct ctgggggccc tgagggcagt atgatggcct ctgattatgt cactcctgga 2400

gatccggtgc tcactctgcc cacagggccc ctgtctacct ctctgggccc ctctctaggg 2460

ttgccctcag cccaaagccc cagtctctgt cttaagctgc ccagggtccc ctctggaagc 2520

ccagctctag ggccaccagg gtttgaggac tatgtggagc tgcctccaag tgtgagccag 2580

gctgccaagt cccctccagg ccatcctgct cctcctgtgg caagcagccc cacagtgatc 2640

ccaggagagc ccagggagga agtgggccca gcatccccac atcccgaagg cctccttgtt 2700

cttcagcagg ttggggacta ctgcttcctc cctggcctgg gacctggctc cctctcacca 2760

cacagtaagc caccctctcc aagtctgtgt tctgagactg aggacctagt ccaggacttg 2820

tctgtcaaaa agtttcccta tcagcccatg ccccaggcgc cagccattca gtttttcaag 2880

tccctaaagc atcaggacta cctgtccctg cccccttggg acaatagcca gtctgggaag 2940

gtgtgctgag tctgtctcct cccaatctca ccagcagcct ggcaccgcag cctgtggtcc 3000

tcagcctgag catcaccaca gaagcctctc tgagttcaca ctcctccttg ctcccagccc 3060

tgacatggca ataccccacc tgtgcttttc tcttccccct ctgtccctct tcccctccct 3120

ccatgcaccc ccatctctct ctctgcagtt ttctgccttc tatgggaact tccttcctat 3180

tcctctgacc tgttggagtg gggatgaggc ctgtgagggt atgggctgtt tagggtttac 3240

aaacctgtga ggccggacgg tggtggcgca ttcccttaat cccagcactc tggaggcaga 3300

ggcaggcaga tttctgagtt tgagtccagc ctggtctaca aagtgagttc caggacagcc 3360

aggactatac agagaacccc tgtctcgaga aaccaaaaag aaaaaaaaaa aagaactgct 3420

gaggtcggct tgtccaccac aggcattggt aatacagcac atttctggct ctgtgtgaaa 3480

ggtgggagtc tcaggtgagc cccttgggag gtcagactgt acaattgggc aggctcttgt 3540

cgctacaaga atagacatgg tcctctatgg ttgtctgaaa ctcctgggga gacctgggga 3600

accttgtaga gggtacttgg taccctcctt atatacagaa atcactgatg tgcacaaagc 3660

tggacacagc tatggccagg ctggagggat gagaagcaat gggaaggctg tgtgtctaga 3720

actcatggtc tcaactgcag acaagcttag ttgtggatcc tggacagcac acccagatac 3780

taagtctaga cagctgagct gttcgttagt tctccctcca gagcaaagcc tggatacctg 3840

tgctcccacc ggcctcagat gagggtctgc tgtgagactg tggcccttgg ccatcaccac 3900

cctcttgaca atccatgcac aatgccatta cctcattctg ttctcactgg agttgtttgt 3960

tcatggtcac gtttgcacat ggcctttgtg tgtgtctcga gcattggctt tttgggtggt 4020

agcgaggaag tagacttgga agttgagctc atgaacagtt ttgtgcttca gactgtcttt 4080

tttggatgag actgaatagc tcttcccaca tggcctcttg tgggccacac gtgtctcccc 4140

tgagtgtcct aattttgtgc aggaggcaca ccagctctgt cagccattgc gtgtctgcat 4200

tgctatgaga tgggttgccg agccacacct gtctttgggt ccctgtttgc aggggtcttt 4260

gctgtaagtg cacacgtgcc tttgtttatg ttctttctgg ttccttctgt gtctaaagcc 4320

ttgagtgaga gacttggagt tttctagaac acatgatctc tctacagagt tcagtcttga 4380

tgtgttctat ggacctggag tcaatggaca ttgtatcatt tcttcaccta tttgtgctct 4440

gtcaggcact ccatgatcca ccaagtcatg aactggatct ggtctgtcct atcccctggc 4500

ctcactcaca tgatggcaga catagaatgt ggcagatcaa atgtcccttg gtctctgttc 4560

attgcagcaa agaaaaccac taacatcttg agtgtgttgc agtggcaatg ttcaacatca 4620

gcctgtcaat actttccaaa gtgaccactc tagagaaaca aacaggagtg gcctccatgt 4680

taagatgtga atgccaaagt gccttgcata agaggaaata ttgtaataaa catgtttaca 4740

tacaataaaa cagcaaaaca aggcaaaaaa aaaaaa 4776

<210> 7

<211> 893

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Val Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Met Ala Leu Leu Ala Leu Cys

1 5 10 15

Trp Glu Arg Ser Leu Ala Gly Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr

20 25 30

Leu Arg Cys Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser His Ile Thr Cys Arg Trp Ala

35 40 45

Asp Thr Gln Asp Ala Gln Arg Leu Val Asn Val Thr Leu Ile Arg Arg

50 55 60

Val Asn Glu Asp Leu Leu Glu Pro Val Ser Cys Asp Leu Ser Asp Asp

65 70 75 80

Met Pro Trp Ser Ala Cys Pro His Pro Arg Cys Val Pro Arg Arg Cys

85 90 95

Val Ile Pro Cys Gln Ser Phe Val Val Thr Asp Val Asp Tyr Phe Ser

100 105 110

Phe Gln Pro Asp Arg Pro Leu Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Leu Thr

115 120 125

Gln His Val Gln Pro Pro Glu Pro Arg Asp Leu Gln Ile Ser Thr Asp

130 135 140

Gln Asp His Phe Leu Leu Thr Trp Ser Val Ala Leu Gly Ser Pro Gln

145 150 155 160

Ser His Trp Leu Ser Pro Gly Asp Leu Glu Phe Glu Val Val Tyr Lys

165 170 175

Arg Leu Gln Asp Ser Trp Glu Asp Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Thr

180 185 190

Ser Gln Ala Thr Leu Gly Pro Glu His Leu Met Pro Ser Ser Thr Tyr

195 200 205

Val Ala Arg Val Arg Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ser Arg Leu Ser Gly

210 215 220

Arg Pro Ser Lys Trp Ser Pro Glu Val Cys Trp Asp Ser Gln Pro Gly

225 230 235 240

Asp Glu Ala Gln Pro Gln Asn Leu Glu Cys Phe Phe Asp Gly Ala Ala

245 250 255

Val Leu Ser Cys Ser Trp Glu Val Arg Lys Glu Val Ala Ser Ser Val

260 265 270

Ser Phe Gly Leu Phe Tyr Lys Pro Ser Pro Asp Ala Gly Glu Glu Glu

275 280 285

Cys Ser Pro Val Leu Arg Glu Gly Leu Gly Ser Leu His Thr Arg His

290 295 300

His Cys Gln Ile Pro Val Pro Asp Pro Ala Thr His Gly Gln Tyr Ile

305 310 315 320

Val Ser Val Gln Pro Arg Arg Ala Glu Lys His Ile Lys Ser Ser Val

325 330 335

Asn Ile Gln Met Ala Pro Pro Ser Leu Asn Val Thr Lys Asp Gly Asp

340 345 350

Ser Tyr Ser Leu Arg Trp Glu Thr Met Lys Met Arg Tyr Glu His Ile

355 360 365

Asp His Thr Phe Glu Ile Gln Tyr Arg Lys Asp Thr Ala Thr Trp Lys

370 375 380

Asp Ser Lys Thr Glu Thr Leu Gln Asn Ala His Ser Met Ala Leu Pro

385 390 395 400

Ala Leu Glu Pro Ser Thr Arg Tyr Trp Ala Arg Val Arg Val Arg Thr

405 410 415

Ser Arg Thr Gly Tyr Asn Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser Glu Ala Arg

420 425 430

Ser Trp Asp Thr Asp Trp Val Met Pro Thr Leu Trp Ile Val Leu Ile

435 440 445

Leu Val Phe Leu Ile Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Arg Phe Gly Cys

450 455 460

Val Ser Val Tyr Arg Thr Tyr Arg Lys Trp Lys Glu Lys Ile Pro Asn

465 470 475 480

Pro Ser Lys Ser Leu Leu Phe Gln Asp Gly Gly Lys Gly Leu Trp Pro

485 490 495

Pro Gly Ser Met Ala Ala Phe Ala Thr Lys Asn Pro Ala Leu Gln Gly

500 505 510

Pro Gln Ser Arg Leu Leu Ala Glu Gln Gln Gly Glu Ser Tyr Ala His

515 520 525

Leu Glu Asp Asn Asn Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu Asp Pro Asn Ile

530 535 540

Ile Arg Val Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro Ala Ala Ser Ser

545 550 555 560

Glu Ser Thr Glu Gln Leu Pro Asn Val Gln Val Glu Gly Pro Thr Pro

565 570 575

Asn Arg Pro Arg Lys Gln Leu Pro Ser Phe Asp Phe Asn Gly Pro Tyr

580 585 590

Leu Gly Pro Pro Gln Ser His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Asp Gln Leu

595 600 605

Gly Ser Pro Gln Val Gly Gly Ser Leu Lys Pro Ala Leu Pro Gly Ser

610 615 620

Leu Glu Tyr Met Cys Leu Pro Pro Gly Gly Gln Ala Gln Leu Val Pro

625 630 635 640

Leu Ser Gln Val Met Gly Gln Gly Gln Ala Met Asp Val Gln Cys Gly

645 650 655

Ser Ser Leu Glu Thr Ser Gly Ser Pro Ser Val Glu Pro Lys Glu Asn

660 665 670

Pro Pro Val Glu Leu Ser Met Glu Glu Gln Glu Ala Arg Asp Asn Pro

675 680 685

Val Thr Leu Pro Ile Ser Ser Gly Gly Pro Glu Gly Ser Met Met Ala

690 695 700

Ser Asp Tyr Val Thr Pro Gly Asp Pro Val Leu Thr Leu Pro Thr Gly

705 710 715 720

Pro Leu Ser Thr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Gly Leu Pro Ser Ala Gln

725 730 735

Ser Pro Ser Leu Cys Leu Lys Leu Pro Arg Val Pro Ser Gly Ser Pro

740 745 750

Ala Leu Gly Pro Pro Gly Phe Glu Asp Tyr Val Glu Leu Pro Pro Ser

755 760 765

Val Ser Gln Ala Ala Lys Ser Pro Pro Gly His Pro Ala Pro Pro Val

770 775 780

Ala Ser Ser Pro Thr Val Ile Pro Gly Glu Pro Arg Glu Glu Val Gly

785 790 795 800

Pro Ala Ser Pro His Pro Glu Gly Leu Leu Val Leu Gln Gln Val Gly

805 810 815

Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu Gly Pro Gly Ser Leu Ser Pro His

820 825 830

Ser Lys Pro Pro Ser Pro Ser Leu Cys Ser Glu Thr Glu Asp Leu Val

835 840 845

Gln Asp Leu Ser Val Lys Lys Phe Pro Tyr Gln Pro Met Pro Gln Ala

850 855 860

Pro Ala Ile Gln Phe Phe Lys Ser Leu Lys His Gln Asp Tyr Leu Ser

865 870 875 880

Leu Pro Pro Trp Asp Asn Ser Gln Ser Gly Lys Val Cys

885 890

<210> 8

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtctatcta tgtacacaga taaattggaa ggttggtggg acccattcgg tcgacggtat 60

cgataagctt gatatcgaat tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag ga 112

<210> 9

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctctagaaag tataggaact tcatcagtca ggtacataat ggtggatcca atatttcctg 60

ctgatttccc ttcccttgaa ccctgcagtc agtgctggtg tgtcc 105

<210> 10

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcgcacgtc tgccgcgctg ttc 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggattgtca agagggtggt gatgg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacctgggca agaaacagag catca 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcaacaacg tgtctcacac atgga 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atctcttgct gttcacctcc ttggc 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

accacttctc ttgcttactt caatgct 27

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 18

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacagctctc agccttacgc atctt 25

<210> 19

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagagagcca ccagtgccat gtag 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagtgaggac agggacaggg aagt 24

<210> 21

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctttgtgga agccatgata ggcca 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tggagttcat ggctctagcc ctctt 25

<210> 23

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctctcaggac gtcccagcaa 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agcaaggtga ggatgagaaa gac 23

<210> 25

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggaccagca aatggcact 19

<210> 26

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggtgtagaca ctggcccc 18

<210> 27

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctcaggagag tgtttcctcg tc 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccctgttgct gtagccgtat 20

Claims

1.一种CSF2RB基因人源化改造的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述的构建方法包括用SEQ ID NO.5所示核苷酸序列替换至非人动物CSF2RB基因座上，所述的非人动物表达人源化CSF2RB蛋白，所述的人源化CSF2RB蛋白包括人CSF2RB蛋白的胞外区和/或信号肽，所述的人源化CSF2RB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的构建方法包括使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂、3’臂，所述的5’臂如SEQ ID NO.3所示，所述的3’臂如SEQ ID NO.4所示，所述的非人动物为大鼠或小鼠。

2.权利要求1构建方法构建的非人动物在CSF2RB基因或蛋白相关研究中的应用，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法，所述的应用包括：

C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究的应用；