CN111485001A - 具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：具有人工补充外源性细胞因子IL‑15的步骤。本发明在补充外源性的人源细胞因子后，人源化免疫系统小鼠体内的NK细胞发育水平得到了极大提高，达到了正常人外周血中相应NK细胞亚群的水平，且具备相应的功能。

Description

具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法
技术领域
本发明涉及一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，属于生物模型领域。
背景技术
人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫系统发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物为替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物之间巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物虽然能感染HIV，但是感染后并不发病，而且属濒危动物，逐渐被禁止使用。因此，亟需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫系统人源化小鼠便应运而生。免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫系统及其免疫应答的重要工具。
由于普通小鼠中存在的免疫细胞会排斥外来移植的人源造血干细胞或淋巴细胞，为了制作免疫系统人源化的小鼠，需要拥有有足够免疫缺陷程度的小鼠。早在1988年，Mccune等发现在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干细胞、胎胸腺和胎淋巴结可以支撑人源T细胞和B细胞的重建。但是由于SCID小鼠较强的NK细胞功能对外源细胞的排斥作用，及随年龄增长出现小鼠T、B细胞，即发生“渗漏现象”等因素，均极大程度的限制了重建。随后通过SCID缺陷小鼠与NOD背景小鼠回交，产生了NOD/SCID小鼠，该小鼠NK细胞活性及天然免疫细胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下来的很长一段时间里，NOD/SCID小鼠被认为是用于人源化重建的最理想受者小鼠。然而，当研究者用造血干细胞进行免疫重建时，残存的NK细胞和天然免疫细胞活性，仍然成为了难以跨越的障碍。因此，为了制作更加完善的人源化免疫系统小鼠，需要克服目前免疫缺陷动物中过强的NK细胞功能。而NK细胞发育成熟过程中，IL-2是起到主要作用的细胞因子。因此，对NOD/SCID小鼠的IL-2受体的gamma亚基进行敲除，其体内的T，B和NK细胞基本完全缺失或失去功能，巨噬细胞及DC细胞及补体系统的功能也大幅减弱，且成年后不再会发生免疫渗漏问题，使其成为目前免疫缺陷程度最高的小鼠。且此重度免疫缺陷小鼠寿命比普通NOD/SCID小鼠长30-50％，达1.5-2年，极大的延长了实验的观察期。以上优点，使得此重度免疫缺陷小鼠对人源组织几乎没有排斥反应，使其成为目前最适合作为人源组织/细胞移植的实验动物，包括人源化动物模型(CD34+，BLT及PBLS人源化小鼠)，肿瘤移植及肿瘤干细胞研究(CDX，PDX)，人造血和免疫系统研究和人类感染性疾病(HIV，HBV)的动物模型首选。
但是上述小鼠的髓系免疫系统仍然保持完好。而且由于其淋巴系免疫系统的重度缺陷，其髓系免疫系统进行了代偿，使得其髓系免疫系统比普通小鼠更为强大。并且由于NK细胞的发育需要特定细胞因子的诱导分化和支持，例如IL-2和IL-15等细胞因子。而这些细胞因子的人鼠同源性较差，人的造血干细胞上的细胞因子受体，无法与鼠源的细胞因子结合。使得上述小鼠接种人源造血干细胞后，由于NK细胞的增殖能力较差，且面临来自小鼠髓系免疫系统的异体的排斥和吞噬作用等原因，其体内很难有NK细胞发育出来。进一步加大了人NK细胞发育的困难程度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，进一步完善人源化免疫系统小鼠，使其具有更加完整的免疫系统。
本发明采用了如下技术方案：
一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：
具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：补充细胞因子IL-15的方法包括AAV载体、质粒的高压水动力注射、FC化的长效细胞因子注射或者普通细胞因子注射。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，包括：
步骤一：制作常规的人源化免疫系统小鼠；
步骤二：制备包装好的AAV载体，AAV载体中包含细胞因子IL-15基因；
步骤三：向常规的人源化免疫系统小鼠体内注射包装好的AAV载体。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
步骤一中，制作常规的人源化免疫系统小鼠的方法如下：
步骤1-1，选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠；
步骤1-2，经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠；
步骤1-3，干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，即能够用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
步骤二中制备AAV载体的步骤如下：
步骤2-1，根据IL-15的人源基因序列进行引物设计；
步骤2-2，扩增目的基因IL-15；
步骤2-3，将目的基因构建入线性化表达载体中，形成重组质粒；
步骤2-4，制备感受态细胞；
步骤2-5，将重组后的质粒转化到感受态细胞中；
步骤2-6，使用菌落PCR鉴定阳性转化子；
步骤2-7，提取构建成功的质粒；
步骤2-8，将质粒包装到AAV病毒载体中。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
步骤三中，尾静脉注射包装好的AAV病毒载体，剂量范围为1*109～2*1011每只小鼠。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
AAV病毒包装完成后，还具有AAV对293T细胞的表达验证的步骤：
步骤2-10：总蛋白抽提：将病毒与293T细胞共同培养48小时后，离心洗涤并分离细胞，将细胞裂解后提取总蛋白，
步骤2-11：测蛋白浓度，
步骤2-12：样品制备，
步骤2-13：SDS-PAGE凝胶电泳，
步骤2-14：转膜，
步骤2-14：免疫反应，成像仪拍照。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
Fc化细胞因子注射的方法如下：
制备Fc化细胞因子：
步骤4-1，IL-15功能基因的克隆；
步骤4-2，人IgG Fc基因的克隆；
步骤4-3，Fc融合蛋白表达质粒的构建；
步骤4-4，将表达质粒转入受体细胞，并筛选高表达细胞株；
步骤4-5，IL-15与Fc融合蛋白的纯化：收集高表达细胞株的表达产物，分离提纯；
然后将IL-15与Fc的融合蛋白注射给常规的人源化免疫系统小鼠。
进一步，本发明的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，还具有这样的特征：
还具有鉴定步骤:采用流式检测，当模型小鼠的外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，NK细胞占人源免疫细胞的8％以上，则造模成功。
本发明还提供人源化免疫系统小鼠在针对NK细胞相关的药效评价中的应用。
发明的有益效果：本发明的进一步完善人源化免疫系统小鼠，使其具有更加完整的免疫系统。通过促进NK细胞的发育，提升该动物的ADCC能力。在原有的T，B淋巴细胞为主的免疫系统上，加强进行特异性细胞毒杀伤的能力。
本发明在补充外源性的人源细胞因子后，人源化免疫系统小鼠体内的NK细胞发育水平得到了极大提高，达到了正常人外周血中相应NK细胞亚群的水平，且具备相应的功能。
附图说明
图1是构建成功的质粒的示意图。
图2是Western Blot实验中蛋白Marker的电泳结果图。
图3是Western Blot实验中质粒表达的电泳结果图。
图4A、图4B、图4C、图4D是注射AAV前小鼠外周血的流式检测结果图。
图5A、图5B、图5C、图5D是注射AAV后小鼠外周血的流式检测结果图。
图6是本发明的小鼠模型对郝赛汀药效评价的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式，进一步说明本发明的技术方案。
本发明通过腺相关病毒AAV转染，质粒的高压水动力注射，或直接注射人源细胞因子等方法，生产一种基人源化免疫系统小鼠的，新一代具有髓系免疫系统的人源化小鼠。所述小鼠，在原有的人源化免疫系统小鼠的基础上，通过上述的三种方法，补充对NK细胞分化和发育起到关键作用的细胞因子IL-15。
实施方式中未具体描述的方法，均为在《生物化学实验技术》或者在商用试剂供应商所建议的实验操作下进行。
本发明具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法的整体步骤如下：
1.1制作常规的人源化免疫系统小鼠
1.2在4-16周检测人源化免疫系统小鼠外周血中人源免疫细胞的占比，如若符合历史数据，则该批动物可被用于制作带有髓系免疫系统的第二代人源化免疫系统小鼠。
1.3构建含有人源IL-15的质粒，及通过该质粒构建可以表达该三种人源细胞因子的AAV载体。
1.4在另一方法中，表达FC化的长效人源细胞因子IL-15-Fc。
1.4将构建好的AAV载体，质粒或者长效细胞因子注射进普通人源化免疫系统小鼠体内。再经过4-8周，该小鼠即可发育成具有人源髓系免疫细胞的人源化免疫系统小鼠。
1.5对该新一代人源化免疫系统小鼠进行表型和功能验证。
实施例一：
以下以AAV载体为例进行说明：
2.1质粒构建
首先查得IL-15的人源基因序列，并进行引物设计。通过高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：
表1：PCR反应体系
Figure BDA0002450477270000091
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。最终得到IL-15细胞因子的目的基因片段。
2.2线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
2.3目的基因构建入线性化表达载体中
将上步中所得的目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：
表2：重组反应试剂
ddH<sub>2</sub>O Up to 20μl
5x反应Buffer 4μl
插入片段 x μl
线性化载体 y μl
无缝克隆酶 2μl
总体积 20μl
最适插入片段使用量＝[0.04x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)
最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)
混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。
2.4感受态细胞的制备和转化：
使用CaCl2法制备及转化Ecoli DH5α感受态细胞，步骤如下：
制备：
1.取DH5α菌划线，过夜培养。
划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角划一下，逐渐降低菌液浓度。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中或者试管中5ml，37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中，接种浓度是1ml/100ml，37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600＝0.4左右。
4.分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min(离心前，离心机4℃预冷)，弃上清。
5.加10ml凉的0.1M CaCl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
6.4℃，3000g，离心10min,弃上清。
7.加10ml凉的0.1MCacl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
8.4℃，3000g，离心10min,弃上清。
9.加入2ml(2ml/50ml初始菌液量)0.1M Cacl2/15％甘油于50ml离心管中，轻轻摇匀。
10.分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
转化
1.具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.
2.42℃热激90s,不要摇动管，立即放在冰上1～2分钟。
3.加入1ml LB液体培养基至管中，37℃，200rpm,30min～1h,活化细菌。
4.取50μL菌液涂平板，涂板时，感受态涂两个，有抗性，无抗性，转化后菌液涂一个有抗性。
2.5菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：
表3：菌落PCR鉴定的反应体系
Figure BDA0002450477270000131
2.6阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，进行测序验证。测序结果显示上述三种细胞因子的质粒的测序结果，与目标细胞因子的序列完全符合，质粒构建成功。
2.7质粒提取：
测序通过的阳性克隆，安排质粒提取。
构建成功的质粒的示意图如图1所示。
2.8 AAV病毒包装
第一天：聚合度90％以上的HEK293细胞按1：3比例传盘，培养基Hycone高糖DMEM培养基，
第二天：转质粒前1-2天，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒和辅助质料转入HEK293T中
第三天：质粒转化24小时后，换新的无血清培养基，
第五天：转染72小时后，收集病毒。吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀，用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，过夜后收集病毒沉淀。
以上仅是AAV病毒包装的一种方法，本领域的技术人员亦可采用其它的成熟的AVV病毒包装方法，并不会影响本发明技术方案的效果。
2.9 AAV对293T细胞的表达验证
将病毒与293T细胞共同培养48小时后，离心洗涤并分离细胞。将细胞裂解后提取总蛋白。使用SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot测定目标蛋白的表达量。具体步骤如下：
2.9.1总蛋白抽提
2.9.1.1收细胞
a.从-20℃取出Western及IP细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，每990μl细胞裂解液加10μl PMSF，置于4℃冰上；
b.取出灭菌EP管，做好标记，置于4℃冰上；
c.从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤1-2次；
d.弃去PBS，加入适量预冷的Western及IP细胞裂解液(含PMSF)，冰上裂解细胞30min，细胞刮刮下细胞，将样品转移入EP管中；
e.转移含裂解细胞的离心管至预冷的高速低温离心机，4℃，
12000rpm离心5-10min。
2.9.2测蛋白浓度
2.9.2.1细胞蛋白液
从原液中抽出3μl，再加27μl PBS，稀释10倍。
2.9.2.2 BCA工作液配制
根据样品数量，按照A与B的体积比为50:1配制适量BCA工作液并充分混匀。
2.9.2.3制作标准蛋白梯度
将2000μg/mlBSA标准品稀释为0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/ml。
2.9.2.4蛋白浓度测定
将标准品和样品各取25μl加到96孔板中；
各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟；
用酶标仪测定A562的吸光度；
根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
2.9.3样品制备
将计算好的每孔数据，根据样品母液实际量等体积扩大、稀释，再加入loadingbuffer，按照1:4(loading buffer：细胞液)加入，混合，再95℃煮5min，摆放到干燥的冰盒上，然后4℃，12000g，离心5min。
2.9.4 SDS-PAGE凝胶电泳
将制作好的凝胶板固定到电泳装置内槽，将固定好的凝胶板放入外槽中，向外槽加入适量的1×SDS电泳缓冲液。并向内槽加入电泳缓冲液至刚好淹没凝胶加样孔；
小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。拔出梳子后以1×SDS电泳缓冲液冲洗和充满加样孔；
上样并进行SDS-PAGE电泳。连接电源，先在80V下电泳30min至溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳60min至溴酚蓝到达凝胶底部；
关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液，取出凝胶夹层。
2.9.5转膜
电泳结束前，准备与凝胶同样大小的1张PVDF膜与6张滤纸。PVDF膜用甲醇活化5min，然后在缓冲液中平衡15min；滤纸在转移缓冲液中平衡15min；
在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜；
将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫。在垫子上垫三层滤纸，去除其中的气泡；
撬去玻板，将浓缩胶轻轻刮去，凝胶在ddH2O中漂洗一遍，再于1×转膜缓冲液中漂洗一次。小心将分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子；
将夹子放入转移槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时产热，在槽的一边放一块冰降温。一般用300mA转移2h。
2.9.6免疫反应
表4：抗体信息表
抗体名称 品牌 货号 稀释比
FLAG Sigma F1804S 1:5000
Goat Anti-mouse IgG Beyotime A0216 1:3000
Tubulin Bioworld BS1482M 1:5000
Goat Anti-mouse IgG Beyotime A0216 1:3000
免疫反应
将膜移至含5％脱脂奶粉的TBST孵育盒中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h；
一抗用含5％脱脂奶粉的TBST稀释至适当浓度；从封闭液中取出膜，膜的蛋白面朝上放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；4℃脱色摇床上摇动孵育过夜；
用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min；
同上方法稀释二抗并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min，进行化学发光反应。
化学发光
将发光试剂等体积混合；将膜的蛋白面朝上放在白板上，将发光液滴加在膜上，充分覆盖膜表面，然后放入成像仪中拍照。
2.9.7实验结果
IL-15的Western Blot检测结果如图2和图3所示表5：检测样品顺序表
Figure BDA0002450477270000171
Figure BDA0002450477270000181
图2.蛋白Marker
图3.上下图分别为FLAG、Na-K-ATP
目的基因IL-15-3FLAG的预测蛋白大小约为30.5KDa，实验结果显示，在Marker43KDa附近检测到蛋白条带。可见携带L-15-3FLAG基因的质粒在293T细胞中有表达。
具有NK细胞的人源化小鼠的构建，过程如下：
1.1.常规人源免疫系统小鼠的构建
选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠。经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104–1*106每只小鼠。干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，则认为可以用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。
1.2.AAV注射
在常规人源化免疫系统小鼠外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％后，尾静脉注射上述包装好的AAV载体，剂量范围可以为1*109-2*1011每只小鼠。经过2-8周的IL-15的刺激，分化和增殖，人源化免疫系统小鼠的造血干细胞，将分化出功能性的巨噬细胞及DC细胞等等髓系免疫细胞。
具有NK细胞的人源化免疫系统小鼠鉴定：
AAV，质粒或Fc化细胞因子注射2-8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测。当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，NK细胞占人源免疫细胞的8％以上，则认为造模成功。其流式检测数据，注射前：如图4A、图4B、图4C和图4D所示，注射后：如图5A、图5B、图5C和图5D所示。
可见经过16周的发育，本发明的方法得到的人源化免疫系统小鼠的外周血中，45％的免疫细胞已经为人源免疫细胞，其NK细胞占比达到11.9％，T细胞占比达到46.6％。而注射AAV前，该小鼠外周血中NK细胞占比只有3.25％，T细胞只有2.02％.可见注射AAV后，NK细胞和T细胞占比都有所上升。
人源化免疫系统小鼠用于药效评价
在具有NK细胞的人源化免疫系统小鼠的基础上，使用依赖ADCC杀伤功能的抗体，验证该模型中NK细胞的功能。本实验选用依赖ADCC作用发挥药效的抗Her2抗体美罗华，验证细胞系为Her2高表达细胞系NCI-N87.
本实验所用的NCI-N87细胞系购自美国典型培养物保藏中心ATCC.该细胞以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基传代。在传代次数小于10次前，收取细胞。将大约5×106NCI-N87细胞的无血清培养基，通过皮下注射接种于带有或不带有NK细胞的人源化免疫系统小鼠。裸鼠事先用3-4％异氟烷麻醉。当肿瘤生长到平均约100-150mm3左右时，肿瘤大小合适的裸鼠将根据肿瘤大小和体重被随机分成4组，分组情况如下表。
表6：药效评价的给药分组
Figure BDA0002450477270000201
各组肿瘤体积曲线如图6所示。
由于郝赛汀发挥药效高度依赖NK细胞参与的ADCC作用，在该实验中可见，在缺乏NK细胞的小鼠中给予赫赛汀几乎没有药效。而在有NK细胞存在的人源免疫系统小鼠中，其药效非常显著。可见，该NK细胞加强的人源化免疫系统小鼠中，存在有功能和活性的NK细胞，该模型构建成功。
进一步，上述实验也证明本发明的人源化免疫系统小鼠可以用于针对NK细胞相关药效评价的实验中。
实施例二
本实施方式以IL-15与Fc融合蛋白注射为例进行说明。
IL-15与Fc融合蛋白表达质粒的构建
1、IL-15功能基因的克隆
从正常人的外周血中分离粘附的单核细胞，加入LPS刺激4小时后，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA第一条链，再以其为模板扩增IL-15胞外区全部序列，包含分泌信号肽序列。
进行PCR反应，产物大小与预期大小一致。将得到的基因产物回收纯化。将筛选、抽提得到的pRc-CMV-IL15质粒测序，比对，与预期序列完全一致。
2、人IgG1 Fc基因的克隆
从正常人外周血白细胞中提取mRNA，反转录获得cDNA第一链，再以其为模板扩增IgG1 Fc基因(GeneBank：AK304469.1)，上、下游引物分别引入BamHI和XbaI位点。
进行PCR并将得到的基因产物回收纯化后，用BamHI和XbaI酶切克隆pRc-CMV-IL15质粒，将筛选、抽提得到的质粒测序，比对，与预期序列完全一致，即得到IL15与FC融合蛋白一种形式的表达质粒，记为IL15/Fc。
3.稳定的高表达细胞株的筛选
用冷的1×PBS将对数生长期的CHO细胞稀释至8x106/ml后，
取0.4ml悬液，加入电击杯，再加入15ug线性化表达质粒，混合后冰上静置10-15min。设定电穿孔仪电压800V，电容25uF，点穿后电击杯在冰上静置10min，用移液管转移细胞至含5％1×FBS培养液的10cm培养皿中培养。两天后待细胞生长状态恢复，用400ug/ml的G418对阴性细胞进行筛选。观察细胞状态，每4天换液一次，培养两周后，采用极限稀释法，用96孔培养板进行高表达细胞株筛选。最终通过ELISA检测和比较筛选，得到稳定的高表达细胞株。
收集高表达细胞株产生的IL15-Fc融合蛋白并通过尾静脉注射给实施例一中方法制备的常规人源免疫系统小鼠体内。注射2-8周后，对本实施方式得到的人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测。当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，NK细胞占人源免疫细胞的8％以上，则认为造模成功。

Claims (10)

1.一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：
具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。
2.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
补充细胞因子IL-15的方法包括AAV载体、质粒的高压水动力注射、FC化的长效细胞因子注射或者普通细胞因子注射。
3.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：
步骤一：制作常规的人源化免疫系统小鼠；
步骤二：制备包装好的AAV载体，AAV载体中包含细胞因子IL-15基因；
步骤三：向常规的人源化免疫系统小鼠体内注射包装好的AAV载体。
4.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
步骤一中，制作常规的人源化免疫系统小鼠的方法如下：
步骤1-1，选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠；
步骤1-2，经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠；
步骤1-3，干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，即能够用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。
5.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
步骤二中制备AAV载体的步骤如下：
步骤2-1，根据IL-15的人源基因序列进行引物设计；
步骤2-2，扩增目的基因IL-15；
步骤2-3，将目的基因构建入线性化表达载体中，形成重组质粒；
步骤2-4，制备感受态细胞；
步骤2-5，将重组后的质粒转化到感受态细胞中；
步骤2-6，使用菌落PCR鉴定阳性转化子；
步骤2-7，提取构建成功的质粒；
步骤2-8，将质粒包装到AAV病毒载体中。
6.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
步骤三中，尾静脉注射包装好的AAV病毒载体，剂量范围为1*109～2*1011每只小鼠。
7.如权利要求5所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
AAV病毒包装完成后，还具有AAV对293T细胞的表达验证的步骤：
步骤2-10：总蛋白抽提：将病毒与293T细胞共同培养48小时后，离心洗涤并分离细胞，将细胞裂解后提取总蛋白，
步骤2-11：测蛋白浓度，
步骤2-12：样品制备，
步骤2-13：SDS-PAGE凝胶电泳，
步骤2-14：转膜，
步骤2-14：免疫反应，成像仪拍照。
8.如权利要求2所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
Fc化细胞因子注射的方法如下：
制备Fc化细胞因子：
步骤4-1，IL-15功能基因的克隆；
步骤4-2，人IgG Fc基因的克隆；
步骤4-3，Fc融合蛋白表达质粒的构建；
步骤4-4，将表达质粒转入受体细胞，并筛选高表达细胞株；
步骤4-5，IL-15与Fc融合蛋白的纯化：收集高表达细胞株的表达产物，分离提纯；
然后将IL-15与Fc的融合蛋白注射给常规的人源化免疫系统小鼠。
9.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：
还具有鉴定步骤:采用流式检测，当模型小鼠的外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25％，NK细胞占人源免疫细胞的8％以上，则造模成功。
10.人源化免疫系统小鼠在针对NK细胞相关的药效评价中的应用。
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