CN102660579A - HBx和人IL-12双基因重组载体及抗肝癌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因治疗领域，要解决的问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新的靶向基因疫苗及其在制备HBV相关性肝癌靶向基因免疫治疗药物中的用途。本发明抗肝癌疫苗的主要活性成分为装载有编码HBx蛋白的基因和编码人IL-12蛋白的基因的重组载体，该重组载体能够在真核细胞中同时表达HBx蛋白和人IL-12蛋白。实验表明，本发明的重组腺病毒疫苗能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效果。本发明重组腺病毒疫苗为HBV相关性肝癌的靶向基因免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。

Description

HBx和人IL-12双基因重组载体及抗肝癌疫苗

技术领域

本发明属于疾病基因免疫治疗领域。涉及乙肝病毒X蛋白(HBx)和人白介素-12(hIL-12)双基因重组载体及以其为主要活性成分制备的抗肝癌疫苗。

背景技术

肝癌是人类常见的恶性肿瘤之一，世界每年新增肝癌患者62.6万，它的死亡率排在恶性肿瘤死亡率的第三位。肝癌是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，其患者自确诊后的平均6个月存活率不到50％，1年存活率为24％，5年存活率仅5％。我国属肝癌高发区域，国内肝癌发病率逐年上升。我国肝癌发病率占全球的45％，居我国癌症发病率的第二位。

现今肝癌治疗仍以手术切除为主，然从临床实践来看，包括进行术前化、放疗后能够施行完全肝癌切除手术患者比例不到肝癌总例数的10％。其余90％肝癌患者虽可接受放疗、包括射频或酒精消融及给予阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂、α-干扰素等进行系统或肝动脉输注或栓塞化学疗法，然而这些疗法不仅毒性严重，且通常也无明显疾病缓解或延长生存期效果。正由于肝癌缺乏有效控制方法，肝癌患者的预后极差。除可切除小型肝癌患者的5年存活率达到80～90％外，不能手术肝癌患者自症状发作后的平均存活时间只有3～4个月，而发展中国家全部肝癌病例的平均5年存活率仅为5％左右。肝癌迄今尚还处于一种严重缺乏有效治疗药物的尴尬境地，因此，肝癌治疗是目前医药领域需予面对的强力挑战之一。近年来，随着分子生物学、免疫学和细胞生物学等学科的快速发展，以肿瘤免疫治疗、基因治疗为代表的肿瘤生物治疗有望成为继手术治疗、化疗和放疗后肝癌治疗的新手段。

流行病学研究表明：慢性HBV感染与肝癌的发生密切相关。HBV属嗜肝DNA病毒科正类嗜肝DNA病毒属，基因组全长约3.2kb，为部分单链的双股环状DNA。HBV基因组有4个开放读码框(ORF)，分别编码包膜蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)及X蛋白。HBV基因组有4个开放读码框(open reading frame，ORF)，分别编码包膜蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)及X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)。乙肝病毒X抗原(HBx)上存在能够诱导CTL反应的抗原表位，这些抗原表位对实验动物和急性肝炎患者表现出了良好的治疗作用。临床研究表明：90％的HBV相关性肝癌患者的肝癌组织中表达HBx。因此，当HBx特异性的CTL被激活时，HBx可以成为肝癌免疫治疗的一个有效靶点。

由于肿瘤抗原免疫原性弱、MHC分子表达下调和共刺激分子缺失等特点，机体对肿瘤存在免疫耐受，现有的肿瘤抗原往往不能诱导强而有效的抗肿瘤免疫应答。

白细胞介素12(Interleukin 12，IL-12)作为一种异源二聚体细胞因子，能显著促进NK细胞、T细胞增殖和增强细胞毒活性，促进CTL细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞分泌IFN-γ，促使Th细胞向Th1细胞分化等多种生物学活性。

基因疫苗是将DNA直接注入动物体内，使其在体内表达产生蛋白刺激免疫系统。与传统的蛋白疫苗相比，基因疫苗非常稳定，易于贮存；基因疫苗在宿主体内可较长时间存在，抗原基因持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长效免疫，免疫效果可靠，避免了直接使用蛋白质进入体内诱导体液免疫反应而被抗体中和的弊端。基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。到2009年12月份为止，在全世界范围内开展的1347项基因治疗临床方案中，以腺病毒为载体的方案占了其中的25％(342项)，高于质粒DNA非病毒载体(17.7％)和逆转录病毒载体(20.8％)及其它病毒载体，并呈逐年呈现上升趋势，适应症包括肿瘤、心血管疾病、传染性疾病(包括艾滋病)等多种重大疾病。

目前，基因治疗临床方案基本是单基因治疗。双基因导入多采用两种载体携带两个不同的基因，但在体内研究中几乎不可能控制两种腺病毒的感染效率，两个基因的表达量也很难控制。或者采用在两个基因间插入一个内在的IRES位点共用同一个启动子，但是往往第二个基因的表达效率受第一个基因表达的影响，表达量很难受控制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供能够治疗HBV相关性肝癌的新的靶向基因疫苗。

本发明提供一种装载有编码HBx蛋白的基因和编码人IL-12蛋白的基因的重组载体，该重组载体能够在真核细胞中同时表达HBx蛋白和人IL-12蛋白。

其中，上述重组载体中所述的HBx编码基因的核苷酸序列为Seq ID NO.1所示，所述的人IL-12编码基因的核苷酸序列为Seq ID NO.2所示。

其中，上述重组载体中所述的编码HBx蛋白的基因在hEF1-HTLV杂合启动子的控制下表达，表达HBx蛋白的基因的表达框构成是：从5’到3’方向依次为hEF1-HTLV杂合启动子、编码HBx蛋白的基因和SV40加尾信号。

其中，上述重组载体中所述的表达HBx蛋白基因的表达框的的核苷酸序列为Seq ID NO.3所示。

其中，上述重组载体中所述的编码人IL-12蛋白的基因在CMV5启动子的控制之下表达，表达人IL-12蛋白基因的表达框的构成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、编码人IL-12蛋白的基因和β球蛋白加尾信号。

其中，上述重组载体中所述的表达人IL-12蛋白基因的表达框的核苷酸序列为Seq IDNO.4所示。

其中，所述的重组载体为复制缺陷型腺病毒，该病毒载体表达框架具有Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。

其中，上述重组载体中所述的复制缺陷型腺病毒是血清型5的腺病毒。

本发明还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。

本发明还提供了以上述重组载体为主要活性成分的抗肝癌疫苗。

本发明还提供了上述的重组载体在制备预防或治疗肝癌的药物中的用途。

显然，本发明上述技术方案中的表达载体可使用常用的真核表达载体、分离纯化方法也可以参考使用现有的常用方法。而将所述的基因序列及表达框架构建成载体，则可以参照各种基因工程手册和具体使用的载体与宿主细胞的说明进行。

本发明首次将在同一载体上同时表达肿瘤抗原和细胞免疫调节因子腺病毒疫苗用于HBV相关性肝癌的靶向基因免疫治疗，实验证明本发明的重组腺病毒疫苗中的双因子可以起到协同靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞的作用，能够显著提高治疗效果。本发明为HBV相关性肝癌的靶向基因免疫治疗提供了新的选择，具有良好的应用前景。

附图说明

图1、pAdv-HBx/hIL-12载体PCR鉴定。泳道从左到右分别为：500bp marker，HBx阳性对照，克隆1，2，3。

图2、pAdv-HBx/hIL-12载体BamHI和XhoI酶切验证。上部分电泳图显示是BamHI酶切图谱，泳道从左到右分别为：100bp marker，克隆1，2，3，4，5，6，未酶切plasmid 1。下部分电泳图显示是XhoI酶切图谱，泳道从左到右分别为：1kb marker，克隆1，2，3，4，5，6，未酶切plasmid 1。

图3、pAd-HBx/hIL-12质粒(in BJ5183菌)PacI酶切鉴定图谱。酶切后DNA电泳图PacI酶切1～6号pAd-HBx/hIL-12质粒(in BJ5183菌)图谱，泳道从左到右分别为：1kb marker，1，2，3，4，5，6号pAd-HBx/hIL-12质粒，pAd-mPSMA。

图4、pAd-HBx/hIL-12质粒(in JM109菌)PacI酶切鉴定图谱。酶切后DNA电泳图PacI酶切pAd-HBx/hIL-12质粒(in JM109菌)图谱，泳道从左到右分别为：1kb marker，1，4号pAd-HBx/hIL-12质粒。

图5、pAd-HBx/hIL-12质粒各自BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI单酶切图谱。上部分电泳图显示是Plasmid 1酶切图谱，泳道从左到右分别为：BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI。上部分电泳图显示是Plasmid 1酶切图谱，泳道从左到右分别为：BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI。

图6、重组腺病毒pAd-HBx/hIL-12包装293细胞产生细胞病变。(A)正常293细胞(B)转染线性化pAd-HBx/hIL-12的293细胞

图7、重组腺病毒pAd-HBx/hIL-12PCR鉴定。泳道从左到右分别为：1kb marker，HBx引物+1，HBx引物+2，IL-12引物+1，IL-12引物+2。

图8、mIL-12基因PCR扩增结果。M：DNAmarker  1：mIL-12的PCR产物。

图9、pAdV-HBx-mIL-12的酶切鉴定。(A)M：DNA marker 1：Pme I单酶切2：NheI和EcoR I双酶切。(B)M：DNA marker 1-6：Kpn I和Nco I双酶切。

图10、pAd-HBx-mIL-12的Pac I鉴定。M：DNAmarker 1：Pac I酶切。

图11、Ad-HBx-mIL-12的PCR鉴定。M：DNA marker 1：mIL-12的PCR产物 2：HBx的PCR产物。

图12、肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠生存时间。(A)(B)在保护性免疫模型中，肌肉免疫HBx/IL-12重组腺病毒疫苗10⁷vp/次，每周1次，共3次，结果表明该疫苗能够抑制肝癌生长和延长荷瘤小鼠生存时间；(C)(D)在治疗性免疫模型中，待皮下成瘤后，肌肉免疫HBx/mIL-12重组腺病毒疫苗10⁷vp/次，每周1次，共3次，结果表明该疫苗能够抑制肝癌生长和延长荷瘤小鼠生存时间。

图13、CTL体外杀伤肿瘤细胞活性作用⁵¹Cr释放实验。各组小鼠的脾淋巴细胞与⁵¹Cr标记的肿瘤细胞孵育，结果提示HBx/IL-12重组腺病毒疫苗免疫的小鼠的脾淋巴细胞能特异性杀伤HBx阳性的小鼠肝癌细胞。

(A)脾细胞特异性杀伤小鼠肝癌细胞Hepa1-6(HBx阳性)

(B)脾细胞非特异性杀伤小鼠肝癌细胞Hepa1-6(HBx阴性)

图14、HBx/IL-12重组腺病毒对Th分化的调节作用：收集各实验组病毒刺激的T细胞培养的上清液，酶联免疫吸附法测定IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)的水平，作为观察不同Th的指标。结果表明HBx/IL-12重组腺病毒能够调节Th1T细胞的分化。

(A)小鼠脾细胞分泌IFN-γ(Th1)的水平

(B)小鼠脾细胞分泌IL-4(Th2)的水平

图15、HBx/mIL-12重组腺病毒疫苗在小鼠体内激活CTL后可诱导肿瘤细胞凋亡。各组小鼠的肿瘤组织进行TUNEL染色，结果提示HBx/mIL-12重组腺病毒疫苗免疫可显著诱导小鼠肝癌细胞凋亡(A)NS(生理盐水)(B)Ad-null  (C)Ad-HBx  (D)Ad-IL-12(E)Ad-HBx/IL-12(F)凋亡指数分析

具体实施方式

本发明将生物学活性相互协调同的两个基因HBx和IL-12构建在同一个载体上，利用双启动子同时表达HBx和IL-12，开发出一种靶向基因免疫治疗HBV相关性肝癌中的双基因重组疫苗。优选的，使用的载体为腺病毒载体。

实施例一HBx和hIL-12双基因重组腺病毒载体的构建和筛选

HBx和hIL-12双基因重组腺病毒载体的构建过程如下：在双基因穿梭载体pAdV-hcERB2/hIL-12(其表达框核苷酸序列为Seq ID NO.6所示)的基础上利用Age I酶切使其线性化，DNA片段进行平端化后Nhe I进行酶切产生粘性末端。质粒pcDNA3.1-HBx(具有SeqID NO.7所示的核苷酸序列)用Pme I和Xba I进行双酶切反应，得到-HBx-片段，一端为平末端，一端为Xba I酶切产生的粘性末端。-pAdV-hIL-12-大片段和-HBx-小片段利用T4DNALigase进行连接，重组成pAdV-HBx/hIL-12穿梭质粒，利用两步法细菌内同源重组法将pAdV-HBx/hIL-12穿梭质粒上的HBx/hIL-12基因重组至腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3上，得到腺病毒质粒pAd-HBx/hIL-12，进而在293A细胞中包装成HBx和hIL-12双基因重组腺病毒(Ad-HBx/hIL-12)，表达框具有Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。

HBx和hIL-12双基因重组腺病毒载体的构建具体过程如下：

1.构建pAdV-HBx/hIL-12

(1)质粒pAdV-hcERB2/hIL-12和pcDNA3.1-HBx的转化

将从-80℃取出冻存的感受态细胞置于冰浴上待其融化，加入1μL pAdV-hcERB2/hIL-12或pcDNA3.1-HBx质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30min。菌液42℃热激90秒后，立即冰浴2min。加入0.9mL无抗生素的LB培养基，37℃恒温摇床上200rpm振摇1h后，菌液4000rpm/min离心3min，弃上清，留100μL上清重悬菌体。用玻璃推棒将菌液均匀涂布于含抗生素的固体LB培养基平板表面，37℃倒置培养过夜。

(2)质粒pAdV-hcERB2/hIL-12和pcDNA3.1-HBx的提取

按照质粒小量提取试剂盒说明操作：挑取平板上的单克隆菌落，接种于含卡那霉素或氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜；收取1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液，13000rpm离心1分钟，弃上清。加入250μL含有RNase A的重悬Buffer，充分重悬细菌沉淀后，加入250μL裂解Buffer，温和地颠倒混合6-10次，直至溶液变得清亮；随即加入400μL中和Buffer，立即轻柔地颠倒混合6-10次，室温放置5分钟；室温13000rpm离心10分钟；将上清液转移至预处理过的Spin Column中，13000rpm离心1分钟，弃滤液；将500μL的蛋白去除Buffer加入Spin Column中，13000rpm离心30-60秒，弃滤液；加入600μL的Wash Buffer 13000rpm离心1min，洗涤2次后，空柱13000rpm再离心2分钟，除去残留乙醇；待乙醇完全挥发后加入100μL的ddH₂O，13000rpm离心1分钟洗脱DNA，-20℃保存备用。

(3)质粒pAdV-hcERB2/hIL-12和pcDNA3.1-HBx的酶切(制备连接片段)

质粒pAdV-hcERB2/hIL-12用Age I酶切使其线性化，纯化回收后加入Fragement Klenow对此线性化DNA片段平端化，乙醇沉淀后用Nhe I进行酶切，纯化回收得到-pAdV-hIL-12-片段。质粒pcDNA3.1-HBx用Pme I和Xba I进行双酶切反应，琼脂糖凝胶纯化回收酶切产物，得到HBx片段，具体酶切的反应体系及反应条件如下：

1)AgeI单酶切pAdV-hcERB2/hIL-12

Buffer AgeI                    5uL

pAdV-hcERB2/hIL-12             40uL

AgeI                           5uL

37℃酶切1h，75℃10min，使AgeI酶热失活

2)Fragment Klenow补平Age I酶切pAdV-hcERB2/hIL-12产物：

37℃反应30min。

3)NheI单酶切pAdV-hcERB2/hIL-12片段

37℃酶切1h。

1)PmeI和XhoI双酶切pcDNA-HBX

37℃酶切2h。

(4)pAdV-hIL-12片段和HBx片段连接

将经酶切处理纯化回收的pAdV-hIL-12大片段和HBx小片段进行连接。pAdV-hIL-12大片段的两端分别为平末端和Nhe I酶切产生的粘性末端，HBx小片段两端分别为平末端和XhoI酶切产生的粘性末端，Nhe I与XhoI属于同尾酶，二者具有相同的粘性末端。连接反应体系如下：

16℃连接过夜。

(5)连接产物转化

取10uL连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB/Kana琼脂平板37℃过夜培养。

(6)摇菌、碱裂解法提取质粒、酶切验证及PCR验证

挑取平板上单克隆菌落，接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm恒温振荡培养过夜；碱裂解法提取质粒并进行PCR验证和BamHI、XhoI双酶切验证。

pcDNA-HBx经PmeI和XhoI双酶切后回收纯化得到的长度为456bp的HBx片段，pAdV-H1/IL-12经AgeI单酶切线性化后回收纯化pAdV-IL-12大片段，片段平端化后用NheI进行酶切，回收产物与HBx片段连接转化JM109大肠杆菌，经PCR(图1)和BamHI或XhoI酶切鉴定(图2)筛选得到pAdV-hIL-12-HBx阳性克隆，选择酶切正确的重组克隆送至上海英骏生物有限公司测序。

2.构建重组pAd-HBx/hIL-12质粒

腺病毒质粒的构建采用细菌内同源重组的方法。

(1)腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3的电转化

将1μl病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3加入至含有50μl BJ5183感受态大肠杆菌细胞的EP管中，混匀，冰上冷却；设定电转仪参数2500V，5ms；将混合物加入电转杯，启动电击程序；电击结束迅速将样品加入1mL LB培养基中，37℃低速振摇培养40min后涂布于含有氨苄青霉素抗性的平板上，37℃培养过夜；次日挑取最小的菌落克隆，接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜后，提取质粒，BamH I和EcoR I双酶切鉴定，鉴定正确骨架质粒的菌液保种备用。

(2)BJ5183/pAdenoVatorΔE1/E3感受态的制备

采用氯化钙法制备经鉴定正确的BJ5183/pAdenoVatorΔE1/E3感受态大肠杆菌。从平板上挑取新活化的单克隆菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期后，将该菌液按1∶100的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2h至OD600＝0.5左右，冰上放置10分钟后4℃3000g离心10分钟；弃去上清，用预冷的0.05mol/L CaCl2溶液10mL重悬大肠杆菌菌体，冰上放置15-30分钟后，4℃3000g离心10分钟，弃去上清，加入4mL含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液重悬大肠杆菌，即成感受态细胞悬液，分装存于-80℃备用。

(3)pAdV-HBx/hIL-12质粒与腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3大肠杆菌内同源重组

将pAdV-HBx/hIL-12质粒进行FseI线性化，普通化学转化的方法转化入BJ5183/pAdenoVatorΔE1/E3感受态细胞，次日挑取平板上最小的菌落，扩增培养，小量抽提，PacI酶切鉴定。由于BJ5183为recA+，质粒DNA易发生突变而不够稳定，我们将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx/hIL-12转化JM109感受态细胞。摇菌、提取质粒后PacI单酶切或BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI酶切验证鉴定。

挑取体积较小的克隆摇菌后提取质粒，并用PacI酶切单酶切鉴定，重组腺病毒质粒pAdV-HBx/hIL-12经Pac I酶切后，可见约30kb的大片段以及3.0kb的小片段，图3结果显示：2，3，4，5号克隆可能重组正确。由于BJ5183为recA+，质粒DNA易发生突变而不够稳定，我们将鉴定正确的2，4，5号重组腺病毒质粒pAd-HBx/hIL-12转化JM109感受态细胞。摇菌、提取质粒后PacI单酶切1号和4号pAd-HBx/hIL-12质粒，电泳结果如图4所示；同时我们再采用BamHI，EcoRI，HindIII，XhoI酶切验证鉴定，得到多条条带，电泳结果如图5所示。

3.重组腺病毒Ad-HBx/hIL-12的包装、鉴定

(1)重组腺病毒Ad-HBx/hIL-12的包装

PacI单酶切重组病毒质粒Ad-HBx/hIL-12，完全线性化后，乙醇沉淀，再用适量ddH2O溶解；2μg质粒和10μL脂质体分别稀释于250μL无血清培养基，再混合，置于室温下15-30min；弃去6孔板中的培养基，无血清培养基轻轻洗涤细胞后，加2mL无血清无抗生素DMEM培养基，将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱孵育培养4-6h，4-6h后弃Lipofectamine-DNA混合液，2mL含有抗生素的DMEM完全培养基。约15天后观察到细胞肿胀、变圆，部分细胞脱壁漂浮，聚集成葡萄状，表现出典型的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，可见明显的病毒空斑，表明重组腺病毒包装成功(图6)。待80％-90％细胞病变，此时收集细胞和上清，37℃/-80℃反复冻融3次，离心收集的上清为包装成熟的原代重组腺病毒。

(2)重组腺病毒Ad-HBx/hIL-12的鉴定

转染15天后，细胞完全病变时收集上清和细胞沉淀，37℃/-80℃反复冻融3次，离心收集的上清为包装成熟的原代重组腺病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2μ1分别用针对HBx和hIL-12基因的特异性引物进行PCR扩增鉴定。

基因HBx的PCR条件：

基因hIL-12的PCR条件：

原代病毒种子液抽提病毒DNA后，分别用针对HBx和hIL-12基因的特异性引物进行PCR扩增鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示：分别在465bp、1600bp左右出现预期大小的目的基因条带，表明重组腺病毒构建成功，并且携带有HBx和hIL-12目的基因(图7)。

实施例二HBx和mIL-12双基因重组腺病毒载体的构建和筛选

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒载体的构建过程如下：在实施例一的重组HBx和hIL-12双基因穿梭载体pAdV-HBx/hIL-12的基础上利用Pme I酶切pAdV-HBx/hIL-12穿梭质粒，回收大片段(pAdV-HBx-)，利用T4 DNA Ligase将带有Pme I酶切位点的mIL-12PCR产物连接至pAdV-HBx-大片段上，重组成pAdV-HBx/mIL-12穿梭质粒，利用两步法细菌内同源重组法将pAdV-HBx/mIL-12穿梭质粒上的HBx/mIL-12基因重组至腺病毒骨架载体pAdenoVator ΔE1/E3上，得到腺病毒质粒pAd-HBx/mIL-12，进而在293A细胞中包装成HBx和mIL-12双基因重组腺病(Ad-HBx/mIL-12)。

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒载体的构建具体过程如下：

1.mIL-12基因的PCR扩增：根据pORF-mIL-12载体中的mIL-12基因序列，利用PrimerPremier 5软件设计引物。上游引物5’端加7个保护碱基，分别为AGCTTTG，并引入Pme I酶切位点，序列为(Seq ID NO.8)：

5’-AGCTTTGTTTAAACCATGGGTCAATCACGCTACCTCCTC-3’；

下游引物5’端加8个保护碱基，分别为CTCATCAG，并引入Pme I酶切位点，序列为(SeqID NO.9)：

5’-CTCATCAGTTTAAACTATCATGTCGAGCTAGCATCCGTTG-3’。

通过PCR扩增mIL-12基因，得到片段大小为1620bp的特异性条带，与预期结果一致，见图8。将基因mIL-12的PCR产物纯化后，送至上海英骏公司测序。经测序证实即为mIL-12基因片段。

2.重组穿梭质粒pAdV-HBx/mIL-12的构建：将质粒pAdV-HBx/hIL-12用Pme I单酶切，纯化回收-pAdV-HBx-大片段，与经同样处理的mIL-12PCR产物进行平末端连接后转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，小量制备质粒，选用mIL-12基因末端的Nhe I位点与pAdenoVator-CMV5上的EcoR I位点，酶切鉴定mIL-12基因的方向，酶切得到大小约为2900bp和7200bp的两个片段，证实mIL-12为正向插入，见图9A。选用Kpn I和Nco I位点对重组穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12进行酶切鉴定，得到多个条带，见图9B。选择酶切正确的重组克隆送测序。

3.重组病毒质粒pAd-HBx/mIL-12的构建：采用两步法细菌内同源重组的方法进行。利用电转化的方法将腺病毒骨架载体pAdenoVator ΔE1/E3转化入BJ5183大肠杆菌，鉴定正确后制备成BJ5183/pAdenoVatorΔE1/E3感受态细菌。将pAdV-HBx/mIL-12质粒进行EcoR I线性化，转化入BJ5183/pAdenoVatorΔE1/E3感受态细胞，次日挑取平板上最小的菌落，扩增培养，小量抽提，作进一步的Pac I酶切鉴定，酶切后可见约30kb的大片段以及3.0kb的小片段，表明重组病毒质粒构建成功，见图10。将鉴定正确的质粒送至上海英骏公司测序。

4.双基因重组病毒Ad-HBx/mIL-12的包装、鉴定：将鉴定正确的pAd-mIL-12-HBx质粒进行小量扩增，抽提质粒并测定其浓度。以PacI单酶切重组病毒质粒，完全消化以去除ori和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其反转末端重复序列(ITR)。利用Lipofectamine 2000将线性化的pAd-mIL-12-HBx质粒转染入293A细胞，筛选得到Ad-HBx/mIL-12双基因重组病毒。原代种子液抽提病毒DNA，通过PCR扩增插入HBx DNA片段和mIL-12DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳结果显示出现预期大小的目的基因条带，分别在465bp、1620bp左右，表明重组腺病毒构建成功，见图11。

实施例三本发明双基因重组腺病毒疫苗的体内功效实验

1.预防性免疫实验

6-8周龄C57小鼠肌肉注射Ad-HBx/IL-12 10⁷vp/100μl/次、Ad-HBx 10⁷vp/100μl/次、Ad-IL-12 10⁷vp/100μl/次、Ad-null 10⁷vp/100μl/次或生理盐水100μl/次，每周1次，共3次，最后一次免疫后7天，皮下接种2×10⁶个Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞，待小鼠皮下扪及肿块时，每3天用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，按公式：肿瘤体积(mm³)＝0.52×长×宽²计算肿瘤体积，并记录小鼠死亡时间，绘制肿瘤生长曲线和生存曲线。

图12A和12B显示：在预防性免疫试验中Ad-HBx/IL-12组肿瘤生长速度明显慢于Ad-HBx、Ad-IL-12单基因组和生理盐水和Ad-null对照组(P＜0.01)。生理盐水和Ad-null处理组荷瘤小鼠均在接种肿瘤第48天开始出现死亡；Ad-HBx和Ad-IL-12处理组荷瘤小鼠分别在接种肿瘤第54天和第51天开始出现死亡，当生理盐水和Ad-null和Ad-IL-12处理组荷瘤小鼠完全死亡时，Ad-HBx处理组荷瘤小鼠40％存活，而Ad-HBx/IL-12处理组荷瘤小鼠80％存活，Ad-HBx/IL-12处理组荷瘤小鼠生存期明显延长(P＜0.01)。

2.治疗性免疫实验

将2×10⁶个Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞接种于6-8周龄C57小鼠右侧胁皮下，接种肿瘤细胞后第9天，当扪及肿瘤直径约4～5mm时，将荷瘤小鼠随机分为生理盐水、Ad-null、Ad-HBx、Ad-IL-12和Ad-HBx/IL-12五组，每组15只。小鼠腿部肌肉注射生理盐水100μl/次、Ad-null、Ad-HBx、Ad-IL-12或Ad-HBx/IL-1210⁷vp/100μl/次，每周1次，共3次，每3天用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，按公式：肿瘤体积(mm³)＝0.52×长×宽²计算肿瘤体积，并记录小鼠死亡时间，绘制肿瘤生长曲线和生存曲线。

图12C和12D显示：在治疗性免疫试验中Ad-HBx/IL-12组肿瘤生长速度明显慢于Ad-HBx、Ad-IL-12单基因组和生理盐水和Ad-null对照组(P＜0.01)。生理盐水和Ad-null处理组荷瘤小鼠分别在接种肿瘤第42天和第45天开始出现死亡；Ad-HBx和Ad-IL-12处理组荷瘤小鼠均在接种肿瘤第48天开始出现死亡，当生理盐水和Ad-null处理组荷瘤小鼠完全死亡时，Ad-HBx处理组荷瘤小鼠30％存活，Ad-IL-12处理组荷瘤小鼠20％存活，而Ad-HBx/IL-12处理组荷瘤小鼠70％存活，Ad-HBx/IL-12处理组荷瘤小鼠生存期明显延长(P＜0.01)。

实施例四免疫治疗机理研究

建立HBx+小鼠肝癌模型后，开始实施实施例三的免疫治疗方案，治疗结束后，每组取5只小鼠，断颈椎处死，取血清和脾脏分离脾细胞，做CTL杀伤实验和细胞因子分析及过继治疗实验；同时取肿瘤组织4％福尔马林固定，包埋制成切片后行原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡。

(1)CTL体外杀伤实验

1)靶细胞准备：收集对数生长期肝癌细胞Hepa1-6或Hepa1-6/HBx，调浓度为4×10⁵个/ml；每细胞加入铬酸钠200μCi，混匀后置37℃细胞培养箱2小时，约20～30分钟摇匀1次；收集细胞并以RPMI1640液洗涤3次去除游离的同位素，调细胞浓度为1×10⁵个/ml。

2)效应细胞：无菌取小鼠脾脏，剪碎，通过600目铜网；加入5ml 10％1640培养基，以冲洗下铜网上的细胞，收集细胞悬液入15ml无菌试管中，计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml；小鼠淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque分离脾细胞，制备免疫小鼠脾细胞悬液，各组脾细胞分别加入生理盐水、Ad-null、Ad-HBx、Ad-IL-12或Ad-HBx/IL-12(10⁷vp)和IL-220U/ml刺激培养5天后，吹下脾细胞，计数调浓度为5×10⁵～4×10⁶个细胞/ml，接种于V型底96孔板，按每样品3重复孔的原则加入200μCi标记靶细胞后按如下方案进行：

a.自发释放组：加入100μl培养基；

b.最大释放组：各孔均加入100μl 2％Triton X-100；

c.CTL活性测定组：各孔按效靶比40∶1、20∶1、10∶1和5∶1加入100μl脾T细胞；

d.效靶细胞混匀的96孔板置37℃细胞培养箱4小时；

e.按对应位置，每孔取上清100μl上机检测放射活性；

f.计算结果：细胞特异性杀伤率％＝[(实验组释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100。

图13显示：当效靶比≥10∶1时，Ad-HBx/IL-12免疫组小鼠脾细胞对Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞的杀伤效应较Ad-HBx、Ad-IL-12单基因组和生理盐水和Ad-null对照组强(P＜0.01)，但是在各效靶比时，Ad-HBx/IL-12免疫组小鼠脾细胞对Hepa1-6小鼠肝癌细胞的杀伤效应与Ad-HBx、Ad-IL-12单基因组和生理盐水和Ad-null对照组比较无明显差异。

(2)ELISA细胞因子检测

按照ELISA检测细胞因子试剂盒说明书进行测定。免疫小鼠脾细胞在体外经过生理盐水、Ad-null、Ad-HBx、Ad-IL-12或Ad-HBx/IL-12(10⁷vp)和IL-220U/ml刺激培养5天后，取培养上清液用ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4分泌情况：

1)加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟；

2)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，在滤纸上印干；

3)每孔中加入第一抗体工作液，将反应板充分混匀后置37℃60分钟；

4)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，在滤纸上印干；

5)每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃30分钟；

6)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，在滤纸上印干；

7)每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应15分钟；

8)每孔加入100μl终止液混匀；

9)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值；

10)结果计算与判断所有OD值都应减除空白值后再行计算：

a.以标准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线；

b.根据样品OD值在该曲线图上查出相应细胞因子的含量。

图14显示：Ad-HBx和Ad-IL-12免疫的小鼠脾细胞分泌的IFN-γ的量较生理盐水和Ad-null对照组高，但明显低于Ad-HBx/IL-12双基因组(P＜0.01)；各组免疫的小鼠脾细胞分泌的IL-4的量无明显差异。IFN-γ由Th1型T细胞分泌，参与细胞免疫，而IL-4由Th2型T细胞分泌，参与体液免疫。由此可见，Ad-HBx/IL-12双基因组抗肝癌免疫效应主要与细胞免疫有关。

(3)原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡

1)脱蜡复水：将石蜡切片置于60℃孵箱中烤片1h，二甲苯脱蜡15min×2次；100％、95％、80％、70％酒精浸泡各2min；蒸馏水洗涤5min×2次；室温干燥15min；

2)PBS漂洗切片5min，用滤纸吸去切片周围液体，滴加蛋白酶K溶液(10μg/ml溶于0.01MTris.Cl，pH7.4～8)，置湿盒内于37℃消化60min；PBS漂洗切片5min，2次；

3)用滤纸吸去切片周围液体，滴加50μl TUNEL反应混合液，置湿盒内于37℃避光孵育60min；

4)PBS漂洗切片5min 3次；

5)荧光显微镜下观察，激发光波长450～500nm，检测光波长515～565nm(绿色荧光)；

6)缓冲甘油封片，光镜下观察读片。

结果判定：细胞核着色，呈现绿凋亡小体，判为阳性；细胞核无着色者判为阴性。全面观察每一张切片，随机选择5个高倍视野(×400)，共计数1000个细胞，计算阳性细胞百分率。

通过对经过免疫治疗过的小鼠肿瘤组织的石蜡切片进行TUNEL染色，观察各组小鼠肿瘤组织的凋亡情况，间接判断CTL杀伤肿瘤活性。图15显示：在荧光显微镜下，Ad-HBx/IL-12组肿瘤组织中可见大量均匀分布的绿色荧光信号，均匀分布的绿色荧光信号明显多于Ad-IL-12和Ad-HBx组，而生理盐水和Ad-null组肿瘤组织中仅可见少量散在分布的绿色荧光信号。生理盐水、Ad-null和Ad-HBx、Ad-IL-12和Ad-HBx/IL-12组的细胞凋亡指数分别为5.6±1.2％，6.8±1.7％、16.5±3％、20.3±1.7％和38.1±3.4％。Ad-HBx/IL-12组肿瘤细胞凋亡指数明显高于Ad-HBx、Ad-IL-12单基因组和生理盐水和Ad-null对照组(P＜0.01)。

本发明实施例中，在重组腺病毒疫苗均能靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞，表现出良好的抗肝癌效应。小鼠注射Ad-HBx、Ad-IL-12单基因和Ad-HBx/IL-12双基因疫苗进行免疫治疗，结果表明三者均能抑制小鼠肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存期，但Ad-HBx/IL-12双基因疫苗的抗肿瘤效应明显优于Ad-HBx、Ad-IL-12单基因。小疫苗的抗肝癌机理研究表明：当效靶比≥10∶1时，Ad-HBx/IL-12免疫组小鼠脾细胞对Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞的杀伤效应较各对照组强，但在各效靶比时，Ad-HBx/IL-12免疫组小鼠脾细胞对Hepa1-6小鼠肝癌细胞的杀伤效应与各对照组比较无明显差异，结果提示Ad-HBx/IL-12双基因疫苗较各对照组能显著激活HBx特异性的CTL，从而靶向杀伤HBx阳性的肝癌细胞。小鼠脾细胞分泌细胞因子ELISA检测，结果显示：Ad-HBx和Ad-IL-12免疫的小鼠脾细胞分泌的IFN-γ的量较生理盐水和Ad-null对照组高，但明显低于Ad-HBx/IL-12双基因组；各组免疫的小鼠脾细胞分泌的IL-4的量无明显差异。IFN-γ由Th1型T细胞分泌，参与细胞免疫，而IL-4由Th2型T细胞分泌，参与体液免疫。由此可见，Ad-HBx/IL-12双基因组诱导的抗肝癌细胞免疫效应强于Ad-HBx和Ad-IL-12单基因组。同时小鼠肿瘤组织病理切片也显示Ad-HBx/IL-12组肿瘤组织中可见大量均匀分布的凋亡细胞，明显多于Ad-IL-12和Ad-HBx组，进一步证实Ad-HBx/IL-12双基因疫苗诱导HBx特异性的CTL能力强于Ad-IL-12和Ad-HBx单基因组。

Claims (11)

1.装载有编码HBx蛋白的基因和编码人IL-12蛋白的基因的重组载体，该重组载体能够在真核细胞中同时表达HBx蛋白和人IL-12蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述HBx编码基因的核苷酸序列为SeqID NO.1所示，所述的人IL-12编码基因的核苷酸序列为Seq ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述编码HBx蛋白的基因在hEF1-HTLV杂合启动子的控制下表达，表达HBx蛋白的基因的表达框的构成是：从5’到3’方向依次为hEF1-HTLV杂合启动子、编码HBx蛋白的基因和SV40加尾信号。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述表达HBx蛋白基因的表达框的的核苷酸序列为Seq ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述编码人IL-12蛋白的基因在CMV5启动子的控制之下表达，表达人IL-12蛋白基因的表达框的构成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、编码人IL-12蛋白的基因和β球蛋白加尾信号。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述表达人IL-12蛋白基因的表达框的核苷酸序列为Seq ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为复制缺陷型腺病毒，该病毒载体表达框架的核苷酸序列为Seq ID NO.5所示。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于所述的复制缺陷型腺病毒是血清型5的腺病毒。

9.含有权利要求1～8任一项所述的重组载体的宿主细胞。

10.权利要求1～8任一项所述的重组载体在制备预防或治疗肝癌的药物中的用途。

11.抗肝癌疫苗，其特征在于所述的抗肝癌疫苗的主要活性成分为权利要求1～8任一项所述的重组载体。

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