CN104721835A

CN104721835A - 抗黑色素瘤dna质粒疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN104721835A
Application number: CN201410687088.9A
Authority: CN
Inventors: 胡英; 钦富华
Original assignee: Zhejiang Medical College
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明涉及一种DNA抗黑色素瘤质粒疫苗，包括质粒载体，含黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件，构成一种多元、靶向、高效的复合型DNA疫苗，本发明还公开了该DNA质粒疫苗的制备方法，以阳离子聚合物为载体材料构建给药系统，以含有目标抗原编码序列的DNA质粒作为新一代治疗性疫苗，该疫苗在体内诱导产生特异性针对相关编码抗原的免疫反应，并有效抑制黑色素瘤发展和转移，因此本发明是一种制备简单、成本低廉且安全可靠、治疗黑色素瘤有效的DNA质粒疫苗。

Description

抗黑色素瘤DNA质粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及DNA疫苗，具体涉及一种抗黑色素瘤DNA质粒及其制备方法。

技术背景

恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一类起源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发于皮肤，是一种最具有侵袭性的皮肤肿瘤，具有发病年龄早，转移率高等特征。目前，我国MM的发病率相对较低，但随着我国工业的发展和环境状况的恶化，其发病率的增长速度已远远超过其他恶性肿瘤，近四年间我国恶性黑色素瘤的发病率升高了5倍，是肿瘤发病率增长最快的一种。由于MM的恶性程度高，发生比较隐匿，且对目前临床各种治疗方法极不敏感，尤其是对化疗药具有较高的耐受性。因此，应用免疫疗法治疗恶性黑色素瘤被认为是极具前景的治疗策略。

DNA疫苗是在基因治疗和转基因技术基础上产生的第三代疫苗，是疫苗的一次革命，在预防和治疗病毒、细菌等传染病和肿瘤等方面具有广阔的应用前景，DNA疫苗进入体内后主要依靠树突状细胞（DCs）的递呈，产生免疫应答。不成熟的DCs会导致肿瘤的特异性耐受和免疫逃逸，而成熟的DCs可产生免疫反应，也就是说处于不同成熟阶段的DCs决定了机体发生免疫反应的类型。可见，改变DC的表型和功能将是机体对肿瘤抗原产生免疫应答的前提。

作为肿瘤免疫治疗的DNA疫苗是将编码某种肿瘤特异性抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达、合成抗原蛋白，进而活化能特异性杀伤肿瘤细胞的T细胞，以达到预防和治疗肿瘤的目的。树突状细胞是机体内抗原呈递功能最强、唯一能在体内激活初始型T细胞的抗原呈递细胞，同时可以通过MHCⅠ和MHCⅡ 类分子途径呈递抗原，并提供充分的共刺激信号，在T细胞抗肿瘤免疫应答的启动、调控过程中起着关键作用。而细胞因子能刺激DCs的成熟和递呈，特别是GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）是一种强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子。但现有的DNA疫苗的抗原性不强，并不能有效防治黑色素瘤，为此需要寻找一种有效的DNA疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有DNA疫苗的抗原性不强，并提供一种制备简单、成本低廉且安全可靠有效防治黑色素瘤的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗。

本发明还相应地提供一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中除了黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）目的基因，增加了强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子（GM-CSF）以及Fc融合蛋白2种基因表达单位元件和报告基因的重组质粒的真核表达载体。

所述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗含有Trp₂对应的全部基因序列。

所述质粒载体中含有GM-CSF对应的全部基因序列。

所述质粒载体中含有Fc融合蛋白对应的全部基因序列。

所述质粒载体pUCM-T，也可用其他的真核表达质粒载体pcDNA3.0、pcDNA3.1等。

还提供一种制备上述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤:

l）分别根据GenBank的Trp_2、GM-CSF、Fc的功能编码区的序列，采用相关计算机软件进行引物设计, 人外周白细胞或淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成，以反转录出的各自第一条 cDNA 为模板，用PCR扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收；

2）目的基因片段（Trp₂、GM-CSF、Fc）分别与T载体（pGEM-T Vector）连接，转化并酶切鉴定筛选；构建的三种目的基因质粒及pEGFP-N2质粒的扩增、抽提，并分别进行双酶切，使得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切位点，在Trp₂两端引入Bgl II、Sal I酶切位点，在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点；

3）目的片段（Trp₂、GM-CSF、Fc、EGFP）与用T4 DNA连接酶pUCM-T Vector载体连接；

4）将连接产物转化化学感受态细胞中，在合适温度下的培养基中培养扩增；经过筛选和质粒抽提试剂盒抽提获得DNA质粒疫苗pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc。

上述抗黑色素DNA质粒疫苗的制备方法，将上述DNA质粒疫苗溶于纯水中，并以阳离子聚合物PEI（MW 25 KDa）为免疫佐剂和给药载体，制备得到含有阳离子聚合物的DNA质粒疫苗。

本发明将编码细胞因子、靶向膜表面Fc受体、肿瘤特异性抗原蛋白的基因构建在同一质粒中以增强疫苗的免疫诱导作用。本部分以构建黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件，以构成一种多元、靶向、高效的复合型DNA疫苗。利用DCs膜表面的Fc受体能改变DCs的表型和功能，通过激活或抑制DC上Fc受体，决定DC产生免疫反应或免疫耐受，将表达Fc融合蛋白的基因重组于治疗性DNA疫苗中可使其进入体内后实现DCs靶向。

本发明选择聚乙烯亚胺（PEI）作为载体材料，通过静电吸附制备免疫纳米粒，该载体材料存在以下2个优点：①PEI分子富含氨基，在生理pH条件下仅部分氨基质子化，富含阳离子，有较强的结合DNA和粘附细胞的能力；②PEI具有较强压缩DNA的作用，其转染效率很高，在胞内体、溶酶体酸性囊泡中有“质子海绵”的作用，因此能使胞内体裂解，溶酶体肿胀，破裂以避免对DNA的降解。

本发明将PEI/pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc通过微针或局部注射对荷黑色素瘤小鼠给药，能大量刺激产生IL-12和IFN-γ等细胞因子的分泌表达，延长荷瘤小鼠的生存周期，明显抑制肿瘤部位细胞的炎症，结果表明对黑色素瘤有很好的治疗效果。

附图说明

图1. pEGFP-N2 质粒载体构建图。

图 2. pEGFP-N2载体质粒酶切鉴定结果。

图3. PCR扩增后Trp₂目的基因片段的琼脂糖电泳图。

图4. PCR扩增后GM-CSF目的基因片段的琼脂糖电泳图。

图5. PCR扩增后Fc目的基因片段的琼脂糖电泳图。

图6. EGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc重组质粒的酶切鉴定结果。

图7. PEI_25k/DNA 体外对B16细胞的毒性结果。

图8. PEI_25k/DNA 对荷瘤小鼠抗肿瘤效果。

图 9. PEI_25k/DNA 对荷瘤小鼠生存率情况。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

抗黑色素瘤DNA质粒的构建与纯化：1）目的基因获得：采用Primer Premier 6.0和Beacon designer软件进行引物的设计，分离人外周白细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，以上反转录出的各自第一条 cDNA 为模板，用Platinum PCR Supermix High Fidelity（Invitrogen）扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收。回收得到的目的基因片段分别连接到pGEM-T Vector，感受态DH5α转化，扩增，抽提并鉴别。三种目的基因质粒以及pEGFP-N2质粒分别进行双酶切，使得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切位点，并在Trp₂两端引入Bgl II、Sal I酶切位点，在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点。结果如图2、3、4、5所示。2）目的基因片段（Trp₂、GM-CSF、Fc）用T4DNA连接酶分别与pCUM-T Vector连接、转化，将连接产物涂布到含卡那霉素抗性固体培养基平皿转化，挑取若干单克隆菌落，接种到含卡那霉素抗性液体培养基中，摇床中 37℃ 300 rpm 振荡培养过夜。将重组质粒酶切鉴定，结果如图5所示，测序鉴定为：

AGATCT ATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGTTCCATTCAGAGCCGATACATCAGCATGAGTGTGTGGACAAGCCCACGGAGACTTGTGGAGCTGGCAGGGCAGAGCCTGCTGAAGGATGAGGCCCTGGCCATTGCCGCCCTGGAGTTGCTGCCCAGGGAGCTCTTCCCGCCACTCTTCATGGCAGCCTTTGACGGGAGACACAGCCAGACCCTGAAGGCAATGGTGCAGGCCTGGCCCTTCACCTGCCTCCCTCTGGGAGTGCTGATGAAGGGACAACATCTTCACCTGGAGACCTTCAAAGCTGTGCTTGATGGACTTGATGTGCTCCTTGCCCAGGAGGTTCGCCCCAGGAGGTGGAAACTTCAAGTGCTGGATTTACGGAAGAACTCTCATCAGGACTTCTGGACTGTATGGTCTGGAAACAGGGCCAGTCTGTACTCATTTCCAGAGCCAGAAGCAGCTCAGCCCATGACAAAGAAGCGAAAAGTAGATGGTTTGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCTTCATTCCAGTAGAGGTGCTCGTAGACCTGTTCCTCAAGGAAGGTGCCTGTGATGAATTGTTCTCCTACCTCATTGAGAAAGTGAAGCGAAAGAAAAATGTACTACGCCTGTGCTGTAAGAAGCTGAAGATTTTTGCAATGCCCATGCAGGATATCAAGATGATCCTGAAAATGGTGCAGCTGGACTCTATTGAAGATTTGGAAGTGACTTGTACCTGGAAGCTACCCACCTTGGCGAAATTTTCTCCTTACCTGGGCCAGATGATTAATCTGCGTAGACTCCTCCTCTCCCACATCCATGCATCTTCCTACATTTCCCCGGAGAAGGAAGAGCAGTATATCGCCCAGTTCACCTCTCAGTTCCTCAGTCTGCAGTGCCTGCAGGCTCTCTATGTGGACTCTTTATTTTTCCTTAGAGGCCGCCTGGATCAGTTGCTCAGGCACGTGATGAACCCCTTGGAAACCCTCTCAATAACTAACTGCCGGCTTTCGGAAGGGGATGTGATGCATCTGTCCCAGAGTCCCAGCGTCAGTCAGCTAAGTGTCCTGAGTCTAAGTGGGGTCATGCTGACCGATGTAAGTCCCGAGCCCCTCCAAGCTCTGCTGGAGAGAGCCTCTGCCACCCTCCAGGACCTGGTCTTTGATGAGTGTGGGATCACGGATGATCAGCTCCTTGCCCTCCTGCCTTCCCTGAGCCACTGCTCCCAGCTTACAACCTTAAGCTTCTACGGGAATTCCATCTCCATATCTGCCTTGCAGAGTCTCCTGCAGCACCTCATCGGGCTGAGCAATCTGACCCACGTGCTGTATCCTGTCCCCCTGGAGAGTTATGAGGACATCCATGGTACCCTCCACCTGGAGAGGCTTGCCTATCTGCATGCCAGGCTCAGGGAGTTGCTGTGTGAGTTGGGGCGGCCCAGCATGGTCTGGCTTAGTGCCAACCCCTGTCCTCACTGTGGGGACAGAACCTTCTATGACCCGGAGCCCATCCTGTGCCCCTGTTTCATGCCTAACGTCGACATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGGAATTCATGGTGATTGCCGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGGGATCC---EGFP

其中ATG为启始密码子, 斜体字的为Trp₂基因, 黑体字的为GM-CSF基因, 加下划线的为Fc基因, 之后为EGFP。

表明已经正确后再转化至大肠杆菌DH5a中，在37℃温度条件下培养扩增，然后大规模制备质粒，用Qiagen试剂盒筛选、纯化、抽提获得符合转染和注射要求的不含外毒素的高纯度黑色素瘤DNA质粒疫苗pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc。

阳离子聚合物PEI（MW 25 KDa）为免疫佐剂和给药载体，制备得到含有阳离子聚合物的DNA质粒疫苗：取适量的DNA和PEI_25k分别溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成适当浓度，将阳离子聚合物溶液逐滴加入到等体积的DNA溶液中，漩涡混合，在室温孵育20 min，在制备PEI/DNA纳米复合物时PEI阳离子聚合物与DNA之间的比例关系是根据氮磷比（N/P=10），其中 N代表阳离子聚合物中氨基基团摩尔数，P 代表 DNA 中磷酸基团摩尔数。

PEI_25k/pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc疫苗对体外黑色素瘤细胞（B16）的作用：将1×10⁵个/孔的B16细胞接种于96孔培养板，37℃, CO₂孵箱培养12 h，待细胞贴壁后，三种细胞中分别加入不同N/P比例（N/P=1，2，5，10，20，30，40）PEI/DNA纳米复合物20 μl。每一梯度做三个复孔，作用12 h后，每孔加MTT溶液20 μl（5 mg·mL^-1），继续在37℃，培养4 h，弃上清，每孔加二甲基亚砜150 μl，振荡10min，酶联免疫测定570 nm处各孔吸光度（A），以无血清培养基为空白对照，取平均值，并计算细胞生长抑制率% =（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100%。PEI_25k/DNA组给药后，48小时内对B16细胞毒性明显大于对照组（p＜0.05）,结果如图6所示。

PEI_25k/pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc纳米复合物的经皮免疫给药：选用4-6周龄的BALB/c小鼠60只，体重18±2 g，随机分为5组，每组12只，用1×10⁶B16黑色素瘤细胞皮下接种小鼠下腹部，当肿瘤长到体积约40 mm³，根据肿瘤大小，每组各选择10只进行以下抗肿瘤免疫治疗实验。分别在第0、7、14 d用5%的水合氯醛麻醉小鼠，小鼠腹部毛发剪去2 cm×2 cm区域，用微针处理2 min，涂抹PEI_25k/pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc 100 μl/只/次，质粒浓度为0.6 mg·mL^-1，待充分吸收。以微针给药PBS液 100 μl/只/次为阴性对照组。

肿瘤免疫治疗各组小鼠抑瘤效果及生存率评价：上述各组小鼠接种了B16黑色素瘤细胞后，每天观察成瘤情况，并于实体肿瘤长到体积约40 mm³的第0、7、14 d微针给药各组试剂，操作同上。间隔一定时间测量肿瘤长径（a）和短径（b），采用公式肿瘤体积（mm³）= 短轴（mm）²×长轴（mm）/2，，计算肿瘤体积，并观察小鼠的存活情况。实验结果显示，给药组荷瘤小鼠的肿瘤体积明显小于对照组（p＜0.01），且小鼠生存率提高，结果如图7、8、9所示。

免疫治疗后荷瘤小鼠组织学评价：于末次免疫7 d后，每组各荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后，完整分离肿瘤，立刻置于经 10 %的福尔马林固定 4 h，PBS 漂洗数次，分别于60 %乙醇浸泡 3 h，70 %乙醇浸泡 2 h，80 %乙醇浸泡 3 h，95 %乙醇浸泡3 h，100 %乙醇浸泡 30 min，重复2次。二甲苯浸泡 15 min，重复2次。58 ℃浸蜡 1 h。进行组织包埋。切片，为4 μm 厚度，60 ℃烘烤 2 h。37 ℃过夜，4 ℃保存待用。

根据肿瘤坏死的分级为：

―，瘤体无坏死；

＋，瘤体坏死少于 1/3；

＋＋，瘤体坏死 1/3～2/3；

＋＋＋，瘤体坏死超过 2/3。

瘤体内和瘤体周围炎性细胞（中性粒、淋巴、单核细胞）浸润的分级为：

―，无炎性细胞浸润；

＋，少量炎性细胞浸润；

＋＋，中等量炎性细胞浸润；

＋＋＋，大量炎性细胞浸润。

HE染色后结果显示给药组瘤体内的坏死程度明显高于对照组，结果如表1所示。

表 1 PEI_25k/DNA抗肿瘤免疫治疗后肿瘤部位的炎症情况

Claims

1.一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中含有黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件和绿荧光蛋白报告基因的重组质粒，用PCR扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，分别通过双切酶连接到真核表达的质粒载体上，构建成pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc质粒。

2.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有Trp₂（NCBI Reference Sequence: NM_006115.3）对应的全部基因序列。

3.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有GM-CSF（GenBank: M11220.1）对应的全部基因序列。

4.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有Fc融合蛋白（GenBank: X67292.1）对应的全部基因序列。

5.如权利要求l所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体为pUCM-T Vector。

6.一种权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤:

7.如权利要求6所述的抗黑色素DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于：将所述DNA质粒疫苗溶于磷酸盐缓冲液中，并以阳离子聚合物PEI为免疫佐剂和给药载体，制备得到含有阳离子聚合物的DNA质粒疫苗。