CN102234659B - 沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白b1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法，属于遗传工程技术。本发明通过基因重组的方法，将细胞因子信号抑制因子1小干扰RNA片段shSOCS1，NY-ESO-1和MAGE3的融合基因编码序列及HMGB1的编码序列连接入同一载体pIRES-EGFP中，并保证各自的正确表达，构建共表达shSOCS1、HMGB1及肿瘤相关抗原的质粒。采用本发明质粒制备的新一代树突状细胞疫苗，既能引起高效率的CTL细胞的免疫应答，又几乎不引起副作用，成为一种安全有效的免疫疗法。

Description

沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及遗传工程技术，具体是一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法。

技术背景

细胞因子信号抑制因子1（suppressor of cytokine signaling1, SOCS1）是新发现的一个抗原呈递的抑制因子，已证实其在维持自身耐受性和限制抗肿瘤免疫方面起着关键性的作用。SOCS1是T细胞和抗原呈递细胞中多种致炎细胞因子的信号传导的关键负性调节蛋白，这些细胞因子包括IFN-g、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15等。作为一种反馈机制，SOCS1在促炎症反应刺激之后诱导表达，可作为一种假底物阻止JAK 和STAT结合，同时可增加JAK的泛素化降解，此外，SOCS1还可以通过抑制NF-κB信号通路来负调控Toll样受体（Toll-likereceptors, TLRs）信号。

最新的研究证实，沉默SOCS1能够增强树突状细胞（dendritic cells, DCs）的免疫刺激能力和持续时间，从而克服宿主水平的自身耐受，高度活化抗原特异性的CTL反应。体内实验已证实该方法可以有效抑制小鼠体内建立的低免疫原性的肿瘤的生长。更引人注意的是，还有证据显示沉默这类抗原呈递弱化因子有可能克服调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）介导的免疫耐受。Treg可以抑制CD8+T细胞、CD4+CD25-T细胞以及自然杀伤细胞（natural killer，NK）的增殖和免疫活性，在预防自身免疫性疾病以及移植排斥方面起到至关重要的作用，但同时也是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。研究表明肿瘤患者Treg数量较正常人升高，即肿瘤通过某种机制诱导了Treg的分化，而Treg又可以抑制机体的免疫反应，从而有利于肿瘤的生长和转移。对SOCS1的研究不仅证实它是抗肿瘤免疫反应初始阶段和效应阶段的抗原呈递弱化因子，也为我们提供了一条可能克服Treg介导的肿瘤免疫耐受的抗原特异性的新途径。因此，对SOCS1等抗原呈递弱化因子的抑制是一种新的消除宿主水平自身耐受的有效方法，从而可诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1 protein , HMGB1）

仅仅抑制可诱导的反馈抑制因子SOCS1尚不足以激活DCs，因为促炎症反应的刺激，如TLRs激动剂或细胞因子，是启动前炎症信号级联放大所必须的。警报素（alarmins）是近年来提出的一类具有DCs募集和活化双重作用的内源因子。Alarmins 可以通过促进抗原的摄取、处理和呈递来增强对抗原特异性免疫反应的诱导，从而在对获得性免疫进行预警的过程中起到关键作用。

HMGB1为alarmins家族中最为受关注的成员。最早研究发现HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，在核内能够识别和结合DNA，参与DNA的转录、复制、修复以及细胞运动等。HMGB1 分子由251个氨基酸组成，含有与DNA 结合的结构域 A 盒(aa1～79)和 B 盒(aa89～163)，以及1 个高度重复并富含酸性氨基酸的 C末端(aa186～215)。其中，B盒前 20 个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点。A 盒蛋白能取代全长 HMGB1 而与相应受体结合 , 但不发挥生物学效应。HMGB1通过坏死的细胞被动释放和激活巨噬细胞主动分泌两种途径被释放到细胞外，发挥TLRs样受体激动剂的作用。HMGB1的基因同源性很高，人和鼠的同源性在99%以上。

HMGB1可刺激DCs成熟，上调人单核细胞来源的DC表面CD83、CD54、CD80、CD40、CD58及 MHC II类分子等的表达，并能够促使其分泌IL-12、IL-6、IL-1、IL-8、TNF-α及RANTES等促炎细胞因子；HMGB1能促使DC从CCL5敏感（未成熟表型）转变为对CCL21敏感(成熟表型)，从而有利于DC迁移至次级淋巴结；HMGB1本身也是未成熟DC的趋化因子；混合淋巴细胞反应中，B盒刺激的DC可诱导同种T细胞分泌IL2和IFN-γ,并分化为Th1细胞；给予抗HMGB1中和抗体、抗A盒或抗RAGE抗体,可使成熟DC表面CD80、CD83 和CD86 表达上调受阻, 并对DC分泌IL12、克隆扩增和初始T细胞存活显示抑制作用。HMGB1也可直接作用于T、B细胞。成熟的DC通过分泌HMGB1而促进CD4+T细胞增殖、生存和分化为Th1细胞。HMGB1也参与自身反应性B 细胞活化。鉴于其对DC强大的募集和活化作用，HMGB1可作为刺激抗原特异性免疫反应的强效佐剂。

肿瘤相关抗原—NY-ESO-1，MAGE3

有许多肿瘤相关抗原（TAA）可被用于肿瘤疫苗。一个理想的TAA应该在肿瘤细胞而非正常细胞中高表达，且还应该是肿瘤生存所必需的。目前普遍认为，对于肿瘤疫苗，靶向多个TAA将更为有效。

NY-ESO-1抗原是肿瘤-睾丸抗原家族中的重要成员，低表达于成人卵巢、子宫和正常乳腺，而在多种类型的肿瘤如：前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤和肝细胞癌中广泛高表达。并且NY-ESO-1是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原, 可以在 NY-ESO-1表达阳性的肿瘤患者体内引起自发性体液免疫反应和特异性 T细胞免疫反应，其全长蛋白抗原还具有较强大的诱导抗体应答的潜能，后者可能会通过形成免疫复合物，进一步辅助DC摄取、加工和呈递抗原。因此，NY-ESO-1被认为是最好的肿瘤候选疫苗，在肿瘤免疫治疗中最具发展潜力。

MAGE3基因作为MAGE基因家族中最早被分离鉴定的基因之一，广泛存在于各种恶性肿瘤细胞中，而在正常组织(除睾丸、胎盘)中并不表达,在炎症组织，良性肿瘤以及癌旁组织中也不表达。MAGE3中MHC限制性的抗原决定簇已被鉴定出来，将MAGE3肽表位疫苗由HLA分子呈递给CTL发挥抗肿瘤作用早已广泛试用于黑色素瘤,肝癌,肺癌为主的各种肿瘤的临床治疗。MAGE3治疗性疫苗在体内能诱导特异性CTL的产生,并在一些病例中取得了一定的疗效。

发明内容

本发明就是为了避免了因抗原解离或降解影响其功能的不足，保障抑制负性因子，免疫佐剂激活和肿瘤抗原三者都能正常表达且互不干扰，而提供一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1）及其制备方法。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1），其是在质粒载体pIRES-EGFP中包含细胞因子信号抑制因子1小干扰RNA片段，肿瘤相关抗原NY-ESO-1全长编码序列、MAGE-3表位p271-279编码序列，HMGB1的编码序列，并在HMGB1序列N端添加了人胰岛素信号肽序列，该质粒的碱基序列见序列表。

所述沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1），其细胞因子信号抑制因子1的shRNA由人U6 RNA启动子控制；编码NY-ESO-1和MAGE3融合蛋白的序列由CMV启动子控制，HMGB1基因位于CMV启动子下游，由一个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）启动转录。

所述沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1），该质粒转染入DCs，通过沉默细胞因子信号抑制因子1，分泌表达HMGB1和胞内表达肿瘤相关抗原NY-ESO-1、MAGE-3，刺激DC细胞成熟，增加DCs细胞因子分泌量，并使DC疫苗具有更加有效的免疫刺激能力，增强DC疫苗对肿瘤的特异性。

一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒的制备方法，该质粒是按以下步骤制备的：

①.细胞因子信号抑制因子1沉默质粒（pENTR/U6/shSOCS1）的构建，设计并合成用以敲减细胞因子信号抑制因子1基因表达的shRNA oligo序列，分别合成并经退火形成的oligo双链连入pENTR/U6载体中；

②.HMGB1表达质粒（pIRES/sig-HMGB1）的构建，以P1-sig、P2-NotI为引物，HMGB1 ORF克隆为模板扩增带有信号肽序列和NotI的HMGB1序列；以P3-EcoRI、P4-sig为引物pIRES-EGFP载体为模板扩增带有EcoRI和信号肽序列的IRES序列，将上述两段产物以PCR方法拼接为IRES-胰岛素信号肽-HMGB1, 该拼接产物用EcoRI和NotI酶切后连接入经同样酶切的载体pIRES-EGFP中，得到高迁移率族蛋白B1表达质粒；

③.肿瘤相关抗原表达质粒（p/NY-MA）的构建，以P5-EcoRI，P6-NotI为引物，NY-ESO-1 ORF克隆为模板扩增带EcoRI位点和MAGE3-NotI的NY-ESO-1序列，利用NotI和EcoRI酶切位点将PCR扩增产物装入载体中后经转化感受态细菌，克隆扩增提取质粒；

④.共表达高迁移率族蛋白B1和肿瘤相关抗原质粒

（p/NY-IRES-sig-HMGB1）的构建，以P7-BglII，P8-EcoRI为引物，第③步构建的质粒为模板扩增带有BglII和EcoRI识别位点的NY-ESO-1-MAGE序列，将扩增片段利用BglII和EcoRI装入第②步所构建的质粒中后经转化感受态细菌，选择性培养基克隆扩增提取质粒；

⑤.沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1）的构建，以P9-BasI，P2-NotI为引物，第④步骤所构建质粒为模板扩增带有BasI和NotI酶切位点的CMV+NY-ESO-1-MAGE3表位-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，以P10-BfaI，P11-BsaI为引物，以第①步所骤构建的质粒为模板PCR扩增带BfaI和BsaI位点的U6-shSOCS1序列，上述两段PCR产物利用BsaI酶切后连接后利用AseI和NotI装入pIRES-EGFP载体中，经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序；

⑥.质粒鉴定，沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒（p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1）转染293T后，经western blot验证，正确表达NY-ESO-1蛋白，并表达高迁移率族蛋白B1，转染PC3细胞后，SOCS1蛋白表达明显较野生型PC3及shNC/EGFP转染组降低。

这样，本发明将抑制负性因子，免疫佐剂激活和肿瘤抗原表达于同一质粒中，U6，CMV及IRES的组合保证三者都能正常表达且互不干扰。将该质粒用于DC疫苗的制备可更加方便的产生强大的免疫激活功能。并且，该质粒也可被用于包装为病毒载体使转染更加稳定高效。共表达shSOCS1、HMGB1、TAA的质粒p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染DC细胞有望代表新一代的DC疫苗，既能引起高效率的CTL细胞的免疫应答，又几乎不引起副作用，是一种安全有效的免疫疗法，将能够广泛地用于治疗不同种类的人类癌症，具有广泛，良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明质粒结构示意图；

图2是Western blot 验证NY-ESO-1表达；

图3是Western blot 验证HMGB1表达；

图4是Western blot 验证SOCS1沉默；

图5a是转染后DC细胞表面CD40表达量的变化比较图；

图5b是转染后DC细胞表面CD83表达量的变化比较图；

图5c 是转染后DC细胞表面CD86表达量的变化比较图；

图5d是转染后DC细胞表面HLA-DR表达量的变化比较图；

图6a-1是转染后24h TNF-α分泌量的差异比较图；

图6a-2是转染后24h IL-1β分泌量的差异比较图；

图6a-3是转染后24h IL-6分泌量的差异比较图；

图6a-4是转染后24h IL-10分泌量的差异比较图；

图6b-1是转染后24h与TLR激动剂相比TNF-α分泌量的差异比较图；

图6b-2是转染后24h与TLR激动剂相比IL-1β分泌量的差异比较图；

图6b-3是转染后24h 与TLR激动剂相比IL-6分泌量的差异比较图；

图6b-4是转染后24h与TLR激动剂相比IL-10分泌量的差异比较图；

图6c-1是转染后72h与TLR激动剂相比TNF-α分泌量的差异比较图；

图6c-2是转染后72h与TLR激动剂相比IL-1β分泌量的差异比较图；

图6c-3是转染后72h 与TLR激动剂相比IL-6分泌量的差异比较图；

图6c-4是转染后72h与TLR激动剂相比IL-10分泌量的差异比较图；

图7是HMGB1、IRES及NY-ESO-1/MAGE3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图8是IRES+胰岛素信号肽-HMGB1 拼接PCR产物电泳图；

图9是U6- shSOCS1，NY-ESO-1-MAGE PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图10是CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位）-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

本发明通过H1及CMV双启动子同时实现对DCs抗原呈递负性调节因子SOCS1的抑制，TLRs的激活和肿瘤抗原负载DC，通过体外转染DCs，检测其抗原呈递能力和对T细胞的激活作用，成为一种新的有效的消除宿主水平的自身耐受的方法，从而诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。

在构建的质粒中，SOCS1的shRNA由人U6 RNA启动子控制，而编码NY-ESO-1和MAGE3融合蛋白的序列由CMV启动子控制。在这个融合蛋白中，NY-ESO-1为其全长编码序列，MAGE-3选择其HLA-A0201（亚洲人群中表达率最高的HLA等位基因）表位p271-279编码序列。HMGB1基因位于CMV启动子下游，由一个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）启动转录。并且为了使得HMGB1可以分泌性表达从而能够与DCs表面的TLRs相互作用，在其N端添加了人胰岛素信号肽序列。CMV启动子加IRES的组合可以有效地避免双CMV启动子之间的相互影响，确保两个基因均能正常表达。质粒结构如图1所示。

由于单独依靠SOCS1的抑制作用不能有效的触发促炎症反应信号的产生，而仅仅有TLRs配合体或是致炎细胞因子等佐剂也不能有效地阻断在宿主水平上的自身耐受性以及激活有效的抗肿瘤反应。因此，将SOCS1抑制作用和免疫激活作用结合起来，对DC细胞在JAK/STAT和TLRs通路上不受限制地产生信号持续激活抗原特异性T细胞反应是必需的。本发明构建出可用于DC疫苗基因修饰的质粒，即p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1。将沉默负性调节因子，TAA及佐剂刺激同时引入DC疫苗的基因修饰中。将该质粒转染入DC细胞可通过抑制负性因子和免疫佐剂激活二者的同时作用，使DC疫苗具有更加有效的免疫刺激能力。

在本发明所构建的质粒中，一方面，利用小干扰RNA技术将DC细胞成熟信号通路的负性调节因子SOCS1沉默；另一方面，利用胰岛素信号肽将对DC强大刺激能力的HMGB1引导至胞外分泌表达以发挥激活DC的佐剂功能。已有的研究证实，SOCS1对DC的激活起到抑制的作用，而沉默其表达后，DC表面共刺激分子CD83，CD80，CD86表达增加并且表达更加持久，促炎性细胞因子如：IL-1、IL-12、IFN-γ、IL-6和TNF-α的分泌量也会增加，并且更能激活CTL反应。HMGB1作为一类刚刚被鉴定出的具有激活募集DC，增强抗原特异性免疫反应功能的强效免疫佐剂，将它用于DC疫苗的制备中。HMGB1对DC的作用是通过TLRs实现的，而SOCS1可通过对下游信号分子的作用控制TLRs的信号传导，因此二者的结合可起到协同效应。由于HMGB1需要与DC表面的TLRs相互作用，选择在HMGB1序列上游加入胰岛素信号肽序列将HMGB1修饰为可以分泌表达的蛋白，从而最大化它的刺激活性。为增强DC疫苗对肿瘤的特异性，在质粒中加入TAA NY-ESO-1和MAGE3的编码序列。

一.试剂来源

pIRES-EGFP 载体购自BD biosciences公司；BLOCK-iT™ U6 RNAi Entry Vector 试剂盒、HMGB1及NY-ESO-1 ORF克隆、Lipofectamine 2000均购自invitrogen公司；引物及SOCS1 shRNA由invitrogen公司合成；限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；DH5α感受态细菌购自Takara公司；质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司； 293T细胞系及PC3细胞系由本实验室所保存；细胞培养基RPMI-1640及胎牛血清购自Heyclone公司；anti-CD83-PE、anti-CD86-PE、anti-CD40-PE、anti-HLA-DR-FITC及其同型对照抗体均购自BD公司；ELISA试剂盒均购自北京晶美生物公司。

二.方 法

1、pENTR/U6/shSOCS1的构建

设计并合成用以敲减SOCS1基因表达的shRNA oligo和其互补链，正义链序列为

caccGCTGGTTGTTGTAGCAGCTTAAGAACGAAGTTAAGCTGCTACAACAACCAGTT，注意两条oligo各有一个4碱基的突出末端用以连接pENTR/U6载体的粘性末端。将两条oligo退火形成双链。退火时分别把两条oligo用去离子水溶解成100μM，各取5μl混合，再加入2μl的10×oligo annealing buffer和8μl的去离子水。在95℃加热4分钟，然后放置室温自然冷却20分钟，形成双链oligo。将退火双链oligo稀释成5nM浓度，用T4连接酶克隆入pENTR/U6载体中。为构建对照质粒，我们又将shSOCS1装入pIRES-EGFP载体中。扩增扩增带BfaI和NotI位点的U6-shSOCS1序列，上游引物为P10-BfaI：5'-GGGCAACTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'

（划线示BfaI识别位点），下游引物为

P12-NotI：5'-GGTTCCGCGGCCGCAAAAAACTGGTTGTTGTAGCAGC-3'。用AseI和NotI酶切pIRES-EGFP 载体，用BfaI和NotI酶切U6-shSOCS1片段，利用AseI和BfaI同尾原理，用T4 DNA ligase连接U6-shSOCS和pIRES-EGFP，室温连接2小时。转化入DH5α感受态细胞中，涂于含50 mg/L kanamycin LB平板上，挑取阳性克隆菌落抽提质粒并测序。

2、pIRES/sig-HMGB1的构建

我们选择pIRES-EGFP为载体，该载体包含有CMV启动子，IRES序列连接EGFP。我们首先将该载体中的EGFP替换为HMGB1。以HMGB1 ORF克隆为模板PCR扩增带有信号肽序列和NotI位点的HMGB1序列，

上游引物为P1-sig：

5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGC-3' (划线示胰岛素信号肽序列)，

下游引物为P2-NotI：

5'-GCGTTTGCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTCTTCTTC-3' (划线示NotI识别位点)。

以pIRES-EGFP载体为模板PCR扩增带EcoRI位点和信号肽序列的IRES序列，

上游引物为P3-EcoRI：

5'-AGCTCAAGCTTCGAATTCTGC-3'(划线示EcoRI识别位点)，

下游引物为P4-sig：

5'-CCAGAGGGCCAGCAGCGCCAGCAGGGGCAGGAGGCGCATCCACAGGGCCATGGTTGTGGCCATATTATCATCG-3'(划线示胰岛素信号肽序列)。

用PCR方法将上述两段扩增产物拼接成IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段。该拼接产物用EcoRI和NotI酶切后连接入经同样酶切的载体pIRES-EGFP中，得到质粒pIRES/sig-HMGB1。转化入DH5α感受态细胞中，涂于含50mg/L kanamycin LB平板上，挑取阳性克隆菌落抽提质粒并测序。

3、p/NY-MA的构建

为构建单独抗原的对照载体，我们将NY-ESO-1和MAGE3（表位）连接后，装入pIRES-EGFP载体中。NY-ESO-1 ORF克隆为模板PCR扩增带EcoRI位点和MAGE3（表位）-NotI的NY-ESO-1序列，

上游引物为P5-EcoRI：

5'-TTTAAAgaattcATGCAGGCCGAAGGCCGG-3' (划线示EcoRI识别位点)，

下游引物为P6-NotI：

5'-AAAGGGGCGGCCGCTTAAACGAGGGCCCTTGGACCCCACAGGAAGCGCCTCTGCCCTGAGGGA-3'（划线示NotI识别位点及双划线表示MAGE3 HLA-0201表位）。

用EcoRI和NotI酶切带EcoRI位点和MAGE-NotI的NY-ESO-1片段及载体pIRES-EGFP，用T4 DNA ligase连接回收的片段和载体，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂于含50 mg/L kanamycin LB平板上，挑取阳性克隆菌落抽提质粒并测序。

4、p/NY-IRES-sig-HMGB1的构建

第二步所构建的质粒中包含有多克隆位点，我们选择BglII和EcoRI酶切位点将NY-ESO-1-MAGE3装入第二步所构建的质粒中，构建p/NY-IRES-sig-HMGB1。以第三步所构建的质粒为模板PCR扩增带有BglII和EcoRI识别位点的NY-ESO-1-MAGE序列，上游引物为P7-BglII：5'-GGGTTAagatctATGCAGGCCGAAGGCCG -3'（划线示BglII识别位点），下游引物为P8-EcoRI：5'-AAATTTgaattcTTAA ACGAGGGCCCTTGGA-3'（划线示EcoRI识别位点）。用BglII和EcoRI酶切带BglII和EcoRI的NY-ESO-1-MAGE片段及第二步所构建的质粒。用T4 DNA ligase连接回收的片段和载体，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂于含50 mg/L kanamycin LB平板上，挑取阳性克隆菌落抽提质粒并测序。

5、p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1的构建

分别以第一步和第四步已构建完成的质粒为模板扩增U6-shSOCS1片段和CMV-NY-ESO-1-MAGE3-sig-HMGB1片段利用酶切位点将两段产物拼接后装入pIRES-EGFP载体中，完成最终p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1构建。首先以第四步所构建的质粒为模板PCR扩增CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位）-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，引入BasI和NotI酶切位点，

上游引物为P9-BasI：

5'-tttccgccGGTCTCATAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3'（划线示BasI 识别位点），

下游引物为P2-NotI。以第一步所构建的质粒为模板PCR扩增带BfaI和BsaI位点的U6-shSOCS1序列，

上游引物为P10-BfaI：5'-GGGCAACTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'（划线示BfaI识别位点），

下游引物为P11-BsaI：5'-tttccgccGGTCTCAactaAAAAAACTGGTTGT TGTAGCAGC-3'（划线示BsaI识别位点）。

用BasI和NotI酶切CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位）-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，用BfaI和BsaI酶切U6- shSOCS1片段，AseI和NotI酶切pIRES-EGFP 载体，利用AseI和BfaI同尾原理，用T4 DNA ligase连接回收的片段和载体，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂于含50mg/L kanamycin LB平板上，挑取阳性克隆菌落抽提质粒并测序。

6、质粒转染及验证

人胚肾细胞293T培养于10%胎牛血清的PRMI 1640中，待生长至对数生长期，进行脂质体lipofetamine 2000介导的质粒转染。同时转染表达EGFP的空质粒作为阴性对照，也用于观察转染效率。48h后，收获细胞进行Western blot分析NY-ESO-1及MAGE3的表达水平，收集细胞培养上清液Western blot分析HMGB1表达水平。将所构建的质粒进行脂质体转染入SOCS1表达阳性的细胞系PC3中，48h后分别进行Westernblot和定量RT-PCR分析SOCS1蛋白和基因表达量的变化。

7、DC细胞培养及转染

取富集外周血4ml，常规Ficoll分离获得单个核细胞。用RPMI 1640调整细胞密度至4-5×10⁶/ml，每20ml细胞悬液种入75cm²培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育2h。轻轻吸去未贴壁细胞，加入含有1000U/ml IL-4， 1000U/ml GM-CSF和10%胎牛血清的RPMI 1640 20ml，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。每三天半量更换新鲜培养基。至细胞生长至第六天，使用Amaxa高效电转染仪及其配套DC细胞转染试剂盒按照说明书转染DC细胞。转染质粒包括p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1及我们同时构建的对照质粒pENTR/U6/shSOCS1、pIRES/sig-HMGB1和空质粒。为比较所构建质粒转染与经典TLRs激动剂对DC功能的影响，在转染的同时，用LPS（20μg/ml），Poly(I:C) （25μg/ml），CpG（1nM）刺激DC成熟。

8、ELISA法测定细胞因子分泌

分别于转染或刺激后24h及72h留取细胞培养上清，按照晶美公司ELISA试剂盒操作说明测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的分泌量。

9、DC细胞表型分析

于转染24h后，收集细胞通过流式细胞仪分析DC表面标志CD40、CD83、CD86及HLA-DR的表达。

三.结 果

1、pENTR/U6/shSOCS1的构建

经测序，分别合成并经退火形成的oligo双链连入pENTR/U6载体中，成功构建shSOCS1质粒，。

2、pIRES/sig-HMGB1的构建

通过序列比对，所构买的HMGB1 ORF克隆有一个碱基与GenBank原序列不同，但此改变同样记录在GenBank中，其编码氨基酸并未发生改变。以P1-sig、P2-NotI为引物HMGB1 ORF克隆为模板扩增带有信号肽序列和NotI的HMGB1序列，片段长度为731bp。以P3-EcoRI、P4-sig为引物pIRES-EGFP载体为模板扩增带有EcoRI和信号肽序列的IRES序列，片段长度为688bp。PCR产物电泳如图7中2、3所示，其中1是marker；2是带信号肽序列和NotI位点的HMGB1 （600-850bp之间） 3是EcoRI和信号肽序列的IRES（600-850bp之间）；4是EcoRI位点和MAGE-NotI的NY-ESO-1。

将上述两段产物以PCR方法拼接为IRES-胰岛素信号肽-HMGB1，片段长度为1368bp，产物电泳如图8所示，其中1是IRES+胰岛素信号肽-HMGB1；2是marker，1000bp与1500bp之间可见清楚条带。本阶段所构建质粒经测序与预期序列完全一致。

3、p/NY-MA的构建

以P5-EcoRI，P6-NotI为引物，NY-ESO-1 ORF克隆为模板扩增带EcoRI位点和MAGE3（表位）-NotI的NY-ESO-1序列，片段长度为593bp，如图7中4所示。利用NotI和EcoRI酶切位点将PCR扩增产物装入载体中后经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序结果与预期序列完全一致。

4、p/NY-IRES-sig-HMGB1的构建

以P7-BglII，P8-EcoRI为引物，第三步构建的质粒为模板扩增带有BglII和EcoRI识别位点的NY-ESO-1-MAGE序列，片段长度为591bp，如图9中3所示，其中1是marker；2是带BfaI和BsaI位点的U6- shSOCS1；3是BglII和EcoRI的NY-ESO-1-MAGE。将扩增片段利用BglII和EcoRI装入第二步所构建的质粒中后经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序结果与预期序列完全一致。

5、p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1的构建

以P9-BasI，P2-NotI为引物，第4步所构建质粒为模板扩增带有BasI和NotI酶切位点的CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位）-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，片段长度为2549bp，如图10所示，1是marker；2是CMV+NY-ESO-1-MAGE3(表位）-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1。以P10-BfaI，P11-BsaI为引物，以第一步所构建的质粒为模板PCR扩增带BfaI和BsaI位点的U6-shSOCS1序列，片段长度为350bp，如图9中2所示。上述两段PCR产物利用BsaI酶切后连接后利用AseI和NotI装入pIRES-EGFP载体中，经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序结果与预期序列完全一致。

6、质粒鉴定

构建完成的p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1脂质体转染入293T细胞和PC3细胞中分别验证NY-ESO-1、HMGB1的表达和SOCS1的沉默效果，经Western blot验证可正确表达NY-ESO-1及HMGB1，如图2所示，其中1是p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组；2是空质粒转染组。细胞培养上清中也可检测到HMGB1，如图3所示，其中1是p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组；2是空质粒转染组。转染PC3细胞后，SOCS1蛋白表达明显较野生型PC3及空质粒转染组降低，如图4所示，其中1是野生型PC3组；2是p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组；3是空质粒转染组。经定量RT-PCR检测基因表达水平与Western blot结果一致。

7、转染DC后增加细胞因子分泌量

分别于转染后24h及72h留取细胞培养上清，ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的分泌量，如图6a-1至6a-4所示，其中1是未转染组；2是空质粒转染组；3是pENTR/U6/shSOCS1转染组；4是pIRES/sig-HMGB1转染组；5是p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组。p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DC细胞分泌促炎性反应细胞因子TNF-α、IL-β、IL-6的量明显高于pENTR/U6/shSOCS1转染组和pIRES/sig-HMGB1转染组，而具有免疫抑制作用的细胞因子IL-10的分泌量呈相反的趋势。与经典TLRs激动剂相比，pIRES-EGFP/ shS1-NY-HMGB1转染DC细胞分泌细胞因子具有明显的优势，如图6b-1至6b-4所示，1是未转染组；2是脂多糖刺激组；3是CpG寡核苷酸刺激激组；4是聚肌胞苷酸刺激组。继续培养至72h再次测定细胞因子，LPS组、CpG组、poly(I:C)组细胞因子分泌量下降明显，而p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染组DC细胞细胞因子分泌量没有明显下降，如图6c-1至6c-4所示，其中1是未转染组；2是脂多糖刺激组；3是CpG寡核苷酸刺激激组；4是聚肌胞苷酸刺激组。

8、p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染后更能刺激DC成熟

将p/shS1-NY-IRES-sig-HMGB1转染入DC 24h后，收集细胞通过流式细胞仪分析DC表面标志CD40、CD83、CD86及HLA-DR的表达。与转染空质粒，SOCS1沉默质粒（pENTR/U6/shSOCS1）及HMGB1表达质粒（pIRES/sig-HMGB1）的对照组相比，DC细胞表面CD40、CD83、CD86和HLA-DR表达量明显上升，如图5a-5d所示。

Claims (2)

1.一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒，其特征在于：在质粒载体pIRES-EGFP中包含细胞因子信号抑制因子1小干扰RNA片段，肿瘤相关抗原NY-ESO-1全长编码序列、MAGE-3表位p271-279编码序列，HMGB1的编码序列，并在HMGB1序列N端添加了人胰岛素信号肽序列，该质粒的碱基序列为序列表中SEQ ID No:1所示的序列。

2.如权利要求1所述沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒的制备方法，其特征在于：该质粒是按以下步骤制备的：

①.细胞因子信号抑制因子1沉默质粒的构建，设计并合成用以敲减细胞因子信号抑制因子1基因表达的shRNA oligo序列及其互补链，经退火形成oligo双链并连入pENTR/U6载体中；

②.高迁移率族蛋白B1表达质粒的构建，以

5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGG

ACCTGACCCAGCCGCAGCCGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGC-3'、

5'-GCGTTTGCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTCTTCTTC-3'为引物，HMGB1 ORF克隆为模板扩增带有信号肽序列和NotI酶切位点的HMGB1序列；以5'-AGCTCAAGCTTCGAATTCTGC-3'、

5'-CCAGAGGGCCAGCAGCGCCAGCAGGGGCAGGAGGCGCATCCACAGGGCCATGGTT

GTGGCCATATTATCATCG-3'为引物pIRES-EGFP载体为模板扩增带有EcoRI酶切位点和信号肽序列的IRES序列，将上述两段产物以PCR方法拼接为IRES-胰岛素信号肽-HMGB1，该拼接产物用EcoRI和NotI酶切后连接入经同样酶切的载体pIRES-EGFP中，得到高迁移率族蛋白B1表达质粒；

③.肿瘤相关抗原表达质粒的构建，以

5'-TTTAAAGAATTCATGCAGGCCGAAGGCCGG-3'，

5'-AAAGGGGCGGCCGCTTAAACGAGGGCCCTTGGACCCCACAGGAAGCGCCTCTG

CCCTGAGGGA-3'为引物，NY-ESO-1 ORF克隆为模板扩增带EcoRI位点和MAGE3-NotI的NY-ESO-1序列，利用NotI和EcoRI酶切位点将PCR扩增产物装入载体中后经转化感受态细菌，克隆扩增提取质粒；

④.共表达高迁移率族蛋白B1和肿瘤相关抗原质粒的构建，以

5'-GGGTTAAGATCTATGCAGGCCGAAGGCCG -3'，

5'-AAATTTGGATTCTTAA ACGAGGGCCCTTGGA-3'为引物，第③步构建的质粒为模板扩增带有BglII和EcoRI识别位点的NY-ESO-1-MAGE序列，将扩增片段利用BglII和EcoRI装入第②步所构建的质粒中后经转化感受态细菌，选择性培养基克隆扩增提取质粒；

⑤.沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒的构建，以

5'-TTTCCGCCGGTCTCATAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3'，

5'-GCGTTTGCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTCTTCTTC-3'为引物，第④步骤所构建质粒为模板扩增带有BasI和NotI酶切位点的CMV+NY-ESO-1-MAGE3表位-IRES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，以

5'-GGGCAACTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'，

5'-TTTCCGCCGGTCTCAactaAAAAAACTGGTTGTTGTAGCAGC-3'为引物，以第①步骤所构建的质粒为模板PCR扩增带BfaI和BsaI位点的U6-shSOCS1序列，上述两段PCR产物利用BsaI酶切后连接后利用AseI和NotI装入pIRES-EGFP载体中，经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序；

⑥.质粒鉴定，沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒转染293T后，经western blot验证，正确表达NY-ESO-1蛋白，并表达高迁移率族蛋白B1，转染PC3细胞后，细胞因子信号抑制因子1蛋白表达明显较野生型PC3及shNC/EGFP转染组降低。

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