CN104004712A - 抗原特异性的细胞毒性t淋巴细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，包括步骤：A）携带肿瘤抗原基因重组载体的构建；B）DC细胞的分离与培养；C）使用步骤A）所述重组载体转导步骤B）所述的未成熟DC细胞；D）进一步通过细胞因子诱导步骤C）所述的未成熟DC细胞成为成熟DC细胞；E）将步骤D）所述的成熟DC细胞与T淋巴细胞共培养，获得具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。本发明优选同时转导可用于表达CEA、MAGE-A3、MUC1三种广谱肿瘤抗原的慢病毒混合载体转导未成熟DC细胞，获得经活化和增殖的肿瘤抗原特异性的T细胞，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种新的多抗原广谱CTL的制备方法和应用。
背景技术
目前，癌症的抗肿瘤免疫治疗策略主要有：肿瘤全细胞疫苗(Whole-tumor cell vaccines)、树突状细胞疫苗(Dendritic cell vaccines,DC疫苗)、重组蛋白疫苗(recombinant proteins vaccines)、多肽疫苗(Peptide vaccines)、DNA疫苗(DNA vaccines)和病毒疫苗(Viral vaccines)等，有研究显示，以DC疫苗联合过继性T细胞免疫治疗(adoptive T-cell therapy)效果最好。DC是目前发现的功能最强大的专职抗原递呈细胞，成熟DC表面高表达MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，不仅能有效的将肿瘤抗原递呈给已活化或记忆性T细胞，还能将抗原递呈给初始T细胞使其增殖，是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在适应性T细胞免疫应答的诱导中具有独特的地位。目前，以DC为基础的CTL主要包括：肿瘤抗原肽致敏的CTL、肿瘤全细胞抗原致敏的CTL、肿瘤抗原基因转导的CTL等。其中，用肿瘤抗原肽或肿瘤全细胞抗原致敏DC回输后，虽然可以引起特异免疫保护作用，但并不持久；然而有意义的是，从有限的肿瘤组织中扩增足量的有效刺激DC的mRNA，采用差异筛选方法获特异性表达的肿瘤特异性抗原mRNA导入DC，制备RNA疫苗，或将肿瘤抗原基因以裸DNA方式导人DC，或以病毒为载体转导DC，使DC持续表达肿瘤抗原，可解决上述两种CTL因抗原解离、肿瘤来源有限、有诱发自身免疫性疾病危险等不足的问题。
目前基因修饰DC的方法主要有病毒载体和非病毒载体介导两大类方法。非病毒载体介导的方法主要有脂质转导、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法等。脂质体转导作为早期的方法之一近年来虽然不断改进，但其转导效率不高和细胞毒性 仍是其广泛应用的障碍，同时对DC的功能及活性也有较大的影响。现认为病毒载体对DC的转导更为有效。如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。腺病毒载体转基因效率高，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制，容易制得高滴度病毒载体，生物活性评价也较简便，但由于有较高的免疫原性，导致其使用受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的广谱肿瘤抗原特异性的CTL，使用慢病毒载体细胞基因工程的方法，利用树突状细胞强大的抗原递呈功能，更有效的激活广谱肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的增殖和杀伤能力。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种CTL的制备方法，包括步骤：
A)携带肿瘤抗原基因重组载体的构建；
B)DC细胞的分离与培养；
C)使用步骤A)所述重组载体转导步骤B)所述的未成熟DC细胞；
D)进一步通过细胞因子诱导步骤C)所述的未成熟DC细胞成为成熟DC细胞；
E)将步骤D)所述的成熟DC细胞与T淋巴细胞共培养，获得具有抗原特异性的杀伤毒T淋巴细胞，即CTL。
所述的肿瘤抗原基因为新构建的癌胚抗原(CEA)基因片段，或黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)基因片段，或粘蛋白1抗原(MUC1)基因片段；本发明通过大量的筛选和探索，最终确定出癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；黑色素瘤相关抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；粘蛋白1抗原基因片段如SEQ ID NO:3所示，使得最终制备得来的CTL具有极佳的抗原特异性。
在采用血细胞分离仪或直接抽取肿瘤患者静脉外周血(50-150毫升)，分离出外周血单个核细胞(PBMC)。经培养，PBMC被分离为淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞继续培养，备用。携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的慢病毒载体感 染未成熟的单核细胞来源的未成熟DC细胞，并以细胞因子TNF-α诱导成熟的树突状细胞(DC)产生。将成熟的DC与T淋巴细胞混合培养，使淋巴细胞诱导成为具有抗原特异性的，杀伤抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，最后将被激活的CTL回输给肿瘤患者。整个过程需要12-14天。
本发明优选为同时转导可用于表达CEA、MAGE-A3、MUC1三种广谱肿瘤抗原的慢病毒混合载体转导未成熟DC细胞，获得经活化和增殖的肿瘤抗原特异性的T细胞(Lv-DC-CTL)，以达到更大的广谱肿瘤治疗范围和针对多靶点抗原诱导，增强特异肿瘤杀伤性的治疗效果。
广谱肿瘤抗原的使用可以弥补对肿瘤抗原缺乏检测手段的不足，同时可以通过增加抗原靶点从而增强免疫疗效；慢病毒载体可以有效和稳定的转导细胞，并使其持续表达肿瘤抗原；树突状细胞是专职的免疫抗原递呈细胞，可以有效地促进特异性T细胞的活化和增殖。
本发明可在符合GMP标准的车间中进行大批量，商业化生产高纯度，并符合临床应用的高活性滴度的携带肿瘤相关抗原决定簇基因的慢病毒载体。克服了以往DC刺激物不能大规模，按照制药标准生产的缺点。
慢病毒载体系统(Lentiviral vector,Lv)是以慢病毒为基本骨架改建而来的，可有效地整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所携带的外源基因，所携带外源基因不会发生突变，因而以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来基因转移载体的最佳选择。与其他逆转录病毒载体相比具有以下优点：(1)既可以感染处于有丝分裂期的细胞，也可以感染处于分裂终末期和静止期的细胞；(2)转移基因片段容量较大，可以容纳约10kb左右的外源基因，可以兼容多个转录启动子；(3)整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力，可长期而稳定的表达；(4)不易诱发宿主免疫反应；(5)LVs经改造后不在宿主细胞繁殖，不会导致宿主细胞的死亡，被感染或转化的细胞能够连续传代。此外，DCs对慢病毒载体天然易感，故修饰的慢病毒载体变异株能成为DCs的合适载体，而不成熟及成熟DCs都能被慢病毒载体转导，不成熟DCs被感染后仍能进一步发育成熟，而成熟DCs仍具有良好的抗原呈递功能，能诱导同种CTL 产生。因此，慢病毒载体成为基因修饰DC的理想载体。
肿瘤抗原的存在是T细胞特异免疫反应的物质基础，因此，有效地筛选肿瘤抗原(或抗原肽)是提高其致敏DC后诱导特异性抗肿瘤反应能力的关键和难点。为制备广谱肿瘤抗原CTL，我们根据以往的研究成果选择了以下三个肿瘤抗原：1)癌胚抗原(CEA)是一种相对广谱的肿瘤标志物，在大多数的结直肠癌、胰腺癌，50％的乳腺癌以及70％的非小细胞型肺癌，以及正常的结肠粘膜以及胎儿消化器官都有表达。目前基于CEA为免疫原的肿瘤治疗已经展开相当数量的临床实验。2)黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)，该抗原只在机体发育的胚胎期及其出生后的睾丸和卵巢等生殖细胞上表达。MAGE-A3可在多种肿瘤中表达，且存在很多CD4+和CD8+T细胞表位。Sienel等对204例I/II期非小细胞肺癌的多中心研究,检测手术标本中MAGE-A3的阳性表达率为39.2％,更有意义的是,99名II期患者肿瘤中的表达阳性率为49.5％,显著高于105名I期患者的29.5％(P<0.004),认为在非小细胞肺癌中,MAGE-A3表达水平增高可能与疾病分期进展存在相关性。此外,MAGE-A3还广泛表达于其他实体肿瘤,有研究报道原发性肝癌为24％,头颈部鳞癌为44.4％,结肠癌为27.3﹪,肝内胆管癌为40.7﹪。由于MAGE-A3在肿瘤中的高水平表达,通过检测MAGE-A3的表达水平可以为肿瘤的诊断提供分子水平的证据。更有价值的是,把MAGE-A3作为肿瘤特异性抗原,利用抗原递呈细胞把MAGE-A3抗原递呈给免疫细胞识别,可以达到杀伤肿瘤细胞的目的。3)粘蛋白1(MUC1)为一种跨膜糖蛋白，在多种腺癌中异常过表达的肿瘤生物学标志物，具有高度表达、非MHC限制性活化CTL等免疫学特性，由外周骨架和外周糖链组成，其多肽骨架含有空间结构稳定一致的连续重复序列，构成许多相同的重复的表位，这些表位可被抗体识别，也可作为超抗原与T细胞受体多价结合而活化T细胞。目前有多种基于MUC1的免疫原作为疫苗和基于MUC1抗体的免疫导向载体用于肿瘤生物治疗的研究，如L-BLP25已进入临床试验阶段。
附图说明
图1为携带肿瘤抗原的慢病毒载体图。其中Lv-CEA载体携带肿瘤抗原CEA片段，Lv-MAGE-A3载体携带肿瘤抗原MAGE-A3片段，Lv-MUC1载体携带肿瘤抗原MUC1片段。
图2为携带不同肿瘤抗原基因片段慢病毒载体的酶切鉴定。其中，L为DNA标准，1、2、4分别为Lv-CEA、Lv-MAGE-A3、Lv-MUC1重组载体XhoI/SpeI双酶切；3为Lv-MAGE-A3重组载体BamHII/SpeI双酶切。其结果如表1所示。
图3为携带肿瘤抗原的慢病毒载体转导Hela细胞后所做蛋白印迹实验。其中，通过检测标签蛋白HA证实肿瘤抗原表达，内参蛋白为Beta-actin。在A图中，1-3分别为不同浓度Lv-CEA转导的Hela细胞(1:2.5,1:5，1:10)；4为空载体转导的Hela细胞对照；5-6分别为Lv-MAGE-A3转导的Hela细胞(1:100，1:500)。B图中，1-2分别为不同浓度Lv-MUC1转导的Hela细胞(1:5，1:10)；3为空载体转导的Hela细胞对照。
图4为单核细胞分化成为DC细胞过程中细胞表型的流式检测图。单核细胞在含有GM-CSF和IL-4的无血清的AIM-V培养基中培养5天分化成为未成熟DC细胞，然后通过添加细胞因子TNF-α与IFN-γ培养分化成为成熟的DC细胞。通过流式细胞仪分析单核来源的DC细胞，在0天、5天和7天检测CD14,CD83,HLA-DR，CD80和CD86的细胞表型。
图5为通过载体转导DC细胞，并激活、扩增特异性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤实验。A图中流式分析散点图显示，未经转导的DC与T细胞共培养后对HLA-A2阳性的MCF-7没有显著的细胞杀伤毒性(效应T细胞与靶细胞的比率为10:1)。B图中经载体转导的DC与T细胞共培养后MCF-7的细胞比率与HLA-A2-阴性的PLC/PRF/5对照相比明显减少，显示其特异性的肿瘤细胞杀伤毒性。C图中总结了不同效应T细胞与靶细胞比率的细胞杀伤实验。随着效应T细胞比率的增加，肿瘤细胞杀伤毒性也有相应增强。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
采用血细胞分离仪或直接抽取肿瘤患者静脉外周血，分离出外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC被进一步分离为淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞冻存或继续培养，备用。单核细胞经体外诱导分化为未成熟DC细胞后，通过转导携带肿瘤抗原的慢病毒载体表达、处理和递呈相关肿瘤抗原。并经细胞因子TNF-α、IFN-gama进一步诱导成为成熟的树突状细胞(DC)。通过把这些成熟的具有递呈肿瘤抗原特性的DC与同源的T淋巴细胞共培养，获得具有抗原特异性的、杀伤毒性的T淋巴细胞(Lv-DC-CTL)。最后通过回输Lv-DC-CTL达到治疗肿瘤的目的。整个Lv-DC-CTL制备的过程需要12-14天。
实施例1
以靶向癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)为例，通过体外合成、分子克隆方法获得CEA特异性的基因片段。癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；黑色素瘤相关抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；粘蛋白1抗原基因片段如SEQ ID NO:3所示。
实施例2
将所述CEA的基因片段导入慢病毒载体Lv，如图1所示得到携带CEA抗原基因的慢病毒载体Lv-CEA。采用相同的方法，构建具有MAGE-A3、MUC1抗原基因片段的的慢病毒载体。如图1所示，其中，Lv-CEA慢病毒载体为携带CEA抗原片段的表达载体；Lv-MAGE-A3慢病毒载体为携带MAGE-A3抗原片段的表达载体；Lv-MUC1慢病毒载体为携带MUC1抗原片段的表达载体。
将携带有不同嵌合抗原受体基因片段的慢病毒载体采用单/双酶切鉴定，其结果如图2和表1所示。
表1携带不同肿瘤抗原基因片段的慢病毒载体采用酶切鉴定结果
| 载体名称 | 酶切位点 | 酶切产物(kb) | |
| 1 | Lv-CEA | XhoI/SpeI | 1.98/6.36 |
| 2 | Lv-MAGE-A3 | XhoI/SpeI | 0.32/0.68/6.36 |
| 3 | Lv-MAGE-A3 | BamHI/SpeI | 1.00/6.36 |
| 4 | Lv-MUC1 | XhoI/SpeI | 0.35/6.36 |
实施例3
将上述构建的携带不同肿瘤抗原基因的慢病毒载体转导Hela细胞，48h后， 裂解细胞，采用Western blot方法检测各抗原标签蛋白的表达，结果如图3所示。结果表明，Hela细胞本身不表达CEA、MAGE-A3和MUC1，经重组载体转导后，可检测到符合预期大小的重组肿瘤抗原蛋白，说明经重组载体转导后肿瘤抗原蛋白可以在Hela细胞中正确表达。
实施例4
单核细胞来源的DC细胞(monocyte cell derive dendritic cell,MD-DC)的分离与培养，取50-150ml人的血液或者1个单位(约30-40ml)白细胞分离液(机采)，使用淋巴细胞分离液梯度离心，对白细胞进行富集。并通过37度贴壁2小时，进一步分离单核细胞与T淋巴细胞，并冻存T淋巴细胞。使用GM-CSF(50ng/ml)、IL-4(25ng/ml)在AIM-V培养基进行5天的单核细胞诱导和分化；在第5天，加入IFN-γ(50ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)使单核细胞来源的未成熟DC细胞进一步分化成为成熟的DC细胞，并用FACS检测与DC分化相关的细胞表型。结果表明，在单核细胞分化为DC细胞的过程中，单核细胞上高表达的CD14逐渐减少，而单核细胞上低表达的共刺激分子CD80、CD86逐渐增高，CD83则只在成熟DC细胞高表达，HLA-DR的高表达与DC分化无关，见图4。
实施例5
将转导重组慢病毒载体的DC细胞与自体T淋巴细胞共培养12-14天后与CEA、MAGA3或MUC1阳性的肿瘤细胞共培养，检测其杀伤活性。发现基于转导重组载体的DC激活、扩增的CTL对肿瘤细胞的特异性的细胞杀伤毒性与对照组非特异性的CTL相比显著增强，具体结果如图5所示。
综上所述，本发明采用携带三种肿瘤抗原基因片段的慢病毒载体转导DC细胞，从而激活、扩增具有广谱肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并通过回输由此获得的CTL达到更好的肿瘤治疗的目的。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>深圳市合一康生物科技有限公司
<120>抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法
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Claims (10)
1.一种抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，包括步骤：
A）携带肿瘤抗原基因重组载体的构建；
B）DC细胞的分离与培养；
C）使用步骤A）所述重组载体转导步骤B）所述的未成熟DC细胞；
D）进一步通过细胞因子诱导步骤C）所述的未成熟DC细胞成为成熟DC细胞；
E）将步骤D）所述的成熟DC细胞与T淋巴细胞共培养，获得具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
2.如权利要求1所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤A）所述的重组载体的载体为病毒载体。
3.如权利要求2所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤A）所述的重组载体的载体为慢病毒载体。
4.如权利要求1所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤A）所述的肿瘤抗原基因为新构建的癌胚抗原 (CEA) 基因片段，或黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)基因片段， 或粘蛋白1抗原(MUC1)基因片段；所述癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述黑色素瘤相关抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述粘蛋白1抗原基因片段如SEQ ID NO:3所示。
5.如权利要求4所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述携带肿瘤抗原基因重组载体为携带癌胚抗原 (CEA) 基因，或携带黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)基因，或携带粘蛋白1抗原(MUC1)基因的重组载体的一种，或者两种或者三种混合重组载体。
6.如权利要求1所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是，所述步骤C）使用重组载体转导未成熟DC细胞所用的重组载体为一种携带肿瘤抗原基因片段的重组载体，或者两种或两种以不同肿瘤抗原基因片段的重组载体的混合重组载体。
7.如权利要求6所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤C）使用重组载体转导未成熟DC细胞所用的重组载体为分别携带癌胚抗原基因片段，粘蛋白1抗原基因片段，黑色素瘤相关抗原A3基因片段的三种重组载体混合物。
8.如权利要求1所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤B）为从肿瘤患者的外周血中分离单个核细胞，将单个核细胞被进一步分离为淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞冻存或继续培养，备用；单核细胞经体外诱导分化为未成熟DC细胞。
9.如权利要求8所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述外周血中分离单个核细胞，经体外培养，经细胞因子GM-CSF或/和IL4诱导分化为未成熟DC细胞。
10.如权利要求1所述的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征是：所述步骤D）所述细胞因子为细胞因子TNF-α或/和IFN-gama。
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