CN101575607A - 一种基于人muc1重复序列与gm-csf融合表达的重组卡介苗疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于人MUC1重复序列与GM－CSF融合表达的重组卡介苗疫苗，首先构建人MUC1重复序列串联体通过连接DNA与GM－CSF基因连接的融合基因，进一步连接信号肽序列和Kozak序列，并构建成表达载体；将构建成的融合基因转染卡介苗疫苗，应用于以MUC1为靶点的抗肿瘤疫苗或者抗肿瘤药物的制备。本发明实现抗原、佐剂和疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效果，同时安全无毒副作用，能够诱导特异性的T细胞免疫应答和持久性分泌表达人MUC1重复序列与GM－CSF融合蛋白。

Description

一种基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及抗肿瘤疫苗的制备，特别涉及一种基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗，及其制备方法和用途。

背景技术

1、MUC1分子与MUC1肿瘤疫苗的相关研究

1.1MUC1的分子生物学

Mucinl黏蛋白(MUC1)，又称多形性上皮黏蛋白(polymorphic epithelialmucin，PEM)、DF3等。MUC1是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，正常情况下主要表达于多种组织、器官中的上皮细胞腺腔面，呈顶端表达，极性分布；在癌细胞表面MUC1异常表达，呈非极性分布。

MUC1基因位于1号染色体长臂21带处，由7个外显子组成4～7kb不等的长度。MUC1基因的一个重要特征是其多态性(polymorphism)，其第2个外显子中含有许多连续重复序列(variable number of tandem repeats，VNTRs)，重复序列的数目决定MUC1基因的长度，VNTRs区同时也是MUC1分子的抗原表位表达的转录区。

MUC1由肽核心蛋白和糖链组成，其骨架胞外段含有20～125个连续重复序列(variable numbers of tandem repeats，VNTR)，每个VNTR由20个氨基酸组成，其氨基酸序列为：GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH，是核心蛋白的主要成分，是MUC1最具免疫原性的结构。在分泌组织的正常细胞中，VNTR富含O-糖基化位点(丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，高度糖基化)，而在肿瘤细胞中糖基化较少。一般认为，糖基化是抗体结合肽骨架的障碍，减少或消灭糖基化被认为是对肿瘤MUC1产生有效免疫反应的必要条件。

MUC1第2个外显子的抗原肽链表位在正常表达时，MUC1核心蛋白被外周糖链所掩盖，不能被识别；而在癌变细胞由于糖基转移酶活性增高而导致糖基化不完全，使MUC1多肽骨架上的抗原决定簇暴露出来，成为CTL细胞识别的靶点，也成为肿瘤免疫治疗的靶点。所以，以MUC1为靶抗原的免疫治疗特异性杀伤表达MUC1肽表位的肿瘤细胞，而对正常组织无损伤，是肿瘤主动性免疫治疗的靶抗原；在不同的肿瘤中，MUC1表现出不同的基因表型和蛋白表型，尤其是对乳腺癌的免疫治疗，MUC1是理想的靶抗原。

1.2MUC1诱导抗肿瘤免疫的生物学功能

1989年，Finn首先从乳腺癌和卵巢癌患者体内分离到了能以HLA非限制性方式杀伤表达MUC1细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，他们还发现CTL识别的表位位于VNTR内。其可能的机制是MUC1通过VNTR使TCR发生交联，从而以MHC I类非限制性的方式直接活化CTL。

同时，MUC1也可以通过MHC限制性的方式诱导产生免疫应答。1995年，Apostolopoulos用人的MUC1免疫小鼠后诱导出了MHC I类限制性的抗MUC1的免疫应答，HLA限制性的CTL也从HLA-A2转基因小鼠中分离得到。同年，Domenech发现人的CTL细胞能识别由HLA-A 11呈递的MUC1多肽表位。1996年，Agrawal用MUC1的串连重复多肽刺激T辅助细胞，并诱导了T辅助细胞的增殖。此外，肿瘤细胞表面MUC1多肽表位暴露，还能刺激机体产生针对多肽表位的抗体。

1.3MUC1肿瘤疫苗研究现状

由于MUC1独特的分子生物学特点和生物学功能，以MUC1为靶点的肿瘤疫苗方面的研究近年来成为肿瘤生物治疗领域研究的热点之一。

1.3.1糖链疫苗

由于癌变时MUC1糖链结构发生变化，主要表现为糖基化不全，导致新的糖链表位产生，因此利用人工合成的相应糖链表位及适当的载体交联，加以佐剂，可诱发针对相应表位的免疫应答。试验表明，合成Tn表位与KLH交联，以Detox为佐剂免疫小鼠，可抑制肿瘤的生长并延长其寿命，目前该疫苗已进入I期临床试验阶段(Maelean G et al，J Immunotber，1996，19：309)。另一个合成的STn糖链疫苗也与KLH交联，以Detox为佐剂，免疫前静脉注入或口服小剂量环磷酰胺，可促进患者体内产生高效价的抗体，目前该疫苗已进入II期临床试验阶段(Miles DW et al，Br J Cancer.1996Oct；74(8)：1292-6.)。

1.3.2基因疫苗

基因疫苗即携带目的基因的表达载体可诱发特异性细胞及体液免疫应答，进而杀灭肿瘤细胞。Johnen等用携带MUC1基因的质粒在C57BL6小鼠内注射2次进行免疫，第15天后把表达人MUC1的MC38癌细胞株植入小鼠，发现85％的鼠肿瘤生长受到抑制，观察到明显的MUC1特异性体液免疫和细胞免疫应答，而对照组肿瘤生长明显。3个月后把MC38癌细胞株再次植入免疫过的小鼠，没有发现有肿瘤生长，显示了长期的抗肿瘤作用。(Johnen H，et al，Cancer Immunol Immunother.2001Sep；50(7)：356-60.)Kontani等报道，在小鼠模型中同一位置注射MUC1的DNA疫苗和树突细胞，可明显提高MUC1特异性的抗肿瘤免疫(Kontani K，et al，CancerGene Ther，2002，9(4)：330)。袁时芳等开展的针对MUC1的DNA疫苗研究也取得了进展，发现接种MUC1基因疫苗可诱导机体产生MUC1特异的CTL应答和抗体应答，一定程度上抑制了乳腺癌移植瘤的生长(袁时芳，等.细胞与分子免疫学杂志，2004，20(6)：737-740.)。

1.3.3多肽或蛋白疫苗

MUC1的多肽骨架中含有许多连续重复序列，可非MHC限制性或MHC限制性活化CTL，特异地杀伤肿瘤细胞。因此，可设计含有一定数量连续重复序列的肽作为疫苗，诱导针对肿瘤细胞的特异性细胞免疫应答。Fontenot的研究表明，合成MUC1的正确折叠与连续重复序列的数量有关，含有3个连续重复序列的肽较只含有1个或2个的肽更易正确折叠，而肽的正确折叠对于抗原表位的形成具有重要意义。(Kim SK，et al，Vaccine.2000Oct 15；19(4-5)：530-7)Kim等通过合成不同长度的MUC1串连重复序列，将30个氨基酸重复序列与KLH连接，免疫鼠诱导出高效价的MUC1抗体，明显抑制了肿瘤的生长，该疫苗在2000年已进人I期临床研究。Mechenzie等研制的Mannan-MUC1也进入了临床阶段，其抗肿瘤效果比MUC1-KLH更为明显。美国Biomira公司正在研制基于MUC1的多肽疫苗，已进入非小细胞肺癌的II期临床试验(Morse MA.Curr Opin Mol Ther，2001.3：102)。

1.3.4细胞疫苗

把肿瘤中的MUC1基因转入抗原提呈细胞(APC)，使APC表达黏蛋白分子，因为APC表面有丰富的共刺激分子如B7.1、B7.2，这样APC在直接和T细胞作用时就加入了活化T细胞所必需的共刺激分子。Jerome等从黑猩猩中得到EB病毒永生化的B淋巴细胞系，在体外增殖后用MUC1 cDNA转染，并用糖基化抑制剂(Phenyl-Gal-NAc)处理，给黑猩猩皮下注射。结果表明，在外周血和引流淋巴结中发现有MUC1特异性CTL，并观察到MUC1特异性DTH。他们用MUC1cDNA转染乳腺癌、胰腺癌病人自体或异体EB病毒永生化B细胞，并加入糖基化抑制剂进行处理，转染后的B细胞在体外刺激患者引流淋巴结或外周血中的淋巴细胞，发现了MUC1特异性CTL。Gong等将MUC1 RNA转染树突状细胞(DC)，这种DC既表达MUC1抗原，又是强大的抗原呈递细胞。用转染后的DC给小鼠尾部进行注射时发现，接种后的野生荷瘤鼠可产生对MUC1⁺肿瘤细胞的抗肿瘤免疫，CTL活性增强，保护野生荷瘤鼠不受MUC1⁺肿瘤细胞的侵袭，且可清除MUC1⁺肿瘤细胞。Kontani等研究了针对MUC1肿瘤抗原的DC疫苗免疫的临床效果：将装载MUC1抗原的DC接种到14个乳腺癌和肺癌晚期病人(9个MUC1阳性，5个MUC1阴性)后，所有MUC1阳性的病人均获得了抗原特异性免疫。结果表明获得免疫的病人肿瘤大小、肿瘤标记物水平都有显著的减小或降低。9例MUC1阳性病人中有6例恶性胸腔积液消失，且MUC1阳性病人与MUC1阴性病人相比生存期有显著延长。

虽然多种疫苗在动物实验中取得了较好的结果，但仍面临着疫苗免疫原性弱、难以诱导细胞免疫等缺点。糖链疫苗需要化学合成制备，工艺复杂，不利于工业化生产；基因疫苗虽然制备简便，节省了纯化蛋白的步骤，且在体内可以诱导体液和细胞免疫，但对于载体的安全性以及进入人体的有效途径还有待探讨；DC疫苗尽管可以诱导T细胞反应，但对于DC的来源及应用对象有一定的局限性。因此，在多种以MUC1为靶点的肿瘤疫苗中，就其稳定性、安全性、有效性和可行性而言，均有待提高。

2、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为肿瘤疫苗免疫佐剂的研究现状肿瘤疫苗通过激活患者自身免疫系统以清除或控制肿瘤，是治疗肿瘤的理想方法。然而肿瘤疫苗研制中存在的一个重要问题是大多数肿瘤抗原的免疫原性弱，不能有效地激活细胞毒性T淋细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，为了提高其免疫原性，常需加入佐剂。Dranof首次将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor，GM-CSF)作为黑色素瘤疫苗免疫佐剂，发现相对于其他细胞因子，GM-CSF可以更持久、更有效地增强肿瘤疫苗的免疫效果(Dranof G，Oncogene.2003.22(20)：3188-3192.)。

2.1GM-CSF的免疫作用

GM-CSF是一种主要由巨噬细胞和活化T细胞产生的细胞因子，其可通过促进树突状细胞(dendritic cell，DC)、巨噬细胞等抗原呈递细胞(antigen presentingcell，APC)分化、成熟和活化进而促进Th、Tc、NK细胞识别肿瘤相关抗原，引起系统性抗肿瘤反应，杀伤肿瘤；还可促进CD45RO⁺T细胞分化成熟及Langerhans细胞协同刺激因子及黏附分子B7/BB1的表达，提高其抗原呈递能力；另外还可增加巨噬细胞主要组织相容性复合物-II(MHC-II)的表达，提高其抗原呈递能力。

2.2GM-CSF作为肿瘤疫苗的免疫佐剂作用

应用GM-CSF能够有效地增强肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫反应。MoretTatay等将转染GM-CSF的B16恶性黑色素瘤细胞经150Gy照射灭活制备成GM-CSF高表达及低表达肿瘤细胞疫苗免疫荷瘤小鼠，观察小鼠生存时间，90d后发现，高表达1组80％小鼠未见肿瘤生长，高表达2组无一只小鼠见肿瘤生长，低表达1组及低表达2组则全部死亡。进一步的研究证实：GM-CSF作为肿瘤细胞疫苗免疫佐剂效果确切持久，并且呈剂量反应相关关系(Motet Tatay，et al，Cancer Gene Ther，2003，10(12)：887-897.)。Ellem首次将GM-CSF基因转染自体肿瘤细胞疫苗应用于临床，治疗1例恶性黑色素瘤伴全身广泛转移患者并取得了一定的效果。目前已有多项GM-CSF修饰自体肿瘤细胞疫苗(GVAX)进入临床I、II期试验。Atzpodien等在分析合成多肽疫苗联合GM-CSF治疗II A-IIIC期恶性黑色素瘤术后患者的研究中指出，GM-CSF可能通过增强DC的抗原呈递能力而增强了多肽疫苗的治疗有效性。Ross等构建表达前列腺特异性抗原(PSA)的DNA疫苗(pVax-PSA)，协同pcDNA3-GM-CSF通过肌肉注射导入C57BL/6小鼠体内，然后以EL4-PSA细胞攻击免疫小鼠，观察免疫小鼠肿瘤体积增长情况。结果显示，GM-CSF可以作为疫苗的有效佐剂提高其细胞免疫及抗肿瘤免疫反应(Roos AK，et al，Prostate，2005，62(3)：217-223.)。袁时芳等的研究也表明：GM-CSF有效的增强了MUC1基因疫苗诱导机体产生MUC1特异的CTL应答和抗体应答，增强了对乳腺癌生长的抑制作用(袁时芳，等.细胞与分子免疫学杂志，2004，20(6)：737-740.)。

随着分子生物学及免疫学的不断发展，研制肿瘤疫苗通过激活患者自身免疫系统以清除或控制肿瘤将是治疗恶性肿瘤最有前景的手段之一。GM-CSF以其显著的免疫调节作用和低毒性成为肿瘤疫苗重要的免疫佐剂。目前，已有多项将GM-CSF作为肿瘤疫苗免疫佐剂的研究进入临床I、II期试验。

3、BCG作为一种疫苗载体的研究现状

卡介苗(BCG)是一种活的预防性疫苗，是目前唯一用于结核病预防的疫苗，具有诸多优点，如BCG是用于实验动物和人的最强免疫佐剂。随着研究的深入，人们发现BCG不仅是一种活疫苗，而且也是外源基因的表达载体。重组BCG(rBCG)将BCG作为工程菌，利用基因工程技术将几种外源基因导入同一BCG中，依靠BCG在宿主内的复制，表达多种外源抗原，以诱导对多种疾病的特异性体液和细胞免疫，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。rBCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，是一种活载体疫苗，一次接种可获得强而持久的多种特异性免疫；作为重组细菌活载体的rBCG比重组腺病毒活载体更容易开发。目前，已能在BCG中表达多种外源基因，如：HIV-1nef基因、HIV-1gag基因、HIV-1gp120基因、破伤风毒素C片段等基因。对啮齿类动物的实验研究表明，适宜的rBCG能特异地活化细胞免疫系统，包括DTH、T细胞增生应答、Th1型细胞因子的产生，以及MHC-I类限制的CTL应答等。现有的rBCG疫苗多包含信号肽序列，可使rBCG载体大量分泌重组蛋白，诱导Th1优势的抗原特异性免疫应答，以增强其免疫原性。

目前，rBCG载体多用于抗结核病的研究。Horwitz等将编码结核分支杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)的Ag85B基因导入穿梭载体pSMT3，构建重组质粒pMTB30，电穿孔转化BCG，构建rBCG-Ag85B疫苗。将1×10³CFU疫苗皮下注射免疫豚鼠3次，末次免疫6周后，用1×10⁵CFU MTB Erdman株雾化吸入进行攻击，攻击后10周发现疫苗免疫和MTB攻击鼠的体重轻微降低，鼠肺和脾细菌数目显著减少，鼠肺和肝组织的结核病灶较小较少，肺部只有轻微的组织病理学变化，提示rBCG-Ag85B疫苗可诱导豚鼠产生抗MTB的保护性免疫反应。Ohara等将编码MTB的Ag85A、Ag85B和MPB51基因组成复合基因BAS1，导入穿梭表达载体pMSC1，构建重组质粒pMSC-BAS1，电穿孔转化BCG，构建rBCG-BA51疫苗，发现其分泌抗原水平较普通BCG提高5倍以上。袁时芳等将热休克蛋白65(Heat shock protein 65，Hsp65)and bIL-2融合基因导入穿梭载体pDE22，构建重组质粒，电穿孔转化BCG，构建rBCG-Hsp65-hIL-2疫苗。免疫结果显示：有良好的抗结核病能力，可诱导小鼠产生抗MTB的保护性免疫反应。(Shi C，Yuan S，et al，Scand J Immunol.2009Feb；69(2)：140-9.)

Chung等将BCG作为外源基因的表达载体用于抗肿瘤的研究，用全长MUC1和人白介素2(IL-2)重组的BCG疫苗免疫hu-PBL-SCID鼠，每2周接种一次，共3次，发现其可抑制乳腺癌的生长，但其诱发的免疫反应和保护力尚存在不足，可能与MUC1全长序列影响其免疫效果等因素有关。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种人MUC1重复序列与GM-CS F融合表达的表达载体，提高MUC1的免疫原性，克服上述的缺陷；

并将上述载体转染卡介苗，制备重组卡介苗疫苗，进一步实现抗原、佐剂和疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效果，同时安全无毒副作用，提供一种新的抗肿瘤疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种包含人MUC1重复序列的融合基因，人MUC1重复序列串联体通过连接DNA(DNA linker)与GM-CSF基因连接。

所述的人MUC1重复序列串联体为至少包含两个重复序列的串联体。

所述的人MUC1重复序列串联体为人MUC1重复序列4串联体或者人MUC1重复序列8串联体。

所述的人MUC1重复序列串联体还依次连接有信号肽序列和Kozak序列；连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列4串联体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列8串联体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

更进一步，本发明提供一种抗肿瘤疫苗：

所述的抗肿瘤疫苗为细胞疫苗，宿主细胞为卡介苗疫苗，转染卡介苗疫苗的载体片段包含人MUC1重复序列串联体和GM-CSF融合基因片段。

所述的抗肿瘤疫苗转染卡介苗疫苗的载体片段还包含信号肽序列和Kozak序列。

所述转染卡介苗疫苗的载体片段为pDE22-MUC1VNTRs-GM-CSF载体，在大肠-分枝杆菌穿梭载体上克隆包含信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列串联体和GM-CSF融合基因片段。

本发明更进一步证实了以下应用：

所述的抗肿瘤疫苗应用于以MUC1阳性表达的肿瘤细胞为靶点的治疗性抗肿瘤疫苗或者御防性抗肿瘤疫苗的制备。

所述的抗肿瘤疫苗应用于抗乳腺癌的治疗性疫苗或御防性疫苗的制备。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建了含Kozak序列和信号肽的人MUC1重复序列串联体基因，Kozak序列可以提高VNTR翻译的精确性和产率，信号肽序列可以保持对MVNTRs-CSF融合蛋白的分泌功能。所述的重复序列串联体为多串体，以提高MUC1的抗原性，为诱导特异性T细胞免疫应答提供分子基础。

2、本发明构建了包含人MUC1重复序列多串联体和GM-CSF，能够表达MUC1重复序列和GM-CSF的融合蛋白，以GM-CSF因子作为佐剂，以及通过GM-CSF因子的免疫调节作用提高MUC1蛋白的免疫原性。

3、本发明构建了包含人MUC1重复序列多串联体和GM-CSF融合基因的重组BCG疫苗，通过潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，筛选分泌表达MVNTRs和GM-CSF因子的融合蛋白，进一步实现抗原、佐剂和疫苗载体的有效结合，使得MUC1肿瘤疫苗的免疫原性达到更有效、更持久的效果；而BCG疫苗作为抗原、佐剂的疫苗载体安全无毒副作用，是一种针对MUC1为肿瘤靶点的抗肿瘤疫苗。

4、本发明构建的重组BCG疫苗，在对肿瘤的免疫治疗作用和对乳腺癌的免疫预防作用都起到了显著的效果，明显降低了植入肿瘤细胞的肿瘤生成率、明显抑制肿瘤的生长、明显提高了存活率；特别是对乳腺癌的免疫治疗和预防。

5、通过肿瘤组织切片免疫组化染色显示，在瘤体组织中观察到CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润，表明重组BCG疫苗诱导了CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞的特异性增殖，并且激活的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞识别了阳性表达MUC1的肿瘤组织、并产生细胞免疫应答，诱导了CTL的抗肿瘤效应，杀伤MUC1阳性表达的肿瘤细胞，比如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等。

6、通过脾脏切片免疫组化染色显示重组BCG菌株在体内分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的持久性，从而诱导了更持久、更有效的抗肿瘤效应。

附图说明

图1是人MUC1二串体重复序列的构建示意图；

图2是pDE22-MUC1VNTRs-GM-CSF载体PstI/ClaI双酶切鉴定结果图；

图3是pDE22-MVNTRs-GM-CSF载体的质粒图谱；

图4是包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的重组BCG菌株的SDS-PAGE蛋白电泳鉴定结果图；

图5是包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的重组BCG菌株的Western-blot鉴定结果图，其中，图5a是为抗MUC1抗体的Western-blot鉴定结果，图5b为抗GM-CSF抗体的Western-blot鉴定结果；

图6是重组BCG菌株与普通BCG的生长曲线比较，其中，横坐标为生长时间，纵坐标为光密度(OD)值；

图7是重组BCG疫苗对成瘤小鼠的肿瘤体积生长的抑制作用曲线图，其中，横坐标为肿瘤细胞接种后时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)；

图8是预防接种重组BCG疫苗对成瘤小鼠的肿瘤体积生长的抑制作用曲线图，其中，横坐标为肿瘤细胞接种后时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)；

图9是肿瘤组织切片免疫组化染色检测重组BCG疫苗诱导的特异性T细胞免疫应答结果的观察图；

图10是脾脏切片免疫组化染色检测重组BCG分泌的MUC1、GM-CSF及BCG蛋白在脾脏的表达结果的观察图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用基因重组技术，通过克隆人MUC1串联体连续重复序列，并将其与GM-CSF基因融合，得到新的表达载体MUC1VNTRs-GM-CSF，该载体表达融合蛋白MVNTRs-GM-CSF，以提高MUC1的免疫原性；本发明所述的人MUC1串联体连续重复序列为多串联体连续重复序列，具体以1串体、4串体和8串联为例进行说明，分别表示为MUC1VNTR1-GM-CSF、MUC1VNTR4-GM-CSF、MUC1VNTR8-GM-CSF，为了便于描述以上3种串体描述为MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF；

将上述融合基因转染BCG，筛选表达外源基因MUC1VNTRs-GM-CSF得到表达的重组BCG菌株；该重组BCG疫苗一方面可达到增强MUC1的免疫原性的目的，另一方面可通过分泌型rBCG活载体疫苗的分泌蛋白特性，在体内不断分泌重组的MVNTRs-GM-CSF融合蛋白，实现抗原、佐剂和疫苗载体的最佳结合，从而解决以往的MUC1疫苗的免疫应答弱、保护期短等问题。

本发明筛选出优化的重组rBCG-MUC1VNTRs-GM-CSF疫苗，进一步提高其抗肿瘤活性和安全性，为临床应用奠定基础；持久表达并分泌人MUC1重复序列与巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的重组BCG疫苗的构建，其对乳腺癌生长的防治起到积极的作用。

下面对其具体的构建过程进行说明，其中，所用到的质粒及试剂如下：

菌株与质粒：分支杆菌表达载体pDE22、BCG疫苗株、pBV-GM-CSF质粒、人乳腺癌MCF-7细胞及大肠杆菌DH5α菌株，上述菌株与质粒各大实验室均有保藏，或者可以通过商业购买获得。

主要实验材料：

限制性内切酶、DL-2000、T₄DNA连接酶、pUC18载体购自Takara公司；

高纯质粒小量制备试剂盒(离心柱型)、快捷型琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒(离心柱型)均购自北京百泰克生物技术有限公司；

抗人MUC1单克隆抗体为Sigma，St.Louis，MO公司产品；

抗人GM-CSF单克隆抗体为R&D公司产品，USA；

抗人CD4⁺T淋巴细胞抗体，抗人CD8⁺T淋巴细胞抗体及抗人BCG抗体(DAKO Corp.)，荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司；

7H9液体、7H10固体培养基以及ADC购于Difco公司；

丙烯酰胺，N N′-甲叉双丙烯酰胺，SDS及Agrose等购自Bio-Rad公司；

小牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基购自Gibco公司；RPMI 1640培养液为Gibco，USA公司产品。

实验动物SCID鼠，4-6周龄，购于中科院上海实验动物中心。

1、MUC1重复序列串联体基因的克隆

按人MUC1基因重复序列设计、合成编码人MUC1基因的一个重复序列和Kozak序列、信号肽及相应酶切位点的基因片段，并通过HindIII和EcoRI位点克隆入pUC18载体并鉴定(由北京奥科生物技术有限责任公司合成并鉴定)。

所述的编码MUC1的一个重复序列的寡核苷酸片段的设计如SEQ.ID.NO.1所示：

ctgcagacca tgttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt tggatccggc  60

tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga 120

tcttgaatcg at                                                     132

其中，5′端1-6bp为PstI酶切位点，52-57bp为BamHI酶切位点，118-123bp为BglII酶切位点，3′端127-132bp为ClaI酶切位点，上述多克隆位点均为连接DNA(DNA linker)。

所述的Kozak序列为：acc(7-9bp)；

所述的信号肽序列为：ttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt t(1341bp)；

MUC1基因的一个重复序列为：ggc tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacctcggccccgg acaccaggcc ggccccg(58-117bp)；其两端分别的多克隆位点为BamHI酶切位点和BglII酶切位点，而两者的序列互补，彼此的黏性末端可以互补连接。

Kozak序列可以提高VNTR翻译的精确性和产率；信号肽序列可以引导VNTR在翻译的同时直接进入内质网，加强抗原的MHC I类递呈，并可以保持对MUC1VNTR-GM-CSF融合蛋白的分泌功能。

对含一个重复序列的质粒载体进行扩增提取，一份用ScaI和BglII双切，回收包含信号肽序列和Kozak序列的MUC1单体小片段；另一份用ScaI和BamHI双切，信号肽序列和Kozak序列和一部分载体片段被切除，回收包含pUC18载体序列和MUC1单体的大片段；回收的大、小片段通过T₄DNA连接酶连接，得到包含MUC1VNTR二串体的pUC-MUC1VNTR2质粒载体；其中，所涉的3个酶切位点，ScaI为pUC质粒的酶切位点，BamHI和BglII酶切位点位于MUC1VNTR单体之间，两者的序列互补，彼此的黏性末端可以互补连接，即两个MUC1VNTR单体通过aga tcc的DNA linker连接(互补的BamHI和BglII酶切位点)连接，其构建示意图如图1所示；

按照同样的方法，将包含二个重复序列的(二串体)pUC-MVNTR2质粒载体进行扩增提取，一份用ScaI和BglII双切，另一份用ScaI和BamHI双切，分别回收大、小片段，通过T₄DNA连接酶连接，得到包含MUC1VNTR 4串体的pUC-M UC1VNTR4质粒载体，在其5′端连接有信号肽序列和Kozak序列，相邻的MUC1重复序列均通过aga tcc的DNA linker连接；

按照同样的方法，再将包含四串体的pUC-MVNTR4质粒载体进行扩增提取，酶切提取片段后连接，得到包含MUC1VNTR 8串体的pUC-M UC1VNTR8质粒载体。

并将上述包含多个重复序列的多串体载体进行PstI和ClaI双酶切及序列分析证实上述质粒载体均构建成功。经过序列分析证实的包含信号肽序列和Kozak序列的MUC1VNTR 4串体、8串体的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

2、GM-CSF基因的克隆

设计含连接DNA(DNA linker)的扩增人的GM-CSF基因的引物P1和P2：

P1：attagatctg gatccggtgg ttcagcacct gcccgttctc cgag    44；

P2：tcatcgattc actcctggac tggctcccag                    30；

其中，5′端4-9bp为P1引物BglII酶切位点，5′端3-8bp为P2引物ClaI酶切位点。

PCR扩增：以P1、P2引物，以pBV-GM-CSF为模板，常规PCR，回收产物克隆入pMD18-T中，转化，挑取克隆进行酶切鉴定及序列分析，所得扩增人的GM-CSF序列如GenBank中人的GM-CSF基因的序列一致。

3、融合基因M UC1VNTRs-GM-CSF的构建

取测序正确的重组pMD18T-GM-CSF载体经BglII/ClaI双酶切，回收400bp大小的GM-CSF基因片段；

回收同样经BglII/ClaI双酶切的pUC-MUC1VNTR1、pUC-MUC1VNTR4、pUC-MUC1VNTR8质粒载体所得的包含MUC1VNTRs的载体片段，T₄DNA连接酶连接，构建MUC1VNTRs-GM-CSF融合基因，所得载体分别为pUC-MUC1VNTR1-GM-CSF、pUC-MUC1VNTR4-GM-CSF、pUC-MUC1VNTR8-GM-CSF，并经酶切鉴定及序列测定证实。

4、pDE22-MUC1VNTRs-GM-CSF的构建

取大肠-分枝杆菌穿梭载体pDE22用PstI/ClaI双酶切，琼脂糖电泳后回收载体片段；

对pUC-MUC1VNTR1-GM-CSF、pUC-MUC1VNTR4-GM-CSF、pUC-MUC1VNTR8-GM-CSF(pUC-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF)质粒载体分别同样PstI/ClaI双酶切，分别回收目的片段MUC1VNTR1-GM-CSF、MUC1VNTR4-GM-CSF、MUC1VNTR8-GM-CSF；

将上述两种片段分别在T4DNA连接酶的作用下构建重组表达载体pDE22-MUC1VNTR1-GM-CSF、pDE22-MUC1VNTR4-GM-CSF和pDE22-MUC1VNTR8-GM-CSF，并对重组表达载体进行酶切鉴定及序列分析证实。其酶切鉴定结果如图2所示，其中，泳道M为Mark，泳道1为pDE22-MUC1VNTR1-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的535bp的条带为MUC1VNTR1-GM-CSF条带；泳道2为pDE22-MUC1VNTR4-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的733bp的条带为MUC1VNTR4-GM-CSF条带；泳道3为pDE22-MUC1VNTR8-GM-CSF的酶切鉴定，其所示的997bp的条带为MUC1VNTR8-GM-CSF条带。

所得到的pDE22-MUC1VNTRs-GM-CSF的载体为，包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的大肠-分枝杆菌穿梭载体，其质粒构建图谱如图3所示；含潮霉素抗性基因的穿梭载体pDE22可以介导外源基因MUC1VNTRs-GM-CSF在分枝杆菌中分泌表达。

5、重组BCG菌株rBCG-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF的构建

将BCG在7H9培养基中大量培养4周后，按1％的比例转接；培养至3周时，加入2M的甘氨酸，继续培养2d后冰浴30min。

用冰浴的10％甘油制备5×10⁶个BCG感受态细胞，然后将纯化的pDE22-MUC1VNTR1-GM-CSF、pDE22-MUC1VNTR4-GM-CSF、pDE22-MUC1VNTR8-GM-CSF用电穿孔法转化感受态BCG；37℃培养24h后涂布于含ADC(葡萄糖-牛血清白蛋白因子v-过氧化氢酶)和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒作为对照，37℃培养28～30d。利用潮霉素抗性筛选外源基因MUC1VNTRs-GM-CSF得到表达的重组BCG菌株，得到rBCG-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF的克隆菌落。

所述的电穿孔法其具体参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Ω。

6、重组BCG菌株rBCG-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF的表达、鉴定

从重组载体转染BCG成功的7H10平板中挑出克隆，接种于5ml 7H9培养基中培养21d后，上述培养的重组BCG菌株，提取质粒，用PCR法进一步鉴定转染阳性的克隆，引物对为上述设计的引物对44bp的P1和30bp的P2。

挑取鉴定结果正确的阳性克隆加入潮霉素，在7H9培养基中培养，37℃震荡培养30d，10000rpm离心3min，收集菌体沉淀，PBS缓冲液洗涤2次得到重组BCG菌体。

进行如下的SDS-PAGE电泳和Western-blot验证：

由于重组BCG表达MVNTRs-GM-CSF融合蛋白是分泌型的，取部分重组BCG菌株的培养上清进行经12％SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜。以含5％脱脂奶粉的TBST(Tris-Tween盐缓冲液)4℃封闭过夜，TBST洗膜，分别加入抗人MUC1单抗(1∶500稀释)和抗人GM-CSF单抗(1∶500稀释)作用1h，TBST洗膜；HRP标记的山羊抗小鼠抗体(二抗)(1∶500稀释)(Sigma)室温孵育1h，TBST洗膜后，加入ECL化学发光试剂(Amersham公司)，曝光，冲片。

SDS-PAGE电泳和Western-blot结果证实重组BCG菌株有MVNTRs-GM-CSF融合蛋白的表达，其结果分别如图4、图5所示：

如图4所示的SDS-PAGE电泳结果图，其中，泳道M为蛋白Mark；泳道1为rBCG-pDE22；泳道2为rBCG-MUC1VNTR1-GM-CSF，其所示的19kDa的条带为MVNTR1-GM-CSF融合蛋白；3为rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF，其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF融合蛋白；泳道4为rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF，其所示的35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合蛋白。SDS-PAGE电泳结果说明：MUC1重组BCG菌株rBCG-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF各自有MVNTRs-GM-CSF融合蛋白的表达。

如图5所示的Western-blot鉴定结果，其中，图5a为抗MUC1抗体的Western-blot鉴定结果，所示的泳道1所示的19kDa的条带为MVNTR1-CSF融合蛋白；泳道2其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF融合蛋白；3其所示的35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合蛋白。

图5b为抗GM-CSF抗体的Western-blot鉴定结果，泳道1所示的19kDa的条带为MVNTR1-CSF融合蛋白；泳道2其所示的26kDa的条带为MVNTR4-CSF融合蛋白；3其所示的35kDa的条带为MVNTR8-CSF融合蛋白。

Western-blot结果说明：人MUC1重复序列与GM-CSF融合基因的重组BCG疫苗rBCG-MUC1VNTR1/4/8-GM-CSF各自有MVNTRs与GM-CSF融合蛋白的表达。

7、重组BCG菌株rBCG-M UC1VNTRs-GM-CSF的生物学特性鉴定

将分泌表达MVNTRs与GM-CSF融合蛋白的rBCG-M UC1VNTR1-GM-CSF、rBCG-M UC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-M UC1VNTR8-GM-CSF的rBCG和普通BCG接种在含10％ADC的7H9培养液中，37℃振荡培养，测定不同时间点的OD₆₀₀值，绘制生长曲线，观察比较rBCG的增殖特性与普通BCG的差别。其生长曲线的比较结果如图6所示，重组BCG菌株rBCG-M UC1VNTRs-CSF与普通BCG的增殖特性无明显差别；说明上述重组BCG菌株rBCG-M UC1VNTRs-CSF与普通BCG的增殖特性无明显差别。

下面对本发明所提供的包含人MUC1重复序列与GM-CSF融合基因的重组BCG疫苗的作用进行说明，尤其是对乳腺癌生长的免疫治疗及防治作用

a、乳腺癌细胞MCF-7的准备

人乳腺癌细胞MCF-7均在含有10％小牛血清(Gibco公司)和100U/ml的青霉素、链霉素的RPMI1640培养基(Gibco)中培养；取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化、计数，在倒置显微镜下观察，发现纤维状细胞边缘，部分脱壁，立即加入5ml含有血清的培养液终止消化，吹打离心收集细胞，用无血清的培养液洗涤2次，将单细胞悬液用不含小牛血清的培养基稀释至计数，使细胞的浓度为2×10⁷/ml备用。

b、hu-PBL-SCID鼠免疫重建

1.人外周血淋巴细胞(PBL)分离：富含人PBL的白膜层来源于第四军医大学西京医院血库中心。将富含人PBL的白膜层液加在等量的Ficoll-Paque淋巴细胞分离液上，室温2500rpm水平离心20min，分离人淋巴细胞(PBL，HLA-A2)。此时离心管中形成3层：上层是血浆，中间层为PBL，下层为红细胞。小心吸取中间PBL，加入两倍体积Hank’s液悬浮PBL，混匀后2000rpm×10min洗涤两次，收集沉淀，以10％RPMI 1640完全培养液重新悬浮，调整细胞浓度为5×10⁷/ml。

2.hu-PBL-SCID鼠免疫重建：雌性SCID小鼠，4-6周龄，上述人PBL通过腹腔注射途径接种，5×10⁷/只，建立hu-PBL-SCID鼠模型。

c、MUC1重组BCG菌株的免疫治疗

SCID鼠免疫重建后(hu-PBL-SCID)，进行分组，设为5个组，每组8只鼠。每只鼠均按0.2ml/只的剂量(4×10⁶/只)胸部皮下接种MCF-7细胞。接种肿瘤细胞7天后，分别采用腹腔注射方式免疫接种rBCG-pDE22，rBCG-MUC1VNTR1-GM-CSF、rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8GM-CSF疫苗，剂量为10⁶CFU/0.1ml/只，同时设PBS对照组0.1ml/只；3周免疫1次，共3次，每周观察小鼠的成瘤率及肿瘤体积的变化，共观察9周；用1/50mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按下式计算肿瘤体积：

肿瘤体积(mm³)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径(mm)²×0.52

在9周内观察上述5组小鼠的成瘤率，rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF免疫治疗组在MCF-7乳腺癌细胞接种后35天，肿瘤成瘤率分别为37.5％和25％，而BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿瘤成瘤率均为100％(8/8)，统计学差异显著P＜0.05；在MCF-7乳腺癌细胞接种后56-70天，肿瘤成瘤率分别为62.5％和37.5％，而BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿瘤成瘤率均为100％(8/8)，统计学差异显著P＜0.05；结果表明rBCG-MVNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF免疫治疗组显著降低了成瘤率；

从第4周起开始有肿瘤生成，对成瘤小鼠观察重组BCG疫苗对肿瘤生长的抑制作用，其结果如图7所示，可以看出rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF组和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组显著抑制了MUC1阳性表达的人乳腺癌细胞生长：从接种肿瘤第5周起(免疫后第4周)与其他3组相比，肿瘤体积的增长显著降低，rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF免疫接种显著抑制MCF-7乳腺癌细胞生长，统计学差异显示P＜0.01，且对肿瘤体积的生长抑制作用随着VNTR的增加而增强；例如，在接种肿瘤细胞后35天，PBS对照组和rBCG-pDE22对照组的肿瘤体积分别为485.2±63.5和463.1±60.8mm³，而rBCG-MUC1VNTR1-GM-CSF，rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组的肿瘤体积分别为401.5±41.6，212.6±38.0和165.5±40.3mm³(P＜0.01，rBCG-MVNTR4/8-CSFvs.对照组)；肿瘤细胞接种后70天，PBS对照组和rBCG-pDE22组肿瘤体积为1556.3±134.5和1523.4±154.3mm³，而rBCG-MUC1VNTR1-GM CSF，rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组肿瘤体积为1235.8±85.7，723.6±89.0和565.7±68.1mm³(P＜0.01，rBCG-MUC1VNTR4/8-GM-CSF vs.对照组)。

肿瘤细胞接种70天后，接种rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF组和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组小鼠的生存率分别为62.5％和75％，而BCG-pDE22对照组的生存率为12.5％，统计学差异显示P＜0.05(rBCG-MVNTR8-CSF vs.对照组)，说明重组BCG疫苗显著延长了乳腺癌细胞生长小鼠的生存率。

d、MUC1重组BCG菌株的免疫预防

对免疫重建的hu-PBL-SCID鼠进行分组免疫，实验组设为5个组，每组8只，分别采用腹腔注射方式接种rBCG-pDE22，rBCG-MUC1VNTR1-GM-CSF、rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF，剂量为106CFU/0.1ml/只，同时设PBS对照组0.1ml/只；3周免疫1次，共3次，第3次免疫后2周，各只小鼠均按0.2ml/只的剂量(4×10⁶/只)胸部皮下接种MCF-7细胞。每周观察鼠的成瘤率，并对成瘤小鼠用1/50mm精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按上述肿瘤体积计算公式计算肿瘤体积。

rBCG-MVNTR4-CSF和rBCG-MVNTR8-CSF免疫预防组在MCF-7乳腺癌细胞接种70天后，肿瘤成瘤率分别为50％和37.5％，而BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿瘤成瘤率均为100％(8/8)，统计学差异显著P＜0.05；

肿瘤的生长曲线如图8所示，接种肿瘤第5周起不同免疫组的小鼠的肿瘤生长出现明显差别，rBCG-MUC1VNTR4-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-CSF预防接种显著抑制MCF-7乳腺癌细胞生长，统计学差异P＜0.01；且生长抑制作用也随着VNTR的增加而增强。例如，在接种肿瘤细胞35天后，BCG-pDE22对照组和PBS对照组的肿瘤体积为308.3±94.5 and 289.4±84.9mm³，而rBCG-MVNTR1-CSF，rBCG-MVNTR4-CSF和rBCG-MVNTR8-CSF组的肿瘤体积为251.8±52.7，121.3±49.0和75.4±50.8mm³；

肿瘤细胞接种70天后，rBCG-MVNTR4-CSF和r BCG-MVNTR8-CSF组小鼠的生存率分别为75％和87.5％，而BCG-pDE22对照组的生存率为12.5％，统计学差异P＜0.05。

e、瘤体组织学分析

1)瘤体组织抗人CD4+T淋巴细胞抗体和抗人CD8+T淋巴细胞抗体免疫组化染色，检测重组BCG疫苗诱导的特异性T细胞免疫应答。

免疫组化染色的方法步骤：取上述免疫预防组的接种MCF-7乳腺癌细胞70天后生存的小鼠，采血后处死，立即取瘤体及脾脏。

所有标本均经10％甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片；

切片常规脱蜡，水化后，用内源性过氧化物酶阻断剂和正常马血清分别室温孵育30分钟以减低非特异性染色；

MUC1单克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜；

CD4+、CD8+淋巴细胞抗体(1∶100)4℃孵育过夜；

生物素标记的羊抗鼠IgG二抗和抗生物素-过氧化物酶连接物室温分别孵育30分钟；

DAB显色1～3分钟；

苏木素衬染，脱水、透明、封片、光镜观察；观察瘤体组织间隙中CD4+和CD8+T淋巴细胞染色结果，阳性染色说明为产生T细胞免疫应答；实验中以空白试验和替代试验作为阴性对照，以确保实验的特异和可靠性；

肿瘤组织切片免疫组化染色显示结果如图9所示，接种重组BCG疫苗rBCG-MUC1VNTR4-GM-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF的免疫组瘤体组织间隙中观察到CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞，如图9A、B所示；而PBS和rBCG-pDE22对照组肿瘤组织观察不到CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞分布，如图9C、D所示。

以上对比实验说明rBCG-MUC1VNTR4/8-GM-CSF均诱导的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞识别了阳性表达MUC1的肿瘤组织、并产生细胞免疫应答，杀伤MUC1阳性表达的肿瘤细胞。

2)采用MUC1单克隆抗体、GM-CSF单克隆抗体及分枝杆菌抗体作为一抗，采用上述的免疫组化染色方法，检测GM-CSF及BCG蛋白在脾脏的表达：

脾脏切片免疫组化染色显示结果如图10所示，其中，图A为BCG-pDE22组BCG蛋白阳性表达，图B为rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组BCG蛋白阳性表达，图C为rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组MUC1蛋白阳性表达，图D为rBCG-MUC1VNTR8-GM-CSF组GM-CSF蛋白阳性表达，E和F为阴性对照组。

上述结果表明，重组BCG菌株在体内分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白的持久性。rBCG-MUC1VNTR4-CSF和rBCG-MUC1VNTR8-CSF免疫组在MCF-7乳腺癌细胞接种70天后，脾组织切片免疫组化染色显示，rBCG-MUC1VNTR4/8-CSF组和rBCG-pDE22组的脾组织均可见BCG蛋白阳性表达。重组BCG疫苗rBCG-MUC1VNTR4/8-CSF组免疫的脾组织可见MUC1和GM-CSF蛋白阳性表达，而rBCG-pDE22对照组脾组织观察不到MUC1和GM-CSF表达，说明重组BCG菌株rBCG-MUC1VNTR4/8-CSF在体内持久分泌表达人MUC1重复序列与GM-CSF融合蛋白至少保持70天，从而诱导了更持久、更有效的抗肿瘤效应。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗

<160>3

<210>1

<211>132

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ctgcagacca tgttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt tggatccggc   60

tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga  120

tcttgaatcg at                                                      132

<210>2

<211>330

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ctgcagacca tgttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt tggatccggc  60

tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga  120

tccggctcca ccgccccccc agcccacggt gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc  180

ccgagatccg gctccaccgc ccccccagcc cacggtgtca cctcggcccc ggacaccagg  240

ccggccccga gatccggctc caccgccccc ccagcccacg gtgtcacctc ggccccggac  300

accaggccgg ccccgagatc ttgaatcgat                                   330

<210>3

<211>594

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ctgcagacca tgttcttcct gctgctgctc ctcacagtgc ttacagttgt tggatccggc   60

tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga  120

tccggctcca ccgccccccc agcccacggt gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc  180

ccgagatccg gctccaccgc ccccccagcc cacggtgtca cctcggcccc ggacaccagg  240

ccggccccga gatccggctc caccgccccc ccagcccacg gtgtcacctc ggccccggac  300

accaggccgg ccccgagatc cggctccacc gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc  360

ccggacacca ggccggcccc gagatccggc tccaccgccc ccccagccca cggtgtcacc  420

tcggccccgg acaccaggcc ggccccgaga tccggctcca ccgccccccc agcccacggt  480

gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc ccgagatccg gctccaccgc ccccccagcc  540

cacggtgtca cctcggcccc ggacaccagg ccggccccga gatcttgaat cgat        594

Claims (10)

1、一种包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，人MUC1重复序列串联体通过连接DNA与GM-CSF基因连接。

2、如权利要求1所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，所述的人MUC1重复序列串联体为至少包含两个重复序列的串联体。

3、如权利要求2所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，所述的人MUC1重复序列串联体为人MUC1重复序列4串联体或者人MUC1重复序列8串联体。

4、如权利要求1或2或3所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，人MUC1重复序列串联体还依次连接有信号肽序列和Kozak序列。

5、如权利要求3所述的包含人MUC1重复序列的融合基因，其特征在于，连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列4串联体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

连接有信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列8串联体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

6、一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述的抗肿瘤疫苗为细胞疫苗，宿主细胞为卡介苗疫苗，转染卡介苗疫苗的载体片段包含人MUC1重复序列串联体和GM-CSF融合基因片段。

7、如权利要求6所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，转染卡介苗疫苗的载体片段还包含信号肽序列和Kozak序列。

8、如权利要求6所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，转染卡介苗疫苗的载体片段为pDE22-MUC1VNTRs-GM-CSF载体，在大肠-分枝杆菌穿梭载体上克隆包含信号肽序列和Kozak序列的人MUC1重复序列串联体和GM-CSF融合基因片段。

9、如权利要求6或7所述的抗肿瘤疫苗应用于以MUC1阳性表达的肿瘤细胞为靶点的治疗性抗肿瘤疫苗或者预防性抗肿瘤疫苗的制备。

10、如权利要求6或7所述的抗肿瘤疫苗应用于抗乳腺癌的治疗性疫苗或预防性疫苗的制备。

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