CN105176957A

CN105176957A - 肾癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

Info

Publication number: CN105176957A
Application number: CN201510647614.3A
Authority: CN
Inventors: 黄锡坚; 张小俊; 章文乐
Original assignee: SHENZHEN CURE & SURE BIOTECH Ltd
Current assignee: SHENZHEN CURE & SURE BIOTECH Ltd
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明提供了一类与热休克蛋白结合的肾癌抗原，包括CA9抗原肽、5T4抗原肽和G250抗原肽。本发明同时还提供了抗原与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这种复合物可用于制备肾癌预防和治疗的疫苗。

Description

肾癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及肾癌抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物以及它们的用途。

背景技术

肾细胞癌（RenalCellCarcinoma，RCC）简称肾癌，是最常见的肾脏恶性肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的80～90%，占全部成人恶性肿瘤的2%～3%，每年全世界因肾癌死亡的病例超过100,000例，而且其发病率仍以每年2%的速度递增。肾癌具有高转移性、强免疫性的特点，目前缺乏有效的治疗方案，根治性手术仍是肾癌首选的治疗方法，但是总体预后差，多数患者治疗后肿瘤仍会复发和转移，这也是其导致死亡的主要因素。由于肾癌对放疗与化疗均不敏感，一般化疗的效果<10%，因此，生物治疗日显重要。

热休克蛋白（HeatShockProteins，HSPs）是一类广泛存在于原核及真核生物中，并且在进化上高度保守的蛋白质，gp96属于热休克蛋白HSP90家族，是胞质HSP90的旁系同源蛋白，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达，主要定位于内质网腔（EndoplasmicReticulum）。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，但热体休克、氧化应激、细菌和病毒感染等均可诱导其表达量上调。gp96作为分子伴侣，与其他蛋白质结合，参与蛋白质水解，细胞抗损伤、修复以及热耐受等过程，对细胞的生长、发育、分化以及死亡具有一定的调节作用。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。

经过多年的基础理论研究和临床试验表明，HSP分子本身不具有抗原性，抗原性由其结合的短肽决定。在肿瘤细胞内，HSP作为载体以非共价键方式与具有肿瘤特异性的抗原肽结合，产生HSP-多肽复合物(HSP-PCs)。HSP-PCs能通过与抗原提呈细胞(antigen-presentingcells，APC)表面受体如CD91等相结合，经过抗原加工呈递途径，激活抗原肽特异性的抗肿瘤T细胞免疫反应，识别和杀伤自身肿瘤，从而有效地抑制肿瘤生长和转移。而且HSP-PCs能活化多个CD8+的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而克服肿瘤异质性及“肿瘤免疫逃逸”。由于HSP蛋白在人个体之间没有差异，因此应用HSP免疫治疗能有效地避开主要组织相容性复合物I(majorhistocompatibilitycomplexI，MHC-I)类分子限制的问题。同时，HSP分子可作用于抗原呈递细胞，特别是树突状细胞（DC）及其它免疫细胞（T细胞等）表面Toll样受体，促进DC成熟，并刺激产生免疫因子（IL-12，TNFX，IL-6等），从而增强机体非特异性免疫反应。因此这种gp96-抗原多肽复合物和HSP78-抗原多肽复合物可用于防治自体肿瘤和某些传染病。

目前已证实gp96和HSP78分子能结合多种抗原多肽，包括泡状口炎病毒抗原区肽、鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病CTL表位肽、乙肝病毒抗原肽等抗原多肽。但目前为止未见从肾癌患者肿瘤组织中分离鉴定与HSP结合的抗原多肽。

RCC作为肾脏中最常见恶性肿瘤。自体gp96免疫治疗可以将中等风险肿瘤患者的生存期提高46%，复发时间延长1.8年。然而RCC从总体上仍然不能治愈。其主要原因是这种治疗方法对肿瘤组织大小的要求和疫苗制备的一次性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是筛选肾细胞癌特异性的肽段。克服肿瘤细胞免疫导致的低免疫原性，能够在健康个体及肾细胞癌患者诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(又称杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗肾细胞癌作用，对正常细胞及组织无破坏作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原CarbonicAnhydraseIX。所述的表位肽是从CarbonicAnhydraseIX的第420位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为FLLFAVTSV，如序列表中SEQIDNO.1所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明中，所述的表位肽可与热休克蛋白gp96或HSP78形成复合物。

本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合。本发明提供了制备本发明的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物的方法。

本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性的CTL。

本发明所述形成的特异性CTL可以在转输实验中显著的抑制HLA-A2阳性的肾细胞癌细胞A-498的生长。

本发明所诉的表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性肾细胞癌患者PBMC分泌IFN-γ，且这种作用在自体gp96复合物免疫后显著增强。

本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性肾细胞癌患者特异性T细胞反应。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是:一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原CarbonicAnhydraseIX。所述的表位肽是从CarbonicAnhydraseIX的第417位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为ALVFLLFAV，如序列表中SEQIDNO.2所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是:一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原CarbonicAnhydraseIX。所述的表位肽是从CarbonicAnhydraseIX的第185位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为FQLPPLPEL，如序列表中SEQIDNO.3所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是:一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原CarbonicAnhydraseIX。所述的表位肽是从CarbonicAnhydraseIX的第325位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为FQYEGSLTT，如序列表中SEQIDNO.4所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是:一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原5T4。所述的表位肽是从5T4的第373位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为VLYLNRKGI，如序列表中SEQIDNO.5所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之六是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原5T4。所述的表位肽是从5T4的第290位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为FLDNNPWVC，如序列表中SEQIDNO.6所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之七是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原5T4。所述的表位肽是从5T4的第33位氨基酸开始，肽段由10个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为VLLELNSADL，如序列表中SEQIDNO.7所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之八是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原5T4。所述的表位肽是从5T4的第224位氨基酸开始，肽段由10个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为YLPRDVLAQL，如序列表中SEQIDNO.8所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之九是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原5T4。所述的表位肽是从5T4的第362位氨基酸开始，肽段由10个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为VLALIGAIFL，如序列表中SEQIDNO.9所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原G250。所述的表位肽是从G250的第418位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为LVFGLLFAV，如序列表中SEQIDNO.10所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十一是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原G250。所述的表位肽是从G250的第185位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为FQLPPLPEL，如序列表中SEQIDNO.11所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十二是：一种肾细胞癌表位肽，其特征在于表位肽来源于肿瘤抗原G250。所述的表位肽是从G250的第25位氨基酸开始，肽段由9个氨基酸序列构成，所述的表位肽的氨基酸为LLLSLLLLM，如序列表中SEQIDNO.12所示，同时也包括其对应的突变肽。

本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十三是：提供了制备肾细胞癌抗原肽和热休克蛋白形成复合物的方法。

本发明提供了一种制备肾癌抗原肽与热休克蛋白gp96的非共价复合物的方法。在本发明的方法中，在pH7.4的DPBS缓冲液，反应温度60℃，反应时间10分钟，gp96蛋白的浓度为0.421μmol/L，9肽抗原的浓度为3.0μmol/L时可以在体外有效的形成gp96-抗原肽的复合物。

本发明还提供了肾癌抗原肽与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的方法。人工合成对应于该肽的核酸序列，采用分子生物学常用的方法将该序列连接于gp96基因5’端，然后在CHO系统中融合表达，表达产物是gp96与9肽的融合蛋白。

首次从五例肾细胞癌肿瘤组织中与热休克蛋白gp96结合的多肽中分离出一特异9肽，经氨基酸序列分析为“FLLFAVTSV”，经查询发现该序列位于肾细胞癌特异性抗原CarbonicAnhydraseIX的420-428位，人工合成该序列并与重组表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-9肽复合物，将9肽与gp96-9肽复合物免疫HLA-A2转基因小鼠，均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)，gp96-9肽复合物免疫原性比单独使用肽高100倍以上。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型肾细胞癌的治疗和预防的药物。

附图简要说明

图1以9肽和gp96-9肽复合物（0,1,3周）免疫小鼠BALB/c(HLA-A2⁺)后引发的特异性CTL反应。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准⁵¹Cr释放测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10，25，50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。

图2A-498荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线。裸鼠皮下接种人肾细胞癌细胞A-498，荷瘤14天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。肽段1组（n=20）的接受经过gp96-肽段1复合物免疫的BALB/c(HLA-A2⁺)小鼠的脾脏淋巴细胞；无关肽组（n=20）接受经过gp96-无关肽（HBcAg80-92）复合物免疫的BALB/c(HLA-A2⁺)小鼠的脾脏淋巴细胞。

图3肾细胞癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后9肽特异性T细胞的变化。以IFN-γ的ELISPOT方法检测患者外周血中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg_82-90肽为阴性对照。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.从肾脏组织中纯化gp96蛋白

将五份肾细胞癌组织和一份肾脏组织匀浆后离心，用30%/70%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀溶解后采用ConASepharose（GE公司）进行亲和层析，用10%的α-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q(GE公司层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(SantaCruz公司)进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相HPLC鉴定。

实施例2.从gp96蛋白释放非共价结合的多肽

将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其终浓度达到0.2%（pH约2.0），然后用超滤法(截留分子量为30kDa，Millipore公司)分离多肽，将多肽混合物进行MALDI-TOF质谱(ABI4700)分析，多肽分子量大多在600-1100Da之间。

实施例3.反相HPLC分析多肽

多肽混合物冻干后溶于溶液A（0.065%TFA，2%乙腈），上样于C18反相柱(SephasilpeptideC18；5μm粒度；4.6X250mm，GE公司)，从0至65%溶液B（0.05%TFA，100%乙腈)进行梯度洗脱，流速为1mL/min，用214nm波长检测。比较肿瘤组织和正常组织HPLC图谱，发现一个五份肾细胞癌肿瘤组织共有而正常组织中没有的肽峰。

实施例4.多肽微量测序与序列分析

收集该特异肽峰，用MALDI-TOF质谱(PE公司Voyager-DE系统)鉴定其纯度，只发现分子量为1033Da的单一峰。对该肽微量测序(ABI，Procise491蛋白测序仪)，其氨基酸序列为“FLLFAVTSV”，5份肿瘤组织得到的序列一致。将该序列在网上蛋白数据库（NCBI）查询，发现它位于肿瘤抗原CarbonicAnhydraseIX的420-428位。

实施例5.gp96蛋白与人工合成的多肽体外快速组装

人工合成9肽“FLLFAVTSV”（委托吉尔生化有限公司合成），将gp96蛋白与多肽进行体外组装，体外结合反应体系:

2.7mmol/LKCl，1.47mmol/LKH₂PO₄，8.1mmol/LNa₂HPO₄，138mmo1/LNaCl，10%(V/V)甘油，3.0mol/L9肽，0.421mmol/Lgp96蛋白，60℃反应10分钟，超滤法(分子截留30KDa，Millipore公司)去除未结合的多肽。

实施例6CHO表达系统中分泌表达肾细胞癌抗原肽1和热休克蛋白gp96的融合蛋白

本实例提供了肾癌抗原肽1（FLLFAVTSV）与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的方法。我们人工合成互补的核酸序列（5‘GATCCTTTCTCCTTTTTGCTGTCACCAGCGTCA3’及5‘GATCTGACGCTGGTGACAGCAAAAAGGAGAAAG3‘），并通过复性获得双链DNA片段，核酸序列对应于该肽的氨基酸序列，同时还在序列的5‘端引入限制性酶切位点BamHI粘性末端，3端引入限制性酶切位点BglII的粘性末端，获得粘性片段1。我们通过PCR在gp96的基因两端分别引入限制性酶切位点BglII和XhoI，限制性酶切获得粘性片段2。我们酶切真核表达载体pSecTag2/HygroA获得BamHI、XhoI双切的粘性片段3。将3个DNA片段用T4连接酶连接，将抗原肽-gp96表达框插入到表达载体pSecTag2/HygroA。将基因工程载体pSecTag2/HygroB-Seq1-hgp96通过电穿孔的方式转染CHO细胞，以潮霉素B抗生素筛选阳性克隆，并通过ELISA检测培养上清中的gp96获得高产细胞株。

实施例7.免疫小鼠

选用生长8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠(HLA-A2⁺)用于本实验。

免疫方式采用将样品溶于100μL的PBS中颈背皮下注射。皮下注射操作相对简单，要求免疫剂量适中，故采用该种免疫方式。同时在实验组每次免疫前1天腹腔注射0.4mg的环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免疫效果。

gp96蛋白-9肽复合物的最适免疫剂量为0.1nmol。

免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。

因此采用皮下注射免疫，将9肽溶于缓冲液(90%PBS10%DMSO0.1%TFA)，gp96-肽1复合物溶于PBS中，注射前剧烈振荡1分钟，每只小鼠免疫剂量肽段1分别为1nmol和10nmol，将肽与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。gp96-肽段1复合物免疫剂量分别是0.10nmol，采用颈背皮下注射，第一次免疫1周后进行第二次免疫，2周后加强免疫，3天后进行细胞毒性分析。每一处理使用10只小鼠。

实施例8.细胞毒性分析

小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠收获得约3×10⁷脾细胞悬于含有10mMHEPES缓冲液、5×10^-5M巯基乙醇，抗生素和10%(V/V)FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射(4500Rad)的T2细胞(3:1)和1μg/mL肽在完全培养基中37℃培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准⁵¹Cr释放实验(具体方法见Kuhrober,A,etal.1997.InternationalImmunology,9(8):1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，靶细胞用10μg/mL肽于37℃致敏30分钟后加入不同数量的效应细胞，反应体系为100μL的完全培养基。37℃共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。

从⁵¹Cr释放实验可以看出gp96-肽1复合物和单独的肽段1均可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，但gp96复合物的免疫效果是单独9肽的100倍以上。每只小鼠免疫0.1nmol(约10μg)的gp96-肽1复合物即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上，且环磷酰胺的预处理可以进一步增强这种细胞毒效应（图1）。实验结果表明gp96-肽1复合物可开发成为一种新型肾细胞癌的治疗和预防的药物。

实施例9细胞转输体内抑瘤实验

用HLA-A2阳性人肾细胞癌细胞A-498皮下注射裸鼠接种。14天后转输从gp96-肾细胞癌抗原9肽1复合物免疫HLA-A2转基因小鼠获得的脾脏淋巴细胞（n=20)、gp96-无关肽复合物免疫小鼠淋巴细胞（n=20），每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小可以发现转输gp96-肾细胞癌抗原9肽1复合物免疫小鼠的淋巴细胞可明显抑制肾细胞癌细胞的生长(图2)。

实施例10肾细胞癌患者免疫自体gp96复合物治疗肿瘤

该研究中入组的gp96免疫治疗的肾细胞癌患者完成10个疗程的治疗。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后8周内进行常规治疗及gp96自体免疫治疗。

操作流程

i患者入选：肾细胞癌患者，接受根治手术。

ii肿瘤组织中gp96-肿瘤抗原复合物的纯化

按照孟颂东等发表的三步法（MengS,SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificationofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolationofgp96-boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.）对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化，通过ConA柱亲和层析、HitrapQ柱离子交换纯化得到纯度95％以上gp96蛋白。

考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，蛋白提取量应足够完成10个疗程。

样品应满足疫苗应用的微生物要求。

样品应满足疫苗应用的内毒素含量要求。

gp96样品应具有生物活性。

iiigp96-肿瘤抗原复合物的使用

患者在手术后12周后接受第一次免疫治疗。每次免疫前1天，静脉注射环磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96复合物。每周1次，共注射10次。

iv免疫学指标检查

以自体肿瘤裂解液及自体gp96复合物抗原为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较肾细胞癌患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。

v随访

患者完成gp96自体免疫治疗后2年内每3月访视1次，2年后每6月访视1次，直至患者疾病复发或死亡，具体访视内容如下：

①2年内每3个月复查1次：

a)第3、9、15、21月复查内容：

肿瘤标志物；

腹、盆腔B超；

胸部X线。

b)第6、12、18、24月复查内容：

CEA、TPA、β-微球蛋白、Sfer；

胸、腹、盆腔增强CT。

②2年后每6个月复查1次，复查内容：

CEA、TPA、β-微球蛋白、Sfer；

胸、腹、盆腔增强CT。

患者随访期间疾病复发，达到研究终点，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范（如NCCN指南等）给予其他治疗

实施例11.ELISPOT法检测特异性T细胞

ELISPOT检测肾细胞癌患者PBMC中表位特异性CTL。按照ELISPOT试剂盒的说明书操作。先用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基封闭ELISPOT预包被板一小时,临用前倒掉封闭液,加入100μL含1×10⁵的人的PBMC（直接用新鲜的PBMC或者将PBMC体外扩增培养7天）。实验组中加入10μg/mL的9肽1、阳性对照加入4μg/mL的PHA进行刺激,阴性对照加入无关肽（HBcAg_82-90）。在细胞培养箱内培养26-36小时后,检测特异性斑点的形成，并进行统计分析。我们选取HLA-A2阳性的肾细胞癌患者作为研究组，通过ELISPOT方法检测患者新鲜血液中表位特异性CTL，特异性CTL的频率通过计数斑点数量来确定。在4例经自体gp96复合物免疫的HLA-A2阳性肾细胞癌患者中均检测到高频率的FLLFAVTSV特异性CTL，且比免疫前有显著的提高,同时并没有检测到无关肽HBcAg82-90（阴性对照）特异性T细胞，说明ELISPOT结果是表位特异的（图3）。

实施例12.其它gp96一多肽复合物的免疫活性测定

除上述抗原9肽之外，我们又选取其它11个肾细胞癌抗原多肽与gp96体外组装并测定其免疫活性，这11个抗原多肽分别是1）CA9抗原多肽“ALVFLLFAV”，2）CA9抗原多肽“FQLPPLPEL”，3）CA9抗原多肽“FQYEGSLTT”4）5T4抗原多肽“VLYLNRKGI”5）5T4抗原多肽“FLDNNPWVC”，6）5T4抗原多肽“VLLELNSADL”7）5T4抗原多肽“YLPRDVLAQL”，8）5T4抗原多肽“VLALIGAIFL”，9）G250抗原多肽“LVFGLLFAV”，10）G250抗原多肽“FQLPPLPEL”，11）G250抗原多肽“LLLSLLLLM”。

分别人工合成这11种多肽，采用实施例7中所述的反应体系在体外与gp96结合，这11种多肽与gp96均有较高的亲和力，通过测定结合反应平衡常数K在4.8-5.7之间。采用实施例5中所述的方法用上述11种肾细胞癌抗原多肽与gp96形成的复合物，和上述gp96与11种肾细胞癌抗原多肽的融合蛋白分别免疫小鼠，并采用实施例7中所述的方法分别对这22种复合物进行CTL分析，从⁵¹Cr释放实验可以看出这11种肾细胞癌抗原多肽与gp96形成的复合物均可刺激HLA-A2转基因小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，11种多肽与gp96形成的复合物的免疫活性比单独多肽高100-180倍。每只小鼠免疫剂量为0.1nmol(约10μg)时即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，通过对这11种多肽与gp96形成的复合物的细胞毒性测定发现靶细胞的裂解率在50%-70%之间。

以上实验结果表明gp96与肾细胞癌抗原多肽体外组装合成的复合物可开发成为一种新型肾细胞癌的治疗药物。由于实验条件所限本发明专利不可能对每一种肾细胞癌抗原多肽进行体外组装及免疫活性测定，但我们通过选取12种有代表性的肿瘤抗原肽作研究对象，在体外与gp96结合并进行免疫活性测定，大量实验表明gp96与这些抗原多肽形成的复合物均能刺激小鼠产生强烈的免疫反应，gp96作为抗原多肽的新型良好佐剂，可开发成为一种新型治疗和预防性疫苗。因此，除上述12种抗原多肽之外，其它任何肾细胞癌抗原多肽与gp96结合作为新型疫苗也应当在本发明的保护范围之内。

实施例12.HSP78-多肽免疫原性测定

将HSP78与12种多肽体外组装形成的复合物，反应体系同gp96(见实施例5)，将体外合成的复合物和HSP78与12种多肽的融合蛋白（实施例6）免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫剂量以及免疫程序同gp96(见实施例7)细胞毒性(CTL)分析方法同gp96（见实施例8)。从⁵¹Cr释放实验可以看出HSP78-肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，HSP78-肽复合物的免疫原性为单独抗原肽的100倍以上，每只小鼠免疫0.1nmol(约10μg)即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上。实验表明HSP78-9肽复合物可开发成为一种新型肾细胞癌的治疗和预防药物。

序列表

SEQUENCELISTING

<110>深圳市康尔诺生物技术有限公司

<120>肾癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

<130>肾癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

<160>12

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

PheLeuLeuPheAlaValThrSerVal

15

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

AlaLeuValPheLeuLeuPheAlaVal

15

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

PheGlnLeuProProLeuProGluLeu

15

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

PheGlnTyrGluGlySerLeuThrThr

15

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

ValLeuTyrLeuAsnArgLysGlyIle

15

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

PheLeuAspAsnAsnProTrpValCys

15

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

ValLeuLeuGluLeuAsnSerAlaAspLeu

1510

<210>8

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

TyrLeuProArgAspValLeuAlaGlnLeu

1510

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

ValLeuAlaLeuIleGlyAlaIlePheLeu

1510

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

LeuValPheGlyLeuLeuPheAlaVal

15

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

PheGlnLeuProProLeuProGluLeu

15

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>12

LeuLeuLeuSerLeuLeuLeuLeuMet

15

Claims

1.一种与热休克蛋白结合的表位肽FLLFAVTSV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。

2.一种与热休克蛋白结合的表位肽ALVFLLFAV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。

3.一种与热休克蛋白结合的表位肽FQLPPLPEL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。

4.一种与热休克蛋白结合的表位肽FQYEGSLTT，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。

5.一种与热休克蛋白结合的表位肽VLYLNRKGI，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.5所示。

6.一种与热休克蛋白结合的表位肽FLDNNPWVC，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。

7.一种与热休克蛋白结合的表位肽VLLELNSADL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.7所示。

8.一种与热休克蛋白结合的表位肽YLPRDVLAQL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。

9.一种与热休克蛋白结合的表位肽VLALIGAIFL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.9所示。

10.一种与热休克蛋白结合的表位肽LVFGLLFAV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.10所示。

11.一种与热休克蛋白结合的表位肽FQLPPLPEL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.11所示。

12.一种与热休克蛋白结合的表位肽LLLSLLLLM，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.12所示。

13.如权利要求1-12任一项所述的表位肽与gp96或HSP78的共价或非共价连接的复合物。

14.如权利要求1-12任一项所述的表位肽在体外单独或与热休克蛋白形成如权利要求13所述的复合物单独或共同免疫人体诱导生成杀伤性T细胞中用途。

15.如权利要14所述的免疫诱导杀伤性T细胞在预防或治疗肾细胞癌中的用途。