CN104211797A - 胃癌抗原肽与热休克蛋白的复合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类与热休克蛋白结合的胃癌抗原，包括胃癌特异性抗原LY6K、IEX-1和Survivin-2B来源的肽段。本发明同时还提供了抗原与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这种复合物可用于制备治疗胃癌的治疗性疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及胃癌抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物以及它们的用途。
背景技术
热休克蛋白(Heat Shock Protein, HSP)是一类高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，在热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等应激状态下会表达升高。gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(Endoplasmic Reticulum)，能够阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错折叠蛋白质的分泌。gp96在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。gp96分子除了具备分子伴侣的功能，gp96分子还具有多肽结合的能力，能结合细胞中5-25个氨基酸的多肽序列。热休克蛋白hsp78是细胞质中hsp70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子也能够和细胞中各种短肽结合。
近年来的研究发现，组织提取的gp96、HSP78蛋白具有很强免疫原性，能够有效的激起组织特异性的免疫反应。同时也发现这种抗原性由这些HSP结合的短肽所决定。HSP将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性的效应和记忆T细胞，引发长期的细胞免疫反应。gp96还可以活化树突细胞（DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共刺激因子的表达，从而提高免疫反应。
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率仅次于肺癌，位居第二位。在我国2012年胃癌发病率高达36/10万，为恶性肿瘤中的第二位；死亡率约为26/10万，为恶性肿瘤的第三位。现行胃癌治疗常规方案是手术切除肿瘤组织并辅以化疗。但即便使用紫杉类、口服氟尿嘧啶、伊立替康等新的化疗药物中位生存时间仍维持在10个月左右，并无根本性的突破。这是由于休眠肿瘤细胞、肿瘤干细胞对化疗的耐受度很高，并且肿瘤细胞的免疫原性差不能有效激发抗肿瘤免疫反应。因此多数患者治疗后肿瘤仍会复发和转移，这是导致死亡高的主要因素。
近年来研究发现自体肿瘤组织中分离纯化的gp96和HSP78结合有肿瘤组织特异的抗原肽库，可以激活肿瘤特异性T细胞，起到抑制肿瘤生长、延缓复发的作用。临床试验已证实胃癌患者接受自体肿瘤gp96复合物免疫治疗后中位总生存期大于16个月，而常规的治疗方案的中位生存期为9.2个月，延长74%；同时中位无进展生存期也达到7个月。自体gp96复合物免疫治疗起到了推迟胃癌复发的作用。
然而作为消化系统中最严重的恶性肿瘤，胃癌从总体上仍然不能治愈。新的化疗药物、靶向药物的进展缓慢。即便目前最具希望的自体gp96免疫治疗由于需要的足够大的肿瘤组织来制备疫苗，同时自体疫苗制备的一次性，影响了该方法的疗效和受众。
目前已证实gp96和HSP78分子能结合泡状口炎病毒抗原区肽、鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、La限制的白血病抗原肽、乙肝病毒抗原肽等抗原多肽。但目前为止未见从胃癌患者肿瘤组织中分离鉴定与HSP结合的抗原多肽。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是筛选胃癌特异性的肽段。克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，能够在胃癌患者或者健康个体中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗胃癌作用，对正常细胞及组织无破坏作用。
本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的胃癌抗原的复合物。所述的胃癌抗原可以分别是胃癌肿瘤抗原LY6K蛋白上第91-99位的氨基酸序列，其序列可以是RTDEGDNRV，或其变异序列；胃癌肿瘤抗原LY6K蛋白上第127-135位的氨基酸序列，其序列可以是IAAVMLRWL，或其变异序列；胃癌肿瘤抗原LY6K蛋白上第118-126位的氨基酸序列，其序列可以是CKWTEPYCV，或其变异序列；胃癌肿瘤抗原IEX-1蛋白上第86-94位的氨基酸序列，其序列可以是LLFLLLTIV，或其变异序列；胃癌肿瘤抗原SURVIVIN-2B蛋白上第79-87位的氨基酸序列，其序列可以是VAYACNTST，或其变异序列。
本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合。本发明提供了制备本发明的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物的方法。
本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性的CTL。
本发明所诉的表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性胃癌患者PBMC分泌IFN-g，且这种作用在自体gp96复合物免疫后显著增强。
本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性胃癌患者特异性T细胞反应。
本发明所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。
首次从五例胃癌肿瘤组织中与热休克蛋白gp96结合的多肽中分离出一特异9肽，经氨基酸序列分析为“RTDEGDNRV”，经查询发现该序列位于胃癌特异性抗原LY6K的91-99位，人工合成该序列并与体外表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-9肽复合物，将9肽与gp96-9肽复合物免疫HLA-A2转基因小鼠，均能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL),且调节性T细胞抑制剂的预处理可以增强gp96-9肽复合物的免疫效果2倍以上。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型胃癌的治疗性药物。
附图简要说明
图1.小鼠（BALB/cHLA-A2+）的特异性CTL反应。以gp96-9肽复合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠的平均值。
图2.胃癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后9肽特异性T细胞的变化。以IFN-g的ELISPOT方法检测患者外周血中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg82-90肽为阴性对照。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1. 从胃组织中纯化gp96蛋白
将五份胃癌组织和一份正常胃组织匀浆后离心，用30%/70%饱和度(NH4)2SO3沉淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose（GE公司）进行亲和层析，用8%的a-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q (GE公司层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(Santa Cruz公司)进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相HPLC鉴定。
实施例2.从gp96蛋白释放非共价结合的多肽
将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其终浓度达到0.2%（pH约2.0)，然后用超滤法(分子截留为30kDa, Millipore公司)分离多肽，将多肽混合物进行MALDI-TOF质谱(ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1100 Da之间。
实施例3.反相HPLC分析多肽
多肽混合物冻干后溶于溶液A（0.065% TFA，2%乙腈），上样于反相C18层析柱（Sephasil peptide C18；5 mm粒度；4.6 X 250 mm，GE公司），从0至65%溶液B（0.05% TFA，100%乙腈)进行梯度洗脱，流速为1 mL/min，用214nm波长检测。比较肿瘤组织和正常组织HPLC图谱，发现一个五份胃癌组织共有而正常胃组织中没有的肽峰。
实施例4.多肽微量测序与序列分析
收集该特异肽峰用MALDI-TOF质谱(PE公司Voyager-DE系统)鉴定其纯度，只发现分子量为1061 Da的单一峰。对该肽微量测序(Procise 491.蛋白测序仪，ABI公司)，其氨基酸序列为“RTDEGDNRV”，5份肿瘤组织得到的序列一致。将该序列在网上蛋白数据库（NCBI）查询，发现它位于LY6K 蛋白的91-99位。
实施例5. gp96蛋白与人工合成的多肽体外快速组装
人工合成9肽“RTDEGDNRV”(委托吉尔生化有限公司合成)，将gp96蛋白与多肽进行体外组装，体外结合反应体系：
2.7 mmol/L KCl，1.47 mmol/L KH2PO4，8.1 mmol/L Na2HPO4，138mmo1/L NaCl, 10%(V/V)甘油，3.0 mmol/L 9肽，0.421 mmol/L gp96蛋白，60℃反应10分钟，超滤法(分子截留30 kDa，Millipore公司)去除未结合的多肽。
实施例6表达胃癌抗原肽1和热休克蛋白gp96的融合蛋白
本实例提供了胃癌抗原肽1（RTDEGDNRV）与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的方法。我们人工合成对应于该肽的核酸序列（CGCACCGATGAAGGCGATAACCGCGTG），引入限制性酶切位点Bgl II将该9肽的核酸序列与gp96基因5’端用T4连接酶连接，连接产物的5’和3’端引入2个限制性酶切位点EcoR I和Xho I，连接到表达载体pPICZaA中在毕赤酵母中分泌表达，表达产物是gp96与该9肽的融合蛋白。
实施例7. 免疫小鼠
选用生长8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠(HLA-A2+)用于本实验。
免疫方式采用将样品溶于100mL的PBS中颈背皮下注射。皮下注射操作相对简单，要求免疫剂量适中，故采用该种免疫方式。同时在每次免疫前1天腹腔注射0.4 mg的环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免疫效果。
gp96蛋白-9肽复合物的最适免疫剂量为0.1 nmol。
免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。
因此采用皮下注射免疫，将9肽溶于缓冲液(90% PBS 10% DMSO 0.1% TFA) gp96-9肽复合物溶于PBS中，注射前剧烈振荡1分钟，每只小鼠免疫剂量9肽分别为0.2 nmol, 2 nmol和20 nmol，将肽与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。gp96-9肽复合物免疫剂量分别是0.01 nmol,0.05 nmol, 0.10 nmol和0.50 nmol,采用颈背皮下注射，第一次免疫1周后进行第二次免疫，2周后加强免疫，3天后进行细胞毒性分析。每一处理使用10只小鼠。
实施例8. 细胞毒性(CTL)分析
小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠收获得约3 X 107脾细胞悬于含有10 mM HEPES缓冲液、5 X 10-5 M琉基乙醇，抗生素和10% (V/V) FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射(4500 Rad)的T2细胞(3:1)和1mg/mL肽在完全培养基中37℃培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准51Cr释放实验(具体方法见Kuhrober, A, et al. 1997. InternationalImmunology, 9(8):1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，靶细胞用10mg/mL目标肽或者无关肽于37℃致敏30分钟后加入不同数量的效应细胞，反应体系为100 mL的完全培养基。37℃共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。
从51Cr释放实验可以看出gp96-9肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，每只小鼠免疫0.1 nmol(约10mg)的gp96-9肽复合物即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在60%以上，通过注射环磷酰胺的预处理可以明显的提高gp96-9肽复合物的免疫效果，且这种细胞毒效应是表位肽特异性的（图1）。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型胃癌的治疗药物。
实施例9 胃癌患者免疫自体gp96复合物治疗肿瘤
该研究中入组的gp96免疫治疗的胃癌患者需完成10个疗程的治疗。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后8周内在常规治疗的基础上开始自体gp96免疫治疗。
操作流程
i 患者入选：初发Ⅲ期或IV期的胃癌患者，可进行根治性手术。
ii 肿瘤组织中gp96-肿瘤抗原复合物的纯化
按照孟颂东等发表的三步法（Meng S, Song J, Rao Z, Tien P, Gao G. 2002. Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable for isolation of gp96-bound peptides. Journal of Immunological Methods, 264(1-2): 29-35.）对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化。首先通过ConA柱亲和层析，再通过Hitrap Q柱离子交换洗脱，得到纯度95％以上gp96蛋白。
考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足10个疗程的治疗需要。
蛋白应满足疫苗的微生物要求（检测方法参照生物制品规程）。
蛋白的内毒素含量需满足疫苗制剂的要求(鲎试剂法检测)。
iii gp96-肿瘤抗原复合物的使用
患者在手术后8周内接受第一次免疫治疗。每次免疫前1天，静脉注射环磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96复合物。每周1次，共注射10次。
iv 免疫学指标检查
以自体肿瘤裂解液及自体gp96复合物抗原为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较胃癌患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。
v 随访
注射完成后，于3个月、6个月、1年、1年半、2年时各访视1次；之后每半年访视1次，直至患者复发或死亡。
① 2年内每3个月复查1次：
a) 第3、9、15、21月复查内容：
肿瘤标志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA）；
腹、盆腔B超；
胸部X线。
b) 第6、12、18、24月复查内容：
肿瘤标志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA）；
胸、腹、盆腔增强CT；
胃镜。
② 2年后每6个月复查1次，复查内容：
肿瘤标志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA）；
胸、腹、盆腔增强CT；
胃镜。
患者随访期间疾病复发，达到研究终点，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范（如NCCN指南等）给予其他治疗。
实施例10 ELISPOT法检测特异性T细胞
ELISPOT检测胃癌患者PBMC中表位特异性CTL。按照ELISPOT试剂盒的说明书操作.先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基封闭ELISPOT预包被板一小时,临用前倒掉封闭液,加入100mL含3 X 105的人的PBMC（直接用新鲜的PBMC或者将PBMC体外扩增培养7天）.实验组中加入10mg/mL的肽1、阳性对照加入4mg/mL的PHA进行刺激,阴性对照加入无关肽。在细胞培养箱内培养26-36小时后,检测特异性斑点的形成，并进行统计分析。我们选取HLA-A2阳性的胃癌患者作为研究组,选取HLA-A2阴性患者作为对照组,通过ELISPOT方法检测患者新鲜血液中表位特异性CTL，特异性CTL的频率通过计数斑点数量来确定。在3例经自体gp96复合物免疫的HLA-A2阳性胃癌患者中均检测到高频率的RTDEGDNRV特异性CTL，且比免疫前有显著的提高，同时并没有检测到无关肽HBcAg82-90（阴性对照）特异性T细胞，说明ELISPOT结果是表位特异的（图2）。
实施例11 其它gp96-多肽复合物的免疫活性测定
除上述抗原9肽之外，我们又选取其它4个胃癌抗原多肽与gp96体外组装并测定其免疫活性，这4个抗原多肽分别是1） LY6K抗原多肽“IAAVMLRWL”，2） LY6K抗原多肽“CKWTEPYCV”， 3) IEX-1抗原多肽“LLFLLLTIV”，4） SURVIVIN-2b抗原多肽“VAYACNTST”。
分别人工合成这4种多肽，采用实施例5中所述的反应体系在体外与gp96结合，这4种多肽与gp96均有较高的亲和力，通过测定结合反应平衡常数K，4种肽与gp96结合反应中K值均在6以上。采用实施例7中所述的方法用上述4种胃癌抗原多肽与gp96形成的复合物，和上述gp96与4种胃癌抗原多肽的融合蛋白分别免疫小鼠，并采用实施例7中所述的方法分别对这4种复合物进行CTL分析，从51Cr释放实验可以看出这4种胃癌抗原多肽与gp96形成的复合物均可刺激HLA-A2转基因小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，4种多肽与gp96形成的复合物的免疫活性比单独多肽高100-200倍，且通过Treg细胞抑制剂预处理可以进一步提高免疫效果。每只小鼠免疫剂量为0.1 nmol(约10mg)时即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，通过对这4种多肽与gp96形成的复合物的细胞毒性测定发现靶细胞的裂解率在60%-75%之间。
以上实验结果表明gp96与胃癌抗原多肽体外组装合成的复合物可开发成为一种新型胃癌的治疗或预防药物。由于实验条件所限本发明专利不可能对每一种胃癌抗原多肽进行体外组装及免疫活性测定，但我们通过选取5种有代表性的肿瘤抗原作研究对象，在体外与gp96结合并进行免疫活性测定，大量实验表明gp96与这些抗原多肽形成的复合物均能刺激小鼠产生强烈的免疫反应，可开发成为一种新型治疗疫苗。因此，除上述5种抗原多肽之外，其它任何胃癌抗原多肽与gp96结合作为新型疫苗也应当在本发明的保护范围之内。
实施例12. HSP78-多肽免疫原性测定
将HSP78与5种多肽体外组装形成的复合物，反应体系同gp96(见实施例5)，将体外合成的复合物和HSP78与5种多肽的融合蛋白（见实施例6）免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫剂量以及免疫程序同gp96(见实施例7)细胞毒性(CTL)分析方法同gp96（见实施例8)。从51Cr释放实验可以看出HSP78-9肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，HSP78-9肽复合物的免疫原性为单独9肽的150倍以上，每只小鼠免疫0.1 nmol(约10mg)即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上。实验表明HSP78-9肽复合物可开发成为一种新型胃癌的治疗药物。
序列表
<110> 深圳市康尔诺生物技术有限公司
<120> 胃癌抗原肽与热休克蛋白的复合物及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽1
<400> 1
Arg Thr Asp Glu Gly Asp Asn Arg Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽2
<400> 2
Ile Ala Ala Val Met Leu Arg Trp Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽3
<400> 3
Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽4
<400> 4
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Val
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位肽5
<400> 5
Val Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr
1 5
Claims (8)
1.一种与热休克蛋白结合的表位肽RTDEGDNRV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.一种与热休克蛋白结合表位肽IAAVMLRWL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
3.一种与热休克蛋白结合的表位肽CKWTEPYCV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
4.一种与热休克蛋白结合的表位肽LLFLLLTIV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
5.一种与热休克蛋白结合的表位肽VAYACNTST，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
6.如权利要求1-5任一项所述的表位肽与gp96或HSP78的共价或非共价连接的复合物。
7.如权利要求1-5任一项所述的表位肽在体外单独或与热休克蛋白形成如权利要求6所述的复合物单独或共同免疫人体诱导生成杀伤性T细胞中用途。
8.如权利要7所述的免疫诱导杀伤性T细胞在预防或治疗胃癌中的用途。
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| CN1316431A (zh) * | 2000-08-11 | 2001-10-10 | 中国科学院微生物研究所 | 乙肝病毒抗原多肽与热休克蛋白的复合物及其应用 |
-
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