JPH09505723A - ４３ｋｄヒトガン抗原からの免疫反応性ペプチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍関連蛋白質が、ヒトモノクローナル抗体Ｌ９２に免疫反応性を示すことが判った。該蛋白質の１０アミノ酸ペプチドセグメント及び該１０アミノ酸ペプチドを含む１４アミノ酸ペプチドがまた、単離され、そして該抗体に対して免疫反応性を示す。端が切り取られた融合蛋白質を用いて、抗体結合の最小認識部位が、４つのアミノ酸であると決定された。また、本明細書に開示されたペプチド又は蛋白質を含む腫瘍に対するポリペプチド組成物、並びに治療及び診断に直接利用されうる抗体を開示している。本発明のある実施態様はまた、１０アミノ酸ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列、及び、ヒトモノクローナル抗体Ｌ９２及び細胞毒性Ｔ細胞と免疫反応性を示す１４アミノ酸ペプチドをエンコードするＤＮＡである。

Description

【発明の詳細な説明】 ４３ＫＤヒトガン抗原からの免疫反応性ペプチド配列 本発明は、一般に、ヒト腫瘍抗原の同定及び単離に基ずく免疫療法の分野に関 する。特定の実施態様において、本発明はまた、腫瘍関連抗原のエピトープ性配 列を単離するためのヒトモノクローナル抗体の使用に関する。更なる実施態様は 、腫瘍関連蛋白質から派生した合成ペプチド、及び、ヒトのガンの治療、診断及 び予後のためにそれらを用いることに関する。 理想的なガンワクチンは、副作用無しに抗腫瘍免疫性を誘発するものである。 理想的には、このようなワクチンは、安定で、製造が高価でなく、そして容易に 投与されるものである。全細胞ワクチン又は細胞抽出物を用いた初期の試みは、 ガン患者の生存をかなり改善した。しかしながら、ワクチンの製造、貯蔵及びデ リバリーについてはなお問題がある。例えば、患者に副作用を誘発しうる細胞性 分子の汚染の可能性が存在する。 これらの問題故、合成又は組み換え抗原が、より有効なワクチンであると予想 される。但し、抗原デリバリーシステム、担体分子及びアジュバンドが、特異的 な抗腫瘍免疫性の誘発のために最適化されることが必要である。必要なことは、インビボ における腫瘍破壊において重要な役割を果たす腫瘍抗原、特にヒトにお いてＴ細胞免疫性を誘発で きる腫瘍抗原の同定及び特徴付けである。 自己抗体の高められた力価は、宿主に種々の自己免疫疾患、神経病理学的な疾 患及びガンを生じさせるということが判っているので、それらは、このような疾 患の病原性抗原を発見するために発現ライブラリーからｃＤＮＡクローンをスク リーニングするために用いられてきた（Ｔａｎ ＥＭ、１９９１；Ａｍａｇａｉ Ｍら、１９９１；Ｄｒｏｐｃｈｏ ＥＪら、１９８７；Ｓｚａｂｏ Ａら、１ ９９１；Ｈａｙａｓｈｉｂｅ Ｋら、１９９１）。ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ） を同定するためにこのアプローチを用いることの困難性は、高い力価のヒト抗Ｔ ＡＡ抗体を入手できないこと及びＴＡＡと無関係な血清抗体の妨害を含む。 自系メラノーマ細胞に特有のメラノーマ関連抗原（ＡＵ及びＦＤ）は、自系血 清を用いて検出されている（Ｃａｒｅｙ ＴＥら、１９７９）。ＦＤ抗原は、９ ０ＫＤの細胞表面の糖蛋白質である。抗原決定基は、トランスフェリンに相同な アミノ酸を有するイオン結合性蛋白質上に存在する（Ｒｅａｌ ＦＸら、１９８ ４）。同じ分子が、ヒトメラノーマ関連抗原ｐ９７に対して開発されたネズミの モノクローナル抗体を用いて同定された（Ｂｒｏｗｎ ＪＰら、１９８２）。ｐ ９７の配列は公知であるけれども、特有のＦＤエピトープの配列はまだ決定され ていない。ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）研究所は、ヒトメラノーマ細胞 によって主に発現される分子量９７０００の糖蛋白質抗原、ｐ９７を研究してい る（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ ＲＧら、 １９８０；Ｂｒｏｗｎ ＪＰら、１９８１）。ｐ９７遺伝子は、組み換えワクチ ンウイルス中に挿入され、そして、ｐ９７抗原を発現するためにトランスフェク トされたマウスメラノーマ細胞に強い抗腫瘍免疫性を誘発した（Ｂｒｏｗｎ Ｊ Ｐ、１９８２）。このワクチンを用いた臨床試験は、このグループによって行わ れている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ Ｉら、１９９２）。 Ｖｌｏｃｋとその共同研究者は、血清免疫複合体を酸処理により解離した後の 自系メラノーマ血清を用いて、抗原性の６６ｋＤの酸性糖蛋白質を見いだした（ Ｖｌｏｃｋ ＤＲら、１９８８）。その後のエピトープ分析は、糖蛋白質の炭水 化物の半分は、その抗原決定基を表していることを示した。コア蛋白質の配列は 、報告されていない。 メラノーマ患者からの同種異系のポリクローナル血清はまた、免疫原性のメラ ノーマ関連抗原を同定するために用いられてきた。これらの抗原は、１より多く のメラノーマにより共有されている。Ｂｙｓｔｒｙｎ及びその共同研究者は、メ ラノーマの細胞上清で免疫療法を受けた患者からの血清を用いて、免疫原性のメ ラノーマ関連抗原（２００＋、１５０、１１０、７５及び３８ｋＤ）を検出した （Ｌｉ Ｊら、１９９０）。 Ｇｕｐｔａ及びその共同研究者は、尿中の腫瘍関連抗原（ＵＴＡＡ）を明らか にした。それは、メラノーマ患者の尿中に元々見いだされた糖蛋白質抗原であり 、そしてまたメラノーマ細胞、例えばＭ１４セルラインの表面上にも見 いだされる。ＵＴＡＡは、お互いにジスルフィド結合で連結された７つのサブユ ニットからなる。全分子量は、約３００ｋＤであり、これは、４５ｋＤ、６５ｋ Ｄ、９０ｋＤ、１２０ｋＤ及び１５０ｋＤの免疫原性サブユニットを持つ（Ｅｕ ｈｕｓ ＤＭら、１９９０）。 Ｆｅｒｒｏｎｅ及びその共同研究者は、メラノーマ患者からのプール血清を用 いて、メラノーマ中の５０ｋＤの糖蛋白質抗原（Ｄ−１）を同定した（Ｈａｙａ ｓｈｉｂｅ Ｋら、１９９１）。メラノーマセルラインのｃＤＮＡライブラリー を用いて、免疫反応性クローンを単離しそして配列決定した。Ｅ−ｃｏｌｉ蛋白 質を用いた非特異的な抗体による大規模な吸着の後、健康なドナーのプール血清 から単離したＩｇＧを用いてニトロセルロース上のｃＤＮＡプラークをブロック することができ、クローニングに成功した。この蛋白質（Ｄ−１）の正確な腫瘍 特異性は不明であるが、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、末梢 血リンパ球（ＰＢＬ）及び正常繊維芽細胞はこの抗原を発現しないということが 示された。 いくつかの他の研究により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析におい て、４３ｋＤの位置に又はその付近に移動する、他のヒトガン細胞からの蛋白性 分子が同定された。これらの研究は、ネズミ又はヒトのモノクローナル抗体を用 いた。ＨＧＰ４３は、４３ｋＤａのヒトの糖蛋白質であり、これは、ネズミモノ クローナル抗体により同定され、そして元々はマウスへの致死的なリステリア菌 感染 に対する防御抗体として報告された（Ｆｏｎｔａｎ Ｅら、１９９２）。ＨＧＰ ４３は、健康で、正常な人の尿中並びにガン患者において検出される。ＨＧＰ４ ３はまた、マウスの単球を刺激して、ルイス肺腫瘍に対して細胞毒性を誘発する ということが示された（Ｆｏｎｔａｎ Ｅら、１９９３）。モノクローナル抗体 と反応性であるＨＧＰ４３のアミノ酸配列は、報告されていない。 ヒトモノクローナル抗体１６．８８及びＣ−ＯＵ１は、ヒトガン細胞中の他の ４３ｋＤ蛋白質分子と反応する（Ｅｒｂ Ｋら、１９９１）。抗原は、メラノー マ中で最も強く発現され、そして結腸ガン細胞中でより弱く発現される。 この蛋白質のアミノ酸配列は、部分的に知られており、そしてサイトカイン１８ と７０％の同一性を示す。 他のＨｕＭＡｂである、ＭＳ２Ｂ６が、卵巣ガン中に高密度で存在しそして種 々のヒトのガン及びあるタイプの正常な組織中では少ない細胞質抗原を検出する ために用いられている（Ｓｍｉｔｈ ＬＨら、１９９２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥウ エスタンブロット分析において、ＭＳ２Ｂ６は、分子量が３３〜４４ｋＤ及び６ ０ｋＤという広範囲にて蛋白質と反応した。競合阻害試験により、ＭＳ２Ｂ６で 同定された抗原、及びＨｕＭＡｂである１６．８８及びＣ−ＯＵ１で同定された サイトケラチンとの間では交差反応性がないことが示された。 抗腫瘍ワクチンを開発するための他のアプローチは、抗イディオタイプのワク チンの開発である。この方法におい て、ＭＡｂは、目的の抗原に対して開発される。その後、これらの抗体は、標的 抗原をまねるペプチドを見いだすべく、エピトープライブラリーをスクリーニン グするために用いられる。その後、この抗イディオタイプのエピトープは、ワク チンとして用いられる。このことは、容易に合成されないグリコシド抗原に対す る抗体を開発するのに特に重要である。ドクターＦｅｒｒｏｎｅの研究室は、メ ラノーマの活性特異的な免疫治療のために、高分子量のメラノーマ関連抗原（Ｈ ＭＷ−ＭＡＡ）をまねている抗イディオタイプワクチンの研究を行ってきた（Ｋ ｕｓａｍａ Ｍら、１９８９）。ＨＭＷ−ＭＡＡは、メラノーマ細胞により高密 度で発現されるが、正常の組織上への分布は限定されている（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡとＣｈｅｒｅｓｈ ＤＡ、１９８７）。抗イディオタイプの模擬ＨＭＷ− ＭＡＡは、免疫原として、ＭＡＡに対する同系のマウスモノクローナル抗体を用 いて開発された。これらの抗イディオタイプワクチンがマウス及びウサギに注入 された場合、特異的な免疫応答が現れた（Ｋｕｓａｍａ Ｍら、１９８９；Ｃｈ ａｌｌｏｐａｄｈｙａｙ Ｐら、１９９１）。フェーズＩ臨床試験での、これら のワクチンの患者への注入により、抗イディオタイプのワクチンが、安全であり かつ、メラノーマを有する患者（二人の完全に緩解した患者を含む）において臨 床上の応答を誘発すると判った（Ｍｉｔｔｌｅｍａｎ Ａら、１９９２）。しか しながら、動物モデルにおいて観察される、高い抗腫瘍抗体又はＴ細胞応答は、 臨床試 験において繰り返されなかった。それ故、これらの抗原を用いた免疫化により患 者中に見られる弱い免疫応答は、これらの抗原が、ヒトの通常の免疫状態下で部 分的に許容されうるという事実を反映していると考えられうる。 それ故、抗腫瘍免疫療法のための当面の要求がまだ存在する。有効なワクチン は、ヒトにおいて抗体及び／又はＴ細胞応答を誘発しうる腫瘍抗原を含む。 本発明は、従来技術に固有のこれらの及び他の欠点を、ヒトにおいて高い免疫 原性である蛋白抗原を同定しかつ単離することにより克服することを追求してい る。その後、これらの抗原は、特異的な抗腫瘍応答を促進するためにワクチンに て用いられる。 本発明の重要な実施態様は、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性を有すると見い だされた精製されたポリペプチドである。特には、本発明のこの実施態様は、４ アミノ酸セグメントＫＹＱＩ（配列番号 ８）を含む精製されたポリペプチド、 又は９アミノ酸セグメントＱＤＬＴＭＫＹＱＩ（配列番号 ９）を含む精製され たポリペプチド、更には１０アミノ酸セグメントＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ（配列番 号 １）を含む精製されたポリペプチドである。本発明の精製されたペプチドは 、更に、配列番号 １、８及び９として記述した配列を含み、そして公知の分子 量の蛋白質との比較により、変性性ポリアクリルアミドゲルを通る蛋白質の移動 性によって約４３ｋＤと規定される分子量を含むとして定義されうる。 本明細書中で用いる「精製したポリペプチド」なる語は、他の腫瘍細胞関連蛋 白質から単離可能であるポリペプチド組成物を意味し、ここでポリペプチドは自 然に得られうる状態と比べて、即ちこの場合は、腫瘍細胞抽出物内の純度に比べ て幾分か精製されているという意味が意図されている。それ故、精製されたポリ ペプチドはまた、それが完全な細胞中に自然に現れうる環境中にあるのではない ポリペプチドを意味する。 ある実施態様において、「精製された」は、種々の非蛋白性成分、例えば他の 細胞成分を除くために分画を行ったポリペプチド組成物を意味する。蛋白質精製 においての使用に適した種々の技術が、本技術分野の熟練者に公知である。これ らは、例えば、硫安、ＰＥＧ、抗体等を用いた沈殿、又は熱変性、そして、それ に続く遠心分離、クロマトグラフィー段階、例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相 、ヒドロキシアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳 動、ゲル電気泳動、及びこれら及び他の技術との組み合わせを含む。 ある種の他の実施態様において、精製されたポリペプチドは、固相合成により 化学的に合成され、そして、例えば、ＨＰＬＣにより他の化学反応生成物と分け られて精製される。或いは、ポリペプチドは、組み換え細胞中でベクター中に含 まれたＤＮＡ配列を過発現することにより製造されうる。ポリペプチドを製造す るこの方法において、精製は、先のパラグラフ中に記したいずれかの適当な技術 を用 いて達成される。 ４３ｋＤａ蛋白質の他のペプチドセグメントもまた、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と免 疫反応性であり得るということが理解される。例えば、抗原決定基はときどき不 連続であり、それ故、同じ４３ｋＤａ蛋白質の他のペプチドセグメントもまた、 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性であり得ることが判る。連続又は不連続のいず れかであるこのような全てのペプチドセグメント（これは更に、ＨｕＭＡｂ Ｌ ９２によって認識される完全長の蛋白質を包含する）は、本発明に包含されるベ きでありかつ本発明の請求の範囲内にあると理解される。例えば、配列番号１、 ８又は９として示された配列を含み、そして１００アミノ酸未満の長さを有する 、又は５０アミノ酸未満の長さを有する、又は２５アミノ酸未満の長さを有する 、又は１０アミノ酸或いはそれ未満の長ささえを有する精製されたポリペプチド はまた、本発明の請求の範囲内に含まれる。 また、本発明の蛋白質又はポリペプチドセグメントはまた、一般的に本技術分 野の熟練者に公知の遺伝的技術を用いて、キャリアー蛋白質に融合されうること 、及びＨｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性を示すこのような蛋白質−蛋白質又は蛋 白質−ペプチド融合物はまた本発明に包含されるということが理解される。例え ば、配列番号１、８、又は９として表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、そ して更に、例えばβ−ガラクトシダーゼ又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ ーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド もまた、本発明の実施態様である。これらのキャリアー蛋白質配列は例示のため に記載されているが、他の公知のキャリアー蛋白質配列、例えばキーホールカサ ガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）、他のアルブミン、例えばオブアルブミン、マウス血清アルブ ミン又はウサギ血清アルブミン又は他の適した蛋白質配列もまた本発明の実施態 様として含まれうるということが理解される。更に、「蛋白質」なる語の使用は 、本発明を、いずれかの特定のサイズのポリペプチド又はペプチドに限定するも のではないということが理解される。長さにおいて数アミノ酸ほどの小さいペプ チドから任意の大きさの蛋白質まで、並びに蛋白質−ペプチド融合物が、蛋白質 又はペプチドが抗原性であり及び／又は低い免疫原性を示す限りにおいて、本発 明に包含される。 一般的な意味において、本発明の蛋白質又はポリペプチドは、ヒト腫瘍細胞と 関連している、又はそれから由来するとして定義されうる。更に特には、本発明 の蛋白質及びペプチドは、約４３ｋＤａの分子量（Ｍｒ）を有しかつＨｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性であるヒト腫瘍細胞と関連している蛋白質、該４３ｋＤ蛋 白質のポリペプチドフラグメント、該４３ｋＤａ蛋白質のいずれかの部分を含む 蛋白質融合物又はペプチド−蛋白質融合物、及び特には、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と 免疫反応性でありうる蛋白質−ペプチド融合物（ここで、ポリペプチド、好まし くは配列番号１、 ８又は９として表わされるそれらのペプチド配列のひとつは、β−ガラクトシダ ーゼ又はＧＳＴと融合される）として定義されうる。組み換えＤＮＡ技術を用い て、完全なコーディング配列及び何らかのプロモーター、エンハンサー、ポリＡ スプライス部位、リボソーム結合部位又は他の転写或いは翻訳制御配列を含む４ ３ｋＤａ蛋白質の配列の任意の部分が、異種ＤＮＡ配列中に挿入され、そしてＨ ｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性である蛋白質を得るために発現されること、及び ４３ｋＤａ蛋白質の遺伝子配列及び／又はアミノ酸配列のこのような使用はいず れも、本発明の請求の範囲に包含されることが理解される。 更に、本発明の開示の蛋白質のアミノ酸配列又はその基礎の遺伝子配列は、例 えば、部位接定突然変異誘発により、又はいずれかの他の手段によって変更され ることができ、そしてそれにより、生物学的利用性及び抗原性を保持した蛋白質 が得られうるということが理解される。また、このような変更された蛋白質は、 生物学的活性を保持できない、又は、変更された或いは高めれられた生物機能或 いは抗原性を有することができ、そして全てのこのような変更された蛋白質は本 発明に包含される。 更なる実施態様において、本発明は、前記のパラグラフ中で議論した蛋白質、 ポリペプチド及び／又は蛋白質−蛋白質又は蛋白質−ポリペプチド融合物を製造 できる組み換えセルラインに関する。該セルラインは、好ましくは、バクテリア のセルライン、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉセルライン であることができ、それは、細胞内に、本発明の蛋白質、ペプチド、又は融合物 をコーディングするＤＮＡセグメント、及びベクターの複製及びポリペプチド、 蛋白質又は融合物の発現のために必須の制御要素を含むプラスミド又はウイルス ベクターを含む。セルラインはまた、他のバクテリア細胞、又は酵母、植物、動 物或いはヒトのセルラインであり得る。 適当なセルライン及びそれに適合するベクターの選択は、本技術分野の熟練者 に公知の方法であり、そしてすベてのこのようなセルライン及びベクターは、本 発明の範囲内にある。また、蛋白質をエンコードする遺伝子の発現は、誘発可能 なプロモーター、例えば、ｌａｃプロモーターの制御下にあることができ、そし て発現は外から付与した誘発剤によって制御されうるということが理解される。 最も好ましくは、配列番号１、８又は９として示されたペプチドは、β−ガラク トシダーゼと融合され、ｌａｃプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉセルライ ン中で発現される。 本明細書中で用いている、「組み換え」セルラインなる語は、組み換え遺伝子 、例えば、ヒトＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性を示すポリペプチドをエンコードす る遺伝子がその中に導入された細胞を意味するものと意図されている。 それ故、加工された細胞は、組み換え的に導入された遺伝子を含まない自然発生 の細胞と区別される。従って、加工された細胞は、ヒトの手を介して導入された １又は複数の遺伝子を有する細胞である。組み換え的に導入された遺伝 子は、ｃＤＮＡ遺伝子（即ち、イントロンを含まない）又はゲノム遺伝子のコピ ーの形のいずれかであり、或いは、特定の導入された遺伝子に自然には関連しな いプロモーターに隣接して配置された遺伝子を含む。 形質転換された細胞は、一般に、該形質転換された細胞内で複製できる挿入さ れたプラスミドベクターを有する細胞であると理解される。トランスフェクショ ンされた細胞は、一般に、ウイルスベクター又はウイルス由来のベクターで感染 された細胞であると理解される。いずれのケースにおいても、ベクターは、目的 の蛋白質又はペプチドをエンコードし、かつ複製されることができ、そしてプラ スミド又はウイルスベクターのＤＮＡと一緒に発現されるＤＮＡのセグメントを 運びうる。細胞の生育条件の操作を通じて、所望の蛋白質又はペプチドを「過製 造」させて、それらが細胞中で発現された主要な蛋白質となるようにすることが しばしば可能である。 一般的に言うと、組み換え遺伝子として、遺伝子のｃＤＮＡ版を用いるのがよ り便利であり得る。ｃＤＮＡ版を用いることは、ゲノム遺伝子（これは、典型的 には、ｃＤＮＡ遺伝子より１オーダーまで大きいであろう）を用いるよりも、遺 伝子のサイズが一般にかなり小さく、そして標的細胞へトランスフェクトするこ とがかなり容易に行えるという点で利点がある。しかしながら、発明者は、所望 の場合に、特定の遺伝子のゲノム版を用いることの可能性を排除していない。 本発明の他の実施態様は、本明細書中で配列番号１、８又は９として示された ポリペプチド配列をエンコードするＤＮＡのセグメント及びその補体（該ＤＮＡ 配列は、図４に描かれそして配列番号６及び７と指定されている）である。これ らのＤＮＡ配列は生物又はベクターからのＤＮＡの相補的伸長を同定するための プローブとして用いられ得ること、同定されたＤＮＡセグメントが本技術分野に おいて良く知られた技術により単離されそしてクローン化されうること、及び該 ＤＮＡセグメントの全てのこのような使用、及び該ＤＮＡセグメントを用いて単 離された製造物が本発明に包含されると理解される。また、該ＤＮＡ配列中の小 さな変更は、例えば、遺伝子コードの重複性を通じて起こりうること、及び該ペ プチド配列をエンコードするこのような遺伝子配列がまた本発明の請求の範囲の 一部として含まれるということが理解される。 本発明の他の実施態様は、ヒト抗体であり、より好ましくは、配列番号１、８ 又は９として示されたペプチド配列と免疫反応性であるモノクローナル抗体であ る。メラノーマ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、エプスタイン−バールウイ ルス（ＥＢＶ）トランスフォーメーション技術（Ｉｒｉｅら、１９８２）を用い て腫瘍関連抗原に対して抗体を産生するＢセルラインを確立するために使用した 。これらのセルラインの一つは、ヒトモノクローナル抗体Ｌ９２を産生する。該 抗体、（ＨｕＭＡｂ）Ｌ９２は、ヒト腫瘍細胞に関連する４３ｋＤａ蛋白質と反 応すると判った。 この４３ｋＤａ蛋白質は、４３ｋＤａの相対分子量（Ｍｒ）及び入手可能な配列 データにより上記で議論した公知のメラノーマ関連抗原の殆ど区別されるので、 それは新しくかつ類のない腫瘍関連抗原であろうと思われる。 例えば、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２に反応する１０アミノ酸配列は、サイトケラチン １８を含む報告されている蛋白質のいずれの配列とも一致しない。このことは、 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２をヒトモノクローナル抗体１６．８８及びＣ−ＯＵ１とはっ きりと区別している。これらの後者の２つの抗体は、そのアミノ酸配列が部分的 に知られておりかつサイトケラチン１８と約７０％の同一性を示すヒトガン細胞 中の他の４３ｋＤ蛋白質分子と反応する。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、サイトケラチ ン１８とは同一性を示さないので、これらの２つの抗体は、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２ が認識しているのとは異なった分子又はエピトープを認識していると考えられて いる。 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２とＭＳ２Ｂ６との類似性は知られていないが、ウエスタン ブロティングにおけるＨｕＭＡｂ Ｌ９２を用いた免疫反応性バンドは、４３ｋ Ｄのはっきりした明瞭なバンドを生じた。このことは、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２がＭ Ｓ２Ｂ６とは異なった抗原性エピトープを検出していることを示している。これ らの４３ｋＤａ蛋白質又は４３ｋＤａに近い蛋白質のアミノ酸配列は知られてい ないので、正確な比較は不可能である。これらの抗原が、同じ分子上の異なった エピトープを検出するという可能性は、 排除されていない。このことは、その蛋白質の全アミノ酸配列が決定されたとき に明らかとなろう。 抗原性エピトープをエンコードする遺伝子を同定するために、ヒトメラノーマ セルラインＵＣＬＡＳＯ Ｍ１４（Ｉｒｉｅら、１９７６）から構築したｃＤＮ Ａ発現ライブラリーを、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を用いてスクリーニングした。単離 されたクローンのＤＮＡ配列分析は、抗原性エピトープが１０アミノ酸ペプチド であるということを明らかにした。更なるテストは、１０アミノ酸ペプチド中に 含まれている４アミノ酸ペプチド（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ、配列番号 ８）が、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の最小抗原性エピトープであることを明らかにした 。ペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、β−ガラクトシダーゼ−ペプチド融合物とし て、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−蛋白質融合物とし て発現された。 ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、活性的に転写されたメッセージのみをライブラ リー中にクローン化するために、一般にはポリＡ⁺ｍＲＮＡからクローン化され た、クローン化ＤＮＡセグメントを含む一群のベクターである。従って、ライブ ラリーベクター中に挿入されたセグメントは、ライブラリーが由来する特定のセ ルライン中で活性的に転写された又は発現されたＲＮＡに対してのみ相補的であ る。 本明細書中でＨｕＭＡｂ Ｌ９２と言われているヒトモノクローナル抗体は、 本発明の他の実施態様である。抗体は、発明者によって開発されたＢセルライン により発現さ れ、そして４３ｋＤａのメラノーマ関連抗原、及び本明細書中で配列番号１、２ および８として示しているペプチドと免疫反応性である。この抗体は、ヒト患者 からの試料中のメラノーマ関連抗原を検出する目的で、該試料をスクリーニング するのに有用である。該抗体はまた、関連する抗原性配列の発見のために、発現 されたＤＮＡセグメント又はペプチド及び蛋白質のスクリーニングにおいて有用 であり得る。該抗体のこのような全ての使用、及びそのようにして発見されたい ずれの抗原又はエピトープ配列も、本発明の範囲内である。 本発明の他の実施態様は、ＣＴＬ又は抗体応答を誘発するための有効量にてＨ ｕＭＡｂ Ｌ９２と免疫反応性である蛋白質又はポリペプチドを含む抗原組成物 である。好ましくは、ペプチド組成物は、本明細書において配列番号１、８又は ９として示されたポリペプチド配列を、単独で或いは組み合わせて含み、そして また、キャリアー蛋白質、例えばβ−ガラクトシダーゼの配列を含む。ポリペプ チドが、１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌにて組成 物中に存在することが意図される。このパラグラフ中で議論したポリペプチド組 成物はまた、多価のメラノーマ細胞ワクチン（ＭＣＶ）の成分となりうる。 多価のメラノーマ細胞ワクチンは、例えば、複数のメラノーマ関連抗原を発現 する数種のセルラインを含むワクチンである。細胞は、好ましくは照射により、 生存不能とし、そして他の箇所で議論した如くの免疫応答を誘発するため に患者に投与される（Ｍｏｒｔｏｎら、１９９２、この文献は引用することによ り本明細書の一部である）。 本明細書中で示されている如く、ＭＣＶのメラノーマ細胞は、配列番号１に示 されたペプチドセグメントで予備免疫化することによりより有効となりうる。そ れ故、細胞は、前処理されてもされなくても良く、そして本発明のペプチド配列 を含むポリペプチド組成物が、ＭＣＶと共に投与されうる。ヒトガン患者及び好 ましくはヒトメラノーマ患者を処置する方法は、該患者に、多価のメラノーマ細 胞ワクチンを、約二週間毎に３回、その後約１年間は１月に約１回投与し、引き 続き、約３カ月毎に約４回、その後は６カ月毎に投与すること、及び更に、配列 番号１又は８又は９として本明細書中に示されているポリペプチド配列を含む組 成物を、約４週間毎に２〜４回、その後は約６カ月毎に投与することを含む。 或いは、本発明は、細胞毒性のリンパ球を該患者から得る工程、該細胞毒性リ ンパ球を配列番号１、８又は９に従ったポリペプチドと接触させる工程、及び該 リンパ球を該患者中に再び導入する工程を含む、患者者中の免疫応答を高める方 法であり得る。高められた免疫応答は、能動の或いは受動の免疫応答であり得る 。或いは、応答は、リンパ球がポリペプチドでパルス（ｐｌｕｓｅ）され次いで 患者中に再導入されるという養子免疫療法アプローチの一部であり得る。ある実 施態様において、患者は、ヒトガン患者であり、より好ましくはヒトメラノーマ 患者である。リン パ球は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、１３１８頁（これ は、引用することにより本明細書の一部である）中に開示されている如く、腫瘍 が浸潤したリンパ球を得るために、患者の血清から又は組織から得られうる。あ る好ましい実施態様において、リンパ球は末梢血リンパ球であり、そして他の実 施態様では、免疫応答を高める方法は、メラノーマの全細胞を用いた治療法と共 に行われる。 本発明のポリペプチド及び核酸の配列、抗体及び組み換えセルラインの臨床上 の応用が開示されているけれども、本発明の種々の実施態様は、他の重要な用途 、例えば、メラノーマ関連抗原の存在に関しての組織及び培養試料のスクリーニ ング、メラノーマに対して用いる新しい治療薬及び予防薬の開発における用途を 有する。更に、本発明のポリペプチド及び抗体は、種々の疾患に対する免疫原性 の攻撃手段の検索における一般の知識の進歩、及び、抗原配列、抗体及び活性化 された細胞性免疫系の使用のために有用である。 図１Ａ：ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を用いたＭ１４細胞のウエスタンブロット 図１Ｂ：非特異的ヒトＩｇＭを用いたＭ１４細胞のウエスタンブロット 図１Ｃ：クマシー ブリリアント ブルーで染色した、蛋白質のＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ分析 図１Ａ〜Ｃ：レーン１、分子量標準、レーン２、ヒトＡ Ｂ血清中で生育したＭ１４ヒトメラノーマセルライン、レーン３、ウシ胎児血清 を含有する培地中で生育したＭ１４ヒトメラノーマセルライン、レーン４、ウシ 胎児血清を含有する培地中で生育したＭ１２ヒトメラノーマセルライン、レーン ５、胎児の脳、第二トリメスター。 図２：ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の³⁵Ｓ−メチオニン標識したＭ１４ヒトメラノーマ セルラインに対する反応性。ビオチン標識した抗ヒトＩｇＭ抗体は、第二抗体と して用いられた。レーン１、全細胞抽出物、レーン２、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２なし での免疫沈降、レーン３、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を用いた免疫沈降、レーン４、Ｈ ｕＭＡｂ Ｌ６１２を用いた免疫沈降。 図３Ａ：クマシー ブリリアント ブルーで染色した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分析した、Ｅ．ｃｏｌｉ中での免疫陽性（ｉｍｍｕｎｏｐｏｓｉｔｉｖ ｅ）な融合蛋白質の発現。 図３Ｂ：ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を用いたウエスタンブロットにより分析した、Ｅ ．ｃｏｌｉ 中での免疫陽性な融合蛋白質の発現。 図３Ａ〜Ｂ：レーン１、免疫陽性な＃８１０クローンの蛋白質、配列番号２を 含んだＥ．ｃｏｌｉの溶原物。レーン２、レーン１と同様、但し、ＩＰＴＧ誘導 はなし。レーン３、β−ガラクトシダーゼ。レーン４、分子量標準。 図４：免疫陽性のクローン＃８１０の二本鎖ヌクレオチド配列及びそれから推 論されるアミノ酸配列。アミノ酸配 列は、配列番号２に示された配列である。上段のＤＮＡ配列は、配列番号６に示 されており、下段の、相補的な配列は配列番号７に示されている。 図５Ａ：合成ペプチド（ＤＳＲＰＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号２）を用い て予備吸収したＨｕＭＡｂ Ｌ９２を免疫染色により分析した、メラノーマセル ラインの蛋白質へのＨｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に対する合成ペプチド（配列番号 ２）の競合。 図５Ｂ：合成ペプチド（ＤＳＲＰＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号２）を用い て後吸収したＨｕＭＡｂ Ｌ９２を免疫染色により分析した、メラノーマセルラ インの蛋白質へのＨｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に対する合成ペプチド（配列番号２ ）の競合。 図５Ａ〜Ｂ：レーン１、分子量標準、レーン２、クローン＃８１０からの溶原 物、及びレーン３、Ｍ１４メラノーマ溶解物。 図６：ＥＬＩＳＡにおける合成ペプチド（ＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号１ ）に対するＨｕＭＡｂ Ｌ９２の反応性。１０アミノ酸ペプチドを、ＥＬＩＳＡ プレート（Ｒｅａｃｈｉ−Ｂｉｎｄ（商標）、ＰＩＥＲＣＥ）上に製品説明書の 指示に従って固定化した。■：ＨｕＭＡｂ Ｌ９２、○：１０μｇ／ｍｌの関連 性のないヒトＩｇＭ（Ｌ６１２）、□：ＨｕＭＡｂ Ｌ９２なし。 図７Ａ：ウエスタンブロット分析による、Ｍ１４細胞の表面上の４３ｋＤ蛋白 質の検出。Ｌ９２ ＨｕＭＡｂ抗体を、Ｍ１４細胞（３×１０¹⁰細胞以上）と共 に、４℃で１晩温置した。遠心分離後、上清の抗体を、４３ｋＤ蛋白質及び＃８ １０、配列番号２の融合蛋白質との反応性についてテストした。 図７Ｂ：Ｌ９２ ＨｕＭＡｂをＭ１４細胞なしで１晩温置した場合の、ウエス タンブロット分析による、Ｍ１４細胞の表面上の４３ｋＤ蛋白質に検出の対照反 応。 図７Ａ〜Ｂにおいて、レーン１：分子量標準、レーン２：Ｍ１４細胞溶原物、 レーン３：＃８１０抗原、配列番号２。 図８Ａ：散在した細胞質シグナルが、メラノーマＭ１４細胞内で見える（倍率 ２００倍）。細胞は、＃８１０アンチセンスプローブに対してハイブリダイゼ ーションした。 図８Ｂ：メラノーマＭ１４細胞を＃８１０センスプローブに対してハイブリダ イゼーションした。 図９Ａ：＃８１０ペプチド、配列番号１でパルスされた 自系ＢＣＬに対する細胞毒性。細胞毒性及び増殖アッセイは、本明細書内の記載 に従って行った。１９の患者及び１９の対照の正常ドナーの代表的データを示す 。０、４及び８週にて、患者のＰＢＭＣは、自系の＃８１０でパルスされたＢＣ Ｌのポジティブな細胞溶解（８０：１のＥ：Ｔにて１７％以上）を示したが、一 方正常ドナーは示さなかった。ペプチドなしの自系のＢＣＬの溶解は、いずれの エフェクターによっても７％を超えなかった。３連の培養の平均ｃｐｍ±ＳＤを （Ｂ）中に示した。４及び８週にて、＃８１０ペプチド、配列番号１、０．００ １〜２０μＭを用いた患者のＰＢＭＣの値は、＃８１０、配列番号１を用いない のもより著しく高く（ｐ＜０．００５）、最大のＳＩは、それぞれ、４及び８週 において２．７１及び２．８７であった。これに対して、＃８１０、配列番号１ に対する著しい増殖性応答は、ワクチン接種前（Ｏ週）及び対照のソナーにおい ては観察されなかった。 図９Ｂ：ワクチン接種されたメラノーマ患者からのＰＢＭＣの＃８１０、配列 番号１に対する増殖性応答。アッセイは、図９Ａに記載された如くにして行った 。 図１０：インビトロにて、＃８１０、配列番号１で再度刺激された患者のＰＢ ＭＣの細胞毒性。ワクチン接種後４週の患者ＡからのＰＭＢＣを、インビトロに て、＃８１０で再刺激し、そして、本明細書中に記載の如くして、自系の＃８１ ０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ及びメラノーマＭＡ標的の細胞溶解につい てアッセイした。□及び○ は、培地のみで培養された対照のＰＢＭＣの細胞毒性を示す。ペプチドなしの及 び関連性のないデカペプチドでパルスされた自系ＢＣＬの細胞溶解は、いずれの エフェクターによっても、８０：１のＥ：Ｔにおいて８％を超えなかった。＃８ １０、配列番号１で再刺激されたＰＢＭＣ及び対照による８０：１のＥ：Ｔにお けるＫ５６２の細胞溶解は、それぞれ２４．０及び２４．５％であった。データ は、３つの別個の試験の代表値である。 図１１Ａ：自系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬの細胞溶解。自 系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ及びメラノーマＭＡの細胞溶解 のコールド標的阻害。患者ＡからのＰＢＭＣを、図１０に対するのと同様にして ＃８１０、配列番号１で再刺激し、そして自系の⁵¹Ｃｒ標識された＃８１０、配 列番号１でパルスされたＢＣＬ（Ａ）及びメラノーマＭＡ（Ｂ）の２０：１のＥ ：Ｔにおける細胞溶解をアッセイした。標識されてないコールド標的細胞を、示 された割合にて加えた。ペプチドなしのＢＬの溶解は、２０：１のＥ：Ｔにおい て３．０％であった。データは、４つの別個の実験を代表したものである。 図１１Ｂ：図１１Ａに記載された如くに行った、メラノーマＭＡの細胞溶解。 図１２：＃８１０、配列番号１で再刺激されたＰＢＭＣによる細胞毒性の抗体 阻害。＃８１０、配列番号１で再刺激された患者ＡからのＰＢＭＣを、抗体の存 在下及び非存在下で、自系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣ Ｌ及びメラノーマＭＡの４０：１のＥ：Ｔにおける細胞溶解についてアッセイし た。各抗体の最終濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。ペプチドなしの及び関連性 のないデカペプチドでパルスされた自系ＢＣＬの溶解は、それぞれ、５．４及び ５．２％であった。データは、４つの別個の実験を代表したものである。 図１３：＃８１０、配列番号１で再刺激されたＰＢＭＣによる、自系の及び同 種異系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬの細胞溶解。３つの実験の 代表するデータを、＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ標的の４０：１ のＥ：Ｔにおける特異的な細胞融解の％として示した。エフェクターは、＃８１ ０、配列番号１で再刺激された患者Ｂ（ＨＬＡ−Ａ２＋）及びＤ（ＨＬＡ−Ａ１ １＋）からのＰＢＭＣである。左の余白のカッコは、エフェクター及び標的間で 共通のＨＬＡ−Ａ又はＢ抗原を示す。各自系の及び同種異系の標的はまた、培地 のみ或いは関連性のないデカペプチドでパルスされた培地中で予備温置し、そし てエフェクターによる溶解についてテストした。それらの対照の標的の溶解は、 いずれのエフェクターによっても５％を超えなかった。 図１４：最小抗体認識ペプチドの決定。 １０アミノ酸ＨｕＭＡｂ Ｌ９２免疫反応性ペプチド配列（配列番号１）の端 を切ったいくつかのＧＳＴ融合ペプチドを、合成オリゴヌクレオチド及びベクタ ーとしてｐＧＥＸ−２Ｔを用いて調製した。Ｃ末端からの１アミノ酸残 基の削除は、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に影響せず（レーン３）、２つのＣ末端 アミノ酸残基の除去は、抗体の結合を完全に消した（レーン４）。１０アミノ酸 ペプチドのＮ末端からの６アミノ酸残基の削除は、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に 影響しなかった（レーン７）が、７つのＮ末端アミノ酸の除去は、再び、抗体の 結合を消した（レーン８）。 本発明者らは、以前、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）トランスフォ ーメーション技術を用いてメラノーマセルラインに反応性であるヒトモノクロー ナル抗体を産生する多くのＢセルラインを開発した（Ｉｒｉｅら、１９８２）。 メラノーマ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からの一つの特定のＢセルラインは 、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を産生した。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、特異的に表面抗原を 検出する免疫粘着（Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｔ）アッセイによると、いくつか のタイプのヒトガン細胞と反応するが、正常細胞には応答しないＩｇＭクラスの 抗体である（表１参照）。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と結合する抗原の能力は、グリコ シダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、α−マンノース、ノイラミニダーゼ及 びα−フコシダーゼで処理することによっては変化しない。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２ は、抗原ポジティブなメラノーマ細胞から精製されたガングリオシド及び中性糖 脂質に対する反応性を欠いていた。このことは、Ｌ９２が、蛋白質及びペプチド 抗原を認識していることを示唆している。 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、ヒトガン細胞に関連する４３ｋ Ｄ蛋白質の免疫反応性エピトープをエンコードする遺伝子を同定しそしてクロー ン化するために用いられた。エピトープをエンコードする遺伝子は、新たに発見 された１０アミノ酸配列（配列番号１）、並びに該１０アミノ酸セグメント内に 含まれる４アミノ酸配列（配列番号８）をエンコードし、該１０アミノ酸配列は 、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、β−ガラクトシダーゼ及びＧＳＴとの蛋白質−ペプチド融 合物の形で発現された。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、蛋白質−ペプチド融合物及び合 成ペプチド単独の両者と特異的に結合した。メラノーマ細胞を用いてのＨｕＭＡ ｂ Ｌ９２の吸収は、抗原はあるメラノーマの細胞の内側で優勢に発現されるが 、一方、高密度の抗原は他のメラノーマの細胞表面上で発現されるということを 証明した。 ペプチドをエンコードする核酸配列は、本技術分野の熟練者に良く知られた技 術である、ジデオキシ配列決定により決定した。この配列について、ジーンバン クデーターベース中にある公知のすべての配列に対する相同性を検索したところ 、クローン化された配列といずれかの他の報告されたＤＮＡ配列の間には相同性 は見いだされなかった。 Ｍ１４溶解物は、細胞を³⁵Ｓ−メチオニンで４時間パルスした後に調製した。 細胞の溶解物を、抗ヒトＩｇＭビオチン及びストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔ ａｖｉｄｉｎｅ）アガロースで予備浄化した後、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を添加しそ して温置した。関連性のないＨｕＭＡｂ Ｌ６１２（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓら、 １９９０）又は緩衝液のみ のいずれかを、予備浄化した細胞溶解物に加えた。その後、免疫複合体を、抗ヒ トＩｇＭ−ビオチン及びストレプトアビジンアガロースを用いて沈殿させ、そし て沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーに付した。ＨｕＭ Ａｂ Ｌ９２を用いた免疫沈降は、４３ｋＤの明瞭なバンドを示した。しかしな がら、ＨｕＭＡｂ Ｌ６１２を用いた或いは一次抗体なしの免疫沈降は、バンド を示さず（図２）、このことは、レーン３中の４３ｋＤ蛋白質バンドがＨｕＭＡ ｂ Ｌ９２に特異的に結合することを示唆している。 ウエスタンブロット分析は、蛋白−ペプチド融合物が、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２に 特異的に結合することを示した。１０アミノ酸の抗原をエンコードするペプチド を合成し、そしてインビトロにてその免疫反応性をテストした。ＨｕＭＡｂ Ｌ ９２は、抗体阻害アッセイ及び固相−ＥＬＡＩＳＡの両者において、１０アミノ 酸ペプチドに特異的に反応した。ＨｕＭＡｂ Ｌ９２はまた、ウエスタンブロッ ト分析により、配列番号８として示される４つのアミノ酸のペプチドと反応する と示された。これらの結果は、同定されたペプチド配列が、ヒトにおいて免疫応 答を誘発する４３ｋＤ蛋白質の免疫原性エピトープを含むことを示唆している。 略号 以下の略号を、本発明の開示を通じて用いた。ＨｕＭＡｂ、ヒトモノクローナ ル抗体；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫 吸着検定法；ＰＢＬ、末梢血リンパ球、ＦＣＳ、ウシ胎児血清；ＰＣＲ、ポリメ ラーゼ連鎖反応、ＩＰＴＧ、イソプロプルチオガラクトシダーゼ；ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＡＡ、腫 瘍関連抗原；ＣＴＬ、細胞毒性Ｔリンパ球；ＭＣＶ、メラノーマ細胞ワクチン； ＭＡＡ、メラノーマ関連抗原；ＢＣＬ、エプスタイン−バールウイルスで形質転 換されたＢリンパ芽球セルライン；ＩＡ、免疫付着；ＰＢＭＣ、末梢血単球細胞 ；［³Ｈ］ＴｄＲ、トリチウム標識されたチミジン；ＳＩ、刺激インデックス； ＬＡＫ、リンホカインで活性化されたキラー。 合成ペプチド ペプチド＃８１０（ＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号１）及び関連性のない配 列の非免疫原性デカペプチド（ＩＭＴＱＬＦＱＤＹＫ、配列番号５）を、シティ ー オブ ホープ（カリフォルニア州、デュアルテ）のベックマン リサーチ インスチュートにて、９’−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）法を 用いて合成した。これらのペプチドを、高圧液体クロマトグラフィーによって精 製した。ペプチドは、９５％より大きい純度であった。ペプチドの同定は、高分 解能質量スペクトルによって行った。 腫瘍セルライン メラノーマセルライン、胃ガン、結腸ガン、肺ガン及び 乳ガンのセルライン、赤白血病Ｋ５６２及びエプスタイン−バーツウイルスで形 質転換されたＢリンパ芽球セルライン（ＢＣＬ）は、全て、１０％の熱非働化ウ シ胎児血清（ゲメニ、バイオプロダクト、カラバサス、カリフォルニア州）を補 ったＲＰＭＩ １６４０培地（ＪＲＨバイオサイエンス、レネクサ、カンサス州 ）により培養した。 ウエスタンブロティング 細胞溶解液を、ウエスタンブロティングにより、Ｌ９２抗体を用いて４３ｋＤ 蛋白質の存在について分析した。要約すると以下の通りである。細胞を収穫し、 沈殿させそして溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５％β−メルカプト エタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ブロモフェノールブルー、 １０％グリセロール）中に溶解した。細胞溶解物の蛋白質を、還元条件下で、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲル中の蛋白質をニトロセルロ ースフィルターに転写した。フィルターを、５％のウシ血清アルブミンを含む燐 酸塩緩衝生理食塩水中で温置し、洗浄しそして一次抗体Ｌ９２と共に温置し、洗 浄し、その後、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ二次抗体（ベーリンガー マンハイム）と共に温置し、洗浄し、その後、発色化反応を、Ｈ₂Ｏ₂を加えた メタノール中の４−クロロ−１−ナフトールを用いて行った。 免疫付着（ＩＡ）アッセイ ＩＡアッセイは、本明細書中に記載の如くに行った。要 約すれば以下の通りである。標的細胞を、抗体Ｌ９２と共に３７℃にて９０分間 温置し、洗浄し、次いで、天竺ネズミの補体（ウイタッカー Ｍ．Ａ．、バイオ プロダクツインク、ウオルカーシビレ、メリーランド州）と共に１０分間温置し た。標的細胞及び赤血球を２０分間完全に定着させた後、標的細胞の周りでロゼ ットを形成している赤血球を試験した。 同種異系の全メラノーマ細胞ワクチン（ＭＣＶ） メラノーマ患者は、従来の報告（Ｍｏｒｔｏｎら、１９９２）の如くして、Ｍ ＣＶを用いて免疫化され得る。ＭＣＶは、例えば、使用前に放射線照射されそし て冷凍保存された３つのメラノーマセルライン（Ｍ１Ｏ、Ｍ２４及びＭ１０１） からなる。ＭＣＶを解凍し、洗浄しそしてＢＣＧと混合し、次いで、２週間毎に ３回、その後１年間毎月、その後は３カ月毎に４回、最後は６カ月毎に、皮内に 注射した。 メラノーマ患者及び正常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ） ＰＢＭＣを得るために、ワクチン接種の前（０週）、開始後、月間隔（４及び ８週間）で、患者から採血をした。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ 勾配遠心分離により分離し、そして試験前に冷凍保存した。正常ドナーからのＰ ＢＭＣは、アメリカン レッド クロス（ロサン ジェルス、カリフォルニア州）から入手した。ＢＣＬは、それらのＰＢＭＣをエ プスタイン−バールウイルスで形質転換することにより調製した。 培養培地 １０％の熱非働化ヒトＡＢ血清（イリバイン サイエンティフィック、サンタ アナ、カリフォルニア州）を補ったＰＲＭＩ １６４０を、以下の実施例にお いて培養培地として用いた。 モノクローナル抗体 ヒトＩｇＭモノクローナル抗体Ｌ９２及びＬ６１２（抗ガンスリオシド ＧＭ₃ ）を、発明者の研究室においてクローン化しそして精製した。マウスＩｇＧモ ノクローナル抗体 抗ＨＬＡクラスＩ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及 び抗ＣＤ８は、ＡＭＡＣ インク（ウェストブック、メーン州）から購入した。⁵¹ Ｃｒ標識された標的を、エフェクター細胞の添加の前に、抗クラスＩ、抗ＨＬ Ａ−ＤＲ、Ｌ９２又はＬ６１２と共に３７℃で１時間予備温置した。エフェクタ ー細胞は、標的の添加前に、抗ＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８と共に、１時間予備温 置された。それらの抗体は、６時間−細胞毒性アッセイにて１０μｇ／ｍｌの最 終濃度にて用いられた。結果は、スチューデントのｔ検定によって、統計上の有 意性について評価した。 以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すため のものである。本発明の実施において満足に機能するように発明者によって見い だされた、実施例中に開示された以下に示された技術は、その実施において好ま しい様式を構成すると考えられ得るということが本技術分野の熟練者によって認 識されるベきである。しかしながら、本技術分野の熟練者は、ここに示された開 示を考えれば、多くの変更が、開示された特定の実施態様において成されること ができ、そして本発明の考え及び範囲のから外れることなしに同様の又は類似の 結果を得ることができるということが認識すベきである。 実施例１ 免疫化学的分析 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２と反応性である抗原分子を同定するために、免疫化学的分 析の２つの方法を行った。これらは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によ る蛋白質溶液の分離、引き続くウエスタンブロット分析を含み、ウエスタンブロ ット分析においては、蛋白質は、ニトロセルロースフィルターに転写され、そし て発色反応を起こしうる他の抗体に結合された抗体と反応させられる。また抗原 は、ＥＬＩＳＡ反応に付され、該ＥＬＩＳＡ反応においては、ペプチドが、マイ クロタイタープレートウェル中に置かれ、そして抗体（この抗体は、次いで、第 二の、指標抗体と反応させられる）と反応させられる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド／ウエスタンブロット分析 ヒトメラノーマセルラインＭ１４及びＭ１２、及びヒト胎児脳細胞を、ウエス タンブロッティングにおいて、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２との反応性についてテストし た。２つの異なる培地添加物、即ち、ＦＣＳ及びヒトＡＢ血清を、Ｍ１４メラノ ーマセルラインの場合に用いた。溶解物を分離するために、細胞を、ＮＰ−４０ 、ＳＤＳ及びデオキシコール酸を含む溶解溶液中に溶解した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に続いてウエスタンブロット分析を、Ｈ ｕＭＡｂ Ｌ９２に反応性の抗原分子を検出するために行った。５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８、５％β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０． １％ＢＰＢ、１０％グリセロール）中の試料蛋白溶液を５分間沸騰させた。蛋白 質分離は、４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル中で行った。蛋白質は、ニ トロセルロースフィルターに転写され、次いで、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２そしてパー オキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（ベーリンガー マンハイム、インディ アナ州）と、その順に反応させられた。発色化反応は、基質として４−クロロ− １−ナフトールを用いて行った。 得られたブロットにおいて、一つの分離されたバンドが、各細胞溶解物に見ら れた（図１Ａ）。対照の実験において、関連性のない、精製されたヒトＩｇＭが 、同じ細胞溶解物に対してテストされた（図１Ｂ）。対照ゲル上には、対応する バンドは検出されなかった。反応性蛋白質の分子量は、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのその移動度に基づいて、４３ｋＤと判断された。ヒト血清 培地中で生育したＭ１４メラノーマ細胞から得られた細胞溶解物は、同じバンド を示し、このことは、蛋白質が培養培地中のＦＣＳから由来するものではないと いうことを示している。ＥＬＩＳＡ分析 ペプチドＥＬＩＳＡは、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）プレート（ピアス） にて、仕様書に従って行った。要約すれば以下の通りである。合成ペプチドを、 ０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ ｐＨ７．２中に溶解し、そして ＥＬＩＳＡプレートに添加して（１００μｌ／ウェル）、４℃にて１晩温置した 。次いで、ＥＬＩＳＡを、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２又はＬ６１２と共に、パーオキシ ダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて行った。発色は、ｏ−フェニレンジア ミン（ＯＰＤ、シグマ ＵＳＡ）を用いて行い、そして４９０ｎｍにて、ＥＬＩ ＳＡリーダーにて計測した。 実施例２ 免疫沈降 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２に反応性の蛋白質分子を同定するために、インビボにて³⁵ Ｓメチオニンで標識した蛋白質の間接免疫沈降を行った。要約すれば以下の通り である。Ｍ１４メラノーマ細胞を、Ｔ２５培養フラスコ（コースター） を用いて、１０％のＦＣＳを補ったＰＲＭＩ １６４０培地中にて培養し、それ らを、７０％密集まで達成させた。次いで、メチオニンを欠いたＰＲＭＩ １６ ４０培地（シグマ Ｒ７１３０）を１リットルの２回蒸留水に溶解し、それにグ ルタミン酸（０．０２ｇ／Ｌ）、リジン（０．０４ｇ／Ｌ）、ロイシン（０．０ ５ｇ／Ｌ）及び２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを加えてなる培地調製物を用いて、 細胞を２回洗浄した。更に１０％の透析ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を補ったこ の調製物の２ｍｌをフラスコに入れ、引き続き、１．８５ＭＢｑの³⁵Ｓ−メチオ ニン（アマーシャム）と共に４時間温置した。細胞を収穫し、そして２回ＰＢＳ で洗浄した後、細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．０１％ＳＤＳ、１００μｇ／ ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１％ＮＰ−４０及び０ ．５％デオキシコール酸ナトリウムを含む溶解緩衝液の１００μｌを用いて溶解 した。 細胞溶解物の４０μｌを、溶解緩衝液を用いて３００μｌに希釈した。希釈さ れた溶解物を、２０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＭ−ビオチン（ベーリンガー）と共に 氷上に１時間置くことにより予備浄化し、次いで、１００μｌのストレプトアビ ジン−アガロース（シグマ）と共に更に１時間置いた。上清を遠心分離により集 め、そして３つに分けた。その内の一つを、１０μｇのＨｕＭＡｂ Ｌ９２と共 に温置した。２つめは、ＨｕＭＡｂ Ｌ６１２（関連性のない 抗体）と共に温置し、３つめは、抗体無しで氷上にて１時間温置した。１０μｌ の抗ヒトＩｇＭ−ビオチンを、３つに分けたもののそれぞれを加え、そして更に １時間温置した。次いで、１０μｌのストレプトアビジンアガロースを、３つに 分けたもののそれぞれを加え、そして更に１時間温置した。抗原−抗ＩｇＭ−ビ オチン−ストレプトアビジン−アガロース複合体を、遠心分離により沈殿させ、 そして１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、引き続き、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．０）及び１％のＮＰ−４０の１ｍｌで洗浄した。免疫沈降物は、還元 条件下で、４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲルを用いて分析した。 ゲルは、Ａｍｐｌｉｆｙ（商標）（アマーシャム）を用いて処理し、オートラジ オグラフィーを行った。 実施例３ 発現ライブラリーの構築 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２免疫ポジティブ蛋白質をエンコードするｃＤＮＡクローン を単離するために、Ｍ１４細胞からのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、λｇｔ１１ 組み換えファージ系を用いて構築した。約６×１０⁵ファージをスクリーニング し、そして２つのポジティブクローンを得た。その内の一つをその後の分析のた めに選択した。 要約すれば以下の通りである。Ｍ１４細胞を、１０％ＦＣＳ及び抗生物質（Ｇ ＩＢＣＯ、ニューヨーク）を補ったＰＲＭＩ−１６４０培地中で培養した。全Ｒ ＮＡを、５× １０⁸のＭ１４細胞から、グアニジンイソチオシアネートを用いて単離した（Ｃ ｈｉｒｇｗｉｎ ＪＭら、１９７９）。ポリＡ⁺ＲＮＡは、ポリＡ Ｔｒａｃｔ （商標）ｍＲＮＡアイソレーション システム（プロメガ）を用いて調製した。 ｃＤＮＡは、Ｃｏｐｙ（商標）Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて調製した。 両末端へのＥｃｏＲＩアダプターの連結の後、ｃＤＮＡを、λｇｔ１１ファージ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位中に挿入した。インビトロパッケージングを、Ｇｉｇａ ＰａｋIIＧｏｌｄ（ストラテジーン）を用いて行った。ライブラリーは、クスリ ーニングの前に固相培地上でいったん増幅させた。 実施例４ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０を、０．２％マルトース及び０．５％ＭｇＳＯ₄を 補ったＬＢブロス中で３７℃にて、ＯＤ６００が０．５に達するまで培養した。 細胞を集め、そして元の容量の半分の容量の１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄中に懸濁した 。細胞を、実施例IIIのファージライブラリーで感染させ、そしてＬＢアガープ レート上に播いた（１５０ｍｍのプレート当たり約２０、０００プラーク）。プ レートを４２℃にて３．５時間温置した。１０ｍＭ ＩＰＴＧ中に含浸させたニ トロセルロースフィルターをプレート上に置いた後、それらを３７℃にて更に４ 時間温置した。次に、フィルターをＨｕＭＡｂ Ｌ９２及びパーオキシダーゼ結 合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて免疫染色した。発色化反応は、４−クロロ−１ −ナフトールを用いて行った。フィルター上のポジティブなシグナルに対応する プラークを、アガープレートから除き、ファージストックを調製するために溶出 した。スクリーニング手順を、免疫ポジティブな組み換えバクテリオファージの 均質な集団が得られるまで繰り返した。 実施例５ ｃＤＮＡ挿入物の配列決定 クローン化されたＤＮＡを特徴付けするために、挿入ＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔII（ストラタジーン）のＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン化すること を試みた。しかしながら、挿入ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ消化によっては単離されな かった。それ故、全ファージＤＮＡを、ＤＮＡ配列を決定するための鋳型として 用いた。組み換えλｇｔ１１ファージ中のｃＤＮＡ挿入物の部分ヌクレオチド配 列を、ダブル ストランド ＤＮＡ サイクル シークエンシング システム （ＢＲＬ）ガイザースバーグ、メリーランド州）を用いて決定した。 図４に示されている如く、このクローンは、ＥｃｏＲＩ部位において１塩基の 欠失を有し、これがプラスミドのＥｃｏＲＩ部位中への挿入物のサブクローン化 を不可能にした。このクローンの挿入ＤＮＡは、１．４ｋｂｐであるけれども、 それは、ＥｃｏＲＩリンカー配列の後に、わずか の、ひとつの１０アミノ酸オープンリーディングフレームを有している。しかし ながら、挿入物のオープンリーディングフレームとジーンバンクに報告されたＤ ＮＡ配列との間の相同性検索は、意味のある相同性を示さなかった。 実施例６ 蛋白質−ペプチド融合物のバクテリアでの発現 クローン化されたｃＤＮＡの抗原性を決定するために、それを、Ｅ．ｃｏｌｉ 溶原菌系にてβ−ガラクトシダーゼを有した融合蛋白質として発現させ、そして その組み換え蛋白質をウエスタンブロットにて分析した（図３）。３２℃にて１ 晩培養された、５０μｌの組み換えファージ溶原菌を、５ｍｌのＬＢ／アンピシ リン液培地中にて温置し、そして振とうしながら３２℃にて培養した。ＯＤ６０ ０が０．５に達したとき、温度を４２℃に上げ、１０分間置いた。イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、最終濃度１ｍＭにて培養物に加えた 。細胞を３７℃にて２時間培養し、遠心分離を用いて収穫し、そしてＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにて分析した。 ＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、ウエスタンブロットにおいて、１０６ｋＤにてバンド と反応した（図３、レーン１）。対照実験（ＩＰＴＧ誘導なし）から得られた溶 解物は、このバンドを示さなかった（レーン２）。レーン３において、β−ガラ クトシダーゼは、ＣＢＢ染色にて明瞭なバンドを示した。しかしながら、このバ ンドは、ＨｕＭＡｂ Ｌ９ ２には結合しなかった。これらのデータは、β−ガラクトシダーゼ−ペプチド融 合物のｃＤＮＡ部分から由来するアミノ酸がＨｕＭＡｂ Ｌ９２に対して抗原性 を示すということを示している。 実施例７ クローン化されたオリゴペプチドの抗体認識 オリゴペプチドを、ｃＤＮＡから推測されたアミノ酸配列に基づいて合成し、 そして、組み換え蛋白質−ペプチド融合物及びＭ１４細胞溶解物に対するＨｕＭ Ａｂ Ｌ９２の結合を阻害する能力についてテストした。ＨｕＭＡｂＬ９２は、 ５００倍のモル濃度の過剰の１４アミノ酸ペプチド（ＤＳＲＰＱＤＬＴＭＫＹＱ ＩＦ、配列番号２）と共に予備温置された。このペプチド配列は、ｃＤＮＡオー プンリーディングフレーム由来のアミノ酸配列及びＥｃｏＲＩアダプター由来の 追加の４つのアミノ酸を含む。１４アミノ酸ペプチドと共に予備温置されなかっ たＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、蛋白質−ペプチド融合物及びＭ１４細胞抽出物の両者 と、それぞれ１０６ｋＤ及び４３ｋＤにて、別のバンドを形成した（図５Ａ）。 しかしながら、ペプチドと共に予備温置されたＨｕＭＡｂ Ｌ９２は、反応性に おいて著しい減少を示し、ウエスタンブロット上にぼんやりしたバンドのみ形成 した（図５Ｂ）。 ｃＤＮＡオープンリーディングフレームに対応する１０アミノ酸ペプチド（Ｑ ＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号１） は、ウエスタンブロット分析において、蛋白質−ペプチド融合物及びＭ１４細胞 溶解物に対するＨｕＭＡｂ Ｌ９２の類似の結合阻害を示した。１０アミノ酸ペ プチドに対するＨｕＭＡｂ Ｌ９２の直接結合反応をまた、ＥＬＩＳＡアッセイ により試験した。強力なかつ特異的な反応が、ウェル当たり１μｇのペプチドを 用いて示された（図６）。これらの結果は、１０アミノ酸オリゴペプチドが、Ｈ ｕＭＡｂ Ｌ９２に対する抗原性を有することを示している。 更に、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の抗原性エピトープに対して要求される最小の長さ を決定するために、１０アミノ酸の免疫反応性ペプチド配列（配列番号１）から 端を切り取ったいくつかのＧＳＴ−融合ペプチドを、合成オリゴヌクレオチド及 びベクターとしてｐＧＥＸ−２Ｔを用いて調製した。Ｃ末端からの１アミノ酸残 基の切り取りは、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に影響しなかったが（図１４Ｂ）レ ーン３）、２つのＣ末端アミノ酸残基の除去は、完全に抗体結合を欠失させた（ レーン４）。１０アミノ酸ペプチドのＮ末端からの６アミノ酸残基の欠失は、Ｈ ｕＭＡｂ Ｌ９２の結合に影響しなかった（レーン７）が、７つのＮ末端アミノ 酸の除去は、抗体結合を欠失させた（レーン８）。これらの結果は、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２の最小の抗原性エピトープが、４アミノ酸ペプチド（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ− Ｇｌｎ−Ｉｌｅ、配列番号８）であることを示している。 実施例８ メラノーマ細胞中の４３ｋＤ蛋白質の局在 ４３ｋＤ蛋白質が細胞表面上に発現されているか又は細胞内に留まっているか を決定するために、ＨｕＭＡｂ Ｌ９２を、完全なＭ１４細胞を用いて吸収し、 次いで、ウエスタンブロット分析において、組み換え蛋白質−ペプチド融合物及 び４３ｋＤ蛋白質に対して反応させた（図７）。Ｍ１４細胞溶解物の４３ｋＤ蛋 白質及び＃８１０溶原菌の１０６ｋＤ蛋白質の染色の強度は、完全なＭ１４細胞 を用いた抗体の吸収の後、ほんの僅かに減少した。この結果は、４３ｋＤ蛋白質 が、Ｍ１４細胞表面上にかなりの量で発現されているのではないということを示 唆している。しかしながら、他のメラノーマセルラインの引き続く分析は、細胞 表面上の４３ｋＤ蛋白質の密度が、セルライン間で大きく変化するということを 示した。例えば、ＵＣＬＡＳＯＭ２５セルライン（Ｒａｖｉｎｆｒａｎａｔｈ ＭＨら、１９８９）は、テストした２０のヒトメラノーマセルラインの中で、最 も高い程度で細胞表面上に４３ｋＤ蛋白質を発現した。 インサイチュハイブリダイゼーション ＃８１０ペプチド、配列番号２のｍＲＮＡと相補的な合成オリゴデオキシヌク レオチドを、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）を用いて末端標識し、 そして細胞のパネル中のｍＲＮＡを検出するために用いた。インサイチュハイブ リダイゼーションは、（Ｍｏｒｉｓａｋｉら、１ ９９２）の記載に従って行った。ガラススライド上に固定された細胞を、脱イオ ン化したホルムアミド、２０倍の標準クエン酸生理食塩水、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶 液、熱変性され剪断されたニシンの精子ＤＮＡ、酵母のトランスファーＲＮＡ及 び硫酸デキストランを含有する溶液中で、４２℃にて１時間予備ハイブリダイゼ ーションした。＃８１０アンチセンスプローブ（５’−ＡＡＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＴＡ ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＧ−３’、配列番号 ３、モレキュラー バイオロジー インスチュート、ＵＣＬＡ スクール オブ メディシン、ロサンジェルス、カリフォルニア州）を、ジゴキシゲニン−１１ −ｄＵＴＰ（ベーリンガー マンハイム、インディアナポリス、イリノイ州）を 用いて、ＤＮＡ ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー マンハイム）を使用 して、尾−標識した。ネガティブ対照を、反応においてテスト（アンチセンス） プローブに対して相補的である＃８１０センスプローブを用いることにより行っ た。ヒト繊維芽細胞のβ−アクチンに特異的な２７マーのオリゴヌクレオチドプ ローブ（５’−ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＴＣ Ａ ＴＣ ＡＴＣ−３’、配列番号４、クローンテック ラボラトリーズ インク、 パロ アルト、カリフォルニア州）を、ポシティブ対照のために用いた。ジゴキ シゲニン標識されたプローブを、細胞上におき、そして１晩、４２℃にて温置し た。＃８１０ペプチドｍＲＮＡを含む細胞は、Ｇｅｎｉｕｓ非放射性核酸検出キ ット （ベーリンガー マンハイム）を用いて検出された。スライドを、２％正常ヒツ ジ血清及び０．３％トリトンＸ−１００と共に、室温にて３０分間温置した。抗 ジゴキシゲニン抗体を、室温にて３時間、細胞に適用した。ニトロブルーテトラ ゾリウム、Ｘ−燐酸溶液及びリバミソール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）を含む溶液 を、室温にて細胞の上におき、それらが満足な色に発色するまでおいた（２〜５ 時間）。 インサイチュハイブリダイゼーションは、＃８１０ペプチドのｍＲＮＡが、メ ラノーマ、非メラノーマ腫瘍及び更に正常リンパ球にて普通に発現されることを 示した（表１）。図８は、代表的なメラノーマセルラインを示す。＃８１０アン チセンスプローブを用いたハイブリダイゼーションが、単一の細胞レベルにおい て濃い染色を明らかにしたのに反し、センスプローブの使用は、染色を全く示さ ず、このことはプローブ特異性を示している。ウエスタンブロッティングは、＃ ８１０アミノ酸配列の配列を含む４３ｋＤ蛋白質が、＃８１０のｍＲＮＡを発現 する同じ細胞中で検出され、従ってこの蛋白質の存在は、メラノーマに特異的で ないということを明らかにした。しかしながら、その局在は、細胞のタイプ間で 変化し、高密度の４３ｋＤ蛋白質は、ある種のセルライン（Ｍ１２、Ｍ２５、Ｓ ＨＮ等）の細胞表面に局在されているが、それは、他の種類（Ｍ１４、Ｍ２４、 正常リンパ球等）の表面上では検出されず、これらの結果はまた、それらの細胞 を用いた抗体吸収アッセイ によっても証明された。それらの細胞の組織学及び４３ｋＤ蛋白質の細胞内局在 の間の関係は、まだ明らかでない。 実施例９ ペプチドワクチン そのアミノ酸配列の一部として、配列番号１に従った配列を含むペプチドは、 ガン患者において、抗腫瘍の体液性の及び細胞仲介性の免疫応答を誘発するのに 有効なワクチンとして臨床上非常に重要であり得る。発明者等の結果は、合成ペ プチドが、メラノーマ細胞ワクチンを投与されたメラノーマ患者のリンパ球の増 殖を刺激するばかりでなく、自系メラノーマ細胞に対してインビトロで細胞毒性 Ｔ細胞を誘発する能力を有することを示した。 本技術分野において良く知られているように、所与のポリペプチドは、その免 疫原性が変化しうる。それ故、免疫原（例えば、本発明のポリペプチド）を担体 と結合することがしばしば必要である。代表的な及び好ましい担体は、キーホー ル カサガイ ヘモシアニン（ＫＬＨ）及びヒト血清アルブミンである。他の担 体は、種々のリンホカイン及びアジュバンド、例えばＩＮＦ、ＩＬ２、ＩＬ４、 ＩＬ８等を含みうる。 ポリペプチドを担体蛋白質に結合する手段は、本技術分野において良く知られ ており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク シニミドエステル、カルボジイミド及びビス−ジアゾ化ベンジンを含む。ペプチ ドは、本技術分野で良く知られれた遺伝子工学技術により、蛋白質に結合させら れることもまた理解される。 また、本技術分野で良く知られた如く、特定の免疫原に 対する免疫原性は、アジュバンドとして良く知られた、免疫応答の非特異的刺激 剤を用いることによって促進されうる。代表的な及び好ましいアジュバンドは、 完全なＢＣＧ、Ｄｅｔｏｘ（ＲＩＢＩ、イムノケム リサーチ インク）ＩＳＣ ＯＭＳ及びアルミニウムヒドロオキサイドアジュバンド（スーパーホス、バイオ セクター）を含む。 活性成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は、一般に、米国特許第４ ６０８２５１号、４６０１９０３号、４５９９２３１号、４５９９２３０号、４ ５９６７９２号及び４５７８７７０号明細書によって例証されるように本技術分 野にて良く理解されている（これらの明細書は全て、引用することにより本明細 書の一部である）。典型的には、このようなワクチンは、注射可能なようにして 、つまり、液溶液又は懸濁液のいずれか、注射に先だって液に調製されうる溶液 又は懸濁液に適した固体形にて調製される。調製物はまた、乳化されても良い。 活性免疫原性成分は、しばしば、医薬的に許容されかつ活性成分と適合する賦形 剤と混合される。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、 グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。更に、所望により 、ワクチンは、ワクチンの有効性を高める、少量の助剤、例えば、加湿薬又は乳 化剤、ｐＨ緩衝化剤、又はアジュバンドを含みうる。 ペプチドは、中性又は塩の形態にてワクチンへと製剤化されうる。医薬的に許 容される塩は、（ペプチドの遊離のアミノ基と共に形成される）酸性付加塩、及 び無機酸、例 えば塩酸又は燐酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と共に 形成されるものを含む。遊離のカルボキシル基と共に形成された塩はまた、無機 基材、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第 二鉄、及び有機基材、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチ ルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から由来しうる。 ワクチンは、処方投与量に適合した方法にて、そして治療的に有効なかつ免疫 抗原性を示す量にて投与される。投与されるベき量は、処置されるベき患者、例 えば、応答のための個人の免疫系の能力に依存する。投与が要求される活性成分 の正確な量は、処置医の判断に依存する。開始の投与及び追加抗原投与に適した 処方もまた変えることができるが、最初の投与、引き続く接種又は他の投与が典 型的である。 適用方法は、大きく変更されうる。ワクチン投与のための慣用の方法のいずれ も適用可能である。これらは、固形の生理学上許容されうる基材中または生理学 的に許容されうる分散剤中での経口投与、腸管外投与、注射等を含むと考えられ る。ワクチン投与量は、投与経路に依存し、個々の特定の患者に対する処置医の 決定に従って変化する。 実施例１０ 診断免疫アッセイ及び皮膚テスト 効果がある特定の免疫療法の間の、患者における特定の 体液性の及び細胞性の免疫応答の程度を測定する免疫アッセイは、本発明の開示 の観点より開発されうる。本発明のペプチド及び蛋白質は、免疫療法におけるイ ンビボ でのそれらの免疫原性及び治療効果について評価されうる。種々の体液性 及び細胞仲介性アッセイが、臨床応答を予想すべく、最大の能力を持った系を明 らかにするために開発された。体液性アッセイは、免疫付着、膜蛍光抗体法、Ｆ ＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイを含む。 例えば、本発明者らは、ガン患者及び正常健康ドナーからの血清が、ペプチド ＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ、配列番号１及びペプチドＫＹＱＩ、列番号８に反応性で あるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含んでいることを示した。それ故、ペプチドは、本 明細書中で議論したＣＴＬ応答に加えて、体液性の免疫応答を誘発するために用 いられ得る。１０アミノ酸ペプチド、配列番号１はまた、遅延型の過敏性を誘発 すると判った。メラノーマ患者に、１０〜２０μｇのペプチドを皮内注射したと ころ、ＤＴＨ応答が観察された。テストした２５の患者中、１０がポジティブな 応答を示した。従って、１０アミノ酸ペプチド、配列番号１は、抗原に対する免 疫応答をモニターするために及び疾患の予後のために、皮膚テスト抗原として有 用である。 それ故、本発明の開示の観点より、合成ペプチド抗原が、これらの新たに発見 された抗原によって誘発される免疫応答及び臨床上の応答を予期する能力を有す る、より正確な血清学的アッセイ及び皮膚テストの確立ために用いられ得 る。 実施例１１ 完全長遺伝子を単離するためのｃＤＮＡの使用 抗原性蛋白質の完全長ペプチド分析は、抗原エピトープの位置を決定するため 、４３ｋＤ蛋白質内の交差反応性抗原のための他の部位を捜すために、及び疾患 についてのその生物学的機能及び病原性の有意性を評価するために重要である。 クローン化されたｃＤＮＡ＃８１０の配列は、４３ｋＤ蛋白質をエンコードする 完全長の遺伝子を単離するためのプライマー又はプローブとして有用である。完 全長遺伝子の単離を成すための技術は、本技術分野において良く知られている。 例えば、ゲノムライブラリーは、良く知られた技術によって構築され、そして ｃＤＮＡクローン＃８１０を用いてスクリーニングされうる。ライブラリーは、 例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はアガロースゲル電気泳動によっ て分離されて、その後フィルター、例えばニトロセルロースフィルターに転写さ れる。次いで、クローン＃８１０は、例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用い た酵素的標識によって³²Ｐで標識される。クローンはまた、放射性標識されたヌ クレオチドを含んでいる、ニックトランスレーションによって又はポリメラーゼ 連鎖反応にて放射活性的に標識されうる。或いは、プローブが、蛍光マーカー、 例えばビオチン又は他の蛍光体を用いて標識されうる。 このような標識化技術は、本技術分野において良く知られている。 その後、標識されたプローブは、フィルター上にて変性されたＤＮＡに対して ハイブリダイズされ、そして更に厳しい条件、例えば増加したより高い温度のも とで、ポジティブなクローンが、オートラジオグラフィー又は蛍光によって同定 されうるまで洗浄される。その後、これらのポジティブなクローンは、再スクリ ーニングされ、そして４３ｋＤ蛋白質をエンコードする完全長の遺伝子配列を決 定するために配列決定される。 その後、完全な蛋白質が、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株中で発現され、そして更な る分析に用いられることができる。蛋白質はまた、例えば、部位接定突然変異誘 発によって端が切り取られたり又は変えられたりすることができ、そしてこのよ うに変えられた蛋白質又は部分配列もまた、本発明の範囲内であるということが 理解される。 実施例１２ 抗原に対するＣＴＬ応答 細胞毒性アッセイ 標準⁵¹Ｃｒ放出アッセイを、前記（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９２）した如く行 った。メラノーマセルラインを、収穫し、そして１００μＣｉ⁵¹Ｃｒ（アマーシ ャム、アーリングトン ヘイツ、イリノイ州）を用いて、３７℃にて２時間標識 し、そして標的として用いた。標識された標的を 洗浄し、そして培養培地中に再懸濁し、底が丸い９６ウェルのマイクロタイター プレート中に、５×１０³細胞／ウェルにて播き、次いでエフェクター細胞を加 えた。全てのアッセイ（２００μｌ／ウェル）は、３連試験にて行った。温置の ６時間後、上清を１００μｌ回収しそしてカウントを測定した。特異的細胞溶解 の％を、以下の如く算出した：特異的細胞溶解（％）＝１００×（実験的な放出 −自然の放出／５％トリトンＸでの放出−自然の放出）。 ペプチド実験のために、ＢＣＬを、１０μＭのペプチドを用いてパルスし、同 時に１００μＣｉ⁵¹Ｃｒを用いて３７℃にて２時間標識し、そして標的として用 いた。８０：１のＥ：Ｔでのポジティブな又はネガティブな応答を定義するため に、１７％の溶解を閾値とした。この値は、以下の理由より選ばれた。この値は 、２つのネガティブな対照、つまり、ペプチド＃８１０、配列番号１でパルスさ れた自系ＢＣＬについてテストされた１９の対照の正常ドナーからのＰＢＭＣ（ 平均より上３ＳＤ＝１６．９％）、及び培地のみ又は関連性のないデカペプチド でパルスされた自系ＢＣＬについてテストされた１９のメラノーマ患者からのＰ ＢＭＣ（平均より上３ＳＤ＝１６．５％）から得られた細胞溶解における平均よ り上の３ＳＤであった。 １９の患者及び１９の対照正常ドナーの代表的なデータを図９Ａに示す。０、 ４及び８週において、患者のＰＢＭＣは、自系の＃８１０配列番号１でパルスさ れたＢＣＬのポジティブな細胞溶解（８０：１のＥ：Ｔにおいて１７％ 以上）を示したが、一方、正常ドナーのものは示さなかった。ペプチドなしでの 自系ＢＣＬの溶解は、いずれのエフェクターによっても７％を超えなかった。３ 連の培養物の平均ｃｐｍ±ＳＤを図９Ｂに示す。４及び８週において、＃８１０ 、配列番号１ペプチド０．００１〜２０μＭを有する患者のＰＢＭＣの値は、＃ ８１０、配列番号１なしのものより著しく高く（ｐ＜０．００５）、最大のＳＩ は、４及び８週において、それぞれ、２．７１及び２．８７であった。それに対 して、＃８１０、配列番号１に対する重要な増殖性の応答は、ワクチン接種前（ ０週）及び対照ドナーにおいては観察されなかった。 増殖性アッセイ ＰＢＭＣ（１×１０⁵細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中に播き、ペプ チドを所望の濃度にて加え、そして培養培地にて全量を２００μｌ／ウェルとし た。トリチウム化チミジン（［³Ｈ］ＴｄＲ）（０．５μＣｉ／ウェル、アマー シャム アーリングトン ヘイツ、イリノイ州）を、４日間の培養の最後の１８ 時間に加えた。培養物は、３連試験で設定し、そしてブランダルセルハーベスタ ーを用いて収穫し、次いでベックマン シンチレーション カウンターにてカウ ントを測定した。刺激インデックス（ＳＩ）は、以下のようにして算出した：［ ペプチドを加えた３連培養物の平均ｃｐｍ／ペプチド無しでの平均ｃｐｍ］。種 々の濃度のうちでの最大ＳＩが２．０以上のものは、ペプ チド＃８１０、配列番号１に対してポジティブな応答であると定義した。なぜな ら、その値が、２つのネガティブな対照、つまり、ペプチド＃８１０、配列番号 １でテストされた１９の対照ドナーからのＰＢＭＣ（平均より上３ＳＤ＝１．９ ７）、及び関連性のないデカペプチドでテストされた１９のメラノーマ患者から のＰＢＭＣ（平均より上３ＳＤ＝１．３７）から得られる最大ＳＩの平均より上 ３ＳＤであるからであった。 ワクチン接種されたメラノーマ患者からのＰＢＭＣを、ペプチド＃８１０認識 について分析し、その結果を、種々の期（０、４、８週）において比較し、そし てまた対照の通常ドナーの結果と比較した。１９のメラノーマ患者の内の１６（ ８４．２％）において、ワクチン接種の前又は接種後のいずれかで、ＰＢＭＣは 、＃８１０ペプチド、配列番号１でパルスされた自系ＢＣＬを認識し溶解したが 、一方、１９の正常ドナーについてはたった２人（１０．５％）からのＰＢＭＣ が、このような細胞毒性を示した（表２、図９Ａ）。この細胞毒性は、＃８１０ ペプチド、配列番号１に特異的である。何故なら、患者及び正常ドナーからのＰ ＢＭＣは、ペプチドでパルスされていない又は関連性のないアミノ酸配列のデカ ペプチドでパルスされた自系ＢＬＣは溶解できなかった。メラノーマ患者のこの ような＃８１０、配列番号１特異的な細胞毒性は、１５の患者（７８．９％）に おいて、ワクチン接種後に増加した。殆どの場合において、活性が４週にて最も 高く８週ではかなり減少したが、しかし、それでもまだそれは、ワクチン接種前 のレベルより高かった。 メラノーマ患者からのＰＢＭＣはまた、＃８１０、配列番号１への増殖性応答 を示した。だが、応答の強さは、細胞毒性アッセイのそれより弱かった（図９Ｂ ）。１３の患者（６８．４％）において、ペプチドで刺激されたＰＢＭＣの［³ Ｈ］ＴｄＲの取り込みが、＃８１０、配列番号１なしの場合に比べ２倍超に増加 し、そしてこのような増殖 性応答は、１２の患者（６３．２％）において、ワクチン接種後に著しく高めら れた。この応答はまた、＃８１０、配列番号１に特異的であった。何故なら、患 者のＰＢＭＣを関連性のないデカペプチドと共に温置した場合は、この応答は観 察されなかったからである。 それらの結果は、メラノーマ患者からのＰＢＭＣのみが、ワクチン接種前です ら、インビボにおいて、＃８１０、配列番号１に潜在的に感受性でありうり、そ してこのペプチドに対する細胞性免疫応答がインビトロにおいて再生されうると いうことを示唆しており、このことは、自系メラノーマ細胞が、＃８１０、配列 番号１を特異的に表しうるということを示している。ワクチン接種の増大効果は 、同種異系のメラノーマ細胞であるＭＣＶもまた、患者のリンパ球に、＃８１０ 、配列番号１を表し、このペプチドに対する特異的な応答を高めうるということ を示唆している。対照的に、正常ドナーのＰＢＭＣは、＃８１０、配列番号１は 通常体細胞中に存在するけれども、インビボでは、それに感受性でないかもしれ ない。 実施例１３ 配列番号１のペプチドを用いたインビトロでの再刺激効果 ＭＣＶ免疫化後４週のメラノーマ患者からのＰＢＭＣ（３×１０⁶／ウェル） を、３７℃にて、２４ウェルプレート中の２ｍｌの培地中にて、１０μＭの＃８ １０、配列番号１で刺激した。温置の５日後に、細胞を収穫しそして 細胞毒性についてアッセイした。 ワクチン接種の４週後、患者ＡからのＰＢＭＣを、インビトロで、＃８１０、 配列番号１を用いて再刺激し、そして、自系の＃８１０、配列番号１でパルスさ れたＢＣＬ及びメラノーマＭＡ標的の細胞溶解についてアッセイした（図１０） 。□及び○は、培地のみを用いて培養された対照ＰＢＭＣの細胞毒性を示してい る。ペプチドなしの又は関連性のないデカペプチドでパルスされた自系ＢＣＬの 溶解は、いずれのエフェクターによっても、８０：１のＥ：Ｔにて、８％を超え なかった。＃８１０、配列番号１で再刺激されたＰＢＭＣ及び対照による、８０ ：１のＥ：ＴでのＫ５６２の溶解は、それぞれ、２４．０及び２４．５％であっ た。データは、３つの別々の実験を代表したものである。 コールド標的阻害アッセイ 標識されていないコールドの標的細胞（５０μｐｌ）を、適当な濃度にて、９ ６ウェルプレートに播いた。エフェクター細胞（１００μｌ）をウェルに加えて ３７℃で１時間温置し、その後、⁵¹Ｃｒで標識されたホットな標的細胞を所望の コールド：ホット標的比になるように添加した。 患者ＡからのＰＢＭＣを、図１０と同じようにして、＃８１０、配列番号１を 用いて再刺激し、そして、自系の⁵¹Ｃｒで標識された、＃８１０、配列番号１で パルスされたＢＣＬ（図１１Ａ）及びメラノーマＭＡ（図１１Ｂ）の細 胞溶解について、２０：１のＥ：Ｔにて、アッセイした。非標識コールド標的細 胞を、提示の比にて加えた。ペプチドなしのＢＬの溶解は、２０：１のＥ：Ｔに て３．０％であった。データは、４つの別々の実験を代表したものである。 ＃８１０、配列番号１で再刺激されたワクチン接種された患者ＡからのＰＢＭ Ｃは、ペプチドなしで培養された対照（１８．０％）に比べて、自系の＃８１０ 、配列番号１でパルスされたＢＣＬに対する細胞毒性において３倍超の増加を示 した（６７．３％、Ｅ：Ｔ＝４０：１）（図１０）。このような細胞毒性は、＃ ８１０、配列番号１特異的であり、非特異的なリンホカインで活性化されたキラ ー（ＬＡＫ）活性とは異なる。何故なら、Ｋ５６２（ＬＡＫ標的）又はペプチド なしの或いは関連性のないデカペプチドでパルスされた自系ＢＣＬに対する死滅 活性は増加しないからである。更に、この＃８１０、配列番号１での再刺激は、 同時に、自系メラノーマ細胞に対する死滅活性を高める。これらの結果は、同一 の＃８１０抗原、配列番号１が、＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬと 同様に、自系メラノーマ細胞の表面上に存在する可能性があり得ることを示して いる。その可能性は、コールド標的阻害テストにより調査された。コールドの自 系メラノーマ細胞は、自系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬの溶解 を阻害するが、標識されていない＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬよ りは有効性が低かった（図１１Ａ）。逆 に、自系の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬは、完全に、自系メラノ ーマの溶解をブロックした（図１１Ｂ）。これらのデータは、＃８１０抗原、配 列番号１が、メラノーマ細胞の表面上に存在しうること及び細胞溶解の標的抗原 として認識されうることを示している。 抗体阻害アッセイ ＃８１０、配列番号１で再刺激された患者ＡからのＰＢＭＣを、自系の＃８１ ０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ及びメラノーマＭＡの細胞溶解について、 ４０：１のＥ：Ｔにて、抗体の存在又は非存在下でアッセイした。各抗体の最終 濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。ペプチドなし及び関連性のないペプチドでパ ルスされた自系のＢＣＬの溶解は、それぞれ、５．４及び５．２％であった。デ ータは、４つの別々の実験を代表したものである。 実施例１４ ペプチド特異的ＣＴＬのＨＬＡ制限 ＨＬＡのタイプ決定 ペプチド＃８１０、配列番号１の認識を制限するクラスＩ決定基を同定するた めに、一連のＨＬＡタイプのメラノーマ患者をテストした（表３）。患者からの ＰＢＭＣを、Ｄｒ．Ｐａｕｌ Ｔｅｒａｓａｋｉの研究室（ＵＣＬＡスクール オブ メディシン、ロサンジェルス、カリフォルニア州）における補体仲介マイ クロ細胞毒性アッセイによ るＨＬＡのタイプ決定のために用いた。 認識の制限 しばしば、ＨＬＡ−Ａ抗原がメラノーマのＣＴＬ認識のための重要な制限的要 素であると論証されているので（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９２）、クラスＩ抗 原のうち、ＨＬＡ−Ａエピトープを選択した。ＨＬＡ−Ａ２＋患者Ａ、Ｂ及びＣ において、インビトロでの＃８１０、配列番号１を用いての再刺激は、自系の＃ ８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ及びメラノーマ標的の両者に対して、 成功裡に、ＣＴＬ活性の増加をもたらした。対照的に、＃８１０、配列番号１で 再刺激されＡ２（−）患者ＧからのＰＢＭＣは、このようなＣＴＬ活性を示さな かった。だが、この患者は、患者ＢとＡ２９を共有していた。これらのことは、 ＨＬＡ−Ａ２が、＃８１０、配列番号１認識について制限要素として働きうると いうことを示唆している。Ａ２（−）患者の内、＃８１０、配列番号１で再刺激 された、患者Ｄ（オール、３０）及びＥ（Ａ２８、３１）からのＰＢＭＣは、＃ ８１０、配列番号１を認識するらしいが、一方、患者Ｆ（Ａ２４、−）Ｇ（Ａ２ ９、−）及びＨ（Ａ２４、３２）からのものはそうではなかった。ＨＬＡ−Ｂ抗 原は、＃８１０、配列番号１認識において、重要な役割を果たしていないようで ある。つまり、＃８１０、配列番号１で再刺激された患者Ａ（ＨＬＡ−Ｂ７＋） 及びＢ（Ｂ４４＋）からのＰＢＭＣは、ペプチド＃８１０、配列番号１ を認識したが、一方、患者Ｈ（Ｂ７＆４４＋）からのものは認識しなかった。こ の結果は、Ａ２及びＡ１１が、患者Ａ〜Ｄにおいて、＃８１０、配列番号１認識 のためのこのような制限要素として機能しうるが、一方、Ａ２４は機能し得ない （患者Ｆ及びＨ）ということを示している。 この可能性を確認するために、＃８１０、配列番号１で再刺激された患者Ｂ（ Ａ２＋）及びＤ（Ａ１１＋）からのＰＢＭＣを、自系及び同種異系のＨＬＡ−Ａ に適合した或いは適合しない、＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬの細 胞溶解についてテストした（図１３）。＃８１０、配列番号１で再刺激されたＡ ２＋患者ＢからのＰＢＭＣは、＃８１０、配列番号１でパルスされた異種同系の Ａ２＋ＢＣＬを溶解したのに対し、Ａ２（−）標的は溶解できなかった。同様に 、＃８１０、配列番号１で再刺激されたＡ１１＋患者ＤからのＰＢＭＣは、＃８ １０、配列番号１でパルスされたＡ１１＋ＢＣＬのみ溶解できたが、＃８１０、 配列番号１なしのＢＣＬ標的は、それらのエフェクターによって溶解されなかっ た。このことは、溶解が、ペプチド特異的であって、異（ａｌｌｏ）−反応性で はないということを示唆している。これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ１１が 、＃８１０、配列番号１認識のための制限要素として働くことができるというこ とを示している。このような制限を、更に、ＨＬＡに適合した又は適合しないメ ラノーマ標的に対して評価した（表４）。Ａ２＋患者（ＡＮＢ）において、＃８ １０、配列番号１での再刺激は、Ａ２＋メ ラノーマ標的に対する細胞毒性を高め、一方、このような増強は、Ａ２（−）メ ラノーマ標的に対しては観察されなかった。同様の結果が、Ａ１１＋患者Ｄにお いて得られた。それらの結果は、メラノーマが、少なくともＨＬＡ−Ａ２及びＡ １１とともにクラスＩ分子と共同して、ＣＴＬに対して＃８１０抗原、配列番号 １を与えうるということを示唆しており、また、＃８１０、配列番号１がメラノ ーマのＣＴＬエピトープとして機能しうることを示している。 ３つの実験を代表するデータを、図１３中に、＃８１０、配列番号１でパルス されたＢＣＬ標的に対する、４０：１のＥ：Ｔでの特異的細胞溶解の％として示 した。エフェクターは、＃８１０、配列番号１で再刺激された患者Ｂ（ＨＬＡ− Ａ２＋）及びＤ（ＨＬＡ−Ａ１１＋）からのＰＢＭＣである。左の余白の括弧は 、エフェクター及び標的の間で共有されているＨＬＡ−Ａ又はＢ抗原を示してい る。各々の自己及び同種異系の標的はまた、培地のみで予備培養され又は関連性 のないデカペプチドでパルスされ、そしてエフェクターによる溶解についてテス トされた。それらの対照の標的の溶解は、いずれのエフェクターによっても５％ を超えなかった。 実施例１５ ＃８１０、配列番号１で誘発されたＣＴＬによる細胞毒性におけるＬ９２の影響 ＃８１０、配列番号１に対して向けられたモノクローナル抗体Ｌ９２により、自 己の＃８１０、配列番号１でパルスされたＢＣＬ及びメラノーマによる死滅化を 共にブロックすることを試みた。この抗体は、固相ペプチド酵素結合免疫吸着ア ッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、＃８１０、配列番号１に対して特異的な結合活 性を示すけれども、この抗体は、ＩＡアッセイにおいて、＃８１０、配列番号１ でパルスされたＢＣＬに対してばかりでなく患者Ａのメラノーマに対しても実質 的に結合しなかった（表５）。同様の結果が、Ｌ９２を用いた、フローサ イトメトリーにおいても得られた。この抗体はまた、両者の標的のＣＴＬ溶解の 僅かな阻害のみを示し、そして抑制効果は、抗体の濃度を５０μｇ／ｍｌまで上 げた場合で変化がなかった。従って、抗体Ｌ９２は、標的細胞表面上の＃８１０ 、配列番号１を検出しないけれども、その抗原性エピトープは、クラスＩ分子と 関連しておりかつＣＴＬによって認識されると思われる。 本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様の点から記載してきたが、本発明 の概念、考え及び範囲から離れることなしに、変更が、本明細書中に記した組成 物、方法及び方法の工程又は工程の順番において成されうるということは、本技 術分野の熟練者にとって明らかである。更には、同じ又は類似の結果が達成でき るのであれば、化学的及び生理学的に関連する薬剤が、本明細書中に記した薬剤 の代わりになりうるということも明らかである。このような類似の置換及び変更 はすべて、本技術分野の熟練者にとって明らかであり、そして添付の請求の範囲 によって明らかにされた本発明の考え、範囲及び概念の内にあるということが認 められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 9283−4Ｃ Ａ６１Ｋ 35/26 Ｃ１２Ｐ 21/02 9284−4Ｃ 39/395 Ｅ 21/08 9284−4Ｃ Ｔ // Ａ６１Ｋ 35/26 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 37/52 ＡＢＤ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，Ｕ Ｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列ＫＹＱＩ（配列番号８）を含みかつモノクローナル抗体Ｌ９２ と免疫反応性を示す精製したポリペプチドセグメント。 ２．アミノ酸配列ＱＤＬＴＭＫＹＱＩ（配列番号９）を含む請求の範囲第１項の ポリペプチド。 ３．アミノ酸配列ＱＤＬＴＭＫＹＱＩＦ（配列番号１）を含む請求の範囲第１項 のポリペプチド。 ４．約４３ｋＤａの分子量を有する請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ５．長さが、１００アミノ酸よりも短い請求の範囲第１〜３項のいずれか一つに 記載のポリペプチド。 ６．長さが、５０アミノ酸よりも短い請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。 ７．長さが、２５アミノ酸よりも短い請求の範囲第６項に記載のポリペプチド。 ８．長さが、１０アミノ酸以下である請求の範囲第７項に 記載のポリペプチド。 ９．β−ガラクトシダーゼ又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのアミノ 酸配列を含む請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １０．請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを発現する組み換えセルライン。 １１．Ｅ．ｃｏｌｉである請求の範囲第１０項に記載のセルライン。 １２．配列番号８に従ったペプチド配列をエンコードするＤＮＡセグメント。 １３．配列番号９に従ったペプチド配列をエンコードする請求の範囲第１２項の ＤＮＡセグメント。 １４．配列番号１に従ったペプチド配列をエンコードする請求の範囲第１３項の ＤＮＡセグメント。 １５．図４に示されたＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡセグ メント。 １６．請求の範囲第１項のペプチドと免疫反応性である抗 体。 １７．モノクローナル抗体である請求の範囲第１６項に記載の抗体。 １８．ヒトモノクローナル抗体である請求の範囲第１７項に記載の抗体。 １９．ヒトモノクローナル抗体Ｌ９２である請求の範囲第１８項に記載の抗体。 ２０．ＣＴＬ又は抗体応答を誘発するのに有効な量の請求の範囲第１項に記載の ポリペプチドを含む抗原組成物。 ２１．ポリペプチドが、１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて存在する請 求の範囲第２０項に記載の抗原組成物。 ２２．ポリペプチドが約５ｍｇ／ｍｌの濃度にて存在する請求の範囲第２１項に 記載の抗原組成物。 ２３．該ポリペプチドが多価のメラノーマ細胞ワクチンの成分である請求の範囲 第２０項に記載の抗原組成物。 ２４．ガン全細胞ワクチン療法と共同して、請求の範囲第 １８項に記載の抗原組成物を投与することを含むヒトガン患者を治療する方法。 ２５．該ガン患者がヒトメラノーマ患者である請求の範囲第２４項に記載の方法 。 ２６．多価のメラノーマ細胞ワクチンを、ヒトメラノーマ患者に、約２週間毎に ３回、次いで約１年間１月毎に約１回、その後３カ月毎に約４回、そしてその後 は約６カ月毎に投与することを含み、かつ更に、配列番号１、配列番号９又は配 列番号８として本明細書中に示されたペプチド配列を含有するワクチンを、約４ 週間毎に２〜４回、その後は約６カ月毎に投与することを含む請求の範囲第２４ 項に記載の方法。 ２７．請求の範囲第１〜８項のいずれか一つに記載のポリペプチドの有効量を、 患者の免疫系細胞と接触させることを含む、患者の免疫応答を高める方法。 ２８．ポリペプチドの有効量を患者に投与する請求の範囲第２７項に記載の方法 。 ２９．方法が半ビボで行われ、かつ該方法が、 患者から細胞毒性のリンパ球を得る工程、 該細胞毒性のリンパ球をポリペプチドと接触させる工程、 及び 該リンパ球を患者内に再導入する工程 を含む請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３０．該患者が、ヒトガン患者である請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．該患者が、ヒトメラノーマ患者である請求の範囲第３０項に記載の方法。 ３２．該リンパ球が該患者の血清から得られる請求の範囲第２９項に記載の方法 。 ３３．該リンパ球が末梢血リンパ球である請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３４．更に、全メラノーマ細胞ワクチン療法を含む請求の範囲第２９項に記載の 方法。