KR0184715B1 - 자궁암 면역치료제 조성물 - Google Patents

자궁암 면역치료제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포내에서 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 형질전환체 및 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하여 이 바이러스에 의해 감염된 세포를 특이적으로 괴사시키는 자궁암 면역치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자궁암 예방백신에 관한 것이다.

Description

자궁암 면역치료제 조성물
제1도는 분리제정한 비융합형이고 가용성인 18형 E7 단백질이 pRB105 단백질과 결합능이 있음을 보여주는 감광사진이다.
제2도는 생쥐에서 18형 E7 재조합 단백질의 항체형성능을 검증한 결과도이다.
제3도는 면역세포 CD4+ 및 CD8+ 에 대한 18형 E7 재조합 단백질의 증식능 검색 전략을 요약한 것이다.
제4도는 B세포 및 면역세포 CD4+ 및 CD8+ 에 대한 18형 E7 재조합 단백질의 증식능 검색 결과를 나타낸 것이다.
제5도는 18형 E7 재조합 단백질 발현용 동물세포주 P815/18E7을 제조하기 위한 발현 플라스미드 pRCCMV/18E7의 제조 전략을 요약한 것이다.
제6도는 동물세포주 P815/18E7에서 18형 E7 DNA 및 mRNA의 존재를 검증한 결과도이다.
제7도는 동물세포주 P815/18E7에서의 18형 E7 단백질 발현을 웨스턴블랏팅법으로 검색한 결과도이다.
제8도는 18형 E7 재조합 단백질에 의한 살(殺)세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL)의 생산전략을 요약한 것이다.
제9도는 살세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL)의 살해능 검색법을 요약하여 나타낸 것이다.
제10도는 18형 E7 재조합 단백질에 의해 유도된 살세포와 P815/18E7 세포주에 대한 살해능을 검색한 결과를 나타낸다.
본 발명은 동물세포내에서 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 형질전환체 및 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하여 이 바이러스에 의해 감염된 세포를 특이적으로 괴사시키는 자궁암 면역치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자궁암 예방백신에 관한 것이다.
자궁경부암은 자궁암의 90%이상을 차지하는 것으로서 한국여성에 있어서 가장 발생 및 사망 빈도가 높은 악성종양이다. 특히 최근에는, 사람 파릴로마바이러스(human papillomavirus ; HPV) 16형 및 18형의 감염이 발암기전에서 가장 중요하게 작용하는 인자로 밝혀졌는데, 자궁암 환자중에서 HPV 16형의 감염율은 50-70% 정도에 이르고 18형의 감염율은 15-25%에 이르는 것으로 보고되어 있으나, 전이암의 경우를 비교해보면 16형 감염환자의 25% 정도, 18형 감염환자의 50% 이상이 전이암에 걸려있는 것으로 보인다. 따라서 18형은 상대적인 감염율은 낮지만 실제 감염진단 및 그 예후를 추측하는데 있어서는 중요한 인자로 고려하여야 할 것이다.
미국 국립 암연구소에 의해 1993년 7월에 발표된 자료에 의하면 현재 개발도상국의 경우 자궁암이 여성암중 발생률 제1위를 차지하고 있으며, 매년 새로 발생하는 환자의 수가 약50만명에 이를 것으로 조사되어 있다. 우리나라 서울 지역에서도 연간 여자10만명당 123명이 암에 걸리며 이중 자궁암이 22%, 위암 18%, 유방암 12.9%로 자궁암 발생률이 1위를 차지하고 있어 아직 후진국의 전형적인 암발생율을 나타내고 있음을 알 수 있다. 즉, 우리나라에서의 자궁암 발생율은 여성 10만명당 27명으로서 이는 미국의 약 3배 수준이며, 특히 선진국의 경우 확진시의 암이 진행 초기인데 반해 우리나라의 경우 중기 이후인 경우가 많아 그만큼 치료가 어렵고 사망률도 더 높을 것으로 예상된다. 이러한 자궁암 발생율은 조기 진단법으로 정기 검진율을 높일 수만 있어도 3분의 2이상을 줄일 수 있을 것이므로 국민보건의 향상을 위해서는 예방백신과 치료백신 등 치료제의 개발과 함께 예방의학적 차원에허 파필로마바이러스 감염의 조기 진단제 개발이 시급하다.
효과적인 진단제나 예방 및 치료에 이용할 수 있는 암백신의 개발은 무엇보다도 이들 바이러스의 감염에 의한 인체 내 면역 반응을 조사한 결과에 의거하여 수행될 수 있을 것이다. 그러나 사람 파필로마바이러스 16형 및 18형 은 아직 그 효과적인 분리 및 증식 시스템이 수립되어 있지 않기 때문에, 이들 바이러스의 감염 및 암화기작 그리고 인체내 면역반응을 연구하는데 어려움이 따르고 있다. 또한 진단제 및 치료제로 사용할 항원의 확보가 상당히 어렵다. 그러나 바이러스 유전자의 확보는 가능하므로 이를 이용하여 많은 연구 그룹에서 사람 파필로마바이러스에 대한 특정의 항체반응이 질병과 관련이 있는지를 조사하였는데, 예를들어 Joshmus-Kudieka등은 사람 파필로마바이러스 18형 E7 유전자에 대한 합성 펩타이드를 이용한 항체 반응이 자궁암환자 경우에 대조군보다 무려 14배 이상 높은 것으로 보고한 바 있다(참조: Jochmus-Kudieka I, Schneider A., Braun R Kimming, R., Koldovsky, U., Schneweis, K, E. et al. Antibodies against the human papillomavirus type 18 early proteins in human sera : correlation of anti-E7 reactivity with cervical cancer. J. Natl. Cancer Inst. 1989. 81, 1898 - 1904). 이러한 반응은 질병의 감염진단은 물론 진전에 관한 표식인자로서 이용하는 것이 가능할 것으로 보인다.
한편, 사람 파필로마바이러스 E7 또는 E6 단백질이 암특이항원으로 작용한다는 많은 실험결과들이 제시되고 있으므로, 이들 단백질을 발현하는 암세포를 이용하거나 이들 단백질에서 살(殺)세포(cytotoxic T cell : CTL)생성을 유도할 수 있는 펩티드 부위만을 인위적으로 합성하여 면역반응을 유도함으로써 암의 치료제로 사용하려는 시도가 많이 이루어지고 있다.
지금까지 살세포 생성을 유도할 수 있는 항원으로는 세포내에서 생산되는 감염된 바이러스항원 등이 세포내 처리(endogenous processing)를 거쳐 이루어지거나, 세포외부에서 제공되는 경우에는 CTL을 유도할 수 있는 부위(epitopes)를 지닌 펩티드가 MHC(major histocompatability complex, 주요 조직적합유전자 복합체) 클래스 I 과 결합하여 항원제시세포(antigen presenting cell : APC)의 세포 표면에 제시됨으로써 CD8+ 살세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 믿어져 왔다. 그러나, 최근 이러한 도그마에 도전하는 새로운 결과들이 제시되고 있다. 즉, 단백질 항원을 이용하여 적절한 방법으로 면역시키면 세포 외부에서 제공한 가용성의 단백질 항원에 대해서도 CTL생성을 유도할 수 있다는 것이다. 그 기작은 아직 확실히 밝혀지지 않았지만 외부에서 제공한 단백질 항원이 세포 내부로 이입된 후 엔도좀 경유로(endosomal pathway)를 거쳐서 MHC 클래스 Ⅱ와 결합하여 CD4+ 세포를 활성화 시키는데 그치지 않고 MHC 클래스 I과 결합하여 CD8+ 세포를 활성화시키는 것으로 생각되고 있다.
만일 이러한 기술이 가능하다면, 백시니아바이러스, 레트로바이러스 및 아데노바이러스 등 재조합 바이러스 벡터를 이용하는 지금까지의 기술이 아직까지 안전성의 문제로 일반적인 사용이 어렵고, 펩티드 항원의 경우 일반적으로 특정 MHC 클래스 I의 일배체형(haplotype)에만 적용이 되므로 개개인에 대한 합일 여부를 검색한 후에야 항원으로 사용할 수 있다는 단점이 있음에 반하여, 재조합 단백질 자체를 항원으로 사용하는 경우 안전성이 높고; 다양한 MHC 클래스 I의 형에 대한 복수(multiple)의 CTL 유도부위(all the potential epitopes)의 제시가 가능하며; 단일 펩티드 항원에서 제공하기 어려운 B세포 에피토프(epitope) 및 T 헬퍼세포 에피토프를 제공할 수 있고; 항체반응도 유도할 수 있는 가능성이 높다.
따라서, 본 발명자들은 이러한 목적을 달성하기 위하여 오랜 기간에 걸쳐 집중적인 연구를 수행한 결과, 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 항원으로 사용하면 항체반응 및 면역반응을 유도하고 암세포 살해능을 갖는 면역세포를 활성화시켜 자궁암을 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명은 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 하여 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합시킨 자궁암 면역치료제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 자궁암 면역치료제 조성물은 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 있으므로 사람 파필로마바이러스에 의해 감염된 세포를 특이적으로 괴사시킴으로써 자궁암 치료효능을 발휘하며, 특히 사람 파필로마바이러스 18형 감염으로 인한 자궁암에 대해 특별한 효과를 발휘한다.
본 발명자들은 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질이 이러한 치료 및 예방기능을 가지고 있는지 확인하고자 다음과 같은 일련의 실험을 수행하였다.
먼저, 본 발명의 치료제에서 활성성분으로 사용된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질은 대장균 형질전환체로부터 수득된 것이므로, 대장균 유래의 단백질이 동물세포내에서 생산되는 18형 E7 단백질과 유사한 3차원적 구조를 가지고 있는지 검색하기 위하여, 이 단백질이 생체내에서 결합하여 불활성화 시키는 것으로 확인된 인체의 암억제인자(tumor suppressor) pRB105 단백질과 결합능을 시험관내에서 검사하였다. 이 방법은 본 발명자들에 의해 개발된 것이며 면역침전(immunoprecipitation)법을 응용한 새로운 방법이다.
즉, 대장균 형질전환체 유래의 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질을 감마(gamma)-32 P-ATP로 인산화시킨 다음, 이를 pRB105단백질을 생성하는 HeLa 세포주로부터의 추출액과 pRB105 단백질에 대한 항체가 결합된 Protein-A- 세파로오스와의 반응물과 혼합하였다. Protein-A- 세파로오스에 결합시킨 결합물들을 SDS-PAGE로 분리하고 겔을 건조시킨 후 X-ray 필름을 넣어 감광사진(autoradiogram)을 얻었으며, 이로부터 분리정제된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질은 pRB105 단백질과 특이적으로 결합하고 있음을 확인하였다.
한편, 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 자궁암의 면역치료제로 개발하기 위해서는 그 항체형성능(humoral response) 및 세포성 면역반응 단백질(cellular immune response)을 검정함으로써 이 단백질이 효율적인 면역능을 가지고 있음을 확인하는 것이 필요하다. 따라서, 웨스턴블랏팅 및 ELISA 법으로 18형 E7 재조합 단백질에 대해 특이적인 항체가 생성됨을 확인하는 동시에, 18형 E7 단백질에 대해 특이적으로 배양한 T 면역세포의 표면항원을 검색하였다.
T 면역세포의 표면항원을 검색하는 것은 그 기능을 예상해볼 수 있는 점에서 매우 중요하다. 왜냐하면, 배양관 T 면역세포 중에 CD4+ 세포가 많이 포함되어 있다면 항원특이적인 T 헬퍼세포(helper cell)가 활성화 되었다는 것을 의미하며, CD8+ 세포가 많이 포함되어 있다면 이들이 항원 특이적인 암세포 살해능을 지니고 있을 확률이 높기 때문이다. 본 발명에 따른 18형 E7 재조합 단백질에 대한 면역세포의 활성화정도를 검색한 결과, 면역시킨 생쥐의 비장에서 분리한 단일세포(single cell)의 일차 배양물(primary culture)에서는 B면역세포, CD4+ T 면역세포 및 CD8+ T 면역세포 가 각각 약 82%, 15%, 9%인 것으로 나타난 반면, 시험관 내에서 항원에 의한 자극을 주고 2차 배양한 후에는 80%정도가 T 면역세포체로 나타나고, 이중 CD4+ T 면역세포 는 36%, 정도 CD8+ 면역세포는 38% 정도로 증가된 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 배양을 계속함에 따라 분리한 T 면역세포 중에 암세포를 직접 공격하여 죽일 수 있는 CD8+ T 면역세포의 비율이 증가하는 것을 보여주는 것으로서, 이로써 암세포 살해능을 가진 T 면역세포, 즉 살(殺)세포의 생산에 의한 면역치료제로서의 사용가능성을 확인할 수 있다.
일단 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 사용하여 CD4+ 및 CD8+ 세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 다음 단계로 활성화된 이들 T 면역세포가 항원특이적인 암세포 살해능을 가진 살(殺)세포를 포함하는지 검색하고자 하였다. 그런데, 암세포 살해능을 검색하기 위한 시험관내 시스템에는 특정항원을 발현하고 이를 세포내 처리경로(intracellular processing pathway)를 거쳐 항원특이적으로 CD8+ 세포에 의해 인식될 수 있도록 MHC 클래스 I과 결합된 CTL펩타이드를 세포표면에 제시(presentation )할 수 있는 표적세포(target cell)의 수립이 요청된다.
따라서, 본 발명자들은 18형 E7 재조합 단백질을 발현하는 동물세포주를 제조하고자, 공지의 pRCCMV 벡터를 이용하여 동물세포 발현벡터 pRCCMV/18E7을 제조하였으며 DBA/2 마우스의 비반세포종(mastocytoma) 유래의 P815 세포주를 동물세포주로 선택하여 이 세포주에 발현용 pRCCMV/18E7 벡터를 리포펙션(lipofection)법으로 삽입함으로써 형질전환체를 수득하였다. 수득된 형질전환체에 대해 DNA-PCR법과 RNA-PCR법을 수행하여 18형 E7 DNA를 함유하고 있는 동시에 18형 E7 유전자에 특이적인 mRNA 정보를 가지고 있음을 확인하였으며, 제조된 형질전환체내에서 18형 18형 E7 단백질이 효율적으로 발현되고 있음을 웨스턴블랏팅법으로 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 특성을 지닌 형질전환체 동물세포주를 P815/18E7으로 명명하고 1995년 5월30일자로 한국과학기술원 부설 생명공학연구소의 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 0168BP)
상기와 같이 제조된 표적세포주를 대상으로 하여 본 발명의 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질에 의해 활성화된 T면역세포가 항원특이적인 암세포 살해능을 가지고 있는지를 다음과 같이 확인하였다.
표적세포인 P815/18E7의 MHC클래스 I와 유전자형(H-2d)이 동일한 DBA/2 생쥐를 사용하여 18형 E7 재조합 단백질에 의한 살(殺)세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL)를 생산하였다. 생산된 살세포의 항원특이적 P815/18E7 세포 살해능을 제9도에 나타낸 방법에 따라 검색한 결과, 살세포(effector)와 표적세포(target cell)의 비율을 각각 25:1, 5:1, 1:1로 유지하였을때의 항원특이적 살세포 효능이 P815세포주를 표적세포로 실험한 대조군에 비교해서 각각 38%, 15%, 11%로 나타났으므로 이들이 표적세포를 효과적으로 살해하는 것을 관찰하였다.
이상의 결과를 종합해볼 때, 대장균 형질전환체로부터 수득된 본 발명의 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질은 사람 파필로마바이러스 18형의 감염에 의한 자궁암에 대해 효과적인 면역치료제로 작용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 면역치료제 조성물은 임상적으로 투여시에 약제학적으로 허용되는 부형제와 18형 E7 재조합 단백질을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있는데, 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제는 고체이거나 액체일 수 있으며, 면역증강제 또는 면역조절제로 작용할 수 있는 물질중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용하기에 적당한 면역증강제의 구체적인 예로는 백반(alum), 또는 스쿠알렌, Tween 20 및 플루론산(pluronic acid)의 혼합물을 언급할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에 따른 자궁암 면역치료제의 활성성분인 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 생체내로 투여하였을 때, 급성독성등의 부작용이 없는지를 확인하기 위해 마우스를 대상으로 관찰하였는데, 그 결과 투여후 3일내에 사망한 마우스가 전혀 관측되지 않았으며, 7일이 경과한 후 마우스를 해부하여 각 장기를 육안관찰한 결과 착색, 부종, 침윤 등의 중상 또한 전혀 발견할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 재조합 단백질의 독성은 우려할 필요가 없는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 사용된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질의 투여용량은 환자의 연령이나, 증상 또는 투여 제형 등에 따라 다양하게 조절할 수 있으나, 대체로 체중 ㎏당 0.001㎎ 내지 1,000㎎의 범위로 경구 또는 비경구투여함으로써 자궁암세포를 괴사시켜 자궁암 치료효과를 얻을 수 있다. 특정한 상태에서 바람직한 투약량을 결정하는 것은 본 분야의 전문가에게 공지되어 있는 기술이다.
본 발명은 또한, 상기 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자궁암 예방백신에 관한 것이다. 이미 언급된 바와 같이 18형 E7 재조합 단백질의 항체형성능이 확인되었으므로 이를 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합시켜 예방백신으로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 자궁암 예방백신에는 상기 언급한 면역치료제에서와 동일하게 추가로 면역증강제, 면역조절제 등의 효과를 나타내는 성분이 함유될 수 있다. 이들은 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질과 함께 투여됨으로써 생체내의 면역작용을 증강시키고 조절하는 역할을 수행한다.
결론적으로, 본 발명은 최초로 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 외부항원 형태의 면역원으로 사용한 결과, 이 단백질이 항체 반응을 유도할 뿐아니라 T 헬퍼세포의 중요한 세포형인 CD4+ 세포의 증식을 유도하고 CTL의 중요한 세포형인 CD8+ 세포의 증식을 유도하는 것을 확인하고, 나아가 새로이 수립된 시험관내 CTL 검색시스템을 통해 외부항원인 18형 E7 재조합 단백질이 특이적인 CTL을 잘 유도할 수 있다는 결과에 기초한 것이다. 즉, 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 유효성분으로 하여 이를 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합시키면 자궁암에 대한 면역치료제 및 예방백신을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[대장균 형질전환체에서 사람 파필로마바이러스 18형 E7 비융합형 재조합 단백질의 발현]
사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질 발현용 플라스미드 pET18E7에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET18E7 (기탁번호 KCTC 0167BP)을 암피실린이 100㎍/㎖ 농도로 들어있는 Luria Bertani 배지(LB배지 : 박토트립톤 10g, 효모 추출액 5g, 염화나트륨 1g/물 1리터) 1ℓ를 사용하여 37℃ 에서 배양하였다. 650nm에서의 광학밀도(optical density)가 06.-0.8에 이르렀을 때 유전자의 발현을 유도하기 위히 1mM IPTG(isoprophyl thio-beta-D-galactoside)의 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하고 4시간동안 배양하였다. 세포 배양액을 8000rpm, 10분, 4℃에서 원심분리하여 대장균 균체를 회수하고 세포펠렛에 용해 완충액 A(20mM Tris-C1, pH 7.4 100mM NaCl, 0.1mM phenylmethylsulfonylfluoride)를 가하였다. 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 상등액을 취함으로써 펠렛이 제거된 조추출액을 수득하였다.
[실시예 2]
[사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질의 분리정제]
실시예 1에서 기술한 바와 같이, 비융합형인 동시에 가용성으로 발현된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질은 다음의 과정을 통해 분리 정제할 수 있다. 여기서, 정제된 가용성 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질의 순도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한 다음 쿠마시 블루(Coomassie Blue) R-250으로 염색한 후 단백질의 양을 농도계(densitometer)로 측정하여 확인하였으며, 단백질의 양은 Lowry 등(참조 : Lowry OH, Rosenberg NJ, Farr AL, Randall RJ : Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem 193 : 265 - 275, 1951)이 제시한 방법을 따라 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준단백질로 사용하여 측정하였다.
[단계 1]
[암모늄설페이트 침전법 및 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피]
실시예 1에서 수득한 조추출액에 암모늄설페이트를 첨가하여 최종농도가 40%가 되도록 하였다. 90분 동안 4℃를 유지하면서 교반한 다음 12,000rpm, 4℃에서 20분동안 원심분리하였다. 침전물을 회수하여 완충액 B(20mM Tris-C1)에 용해시키고 동일 완충액 중에서 투석한 다음, 12,000rpm에서, 20분간 원심분리하였다. 다시, 상등액을 회수하여 완충액 B로 미리 평형시킨 DEAE-쎄파셀(DEAE-sephacel ; 1.5×10㎝)컬럼에 통과 시켰다. 이때, 칼럼 크로마토그래피는 염화나트륨의 스텝 농도구배(step gradient)에 따라 단백질이 용출되는 방식으로 수행하였다. DEAT-세파셀 칼럼 분획중의 일정량을 취하여 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행함으로써 단백질을 분석한 결과, 0.3M NaCl 농도에서 가용성 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질이 용출됨을 알 수 있었다. 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질을 다량으로 비교적 순수하게 포함하는 것으로 확인된 분획을 모아서 한외여과(ultrafiltration)로 농축시켰다. 농축된 시료는 하기 단계 2에서 기술하는 바와 같이 겔 여과 칼럼 크로마토그래피(gel filtration column chromatography)에 적용하여 더욱 순수하게 분리정제하였다.
[단계 2]
[겔 여과 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC 분석]
완충액 B로 평형시킨 세파크릴(Sephacryl) S200HR 칼럼(2.5×98㎝)에 단계 1에서 농축시킨 시료를 적용하여 크로마토그래피법으로 정제하였으며, 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질은 0.6×컬럼 부피(bed volume)에서 용출되는 것으로 확인되었다. 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질을 순수하게 포함하는 것으로 확인된 분획만을 모아서 다시금 한외여과(ultrafiltration)로 농축시켰다. 정제과정별로 얻어진 시료의 정제상태를 SDS-PAGE 로 분석한 결과, 상기 정제된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질의 순도가 90%이상인 것으로 확인되었다.
또한, 덴시토미터(densitometer)를 사용하여 표준단백질과 비교 측정한 결과, 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET18E7의 1리터 배양액으로부터 DEAE-세파셀 칼럼 및 세파크릴 S200HR컬럼을 통해 분리정제된 가용성 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질의 양은 약30㎎임을 확인할 수 있었다.
[실시예 3]
[사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질과 pRB105 단백질과의 결합활성 검색]
사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질이 동물세포내에서 생산되는 18형 E7 단백질과 유사한 3차원적 구조를 가지고 있는지 검색하기 위하여, 이 단백질이 생체내에서 결합하여 불활성화 시키는 것으로 확인된 인체의 암억제인자(tumor suppressor) pRB105 단백질과의 결합능을 시험관내에서 검사하였다. 이 방법은 본 발명자들에 의해 개발된 것이며 면역침전(immunoprecipitation)법을 응용한 새로운 방법으로서 이 방법에 의거하여 18형 E7 재조합 단백질이 pRB105 단백질에 대한 결합능이 있음을 다음과 같이 확인할 수 있었다.
[단계 1]
[분리정제한 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질의 인산화]
사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질에는 카제인 인산화효소(casein kinase) I에 의하여 인산화될 수 있는 아미노산 서열이 있다. 따라서, 순수하게 분리정제한 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질500㎎을 20mM HEPES(pH 7.5), 20mM MgCl2,56nM 감마-32 P-ATP를 이용하여 상온에서 30분간 인산화시켰다.
[단계 2]
[pRB105 단백질 시료의 제조]
용해완충액(Lysis buffer : 25mM Tris, pH 7.4, 50mM NaCl, 2% NP-40, 0.2% SDS, 1mM PMSF)에 미리 수침시킨 Protein-A 세파로오스(Sepharose) 100㎕에 pRB105 단백질에 대한 모노클로날 항체(클론 No. G3-245 모노AbCpRb, Pharmirgen 사/Cat No. 14001A) 5㎍을 4℃에서 1시간 동안 결합시켰다. pRB105 단백질이 생산되는 HeLa 세포주를 RPMI1640 배지에서 배양하고 원심분리하여 모은 후, 상기 용해완충액 중에서 4℃에서 30분간 방치한 다음 원심분리하여 상등액을 회수하였다. pRB105 단백질에 대한 항체가 결합되어 있는 Protein-A-세파로오스에 HeLa 세포주에서 분리한 상등액을 4℃에서 4시간 동안 결합시킨 후, 세척용 완충액(wash buffer : 25mM Tris, pH 7.4, 50mM NaCl, 0.2% NP-40, 1mM PMSF)으로 3회 세척하였다.
[단계 3]
[사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질과 pRB105 단백질과의 반응]
단계 1에서 제조한 감마-32 P-ATP로 표지된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질과, 단계 2에서 제조한 pRB105 단백질이 생산되는 HeLa세포주로부터의 추출액을 pRB105 단백질에 대한 항체가 결합된 Protein-A-세파로오스와 반응시킨 것과를 혼합하여 4℃에서 4시간동안 결합시틴 다음 세척용 완충액으로 5회 세척하였다. Protein-A 세파로오스에 결합시킨 결합물들을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 겔을 건조시킨 후 X-ray 필름을 넣어 감광사진(autoradiogram)을 얻었다(제1도 참조). 제1도의 lane 2로부터 확인되듯이, 분리정제된 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질은 pRB105 단백질과 특이적으로 반응하고 있음을 알 수 있다.
[실시예 4]
[18형 E7 재조합 단백질의 항체유도능(humoral response)과 세포성 면역반응(celluar immune response) 유도능 검색]
사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 암예방 및 치료제로 개발하기 위해서는 그 면역능을 확인하는 작업이 필요하다. 따라서, 다음에 기술하는 바와 같이 재조합 단백질의 항체형성능(humoral response) 및 세포성 면역반응(cellular immune response)을 검정한 결과 이 단백질이 효율적인 면역능을 가지고 있음을 확인하였다.
[단계 1]
[비융합형이고 가용성인 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질의 항체형성능 검증]
실시예 2에서 수득한18형 E7 재조합 단백질 30㎍을 면역증강제 R-700(RIBI immunochem. Research Inc. MPL(Monophosphoryl Lipid A) + TDM(Trehalose Dicorynomycolate)과 1:1(w/w)로 혼합하였다. 이 혼합물을 3마리의 생쥐에 각각 1차는 피하주사하고(마리당 100㎕씩 발바닥에 피하주사), 일주일 경과후 10㎍의 양으로 복강주사 한 후, 다시 일주일 후 혈액을 채취하여 웨스턴블랏팅 및 ELISA법으로 항체형성을 확인하였다. 웨스턴블랏팅 결과로부터 쥐의 혈액내에는 18형 E7에 특이적인 항체가 생산되었음을 확인할 수 있었고, ELISA법으로 확인한 결과는 제2도에 나타내었는데, 이로부터 희석배수가 10-5인 조건에서 흡광도가 2.3일 정도로 역사가 높은 항체를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 3마리의 생쥐가 유사한 결과를 나타내었으므로 사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질의 항체형성능은 각 개체별로 별다른 차이가 없음도 확인하였다.
[단계 2]
[비융합형이고 가용성인 재조합 단백질 18형 E7 항원에 특이적인 면역세포 CD4+ 및 CD8+ 세포 유도능 검색]
시험관내에서 18형 E7에 특이적으로 배양한 T면역세포의 표면항원을 검색하는 것은 이 T면역세포의 기능을 예상해 볼 수 있다는 점에서 매우 중요하다.
따라서, 본 발명자들은 항원으로서 18형 E7 재조합 단백질 30㎍/마리의 양으로 접종한 생쥐로부터 적출한 비장에서 세포농도 2×106세포/㎖의 단세포 현탁액(suyspension)을 준비한 다음 1㎍/㎖ 농도의 18형 E7 재조합 단백질 항원으로 시험관내 자극한 뒤 T면역세포 서브셋(subset)과 B면역세포의 존재양상을 분석하였다.
T면역세포와 B면역세포의 표면항원을 검사하기 위한 항체로는 하이브리도마(hybridoma) 세포주 J1j. 10(항-Thy-1,2 rat monoclonal antibody를 분비하는 세포주, ATCC TIB184), GK1.5.3(murine T cell 의 helper inducer subset에서 발현되는 표면항원인 L3T4(CD4)를 인식하는 rat monoclonal antibody(lgG2b)를 분비하는 세포주, ATCC TIB207), 3.168(rat monoclonal anti-Lyt(CD8) antibody를 분비하는 하이브리도마, Scripps Research Institute에서 분양받음), J11d(B면역세포와 특이적으로 반응하는 rat monoclonal antibody(1gM)을 분비하는 하이브리도마, ATCC TIB183)를 배양하여 생산된 단일클론항체를 사용하였다.
18형 E7 재조합 단백질에 대한 면역세포 활성화 검색전략은 제3도에 나타내었다. 즉, 비장세포를 J11d, GK.1.5.3, 3.168 및 J1j.10 세포주의 배양상등액과 함께 빙욕중에서 45분간 배양하면서 매10분 간격으로 천천히 흔들어줌으로써 항체가 세포에 결합되도록 하였다. PBS로 2회 세척한 다음, 여기에 Goat anti-rat Ig FITC(×100, 구입처 : TAGO사) 100㎕ 및 프로피듐요오다이드(×100) 25㎕를 첨가하였다. 다시 빙욕중에서 45분간 배양하면서 매10분 간격으로 천천히 흔들어주고 PBS로 세척한 다음, 유량 세포계산기(flow cytometer) 및 FACScan(Becton Dickinson, San, Jose, 미국)를 사용하여 B-면역세포, CD4+ 및 CD8+ T 면역세포수를 분석하였다(제4도 참조).
제4도로부터 알 수 있듯이, 면역시킨 생쥐의 비장에서 분리한 단일세포(single cell)의 일차 배양물(primary culture)을 분석한 결과 B면역세포, CD4+ T 면역세포 및 CD8+ T 면역세포는 각각 약 82%, 15%, 9%이었다. 그러나 시험관 내에서 항원에 의한 자극을 주고 2차 배양한 후에는 80%정도가 T 면역세포로 나타나고, 이중CD4+ T 면역세포는 36%정도 CD8+ T 면역세포는 38% 정도로 증가 되었다. 이러한 결과는 비장세포의 배양을 계속함에 따라 T 면역세포 중에 암세포를 직접 공격하여 죽일 수 있는 CD8+ T 면역세포의 비율이 증가하는 것을 보여주는 것으로서, 이로써 암세포 살해능을 가진 T 면역세포 즉 살(殺)세포의 생산에 의한 면역요법의 사용가능성을 확인할 수 있다.
[실시예 5]
[사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질 항원을 이용한 암세포 살해능을 가진 살세포(CTL) 생성유도]
사람 파필로마바이러스 18형 E7 재조합 단백질을 사용하여 CD4+, CD8+ 세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 다음단계로 이들 T 면역세포가 항원 특이적인 암세포 살해능을 가진 살(殺)세포를 포함하는지 검색하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
[단계 1]
[암세포 살해능을 가진 살세포의 검색을 위한 표적세포(target cell)의 제조 및 분석]
암세포 살해능 검색을 위한 시험관내 시스템에서 표적세포로 이용되기 위해서는 특정항원을 발현하고 이를 세포내 처리경로(intracellular processing pathway)를 거쳐 항원특이적으로 CD8+ 세포에 의해 인식될 수 있도록 MHC 클래스 I과 결합된 CTL 펩타이드를 세포표면에 제시(presentation)할 수 있는 세포주 수립이 요청된다. 이 목적을 달성하기 위해서는 18형 E7 재조합 단백질을 발현하는 동물세포주 수립이 필요하므로 먼저 pRCCMV 벡터를 이용하여 동물세포 발현벡터 pRCCMV/18E7 제조하기 위해 다음과 같은 전략을 수립하였다(제5도 참조).
즉, PCR 에 의해 증폭된 18형 E7 DNA를 EcoRI 및 Bg1II 제한효소로 소화하는 한편 pUC119의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)의 EcoRI 및 BamHI을 소화하여 서브클로닝하였다. 이 클론을 확인하여 EcoRI으로 소화한 후 T4 DNA 중합효소로 처리하고 다시 HindIII 제한효소로 소화하여 18형 E7 단편을 회수하였다. 이를 NotI으로 소화하여 T4 DNA 중합효소로 처리하고 HindIII로 소화시킨 pRCCMV벡터에 16℃에서 밤동안(overnight) 결찰반응시켰다. 이를 heat shock 방법으로 DH5α 숙주균주에 형질전환시키고 엠피실린 배지에서 선별하여 형질전환체를 수득하였다.
상기 전략에 따라 동물세포에서 18형 E7 항원을 생산할 수 있는 발현벡터를 제조하였으므로 동물세포주로 P815 세포주를 선택하여 다음과 같이 본 발명의 표적세포를 제조하였다. P815 세포주를 무혈청 RPMI 1640 배지로 세척하여 2×106세포/well의 농도로 seeding하고 DNA(발현용 pRCCMV/18E7 벡터) 1㎍ 및 리포펙틴(lipofectin) 10㎕의 복합체를 상온에서 15분간 방치한 후 세포위에 점적하였다. 무혈청 배지에서 12시간동안 배양한 후 10% FBS를 포함한 배지로 교체하고 48시간 후 800㎍/㎖의 G418 항생제로 선별하여 네오마이신 양성(neomycin positive)이며 안정한 상태의 형질전환체를 분리하였다.
상기 수득된 형질전환체에서 18형 E7 DNA 및 mRNA의 존재를 확인하기 위하여 분리된 genomic DNA로 DNA-PCR법을 수행하고 Lysate mRNA capture방법에 의한 RT(reverse transcription)-PCR 법을 수행하여 검증하였다. 그결과, 상기 제조된 형질전환체가 18형 E7 DNA를 함유하고 있으며 동시에 18형 E7 유전자에 특이적인 mRNA 정보를 가지고 있음을 확인할 수 있었다(제6도 참조). 또한 18형 E7 재조합 단백질이 발현되는지 알아보기 위하여 18형 E7 단백질 발현을 웨스턴블랏팅법으로 검색하였으며(제7도 참조), 이로써 제조된 형질전환체내에서 효율적으로 18형 E7 단백질이 생산되고 있음을 확인하였다. 따라서, 이러한 특성을 지닌 형질전환체 동물세포주를 P815/18E7 으로 명명하고 1995년 5월 30일자로 한국과학기술원 부설 생명공학연구소의 유전자은행에 부다페스트 조약하의 기탁을 완료하였다(기탁번호 : KCTC 0168BP).
[단계 2]
[생쥐에서 18형 E7 재조합 단백질을 이용하여 제조한 CTL면역세포의 표적 세포주 p815/18E7 에 대한 항원특이적 살해능 검색]
실시예 2에서 순수하게 분리정제된 18형 E7 재조합 단백질에 의한 살(殺)세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL) 생산전략은 제8도에 나타내었다. 사용한 생쥐는 표적세포인 P815 세포의 MHC 클래스 I과 유전자형 (H-2d) 이 동일한 DBA/2 생쥐(입수처 : 한국화학연구소 실험동물실)를 사용하였다. DBA/2 생쥐에 정제된 18형 E7 단백질 30㎍을 피하주사하고 1주일후에 복강주사로 추가자극(boost)하였다. 2번째 면역화한지 1주일후에 비장을 분리하고 단일세포 현탁액을 제조하였다. 현탁액중의 적혈구(RBC)를용해완충액(hemolytic buffer; 0.15M NH4Cl, 0.01M Tris-HCI, pH7.5)에서 파쇄하고 동일완충액으로 3회 세척하여 제거하였다. 비장으로부터 분리한 세포의 살해능을 시험관내에서 검색하기 위해서는 항원특이적 세포의 중식이 필요하며, 이러한 목적으로 P815/18E7 표적세포를 감마선 처리하여 죽인 세포 또는 재조합 단백질 항원 18형 E7 자체를 성장자극제로 사용하여 세포를 증식시키는 과정이 필요하다. 따라서, 상기 수득된 비장세포 2×106개를 2㎍/㎖ 농도의 HPV 18형 E7 단백질 및 10% CAS(Concanavaline A activated rat spleen culture supernatnat)와 혼합한 후 5일간 배양하고, 다시 2㎍/㎖ 농도의 HPV 18형 E7 단백질, 107개의 동유전자형의 비장세포(syngenic splenocytes)를 feeder cell로 넣어주어 10% CAS와 혼합하고 5일간 배양하는 재자극과정(repeating restimulation)을 반복하였다.
계속하여 상기 방법으로 제조된 살세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL)의 살해능을 다음에 설명하는 방법으로 검색하였으며(제9도 참조), 대장균에서 발현시켜 순수하게 분리정제한 18형 E7 재조합 단백질에 의해 유도된 살세포(cytotoxic T lymphocytes : CTL)의 p815/18E7에 대한 항원특이적 세포살해능 검색 결과는 제10도에 나타내었다.
즉, 단계 1에서 제조한 표적세포 5×105개에 50㎍/㎖ 농도의 OAF(Octadecanoylaminofluorescene) 25㎕를 가하고 37℃에서 30분동안 배양하였다. 배양물을 차가운 complete RPMI 1640으로 3회 세척한 다음, 여기에 살세포(effector cell)를 표적세포에 대해 일정비율로 가하고 800rpm에서 단시간 교반한 다음(spin) 37℃의 CO2인큐베이터에서 3.5시간동안 배양하였다. 배양종료후 프로피듐 요오다이드(PI)를 가하고 1분동안 천천히 혼합하였다. PBS로 1회 세척하고 FACScan분석을 수행하여 OAF와 PI 이중염색된 세포집단, 즉 살세포에 의해 용해된 표적세포의 비율을 조사하였다.
그 결과, 살세포(effector)와 표적세포(target cell)의 비율을 각각 25:1, 5:1, 1:1로 유지하였을 때 항원특이적 살세포 효능이 대조군에 비교해서 각각 38%, 15%, 11%로 나타났으므로 이들이 표적세포를 효과적으로 살해하는 것을 관찰하였다. 즉, 18형 E7 재조합 단백질 항원에 특이적인 살세포가 증식된 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 18형 E7 재조합 단백질은 사람 파필로마바이러스 18형에 의한 감염으로 인해 자궁암이 발병한 경우 효과적인 치료백신으로 사용될 수 있으며, 아울러 자궁암의 치료제 및 예방제로도 개발될 수 있다.

Claims (2)

  1. 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET18E7(기탁번호 : KCTC 0167BP)로부터 수득된 비융합형이고 가용성인 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 사람 파필로마바이러스 18형의 감염으로 인한 자궁암 면역치료제 조성물.
  2. 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET18E7(기탁번호 : KCTC 0167BP)로부터 수득된 비융합형이고 가용성인 사람 파필로마바이러스 18형 E7 단백질을 유효성분으로 하여 약제학적으로 허용되는 부형제와 배합시킨 것임을 특징으로 하는 사람 파필로마바이러스 18형의 감염으로 인한 자궁암의 예방백신.
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