JP2000507232A

JP2000507232A - 慢性関節リウマチの病理発生に必要な関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発するために有用なワクチン組成物と方法

Info

Publication number: JP2000507232A
Application number: JP9532622A
Authority: JP
Inventors: エイ．カーソン、デニス; アルバーニ、サルバトーレ
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-06-13
Also published as: AU1975597A; US6153200A; AU727087B2; US5773570A; NZ331989A; KR100328112B1; NO984244L; CA2247804A1; NO984244D0; EP0923646A1; EP1939295A1; WO1997034002A1; KR19990087777A

Abstract

(57)【要約】慢性関節リウマチの病理発生に必要な関節炎誘発性ペプチドに対してホスト内において免疫防御を誘発するために有用なワクチン組成物が開示される。各ワクチン組成物は、抗原性ｄｎａＪｐ１、および場合によって細菌性ｄｎａＪタンパク質および／またはそのヒトホモログペプチドを（ペプチドまたは当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことによって）提供する。慢性関節性リウマチを発症しやすい素因をもつ者を特定する方法および本発明のワクチンを使用する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】慢性関節リウマチの病理発生に必要な関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発するために有用なワクチン組成物と方法関連米国出願本出願は、係属中の米国特許出願第08/246988号の部分継続出願である。合衆国連邦政府による研究支援に関する記述本発明は、アメリカ予防衛生研究所のグラントNo.AR25443により合衆国政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有するであろう。発明の背景１．発明の分野本発明は、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの制御および予防に関する。より具体的には、本発明は、ある種のＨＬＡタンパク質に含まれる配列と相同なアミノ酸配列（Ｑ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ）を含む関節炎誘発性ペプチド（arthritoge nic peptides）に対するホストの反応を減少または予防する方法および試薬に関する。２．従来技術の変遷ヒトでは例えば慢性関節リウマチのような自己免疫疾患は特定のＨＬＡ特異性に付随する傾向がある。特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、現在ではクラスII型ＨＬＡハプロタイプＤＷ４、ＤＷ１４、ＤＷ１５(すべてＤＲ４特異性を有する) および／またはＤＲ１と遺伝子レベルで関係していると考えられている。これらのハプロタイプの各々は、通常では“感受性配列”と呼ばれるアミノ酸配列（以下では“ＲＡ感受性配列”と称する、配列番号：１および２参照）を含む。ＲＡ感受性配列では１つのアミノ酸が変化することが分かっている、すなわちＱＲＲＡＡおよびＱＫＲＡＡ（以下では“Ｑ（Ｒ／Ｋ）ＲＡＡ”）。血清陽性ＲＡ成人忠者の９０％以上はまた、ＨＬＡＤＲ抗原分子の第三の高可変領域内にＲＡ感受性配列を有するＨＬＡＤＲ抗原をもつことが分かった。ＲＡ感受性配列は、重篤な血清陽性型若年性ＲＡ（ＪＲＡ）の患者を除きＪＲＡの開始に関係がなかった。感受性配列のＱＲＲＡＡ変種は、ＨＬＡハプロタイプＤＷ１４、ＤＷ１５およびＤＲ１で特定された。ＱＫＲＲＡ変種は、ＨＬＡハプロタイプＤＷ４で特定された。高度に保存されたこれら変種のホモログはまた、大腸菌（Escherichia co li）に由来する（その他の菌種クレブシーラ、プロテウス、サルモネラおよびラクトコッカスからも同様に得られる）ｄｎａＪ熱ショックタンパク質で特定されるとともに、エプスタイン・バーウイルス糖タンパク質ｇｐ１１０でも同様に特定された。１９９２年に、アルバーニら（Albaniら、J．Clin．Invest.，89:327-331(199 2)）は、組換えｄｎａＪ（ｒｄｎａＪ）を発現させてこれを精製したことを示唆する報告を発表した。精製ｒｄｎａＪは、ＤＷ４タンパク質由来のＲＡ感受性配列に対してウサギで作製した抗血清と特異的に結合した。ｒｄｎａＪに対して作製した抗血清はまた、ＤＷ４がホモ接合型であるＢリンパ球と結合するとともに、無傷の完全なＤＷ４タンパク質とも同様にインビトロで結合した。慢性関節リウマチにおけるｒｄｎａＪによって果たされるインビボにおける作用の役割またはメカニズムは提示されなかった。ＲＡの治療にＲＡ感受性配列を利用する１つの手段がこれまでに提唱された。これは、既知のヒトＨＬＡペプチドに由来するある種のＲＡ感受性配列ペプチドを用いてＲＡに対してヒトにワクチンで免疫を付与しようとするものである（ＰＣＴ出願公告WO9014835号(90年５月31日出願)、Carsonら、発明者ら）。細菌抗原に対する免疫反応を制御するもう１つの治療方法は、ストールら（St olleら）によって米国特許第4732757号で提唱された。ストールらは、ヒトの胃腸管に典型的に常在する広範囲の種類の無傷の完全な菌に対して乳牛の乳汁中に生じたＩｇＧ抗体を投与することを提唱した。ストールらがテストしたＩｇＧは、特定の細菌抗原を標的としないで無傷の完全な菌の混合物に対して作製された。この特許は、ｄｎａＪを含むある種の細菌の熱ショックタンパク質のＲＡ感受性配列が特定される前に特許権が付与された。したがって、ストールらによって記載されたこれらの抗血清は、ＲＡ感受性配列のペプチドに対して誘導されたものではなかった。これらＲＡ治療に対するいずれのアプローチも、関節炎誘発性ペプチドがＲＡ患者の全身的免疫系に表出される前に特異的に当該ペプチドを標的とするものではない。したがって、ＲＡ患者による関節炎誘発性ペプチドに対する全身反応を軽減するだけでなく、そのようなペプチドが患者のＧＩから全身性循環に遊離されることによって患者が当該関節炎誘発性ペプチドに曝露され異常を生じることを防止することができる治療が必要とされる。理想的には、そのような治療は忠者がＲＡを発症する前か、または当該疾患の初期段階で提供されるであろう。したがって、遺伝的または免疫学的にＲＡを発症する傾向を有する人々を特定する方法がまた必要とされる。本発明はこれらの必要性の各々に向けられる。発明の要旨本発明は、関節炎誘発性ペプチド（特にｄｎａＪ）に対するホストの感作を減少または回避する方法を含む。本開示の目的のために、“関節炎誘発性ペプチド ”という語句は、文脈が他の意味を要求しないかぎり、ＲＡ感受性配列を含むタンパク質およびそのペプチドフラグメントを指す。驚くべきことに、特にｄｎａＪペプチドの１つ（以下では“ｄｎａＪｐ１”、配列番号：４）が、血清陽性成人ＲＡ患者で比較的強い免疫反応を誘発することが分かった。本発明の特徴の１つでは、ｄｎａＪｐ１ペプチドワクチンの利点を高めるためにｄｎａＪｐ１の比較的強力な抗原性が利用される。そのようなワクチンは、細菌、合成または組換え体を供給源とするｄｎａＪｐ１を利用し、好ましくはｄｎａＪペプチドまたはヒトｄｎａＪペプチドホモログを含む抗原性ｄｎａＪｐ１の混合物を含む。また別には、本発明のワクチンは、ｄｎａＪｐ１をコードするプラスミドまたはウイルス組換え発現ベクターを含む。特に本発明の好ましいワクチンはｄｎａＪペプチドに対する経口耐性を誘発する。本発明の別の特徴では、抗体（好ましくはＩｇＡ）はｄｎａＪｐ１に対して（好ましくは乳汁中で）生成され、ＲＡ患者に（好ましくは経腸ルートにより、また、好ましくはＩｇＧのＦａｂフラグメントとして）投与される。本発明はまた、（１）関節炎誘発性ペプチドに対する細胞性および体液性免疫反応を測定し、（２）それぞれのＨＬＡＤＲ抗原のＲＡ感受性配列を検出することによって上記の治療を施すべき該当者をスクリーニングする方法を含む。本発明の好ましい実施態様の詳細は添付の図面および下記の記載で説明する。一旦、本発明の詳細が分かれば多くの新たな改善および変更が当業者には明白であろう。図面の簡単な説明図１は、無傷の完全な細菌ｄｎａＪタンパク質に暴露後の初期未治療ＲＡ（“ 初期段階”ＲＡ）の患者２２人から得た培養リンパ球の増殖の定量である。図１のグラフの棒線によって示した反応はリンパ球刺激指標として表現されている。すなわち、（ｄｎａＪを含む培養で検出されたＣＰＭ）／（ｄｎａＪを含まない培養で検出されたＣＰＭ）。“ＣＰＭ”はカウント／分(Counts/minute)を意味する。被験コントロール培養はＲＡでないヒトから得たリンパ球から成る。図２は、合成ｄｎａＪｐ１（アミノ酸配列ＱＫＲＡＡＹＤＱＹＧＨＡＡＦＥ；配列番号：４）または変異ｄａｎＪペプチド（アミノ酸配列ＤＥＲＡＡＹＤＱＹＧＨＡＡＦＥ(“ｄｎａＪｐＶ”；配列番号：５)）に細胞を暴露した後の成人および若年型ＲＡ（ＪＲＡ）患者から得た培養リンパ球の増殖の定量である。被験コントロール培養は、ＲＡでない（“健常”）成人から得たリンパ球から成る。図２のグラフの棒線によって示した反応はリンパ球刺激指標として表現されている。すなわち、（ｄｎａＪを含む培養で検出されたＣＰＭ）／（ｄｎａＪを含まない培養で検出されたＣＰＭ）。図３は、５１人の初期段階ＲＡ患者の別個の血清サンプルで生じた完全なｄｎａＪによる抗ｄｎａＪ抗体の活性抑制についての抑制実験の結果を示す。図３のグラフに棒線で示した％抑制は以下の式で表される：コントロール血清はＲＡでないヒトから得られた。図４は、酵素連結免疫アッセイによって測定したｒｄｎａＪに対するウサギ血清のインビトロ抗体反応を示す。結果は２個１組のプレート穴（ウェル）の４０５ｎｍにおける平均ＯＤで表される。図５は、精製ＨＬＡＭＨＣクラスII型エピトープに対するいくつかのｄｎａＪペプチドの結合効率を比較した表である。結合は、ビオチン標識ｄｎａＪペプチドおよび固定ＨＬＡ分子との間でＥＬＩＳＡによって検出した。結果は、４０５ｎｍでの吸収単位として表に示されている。被験ペプチドは以下の通り：ｄｎａＪｐ１（配列番号：４）、ｄｎａＪｐＶ（配列番号：５）、ｄｎａＪｐ２（配列番号：６）、Ｓ１（配列番号：７）およびＳ６（配列番号：８）。Ｓ１およびＳ２は合成ペプチドで、そのアミノ酸配列は既知のＨＬＡＤＲ抗原の配列と一致する。発明の詳細な説明Ｉ．本発明のワクチンの作用初期段階ＲＡのヒト患者は、ＲＡ感受性配列を有する微生物ペプチドに対して異常に高い細胞性免疫反応を有することが発見された。この発見によって、単球によって関節に運ばれる細菌抗原の無菌フラグメントに対する免疫反応によってＲＡは誘発されるか、または悪化するという結論が導かれる。さらに、これらの免疫反応に必要とされる分子は、ＨＬＡＤＷ４およびＤＲ１のＲＡ感受性配列と交差反応するようである。本発明は、ＲＡの病理発生に関する特定の理論のいずれに対しても制約を受けず、また依拠するものではないが、ＲＡに関与するように思われる免疫機構を本発明がなぜおよびどのように利用するかについての説明として下の考察を提供する。慢性関節リウマチの肉芽組織は単球系統の細胞で満たされている。ヒトでは（下等な動物とは対照的に）、これらの組織のマクロファージは効率的に分裂せず、循環血の単球から持続的に補給される必要がある。ｄｎａＪまたはｄｎａＪペプチドフラグメント（例えばｄｎａＪｐ１）およびそれに対するＩｇＧ抗体を含む免疫複合体は先ず最初に腸の粘膜領域で形成され、Ｆｃレセプターを有する循環血単球によって拾い集められると考えられる。これらの抗原負荷単球のいくつかは、全身を経て関節に移動する。ＲＡ感受性配列をもつ各個体のＴリンパ球はおそらく感作されてある種の関節炎誘発性ペプチドに過剰に反応し、その結果微量の抗原でも関節の炎症を開始させるに十分となるであろう。そのような極めて微量の普遍的な細菌抗原は、古典的免疫手段では決して検出できないであろう。一旦発症すると、滑膜炎は、免疫複合体形成ＩｇＧ（リウマチ様因子）並びに軟骨および結合組織の分解成分に対する抗体の更なる生成によって続くであろう。しかしながら、少なくとも初期段階の慢性関節リウマチは、関節炎誘発性ペプチドを含むＩｇＧ免疫複合体による循環単球の持続的負荷によって左右される。ある特定のｄｎａＪペプチドに対する免疫反応は驚異的に強い反応であることが分かった。図２に示したように、ｄｎａＪｐ１ペプチド（配列番号：４）は、成人ＲＡ患者の血液由来リンパ球の増殖を、ｄｎａＪｐＶペプチド(配列番号：５、これはアミノ酸２つだけがｄｎａＪｐ１の配列と異なっている)に対する同じ細胞の反応のほぼ１０倍の強度で刺激する。ｄｎａＪｐ１ペプチドは、ヒトＨＬＡＤＷ４ペプチド（例えばＳ１およびＳ６、配列番号：７〜８、これらはまたＲＡ感受性配列を含む）と結合するよりもＨＬＡＭＨＣクラスII分子のエピトープとより強力に（１００倍またはそれ以上の強度で）結合する。結合親和性におけるこれらの相違は、初期慢性関節リウマチで見られる強力なＴ細胞反応の説明となるであろう。本発明のワクチンによる治療のための適切な該当者を特定する方法を以下で開示する。II ．本発明のワクチン組成物本発明は、関節炎誘発性ペプチドに対するインビボ反応に対抗する防御を提供するためにワクチン中の抗原としてｄｎａＪｐ１を利用する。特に、ＲＡであるかまたはＲＡ発症の虞があると診断された成人及び幼年者は、本発明にしたがって治療的に有効量のｄｎａＪｐ１ワクチン組成物で治療されるであろう。本発明のｄｎａＪｐ１ワクチンは、（１）精製ｄｎａＪｐ１ペプチド、合成ｄｎａＪｐ１ペプチドまたは組換えｄｎａＪｐ１ペプチドを含むワクチン組成物；（２）ｄｎａＪｐ１ペプチドおよび１つまたは２つ以上のヒトｄｎａＪ同族体を含むワクチン組成物；（３）ｄｎａＪｐ１ペプチドおよびｄｎａＪタンパク質の１つまたは２つ以上の他のペプチドフラグメントを含むワクチン組成物;または（４）ｄｎａＪｐ１ペプチドをコードするプラスミドまたはウイルス組換え発現ベクターのワクチン組成物を含む。Ａ．ペプチドワクチン組成物組換え型ペプチドの精製、合成または産生技術は当技術分野で周知で、本発明で使用するために十分な純度の抗原ペプチドの産生に適している。この点に関して、“実質的に純粋”という用語は、インビボにおいて通常付随している他の物質を実質的に含まないタンパク質を意味する。本発明では、当該用語は、ＲＡ感受性配列を含む均質なタンパク質またはペプチド（特にｄｎａＪｐ１、ｄｎａＪペプチドおよびヒトｄｎａＪペプチドホモログ）を指し、この場合均質性は、当業者に既知の純度基準(例えば当該タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を得るために十分な純度)を参考に決定される。実質的に純粋な関節炎誘発性タンパク質およびペプチドは、無傷の完全な微生物（特に細菌）から、微生物発現により、合成により、および／または当業者に既知の精製手段（例えばアフィニティークロマトグラフィー）によって得ることができる。そのような技術を利用してｄｎａＪ（ｄｎａＪｐ１を含む）の抗原性ペプチドフラグメントを得ることができる。ｄｎａＪｐ１および幾つかの他のｄｎａＪタンパク質フラグメント（ペプチド）のアミノ酸配列は、本明細書に添付した配列表で配列番号：４〜６として示されている。さらに、大腸菌ｄｎａＪタンパク質の完全な長さのアミノ酸配列は配列番号：１で示されている。記載した完全なタンパク質および各ペプチドは抗原性を有するが、ｄｎａＪｐ１ペプチドの抗原活性は、記載した他のｄｎａＪペプチドの活性よりも実質的に高い。幾つかの他の細菌性ｄｎａＪタンパク質およびヒトｄｎａＪ同族体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は知られている。例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のｄｎａＪのアミノ酸配列は報告されている(Van Ass eldonkら、J．Bact.，175:1637-1644(1993))。さらに、ヒトｄｎａＪホモログのアミノ酸配列および／またはヌクレオチドコード配列（ＲＡ感受性配列を欠く）も報告された(Chellaiahら、Biochem．Biophys．Acta，117:111-113(1993);Ohら、Biochem．Biophys．Acta，117:114-116(1993);Raabe & Manley，Nuc．Acids R es.，19:6645(1992);およびSugitoら、FEBS Lett.，358:161-164(1995))。本発明のｄｎａＪｐ１ｐｅプチドまたはｄｎａＪｐ１コードポリヌクレオチドを含む混合物のためにワクチン成分を特定しさらに構築することに関する参考として、これらの参考文献は参照により本明細書に含まれる。そのような配列を参考にして、本発明のワクチン組成物として有用なタンパク質およびペプチドは、アルファアミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような一般的に使用される方法によって合成できる。両方法とも、ペプチドのＣ末端から開始し、１つのアミノ酸が各段階で付加される段階的合成を伴う（Coliganら、「免疫学の最新プロトコル(Current Prot ocols in Immunology)」、Wiley Interscience刊、ユニット９(1991))。本発明のペプチドはまた、０．１〜１．０mMolアミン／ｇポリマーを含むコポリ（スチレンジビニルベンゼン）を用いて、周知の種々の固相ペプチド合成法（例えばメリーフィールド(Merriefield，J．Am．Chem．Soc.，85:2149(1962))およびスチュアートとヤング(Stewart & Young，「固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide s Synthesis)」、Freeman，San Francisco，pp27-62(1969))によって記載された方法）によって合成できる。化学合成の終了時にこのペプチドを脱保護し、液体ＨＦ−１０％アニソールで約１／４〜１時間０℃で処理してポリマーから切断できる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液を用いてポリマーから抽出し、続いてこれを凍結乾燥させて粗物質を得る。通常は、これをフィニティーカラムで溶媒として５％酢酸を用いてゲル濾過のような技術によって精製できる。当該カラムの適切な分画の凍結乾燥によって均質なペプチドまたはペプチド誘導体が得られる。続いてアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光測定法、分子旋光度、可溶性および固相エドマン分解による配列決定のような技術によって性状を決定できる。患者の症状にしたがって、患者の全身性免疫系に作用する免疫刺激剤および／または免疫抑制剤を投与することもまた所望されるであろう。当該活性を有する適切な物質は当技術分野で周知で、これらにはインターロイキン−６（サプレッサー／細胞毒性Ｔ細胞の刺激用）がシクロスポリンＡおよび抗ＣＤ４抗体（免疫抑制用）と同様に含まれる。そのような化合物は、本発明のワクチンと別々にまたは混合物として投与できる。本発明のｄｎａＪｐ１ペプチドワクチンは、当該ワクチンの活性成分を生理学的に許容できる担体と混合して調製できる。そのような担体は受容者にとって用いられた投与量および濃度では無毒であろう。通常、そのような組成物の調製は、個々のワクチン抗原を食塩水、緩衝液、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコースまたはデキストランを含む）またはキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定剤および賦形剤と混合することを必要とする。そのような組成物は、懸濁液、乳剤または凍結乾燥形で医薬的に許容できる形へ適切に調製され、所望の適用について使用が承認されているであろう。ＴＧＦ−βを含む組成物に関しては、ＴＧＦ−β系の化合物は通常は不活性な前駆体の形で製造され、酸またはプロテアーゼに曝露することによって活性化される。したがって、当業者は、ＴＧＦ−β成分のインビボ活性化に干渉したり、当該成分を未熟なままに（すなわち当該組成物の投与前に）活性化したりしない、本発明のＲＡワクチン組成物で使用できる担体および／または賦形剤を選択することができるであろう。Ｂ．本発明のヌクレオチドワクチンワクチン”としてｄｎａＪｐ１コードポリヌクレオチドを投与することによって一定の利が得られるであろう。例えば、抗原それ自体の代わりに当該抗原をコードするポリヌクレオチドを投与してインビボで発現させる場合には、蛋白性抗原ワクチンに付随する潜在的毒性の虞（例えば過敏性ショック）は実質的に回避される。本明細書で用いられるように、“ポリヌクレオチド”とは、別々のフラグメントの形態にあるか、または大きな構築物の成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本発明のｄｎａＪ／ｄｎａＪｐ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え遺伝子発現ベクターに挿入された二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであろう。そのようなポリヌクレオチドはまた非複製型であるか、またはホストのゲノムに組み込まれて複製しないように当技術分野で周知の手段によって遺伝子操作されるべきである。ｄｎａＪｐ１および本発明で問題の抗原性を有する他の免疫刺激性または免疫抑制性ペプチドのコードヌクレオチド配列は、(不明の場合は)細菌およびヒトのゲノムの縮退を考慮に入れながら当該アミノ酸配列から推定することによって容易に決定できる。ｄｎａＪタンパク質（ｄｎａＪｐ１を含む）のコードポリヌクレオチド配列は、配列番号：１として添付の配列表で提供される。核酸のハイブリダイゼーションによるスクリーニング方法は、適切なプローブまたは抗体が利用可能であることを条件にいずれの生物からもいずれのポリヌクレオチド配列を分離することも可能にする。問題のタンパク質をコードする配列の一部分に該当するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成できる。これにはアミノ酸配列の短いオリゴペプチド片を知るか、または推定することが必要である。例えば、ｃＤＮＡ由来の種々のｍＲＮＡを卵母細胞に注射し、当該ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が生じるために十分な時間を与え、所望のｃＤＮＡ発現の有無を例えば問題のポリヌクレオチドによってコードされたペプチドに特異的な抗体を用いるか、または問題のポリヌクレオチドによってコードされるペプチドに特徴的な繰り返しモチーフのためのプローブおよび組織発現パターンを用いることによって、問題のポリヌクレオチドを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。また別には、当該ペプチドに特異的な抗体を用いて少なくとも１つのエピトープを有する問題のペプチドの発現について間接的にｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような抗体は多クローン的または単クローン的に誘導され、問題のｃＤＮＡの存在を示唆する発現生成物を検出するために用いることができる。本発明で使用するポリヌクレオチドはまた、当技術分野で周知の技術および核酸合成装置を用いて合成できる。これに関する参考としては以下を参照されたい :Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、第２および４章、Wiley Inte rscience刊(1989)（ゲノムＤＮＡについて）およびManiatisら、「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manua1)」、Cold Sp ring Harbor Lab.,刊、ニューヨーク(1982)（ｃＤＮＡについて）。構築と使用の容易さのゆえに、一般には合成ポリヌクレオチドおよびｃＤＮＡが、本発明の組換え遺伝子発現ベクターでの使用には好ましい。本発明の組換え遺伝子発現ベクターは、好ましくは抗原をコードする本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはコスミドであるが、またウイルスもしくはレトロウイルスでもよい。当該ベクターは“裸”、すなわち運搬用担体（例えばリポゾーム、コロイド粒子など）と結合してない形であることが好ましい。便利さのために、本明細書で用いられている“プラスミド”と言う用語は、問題のペプチドの発現に使用するためにどちらが適切であるかによってプラスミドまたはコスミドを指す（この場合、両者の間の選択は問題のペプチドをコードする遺伝子のサイズによって決定される）。“機能的にコードする”ということは、ポリペプチドの発現に必要な調節配列（例えばプロモータ）の全てと結合している遺伝子を意味する。外来構造遺伝子挿入物を機能的にコードする一般的に用いられるプラスミドベクターはpBR322PLASMIDである。pBR322はマーカーとしてアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含むが、ヒトで使用するためには、そのようなアンピシリン耐性は避けるべきである。遺伝子免疫プロトコルで有用であるがアンピシリン耐性は付与しない改変ベクターは本出願と共有の米国特許出願第08/593554号（1996年１月30日出願、当該出願文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。本発明で利用できる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターはネズミまたはニワトリのレトロウイルスに由来するものである。ただ１つの外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（HaMuSV）、ネズミ乳癌ウイルス(MuMYV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が含まれるが、但しこれらに限定されない。多くのまた別のレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を取り込むことができる。これらのベクターの全ては選択可能マーカーを伝達または取り込むことができ、それによって形質導入細胞を特定し増殖させることができる。組換えレトロウイルスは不完全であるので、感染性ベクター粒子の産生のために助けが必要である。この助けは、例えばヘルパー細胞株を用いることによって供給される。ヘルパー細胞株は、ＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含んでいる。これらのプラスミドは、被包化のためにパッケージング機構がＲＮＡ転写物を認識することを可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルが欠落しているヘルパー細胞株には例えばΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が含まれるが、但しこれらに限られない。これらの細胞株は、ゲノムが包み込まれないので空のウイルス粒子（ヴィリオン）を産生する。そのようなパッケージングシグナルは無傷であるが、構造遺伝子は目的の他遺伝子で置き換えられているようなヘルパー細胞に、レトロウイルスベクターが導入されると、当該ベクターはパッケージングされ、ベクターヴィリオンが産生される。投与のためには、本発明のヌクレオチドワクチンを例えば食塩水のような担体中に含有させることができる。また望ましさは劣るが、例えばリポゾームまたはコロイド粒子のような配送用担体とともに投与してもよい。そのような配送用担体の調製および使用方法は当業者には周知であり、また当業者はそれらを容易に突き止めることができる。II. 本発明の治療法に適合する該当者を特定するために有用な試薬と方法Ａ．本発明の治療法に適合する該当者の特徴本発明の治療法に適合する主な該当者は、初期段階のＲＡを有する者または当該疾患の発症の傾向を有する者である。これに関しては、ＨＬＡ分子がＲＡ感受性配列を含む場合は、１つの警告としてそのような個体はＲＡを発症する“傾向がある”と考えることができる。しかしながら、この警告は、ある種の“正常な”個体（すなわちＲＡの家族歴をもたず、その者自身もＲＡを発症していない）は、それにもかかわらずＲＡ感受性配列を含む内因性ＨＬＡＤＲ抗原を有するという発見に基づいている。しかも、これらの個体ではＲＡ感受性配列の存在にもかかわらず、ＨＬＡ抗原のＲＡ感受性配列に対して自己免疫反応を生じないであろう。先に見出された知見から、ＲＡの発症には、非自己としてＲＡ感受性配列を認識させるＴ細胞系の感作だけでなく、ＲＡ患者における抗ＲＡ感受性配列抗体の産生が密接に関係しているらしいということが推定できる（例えば実施例IVおよび図３を参照のこと、これらはＲＡ患者由来のリンパ球における抗体結合のｄｎａＪによる抑制が示されているが、その抑制強度は正常な個体由来リンパ球で認められる抑制を凌駕する）。したがって、そのＨＬＡ抗原がＲＡ感受性配列を含み、抗ＲＡ感受性配列抗体を産生する個体は、本発明にしたがえばＲＡの“傾向を有する”と考えられるであろう。初期段階ＲＡを有するか、またはＲＡの傾向を有する個体を特定するスクリーニング方法（“ＲＡスクリーニング方法”）を下記で述べる。Ｂ．ＲＡスクリーニング方法の工程ＲＡスクリーニング方法は、一般に（１）ＲＡ感受性配列が各個体のＨＬＡ分子（特にＤＷ４分子）に存在するか否かを検出し、さらに（２）当該各個体のリンパ球が関節炎誘発性タンパク質またはペプチド(特にｄｎａＪｐ１)の抗原形に曝露されたことに反応して抗体を産生するか否かを検出する工程を含む。また別には、当該スクリーニング方法は後者の工程のみを含むことができる。なぜならば、各個体のリンパ球がＲＡ感受性配列タンパク質に曝露されたことに反応して抗体を産生するならば、当該個体はおそらくＲＡを発症するであろうと推定できるからである。ＲＡスクリーニング方法のＨＬＡ型決定工程を実施するために、生物学的サンプル(これはリンパ球を含んでいるであろうと思われるいずれの液体または組織でもよいが、好ましくは末梢全血または髄液であろう(“リンパ球サンプル”)) が、ＲＡについてスクリーニングされる個体から慣用的な技術を用いて採取される。各個体のＨＬＡ分子がＲＡ感受性配列を含むか否かを決定するために、当業者に周知の通常のＨＬＡ型決定技術を用いることができる。これに関して、極めてよく知られているＨＬＡ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が相当に性状が調ベられており、容易に特定できることは理解されよう（Marshら、Tissue An tigens，37：181-189(1991)；およびBodmerら、Tissue Antigens，37：97-105(1 991)）。例えば、マーシュら(Marshら)およびボドマーら（Bodmerら）が報告したポリヌクレオチド配列および／または本明細書に添付した配列表に含まれるポリヌクレオチド配列を参考にして、当業者は、リンパ球サンプル中の特定のＨＬＡ抗原の検出のために標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを構築できるであろう。適切なプローブを構築する技術およびハイブリダイゼーションを実施する技術は以下で極めて詳細に述べる。当業者は、過重な実験を行うことなくそれらを利用することができる。通常はしかしながら、ＨＬＡ型決定は、血清学的、すなわちリンパ球サンプルに対して（限定的特性をもつ）標準化抗血清を補体とともに用い、テスト細胞が死ぬか否かを観察することによって実施される。ＨＬＡ型決定はまた、“混合リンパ球反応”のような慣用的な免疫学的技術によって実施される。この反応では、テストリンパ球は限定されたＨＬＡ特異性をもつＢリンパ球と混合される。混合リンパ球反応では、既知のＨＬＡ型をもつＢ細胞と異なる特異性をもつテスト細胞は刺激されて分裂する。これらＨＬＡ型決定技術は全て、当業者の通常のレベル内で実施できる。ＲＡスクリーニング方法の免疫アッセイ工程を実施するために、関節炎誘発性ペプチドを液相または固相（担体に結合させる場合）免疫アッセイ様式のいずれかで抗関節炎誘発性ペプチド抗体を用いてリンパ球サンプルで検出できる。これらの様式で使用する抗体は以下で述べるように作製できる。固相アッセイ様式で使用するよく知られた担体の例にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的に合致するためには担体の性状は可溶性でも不溶性でもよい。本発明の抗関節炎誘発性抗体を利用することができる免疫アッセイの種類の例は、直接または間接様式の競合および非競合免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例には、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫測定）アッセイがある。本発明の抗体を用いる関節炎誘発性ペプチドの結合は、正方向、逆方向または同時態様で進行する免疫アッセイ（生理学的サンプル上での免疫組織化学アッセイを含む）を用いて実施できる。当業者は過重な実験を行うことなく他の免疫アッセイ様式を容易に突き止めることができるであろう。実施例Ｖのプロトコルは、どのようにＲＡスクリーニング方法を免疫アッセイ（酵素連結免疫吸着アッセイまたはＥＬＩＳＡ）によって実施するかについての説明である。ＲＡスクリーニング方法の好ましい態様では、初期段階のＲＡが疑われるか、または当該疾忠の傾向を有すると思われる者から慣用的な手段によって得られたリンパ球を培養し、抗原性ＲＡ感受性ペプチド（好ましくはｄｎａＪｐ１（配列番号：４）、上記のように作製）に曝露する。続いて当該抗原性ｄｎａＪペプチドに対する培養リンパ球の細胞性免疫反応を検出する。また別には、このプロトコルは、実施例IVで述べるように抑制実験として実施できる。すなわち、この場合はｄｎａＪｐ１ペプチドと予め保温することによりいずれの抗体結合低下も検出される。本発明の抗関節炎誘発性ペプチド抗体はまた検出可能なように標識される。当業者に知られている多くの異なる標識および方法がある。本発明で用いることができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物が含まれる。当業者は、日常的な実験によって本発明の抗関節炎誘発性ペプチド抗体との結合に適切な他の標識を知ることができるであろう。さらに、本発明の抗関節炎誘発性ペプチド抗体とこれら標識との結合は、当業者にとって一般的な標準的技術を用いて行うことができる。より高い感度をもたらす別の標識技術は、低分子量ハプテンと抗体を共役させることから成る。続いてこれらのハプテンを第二の反応手段によって特異的に検出することができる。例えば、このような目的のために、例えばビオチン（これはアビジンと反応する）のようなハプテンを用いることが一般的である。そのＨＬＡＤＲ抗原分子がＲＡ感受性配列ペプチドを含むがそれにもかかわらずＲＡの傾向をもたない個体と、遺伝的にＲＡになりやすい個体とを区別するために、抗原性ｄｎａＪまたはＲＡ感受性配列ペプチドに対する免疫反応を生じる各人の能力もまた検査できる。最後にリンパ球サンプルは抗原性を有する関節炎誘発性ペプチドと保温される。続いて、当該サンプル中に産生された一切の抗関節炎誘発性ペプチド抗体を、上記または実施例Ｖで述べるように適切な免疫アッセイ様式で検出する。検出の便利性のために、抗原性を有する関節炎誘発性タンパク質またはペプチドは、上記で説明した通り検出可能なように標識できる。Ｃ．スクリーニング方法で使用する試薬およびキット本発明のＲＡスクリーニング方法で使用する試薬は、関節炎誘発性ペプチド( 好ましくは上記で述べたように合成または組換え手段によって製造されたもの) 、免疫アッセイ用抗体、並びにＨＬＡスクリーニング用ハイブリダイゼーションアッセイで使用する、ＨＬＡ分子をコードするポリヌクレオチドを相補しこれと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含む。ＲＡスクリーニング方法を実施する際に使用する便利で保存可能な包装物としてこれらの試薬の１つまたは２つ以上を含むキットは、本発明の範囲内に包含される。本発明のスクリーニング方法で使用されるペプチドおよびオリゴヌクレオチドを得る方法は上記のいずれかの箇所に記載されている。当該方法で使用する抗体は完全な関節炎誘発性タンパク質の他に合成または組換えペプチドに対しても作製できる。そのようなペプチドはＲＡ感受性配列を含み、好ましくはｄｎａＪｐ１（配列番号：４）から成る。例えば、本発明の方法で使用する抗原性を有する適切な関節炎誘発性ペプチドは、本明細書に添付した配列表に配列番号：４および５として記載されている。配列番号：４および５のＲＡ感受性配列に続くアミノ酸は、Ｔ細胞のＲＡ感受性配列による活性化に必要ではないようであるが、ペプチドを強く荷電ししたがって抗原性を引き起こす。最後に、本発明の抗体を製造する際に使用する抗原性を有する関節炎誘発性ペプチドとして好ましいものは全長が少なくとも約７〜１５アミノ酸であろう。抗血清がＲＡ感受性配列に特異的であることを担保し、さらに比較的大量の抗原性ペプチドの製造を可能にするために、好ましくは抗体は関節炎誘発性組換えペプチドに対して作製される。最も好ましくは、本発明の抗体は乳汁（特に牛乳）中に産生され、ＩｇＧの産生を選択的に刺激するであろう（したがって他のＧＩ細菌性抗原以外の関節炎誘発性ペプチドに対する抗血清の特異性を高める）。本発明の抗体はまた、個体のＧＩ管由来の大腸菌集団において、および下記で述べるある種の治療方法においてＨＬＡ分子上のＲＡ感受性配列の存在を検出するために有用であろう。正常な動物でｄｎａＪまたは別の関節炎誘発性タンパク質またばペプチドに対する免疫反応を誘発するために、当技術分野で周知の結合技術を用いて担体タンパク質と共役させることによって当該タンパク質またはペプチドの抗原性を高めることができる。それらの抗原性を高めるために分子に化学的に結合させる一般的に用いられる物質には、カサガイ（ke yhole limpet）ヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドが含まれる。続いてこの共役分子を用いて動物（例えばマウス、ウサギまたは乳牛）を免疫する。抗原性タンパク質による動物の免疫で用いるためには多数回注射による免疫プロトコルが好ましい（例えば以下の成書を参照されたい：Langoneら編、「少量の免疫原による抗血清の作製：多数回の皮内注射(Production of Antisera with Small Doses of Immunogen:Multiple Intradermal Injections)」、Methods of Enzymology，Acad．Press刊(1981)）。例えば、抗体反応は以下のようにして得られる：フロイントの完全アジュバント中で乳剤化させた１ｍｇの抗原性タンパク質をウサギの皮内に注射し、数週間後にフロイントの不完全アジュバント中の同じ抗原を１回または２回以上追加免疫する。本発明の治療用抗体を乳牛で作製するために特に好ましい方法は以下でさらに述べる。さらに免疫動物で産生された多クローン性抗体は、例えば当該抗体を作製したタンパク質またはペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、さらに溶出させることによって精製できる。当業者は、多クローン性抗体とともに単クローン性抗体の精製および／または濃縮について免疫学分野で一般的な種々の技術について知識を有するであろう(Coliganら、「免疫学の最新プロトコル(Current Pro tocols in Immunology)」、ユニット９、Wiley Interscience刊(1991)を例えば参照のこと))。単クローン性抗体の調製のためにはマウスまたはウサギを免疫するのが好ましい。本明細書で用いられるように“抗体”という用語は、完全な分子とともにそのフラグメント、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２（これらは関節炎誘発性タンパク質またはペプチドと結合できる）もまた含むことが意図されている。さらにまた、ここでは“本発明のｍＡｂ”という用語は、関節炎誘発性タンパク質またはペプチドに対する特異性をもつ単クローン性抗体を指す。ハイブリドーマによって分泌される単クローン性抗体（“ｍＡｂ”）の製造に用いられる一般的な方法は周知である（Kohler & Milstein，Nature，256:495(1 975)）。簡単に記せば、上記文献(Kohler & Milstein)に記載されているように、当該技術は、メラノーマ、子宮頸部の奇形癌または子宮頸癌、グリオーマまたは肺癌のいずれかをもつ５人の別個の癌患者の局所排出性リンパ節からリンパ球を分離することを含む。リンパ球は外科的切除検体から得られ、これはプールされた後ＳＨＦＰ−１と融合された。ハイブリドーマは癌細胞と結合する抗体の産生についてスクリーニングされた。関節炎誘発性タンパク質に対する特異性をもつｍＡｂを生成しさらにこれを特定するために、同等な技術を用いた。本発明のｍＡｂ間における関節炎誘発性タンパク質の特異性の確認は、問題のｍＡｂの基礎反応パターンを決定する比較的日常的なスクリーニング技術(例えば酵素連結免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ))を用いて達成できる。また、本発明のｍＡｂがＲＡ関節炎誘発性タンパク質と結合することを被験ｍＡｂが阻止するか否かを決定してｍＡｂを評価することによって、過重な実験を行うことなく被験ｍＡｂが本発明のｍＡｂと同じ特異性を有するか否かを決定することができる。本発明のｍＡｂによる結合の減少によって示されるように、被験ｍＡｂが本発明のｍＡｂと競合する場合には、これら２種の単クローン性抗体は同じかまたは密接な関係を有するエピトープと結合すると考えられ。ｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を有するか否かを決定するまた別の方法は、本発明のｍＡｂを通常それが反応性を有すると思われる抗原と予め保温し、当該抗原と結合する被験ｍＡｂの能力が抑制されるか否かを決定する。当該被験ｍＡｂの能力が抑制される場合は、それは本発明のｍＡｂの場合と同じエピトープとおそらく結合する。III ．本発明の治療方法Ａ．本発明のワクチンの使用方法本発明のペプチドワクチンは、好ましくは患者のＧＩ管でのＩｇＡ産生を選択的に刺激し、さらに経口耐性を誘発するために十分な態様で投与される (動物およびヒトに抗原を食物として供給することによって経口耐性を誘発することに関しては次の文献を参照されたい:Husbyら、J.Immunol.，152:4663-4670( 1994)、この文献は、抗原に対する経口耐性に関する当技術分野における知識の状況を説明するために参照により本明細書に含まれる)。したがって、本発明の抗原性ペプチドは、好ましくはＩｇＡへのＩｇＭスィッチングを誘発することが分かっている免疫刺激剤と同時に投与されるであろう。この免疫刺激剤としては例えばＴＧＦ−βがあり、全身性ヘルパーＴ細胞活性もまた抑制することができる。最も好ましくは、ワクチンの効果をＧＩ管に局在させるために本発明の抗原性ペプチド／ＩｇＡ免疫刺激剤は経腸的に投与される。また別には、本発明のペプチドワクチンは、免疫治療技術で許容されるいずれの態様でも（例えば血管内）投与できる。本発明のヌクレオチドワクチンの好ましい投与方法には皮内を経る方法がある。問題の抗原性ペプチドをコードする組換え遺伝子発現ベクターを利用する皮内遺伝子免疫法は、本出願と共有の米国特許出願第08/593554号（1996年１月30日出願）および第08/446691号(1995年６月７日出願)(これらは共に参照により本明細書に含まれる)に開示されている。簡単に記せば、これらの開示においては組換え遺伝子発現ベクターは、例えば注射、吸収またはホストの皮膚もしくは粘膜の経皮的通過の手段によって投与される。また別に、本発明のヌクレオチドワクチンは免疫学技術で許容される手段のいずれによっても（例えば筋肉内注射）投与できる。本発明のペプチドおよびヌクレオチドワクチンの投与プロトコルは、患者の年令、体重および症状と同様にそれらの組成物によって変動する。しかしながら、ＲＡペプチドワクチン投与の好ましいプロトコルは、免疫学的に有効量のワクチンを毎日経口（経腸）投与することを必要とするが、これは他の治療形態(例えば上記で述べた方法および慣用的な抗炎症療法(例えばステロイド性または非ステロイド性抗炎症剤および／または鎮痛剤の使用))とともに、または単独で実施される。投薬の頻度にしたがって、本発明の各ペプチドワクチンの免疫学的に有効な投与量の範囲は、１００μｇ〜１００ｍｇ（好ましくは１〜１００ｍｇ）の抗原性タンパク質またはペプチドである。抗原性ペプチドの毎日の投与量は最も好ましくは約１ｍｇ／日で投与される。本発明の方法にしたがって供給される各組換え遺伝子発現ベクターの投与量は、所望されるホストの反応および使用されるベクターによって達成される遺伝子発現レベルにしたがって変動するであろう。一般に、裸の組換え遺伝子発現ベクターの経皮ルートによる導入のためには、１００〜２００μｇまでのポリヌクレオチドが１回の投薬で投与できると期待されるが、皮膚または粘膜を通して投与されるポリヌクレオチドはわずか０．３μｇで長時間にわたる免疫反応を誘発することができる。しかしながら本発明の目的のためには、裸の遺伝子発現ベクターが、当該ポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドの発現を引き起こすために十分な投与量で供給されることが必要十分条件である。これらの投与は、種々の免疫刺激的発現レベルを達成するために改変される。発現されたペプチドの存在および量を確認する手段は当業者には周知であり、したがって詳細には述べない。そのような手段のあるものは以下に提供する実施例で例示するが、一般にそれらは免疫アッセイ（例えば酵素連結免疫吸着アッセイ）、ＰＣＲ技術および当技術分野で周知の技術にしたがって実施される免疫組織学的分析を含む。投与されるポリヌクレオチドの量は、このような検出手段および定量手段とともに臨床技術に習熟した医師にとって既知のインビボの臨床的徴候を基にして所望の発現レベルを達成するために調節される。好ましくは、本発明の裸の遺伝子発現ベクターは、“低”用量で投与されるであろう(例えばマウスで約５０μｇまたはそれ未満の免疫刺激ポリヌクレオチド) 。当業者は容易にヒトで使用するこれに匹敵するレベルを決定することができる。当業者は、ワクチン接種および免疫療法プロトコルで用いられる投与工程（すなわち、プライミング、追加免疫および免疫維持投与）に精通しているであろう。この投与工程は、本発明の方法で使用するために適している。ＲＡワクチン中のいずれの免疫刺激／免疫抑制成分も慣用的な用量で用いられるであろう(例えば１〜１００μｇ／ｋｇのインターロイキン６)。そのような用量は当業者には既知であるか、または容易に求めることができるであろう。初期段階のＲＡ患者の治療は、ＲＡの見なし終了点(surrogate end-point)を認めるまで、またはその後も継続することができる。これについては下記のIII節Ｂでさらに詳述する。ＲＡの傾向を有するが未だ発症していない患者のワクチンによる免疫付与は、患者のＧＩ管の液体中および／または末梢血液循環中の抗関節炎誘発性ペプチドＩｇＡの検出可能な増加を得るために十分な、本発明のＲＡワクチンの１回または２回以上の短期投与によって達成できる。しかしながら、一般に本発明のＲＡワクチンの好ましい使用は、初期段階ＲＡの患者での使用である。Ｂ．本発明の方法の治療的有効性の証拠時間経過に対する本発明の治療方法の有効性は、一般に、ＲＡの傾向を有する（しかし当該疾患を発症していない）患者におけるＲＡの臨床症状が認められないということによって判定できる。ＲＡであると診断された患者では、本発明の有効性は、患者の症状の重篤度の軽減によって、または当該疾患の見なし終了点の現われによって判定されるであろう。ＲＡの臨床症状に関する慣用的なパラメーターおよび当該疾忠の見なし終了点は当業者には周知で、間接の柔軟性に関する“リッチー指数(Ritchie Index)” 測定(Ritchieら、Q.J．Med.，37:393-406(1968))、腫脹関節数、早朝の関節の強張りの１日の持続時間、握力、可視アナログスケールによる疼痛の強さ(Huskiss onら、Lancet，2:1127-1131(1974))、および患者の抗炎症剤および／または鎮痛剤使用の相対的レベルが含まれる。大腸菌抽出物の二重盲検臨床試験(Brackertzら、J．Rheu・.，16:19- 23(1989))を基に、当業者は、本発明のＲＡワクチンおよび抗体組成物の臨床的耐性が良好であることを期待できるであろう。最も出現し易い副作用（例えば胃腸の刺激）の重篤度は低いと思われる。これらの組成物の毒性は、慣用的な手段、例えばヘマトクリット、ヘモグロビン、スロンボサイトおよび類リウマチ因子レベルのような変動値のアッセイによる周期的な検査とともに、血液化学的アッセイによってモニターできる。Ｃ．受動的抗体療法上記のいずれかの箇所で記載したように、少なくとも初期段階のＲＡは、関節炎誘発性タンパク質およびペプチド（例えばｄｎａＪｐ１）を含むＩｇＧ免疫複合体をもつ循環単球の持続的負荷に依存する。この“負荷”は、少なくとも部分的には、関節炎誘発性タンパク質、ペプチドおよび／または関連抗原の血液循環中への漏出を防止するために十分な抗体（特にＩｇＡ）を産生できないＧＩ免疫系の不全によって可能になる。したがって本発明のもう１つの治療方法は、初期段階ＲＡであるか、または当該疾患の傾向を有する個体に抗体を導入することを目的とする。好ましくは、そのような抗体療法は、本発明のワクチン投与に関して上記で述べたワクチン接種プロトコルに対するアジュバントとして実施される。これらの抗体は上記で述べたように産生され（この場合は好ましくは単クローン性抗体である）、好ましくは腸溶皮被覆錠剤形で経腸的に投与されるであろう。また別には、これら抗体は以下で述べるように乳汁中に産生されるであろう。使用される抗体（以下では“ＲＡ治療抗体”）は、ｄｎａＪタンパク質またはｄｎａＪｐ１ペプチドに特異的であろう。ＲＡ治療抗体は、天然、合成または組換え形由来のこれら抗原で動物を免疫することによって製造される。使用される抗原は、ＲＡ感受性配列を（特にｄｎａＪｐ１の部分として）発現するいずれの生物由来であってもよいが、好ましくは腸管に常在し、熱ショックタンパク質の部分として当該ペプチドを発現する微生物に対して作製される。最も好ましくは、この抗原は大腸菌に由来するであろう（ヒトのＧＩ管でのこの菌種の普遍性による）が、抗体が広範囲の微生物スペクトルに由来する関節炎誘発性タンパク質およびペプチドに特異的であるということを担保するために、種々の微生物種から得られた抗原混合物に対して作製してもよい。乳汁中でＲＡ治療抗体（これは続いて“免疫ミルク”として治療のために投与できる）を生成するために、上記に一般的に述べたように授乳動物（好ましくは乳牛）を抗原性ＲＡ感受性配列ペプチドで免疫する。乳牛の乳汁は、ヒトのＧＩ管での吸収性のゆえに好ましいＲＡ治療抗体産生媒体である。乳汁を採集して滅菌し、好ましくは貯蔵のために慣用的技術によって凍結乾燥して乾燥粉乳として用いる。免疫粉乳は、粉末の状態でまたは再構成形の状態で米国特許第4732737 号（８段の５行目から１４段の１１行まで、これは参照により本明細書に含まれる）に記載されたように一般に経腸ルートによって投与できる。本発明をこれまで詳細に記載してきたが、その実施態様は以下の実施例によって提供される。しかしながら、そのような実施例を添付の請求の範囲によって規定される本発明を制限するものと解してはならない。実施例Ｉ大腸菌のクローニング、発現および精製大腸菌のｄｎａＪ遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡフラグメント（配列番号：１参照）を大腸菌のｄｎａＫおよびｄｎａＪ遺伝子を包含する組換えファージからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応生成物をベクターPCG808fX(New England Biolabs，ビバリー、マサチューセッツ)のＸｂａｌ部位でサブクローニングし、マルトース結合融合タンパク質として発現させた。これをいずれかのアミロースカラムで濾過し、アミロース緩衝液中に溶出させて精製した。当該融合タンパク質に対するウサギ抗血清を用いて、ｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩ部位でクローニングすることによって発現させたｒｄｎａＪを精製した。最後に、ウサギＩｇＧをアガロース支持体マトリックス(A FFI-GEL Hz、Bio-Rad Laboratories（リッチモンド、カリフォルニア）の商標製品)に結合させ固定したタンパク質Ａで精製した。続いて未加工細胞抽出物をアフィニティーカラムに通し、さらにグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）中に結合タンパク質を溶出させることによって^rｄｎａＪを得た。精製した生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動で、予想分子量が４１ｋＤの１本の固有バンドが示された。実施例II 初期段階ＲＡ患者由来リンパ球のｒｄｎａＪに対する反応初期慢性関節リウマチの未治療忠者のリンパ球を、血液（末梢血リンパ球(“ ＰＢＬ”)）または標準的無菌技術によって髄液から得た。精製した組換え大腸菌ｄｎａＪ(実施例Ｉに記載したように採取、１０μｇ／ｍｌ)とともに細胞を予めスクリーニングした１０％ヒトＡＢ型血清を補充したＲＰＭＩ１６１０培地中で７日間保温した。１０人のコントロール個体（すなわちＲＡでない者）から得たリンパ球を同様に処理した。培養の最後の１６時間の増殖を下記のように刺激指標として表した。ｄｎａＪを含む培養におけるｃｐｍ刺激指標＝ｄｎａＪを含まない培養におけるｃｐｍ１４人の初期段階ＲＡ患者のＰＢＬおよび８人の初期段階ＲＡ患者の髄液リンパ球の細胞増殖反応を基にしたとき、ＰＢＬの増殖反応はコントロール個体のリンパ球の反応より３．６倍高く、一方、髄液リンパ球の反応はコントロール個体のリンパ球の反応より２．３倍高かった（図１参照）。実施例III ＲＡ感受性配列ペプチドに対する初期段階ＲＡ患者のリンパ球の反応初期段階ＲＡの患者から得たリンパ球を実施例IIで述べたプロトコルにしたがって２種のＲＡ感受性配列ペプチドの１つと接触させた。用いたペプチドは、野性型配列ＱＫＲＡＡＹＤＱＹＧＨＡＡＦＥを有する１５アミノ酸の合成ペプチドか、または配列ＤＥＲＡＡＹＤＱＹＧＨＡＡＦＥを有する１５アミノ酸の変異型合成ペプチドのいずれかであった。実施例IIで用いた同じ測定基準に従い結果を評価したとき、図２に示したように野性型ペプチドに対するＰＢＬの反応は変異ペプチドに対するＰＢＬの反応より５倍以上高く、さらにコントロール個体のリンパ球の野性型ペプチドに対する反応より約９倍高かった。実施例IV ｄｎａＪに対する抗体結合の抑制微量定量盤（マイクロタイタープレート）を組換えｄｎａＪ（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した。初期段階ＲＡの患者から得られた血清またはコントロール個体から得られた血清のいずれかをホウ酸緩衝食塩水で１：１００に希釈した。各検体の半分を実施例IIIで述べた野性型ｄｎａＪペプチドとともに４℃で一晩インキュベートした。続いて血清検体各組をｄｎａＪ被覆プレートに添加した。４時間インキュベートした後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて抗体結合を検出した。検出抗体結合レベルは以下の式に従って求めた。図３に示したように、野性型ＲＡ感受性配列ペプチドによってｒｄｎａＪへの抗体結合は、コントロール血清で検出された抑制よりもＲＡ血清で約３倍強く抑制された。実施例ＶＲＡ罹患の遺伝的傾向の免疫アッセイによる決定ｒｄｎａＪに対する抗体反応をＥＬＩＳＡによって測定した。１００μｌずつの^rｄｎａＪ（１０μｇ／ｍｌ）標本またはＨＬＡＤＲもしくはＤＲ４１のホモ接合型細胞由来の膜タンパク質（１００μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆した。続いて種々の段階に希釈したウサギ血清を加え、２時間室温でインキュベートした。０．２％トゥイーン２０を含むＢＢＳで洗浄した後、結合抗体を１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Boehringer-Mannheim Biochemica ls）を用いて検出した。結果は、２つ一組のウェルの４０５ｎｍでの平均ＯＤ値として図４に表されている。配列表配列番号：１は、大腸菌Ｋ１２のｄｎａＪをコードするポリヌクレオチドの開放型読み枠である。配列番号：２は、ＲＡ感受性配列の変種のアミノ酸配列である。配列番号：３は、ＲＡ感受性配列の変種のアミノ酸配列である。配列番号：４は、細菌のｄｎａＪｐ１ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号：５は、細菌のｄｎａＪｐＶペプチドのアミノ酸配列である。配列番号：６は、細菌のｄｎａＪｐ２ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号：７は、合成ヒトＳ１ＨＬＡペプチドのアミノ酸配列である。配列番号：８は、合成ヒトＳ２ＨＬＡペプチドのアミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 33/564 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/245 33/564 14/47 // Ｃ０７Ｋ 14/245 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者アルバーニ、サルバトーレアメリカ合衆国 92014 カリフォルニア州デルマールテンスストリート 111 エイ.

Claims

【特許請求の範囲】１.ホスト内において関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発する場合に有用な、実質的に純粋なｄｎａＪｐ１ペプチドを、医薬的に許容できる担体中に含むワクチン。２.当該ｄｎａＪｐ１ペプチドが単離された細菌性ペプチドである請求項１に記載のワクチン。３.当該ｄｎａＪｐ１ペプチドが合成または組換えペプチドである請求項１に記載のワクチン。４.さらにｄｎａＪｐ１ペプチド以外のｄｎａＪタンパク質またはそのペプチドフラグメントを含む請求項１に記載のワクチン。５．当該ｄｎａＪタンパク質またはペプチドフラグメントが、細菌性ｄｎａＪタンパク質で見出される配列で構成されたアミノ酸を含む、請求項４に記載のワクチン。６．当該ｄｎａＪタンパク質またはペプチドフラグメントが、ヒトｄｎａＪタンパク質で見出される配列で構成されたアミノ酸を含む、請求項４に記載のワクチン。７．当該ｄｎａＪｐ１ペプチドが、エシエリキア属(Escherichia)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、クレブシーラ属（Klebsiella）、プロテウス属(Proteus) 、およびサルモネラ属（Salmonella）から成る属の少なくとも１つから選ばれる細菌によって産生される請求項２に記載のワクチン。８．さらに免疫刺激化合物を含む請求項１に記載のワクチン。９.当該免疫刺激化合物がＴＧＦ−αである請求項８に記載のワクチン。１０.ホスト内において関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発する場合に有用な、ｄｎａＪｐ１ペプチドをコードする組換え遺伝子発現ベクターを含むワクチン。１１.ホストに免疫学的に有効な量のｄｎａＪｐ１ペプチドを投与することを含む、ホスト内において関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発する場合に有用な方法。１２.免疫学的に有効な量のｄｎａＪｐ１ペプチドをホスト内において発現させるために、ｄｎａＪｐ１ペプチドをコードする組換え遺伝子発現ベクターをホストに投与することを含む、ホスト内において関節炎誘発性ペプチドに対して免疫防御を誘発する場合に有用な方法。１３.ホストから得られた生物学的サンプル中の抗関節炎誘発性ペプチド抗体の有無を当該サンプルの免疫アッセイによって決定することを含む該ホスト固体が慢性関節リウマチの素因を有するか否かを決定する方法であって、そのような抗体の存在が慢性関節リウマチの素因を示唆するものである当該決定方法。１４.当該免疫アッセイの標的とされる抗関節炎誘発性ペプチド抗体が抗ｄｎａＪｐ１抗体である請求項１３に記載の方法。１５．その一時構造がＲＡ感受性配列を含むＨＬＡＤＲ抗原を当該個体が有するか否かを決定することをさらに含む請求項１３に記載の方法。１６.個体から得られた生物学的サンプル中に抗関節炎誘発性ペプチド抗体が存在するか否かを決定する、標識抗ｄｎａＪｐ１ペプチド抗体を含むキット。１７．既知のＨＬＡＤＲ抗原と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１６に記載のキット。