JPH01503438A - ヒトの組織因子に関連するｄｎａ断片・ポリペプチド及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの組織因子に関連するＤＮＡ断片・ポリペプチド及び抗体 （本出願の関連文献） 本出願は、１９８７年３月３１日に出願された米国出＠第０３３．０４７号及び １９８７年６月２５日に出願された出願第０６７．１０３号の部分継続出願であ る。

（技術分野） 本発明は、ヒトの組織因子重鎮タンパク質（ｈｕＴＦｈ）をコードする構造遺伝 子を有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）に関し、より詳細には、本発明は、宿 主細胞中に含まれる、ｈｕＴＦｈを発現しうる発現ベクターに関するものである 。また、本発明はｈｕＴＦｈの合成ポリペプチド類似物及びｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ 及び該ポリペプチド類似物と結合するモノクローナル抗体に関する。

（発明の背景） 凝血は、一群の凝集因子として知られる細胞性及び血漿性タンパク質によって仲 介される、一連の、酵素、共因子、タンパク質分解及びゲル化反応のカスケード によって起こる。このカスケードの開始は、組織因子（ＴＦ）として知られる細 胞性レセプターが、凝集因子■又はその誘導体、因子■ａと結合し、触媒的に活 性のある複合体を形成したときに起こる。ＴＦの非存在下、及び複合体への連続 する結合がない場合には、■／■ａは凝集を開始しない。従って、ＴＦの化学的 かつ生化学的特性が、凝集のメカニズムを理解する上で重要なことは明白である 。

組織因子は、通常循環器中で可溶化しておらず、また、因子■／■ａ及び他の凝 集因子を含む血漿タンパク質と接触できないことが分っている、膜に結合した糟 タンパク質である１組織因子は通常、血管を形成している細胞の表面上には発現 されていないが、血管中の箪球によるその発現は、バクテリアのリポ多糖のよう な感染性試薬成分、ある抗原により刺激されたＴヘルパーｖａ胞から誘導され、 直接的にはある刺激されたＴヘルパー細胞由来のリンホカイン及び免疫複合体に よって誘導することができる０例えばバクテリアのリポ多糖同様、インターロイ キン１及びＩｌｌ瘍壊死因子アルファのような単細胞／マクロファージのある炎 症仲介物は血球の体液側表面にＴＦを発現する内皮細胞を刺激することができる 。典型的に、血管要素におけるＴＦの発現は、拡大する血管内凝血又は、局部的 な凝血の開始、すなわち血栓形成を起こす。

組織因子は、試験管内の繊維芽細胞を含む培養物中のある血管外細胞、未同定型 の脳細胞及び基底膜バリヤーにより、循環する血漿タンパク質から分離されてい る上皮細胞の表面上に構成的に発現される。これら細胞上のＴＦの存在は、組織 損傷の結果としての血液との接触でフロントを形成する。従って、ＴＦは、凝血 システムが開始する基礎である。

ハウウェル（Ｈｏｗｅｌｌ　）　（アメリカン・ジャーナル・オフ・フィジオロ ジー（Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）　３１１！１頁（１９１２年））の 報告は、ＴＦを含む単離した組織タンパク質調製物は、リン脂質−タンパク質（ リポタンパク質）複合体として存在するときのみ凝集を促進することができるこ とを示す最初の報告である。典型的に、ＴＦ含有組織タンパク質の単離が、通常 ＴＦタンパク質と会合しているリン脂質を除去してしまうので、単離したタンパ ク質を再脂質化することによるＴＦの機能的プロコアゲラント活性の再構成が必 要であることから、これら再構成の研究が多くの研究者によって行なわれてきて いる。例えば、凝集活性の回復は、リン脂質のタイプ、タンパク質に対するリン 脂質の比、及び再構成混合物の界面活性剤及びイオン組成に影響されると報告さ れている。ネマージン（Ｎｅｗｈｅｒｓｏｎ　）、ジャーナル・オフ・クリニカ ル・インベスチゲーシ；ン（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）　４７〜７ ２頁（１９６８）　；ネマージン（Ｎｅｗａｅｒｓｏｎ　）、ジャーナル・オフ ・クリニカル・インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　） 　４８〜３２２頁（１９６９年）；及びカーリン（Ｃａｒｓｏｎ　）等、サイエ ンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　、２０８巻、３０７頁（１９８０年）参照。

単離した、もしくは、再脂質化したＴＦ含有タンパク！調製物は、数々の種の組 織から抽出物によって調製した０組織因子は、天然の組織中に非常に少量しか存 在しないので、歴史的に使用されてきた方法は、困難で、時間もかかり、かつ低 収率であった。

古典的方法のレヴユーとしては、ネマージン（Ｎｅｗｈｅｒｓｏｎ　）　等の報 告（プログレス・イン・ヘマトシス・アンド・トロンボシス（Ｐｒｏｇ、　Ｈｅ ＠、　Ｔｈｒｏｎ、　）　６　ｅ、２３７〜２６１頁（１９８２年）を参照せよ 。

最近、ブローズ（Ｂｒｏｚｅ　）等（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミ ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓｓ、　）　２６０巻、１０９１７〜２０ （１９８５年））ボム（Ｂｏ園）等（トロンボ・リサーチ（丁ｈｒｏｓｂ、　Ｒ ｅｓ、　）　４２巻、６３５〜６４３頁（１９８６年）及びグハ（Ｇｕｈａ　） 等（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　８３巻、２９ ９〜３０２頁（１９８６年））は、脱脂貧化組織因子タンパク質を、非イオン性 界面活性剤及びＣａＣ１，を含む水溶性溶液に溶かした時、該タンパク質が因子 ■／■ａと結合するという発見に基づいた方法を用いて、ヒトのｖＡ織因子（ｈ ｕＴＦ）タンパク質を単離したことを報告している。しかし、組織因子タンパク 質を単離する手段として、因子■／■親和性吸着体を用いる。これら方法の使用 は、存意量の単離■／■ａを入手することの困難性のみならず、因子■／■ａの 不安定性によっても制限される。

ブローズ等（上記）は、ｈｕＴＦに特異的なモノクローナル抗体の開発及び免疫 親和性吸着体としてのそれらの使用は、因子■／■ａ使用の制限によって起こる 問題を回避できることを指差している。しかし、抗−ｈｕＴＦモノクローナル抗 体は、該文献中には報告されていない。さらに、子牛のＴＦによって生じる２つ のモノクローナル抗体（カーリン（Ｃａｒｓｏｎ　）等、ブランド（Ｂｌｏｏｄ ）。

６６２巻１５６頁（１９８５年））は、ｈｕＴＦとは免疫反応を起こさない（グ ハ（Ｇｕｈａ　）等、上記）。

（本発明の概要） １つの態様において、本発明は、ヒトの組織因子重鎮（ｈｕＴＦｈ）タンパク質 をコードする構造遺伝子を限定する配列を含む、わずか約１２，０００塩基対を 含むＤＮＡ！ｌｒ片を考案している。該構造遺伝子が、第１図の約１番から約２ ６３番で示されているアミノ酸残基を有するタンパク質をコードしていることが 好ましい、さらに、該構造遺伝子は、第２図の約１３０番から、約９１８番で示 されるヌクレオチド塩基配列を有することが好ましい。

望ましい態様においては、そのＤＮＡ断片は、第１の配列の５′末端と連続し、 かつ、ｈｕＴＦ］１タンパク質のアミノ末端に結合したアミノ酸残基リーダー配 列をコードする第２の配列をも含む、その第１及び第２のＤＮＡ配列は一緒にな って、ヒトの組織因子３！１鎖前駆体（ブレｈｕＴＦｈ）タンパク質をコードす る混成構造遺伝子を定義している。該混成構造遺伝子は第１図の約−３２番から 約２６３番で示されるアミノ酸残基を有するタンパク質をコードしていることが 好ましい、さらに、該混成構造遺伝子は、第２図の約３４番から約９１８番のヌ クレオチド塩基配列を有することが望ましい。

別の態様において、本発明は、ヒトの組織因子重鎖タンノ々り質をコードする１ つの構造遺伝子を定義する第１のＤＮＡ断片と機能的に結合したベクターを含む 組換えＤＮＡ分子を考案してし）る。

さらに咳組換えＤＮＡ分子は、第１の断片の５′末端に連続し、上記タンパク質 に結合するアミノ酸残基リーダー配列をコードする第２のＤＮＡ断片を含むこと が好ましい、すなわち、上記の第１及び第２のＤＮＡＩ！Ｉｒ片は一緒になって 、上記タンノぐり質の前駆体をコードする混成構成遺伝子を定義している。

別の態様において、本発明は、わずか約５０アミノ酸残基を含み、かつ式 ％式％ で表わされる配列に相当するアミノ酸残基配列を含むヒトの組織因子結合部位の ポリペプチド類似物を考案している。

さらに好ましくは、本発明はわずか約５０アミノ酸残基を含み、かつ、 一νＮＱＶＹＴＶＱＩＳ？　−。

−ＬＹＹＷ）ｉＳＳＳＳＧＫＫＴ　− からなる群から選択される式で表わされる配列に相当するアミノ酸残基を含むヒ トの組織因子結合部位のポリペプチド類（以物を考案している。

さらに本発明のＢｍには、 ａ）ヒトの組織因子重鎮タンパク質と免疫反応する、ｂ） からなる群から選択される式で表わされるポリペプチドと免疫反応する、 Ｃ）実質的に第１図の部位２０４から部位２２６で示される式で表わされるポリ ペプチドとは免疫反応しない、抗体分子を含む抗体組成物である。

また、本発明は、ハイプリドーマＴＦ８−５Ｇ９、ＴＦ９−１０ＨＩ　０１ＴＦ ９−５Ｂ７及びＴＦ９−６Ｂ４と、それらハイプリドーマによって生成される抗 体分子を含むモノクローナル抗体組成物を考案している。

本発明は、 ａ）身体試料を、ヒトの組織因子重鎮タンパク質と混合し、免疫反応混合物を作 る、 ｂ）その混合物を、抗体が、その試料中に存在するヒトの組織因子と免疫反応し 、免疫反応産物を作るのに十分な時間維持する、そして、 Ｃ）ステップｂ）で生じた免疫反応産物の存在を検出する、以上のステップを含 む体液試料中のヒトの組織因子重鎮タンパク質の存在を検定する方法も考案して いる。

また、本発明は、 ａ）生理学的に許容される希釈剤及び効果的な生体内指示手段と結合させたハイ プリドーマＴＦ９−１０ＨＩＯによって作られたある量の抗体分子を含むモノク ローナル抗体組成物を被検者に静脈注射により投与し、血栓中に存在するヒトの 組織因子と免疫反応させる、 ｂ）該抗体分子が、血栓の一部として生体内に存在する組織因子と免疫反応し、 かつ、免疫反応物質を形成するのに十分な時間、その投与を受けた被検者を維持 する、 Ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応生成物の存在を検定する、以上ａ）〜Ｃ） のステップを含む、生体内で血栓を検出する方法も考案した。

さらに、本発明は、ＴＦ８−５Ｇ９及びＴＦ９−６８４からなる群から選択され るハイブリドーマにより生産され、存在するヒトの組織因子と効率よく結合する 、ある量の抗体分子を含む生理学的に許容される希釈剤を含有するモノクローナ ル抗体組成物を１、被検者に静脈注射によっと投与することを含む、生体内で、 凝集因子■／■ａと結合するヒトの組織因子の能力を中和する方法も考案してい る。

また、本発明は、因子■／■ａと反応するのに有効な量の、からなる群から選ば れるポリペプチドを含む生理学的に許容される希釈剤を含有するポリペプチド組 成物を、静脈注射で被検者に投与することを含む、生体内で、ヒトの組織因子が 、凝集因子■／■ａに結合することを阻害する方法を考案している。

別のＢ様において、本発明は、本発明の抗体組成物を含をするパンケージを含む 、試料中のヒトの組織因子重鎮タンパク質の存在を検定する、キットの形をとっ た診断システムを考案している。

その抗体組成物は、 ａ）ＴＦ８−５Ｇ９゜ ｂ＞　ＴＦ９−６Ｂ４゜ ｃ）ＴＦ９−１０ＨＩＯ。

ｄ）ＴＦ９−５Ｂ７゜ からなるハイブリドーマの群から選ばれたハイブリドーマにより生産されるモノ クローナル抗体を含むことが望ましい。

また、試料から血液凝集因子■／■ａを単離する方法も考案された。

この方法は、 ａ）固体マトリックスに固定した、請求項１５記載のポリペプチドを含む固体サ ポートと試料を混合することにより結合反応混合物を作る、 ｂ）上記結合反応混合物を、上記凝集因子が上記ポリペプチドと結合し、固体複 合体及び上清を作るのに十分な時間、維持する、Ｃ）上記複合体から、上記上滑 を分離する、そしてｄ）ステップＣの分離した複合体から、上記凝集因子を回収 する、以上、ａ）〜ｄ）のステップを含む。

さらに、実質的に、ヒトの組織因子軽鎖タンパク質を含まない、生物学的に活性 のあるヒトの組織因子重鎮タンパク質の水溶液を含む組成物を考案した。この生 物学的に活性のあるヒトの組織因子重鎮タンパク質は、リン脂質又は、非イオン 性界面活性剤中に分散されていることが望ましい。

血管系液体試料中の凝集能力を検定するための、キットの形をとった診断システ ムも考案された。それは、実質的にヒトのＭＡｍ因子軽鎖タンパク質を含まない 、少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の、生物学的に活性のある、ヒトの 組織因子重鎮タンパク質の水溶液組成物を含有するパンケージを含む、その重鎮 タンパク質は、リン脂質中に分散されていることが望ましい。

別の態様において、成熟したヒトの組織因子重鎮タンパク質の調製法及びその方 法によるタンパク質発現産物も考案されている。

この方法は、 ａ）栄養培地中、ヒトの組織因子重鎮タンパク質をコードする構造遺伝子を定義 する第１のＤＮＡ断片及びその第１の断片に連続し、かつ、上記タンパク質に付 随するアミノ酸残基リーダー配列をコードする第２のＤＮＡ断片と機能的に結合 し、宿主ホ乳類細胞と適合する発現ベクターで、上記第１及び第２のＤＮＡ断片 が上記タンパク質の前駆体型をコードする混成構造遺伝子を定義するものである ようなベクターを含む組換えＤＮＡ分子でトランスホームした宿主ホ乳類細胞の 培養を開始する、ｂ）その培養物を、上記細胞が、上記組換えＤＮＡ分子からタ ンパク質を発現し、かつ、上記成熟型のタンパク質を形成するのに十分な時間維 持する、そして、 Ｃ）上記培養物から、上記成熟型のタンパク質を回収する、以上ａ）〜Ｃ）のス テップを含む。

図面の簡単な説明 図式は本公開の一部を形成している。

第１図は、１文字アミノ酸残基コードを用い、左から右に、アミノ末端からカル ホボキシ末端の方向で、ヒトの組織因子重鎮タンパク質の成熟型及び前駆体（各 々、ｈｕＴＦｈ及びプレｂｕＴＦｂ）の完全なアミノ酸残基配列を示している。

主な天然の成熟型タンパク質のアミノ酸残基配列は、１番から２６３番に対応す る。マイナーな成熟型タンパク質の配列は、３番のアミノ酸残基から始まり、２ ６３番の残基で終わる。成熟プロセスで除去されるリーダー配列（前駆体領域） に相当するアミノ酸残基配列は、マイナス番号で示した。細胞外ドメイン及びト ランスメンブレン・アンカー領域は各々、部位１〜２１９及び２２０〜２４２に 対応する。

第２図は、１文字ヌクレオチド塩基コードを用い、左から右に５′末端から３′ 末端の方向で、プレｈｕＴＦｈ及びｈｕＴＦｈタンパク質をコードする、ｃＤＮ Ａのヌクレオチド配列を示している。ｈｕＴＦｈの構造遺伝子は塩基１３０から 始まり、塩基９１８で終わる。

その読み枠は、各アミノ酸を示す１文字を、対応するコドンの中央の塩基上に置 くやり方で、ヌクレオチド配列の上に推察されるアミノ酸残基を付置することに より示した。

第３図は、例２で説明されている、ｈｕＴＦの凝血活性を測定するのに用いる、 凝集検定を示す図である０両対数ブロア）は、秒とミリリットル当りのピコグラ ムで表わしたヒトのｍＡ因子（ｈｕＴＦ）濃度で示される、ヒトのクエン酸化血 漿凝集（ｉ血）時間を示したものである。

第４図は、１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した、因子■／■ａ親和 性で単離したｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈのオートフルオログラムを示している。レーン Ａは、例４で説明されているように、単離され、電気泳動前に、ジチオスレイト ール（ＤＴＴ）で還元した＋２ｓｌラベル化ｈｕＴＦを示している。レーンＢは 、キロダルトン（ｋ）で示した見かけの分子量をもつ分子量標準物質を示してい る。

第５図は、１５％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した、因子■／■ａの親 和性で単離したｈｕＴＦのオートフルオログラムを示している。ｈｕＴＦＯ単離 、１２５工によるラベル化及び電気泳動は、例４と同様に行った。レーンＡは、 Ｄ　Ｔ’Ｔによる還元後の単離したｈｕＴＦを示している。レーンＢは、ＤＴＴ 還元なしで、電気泳動した同サンプルを示している。上のバンド及び下のバンド （Ｕ及びＬと表示した）は、各々、約５８及び４７にの大きさのｈｕＴＦに対応 している。オートフルオログラフィー後、上のバンド及び下のバンドを切り出し 、ＤＴＴを含むＳＤＳサンプルバッファ中で再水和し、第２の１５％アクリルア ミドゲルのサンプルウェルに入れ、電気泳動した。レーンＣは、レーンＢから得 られた、下のバンドの再電気泳動の結果を示している。レーンＤは、レーンＢか ら得られた上のバンドの再電気泳動の結果を示している。１２．５及び４７キロ ダルトン（ｋ）の見がけ上の分、子量をもつタンパク質が矢印で示されている。

第６図は、例４で説明されているように、まずｈｕＴＦ特異的モノクローナル抗 体で免疫沈殿化し、ついで８〜１７％のポリアクリルアミド勾配ゲルで電気泳動 した、因子■／■ａの親和性で単離したｈｕＴＦのオートフルオログラムを示し ている。レーンＡは、ＤＴＴによる還元を伴う、電気泳動した＋２Ｊラベル化ｈ 　ｕ　Ｔ　Ｆを示している。レーンＢは、還元なしで電気泳動した同サンプルを 示している。

第７図は、１５％アクリルアミドゲル中で電気泳動した、因子■／■ａの親和性 で単離したｈｕＴＦのオートフルオログラムを示している。単離、ＩｔＪによる ラベル化、還元及び脱グリコジル化は、例４で説明されているように行った。レ ーン１は、キロダルトンヤ表わされた見かけ上の分子量をもつ標準物質として電 気泳動したタンパク質標準物質：リゾチーム、１４．３；カルボニンク・アンヒ ドラーゼ、３０．０；オバルフ゛ミン、４６．０；ウシ血清アルブミン、６９． Ｏｉホスホリラーゼｂ、９２．５；ミオシン、２００．０（すべてＩＬ州、アー リントンハイツ・アマージャム社より入手）を示している。′！Ｊ−ｈｕＴＦを 含むサンプルをＤＴＴ存在下（レーン２及び３）又は非存在下（レーン４及び５ ）で電気泳動した。これら”Ｊ−ｈｕＴＦ含存サンプルのいくつかは電気泳動前 に脱グリコジル化しくレーン３及び５）、他のものは脱グリコジル化しなかった （レーン２及び４）。

レーン３及び５に流した”’Ｉ−ｈｕＴＦ含有サンプルは、電気泳動前に脱グリ コジル化され、レーン２及び４のものは脱グリコジル化しなかった。

第８図は、例９で説明されているように、１０％のポリアクリルアミドゲル中で 電気泳動した、免疫親和性で単離されたｈｕＴＦのオートフルオログラムを示し てい、レーン１は、キロダルトンで表わされる見かけの分子量をもつ、マーカー として電気泳動した標準タンパク質；チトクロムＣ，１２，４ｉラクトグロブリ ン、１Ｂ、４；カルボニンク・アンヒドラーゼ、２９．０．ラクテート・デヒド ロゲナーゼ、３６．０．オバルブミン、４３．０；グルタメート・デヒドロゲナ ーゼ、５５．０；及びホスホリラーゼｂ、９５．５（全て、ＭＡ州ニュートンセ ンターのディバージファイド・バイオチク（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈ、）から入手した）を含んでいる。

レーン２は、スミス（Ｓｍ１ｔｈ　）等のＢＣＡタンパク！検定法（アナリティ カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　ｂｉｏｃｈｅｓ、　）１５０巻、７６ 〜８５頁（１９８５年））を用いて測定し、かつＤＴＴを用いて還元した約２０ μｇのタンパク質を含んでいる。ｈｕＴＦ重鎖（ｈｕＴＦｈ）は、明らかに、お よそ４７　Ｍ　ｒの位置に確認され、ｈｕＴＦ軽鎖は、およそ１２．５　Ｍ　ｒ の位置にわずかに確認された。タンパク質は、レムリ（Ｌａｅａ＋ｍｌｉ　）（ ネイチャー　（Ｍａｔｕｒｅ）、２２７巻、６８０〜６８５頁（１９７０））の 報告に従がい、コマージ・ブルー染色により可視化した。

第９図は、ｈｕＴＦｈの非リン脂質化（非脂質化）ポリペプチド類似物による、 ｈｕＴＦ由来の凝集開始阻害の投与一応答曲線を示すグラフである０種々の濃度 の非脂質化ポリペプチドによる凝集阻害率は、例１２に説明されているように測 定した。テストしたポリペプチドは、ｐ２６−４９　（△ＴＦ　２６．４９）　 、ｐ１２１−１５５　（０，ＴＦ１２１．１５５）　、ｐ１４６−１６７　（・ 、ＴＦ１４６．１６７）及びｐ２０４−２２６　（■、ＴＦ２０４．２２６）で ある。

第１０ＩＺは、ｈｕＴＦｈのリン脂質化した（脂質化した）ポリペプチド類似物 による、ｈｕＴＦ由来の凝集開始阻害に関する投与一応答曲線を示すグラフであ る。その阻害率は例９で説明されているように、同方法により、同類催物に対し て測定した。

第１１図は、組換えＤＮＡプラスミドｐＣＴＦ６４、ｐ　ＣＴＦ３１４及びｐｃ ＴＦ４０３内のＥｃｏＲＩ断片挿入物の制限地図を示したものである。その挿入 物（＋　）は、プレｈｕＴＦｈ遺伝子の完全なヌクレオチド配列に対応する重複 するヌクレオチド配列領域を示している。別に、その挿入物は、第２図で示され ている、残基１〜４８６　（ｐＣＴＦ６４に含まれている）、残基１３５〜７７ ５　（ｐＣＴＦ３１４に含まれている）、及び残基７７６〜１１２５　（ｐｃＴ Ｆ４０３に含まれている）由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を、 左から右に５′から３′の方向で含んでいる。また、例１６で述べられている種 々の組換えＤＮＡ分子を構築するのに用いられた挿入物内の制限酵素切断部位の およその位置も示されている。さらに、完全な形で示されるリーダーペプチド（ ７）及びトランスメンブレン・アンカードメイン（１）をもつプレｈｕＴＦｈタ ンパク質のおよその位置も示しである。

第１２図は、ｈｕＴＦｈの非リン脂質化（非脂質化）ポリペプチド類似物による 、ｈｕＴＦ由来の凝集開始の阻害を示す、投与一応答曲線のグラフである０モル 濃度で表わした種々の濃度の非脂質化ポリペプチドによる凝集の阻害率（％）は 、例１２に述べられているように測定した。試験したポリペプチドは、ｐ２４− ３５　（△）、ｐ２６−４９　（０）、ｐ１５２−１６９　（ロ）及びペプチド ｐ４０〜７１、ｐ７２〜１０４、ｐ９４〜１２３及びｐ１６１１８９であるがこ れらは全て、実質的な阻害を示さず、集約的に黒丸（・）で示した。

第１３図は、ＴＦ８−５Ｇ９抗体組成物による凝集阻害の速度論を示すグラフで ある。凝集の阻害率（％）は、例１８で述べられているように測定された種々の 抗体免疫反応時間にわたってプロットしである。

第１４図は、ｈｕＴＦ由来の凝集の抗ｈｕＴＦ抗体による阻害の投与一応答を示 すグラフである０種々の濃度の抗ｈｕＴＦモノクローナル抗体ＴＦ８−５０９に よる凝集の阻害率（％）は例１９に述べられているように測定した。

第１５図は、ｈｕＴＦ源がヒトの繊維芽細胞系列ＧＭ１３８１の細胞破壊物であ る、ｈｕＴＦ由来の凝集の、抗ｈｕＴＦ抗体による阻害の投与一応答のグラフで ある０種々の濃度の抗ｈｕＴＦモノクローナル抗体ＴＦ８−５０９による凝集の 阻害率（％）は、例１９に述べられているように測定した。白丸（０）はＴＦ８ −５０９抗体を示し、黒丸（・）は無関係の抗体を示している。

第１６図は、抗ＴＦモノクローナル抗体ＴＦ８−５０９による精製したヒトの脳 ＴＦの凝血活性の阻害を示している。リン脂質ベシクル中に再構成された、精製 したヒトの１ｉｉｉ　Ｔ　Ｆの凝血活性は、種々の濃度の精製１ｇＧと、３７℃ ３０分間、前処理した後測定した。丸は、抗ＴＦ抗体ＴＦ８−５Ｇ９に対するも ので、三角は、無関係なコントロール抗体ＰＡｂｌＯＯに対するものである。デ ータは、抗体を加えない場合の活性に対する阻害率として表わされている。

第１７図は、精製した抗ＴＦモノクローナル抗体で処理した、培養されたＪ８２ 膀胱がん細胞に対する阻害因子■の結合及び、その細胞による因子Ｘａの形成を 示している。因子Ｘａの形成率の阻害の値は、三角で表わされ、因子■の結合阻 害の価は、丸で表わされている。データは、抗体を加えないでインキュベートし た細胞を用いて得られる値に対する阻害率で表現されている。パネルＡは抗体Ｔ Ｆ９−２Ｃ４の効果、パネルＢは、抗体ＴＦ９−５８７の効果を示している。

第１８図は、例２５で述べられているような、免疫親和性で単離したｈｕＴＦの ウェスタンプロット分析を示している。１５％ポリアクリルアミドゲルに次に示 すものがかけられた。レーン１は、キロダルトン（ｋ）でパネルＡの左に示され た見かけの分子量をもつ分子量標準が含まれる。レーン２は、電気泳動前に還元 された、精製ヒトヘモグロビン１μｇを含んでいる。レーン３は、単離したｈｕ ＴＦを電気泳動前に還元したちの０．５μｇを含んでいる。レーン４は、非還元 の、単離されたｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　０．５μｇを含んでいる。５ＤＳ−ＰＡＧＥ後 、生じたタンパク質バンドを電気泳動的にニトロセルロースに移した。このよう にして作ったウェスタン・プロットを０．２μｇ　／　ｔｎ　１．の親和性精製 したウサギ抗ｈｕＴＦ　ＩｇＧ　（パネルＡ）　、１　ｐｇ／ｓｚのウサギ抗ヘ モグロビンＴｇＧ（パネルＢ）又は、１μｇ／＋ａｌｌの非免疫ウサギＩｇＧ（ パネルＣ）と免疫反応させた。免疫染色したバンドの見かけの分子量を右にｋＤ ａで示した。

発明の詳細な説明 Ａ、定義 アミノ酸；ここで同定される全てのアミノ酸は、天然のし一型のものである。標 準的ポリペプチド命名法に従かい（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ鵬、）、２４３巻、３５５７〜５９頁（１９ ６９））、アミノ酸残基の略号は、次の照合表に示されているとおりである。

対応表 記　号　アミノ酸 Ｇ　ｃｒｙ　グリシン Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍ　ｅ　ｔ　メチオニン Ａ　Ａｌａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン Ｌ　ｌｉｅ　イソロイシン Ｌ　Ｌｅｕ　ロイシン Ｔ　Ｔｈｒ　スレオニン Ｖ　Ｖａｌ　バリン Ｐ　Ｐｒｏ　ブロリン Ｋ　Ｌｙｓ　リジン ＨＨｉｓ　グルタミン Ｑ　Ｇｉｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｗ　Ｔｒｐ　）リブトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン ＣＣｙｓ　システィン ここでは、全てのアミノ酸配列は、従来どおり左から右に、アミノ酸末端からカ ルボキシ末端への方向で示されていることに注意を要する。さらに、アミノ酸残 基配列の始め又は終りのダッシュは、各々、アミノ及びカルボキシ末端のＨ及び ○Ｈ（水素及び水酸基）のようなラジカルへの結合、もしくは、ポリペプチド鎖 における１から約１５残基の１つ以上のアミノ酸残基配列を示している。

ポリペプチド及びペプチド；ポリペプチド及びペプチドはここでは、隣合う残基 のアルファアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により互いに直鎖的に 結合した、υずが約５０アミノ酸残基を意味するものとして互換的に用いられて いる。

タンパク質；タンパク質は、ポリペプチドのように互いに直鎖的に結合した５０ 以上のアミノ酸残基を意味して用いられている。

ヌクレオチド；糖部分（ペントース）、リン酸及び窒素へテロ環塩基からなるＤ ＮＡ又はＲＮＡの単量体ユニット、この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１ ′炭素）を介して糖部分と結合しており、塩基と糖の組合せはヌクレオシドと呼 ばれる。ヌクレオシドがペントースの３′又は５′部位に結合するリン酸基を含 むとき、それをヌクレオチドと呼ぶ。

塩基対（ｂｐ）；二本鎖ＤＮＡ分子内でのアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はシ トシン（Ｃ）とグアニンＣＧ）の組合せ。

Ｂ、ＤＮＡ断片 生物において、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列は遺伝子コードを介 して、そのタンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配 列に直接関係づけられる。従って、構造遺伝子は、それがコードするタンパク質 又はポリペプチドのアミノ酸残基配列で定義することも可能である。

重要でかつよく知られた遺伝子コートの性質にリダンダンシーがある。すなわち 、タンパク質を作るのに用いられるほとんどのアミノ酸に対し、１つ以上のコー ドするヌクレオチド・トリプレット（コドン）が、１つのアミノ酸残基をコード 又は指定している。それ故、１つのアミノ酸残基配列をコードするのに多くの異 なるヌクレオチド配列が存在することになる。そのようなヌクレオチド配列は、 全ての生物において、同じアミノ酸残基配列を生産することが可能なので、機能 的には等価であると考えられている。場合によっては、プリン又はピリミジンの メチル化物がヌクレオチド配列の中に組込まれている事もある。しかし、そのよ うなメチル化は、コード関係にはなんら影響しない。

本発明のＤＮＡ断片は、ヒトの組織因子重鎮タンパク質（ｈｕＴＦｈ）をコード するＤＮＡ配列を含むという特徴をもつ、好ましいＢＰＡにおいて、このＤＮＡ 断片は、ヒトの組織因子重鎮前駆体タンパク質（プレｈｕＴＦｈ）をコードする ＤＮＡ配列を含んでいる。

すなわち、本発明のＤＮＡ断片は、ｈｕＴＦｈ、また、より好ましくは、プレー ｈｕＴＦｈの構造遺伝子の存在で特徴づけられる。

さらに、可溶性のｈｕＴＦｈ又は可溶性のプレーｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈタンパク質 をコードする構造遺伝子を形成するＤＮＡ配列がＤ　Ｎ　Ａ断片中に含まれるこ とが望ましい、その遺伝子はｈｕＴＦｈ又はプレｈ　ｕＴＦｈタンパク質中にあ るアミノ酸残基をコードする各コドンが中断することなく連続して存在する、す なわち、イントロンを含まない遺伝子であることが好ましい。

従って、第２図に示される、５′末端の約１３０番から、３′末端の約９１８番 の部位の配列を基本的に含み、かつ、ｈｕＴＦｂを発現することができるＤＮＡ 断片が本発明の１態様を構成している。第２図に示される、約３４番から約９１ ８番の部位の配列を基本的に含み、かつ、プレｈｕＴＦｈを発現できるＤＮＡ断 片が、本発明のもう１つの態様を構成している。

好ましい、可溶性のｈｕＴＦｈ分子は、ｈｕＴＦｈをコードするＤＮＡの５′末 端の約１５０塩基によってコードされるアミノ酸残基を欠いている。従って、第 ２図で示される、５′末端の約１３０番から約７５６番を経由して、３′末端の 約８０１番の部位までの配列を基本的に含み、かつ、可溶性のｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　 ｈを発現できるＤＮＡ断片は、本発明のさらに好ましい態様を構成する。

可溶性のｈｕＴＦｈ構造遺伝子を形成する、典型的な好ましいＤＮＡ断片は、第 ２図で示されている、約１３０番から約７５６番約１３０番から約７７１番、約 １３０番から約７８６番、及び約１３０番から約８０１番で表わされるヌクレオ チド配列を有するものである。

可溶性プレｈｕＴＦｈをコードする、好ましいＤＮＡ断片は、それらが、第１図 で示されるように、−３２番から０番までのアミノ酸残基で示されるような、ア ミノ末端リーダー配列を含むタンパク質をコードしていること以外は、可溶性ｈ 　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈをコードしているものと同じである。従って、可溶性プレーｈ 　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈをコードする構造遺伝子を形成している、好ましいＤＮＡ断片 は、基本的に、第２図で示されている５′末端の約３４番から７５６番を経由し て、３′末端の約８０１番で示される配列を含んでいる。典型的な好ましい可溶 性のプレｈｕＴＦｈコードのＤＮＡ断片とは、第２図で示されているところの、 約３４番から約７５６番、約３４番から約７７１番、約３４番から約７８６番及 び約３４番から約８０１番のヌクレオチド塩基配列を有するものである。

可溶型も含めて、上記ｈｕＴＦｈ及びブレｈｕＴＦｈタンパク質をコードする相 同的ＤＮＡ及びＲＮ　Ａも先に議論したように考案された。

ｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈをコードするＤＮＡ断片は化学的技術、例えばマ チウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　）等のホスホトリエステル法（ジャーナル・オフ ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ 、　）　１０３巻３１８５頁（１９８１年））により容易に合成できる。（ここ で引用されている技術の公開は参考として組込まれている。）もちろん、コード 配列を化学的に合成することにより本来のアミノ酸残基配列をコードする代りに 適当な塩基を用いることにより、いがなる修正も望みどおりにすることができる 。しかし第２図に示されているものと全く相同的な配列を含むＤＮＡ分子の方が 望ましい。

さらに、基本的にｈｕＴＦ及びブレｈｕＴＦｈタンパク質をコードする構造遺伝 子を含むＤＮＡ断片は、これらの遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子から得ることが できる０例えば、プラスミドタイプの組換えＤＮＡ分子ｐＣＴＦ６４、ｐｃＴＦ ３１４及びｐｃｙｐ４０３はいずれもｈｕＴＦｈ及びプレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈタ ンパク質の異なる領域をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、また、これらを合 せると、各タンパク質を発現するのに必要な全てのＤＮＡ配列を有することにな る。各々、ｐＣＴＦ６４、ｐｃＴＦ３１４又はｐｃＴＦ４０３でトランスホーム した大腸菌の培養物は、１９８７年３月２７日、ブダペスト協定に基づき、ＭＤ 州、ロンクビル、パークローン、ドライブ１２３０１番、アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション（ＡＴ　ＣＣ）に保管され、各ｋ、受理番号６７３７ ０．６７３６８及び６７３６９が割当てられた。

ｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦｈをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片は、よ く知られている方法を用い、先に述べた各プラスミドからの適当な制限断片を機 能的に結合することにより作ることができる。典型的に、本方法で作られた本発 明のＤＮＡ分子は、粘着末端、すなわちこの分子の二本鎖領域を越えで伸びた° 突き出した°一本本領領域もっている０本発明のＤＮＡ分子上に粘着末端がある ことは望ましいことである。

本発明は、上述のＤＮＡ断片と等価なリボ核酸（ＲＮＡ）も考案している。

Ｃ９組換えＤＮＡ分子 本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ断片をベクターに機能的に結合す ることにより作ることができる。

ここで用いられているように、°ベクター”という言葉は、細胞中で自己複製で きるＤＮＡ分子で、別のＤＮＡ断片を機能的に結合することができ、その結合し た断片の複製をもたらすものを意味する。ｈｕＴＦｈ及びブレｈｕＴＦｈ遺伝子 の発現を司ることができるベクターは、ここでは“発現ベクター９と呼ばれる。

従って、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）とは、天然においては通常−緒にいるこ とはない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイプリントＤＮＡ分子のこ とである。

本発明のＤＮＡ断片を機能的に結合させるベクターの選択は、この分野ではよく 知られているように、例えば、タンパク質の発現などの機能的性質及びトランス ホームされる宿主細胞などが組換えＤＮＡ分子の構築技術の上で本質的な制限と なることから、これらに直接依存する。しかし、本発明によって考案されたベク ターは、これに機能的に結合しているＤＮＡ断片中に含まれるｈｕＴＦｈ又はブ レｈｕＴＦｈ遺伝子の、少なくとも複製を、好ましくは発現をも可能にする。

好ましい態様において、本発明により考案されたベクターは、原核性のレプリコ ン、すなわち、バクテリア宿主細胞のような原核細胞中の、これをトランスホー ムした染色体外組換えＤＮＡ分子の自己複製及び維持を可能とするＤＮＡ配列を 含んでいる。このようなレプリコンは、この分野ではよく知られている。さらに 、原核性レプリコンを含むこれらＢ様は、これをトランスホームしたバクテリア 宿主に薬剤耐性を与える遺伝子も含んでいる、典型的なバクテリアの薬剤耐性遺 伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。

原核性レプリコンを含む、これらのベクターは、これをトランスホームした大腸 菌のようなバクテリア宿主細胞中で、ｈｕＴＦｈ又はブレｈｕＴＦｈ遺伝子を発 現（転写及び翻訳）させることができる原核性プロモーターも含んでいる。プロ モーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許し、転写を開始させる、ＤＮＡ配 列でできた発現コントロール要素である。バクテリア宿主と適合するプロモータ ー配列の典型的なものは、本発明のＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位を含むプ ラスミドベクター中に存在する。

このようなベクタープラスミドの典型的なものには、ｐＵｃ８、ｐＵｃ９、ｐＢ Ｒ３２２、ＰＢＲ３２９（ＣＡ州、リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ 社）及びｐＰＬ、ｐＫＫ２２３（ＮＪ州、ピスカタウェイ、ファルマシア社）が ある。

真核細胞、好ましくはを椎生物細胞と適合する発現ベクターも、本発明の組換え ＤＮＡ分子を作るのに用いられる。真核細胞発現ベクターもこの分野でよく知ら れており、数社から市販されている。典型的にはこれらのベクターは、目的とす るＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位を含んでいる。これらのベクターの典型的 なもノニハ、ｐＳＵＬ及びｐＫＳＶ−１０（７フルｖシア社）、ｐＢＰＶ−１／ ｐＭＬ２ｄ　Ｃイアターｆ’シ＊ナルバイオ−１’ｌ）０ジ一社）及びｐＴＤＴ ｌ　（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）がある。

好ましい態様において、本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するのに用いられる真 核性細胞発現ベクターは、真核性細胞中で効果的な選択マーカー、好ましくは、 薬剤耐性選択マーカーを含んでいる。好ましい薬剤耐性マーカーとは発現により ネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ（ｎｅｏ　）遺伝子である。サウザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）等、ジャー ナル・オフ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ、　Ｍｏ １．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　１巻、３２７〜３４１頁（１９８２年） 。

本発明のｒＤＮＡを作るための、レトロウィルス発現ベクターの使用も考案され ている。ここで用いられているように、°レトロウィルス発現ベクター２とは； レトロウィルスゲノムのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）領域由来のプ ロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。

好ましいＢ＊において、典型的な発現ベクターは、真核細胞中では複製不能なレ トロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスの構築と使用法は、ソージ（ Ｓｏｒｇｅ　）等により報告されている（モレキュラー・アンド・セルラー・バ イオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　）　４巻、１７３０〜３７頁（１９８４年）。

相補的なホモポリマー末端を介して、ＤＮＡをベクターに機能的に結合する多く の方法が開発されてきている０例えば、相補的なホモポリマーを、挿入するＤＮ Ａ断片及びベクターＤＮＡに付加することができる。それから、このベクターと ＤＮＡ断片を相補的ホモポリマー末端間の水素結合で結合し、組換えＤＮＡ分子 を作る。

１つ以上の制限部位を含む合成リンカ−は、ＤＮＡ断片をベクターに結合するも う１つの方法を提供する。先に報告されているように、エンドヌクレアーゼで制 限消化することによって生成したＤＮＡ１５片を、３’−５’エンドヌクレアー ゼ活性で突出する３′、一本鎖末端を除き、また重合活性で、くぼんだ３′末端 を充填する酵素、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は、大腸ＷＤＮ ＡポリメラーゼＩで処理する。従って、これらの活性の組合せで、平滑末端ＤＮ Ａ断片が生ずる。それから、この平滑末端断片を、バクテリオファージＴ４ＤＮ Ａリガーゼのような、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲージ；ンを触媒することがで きる酵素の存在下、大過剰のリンカ−分子とインキュベージランする。

このような反応でその末端にポリリンカーをもつＤＮＡ断片ができる。さらにこ のＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、このＤＮＡ断片と適合する末端を作る 酵素で切断した発現ベクターとライゲーションする。

多種の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、ＣＮ州ニューヘブン 、インターナシラナル　バイオテクノロジー社を含む多くの会社から市販されて いる。

本発明は、上述の組換えＤＮＡ分子と等価なＲＮＡも考案している。

Ｄ、）ランスホームした細胞と培養 本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子、好ましくは可溶性のｈｕＴＦｈ又はプレ ｈｕＴＦ］１を発現できるｒＤＮＡでトランスホームした宿主細胞にも関連して いる。この宿主細胞は、原核性でも真核性でもよい、バクテリア細胞は、原核宿 主細胞であることが好ましく、また典型的には、ＮＤ州ベセスダ、ベセスダ・リ サーチラボラドリース社から入手できる大腸菌ＤＨ５株のような、大１Ｍ菌の株 である。好ましい真核性宿主細胞には、イースト及びホ乳類細胞、好ましくはマ ウス、ラット、サル又はヒトの繊維芽細胞系列のようなを椎動物細胞が含まれる 。好ましい真核性宿主細胞には、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手できるチャ イニース・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣ から入手できるＮ１）Ｉスイスマウス胚細胞がある。

本発明の組換えＤＮＡによる適当な細胞宿主のトランスホーメーシ＝ンは、典型 的には用いるベクターのタイプに応じて、よく知られている方法により行なわれ る０例えば、原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関しては、コーエン（ Ｃｏｈｅｎ　）等のプロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オフ・ サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ％　６ ９巻、２１１０頁（１９７２年）；及びマニアチス（？１ａｎｉａｔｉｓ　）等 のＮＹ州コールド・スプリング・ハーバ−・コールド・スプリングハーバ−・ラ ボラトリ−、ラボラトリ−・マニュアル、モレキュラー・クローニングを参照せ よ、を椎動物細胞のｒＤＮＡを含むレトロウィルス・ベクターによるトランスホ ーメーションに関しては、例えば、ソーダ（Ｓｏｒｇｅ　）等、モレキュラー・ アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　４ 巻、１７３０〜３７頁（１９８４年）、グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）等、ウィロ ロジ−（ν１ｒｏ１．　）、５２巻、４５６頁（１９７３年）；及びウィグラー （１＋１１ｇ１ｅｒ　）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳ Ａ、　７６巻、１３７３〜７６頁（１９７９年）を参照せよ。

うまくトランスホームされた細胞、すなわち、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む 細胞は、従来の方法によって同定することができる０例えば、本発明のｒＤＮＡ の導入から生じた細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを作る。これら のコロニーから細胞を収穫し、溶解し、そのＤＮＡ内容物について、サウザーン （５ｏｕｔｈｅｒｎ　）　Ｃ’；ヤーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー （Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　９８巻、５０３頁（１９７５年）又は、ベ レフト（Ｂｏｒｅｎｔ　）等（バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ、）　３巻 、２０８頁（１９８５年）によって報告されている方法を用いて、そのｒＤＮＡ の存在を調べた。

ｒＤＮＡ存在の直接的検定に加え、成功したトランスホーメーションは、そのｒ 　Ｄ　Ｎ　ＡがｈｕＴＦｈ又はブレｈｕＴＦｈを発現することができるときは、 従来の免疫学的方法で確かめることができる０例えば、発現ベクターでうまくト ランスホーメーシッンできた細胞は、ｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦ１１抗原性を 示すタンパク質を生産する。トランスホームさせた細胞試料を収穫し、本発明の ハイプリドーマによって生産される抗原等に特異的な抗体を用い、ｈｕＴＦｈ又 はプレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈを検定する。

このように、トランスホームした宿主細胞それ自体に加え、本発明は、栄養培地 中のそれらの細胞の培養物好ましくは、モノクローナル（クローン的に均一な） 培養物、又は、モノクローナル培養物由来の培養物も考史した。この培養物は、 ｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦ）ｌ抗原性を示すタンパク質、またさらに好ましく は、生物学的に活性なｈｕＴＦｈを含むことが望ましい。

トランスホームした宿主細胞を培養するのに有用な栄養培地は当分野ではよく知 られており、また、い（っかの販売会社より市販されている。宿主細胞がホ乳類 細胞であるような態様においては、°無血清２培地を使うことが望ましい、。

Ｅ、ｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈタンパク譬の生産方法本発明の別の特徴には 、ｈｕＴＦｈ抗原性を示すタンパク質の生産方法がある。ｈｕＴＦｈ抗原性を示 すタンパク質は天然の組織因子によって誘導される抗体を免疫反応を起こすタン パク質である。ｈｕＴＦｈ抗原性を示すタンパク質は、抗原として有用であり、 又、抗体を生じさせるときにも有用で、その各々が本発明の診断システムや診断 法で使用することができる。

本方法は、ｈｕＴＦｈ又はブレｈｕＴＦｈ、好ましくは可溶性のｈｕＴＦｈ又は 可溶性のブレｈｕＴＦｈを発現することができる、本発明の組換えＤＮＡ分子で トランスホームした宿主細胞、好ましくは、ヒトの細胞を含をする栄養培地を含 む培養の開始する。この培養を、そのトランスホームした細胞がｈｕＴＦｈ又は プレｈｕＴＦｈタンパク質を発現するのに十分な時間維持する。

発現したタンパク質をその培地から回収する。好ましい態様において、本発明の 方法によって作られたｈｕＴＦｈタンパク質はさらにｈｕＴＦｈの生物学的活性 すなわち、因子■／■ａと結合する能力を示す、これらの方法は、宿主細胞にお いてブレｈｕＴＦｂ遺伝子を発現できる組換えＤＮＡ分子でトランスホームした ホ乳類宿主細胞の培養を含んでいる。その培養により、ブレｂｕ丁Ｆｈタンパク 質が発現し、つづいて、そのプレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈの細胞内での翻訳後の修正 が起こり、生物学的に活性のあるｈｕＴＦｈタンパク質が生じる。

培養物から、発現したタンパク質を回収する方法は、当分野ではよく知られたこ とであり、従来の生化学的方法を用い、その培養物のタンパク質含有画分の分画 が含まれる０例えば、タンパク質の分画に対して知られているゲル濾過法、ゲル クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー及びそれに類するもの が、培養物中にある発現タンパク質の単離に用いることができる。

さらに、免疫親和性、免疫吸着やそれに類するもののような、免疫化学的方法も 、従来法を用いて行なわれる。

Ｆ、ｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈタンパク質組成物と発現産物本発明は、また 本発明のｒＤＮＡのｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ及びブレｈｕＴＦｈタンパク質発現産物 も考案している。好ましい態様において、ｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈ発現産 物は第１図で示されているように、各々残基１から２６３及び−３２から２６３ に対応するアミノ酸残基を有している。その発現タンパク質は、第１図で示され るブレｈｕＴＦｈ及びｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈのアミノ酸残基配列の長さの少なくと も９０％、好ましくは少なくとも９５％であることが望ましい。

別の態様において、可溶型のｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈと、可溶性ｈｕＴＦ ｈそして、または可溶性プレｈｕＴＦｈを含む組成物も考案されている。ここで 用いている“可溶性”という言葉は、本来のｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ及びブレｈｕＴ Ｆｈ分子の細胞外ドメイン、すなわち、第１図に示すところのアミノ末端から残 基２２０までの、ｈｕＴＦｈ及びブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ分子領域を基本的に含 むことを特徴とするｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ及びブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ分子を意味 する。それゆえ、可溶性ｈｕＴＦｈ及び可溶性ブレｈｕＴＦｈは、本来の分子で 形成されるトランスメンブレン・アンカー領域の実質的部分（第１図で示すとこ ろの残基２２０がら２４２）を含まない。

ここで用いている“ｈｕＴＦｈ”及び“プレｈｕＴＦｈ″という言葉は今後特に ことわらないかぎり、そのタンパク質の可溶型を含んでいる。

可溶性のｈｕＴＦｈ及び可溶性ブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈは、除水的なトランスメ ンブレン・アンカー領域を含んでいないので、これらは、生理学的に許容される 水溶液中で実質的に凝集することはない。

それゆえ、可溶性のｈｕＴＦｈ及び可溶性のプレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈは、存在す るｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦｈタンパク質の少なくとも約７０％、好ましくは 約８０％、そしてより好ましくは約９０％（重量パーセント）が非凝集（単量体 ）型であり、タンパク質濃度約０．１ｐｇ／＋ｅｎから約１１００ｎ／ｍｆの生 理学的に許容された希釈剤を用いた水溶液を作りうろことを特徴とする。タンパ ク’Ｒ’ｆＪ液中に存在する凝集量の測定法は、当分野ではよく知られていると ころであり、排除カラムクロマトグラフィーによるサイズ分画を含んでいる。

好ましい可溶性ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈタンパク質は第１図で示されているところの 、アミン末端の残基約１番から、２０９番を経由してカルボキシ末端の残基２２ ４番で示されるアミノ酸残基を示している。従って、好ましい可溶性ｈｕＴＦｈ タンパク質は第１図で示すところの約１番から約２０９番、約１番から約２１９ 番及び約１番から約２２４番の残基で表わされるアミノ酸残基配列を有するもの である。

好ましい可溶性ブレｈｕＴＦｈタンパク質は、第１図で示すところの、アミノ末 端の一３２番から、２０９番を経由して、カルボキシ末端の２２４番の残基で表 わされるアミノ酸残基を有している。従って、好ましい可溶性プレｈ　ｕ　Ｔ　 Ｆ　ｈタンパク質は、第１図で示すところの約−３２番から２１４番、約−３２ 番から２１９番、及び約−３２番から約２２４番の残基で表わされるアミノ酸残 基配列を有するものである。

１つの′Ｂ様において、ｈｕＴＦｈ及びプレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ全産物はグリコ ジル化されていない、すなわち、それらは、本発明のｒＤＮＡでトランスホーム した原核細胞中で生産される。

非グリコジル化型のｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈは、本発明の接種物及び診断 システムにおける免疫原及び抗原として有用である。

典型的には、真核細胞で生産されたｈｕＴＦｈ及びプレｈｕＴＦｈはグリコジル 化されており、また抗原性及び免疫原性に加えて、生物学的活性を有する。ここ で用いられているように、°生物学的活性′という語句は、因子■／■ａの依存 の凝集を誘導する能力をもつｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ又はプレｈｕＴＦｈタンパク質 又はポリペプチドを指して使われる。

このように、本発明は、実質的にヒトのＭＬ織因子軽鎖タンパク質を含まない生 物学的に活性なｈｕＴＦｈを含有する水溶液を含む組成物を考案している。その 組成物も実質的に例えばラウリル硫酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤、ポリ アクリルアミド及び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）で測定される約、１５０００ダルトン以下の見かけの分子量ををする組織由 来のタンパク質のような物質を含まないことが望ましい。

水溶性のｈｕＴＦｈ含有溶液は血液又はクエン酸化した血漿のような血液由来の 産物のような血管系液状サンプルの凝集能力を検定するのに十分な生物学的に活 性のあるｈｕＴＦｈを含んでいる。“凝集能力“という語句は生物学的に活性な ｈｕＴＦｈ存在下、血管系液状サンプルを凝集する能力を意味する。凝集能力を 検定するのに十分な、典型的ｈｕＴＦｈタンパク質濃度は、例２におけるサンプ ル／ｈｕＴＦｈ比と同じ比を用いたとき、約０．１部ｇ／ｍＡから約１１００ｎ ／ｍＡ、好ましくは、約１ｐｇ、／＋ｆから約１０μｇ　／　ｗｈ　Ａ、そして より好ましくは約１（Ｎ）ｇ／＋ｎｊ！から約１ｎｇ／ｍＡである。もちろん、 凝集能力を検定するときに必要な濃度よりも高い濃度であるが、好ましい濃度に 希釈しうるｈｕＴＦｈ溶液も考慮されている。

好ましい態様において、ｈｕＴＦｈ含有水溶液は、リン脂質又は非イオン性界面 活性剤中に分散されたｈｕＴＦｈを含んでいる。

典型的リン脂質：ｈｕ７）”３１タンパク質重量比は、約５：１から１２０００ ：１、好ましくは、約５０：１から約５０００　：　１そしてさらに好ましくは 、約１００：１から２５００：１の範囲である。

Ｇ、ポリペプチド 本発明の各ポリペプチドは、せいぞい約５０個、より通常には約３５個以下の、 そして好ましくは約２５個以下のアミノ酸残基を含んでおり、かつ、少なくとも １０個の残基を含んでいる。さらに、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸残 基配列及び新しい機能特性を特徴としている。

従って、本発明のポリペプチドの１つの態様は、血液凝集因子■／■ａへのｈ　 ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈの結合を競合的に阻害する能力をその特徴の１部としている、ｈ ｕＴＦｈ結合部位ポリペプチド類似物である０本発明の結合部位類僚物は活性化 した複合体を作ることなく、すなわち、凝集を開始することなく因子■／■ａに 結合することが望ましい。

ここで用いている“複合体”という言葉は、抗原−抗体又は、レセプター−リガ ンド反応のような特異的結合反応の産物を意味している。代表的複合体としては 、免疫反応産物及びここでＴＦｉ■／■ａと示されているところの組織因子−因 子■／■ａ結合反応産物がある。

好ましい態様において、ｈｕＴＦｈ結合部位類似物は、少なくとも第１図に示さ れている３０〜３５番のアミノ酸残基を表わしている次に示すアミノ酸残基配列 ； −ＶＮＱＶ’／７− を含んでいる。

さらに好ましくは、ｈｕＴＦｈ結合部位類憤物は、少なく≧も、次のアミノ酸残 基配列； −ＶＮＱＶＹＴＶＱＩ　ＳＴ−及び −ＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴ− のうちの１つを含んでいる。

これらの配列は、第１図で示すところの各々、３０〜４０及び１５５〜１６７番 の、ｈｕＴＦｈのアミノ酸残基を示している。

さらに一層好ましい場合は、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ結合部位顕像物は第１図で示す ところの、各々２６〜４９番及び１４６〜１６７番で表わされている、次のアミ ノ酸残基配列；−ＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴＫＳＧＤＷＸＳＫＣ−。

−ＶＦＧＫＤＬＩＹＴＬＹＹＷ）［５ＳＳＳｌ、ＫＫＴ　−。

からなる群から選ばれたアミノ酸残基配列を含む。

好ましいｈｕＴＦｈ結合部位ポリペプチド類位物は第１表で示されているアミノ 酸残基配列を含んでいる。

第１表 名　称１　アミノ酸残基配列 ａ、各ポリペプチドの実験名は第１図の、含まれているアミノ酸残基配列を表わ している。

ポリペプチドｐ２６〜４９、ｐ１４６〜１６７及びｐ１６１〜１８９も、抗ｈｕ ＴＦｈ抗体分子がｈｕＴＦｈに結合するのを中和（競争的阻害）する能力を特徴 としている。抗ｈｕＴＦｈ抗体のｈｕＴＦｈへの結合を中和する能力をもつ本発 明の他のポリペプチドは、第２表に示されているものである。

第２表 名　称　アミノ酸残基配列 ａ、実験名に付けられた“Ｃ”は、タンパク質結合のためのリンカ−として、示 されている配列に付は加えられたシスティン残基を示している。

本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドが因子■／■ａへの結合に対し、本 来の組織因子と競合でき、そして、または、ｈｕＴＦｈに対する抗ｈｕＴＦｈ抗 体分子の結合を競合的に阻害しろるかぎり、ｈｕＴＦｈのアミノ酸残基配列と同 一である必要がないことを理解すべきである。それ故、本ポリペプチドは、使用 する際に有利となるような、保存的、非保存的にかがわらず挿入、欠失及び置換 のような種々の変化を与えることができる。

保存的を換には、あるアミノ酸残基が他の生物学的に同様の残基に置き換ったも のである。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニ ンのような疏水的残基間の置換又は、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアス パラギン酸又はグルタミンとアスパラギン及びそれに類するもののような極性残 基間の置換がある。また“保存的置換”という語句には、もし、ポリペプチドが 、必要とされる結合活性を示すならば、未置換の元々のアミノ酸の代りに、置換 されたアミノ酸を１いることも含まれる。

本発明のポリペプチドが、１つ以上の保存的、もしくは非保存的置換をしている ために、本来のｈｕＴＦｈの配列と同一ではない場合、本発明のポリペプチドが ラベル又は固体マトリックス、又はキャリヤーにうまく固定する“リンカ−°を 提供する目的で、その各末端に付加的残基をつけ加える場合は別にして、アミノ 酸残基の通常せいぜい約２０パーセント、より普通には、せいぜい１０％が置換 している０本発明のポリペプチドと共に使用されるラベル、固体マトリックス及 びキャリヤーは以下に述べる。

通常、アミノ酸残基リンカ−は、少なくとも１残基であり、また４０以上の残基 のこともあり、しばしば１〜１０残基が用いられる。リンキングに使われる典型 的アミノ酸残基は、チロシン、システィン、リジン、グルタミン酸及びアスパラ ギン酸とそれに類するものである。さらに、本発明のポリペプチドは、末端ＮＨ ２基アシル化、例えばアセチレーション又はチオグリコン酸アミデージョン、タ ーミナルカルボキシアミデージ；ン、例えば、アンモニア、メチルアミン、その 他により配列が修飾を受けていることで、天然の配列とは異なることがある。

キャリ中−・ハプテンのように、当分野でよく知られているリンカ−を介しての キャリヤーとの結合の場合、本発明のポリペプチドは、ｈｕ’ｒｉ”ｈと免疫反 応する抗体を誘導することができる。

免疫学的な交差反応性の明白な原則からみて、本発明は、第１表及び第２表で示 されているポリペプチドの抗原的に関連したバリアントも考案している。“抗原 的に関連したバリアント”とは、第１表もしくは第２表のポリペプチドの、少な くとも６個のアミノ酸残基配列領域を含み、かつ、第１表又は第２表のポリペプ チド及びｈｕＴＦｈと免疫反応を起こす抗体分子を誘導することができるポリペ プチドのことである。

また、ポリペプチドがリン脂質又は非イオン性界面活性剤中に分散した、ｈｕＴ Ｆｈ結合部位ポリペプチド類憤物の水性溶液を含む組成物を、本発明は考案して いる。典型的なリン脂質：ポリペプチド重量比は、約５＝１から２００：１、好 ましくは約３０＝１〜８０：１、さらに好ましくは、約４５：１〜５５：１の範 囲にある。リン脂質中に分散して使用するのに適している好ましいｈｕＴＦｈ結 合部位結合部位上位物ョン■の第４表にリストした。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの分野ではよく知られているいくつかの 方法で合成することができる。使用しろる多くの技術のすぐれたまとめは、Ｊ、 　？１．スチワード（Ｓｔｅｗａｒｄ　）及びＪ、　Ｄ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ　 ）の“固相ペプチド合成”　（１９６９年、サンフランシスコ、Ｗ、　）１．フ リーマン（Ｆｒｅｅａ＋ａｎ　）社）及びＪ。

メイエンホーファ−（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）の１ホルモン性タンパク質及びペ プチド”　（１９８３年、アカデミツクブレス社にニーヨーク）、２巻、４６頁 ）が面相ペプチド合成について、またＥ、シュローダ−（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）と に、クプケ（Ｋｕｂｋｅ　）の“ペプチド”（１９６５年、アカデミツクブレス 社にニーヨーク）１巻）が古典的な液相法について行なわれている。

Ｈ０接種物 別の態様において、本発明のポリペプチド又は、その抗原的に関連したバリアン トは、生理学的に許容しろろ水性希釈剤組成物として、その効果的量が投与され た時、ｈｕＴＦｈと免疫反応する抗体を誘導することができる接種物となる０種 々の文法型の“接種物“という語は、ｈｕＴＦｈに対する抗体の調製に用いられ る活性成分として、本発明のポリペプチドを含む組成物として、ここで使用され ている。ポリペプチドの抗体を誘導するのに用いられるとき、そのポリペプチド は、単独で、又は結合体としてキャリヤーと結合して、又は、ポリペプチド重合 体として用いられるのであるが、表現の簡便性のため、本発明のポリペプチドの 種々のＢｎは、全て、“ポリペプチド”という語及びその種々の文法型で呼ばれ ていることを理解されよう。

約３５以下のアミノ酸残基を含むポリペプチドに対し、すでに記されているよう に抗体生産の誘導のためには、キャリヤーに結合したペプチドを使用する方が望 ましい。

すでに記してきたように、１つ以上の付加的アミノ酸残基をポリペプチドのキャ リヤーへの結合を助けるため、そのポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に 付加することができる。ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端へ付加したシ スティン残基は、ジスルフィド結合を介して、結合体を作るのに特に有用である ことが分っている。しかし、結合体を調製の当分野でよく知られている他の方法 も使用しうる。代表的付加結合法にはミカエル付加反応産物、グルタルアルデヒ ドのようなジアルデヒド（クリブスタイン（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ　）等（ジャー ナル・オフ゛・インフニクシャス・デシーズ（Ｊ、　Ｉｎｐｅｃｔ、　Ｄｉｓ） 　、１４７巻、３１８〜３２６頁、（１９８３年））及びそれに類するものの使 用、又は、キャリヤーに対し、アミド結合を生ずる、水溶性カルボジイミドの使 用ような、カルボジイミド法の使用が含まれる。活性官能基を介してのタンパク 質の結合については、オーラメアス（Ａｕｒａ＋＋＋ｅａｓ　）等のスカンジナ ビアン・ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　８巻、補１．７．７〜２３頁（１９７８年）を参照せよ。

有用なキャリヤーは、当分野ではよく知られており、一般的にはタンパク質その ものである。そのようなキャリヤーの代表例としては、キーホール、リンベット 、ヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロビン、子ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）やヒト血清アルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）のようなアルブミン類、ヤギ赤 血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ）のような赤血球類、テタナストキソイド、コレラトキソイ ド、ポリ　（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）のようなポリアミノ酸及びこれに 類するものがある。

キャリヤーの選択は、その接種物の最終的使用法に依存しており、本発明に特に 関係しない基準に基づいている。例えば、接種される動物中で不都合な反応を起 こさないキャリヤーが選択されるべきである。

本発明の接種物は、典型的には、キャリヤーに結合した結合物として、効果的な 免疫原量の本発明のポリペプチドを含む、他の事項の中で、単位投与量当りの効 果的なポリペプチド量は、当分野ではよく知られているように、接種される動物 種、その動物の体重及び選択し１こ接種レジメンに依存する。典型的に、接種物 は、接種（投与）当り約１０マイクログラムから約５００ミリグラム、好ましく は、約５０マイクログラムから約５０ミリグラムのポリペプチドを含んでいる。

本発明の接種物に用いられている“単位投与°という語句は、各ユニットが、必 要とする希釈剤、すなわち、キャリヤー又はビヒクルと共に望ましい免疫原的効 果を産むのに必要な予め決められた量の活性物質を含む、動物に対する１回の投 与に適した物理的に分離した単位を意味する０本発明の接種物の新しい単位投与 に関する明細は、ｆａｌ活性物質の独特な特性及びその独自の免疫学的効果、及 びｆｂｌここで詳細に公開されている動物中での免疫学的使用に内在する制限に より説明され、かつ直接依存しており、これらが本発明の特徴となっている。

典型的には、接種物は、水、食塩水又はリン酸緩衝食塩水などの生理学的に許容 された（受容できる）希釈剤中にポリペプチド−結合体を分散させることにより 、乾燥した固体のポリペプチド結合体から水性組成物を調製することができる。

また、接種物は希釈剤の一部として、アジュバントを含んでいる。完全フロイン ドアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及びミョ ウバンのようなアジュバントは、当分野ではよ（知られており、いくつかの会社 から市販されている。

■、抗体及び抗体組成物 種々の文法型の“抗体”という語は、イムノグロブリン分子及びイムノグロブリ ン分子の免疫学的に活性な領域すなわち抗体結合部位又はバラトープを含む分子 を意味する０代表的抗体分子には、本来のイムノグロブリン分子、実質的に本来 のものと同じイムノグロブリン分子及びＦａｂ、　Ｆａｂ’、Ｆ　（ａｂ’）ｇ 及びＦ　（ｖ）として、当分野で知られている領域を含む、バラトープを含有す る、イムノグロブリン分子の一部がある。

本発明の抗体組成物は、ｈｕＴＦｈ及び本発明の特異的ポリペプチドの少なくと も１つと免疫反応を起こす抗体分子を含むことを特徴とする抗ペプチド抗体であ る。

例えば、ｈｕＴＦｈ及び組織因子結合部位のポリペプチド類位物と免疫反応する 抗体分子を含む、本発明の抗体組成物は組織因子が因子■／■ａと結合する能力 を中和できる。従って、好ましい抗体組成物は、ｈｕＴＦｈ及びｐ２６−４９又 はｐ１４６−１６７と反応し、かつ、ｐ２０４〜２２６と実質的に免疫反応しな い抗体分子を含むものである。ｈｕＴＦｈに対して生ずるポリクローナル抗血清 は、ｐ２０４−２２６と免疫反応する抗体を含むことに注意すべきである。この ように、抗２０４−２２６免疫反応性が実質的にないことが、本抗体組成物と従 来の報告されているものとを区別する特性となっている。

本発明の抗体組成物の典型的生産は、ホ乳動物を、本発明の接種物で免疫化し、 適当なポリペプチド免疫特異性を有するホ乳類抗体分子を誘導することによって 行なわれる。さらに、その抗体分子をそのホ乳動物から収集し、例えば、免疫ア フィニティ・クロマトグラフィーのような従来技術によって、その必要量を単離 する。このように生産した抗体組成物は、なかんずく、診断法及び身体サンプル におけるｈｕＴＦｈを検出するための、本発明のシステムで用いることができる 。

モノクローナル抗体組成物も、本発明で考案されている。検出限界内で、モノク ローナル抗体組成物は、効果的にｈｕＴＦｈを結合しろる、唯一種類の抗体結合 部位を含んでいる。従って、典型的に、本発明のモノクローナル抗体組成物は、 それがｈｕＴＦｈ以外のタンパク質を結合できる抗体をたとえ含んでいたとして も、ｈｕＴＦｈへの結合親和性を示す、ひとつの態様において、モノクローナル 抗体組成物は、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ及び、組織因子結合部位のポリペプチド類憤 物、好ましくはｐ２６〜４９又はｐ１４６〜１６７と免疫反応する抗体分子を含 んでいる。

他の態様において、本発明は、ｈｕＴＦｈと免疫反応し、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈに より開始する凝集を阻害する抗体分子を含む抗凝集（中和）ＭｏＡｂを考案した 。さらに凝集を阻害する好ましいＭ　ｏ　Ａ　ｂは本発明のポリペプチド、好ま しくは、ｈｕＴＦｈ結合部位ポリペプチド類像物、及びさらに好ましくは、第１ 表で示されているポリペプチドと免疫反応することを特徴とする。

他ＯＢ様において、抗凝集ＭｏＡｂは、ｈｕＴＦｈ及びｈｕＴＦｈ　：因子■／ ■ａの複合体と免疫反応し、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈによって開始する凝集を阻害（ 中和）する抗体分子を含んでいる。さらに、好ましい抗凝集Ｍ　ｏ　Ａ　ｂはｈ ｕＴＦｈポリペプチドｐｉ−３０又はＰ２６−４９と免疫反応することを特徴と し、またこれは、ｈ　ｕＴＦ　ｈポリペプチドル５６−７１と免疫反応しないこ とが好ましい。

また、本発明は、組織因子の凝集を開始する能力を中和しない抗体分子を含む非 中和性モノクローナル抗体組成物も考案した。

そのような組成物は、ｈｕＴＦｈ及びポリペプチドｐｉ−３０と免疫反応し、か つ、ハイプリドーマＴＦ９−１０ＨＩ　Ｑにより生産（分泌）される抗体分子を 含むことが望ましい。

本発明のモノクローナル抗体組成物は、適当なポリペプチド特異性をもつ抗体分 子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含む、モノクローナルハイブ リドーマの培養を開始することによって生産することができる。

このハイブリドーマが培地中に、その抗体分子を分泌するのに十分な条件及び時 間、培養を維持する。それから、抗体含有培地を収集する。さらにこの抗体分子 を従来法により単離する。

これらの組成物の調製に有用な培地は、当分野ではよく知られておりまた、市販 されていて、合成培養培地、同血統繁殖マウス及びそれに類するものが含まれで いる０代表的合成培地は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０■グルタミン及び２ ０％ウシ胎児血清を補足した、ダルベコ最小培地（ＤＭＥＭ；ダルベコ（Ｄｏｌ ｂｅｃｃｏ）等、ヴイロロジー（シｉシｏｌ　）　、８巻、３９６頁（１９５９ 年））である０代表的同車繁殖マウス株はＢａ１ｂ／ｅである。上述の方法で生 産したモノクローナル抗体組成物は、例えば、ｈｕＴＦｈ含有免疫反応の形成が 必要である、診断及び治療法で用いることができる。

Ｊ、ハイブリドーマ 本発明のハイブリドーマは、ｈｕＴＦｈと免疫反応する抗体分子を生産すること を特徴とする。さらに、好ましいハイブリドーマは、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈで開始 する凝集を阻害し、また、望ましくは、本発明のポリペプチド、好ましくは、ｈ ｕＴＦｈ結合部位ポリペプチド類像物、そしてさらに好ましくは、第１表に示さ れているポリペプチドと免疫反応する抗体分子を生産することを特徴としている 。さらに好ましい態様においては、抗凝集ＭｏＡｂは、非ヒト、霊長類、Ｔｆと 免疫反応する。

他の好ましい態様において、本発明のハイブリドーマはｈｕＴＦｈ及びｈｕＴＦ ｈ　；因子■／■ａの複合体と免疫反応し、ｈｕＴＦｈにより開始する凝集を中 和する抗体分子を生産する。さらに、ｈｕＴＦｈ；因子■／■ａの複合体と免疫 反応するハイブリドーマ生産抗体は、該抗体の、ｈｕＴＦｈポリペプチドｐｌ− ３０又はｐ２６−４９、好ましくはその両方と免疫反応し、かつ、より好ましく は、該抗体分子が、ポリｈｕＴＦｈポリペプチドｐ５６−７１とは免疫反応を起 こさないことを特徴としている。

望ましい免疫特異性ををする、すなわち、特別なタンパク質そして、またはポリ ペプチドと免疫反応する抗体分子を生産する（分泌する）ハイブリドーマの作成 法は、当分野ではよく知られている。特に、ニマン（Ｎｉｍａｎ　）等により報 告されたハイブリドーマ技術は（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ ミ−・オフ・サイエンス（Ｐｖｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　 ＵＳＡ、　８０ｔｃ。

４９４９〜４９５３頁（１９８３年））、有用である。好ましいハイブリドーマ を、例１３の第５表に示した。

ハイブリドーマ培養物ＴＦ８−５０９、ＴＦ９−６Ｂ４及びＴＦ９−１０ＨＩ　 Ｏはブタペスト協定に従がい、１９８７年３月２７日ＡＴＣＣに保管され、各々 受理番号、ＨＢ９３８２、ＨＢ９３８１及びＨＢ９３８３が割当てられた。

Ｋ、治療方法及び組成物 本発明のｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ因子■／■ａの結合部位ポリペプチド類似物、抗体 組成物、モノクローナル抗体組成物及び抗凝集Ｍ　ａ　Ａ　ｂは各々、生体内に おいて、組織因子による因子■／■ａの結合を調整するのに用いることができる 。

例えば、ｈｕＴＦｈ因子■／■ａの結合部位ポリペプチド類憤物は、効果量を被 検者に投与したとき、因子■／■ａの組織因子への結合を競争的に阻害すること ができる、医療的に許容しうる組成物に用いることができる。この阻害は、組織 因子−因子■／■ａ複合体形成速度の減少によると考えられている。従って、生 体内において、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ因子■／■ａ結合部位ポリペプチド類位物の 投与は、凝集やある炎症反応のような、組織因子の因子■／■ａへの結合により 開始する生理学的応答を調節するのに用いることができる。好ましい態様におい て、このポリペプチドは、先に述べたように、リン脂質中に分散して投与される 。

生体内における組織因子による因子■／■ａの結合を調節する他の方法は、本発 明の抗体組成物（抗ペプチド抗体）又は抗凝集Ｍ　ｏ　Ａ　ｂの効果量を静脈注 射により投与することである。この抗体分子は、パラトビツク領域を含み、かつ イムノグロブリン分断片Ｆ　（ａｂ’）ｚ　、Ｆａｂ及びそれに類するもののよ うな、Ｆｃ領域を含まないものである。治療的に効果的量の抗凝集Ｍ　ｏ　Ａ　 ｂは、体重−当り１５μｇから５■、好ましくは体重−当り、約１００μｇから 約１■、より好ましくは、体重賭当り約１５０μｇから約５００μｇの範囲であ る。

他の態様において、本発明のＭ　ｏ　Ａ　ｂ、抗凝集ＭｏＡｂ又は非中和性Ｍｏ Ａｂの抗体分子を抗腫瘍試薬に結合し、抗腫瘍治療組成物が作られる。このよう にして作った、効果量の抗腫瘍治療組成物を、その表面に組織因子を発現する腫 瘍細胞を有する被検者に投与することができる。このような腫瘍細胞の代表例は 、胸及び肺のかん細胞である。

ここで考寓された抗腫瘍試薬の代表例には＋３１１　、１＠＠Ｒｅ、　！ＩＪＨ 及びこれに類するもののような放射性核種がある。放射性核種結合モノクローナ ル抗体治療組成物の製造法及びその使用法は、コザフク（Ｋｏｚａｋ　）等（ト レンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、） 　４巻、２５９〜２６４頁（１９８６年））により報告されている。

投与されたポリペプチド又は抗体分子含有組成物は、溶液又はサスペンションの 形をしているが、ポリペプチドは、錠剤、丸薬、カプセル、放出持続製剤又は粉 末の形もとる。どの場合にも、この組成物は、０．１０％〜９５％、好ましくは 、２５％〜７０％の活性成分を含んでいる。

活性成分としてポリペプチド又は抗体分子を含む治療組成物の調製は、この分野 ではよく知られている。典型的には、このような組成物は、液体溶液又はサスペ ンションのような注射可能な形に調製されるが、注射前の液体溶液又はサスペン ションを作るのに通している固体形としても調製される。またこの調製物はエマ ルジョン化されることもある。この活性治療成分は、しばしば、医療的に許容で き、かつ、活性成分に適合する賦形剤と混合する。

例えば、典型的賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、 エタノール又はそれらに類するもの及びこれらの組合せたものがある。加えて、 もし、望ましいなら、この組成分は、加湿剤又はエマルジョン化剤、ｐＨ緩衝剤 のような、活性成分の効果を促進する補助物質を少量含ませることも可能である 。

ポリペプチド又は抗体分子組成物は、中和した医療的に受容しうる塩の形に調整 することもできる。医療的に受容しうる塩には、酸付加塩（ポリペプチド又は抗 体分子の遊離しているアミノ基で形成される）及び、例えば、塩酸又はリン酸の ような無機酸又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸及びこ れらに類するもので形成されるものがある。遊離したカルボキシル基で形成する 塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄の水酸 化物のような無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチル アミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン及びこれらに類するもののような有 機塩基から誘導される。

治療用のポリペプチド又は抗体分子含有組成物は例えば、単位投与量の注射によ るように、局所的に又は静脈注射により簡便に投与される。

本発明の治療組成物に対して用いられる“単位投与”という語句は、ヒトに１回 投与するのに適した、必要とされる希釈剤、すなわち、キャリヤー又はビヒクル と共に、望ましい治療効果をあげるために計算された、予め決められた量の活性 物質を含む、物理的に分離されている単位を意味する。

該組成物は、投与物形状に適した方法で、治療的に効果的な量が投与される。投 与される量は処置される検体、活性成分を利用する検体の血液凝集システムの容 量及び望ましい組織因子結合能の阻害又は中和度に依存する。投与される必要の ある活性成分の精密な量は、医師の診断に依存し、かつ、各個人によっても異な る。しかし、適当なポリペプチド投与範囲は、１日に、患者当り、１から５ミリ グラムの活性物質というオーダーであり、投与の経緯に依存する。第１回投与及 び二次免疫の適正な治療計画もいろいろであるが、典型的には、−次投与後、１ 時間以上の間隔をおいて、さらに注射又は他の方法による投与が繰り返えされる 。別に、血液中、１０ナノモル濃度から１０マイクロモル濃度を維持するのに十 分な、持続的静脈注入性も考案されている。

Ｌ０診断システム 本発明のキット型の診断システムは、少なくとも１回の検定に十分な量の、分包 試薬として、本発明の発現タンパク質ポリペプチド、抗体組成物又はモノクロー ナル抗体組成物を含んでいる。

また、この分包試薬の使用説明書も含まれているのが普通である。

典型的に、“使用説明書”には、試薬濃度には、混合する試薬とサンプルの相対 量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、バッファ条件及びそれに類するも ののような、少なくとも１回の検定法のパラメーターを明確に記述しである。

好ましい態様において、さらに、本発明の診断システムは、試薬を含む複合体の 形成を知らせるラベル又は指示手段を含んでいる。

ここで用いられているように、種々の文法型の１ラベル２及び′指示手段゛は、 複合体の存在を示す検出可能な信号を産み出すのに直接又は間接的に関連する単 一の原子及び分子を意味する。

“生体内”ラベル又は指示手段とは、被検者の体内で有用なものである。どのラ ベル又は指示手段も、本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物の一部である 抗体分子、発現したタンパク質、又はポリペプチドに結合又は組込まれているこ ともあるし、また別々に使用されることもあり、また、これらの原子又は分子は 付加的試薬と組合せて、又は単独で使用されうる。このようなラベルは、臨床的 診断化学においては、よく知られているものであり、それらが、他の新しいタン パク質、方法、そして、又はシステムとともに使用されるときに限り、本発明の 一部を構成する。

ラベルの結合、すなわち、ポリペプチド及びタンパク質のラベル化は、当分野で はよく知られている０例えば、ハイブリドーマによって生産される抗体分子は、 培養培地中の成分として与えられたとき、放射性同位元素含有アミノ酸の代謝的 取込みによるラベル化が可能である１例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等の、 メソンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ）ｖｏｌ、）　７３巻 、３〜４６頁（１９８１年））参照、活性化官能基を介するタンパク質の結合又 はカンプリング技術は特に有用である１例えば、オーラメアス（Ａｕｒａｍｅａ ｓ）等の、スカンジナビアン・ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、 　Ｊ、　Ｊ＋ｍｎｕｎｏ１．）　８巻、補版７巻、７〜２３頁（１９７′８年〕 、ロッドウェル＜Ｒｏｄｗｅｌｌ　）等の、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃ ｈ、）　、３　Ｓ、　８８９〜８９４頁（１９８４年）及び米国特許第４，４９ ３，７９５号参照。

また、診断システムは、好ましくは分包の、特異的試薬を含む。

“特異的結合試薬０は、本発明の試薬を選択的に結合できる分子であるが、本発 明のタンパク質発現産物、ポリペプチド又は抗体分子そのものではない０代表的 な特異的結合試薬は、抗体分子、補体タンパク質又はその断片、タンパク質入、 血液凝集因子■／■ａ、子ウシ＆Ｈ織因子及びそれに類するものがある。この特 異的結合試薬は、反応物が複合体の一部として存在するとき、これと結合するこ とが望ましい。

好ましい態様において、特異的結合試薬はラベル化される。しかし、その診断シ ステムが、ラベル化されていない特異的結合試薬を含むとき、典型的には、この 試薬は、増巾手段又は試薬として用いられる。これらのｆｉ様において、このラ ベル化した特異的結合試薬は、この増巾手段が、反応種含有複合体に結合してい るとき、この増巾手段に特異的に結合することができる。

本発明の診断キットは、血清、血漿又は尿のような体液サンプル中のｈ　ｕ　Ｔ 　Ｆ　ｈの存在又は量を検出するのに１イライザ”方式で用いることができる。

“イライザ法”は、サンプル中に存在する抗原又は抗体量を検出及び定量するた めの、固相に結合した抗体又は抗原及び酵素−抗原又は酵素−抗体結合物を用い た、酵素結合免疫吸着検定法のことである。イライザ法の説明は、全て参考とし てここに組込まれている、１９８２年、ＣＡ州ロサンゼエルスのラング・メディ カル・パブリケーションから出版された、Ｄ、　Ｐ、サイプ（Ｓｉｔｅｓ　）等 の基本的及び臨床的免疫学、第４＆！、第２２章及び米国特許第３，６５４，０ ９０号、第３．８５０，７５２号及び第４．０１６，０４３号に報告されている 。

このように、好ましい態様において、本発明の発現したタンパク質、ポリペプチ ド又は抗体は固相マトリックスに固定され、この診断システム中に、分包されて いる固体サポートを形作っている。

典型的に、この試薬の固体マトリックスの固定は、他の固定法もあるが、この分 野でよく知られている水性媒体からの吸着が用いられている。

有用な固体マトリックスは、当分野でよく知られている。このような物質には、 ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社（ＮＪ州、ピスカタウェイ）から、セフ ァデフクスという登録商標で市販されている、架橋デキストラン；アガロース； ＩＬ州、北シカゴ、アボット・ラボラトリーズ社から市販されている直径約１ミ クロン〜約５ミリメートルのポリスチレンビーズ；シート状、ヒモ状又はヘラ状 のポリ塩化ビニルポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又 はナイロンベースの織物、又は、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルでできている チューブ、プレート又はマイクロプレートのウェルが含まれる。

ここで述べられている＃断システムの試薬、ラベル化結合試薬又は、増巾試薬は 、液体分散物として溶液として、又は、例えば、凍結乾燥型のような、実質的に 乾燥粉として提供される。指示手段が酵素である場合、この酵素基質も、システ ムの別の包むに提供される。先に述べた、マイクロプレートのような固体サポー ト及び１つ以上のバッファも、この診断検定システム中に別にパッケージされた 要素として含まれている。

診断システムに関連して、ここで議論されているパッケージは、診断システムに おいて通常使われるものである。このようなパフケージには、ガラス及びプラス チック製の（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）ボ トル、バイアル、プラスチック及びプラスチックホイルでラミネートした外袋物 及びこれらに類するものが含まれている。

翫検定法 本発明は、本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物中に含まれている、発現 されたタンパク質、ポリペプチド又は抗体分子を含む複合体を生産することによ りｈｕＴＦｈを検出する方法を考史した。当業者には、これらの複合体を形成す るのに利用できる多くの、よく知られている臨床的診断の化学手段があることが 理解できよう、従って、典型的検定方法がここで説明されているが、これは、本 発明を制限するものではない。

１、血栓検出 被検者中に存在する血栓検出法が考藁された。生体内での指示手段と結合する抗 体を含む本発明の、効果的量のモノクローナル抗体組成物を、被検者に静脈注射 する。好ましい態様において、ラベル化した抗体は、ｈｕＴＦｈ及び第１表及び 第２表のポリペプチドと免疫反応するがｐ２０４〜２２６とは反応しないもので 、好ましくはハイブリドーマＴＦ８−５Ｇ９、ＴＦ９−６Ｂ４又はＴＦ９−１０ ＨＩＯから生産されたものである。

それから被検者を、ラベル化した抗体分子が、血栓の一部に存在するｈｕＴＦｈ と反応し、複合体を作るのに十分な決められた時間、及び、好ましくは、未反応 の抗体分子が体内から一掃されるのに十分な付加的時間維持する。その後、被検 者を、生成した複合体の存否及び好ましくはその位置について検定する。

２、身体サンプル中のｈｕＴＦ）ｌの検出身体サンプル、好ましくは体液サンプ ル中のｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈの存在、及び好ましくはその量を検出するため、競合 的又は非競合的な、種々の不拘−及び均一検定法が利用できる０例えば、液体体 液サンプルと、ラベル化したｐ２６−４９を、マイクロプレートのウェルの内壁 に固定した、ハイブリドーマＴＦ８−５Ｇ９又はＴＦ９−１０Ｈ１０から生産さ れた抗体分子を含む固体サポートと混合し、固相免疫反応産物を作る。この混合 物をサンプル中に存在するｈｕＴＦｈ及びラベル化したｐ２６−４９が、固体サ ポートとして存在する抗体分子への結合を競争し、固相免疫反応産物を形成する のに十分な時間、生物学的検定条件下に維持する。

未結合のラベル化ｐ２６−４９を、免疫反応産物から取り除く。

その後、免疫反応産物として結合したラベル化ｐ２６−４９の量を測定し、その 差により、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈの存在を検定できる。

例 次に示す例は、本発明の説明を意図したもので、これを制限するものではない。

１、組織因子含宵ヒト脳抽出物の調製 生検で得られた正常なヒトの脳を１２時間以内に処理するがもしくは、−８０℃ に保存する。その髄膜及び大脳を除き、ついで残存する脳部分を、ポリトロンホ モジナイザー（ＮＹ、ウェストバリー、ブリンクマン、インスツラメント社）を 用いて、等容量の冷（０℃）アセトン中でホモジネートした。このホモジネート したものをさらに３倍容の冷アセトンと混合し、その組織固体画分を、焼結ガラ スロートを用いて濾過して回収した。各々７回の２倍容の冷アセトンとの混合及 び引きつづく濾過により、残留固体からアセトン可溶性物質を抽出した。最後の 濾過の後、残存するアセトンを、２０℃、−晩、残留固体から大気圧下でエバボ レートした。

その後、残留脳組織固体を各々、その固体をヘプタン：ブタノール（２：１）２ ５ミリリンドル（ｓｊり当り、組織固体１ｇの割で、ヘプタン：ブタノール（２ ：　１）と混合することによって行う５回の抽出を行ない、ついで濾過により、 その固体を回収する。最後の濾過後、残留１ｉｉ組織固体を再び大気圧下、約２ ０℃−晩で乾燥し、脱脂脳組織粉末を作り、必要になるまで、−８０℃に保存す る。

つづいて、脳組織粉末２５グラムをＴＳ／ＥＤＴＡバフファ〔１００ミリモル濃 度（ｍＭ）　ＮａＣｊ！　、　５０ｍＭ　）リス・塩酸（せ７．５）、０．０２ ％アジ化ナトリウム、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、０．１％ 　（Ｖ／Ｖ））１，１トｙＸ−１００（ポリアリルエチレン−９−オクチルフェ ニルエーテル））ｓｏｏｍｚと混合し、ついで４℃で一晩攪拌する。さらにこの 混合物を１５．３００Ｘｇで１時間遠心する。生じたベレットを５００ｍｆのバ フ７７Ａ　（１００ｍＭＮａＣｊ！、　５０ｍＭ　）リス・塩酸（ｐＨ７，５） 、０．０２％アジ化ナトリウム、２％トリトンＸ−１００）に再懸濁し、スラリ ーを作る。室温で１時間の攪拌後、このスラリーを上述のように遠心する。生じ た上滑を回収し、凍結乾燥した後、１００ｍＡのバッファＡに溶かして、ｈｕＴ Ｆｈ含有脳抽含有液抽出溶液 ’１．ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆの凝血活性を測定するための凝集検定法ｈｕＴＦプロコア ゲラント活性を、３７℃に維持した、全試薬及び混合物を用いて行う、１段階凝 集検定法で測定した。血漿と同容積の、２０麟Ｍクエン酸ナトリウム２水和物及 び１４０細ＭＮａＣ１（ｐＨ７，４）を含む溶液を混合することにより、正常な ヒト血漿をクエン酸化した。ＴＢＳ／ＢＳＡ溶液（１５０ｍＭＮａｃ　Ｊ！、５ （１＋Ｍ）リス・ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、０．１％子ウシ血清アルブミン） で希釈したｈ　ｕ　Ｔ　Ｆを含むサンプル１００マイクロリツトルを、１００μ ｌのクエン酸化血漿と混合した＊　２５ｍＭＣａＣＡｚ溶液１００μｌを混合し 、凝集反応混合物を作り、凝集が始まるまでゆっくりと揺らした＊ＣａＣｚ、添 加と、凝血形成の間の時間を測定した。それから、ｈｕＴＦ活性の標準曲線を、 秒で示した凝集時間と希釈率をプロットすることにより作った０代表的標準曲線 を第３図に示した。

３、ｈｕＴＦの親和性単離のための、因子■含を固体サポートの調製 ヒトの因子■／■ａを参考文献として組込まれている、フェア（Ｆａｉｒ　）の 報告（ブラッド（Ｂｒｏｏｃｈ）、６２巻、７８４〜９１頁（１９８３年））に 従って単離した。この単離した因子■／■ａを、アガロース固体マトリックスに 結合するため、４℃で一晩、その５ミリグラム（ｍｇ）を、０．１Ｍ２−（Ｎ− モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６，５）に対して透析した。塩 化カルシウムを最終濃度１ｗＭとなるように添加した。それから因子■／■ａを ４ｍｌのアワアゲルー１５活性化アガロースビーズ（ＣＡ州、リッチモンド、バ イオラド・ラボラトリーズ社）と混合し、生じた結合反応混合物を、製造業者が 推薦するもの（バイオラド）に従って４℃、４時間の回転処理を行った。

固体サポート上の過剰タンパク質結合部位を、その固体サポートを、０．１Ｍグ リシンエチルエステル中、室温で１時間撹拌することにより、ブロックした。そ の後、この固体サポートを、焼結ガラスロート上各約２０ｍｆの＋１１バンフｙ Ａ、＋２）ＩＭ　ＮａＣｆ含有バッファＡ、＋３１５ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡ含有バン ファＡ及びｆ４）１ｍＭＣａＣ１２含をバッファＡをこの順序で用いて洗浄した 。それから過剰の液体を減圧下で除き、半乾燥状の粒子物！（ケーキ）を作った 。

４、ｈｕＴＦの因子■／■親和性による単離０．１Ｍのグリシンエチルエステル 及び０．１Ｍ　ＭＥＳ（ｐＨ６，５）を含む２０ｍｆの溶液を、２２．５＋ＩＩ Ｊのアフィゲル−１５アガロースビーズ（バイオラド）と混合し、結合反応混合 物を作る。この結合反応混合物を室温に１時間維持する。この生成した結合物を 、焼結ガラスロート上、１００倍容バッファ１を用い、減圧下で濾過することに より洗浄し、グリシンエチルエステル−アガロースケーキを作る。

例１で調製した３　０ｍｊ！の脳抽出溶液を、１ｍＭ塩化カルシウムを含む６リ ントルのバッフ７Ａに対し、４℃、１晩透析を行う。

透析した脳油出物を、グリシンエチルエステル−アガロースケーキと混合し、固 液相反応混合物を作る。回転しながら室温で２時間維持した後、この固液相を焼 結ガラスロートを用いて濾過することで分離する。この液相を回収し、最終濃度 Ｉ１１当り１０ユニットとなるようにトラシロール（ＭＯ州、セントルイス、シ グマケミカル社、アプロチニン）と混合する。この回収した液相を例３で調製し た因子■／■ａ／アガロースケーキと混合し、第２の固／液相混合物を作る。

この混合物を回転しながら、−晩４℃に維持し、ｈｕＴＦ−因子■／■ａ含有固 相産物を形成させる。その後、この固相及び液相を先に述べたように濾過により 分離する。焼結ガラスロート上に残留物する固相を１ｍＭ塩化カルシウムを含む バッファＡ２５ｍＡで洗浄した。さらに、この固相を焼結ガラスクロマトグラフ ィーカラム（０，５Ｘ１５ｃ閣、バイオラド）に移し、６ｍＡの同洗浄バッファ で洗浄した。上記の洗浄後、この固体サポートに結合したｈｕＴＦを、焼結ガラ スカラム上に保持されている固体サポートを５ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファＡ で洗浄することにより、遊離（溶出）させる、溶出した物質を１ｓＪ画分づつ回 収し、各画分について、例２で述べた方法により、ｈｕＴＦの存否を検定した。

ｈｕＴＦ含有画分を集め、４℃で、１％トリトンＸ−１００を含む６リツトルの ＴＢＳ　（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５）に対し て１晩這析した。

このようにして作った透析物をつづいて、４倍容の冷アセトンと混合し、ｈ　ｕ 　Ｔ　Ｆタンパク質を沈殿した。この沈殿をおよそ一１０℃、５０００Ｘｇ、３ ０分間の遠心で集めた。生成したベレットを窒素雰囲気下で乾燥した。典型的な 収量は、脱脂したＩｉｉｉＭｉ礒粉末１グラム（乾燥重量）当り、２μｇのｈｕ ＴＦであった。

このようにして生じた単離ｈｕＴＦサンプルをＴＢＳ／トリトン中に悲濁し、つ いで、製造業者の指示に従かい（ＩＬ、ロックフォード、ピアス・ケミカル社） 、ヨードゲンを用い、Ｎａ１２Ｓｌでラベル化した（ＩＬ州、アーリントンハイ ツ、アマージャム社、マイクログラム当り１６マイクロキユーリ）、ラベル化後 、過剰の未反応＋２５１をＴＢＳ／）リドンを用いたセファデックスＧ２５（Ｎ Ｊ、ビスカタウィイ、ファルマシア社）での脱塩クロマトグラフィーにより、ラ ベル化したｈｕＴＦから分離した。

１２ｓ１ラベル化ｈｕＴＦ含有サンプルのラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動による（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ）評価は、レムリ 　（Ｌａｅ＋ｅｍｌｉ）　（ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　％　２２７巻、６ ８０〜６８５頁（１９７０年））の方法に従った。還元条件下で評価するサンプ ルに対しては、１００ｍＭのジチオスレイトールを、サンプルバッファ中に含有 させた。１％トリトンＸ　−１００゜５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）　、１ ５０＋ｍＭ　ＮａＣＪ中のｌ！ＪｈｕＴＦを、１０分の１容のＴＦ８−５Ｇ９又 はＰＡｂｌｏｏ（ＡＴＣＣ−Ｔ　Ｉ　Ｂ　１１５　；ここでネガティブコントロ ールとして用いられているＳＶ４０ラージＴ抗原特異的抗体を生産するハイブリ ドーマ）ハイブリドーマ培養上滑とともに、４℃で１晩インキユベートすること により免疫沈殿化を行った。アガロースビーズ（ＭＯ州、セントルイス、シグマ ・ケミカル社）上に固定したヤギの抗マウスＩｇＧを、その　第１次免疫反応産 物を吸収するのに用いた。このビーズを同バッファでよく洗浄し、結合した”’ Ｉ−ｈｕＴＦを、ＤＴＴ存在下又は非存在下、同バッファ中で５分間煮沸するこ とにより溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質バンドはオートフルオログ ラフィーで可視化した。

単離したｈｕＴＦを放射性ヨウ素化し、ＤＴＴで還元し、ついで１０％アクリル アミドゲルで５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析したとき、４７にダルトンの見かけの分子量 をもつ単一のメインバンドが観察された（第４図）、シかし、未還元のｈｕＴＦ を同様に分析した場合は、およそ５８及び４７ｋＤａの２つのバンドが相対的に 等しい量で観察され（第５図レーンＢ）、このことは、少なくとも２つの異なる 多きさのものの存在を示している。

非還元で観察されるこの２つのバンドに対する説明としては、その大きな方、す なわち、泳動が遅いバンドは、非常に多くのグリコジル化を受けたものか、付加 的なプロセッシングを受けていないタンパク質を有しているのか、又は、付加的 な、ジスルフィド結合で結合したポリペプチドと会合しているのかもしれないと いうものである。還元後の単一バンドの存在は、はじめの２つの示唆と一致して いる。その後者の可能性は中でも一番大きいように思えるが、その小さいサイズ の差のために、付加的ポリペプチド鎖は、色素の場所又はその付近に泳動するよ うな十分小さいものらしく、還元後、１０％アクリルアミドでは分離されないの であろう、１５％のポリアクリルアミドゲルの還元及び非還元ｈｕＴＦの電気泳 動は、単一の分離した軽鎖を示すのには失敗したが、いくつかの少量の、速く泳 動するバンドが観察された（第５図、レーンＡ及びＢ）、これらの小さい、少量 のポリペプチドは、以前に報告されているように（ブロース（Ｂｒｏｚｅ）　） 等、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、）　、２６０ｔ−ｉ１０９１７〜２０頁（１９８５年）及びグハ（Ｇｕ ｈａ）等、プロシーディング・イン・ナシ；ナル・アカデミ−・オフ・サイエン ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８３巻、２ ９９〜３０２頁（１９８６年））、汚染物を示している。この可能性を明らかに するため、４７ｋＤａ及び５８ｋＤａのバンドは非還元ゲルから切り出され、そ の各々を、ジチオスレイトールで還元し、その各々を、１５％アクリルアミドゲ ルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（第５図、レーンＣ及びＤ）、５８ｋＤタ ンパク質は１２．５ｋＤ軽鎖及び４７ｋＤａ重鎖であると分った。４７ｋＤａの タンパク質を分析したとき、同分子量の重鎮のみが観察された。このように、両 者は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで同様の挙動をもつ重鎮を保有していた。

直接軽鎖の存在を示すため、”’１−ｈｕＴＦを、ｈｕＴＦ特異的モノクローナ ル抗体ＴＦ８−５０９で免疫沈殿化し、それを還元剤存在下の電気泳動にかけた 。主要な４７ｋＤａバンドがおよそ、１２．５ｋＤａの分離したバンドとともに 観察された（第６図、レーンＡ）、還元化しないサンプルの電気泳動でおよそ４ ７ｋＤａ及び５８ｋＤａのバンドを生じたが、低い分子量のポリペプチドは生じ なかった（第６図、レーンＢ）、また非還元ｈ　ｕＴＦの電気泳動は、プローグ （Ｂｒｏｚｅ）等（ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、　２６０　’ｌ　；　１０９１７〜２０頁（１９ ８５年））により示唆されているｈｕＴＦ重鎮のダイマーと一致する、少量の９ ０ｋＤａタンパク質も示した。

ｈｕＴＦ軽鎖が重鎖からタンパク質の分解によって生ずるという可能性を研究す るため、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより単離した軽鎖及び重鎖を、Ｎ末端アミノ酸配列 分析にかけた。

重鎮及び軽鎖を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、アバーシールド（Ａｂｅｒｓｏｌｄ ）等の高ｐＨ法（ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、２６１巻、４２２５〜４２３Ｂ頁（１９８６年）） を用い、活性化した、アミノ被覆ファイバーガラスフィルター上に電気プロット した。このタンパク質バンドを、蛍光染料（アバーシールド（Ａｂｅｒｓｏｌｄ ）等、上記）により、このプロントを可視化し、切り出し、そして、まだファイ バーガラスに結合したまま、ＰＴＨ誘導体のオン・ラインＨＰＬＣ分析を用いた アプライド・バイオシステムダ４フ０Ａタンパク質シークエンサーで配列決定し た。別にタンパク質バンドをコマージ・ブルーによる染色によりゲルを可視化し 、シーフェンシングのために、電気溶出した０両方法とも等しい結果を与えた。

ｈｕＴＦ重鎮のマイクロシーフェンシングは、はぼ等モル量のアミノ酸配列で一 致した結果となった。はとんど全ての場合、各アミノ酸残基は２サイクル離れて 、２度出現する。これは、長さがＮ末端で２残基異なるｈｕＴＦ重鎮の２つのバ リアントがねじれたＮ末端をもつことの明白な証拠である。大きい方のバリアン トのＮ末端は、非特定のアミノ酸Ｘを含む５ｅｒ−［；１　ｙ　−Ｘ−Ｘ−Ａｓ ｎ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ａｌ　ａ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒ ｐ−Ｌｙｓ−ｓｅｒであることが誘導された。

軽鎖の配列決定するいくつかの試みは、ブロックされたＮ末端と一致して、なん ら配列の情報を与えなかった。しかし、ｈｕＴＦの重鎖及び軽鎖は、単離された ｈｕＴＦに対して生じた、２つのウサギの抗ｈｕＴＦ抗血清及び２８個の、マウ スモノクローナル抗体の全てが、重鎮のみに結合することが分っていることから 、抗原的に全く別のものである。それゆえ、軽鎖は、重鎮のタンパク質分解断片 とは考えにくい、さらに軽鎖は、ベーター２ミクログロブリンに対する抗血清と は反応しなかった。

現在、１２．５ｋＤのｈｕＴＦ軽鎖の意味は知られていない、それは、単一の、 独立した分子種なので、ランダムなジスルフィド交換による、単離の際にアーテ ィファクトとして誘導されたものでもないようだ。還元なしに、親和性による単 離を行ったｈｕＴＦを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけたとき、ｈｕＴＦ活性は、５８ｋ Ｄａと４７ｋＤａの分子量に対応するゲルから溶出した。これら２つの分子量に 対応するｈｕＴＦ活性も、粗液又は部分的に単離した胎盤の抽出物を、ＳＤＳゲ ルの電気泳動にかけたとき（データ示さず）も検出された。全ての場合において 、その活性は、因子■依存で、このことは、ｈｕＴＦ特異的活性を示している。

これらの知見は、ｈｕＴＦのみが因子■を活性化でき、かつ、軽鎖はこの機能に 必要ないことを示している。

軽鎖がｈｕＴＦ重鎮のおよそ半分のみにジスルフィド結合していることは興味深 い、生体内で、ｈｕＴＦの重要な領域に不在なのか、存在するのかとは別に、界 面活性剤で分解される、非共有的相互作用を介して会合しているのであろう、軽 鎖は、サイズが小さく、５ＤＳ−ＰＡＧＥの際にマーカー色素の部分に泳動して しまうため、また、ｈｕＴＦの報告されている分析例が還元後行なわれているこ とから、初期の研究では気づかれなかった。現行の親和性を用いた方法で単離す ることができる制限された量では、タンパク質染色によって、会合した小ポリペ プチド鎖を検出することは困難である。

イン・ビトロでは、単量体ｈｕＴＦが凝集を開始するにもかかわらず、ｈ　ｕ　 Ｔ　Ｆによる凝集の生理的開始は、細胞表面で起こる。

軽鎖は、直接的凝集検定法で検出することができる、ｈｕＴＦ機能又は機構にお いて重要な役割をはたしていることが推察できるであろう０例えば、軽鎖は、因 子■／■ａの組織因子への結合の正の協同性を説明すると仮定されてきている、 因子■に対する２つのサブユニットレセプターのアッセンブリーに関与している 可能性がある。別に、細胞表面上の構造ドメインでのｈｕＴＦの機構及び、細胞 表面上でのｈｕＴＦ活性の制御は、ｈｕＴＦ軽鎖に仲介されるのかもしれない。

Ｎ結合オリゴ糟の役割は、”’１−ｈｕＴＦサンプルの脱グルコシル化により試 験した。毎分およそ３．６Ｘ１０’カウントを含む、ラベル化ｈｕＴＦ約１２． ７４ナノグラムを０．４ユニ７）のグリコペプチダーゼＦ　（ＩＮ州、インディ アナポリス、ベーリンガー、マンハイム・バイオケミカルス社）、２０ｓＭ）リ ス塩酸（ｐ　Ｈ７，５）　、１０ｅ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、及び１％トリトンＸ−１０ ０を含む２０μｍ（Ｄ溶液と混合し、３７℃に１６時間維持した。それから、こ の脱グリコジル化した産物を、先に述べた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

第７図、レーン４及び５に示した、脱グリコジル化の研究結果は、５８ｋＤａの ｈｕＴＦは、別のタンパク質部分、すなわち軽鎖の存在のため、４７ｋＤａのも のよりも、高い相対分子量を示すことを表わしている。

このようにして単離したｈｕＴＦを、再脂質化し、そのプロコアゲラント活性が 再構成された。最高の活性を有する再脂質化組成因子産物を提供するのに必要な 組織因子：脂質比が、０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳバッファ溶液（２０＋ｏＭヘ ベス、ｐＨ６，０，１４０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０１％アジ化ナトリウム）中、 ＭｋＯ）ｔｉ度となるように、上述の得られた単離ｈｕＴＦを溶かすことにより 実験的に測定された。それから、種々ｈｕＴＦ＠釈物を以下に述べるように再脂 質化し、さらに、例２で報告されている凝集検定法で測定された、最も高い活性 を示す比が、後の使用のために準備された。

ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆの再脂質化のための脂質は、ＭＯ州、セントルイス、シグマケミ カル社から入手できるウサギの脳アセトン抽出粉末から抽出することにより調製 した。この粉末を、粉末１ｇに対し、２５ｍＡのへブタン：ブタノール（２：１ 、Ｖ　／　Ｖ　）の割でヘプタン：ブタノールと混合し、ついでこれに含まれる 固体を焼結ガラスロートを用いた濾過により回収した。残留固体について、この 抽出を６回くり返した。さらに、この残留固体をロト・エバポレーシヨンで乾燥 し、クロロホルムに溶解後、−８０℃に保存した。必要なときに、そのクロロホ ルムに溶解した固体を窒素雰囲気下で乾燥し、新しく調製した０、２５％のデオ キシコール酸ナトリウム溶液中、４＋ｅｇ／−Ｊとなるように溶解し、ウサギ脳 すン脂質溶＠（ＰＢＰＬ）を作った。

再脂質化には、各ｈｕＴＦ希釈物１００μｉを、１００μｌのＲＢＰＬ溶液、０ ．７６ｍＡの１％ウシ血清アルブミンを含むＨＢＳ溶液（ＨＢＳ／ＢＳＡ）及び ４０μｐの１０（１＋Ｍ塩化カドミウムと混合する。この混合物を２時間、３７ ℃に維持し、ついで、ここに含まれるｈｕＴＦ活性を、例２で述べた凝集検定法 で測定した。

５、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作成全てのハイブリドーマは、６ 〜８週間の年令の、スクリブス・クリニック・アンド・リーサーチ・インスチチ ュート、動物飼育場から入手できるメスのＢａ１ｂ／ｃマウス由来の牌臓細胞を 用いて作成された。

ａ、マウスＴＦ８の免疫化 例４で調製した親和性単離化ｈｕＴＦ５マイクログラムを１００μｇ７ｍ１２と なるよう生理食塩水に渚かし、ＭＯ州ハミルトンのリビ・イム／ケム・リサーチ 社から入手したＲ−７００アジユバントと１：１の割合で混ぜ：エマルジョン化 した。ついで、このエマルシヨンをマウスＴＦ８に皮下注射した。

このマウスＴＦ８は同様に、約２週間後、変性ｈｕＴＦ及びＲ−７００アジユバ ントを含むエマルシヨンの接種を受けた。変性ｈｕＴＦは、０．０９％トリトン Ｘ−１００，０，９３％ＳＤＳ、０．２Ｍ−２−メルカプトエタノール及び２７ ０　μｇ／ｍｉ！　ｈ　ｕＴＨを含むＴＢＳ　（１５０ｍＭ　ＣａＣ１，，５０ ＋ｅＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）を、５分間魚沸して調製した。その後、 この変性したｈｕ−ＴＦを、等容量の、０．６ｍｇ／＊Ｊマウス血清アルブミン を含む生理食塩水と混合した。つづいて、４倍容のアセトンを、この変性ｈ　ｕ 　Ｔ　Ｆ溶液に混ぜ、生じた混合物を、−晩、−２０℃に保った。生じた沈殿を 約１３０００Ｘｇ、１０分間の遠心で集め、４　：　１　（Ｖ／Ｖ）のアセトン ：水で一度洗浄してから、０．１　ｔｎｇ／ｍｌの濃度となるよう、２００μｇ の生理食塩水で懸濁した。

最初の注射から、約４週間後、０．１ｍｌ生理食塩水中３３μｇの親和性単離化 ｈｕＴＦを、０，１ｍｌ！の完全フロイント・アジュバント（ｃＦＡ）と混合し 、エマルシヨンを作り、これをマウスＴＦ８に腹腔内注射をした。

最初の接種から８運間後、リンａｍ衝食塩水中１５μｇの親和性単離化ｈｕＴＦ を静脈注射（ｉ、ｖ、）Ｌ、同じｈｕＴＦ／ＰＢＳ接種を２４時間後にも行った 。そのマウスＴＦ８の牌細胞を融合のため３日後に採取した。

ｂ、マウスＴＦ９の免疫化 マウスＴＦ９は、２回のリビ・アジュバント注射に、エマルジョン化前に変性し たｈｕＴＦを用いること以外は、マウスＴＦ８と同じ接種スケジュールがほどこ された。さらに、第１回目のＰＢＳ接種の腹腔内注射をＣＦＡ含有接種後４ケ月 半後に行なった。

Ｃ，ハイブリドーマの作成 ＴＦ８及びＴＦ９由来の牌細胞に、同じ融合操作を行った。各マウス由来の牌細 胞約Ｉ　Ｘ　１０＠個を、３０％ポリエチレンゲルコール（ＰＥＧ４０００．Ａ ＴＣＣ２５３２２−６８−３）を含む２００μｌの融合媒体中、２Ｘ１０’のＰ ３Ｘ６３Ａ。

８．６５３．１ミエローマ細胞と混合した。細胞融合後、生じたハイブリドーマ を９６大プレートに植種し、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、及 びチミジン）中で培養し、つづいて、ｈｕＴＦと反応する抗体分子生産能でスク リーニングした。

両マウスＴＦ８及びＴＦ９牌細胞由来の融合体共、ＨＡＴ融合媒体耐性ハイブリ ドーマ細胞クローンを生じた。ＴＦ８融合体は９０７個のＨＡＴ耐性ハイブリド ーマを、一方ＴＦ９融合体は、３４８個のＨＡＴ耐性ハイプリドーマを生じた。

６、抗ｈｕＴＦ抗体分子の生産によるハイブリドーマのスクリーニング ａ、固相ＲＩＡ ＴＢＳ中、２０μ７！／■ｌに希釈した１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（ＩＮ 州、インデアナポリス、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）をイム ロン・９６穴フレキシブル・ビニルマイクロプレートのウェルに入れた。それか らこのプレートを、１時間、３７℃を維持し、Ｔ、Ｇをウェルの壁に吸着させた 。

ＴＢＳで３回洗浄した後、３％オバルミンを含む１００μｌのＴＢＳ／）リドン を各ウェルに入れ、過剰のタンパク質結合部位をブロックした。

ウェルを、１時間、約２０℃に維持したのち、そのブロンキング溶液を、アスピ レータで除いた。そして、各ウェルに５０μβのハイブリドーマ培養上滑を加え た。できた固液相免疫反応混合物を１時間、３７℃に維持した。その後ウェルを ＴＢＳで３回洗浄し、過剰の液は、アスピレータで除いた。

例４で調製した、ＴＢＳ／）リドン中、およそｌｎｇのｈ　ｕＴＦと、およそ５ Ｘ１０’ｃｐｍを含む、５０ｐｌの１２Ｊラヘル化ｈｕＴＦを各ウェルに入れ、 第２の固液相免疫反応混合物を作った。そのウェルをＴＢＳ／）リドンで３回洗 浄し、固相に結合した”Ｊ−ｈｕＴＦ含有免疫反応産物を単離した。過剰の液体 はアスピレータで除き、ウェルを乾燥さセた。個々のウェルを切り離し、各ウェ ルに含まれるｌ！Ｊを、ガンマカウンタで計数した。

バンクグランド放射活性（ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆと抗体の反応無しの場合）はウェル当 り、平均約２００〜３００ｃｐ−であったが、一方、ｈｕＴＦと抗体の反応が育 る場合は、ウェル当り１１００００ｃｐのカウントがある。抗ｈｕＴＦ抗体の生 産が正と検定されたハイブリドーマを選択し、本発明のハイブリドーマとした。

つづいて、これらのハイブリドーマを、以下に述べるドツト・プロット検定でス クリーニングした。

ｂ、ドツト・プロット・イライザ法 例４で調製した、アセトン沈殿したｈ　ｕ　Ｔ　Ｆを、４：１　（ν／ｖ）のア セトン：水溶液で抽出した。残存する沈殿をＴＢＳ中に２０μｇ／■！となるよ うに懸濁した。このｈｕＴＦ溶液２０．ｕｇ（ｌμｌ）を、消えないインクで、 ＢＡ８３ニトロセルロース紙（シニレイチャー・アンド・シニエル、ＮＨ州、キ ーン）上に書いた数字の隣にスポットする。スポットしたｈ　ｕ　Ｔ　Ｆを空気 乾燥し、個々のスポットをパンチを用いて、ディスクに切り出す０個々のディス クを、ＢＬＯＴＴＯ（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等、ジェネフテインク・ア ナリティカル・テクニック（Ｇｅｎｅ、　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、）１巻、３頁 （１９８４年））を含む、多穴トレイの個々のウェルに浸し、約１時間、３７℃ に維持した。

このＢＬＯＴＴＯを、ウェルからアスピレータで除き、各ウェルに、２００μに のハイブリドーマ培養上清を加えた。さらにこのウェルを２時間、３７℃に保ち 、その後、このペーパーディスクを、ＴＢＳで２回洗浄し、ウェルから取り出し 、ＴＢＳにより、さらに洗浄するため、１つの大きな容器に入れた。ついで、過 剰の液体をその容器から除去する。

プロトプロット試薬キットの（μｌ州、アン・アーバー、プロメガバイオチク社 ）アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧを、ＢＬＯＴＴＯで５７００倍に 希釈し、このペーパーディスクと接触させた。このプロトプロット溶液との接触 を、３７℃で３０分間保った。その後、ペーパーディスクを、ＴＢＳ中で３回洗 浄した。業者の指示に従い、プロトプロットキット中に含まれている発色物質に より、ディスク上に結合したアルカリホスファターゼが検出される。

Ｃ，ウェスタン・プロット検定法 ウェスタン・プロント検定のため、例４で報告したように単離した約ｌＯμｇの ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆをサンプルバッファ（２％ＳＤＳ、５０ｍＭジチオスレイトール 、１０％グリセリン）に溶かし、５分間、煮沸した。それから、これを、レムリ 　（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）により報告された（ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、 ２２６巻、６８０頁（１９７０年））、参考としてここに組込まれている、予め 染色された分子量標準の小さい両側のレーンの間の広いレーンに試料をロードす る、分取型のスラブゲルを用いた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか けた（分子量標準＝ＭＡ州、ニュートンセンター、ディバー’７フアアイド・バ イオチク社）、参考としてここに組込まれている、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等 （プロシーディング・イン・ナシヨナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｉｃ、）　ＬＩＳＡ、　７６　巻、４３５ｏ頁（１９７９））により報告され ているように、電気泳動及びニトロセルロースへの電気ブロッティング後、この プロットを、ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳溶液でプロ。

りし、マニホルドに固定した（ＭＡ州、ケンブリッジ、イムネチクス社、ミニプ ロンタ）、８個のハイブリドーマ細胞培養上滑のストフクを、各マニホルドスロ ットにロードし、３７℃で１時間インキュベートした後、このプロットを取り除 き、ＴＢＳで洗浄した（０．０２％アジ化ナトリウム含１ｒＴＢＳ）。抗体が結 合したレーンを、発色物質で発色させたアルカリホスファターゼを結合した第２ 抗体を用い、供給業者の推める方法に従って可視化した（Ｗｌ州、マジソン、プ ロメガバオテク、プロトプロット）、陽性のストック由来の培養上清を、５％脱 脂粉乳ＴＢＳによる８倍希釈物について、別個に再テストし、抗ＴＦ抗体を生産 する個々のハイブリドーマクローンの同定を行った。

抗ｈｕＴＦ抗体産生が正と判断されたハイブリドーマをさらに特徴づけるために 選択した。例えば、上記のＴＦ８融合体由来のハイブリドーマは、例６ｂで述べ られているドツト・プロット検定法及び例６ｃで述べられているウェスタンブロ ンド橙定法でｈｕＴＦとの免疫反応を、そのハイブリドーマ培養上清が示すなら ば、抗ｈｕＴＦ抗体産生ハイブリドーマ培養と特徴づけられる。これらの特徴は 、２４個のＴＦ９ハイプリドーマ細胞系列についてみられ、そのほとんどは、例 １３の第５表に示した。その他のスクリーニング法で選択したハイブリドーマに より産生される抗体分子は１１）牌細胞を独自の融合体に提供する免疫化マウス （すなわちＴＦ８又はＴＦ９）、及び、独特のＨＡＴ培地耐性ハイブリドーマ細 胞が単離される、９６穴培養プレート、列番号及びウェル番号を示す文字によっ て呼ばれる（すなわち、５Ｂ？、ｌＩＤ１２、その他）、特殊な意味の文字は、 １語、ハイフン語又は２語として、ここにリストされる。例えば次の文字は同じ モノクローナル抗体分子組成を意味している；ＴＦ８−５Ｇ９、ＴＦ８−５０９ 及びＴＦ８−５Ｇ９゜ ７、　イムノグロブリンＩｇＧの単離 イムノグロブリンＩｇＧは、製造業者の指示に従がい、バイオラドラボラトリー ズＭＡＰＳｎシステムを用い、マウスのバイブリドーマ細胞系列ＴＦ８−５Ｇ９ 　（ＡＴＣＣ第ＨＢ９３８２号）を含むマウスの腹水液からｉｓされる。単離し たＩｇＧのタンパク質濃度は、製造業者の説明書に従がい、ＢＣＡタンパク質検 定試薬（ピアスケミカル社）を用いて測定した。

８、ｈｕＴＦの免疫親和性による単離のための、抗ｈｕＴＦ含有固体サポートの 調製 抗ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ抗体を、アガロース固体マトリックスへカンブリングするため 、少なくとも１回透析液交換を行う、０．１ＭＭＥＳ。

ｐＨ６，５を含む５０　Ｑ＋ｎｆの透析バッファに対する、４℃、１６時間の、 例７で報告したように調製した、ＭＡＰＳ草離ＴＦ８−５Ｇ９モノクローナル抗 体１０ｍｇの透析により、活性化した。活性化したＴＦ８−５Ｇ９を、２蒙Ｅの アフィゲル−１０アガロースビーズ（バイオラド）と混合し、できたカンプリン グ反応混合物を、製造業者の指示に従がい処理して、ＴＦ８−５０９／アガロ一 ス固体サポートを作った。

それから、例３で報告したように、固体サポート上の過剰のタンパク質結合部位 をブロックし、洗浄後、減圧濾過して、ＴＦ８−５Ｇ９／アガロースケーキを作 った。

９、ｈｕＴＦの免疫親和性による単離 ヒトの脳のおよそ半分、すなわち約１００納ｉに等しい、例１で調製した脳抽出 溶液を、計６１のバッファＡに対し、２回の外液交換をしつつ、４℃で３日間透 析した。その透析した抽出物を１．５時間、１０．ＯＯＯＸｇで遠心した。でき た上滑を、例４で調製したグリシンエチルエステル−アガロースケーキと混合し 、固液相反応混合物を作る８回転しながら、２時間室温に維持したのち、その固 相と液相を焼結ガラスロートによる濾過で分離した。

そのｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ含有液相を回収し、例８で調製したＴＦ８−５０９／アガロ ースケーキと混合し、固／液相免疫反応混合物を作った。

この免疫反応混合物を、回転しながら一晩、４℃に保ち、組織因子音響固相免疫 反応産物を形成させた。それから、この固相及び液相を先に述べたように濾過で 分離した。固相が残留し、これを１００倍容バッファＡで洗浄した。その後、固 相をガラスクロマトグラフィーカラムに移し、順次、（１１１％トリトンＸ−１ ００を含む２倍容の１ＭＮａｃＡ、及び（２）１％トリトンＸ−１００を含む２ 倍容の０．１Ｍグリシン（ｐＨ４，０）で洗った。

上述の洗浄後、その固体サポートに免疫学的に結合しているｈｕＴＦ、その固体 サポートを、焼結ガラスロート上に保持したまま、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２， ５及び１％トリトンＸ−１００溶液２０＋ｎＪで洗浄することにより、開放（溶 出）した、それから、例４に全て述べたように、溶出物質を回収し、ｈｕＴＦ検 定を行ない、集めて透析した。

透析物を４倍容の冷アセトンと混合し、ｈｕＴＦタンパク質を沈殿化した。さら にこの沈殿をおよそ一１０℃、５，０００Ｘｇ、３０分の遠心で集めた。生成し たベレットを窒素雰囲気下で乾燥し、そのベレフトの一部を変性条件でのＳＤＳ ニポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。

第８図に示したこの分析結果は、ｈｕＴＦが免疫親和性により、股脂脳粉末１グ ラム当り、３３ｍｇのｈｕＴＦの収率で単離されることを示している。

１０、抗ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ抗体による凝集の阻害１０μｉのハイブリドーマ培養上 滑を、例４で調製した約２ｎｇの再脂質化ｈｕＴＦを含む９０μ１７）ＨＢＳ／ ＢＳＡと混合した。

このようにして作りだ免疫反応混合物を３０分間３７℃に保ち、抗ｈｕＴＦ抗体 分子を免疫学的にｈｕＴＦに結合させ、免疫反応産物を形成させた。つづいて、 この免疫反応混合物について、例２で述べたように、ｈｕＴＦのプロコアゲラン ト活性を検定した。

ネガティブ・コントロールとして、無関係のＩεＧ調製物を抗ｈｕＴＦ抗体の代 りに用いた。

効果的ｈｕＴＦ濃度は、インヒビターの存在下測定した凝血時間を用い、例２の ように作った標準曲線から外挿した。阻害は、用いた実際のｈｕＴＦｆｉ度につ いて、効果的ｈｕＴＦ濃度の比率として表わされる。少な（とも５０パーセント の阻害をするモノクローナル抗体分子調製物は、本発明の抗体分子成分を中和す るものとして選択された。

例５に述べたように、単離したｈ　ｕ　Ｔ　Ｆに対して生じたハイブリドーマ由 来の数多い培養上清を、凝集開始を阻害する能力について、先の操作により測定 した。有意に凝集を阻害することが分ったハイブリドーマを、第５表に示した。

また、抗ｈｕＴＦ抗体による凝集阻害は、予め形成されたｈｕＴＦ−因子■複合 体を用いて行った０例４で調製した再脂質化したｈｕＴＦｌｎｇを含む１０ｐｌ を、ＨＢＳ／ＢＳＡ７０μ！１２０ｍＭ塩化カルシウム１０μｌ及び、例３で述 べられているように調製した因子約２５ｎｇを含む１０μｌと混合する。この混 合物を１５分間３７℃に保ち、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆを、混合物として使える因子■と 複合体をつくらせる。その後、１０μＥの溶液に、例７で述べたように調製した ＭＡＰＳ−単離化モノクローナル抗体約１０ｎｇを混合し、この第２の混合物を 、３０分間３７℃に保った。さらに、第１に２０ｍＭ塩化カルシウム１００μｍ ついで、ヒトのクエン酸化血漿又は例１２で述べてように調製した因子■欠損血 漿を加え、ついで秒で表わされた凝血時間を観測することにより、生成した混合 物の凝集阻害の測定を行った０例１０で述べられているように、阻害率を表わし 、予め形成したｈｕＴＦ−因子■複合体での阻害の結果を、第６ａ表に示した。

第６表 抗ｈｕＴＦによるｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ−因子■依存の凝集阻害１、クエン酸化豐ト血 漿による凝集 抗　体　因子■６　阻害率 ブランク８＋０ ＴＴＳ５Ｇ９ゝ　＋　５８％ コントロール０＋０ ＴＦ８５Ｇ９　８３％ ■、因子■テプリート化ヒト血漿 抗　体　因子■　阻害率 ブランク　＋　０ ＴＦ８５Ｇ９　＋　５８％ コントロール　＋　Ｏ ａ、　“ブランク′とは、モノクローナル抗体を検定法で用いなかったことを示 している。

ｂ、”ＴＦ８５Ｇ９″とは、ハイブリドーマＴＦ８−５６９がら単離したモノク ローナル抗体を検定で用いたことを示している。

Ｃ１“コントロール”とは、検定で無関係なモノクローナル抗体を用いたことを 示している。

ｄ、　”＋°は、抗体を混合物に加える前、因子■を加え、精製したｈｕＴＦと 複合体を形成させることを示す。

抗ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ抗体による凝集阻害の別の研究が、ＴＦを因子■／■ａと会合 させ、ＴＦ：因子■／■ａ複合体を形成させる前後の阻害を比較する条件下で行 った。

これらの研究で、予め形成したＴＦ：■／■ａ複合体を用いた抗ｈｕＴＦｈ抗体 による凝集阻害を、利用するモノクローナル抗体含有溶液１０μｌにＭＡＰＳ単 離化モノクローナル抗体含宵溶液の代りに、ハイブリドーマ培養上清を用いた以 外、例１ｏで述べたのと基本的に同様に行った。比較のため、抗ｈｕＴＦ抗体に よる凝集阻害を、例１０で述べたように、因子■／■ａを含むクエン酸化血漿と の混合の前、それら抗体及び再脂質化ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆの免疫複合体を形成するこ とにより検定した。

ここで述べている全ての抗体は、この比較阻害検定試験を行ったが、約６０％以 上の阻害を示すものだけが、ｈｕＴＦ：■／■ａ複合体により開始する凝集を阻 害する能力を有意にもつと考えた。

これらのＭｏＡｂには、ＴＦ９−ＩＢ８、ＴＦ９−５Ｂ７、ＴＦ８−５Ｃ４、Ｔ Ｆ８−１１ＤＩ　２、及びＴＦ８−２１Ｆ２がある。

１１、ポリペプチド合成 ここで使用されている種々のｈｕＴＦｈ領域に対応するポリペプチドをハゲンメ イヤー（Ｈａｇｅｎｍａｉｅｒ　）等（ポップーセイラーズ（Ｈｏｐｐｅ−３ｅ ｙｌｅｒ’ｓ　）　Ｚ、　フィジオロジカル・ケミストリー、３５３巻、１９７ ３頁（１９８２年））のシンメトリカル・アンハイドライド法を用いたアプライ ド・バイオシステムダモデル４３０Ａペプチド合成機で化学合成した。第１及び 第２表のポリペプチドに加え、以下に示す第３表のポリペプチドも合成し、これ には、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈと反応できる抗ポリペプチド抗体の生産に有用な、本 発明のポリペプチドが含まれている。

第３表 抗原性ポリペプチド １２、ポリペプチドによる凝集■害 ｈｕＴＦ依存の凝集開始を疎開する、本発明のポリペプチドの能力を、まず、こ のポリペプチドを因子■／■ａ及びカルシウムイオン存在下でインキュベーショ ンし、さらにこの混合物を、因子■／■ａ欠損血漿に加えて、凝血時間を見積っ た。

ヒトの因子■／■ａを例３に述べた方法で単離した。ＨＢＳ／ＢＳＡｍｊ当り、 この単離した因子■／■２００ｎＨの溶液１０ｐｔｉに、！００μｆＨＢＳ、２ ０μｍ２５ｍＭ　ＣａＣ１を及び１００μｌの合成ポリペプチド含有ＴＢＳ／） リドンを加えた０種々の濃度で含まれる多種の混合物をこのように調製し、それ を、１５分間、３７℃に維持した。例４で述べたように調製した再脂質化した組 織因子を、ＨＢＳ／ＢＳＡで希釈し、例２で述べたような凝集検定法でテストし たとき、１０μｌでおよそ４５秒の凝集時間が得られるように調製した。上記の ように維持した混合物をさらに、再脂質化ｈｕＴＦ１０μｌ希釈物、２５ｍＭＣ ａＣＡｚ１００μ！及び１容の血まに対し１，５容のＨＢＳで希釈した因子■／ ■ａ欠損血漿１００μＪ　（ＫＡ州、オーバーランド・パーク、ジシージ・キン グ・バイオメティカル社）と混合した。凝血時間の延長は、この合成ポリペプチ ドによる凝集の阻害を示していることになる。阻害率を、例１０で述べているよ うに計算した。少なくとも３０％の凝集阻害を示すポリペプチドはｈ　ｕ　Ｔ　 Ｆ　ｈ結合部位ポリペプチド類似物、すなわち；第４表のセクレチンＩで示され ているポリペプチド、ｐ２６−４９、ｐ１４６−１０７及びｐ１６１−１８９で ある。

別に、上記阻害検定において、モノクローナル抗体による免疫親和性吸着により 、因子■／■ａ欠損血漿である因子■／■ａ欠損血漿を用いた。ヒトの因子■／ ■ａに対するモノクローナル抗体を、例３で述べたように単離した因子■／■ａ をｈｕＴＦの代り′に免疫原として用いた以外、例５で述べたものと基本的に同 様に調製した。できたハイブリドーマを、イライザ法で評価し、ＩＮ州、サウス ベンド、エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社から入手できるヒトの血液タ ンパク質、タンパク質Ｓ、因子ＩＸ、因子Ｘ及び因子■と反応しないハイブリド ーマを同定した。そのようなハイブリドーマ、ＦＶＩＩ、Ｆｌ、２　Ｈ３−３， ２は、↑、Ｓ。

ニシントン（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ　）博士から載いた（ＣＡ州、ラジョラ・スク リブス・クリニック・アンド・リサーチ・ファンデーション社）、イムノグロブ リンＩｇＧを、ハイブリドーマＦＶＩＩ、Ｆｌ、２　Ｈ３−３，２を含むマウス の腹水から単離し、この単離したＩｇＧを、例８に述べたように、固体サポート に結合させた。できた抗因子■／■ａモノクローナル抗体含有固体サポートを貯 留した正常なりエン酸化血漿から、血漿音響液相を収穫し、保留すること以外、 例９で述べた免疫親和性操作を用いて、因子■／■ａを除くのに用いた。

脂質化型で用いたとき、競合的に凝集を阻害する、いくつかのポリペプチドの能 力を、１００μｌの合成ポリペプチド溶液の代りに、１００μｌの脂質化合成ポ リペプチドを用いることにより上記検定法での評価を行った。

脂質化合成ペプチドは、合成ポリペプチドを、単離したｈｕＴＦの代りに用いる こと以外は、単離したｈｕＴＦの再脂質化で用いた、例４で述べた方法で調製し た。ルーチンには脂質とポリペプチドの比は５２　：　１　（Ｗ／Ｗ）が用いら れた。少なくとも３０％の凝集阻害を起こす脂質化ポリペプチドが、脂質化型で 存在するとき、ｈｕＴＦ結合部位ポリペプチド類イ以物すなわち、第４表のセク ション■で示されたポリペプチドと考えた。

第４表 ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈのポリペプチド類似物のｈｕＴＦによる凝集開始の阻害 ペプチド　阻　害 ■、非リン脂質化ペプチド　濃　度 ｐｉ−３０２５，０１０ｕＭ ｐ２ｓ−４９８８，８１０ｕＭ ｐ４１−７１　２５．０　１０ｕＭ ｐ４０−４９　２５．０　１０ｕＭ ｐ５６−７１　２５．０　１０ｕＭ ｐ７２−１０４　２５．０　１０ｕＭ ｐ９４−１２３　２０．０　１０ｕＭ ｐ１２１　１５５　１０．０　１０ｕＭｐ１４６−１６７　８７．５　１０ｕＭ ｐ１６１−１８９　３２．５　１０ｕＭｐ１９０　２０９　２０．０　１０ｕＭ ｐ２０４−２２６　２０．０　１０ｕＭな　し　Ｏ− ■、リン脂質化ペプチド ｐｌ−３０８１，０１０ｕＭ ｐ２６　４０　Ｂ３．０　１０ｕＭ ｐ４０−７１　６５．０　１０ｕＭ ｐ５０−７１　７３．３　３０ｕＭ ｐ９４−１２３　９３．７　１０ｕＭ ｐ１２１　１５５　５５．０　１０ｕＭｐ１４６−１６７　８０．０　１０ｕＭ ｐ１６１−１８９　９４．０　１０ｕＭａ１例１２で述べたように測定した阻害 率上記のポリペプチド阻害研究で得られた代表的投与一応答曲線を第９及び第１ ０図に示した。

１３、ポリペプチドによる抗体−ｈｕＴＦ免疫反応の阻害フレキシブルビニルで できたイムロンＵ底９６穴プレート（ダイナチク社）のウェルを過剰タンパク質 結合部位のプロフキングを、３７℃２０分間行うこと以外、例６で述べた方法で ヤギ抗マウス］、Ｇ　（ベーリンガーマンハイム社）によりコーティングし５０ μｌのハイブリドーマ培養上清を各ウェルに入れ、１時間３７℃に維持した。さ らにこのウェルをＴＢＳで３回洗浄し、過剰の液体をアスピレータで除いた。

単離化ｈｕＴＦは、例９で述べたように、免疫親和性カラムで調製した。単離化 ｈ　ｕＴＦを含むアセトン沈殿をＴＢＳ／）リドンに溶かし、そのタンパク質濃 度を、製造業者の説明書に従がい、ＢＣＡタンパク質検定試薬（ピアス）を用い て測定した。ｈｕＴＦの炭化水素側鎖を、オシャネシ−（０’５ｈａｎｎｅｓｓ ｙ　）等の報告した方法（イムノロジカル・レターズ（］ｗｕ＋＋ｎｕｏ１．　 Ｌｅｔｔｅｒｓ　）、８巻、２７３〜２２７頁（１９８４年））に従がい、ビオ チン−ヒドラジド（ＮＹ州、プレインビュー、ＩｃＮバイオメディカル社）を用 いて、ビオチン化し、ビオチン化ｈｕＴＦ溶液を作った。

ＴＢＳ／）リドン中６０ｎｇ、／＋ｆに調製した５０μＥのビオチン化ｈｕＴＦ ｉ液を、５μＭ合成ポリペプチドとともに、各ウェルに入れ、１時間、３７℃に 維持した。その後、このウェルをＴＢＳ／　トリトンで３回洗浄した。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡを含むＴＢＳで １／１００に希釈した、１００μｌのストレプトアビジン−結合アルカリホスフ ァターゼ（ＮＹ州、ニューヨーク、エンゾバイオケム社、デテクＩ　−ａｌｋ　 ）を各ウェルに入れ、３０分間、３７℃に維持した。その後、このウェルを、１ ０−Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６，５）　、２％ＢＳＡ、０．５％トリトンＸ−１ ００，０，５Ｍ塩化ナトリウム及び１ｍＭＥＤＴＡを含む溶液を４回洗い、つい で検出バッファ（０，ＩＭ）リス・塩酸（ｐＨ８，８）　、０．１ＭＮａＣｊ、 　５ｍＭ　ＭｇＣＪｘ　）で１度洗った。

その後、検出バッファ中、２■Ｍのｐ−ニトロフェニルリン酸を含む溶液１００ μｌを各ウェルに加え、１時間３７℃に維持する。ついで、４０５ナノメーター での光学密度を各ウェルについて、バイオ・チク・マイクロプレートリーダー（ ＶＴ州、ライノースキ、バイオ・チク・インスツルメント）を用いて測定した。

この競合的阻害研究の結果を第５表に示した。

第５表 モノクローナル抗体とペプチドの相互作用の表ＴＦ８５Ｇ９　→ 丁Ｆ８１１Ｄ１２　十 ７Ｆ８５Ｃ４÷ ＴＦ８２１Ｆ２　＋ τＦ９１Ｄ５　÷　÷　＋ τＦ９２Ｃ４÷　÷　÷　÷ ＴＦ９２Ｆ６　＋ ÷ τＦ９５Ｃ７÷　＋　÷ ＴＦ９６Ｂ４　＋ 十 ＴＦ９９Ｃ３＋　＋　÷　＋ 丁Ｆ９１０Ｃ２＋　＋ τＦ９１Ｆ１　÷ ↑Ｆ９１Ｅ７　、　＋　＋　＋ τＦ９１８８　＋　÷　÷ ＴＦ９１Ｂ９　＋ ７Ｆ９４Ｄ１１　÷　÷　＋ ＴＦ９５Ｇ４　÷　＋ ＴＦ９５Ｂ？　÷　÷ ＴＦ９６Ｇ４　＋ τＦ９７Ｅ１０　＋　＋ 丁Ｆ９８Ｅ８＋＋や 丁Ｆ９９Ｅ１　＋　÷　＋ ＴＦ９９Ｂ４　千　号 ７Ｆ９６Ｃ８’＋十＋ ＴＦ９１０Ｈ５’　＋　＋ τＦ９９Ｄ５’　÷　＋ τＦ９１０Ｈ１０ゝ　＋　＋ ａ、各モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、同名のハイブリドーマにより産生され た。全てのハイプリドーマは例１３で述べたように、ハイプリドーマ培養物上清 を用いてスクリーニングした。

ｂ、これらの抗体は、例１０の結果から中和性をもたないと考えた；その他の全 ての抗体は、同結果に従かい中和性をもつと考えた。

もし、ポリペプチド存在下で得られた吸光度測定値が、ポリペプチド非存在下で 与えられた抗体に対して得られた平均価値から１以上の標準偏差をもつとき、阻 害が有意に起ったと考えた。

１４．２部位イライザ法による身体サンプルにおけるｈｕＴＦ検出 血液、血よ、唾液、尿、その他の身体サンプル中のｈｕＴＦは、同じｈｕＴＦ分 子に同時に結合することができる２つのモノクローナル抗体を用いて検出できる 。

イムロン・ポリスチレンＵ底９６穴プレートを、まず、各ウェルに、ＴＢＳ中１ ０８ｇ　／ｖｂｌに希釈したＩｇＧ１００μｆを入れ、ついで、ウェルと、Ｉｇ Ｇ１１液との接触を、４℃、−晩維持することにより、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ベ ーリンガーマンハイム社）でコートした。そのウェルを、ＴＢＳで３回洗浄し、 ついで、各ウェルに、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ／）リドン１００μｌを加えた。

その後、これらのウェルを１時間、３７℃に維持してから、ＴＢＳで３回洗浄し 、さらに、過剰の液体をアスピレータで除いた。

第１のハイブリドーマ、ＴＦ９−６Ｂ４由来の抗ｈｕＴＦ抗体分子含有培養上清 １００μＩを各ウェルに入れ、１時間３７℃に維持した。それから、これらのウ ェルをＴＢＳで３回洗浄し、ついで過剰の液体を、アスピレータで除いた。

例９で調製したようＳｘ免疫親和性単離し、アセトン沈殿化ｈｕＴＦを、ＴＢＳ ／）リドンに溶した。このｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　溶液の希釈物をＴＢＳ／）リドンで ５μｇ７’ｎＡから０．５　ｎ　ｇ　／ｗｉｌｌの範囲で調製し、希釈液１００ μｌをイムロンプレートのウェルに入れた。このｈｕＴＦ希釈撮を、第１の抗体 と接触させ、１時間３７℃に維持した。さらにこの希釈物をウェルから除き、ウ ェルをＴＢＳ／）リドンで３回洗浄した。過剰の液体をアスピレータで除いた。

抗ｈｕＴＦ抗体を、例７で述べた方法により、第２のハイブリドーマＴＦ９−１ ０）ｉｌｏの腹水からＭＡＰＳで単離した。この抗体溶液のタンパク質を測定し 、ついで、例１３で述べたようにビオチン化によりラベル化した。

このビオチン化した抗ｈｕＴＦ抗体をＴＢＳ／）リドンで６０ｎｇ／＋ｃＡに希 釈し、この溶液１００μＩを各ウェルに入れた。

そＯウェルを１時間、３７℃に維持し、ついでＴＢＳ／）リドンで３回洗った。

この結合した、ビオチン化抗ｈｕＴＦ抗体を、例１３で述べたデテク１−ａｒｋ システムを用いて検出した。この検定法で第１及び第２の抗体として用いている モノクローナル抗体は、その２つがｈｕＴＦに同時に結合できる能力をもつ限り 、いろいろ変えることができる０例えば、第１抗体として、ＴＦ９−６Ｂ４を用 いたとき、ＴＦ９−１１ＤＩ　２を、ＴＦ９−１０ＨＩＯの代りに、第２の抗体 として用いることができる。このように、本発明は、本検定法で同時に結合でき る種々の抗体の組合せを考藁した。

１５、全プレｈｕＴＦｈコード配列を含むＤＮＡ断片の構築全ブレｈｕＴＦコー ド配列を含むＤＮＡ断片を第１１図にその制限地ばに示されている、組換えプラ スミドｐＣＴＦ６４、ｐＣＴＦ４０３及びｐｃＴＦ３１４と、この分野でよく知 られている操作を用いて構築することができる０例えば、マニアチス（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ）等、ＮＹ州、コールドスプリングハーバ−、モレキュラー・ラボラト リ−、ラボラトリ−マニュアル、モレキュラー・クローニング（１９８３年）参 照。

第１１ｒ２で示されている組換えＤＮＡプラスミド中に含まれる挿入断片は、ク ローニングを可能にする、各末端のＥｃｏＲＩリンカ−５’　−ＧＧＡＡＴＴＣ Ｃ−３’　（ＭＡ州、レキシントン、コラボラチプリサーチ社）を有している。

これらのリンカ−配列は、天然のｈｕＴＦｈ　ＤＮＡコード配列の一部ではない ので、第２図に示されるヌクレオチド配列中には存在しない０組換えＤＮＡ分子 構築の説明は、関係するｈｕＴＦｈ　ＤＮＡ配列についても明らかなように、Ｅ ｃｏＲＩ末端を含む消化により生じ、これらの付加的なリンカ−配列を含む断片 は、第２図で示したヌクレオチド塩基番号によって示されるだろう、この断片は 、その末端にこれら付、加的配列を含むことが理解できよう。

プラスミドｐＣＴＦ６４を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＤｒａｍで 消化し、第２図で示される、塩基残基１〜２９６番に対応するヌクレオチド配列 を含むＤＮＡ断片を作った。このようにして作った、３０２ヌクレオチド塩基対 （ｂｐ）断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画により単離し、アルカリホス ファターゼを用いた処理により脱リン酸化した。

プラスミドｐｃＴＦ４０３を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１で消化し、第２ 図の残基７７６〜１１２５番に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を作 った。生成した３５２ｂｐの断片を、アガロースゲルを用いたサイズ分画により 単離した。

プラスミドｐｃＴＦ３１４を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、生 成した６４７ｂｐの断片をサイズ分画で単離した。この断片は、第２図の残基１ ３５〜７７５番の配列に対応するヌクレオチド配列を含んでいる。６４７ｂｐ断 片をサイズ分画で単離し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。

この３５２ｂｐ断片及び脱リン酸化した６４７ｂｐ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼの 反応によって機能的に結合（ライゲーシヨン）し、第２図の残基１３５〜１１２ ５番に対応するヌクレオチド配列を有する９９９ｂｐの断片を作った。

さらに、この９９９ｂｐ断片を、制限エンドヌクレアーゼＤｒａｍで消化し、第 ２図の残基２９６と２９７番の間でこの９９９ｂｐ断片を切断し、これによって 、１６８ｂｐと８３１ｂｐの断片が生ずる。

さらに脱リン酸化した３０２ｂｐの断片と、８３１　ｂｐの断片をＴ’４ＤＮＡ リガーゼで機能的に結合し、第２図の１〜１１２５番に対応するヌクレオチド配 列を含む１１２５ｂｐ断片を作った。

ＥｃｏＲＴで消化して、クローニングプラスミドベクターｐＵＣ８を線状にした 。先に調製した１１３３ｂｐ断片と、ＥｃｏＲＩ消化したベクターをＴ４ＤＮＡ リガーゼで機能的に結合して環状組換えＤＮＡ分子ｐＵＣ−プレｈｕＴＦｈを作 った。

大腸菌ＲＲＩ株（ＭＤ州、ゲイサーズバーグ、ベセスダ・リサ−チラボラトリー ズ）をｐＵＣ−ブレｈｕＴＦｈでトランスホームし、そしてアンピシリン耐性に 基づいて、トランスホーマントを選択した。それから、この選択したトランスホ ーマントをクローン化し、プレｈｕＴＦｈ構造遺伝子をもつ組換えＤＮＡ分子の 存在によりスクリーニングした。

ブレｈｕＴＦｈ構造遺伝子をもつ組換えＤＮＡ分子の存在によるスクリーニング は、各選択されたトランスホーマント由来のｒＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化するこ とによって行った。生じたＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲルでサイズに従って分 解した。３５２ｂｐ、　７８１ｂｐ及び２６８２ｂｐのＤＮＡ断片に対応する三 つのバンドパターンを示す組換えＤＮＡ分子でプレｈｕＴＦｈｆｉ造遺伝子の存 在を確めた。上述のＥｃｏＲＩ消化パターンを生ずるｒ　ＤＮＡを有する大腸菌 ＲＲＩ）ランスホーマントは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含み、かつ、選択さ れ（回収）された。

細胞外アンカー領域を含むが、カルボキシル末端にトランスメンブレン・アンカ ー領域を欠く、ブレｈｕＴＦｈコード配列の実質的領域を含み、従って、可溶性 ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈタンパク質をコードするＤＮＡ断片を次のように構築した。

プラスミドｐ　ＣＴＦ　６４を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ］で消化し、第 ２図の１〜４８６番の残基に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を作っ た。このようにしできた４８６ｂｐの断片を、アガロースゲルを用いたサイズ分 画で単離し、その後、アルカリホスファターゼ処理で脱リン酸化した。つぎに、 このように脱リン酸化した４８６ｂｐの断片を制限エンドヌクレアーゼＤｒａ■ を用いで消化し、第２図の２９６番と２９７番の間の部位で、ａｓｓｂｐ断片を 切断し、２９６ｂｐ及び１９０ｂｐの断片とした。この２９６ｂｐの断片をアガ ロースゲルのサイズ分画で単離した。

プラスミドｐｃＴＦ３１４を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化、し、第 ２図の１３５〜７７５番の残基に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を 作った。この６４１ｂｐ断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画で単離し、つ いで、アルカリホスファターゼ処理により脱リン酸化した。この脱リン酸化した ６４１ｂｐ断片を、Ｄｒａｌ［ｌで消化し、第２図の２９６番及び２９７番の間 の部位で、この６４１ｂｐ断片を切断し、これにより、１６２ｂｐ及び４７９ｂ ｐの断片とした。このうち、４７９ｂｐ断片をアガロースゲルを用いたサイズ分 画により単離した。

上述のように調製した２９６ｂｐ及び４７９ｂｐの断片を、７．４ＤＮＡリガー ゼを用いた反応により機能的に結合（ライゲーション）し、第２図の１番から７ ７５番の配列に対応するヌクレオチドアダプター配列を有する７７５ｂｐ断片を 作った。

クローニングプラスミドベクターｐＬｌｃ１８をＥｃｏＲＩによる消化で線状化 する。上記のように調製した７７５ｂｐｌｊＩＴ片と、ＥｃｏＲ１消化ベクター をＴ４ＤＮＡリガーゼで機能的に結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＵｃ−ブレｈ ｕＴＦｈ−Ｔを作った。

大腸菌ＲＲＩを、ｐｕｃ−ブレｈｕＴＦｈ−Ｔでトランスホームし、ｐＵＣ−ブ レｈｕＴＦｈ−Ｔを含むクローンであるアンピシリン耐性トランスホーマントを 選択した。

組換えＤＮＡ分子ｐｖｃ−ブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ　−ＴをＥｃｏＲＩで消化し 、生成した７７５ｂｐ断片をサイズ分画で単離した。

カルーザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）等（ジャーナル・オフ・アメリカン・ケ ミカル・ソサイアティ−（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　）　、１０３ 巻、３１８５頁（１９８１年））及びゲイト（Ｇａ１ｔ　）等（コールド・スプ リング・ハーバ−・シンポジウム・フォント・バイオロジー（Ｃｏ１ｄ、　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　）４７巻、 ３９３（１９８３年））の方法に従がい、互いにオリゴヌクレオチドが機能的に 結合するのを防ぐため、ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化を行なわれな かったこと以外は同様にして、５　’　−ＡＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＴＡＡＧＡＡ ＴＴＣＧＧＧ−３’３　’　−ＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣ−５’ の配列をもつ、合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を作った。

このオリゴヌクレオチドをアニールし、粘着ＥｃｏＲＩ末端を含む二本鎖ＤＮＡ リンカ−断片を作り、ローザ−スタイン（Ｒｏｔｈｅｒ−ｓｔｅｉｎ）の方法（ メソンズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｏｔｈｅｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　 ）、６８巻、９８頁（１９７９年））に従って、平滑末端とした。つぎに、この リンカ−断片を、ｐＵＣ−ブレｈｕＴＦｈ−Ｔから得た７７５ｂｐ断片に機能的 に結合し、７７５ｂｐ断片の各末端に１つのアニール断片を含む８１７ｂｐ断片 を作った。その後、この８１７ｂｐ断片をＥｃｏＲＩで消化し、８１７ｂｐ断片 の各末端を平滑からＥｃｏＲＩ粘着末端へと転換し、８０５ｂｐ断片とした。

この８０５ｂｐ断片をアガロースゲルを用いたサイズ分画で単離した。

クローニングプラスミドベクターｐＵｃ１８をＥｃｏＲＩで消化し線状化した。

先に調製した５ｏｓｂｐ断片とＥｃｏＲＩ消化したベクターをＴ４ＤＮＡリガー ゼを用いて機能的に結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＵｃ−ブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ 　ｈ　−Ｔ　Ｒとした。

大腸菌ＲＲＩをｐＵＣ−ブレｈｕＴＦｈ−ＴＲでトランスホームし、ｐＵＣ−ブ レｈｕＴＦｈ−ＴＲを含むクローンである、アンピシリン耐性トランスホーマン トを選択した。

１６、組換えｈｕＴＦｈコード配列の発現に反ｈｕＴＦｈの生産組換えＤＮＡ分 子由来の組換えｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈの発現は原核性細菌細胞、非を椎真核性細胞 及びより高等な（を椎）真核性細胞を含む種々の発現媒体中で行うことができる 。そのような発現媒体の代表例には、各々、大腸菌Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ　）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。

ａ、大腸菌におけるブレｈｕＴＦｈの発現大腸菌において、ブレｈｕＴＦｈ構造 遺伝子を発現できる組換えＤＮＡ分子は、例１５で作ったｐｕｃ−ブレｈ　ｕ　 Ｔ　Ｆ　ｈ組換えＤＮＡ分子由来のブレｈｕＴＦｈ遺転子含ｆＤＮＡ断片を単離 し、ついで、この断片を原核性発現ベクターに機能的に結合することにより構築 することができる。

組換えＤＮＡ分子ｐＵＣ−ブレｈｕＴＦｈを、そのプラスミド中に存在するＥｃ ｏＲ１部位を部分的に切断するような条件で、ＥｃｏＲＩ消化する。この部分消 化法は、アニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）等、ＮＹ州、コールドスプリング・ ハーバ−、コールドスプリングハーバ−・ラボラトリーズ、ラボラトリ−マニュ アル、モレキュラー・クローニングにより詳細に報告されている。図２の残基１ 番から、１１２５番で示される配列に対応するヌクレオチド配列を含む１１３３ ｂｐ断片を、サイズ分画によりＥｃｏＲ１部分分解産物から単離した。

原核性発現ベクターｐＸＫ２２３−３　（ＮＪ州、ピスヵタウェイ、ファルマシ ア・ファイン・ケミカルズ社）を、ＥｃｏＲＩによる消化で線状化した。この消 化ベクター及び１１３３ｂｐプレｈｕＴＦｈ構造遺伝子含有断片をＴ４ＤＮＡリ ガーゼを用いて機能的に結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＫＫ−ブレｈｕＴＦｈ を作った。

大腸菌ＲＲＩをｐＫＫ−ブレｈｕＴＦｈでトランスホームし、ｐＫＫ−ブレｈ　 ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ含有クローンとしてアンピシリン耐性トランスホーマントを選択 した。

ｂ、大腸菌におけるｈｕＴＦｈの発現 大腸菌においてｈｕＴＦ遺伝子を発現することができる総換えＤＮＡ分子は、例 １６ａでｌｉ製した１１３３ｂｐ断片を操作して構築した。まずこの断片をアル カリホスファターゼで脱リン酸化し、ついで、制限エンドヌクレアーゼＢｂｖｌ で消化した。生じた９６４ｂｐの断片は、第２図の残基１６４〜１１２５番に対 応するヌクレオチド配列を含んでおり、サイズ分画によう車離した。

先に述べたように、 及び の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を作り、ロザーステイン（ Ｒｏｔｈｅｒｓｔｅｉｎ　）等（メソフズ・イン・エンザイモロジー（！’Ｉｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　６８巻、９８頁（１９７９年））の 方法に従って、粘着ＥｃｏＲＩ及びＢｂｖｌ末端を含む二本鎖ＤＮＡリンカ−断 片をアニーリングすることにより作った。このリンカ−をまず９６４　ｂｐ断片 に機能的に結合して、１００８ｂｐ断とした。ついで、１００８ｂｐ断片を、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼを用い、ＥｃｏＲＩ消化したベクターｐＫＫ２２３−３と機能 的に結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＫＫ−ｈｕＴＦｈを作った。

組換えＤＮＡ分子ｐＫＫ−ｈｕＴＦｈは、ｐＫＫ−ブレｈｕＴＦｈと、（１）残 基１〜１２９番の残基がない、及び（２）新しいメチオニンコドンが、残基１３ ０番の前に機能的に結合しており、その結果タンパク質発現（翻訳）が挿入され たメチオニンコドンの場所で始まることだけが異なる。

組換えＤＮＡ分子ｐＫＫ−ブレｈｕＴＦｈ及びｐＫ）［−ｈｕＴＦｈを、その中 に含まれる構造遺伝子によりコードされるｈｕＴＦｈ又はブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　 ｈの発現に適合する原核性宿主媒体に導入した。

そのような宿主媒体の代表例は、大腸菌ＲＲＩ株である。この宿主を、組換えＤ ＮＡ分子でトランスホームし、細胞増殖とこの組換えＤＮＡの発現に適合する条 件下で培養し、この発現したタンパク質を従来の技術を用いて収穫した。

ｃ、ＣＨＯ細胞におけるブレｈｕＴＦｈの発現を椎動物細胞中、プレｈｕＴＦｈ 遺伝子を発現できる組換えＤＮＡ分子を例１６ａで調製したｌ　１３３　ｂｐ断 片を用いて構築した。

カルーザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）等及びゲイト（Ｇａ１ｔ　）等の方法（ 上記）を用い、 ５　’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３　’５　’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ−３　’ の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を作った。

ついでこのオリゴヌクレオチドアダプター断片を、ロザースタイ７　（Ｒｏｔｈ ｅｒｓｔｅｉｎ　）等の方法（メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　６８巻、９８頁（１９７９年））を用い、 １１３３ｂｐ断片の各末端に結合し、元々１１３３　ｂｐ断片に存在するＥｃｏ ＲＩ粘着末端を、ＢｇｌＩｌ粘着末端に転換した。

真核性シミアンウィルス（ＳＶ４０）を基本とする発現ベクター、ｐＫＳＶ−１ ０（ＮＪ、ビスカタウェイ、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社）を、制限 エンドヌクレアーゼＢｇｌＩｌによる消化で線状化した。１１３３ｂｐのＢｇｌ Ｉｌ適合断片及び、Ｂｇｌ■消化ベクターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、機 能的に結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＳＶ−ブレｈｕＴＦｈを作った。

大腸菌ＲＲＩを、ｐＳＶ−ブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈでトランスホームし、アンピ シリン耐性のトランスホーマントを選択し、クローン化した。それからこの選択 したトランスホーマントをクローン化し、モノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９を 用いて、発現するブレｈｕＴＦｈタンパク質の存在を各クローンについて検定し て、ｐＳＶ−ブレｈｕＴＦｈの存在に関する選択を行った。

ｄ、ＣＨＯ細胞におけるｈｕＴＦｈの発現ホ乳類細胞において、ｈｕＴＦｈを発 現することができる組換えＤＮＡ分子を、例１６ｃ由来のｐＳＶ−ブレｈｕＴＦ ｈを、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩ［で消化することにより構築した。生成 した１　１５３　ｂｐ断片をサイズ分画で車離し、つづいて、制限エンドヌクレ アーゼＢｂνＩで消化した。生じた９　７４　ｂｐ断片は、図２の残基１６４〜 １１２５番の配列に対応するヌクレオチドアダプター配列を含み、これを、サイ ズ分画により単離した。

先に述べた方法で、 及び の配列をもつ合成オリゴヌクレオチドアダプター断片を合成し、アニールして、 粘着性ＢｇｌｌＩ及びＢｂｖＩ末端を含む二本Ｓｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａリンカ−断片 を作った。ついで、このリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて９７４　ｂｐ断 片に機能的に結合して、第２図の残基１３０〜１１２５番の残基の配列に対応す るヌクレオチド配列を含む、ｌ　Ｏ１８ｂｐ断片を作った。

プラスミド発現ベクターＰＫＳＶ−１０を、ＢｇｌＩｌで消化して線状とし、つ いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、１０１８　ｂｐ断片に機能的に結合し、環 状組換えＤＮＡ分子ｐｓ　Ｖ　−ｂｕＴ　Ｆ　ｈを作った。

組換えＤＮＡ分子ｐＳＶ−ブレｈｕＴＦｈ及びｐ　Ｓ　Ｖ　−ｈｕＴＦｂを、内 在する構造遺伝子によりコードされるｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦｈタンパク質 の発現するのに適合した真核性宿主媒体中に導入した。このような媒体を含む宿 主細胞の代表例には、ＣＨＯ細胞がある。

宿主を、組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトし、安定なトランスホーマントを 従来法で選択した０例えば、グラハム（Ｇｒａｈａ＋ｓ）等、ピロロジー（Ｖｉ ｒｏｌ、　）　、５２巻、４５６頁（１９７３年）及びサウザーン（５ｏｕｔｈ ｅｒｎ　）等、ジャーナル・オプ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネ ティクス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　）　１　巻、３２７〜３４１頁（１９８２年）参照、トランスホ ームした宿主細胞を、細胞増殖及びその組換えＤＮＡ発現に適合した条件下で培 養し、発現したタンパク質を、従来法により収穫した。

ｅ、イーストにおけるブレｈｕＴＦｈの発現Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　）において、プレｈｕＴＦｈ遺伝子を発現できる組換えＤＮＡ分子を、 先に述べたように、５　’−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３　’５　’−ＣＧＣＣＣ ＧＧＧ−３　’ の配列をもつオリゴヌクレオチド、アダプター断片を合成し、ついで例１６ａの １１３３ｂｐ断片の末端に、それを結合することに゛より構築した。このように して作ったアダプター化した断片は、Ｃ１ａｌ粘着末端をもつ。

イーストの発現ベクター、ｐＴＤＴｌ　（アメリカン・タイプ・ティシュコレク ション、＃ＡＴＣＣ３１２５５）を、制限エンドヌクレアーゼＣ］ａＩでの消化 により線状化した。上記のＣ１ａｌアダプタ一化１１３３ｂｐ断片及びＣ１ａｌ 消化ベクターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、機能的に結合し、環状の組換え ＤＮＡ分子ｐｙ−プレｈｕＴＦｈを作った。

大腸菌ＲＲＩをプレｈｕＴＦｈでトランスホームし、ブレｈｕＴＦｈ構造遺伝子 を発現するトランスホーマントを、例１６Ｃで述べた方法により同定及び選択を 行った。

ｆ、イーストにおけるｈ　ｕＴＦｈの発現Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ　）において、ｈｕＴＦｈ構造遺伝子を発現できる組換えＤＮＡ分子を、Ｐ Ｙ−プレｈｕＴＦｈのＣ１ａｌによる消化により、第２図の残基１〜１１２５番 の配列に対応するヌクレオチド配列を含む１１５１　ｂｐ断片を作るこ件で構築 した。サイズ分画による単離後、１１５１　ｂｐ断片をＢｂｖＩで消化し、第２ 図の残基１６４〜１１２５番の配列に対応するヌクレオチド配列を含む９７８　 ｂｐ断片を作った。こ０９７８ｂｐ断片は、サイズ分画により単離した。

及び の配列をもつ合成ポリヌクレオチドアダプター断片を作り、先に述べたように、 アニールすることで、Ｃ１ａ＋及びＢｂｖｌ粘着末端をもつＤＮＡアダプターを 作った。まず、このアダプター断片を、９７８　ｂｐ断片に機能的に結合するこ とにより、１０２０　ｂｐ断片とした。つづいて、この１０２０　ｂｐ断片を、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、例１６ｅで述べられているように調製したＣ１ａｌ 消化ｐＴＤＴ１ベクターと結合し、環状組換えＤＮＡ分子ｐＹ−ｈｕＴＦｈを作 った。

組換えＤＮＡ分子ｐｙ−プレｈｕＴＦｈ及びｐＹ−ｈｕＴＦｈを、内在する構造 遺伝子によりコードされるｈｕＴＦｈ又はプレｈｕＴＦｈタンパク質の発現に適 合するイースト宿主媒体中に導入した。このような媒体を含む宿主細胞の代表例 には、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）細胞がある。

宿主細胞を、この組換えＤＮＡ分子でトランスホームし、選択培地で培養して、 従来法により、トランスホームした細胞を単離した。例えば、ハイネン（Ｈｉｎ ｎｅｎ　）等プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＩＪＳＡ、７５巻、１９２９頁（１９７８年）及び、ミャジマ（Ｍｉ ｙａｊｉｍａ　）等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）　４巻、４０７頁（１９８４年）参照。トラン スボームした細胞を、細胞増殖及び組換えＤＮＡ発現に適合する条件下で培養し 、ついでこの発現したタンパク質を従来法で収穫した。

ｇ、Ｍｉ換えｈｕＴＦｈコード配列の発現による可溶性ｈｕＴＦｈの生産 組換えＤＮＡ分子からの可溶性ｈｕＴＦｈの発現は、プレｈｕＴＦｈ及びｈｕＴ Ｆｈに対し、例１６で述べたのと同様に、種々の発現媒体で行なわれた。その例 において、ＥｃｏＲ１粘着末端を存する断片を含む１１３３ｂｐのブレｈｕＴＦ ｈ構造遺伝子の例１６ａでの作成と、つづいて、例１５ｂ−ｆでの操作で、大腸 菌、Ｓ、セレビンアエ（ｃｅｒｅｖｉｓＳａｅ　）及びＣＨＯ細胞の３種の発現 媒体において、プレｈｕＴＦｈ又はｈｕＴＦｈを発現できるベクターを作った。

同様に、ＥｃｏＲＩ粘着末端を有する可溶性ブレｈｕＴＦｈ構造遺伝子を含み、 例１６ａで調製した５ｏｓｂｐの断片を例１５ｂ−ｆで述べた方法に従がって操 作し、これら同発現媒体中可溶性ブレｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈ又はｈｕＴＦｈを発現 できる発現ベクター（すなわち、プレｈｕＴＦｈ−ＴＲ又はｈｕＴＦｈ−ＴＲ） を作った。

１７、ポリペプチドｐ２４−３５及びｐ１５９−１６９による凝集阻害 第７表にそのアミノ酸残基配列を示した例１１で述べたように合成した。

第７表 ペプチド塩　アミノ酸残基配列 Ｐ　２４−３５　）１−ＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴ−０）１ｐｌ　５９−１６９ 　Ｈ−ＩＹＴＬＹＹ誓ＫＳＳＳＳＧＫＫＴＡＫ　−ＯＨａ、各ポリペプチド実験 名は、第１図に含まれているアミノ酸残基配列を表わしている。

それから、ポリペプチドｐ２４−３５及びｐ１５９−１６９について、例１２で 述べられているように、ｈｕＴＦによる凝集開始を競合的に阻害する能力を検定 した。この研究の結果を第１２図に示し、ｐ２４−３５及びｐ１５９−１６９は 、１０μＭ濃度で用いたとき、各々、ｈｕＴＦで開始した凝集を、４５％及び２ ５％阻害できることを示している。この研究において、第１２図で白丸により示 したこれらペプチドに対する阻害バンクグランドは、第４表で示した実験結果よ りも低いことに注意しなければならない、結果として、この研究において、１０ μＭ４度での凝集阻害を少なくとも２０％起こすポリペプチドは、ｈｕＴＦ結合 部位ポリペプチド類似物と考えた。

従って、ポリペプチドｐ２４−３５及びｐ１５９−１６９は本発明のｈｕＴＦｈ ポリペプチド結合部位類似物を示している。また、ポリペプチドｐ２５−４９で 得られた同様の結果を考慮すると、ｐ２４−３５で得られた結果は、ｈｕＴＦｈ −因子■／■ａ結合部位は、これら２つのポリペプチドの共通部分、すなわち、 第１図で示した残基３０〜３５、（−ＶＮＱＶＹＴ−）　の７．／酸残基配列で 作られていることを示していることに注目すべきである。

１８、抗ｈｕＴＦ抗体による凝集阻害の速度論抗ｈｕＴＦ抗体が、ｈ　ｕ　Ｔ　 Ｆの凝集開始を阻害できる時間を測定するため、この阻害の時間経過を、例１０ で述べた阻害検定法を用いて測定した。

例７で述べたように調製した、ＭＡＰＳ単離化ＴＦ８−５Ｇ９モノクローナル抗 体およそｌｎｇを、１００．ｕｊ！ＨＢＳ／ＴＢＳ中、例４で述べたように調製 した再脂質化ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆおよそｌｎｇと混合した。このように形成した種々 の混合物を、３７℃で、約１から６０分の間の種々の時間維持し、抗ｈｕＴＦ抗 体を、ｈｕＴＦと免疫学的に結合させ、免疫反応産物を作った。第１３図で示し た時間に、各混合物について、例２で述べたように、ｈｕＴＦの凝血活性を検定 し、ついで、例１０で述べたように阻害率を示した。

第１３図で、このような速度論的測定の結果は、この検定で用いた抗体及び精製 したｈｕＴＦの濃度で、６５％以上のｈｕＴＦによる凝集開始の阻害が、１０分 以内に起こることを示すことが分る。より高い抗ｈｕＴＦ抗体濃度では、より速 く、完全な阻害が起こると考えられる。

１９、抗ｈｕＴＦ抗体による、ｈｕＴＦによる凝集開始阻害の投与一応答 抗体投与範囲にわたる、ｈｕＴＦ凝集開始を阻害する本発明の抗ｈｕＴＦ抗体の 能力は、次の修正をした例で述べた方法により検定した０例４で調製した再脂質 化ｈｕＴＦ１ｎｇを、０，１ａ＋のＨＢＳ／ＢＳＡ中、例７で述べたように単離 した、種々の量のＴＦ８−５０９モノクローナル抗体と混合した。このように調 製した混合物を維持して免疫反応産物を作り、つづいて例１０で述べたように、 ｈｕＴＦの凝血活性に関する検定を行った。

そのような投与一応答検定の結果を、第１４図に示じ、また、このことはこの研 究で用いたｈｕＴＦｌｉ度に対し、ｍｉ’当り、およそ１〜５ｎｇの抗ｈｕＴＦ での最高価の半分の阻害を示している。

同様の投与一応答実験を、ｈｕＴＦ源として溶解したヒト細胞を用いて行なった 。

ヒトの繊維芽細胞系列ＧＭ１３８１　（ＮＩＧＭＳヒユーマン・ジェネチンク・ ミュータント・セル・レボジトリ−）を、２ｍＭグルタミン、５％ウシ胎児活性 及び抗生物質を補った、ダルベコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＮＹ州、グラン ドアイランド、ギブコラボラトリー）中、３７℃で、７％（ν／ν）二酸化炭素 空気雰囲気下で培養した。０Ｍ１３８１細胞を増殖し、そして収穫し、さらに３ ０Ｘ１０’個の細胞のベレットを遠心で調製し、−７０℃で凍結した。この凍結 ペレフトをＨＮＮバッファ（２５ｍＭヘペス、１４０ｍＭ　ＮａＣＥ、ｐＨ７， ０）中の１５ｍＭベータ、オクチルグルコピラノシド溶液９　ｗ＋１．を加えて 急速に融解し、さらに１０分間３７℃に維持して、細胞を溶解した後、ＨＮ１８ Ｉ１１７！を加えて、細胞溶解物を作った。

例１７で述べなように単離したモノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９を、第１５図 に示した種々の投与に対し、０．０１％ＢＳＡ（シグマ、ＲＩＡ級）で希釈した 。それから各抗体希釈物２５μｌに、先にｔｌｉ製した細胞溶解物２２５μ２を 加え、６０分間３７℃に保って、抗体を細胞溶解物中に存在するｈｕＴＦと免疫 反応させ、免疫反応産物を形成させた。その後、２５ｍＭ　ＣａＣｆ。

５０μＥを、免疫反応産物を含む溶液５０μｌと混合し、ついで、５０μＥのク エン酸化ヒト血漿と混合し、凝集を開始させた。このようにして作った混合物を ３７℃に維持し、血漿の添加と、凝血形成の間の時間を測定した。効果的ｈｕＴ ＦｔＭ度及び阻害率を例１０に述べたように計算した。

ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ源として、ヒ）０Ｍ１３８１細胞溶解物を用いた投与一応答阻害 検定からの結果を、第１５図に示した。これらの結果は、ＴＦ８−５０９抗ｈｕ ＴＦ抗体が、ｌｌｌ１当り、およそ８−１ｏｎＨの抗体濃度でｈｕＴＦのこの細 胞溶解源の半分の阻害を起こしたことを示している。

２０、非ヒト組織因子とＭ　ｏ　Ａ　ｂの交差反応性組織因子を、脳組織（ラッ ト、ラビット、子ウシ、イヌ、羊、ブタ及びヒし）又は、組織培養細胞（アフリ カミドリザル腎臓（ＣＯ３）細胞）から単離した０組織又は細胞を融解し、膜を はぎ、ミンチし、組織１ｇ当り、ｌ　ｍｊＨの冷アセトン中でホモジネートし、 ついで、減圧下、ワフトマン＃１ベーパーで濾過した。

この固体をアセトンに懸濁し、もう５回濾過し、−晩空気乾燥したのち、−３０ ℃で保存した。開始湿重量の１６〜１９％を含むアセトン粉末を細かくしてから 、５　ｍ　ｍｏｌ／ＬＥＤＴを含むＴＢＳ中、５％（に／ν）となるよう懸濁し 、室温で１時間混合した。

１０．０００ｘｇ、２０℃、３０分間の遠心で固体を集め、ついでＴＦ含有膜を １００．ＯＯＯｘｇ、１時間の上清の遠心で集めた。

このベレットを、ＴＢＳに懸濁し、−８０℃に保存した。

動物ＴＦ（ＴＦ活性をもつ粗組織抽出物）による抗体阻害を、次のように測定し た。等容量のＴＦ　（１ｍ／　ｍｊり及びハイブリドーマ上滑（ＴＢＳ／ＢＳＡ での１０倍希釈物）を、３７℃で２時間インキュベートした。残存するＴＦ活性 を、そのインキュベーション混合物１００μｌを、５０μ！のヒト因子■欠損血 ま及び５０μＥの５０ｍＭ　ＣａＣｊ！！に添加することにより測定した。３７ ℃、１分後、相同種の血清の１０倍希釈物５０μＥを因子■源として加え、凝血 形成時間を２度測定した。

２４個のＭｏＡｂのうちの１８個がバブーンｌ１ｉｉＴＦ又は、アフリカ・ミド リザル腎臓細胞抽出物のプロコアゲラント活性を図書した（第８表）。しかし、 ＭｏＡｂのいずれも、ラット、ウサギ、子ウシ、イヌ、羊又はブタのＴＦと、交 差反応を示さなかった。

すなわち、相同的因子■源の存在下、ヒト因子■欠失血漿のりカルシフィケーシ ョン時間促進能を示すＴＦ調製物ではなかった。

抗体のいずれも、正常なヒト血漿での検定による、ウサギＴＦのコアグランド活 性を示さなかった。

第　８　表 ＲＩＡ’　Ｆフト　ウェスタンプロフト　阻害率χ　動物ＭｏＡｂ　アイソタイ プ　（ｃ　ｍ）　プＤ？）　ＲＮ）ｌ　凝血３　■４　の阻ＴＦ８−５Ｃ４１ｇ Ｇ１．　に　６２４２　＋　±　＋　９６　５７ＴＦ８−５Ｇ９　１ｇＧ１．　 に　２８５８７　÷　−÷　９９　８０ＴＦ８−１１Ｄ１２　１ｇＧ１．　に　 ２９４５３　＋　−＋　９９　８２ＴＦ９−ＩＦＩＩｇＧｌ、に２５１３３＋÷ ÷９５８３Ｍ、３ＴＦ９−ＩＤ５　１ｇＧ１．　に　３８７２　÷　＋　＋　９ ５　７６　ヒ、３ＴＦ９−ＩＢ７　１ｇＧ１．　に　２８５８６　＋　÷　÷　 ９７　９０　Ｍ、３７Ｆ９−ＩＢ８　１ｇＧ１．　に　２８５５２　＋　＋　＋ 　９８　８３　？１．３ＴＦ９−ＩＢ９ＩｇＧ１．に２８５２３→十÷９７８４ 月、３ＴＦ９−２Ｃ４ＴｇＧｌ、に　２４４３５　峠　＋　÷　９７　７８　？ １．３７Ｆ９−２Ｆ５　１ｇＧ１．　に　２７４２２　＋　＋　＋　９７　７９ 　Ｌ３ＴＦ９−４０１１１ｇＧ１．に２５９９４＋÷＋９７８１？！、３７Ｆ９ −５Ｃ４１ｇＧ１．に２４０７３＋÷＋９７８３１’１．３ＴＦ９−５Ｂ７　１ ｇＧ１．　に　２５８１９　：　÷　÷　９７　７４　Ｍ、３ＴＦ９−５Ｃ７Ｉ ｇＧ１．に　２４５４３　÷　÷　＋　９６　７２　Ｍ、３τＦ９−６Ｂ４１ｇ Ｇ１．に１７８９４＋＋→９６９８°？１．３丁Ｆ９−６Ｇ４　１ｇＧ１．　に 　２４０６５　÷　÷　＋　９５　７８　？１．３丁Ｆ９−６Ｃ９１ｇＧ１．　 に　８０５４　＋　＋　÷　９５　４７ＴＦ９−７Ｅ１０１ｇＧ１．に８０２５ ÷十＋９７５４丁Ｆ９−８Ｅ３　１ｇＧ１．　に　２９１５２　＋　÷　＋　９ ７　７６　Ｆｌ、３ＴＦ９−９Ｅ１　１ｇＧ１．　に　１８１６９　÷　÷　÷ 　９０　７１　Ｊｌ、３τＦ９−９Ｃ３１ｇＧ１．に３０２２２＋＋＋９７８２ Ｍ、３７Ｆ９−９Ｂ４ＩｇＧ１．に３３７２８＋＋＋９５８２Ｍ、３ＴＦ９−１ ０Ｃ２ＩｇＧ１．　に　２８６９２　＋　＋　＋　９８　７１　Ｍ、３ＴＦ９− １０ＨＩＯＩｇＧ１．　に　２４５８５　＋　÷　＋　０　２０′″　−−ＰＡ ｂｌＯＯＩｇＧ＋、に　１９２９−−　−　０　０”　−−１、　特にことわら ないかぎり、全ての結果は、ハイブリドーマ組織培養・上滑の１０倍希釈物を用 いて得られたものである。毎分当りのカウント数（ｃｐｍ　）で表わされている ラジオイムノアッセイの結果は、ラクトパーオキシダーゼを使ってラベルした１ ２５７　７Ｆを用いている。

２、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）のＴＦを用いて行ったウェスタッフ゛ロント 。

３、　精製したヒトの脳ＴＦによって誘導されるヒト血漿の凝結の阻害。

４、Ｊ８２細胞に対する特異的１ｔ５】−因子■／■ａ結合の阻害。

５、　粗ヒヒ脳抽出物（Ｂ）又は溶解ＣＯ８細胞＜Ｍ）により誘導されるヒト血 漿凝集阻害ａＭｏＡｂが６０％以上の凝血活性を阻害するとき、文字がその種の 場所に入れられている。

種々のヒト細胞及び組織により発現される凝血活性の阻害をＭｏＡｂ　ＴＦ８− ５Ｇ９を用いて詳細に試験した。ＴＦ８−５Ｇ９は、Ｉｇ　Ｇ　濃度≧１μｇ／ ｗｈｌのときの９０％以上、精製再脂質化したヒトＴＦの機能を中和する（第１ ６図）、ヒトの細胞溶解物及び粗組織抽出物の凝血活性を阻害する、このＭｏＡ ｂの能力も示されている（第９表）、１０ＩＪｇ／ｍＡのＩｇＧ濃度でのＴＦ８ −５０９は、粗液及び胎盤のアセトン粉末及び溶解したヒトの繊維芽細胞、膀胱 がん細胞及び内毒素活性化末梢血液単核細胞の凝血活性の８０％以上を定量的に 阻害する。

第９表 モノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９による、種々の細胞及び組織の凝血活性の阻 害 精製ヒトＭｉＴ　Ｆ　１５６９　１５２０　（３％）　２４５　（８４：）相応 抽出物　２０５９　２０５９　（ＯＸ）　４１１　（８０χ）粗胎盤抽出物　１ ２８７　１３４４　（ＯＸ）　１５９　（８８ｍ）ｃＭ１３８１繊維芽細胞（溶 解化）　９９０　９６６　（２２）　１４３　（８６％）ヒト単球（熔解化）　 ２８９３　２７４５　（５Ｘ）　１７６　（９４χ）Ｊ８２膀胱がん細胞（溶解 化＞　８８２　９０２　（０り　９３　（８９χ）ウサギのトロンボプラスチン 　２１０６　２１０８　（ＯＸ）　２１５７　（０χ）１、　精製したヒト脳Ｔ 　Ｆを、テスト前にリピロトビヒクルに再構成した。

２、　右の２つの欄は、指示されている精製１８Ｇで処理した後測定した、ミリ ユニットで表わした残留ＴＦ活性の２回の平均値が示されている。残存するＴＦ 活性の測定前、サンプルを３７℃で２０分間、１０ｐｇ／ｍＲのＩｇＧとインキ ュベートした。

カンコ内の値は、抗体なしの同サンプル活性ユニ７）に対する阻害率が示されて いる。

２１、因子■結合の研究 因子■／■ａｃＤＴＦへの結合は、機能性ＴＦ：■／■ａ凝集促進複合体の集合 に必要とされるので、因子■／■ａのＴＦに対する結合を妨げることによる、第 ８表に示したＭｏＡｂのＴＦ活性中和能がテストされた。

ヒトの組織因子仲介による、因子■の、Ｊ８２の膀胱がんｍ胞表面への結合はよ く調べられている。フェア（Ｆａｉｒ　）等、ジャーナル・オフ・バイオロジカ ル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）、２６２巻、１１６９２ 　（１９８７年）、従って、細胞表面ｈｕＴＦ　：■／■ａ複合体会合に関する ＭｏＡｂの効果は、Ｊ８２細胞を、抗体とブレインキュベートし、さらに、１２ ″Ｉ−因子■／■ａ（７）特異的結合を定量することにより試験した。

Ｊ８２細胞を１２穴培養プレート中、フェア（Ｆａｉｒ　）等によって報告され ているように（上述）、集密化するまで培養し、パンツｙＡ　（１３７ｍＭ　Ｎ ａＣ１’、４ｍＭ　ＫＣ！ｒ、ｌｌｍｍｏｌ　、Ｌ　−クルコース、５ｒｎＭア ジ化ナトリウム、１０ｍＭヘベス、ｐＨ７，４５）で洗浄し、ついで、精製した ＭｏＡｂｌｇＧ又は、ハイプリドーマ培養上清１０倍希釈物を含むパンツｙＡ０ ．７ｍｆとともに、３７℃で２時間インキュベートした。塩化カルシウム及び、 ７２″Ｉ−因子■／■ａを各々、最Ｐ−濃度５ｍＭ及び１ｎＭとなるよう添加し 、さらに３７℃、２時間インキュベートした。

その後、細胞単層を、冷バ７フｙＢ　（１４０ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％ＢＳＡ 、５ｍＭ）リスＨＣＩ　ｐＨ７，４５）で５回洗浄し、１ｗｈｏの０．２Ｍ　Ｎ ａＯＨ，１％ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＥＤ丁Ａ溶液中で溶解し、その溶解物のガンマ 線をカウントした。特異的結合は（非ラベル因子■／■ａを１００倍過剰存在下 、細胞と会合する＋！Ｊ因子■／■ａ）、非特異的結合放射活性を差し引いて測 定した。特異的結合の阻害率は９容のパンファＡと、１容の培養培地で処理した コントロール細胞に対する、ＭｏＡｂで処理したＪ８２細胞という形で測定した 。

因子■／■ａがＴＦに結合したとき、それはうまく取り込まれないが、抗体結合 によるＴＦインターナリゼーシ＝ンの可能性を除くため、Ｊ８２細胞を、５ｍＭ アジ化ナトリウムで代謝的に毒殺した。細胞のアジド処理の有無にかかわらず同 じ結果が得られた。

この研究の結果は、上の第８表に示されている。ＴＦ活性を阻害する全ての２３ 個のＭｏＡｂは、因子■／■ａ結合も阻害した。

予想されるように、ＴＦ活性を阻害しないＭｏＡｂ、ＴＦ９−１０ＨＩＯは、因 子■の結合を阻害しなかった。

２２、Ｊ８２細胞による因子Ｘａ影形成阻害Ｊ８２細胞上でのｈｕＴＦ：■／■ ａ複合体による因子Ｘａ形成速度を、次の修正をした、フェア（Ｆａｉｒ　）等 （ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　）、２６２巻、１１６９２頁（１９８７年））により報告された、多穴 培養プレート検定法を用い２度定量した。細胞を、１２穴プレート中で培養し、 Ｊ８２細胞への因子■／■ａ結合の際に上述したように、検定開始前、種々の濃 度の精製した、ＭｏＡｂのＩｇＧ画分と３７℃で２時間ブレインキュベートした 。単一の１度の因子■／■ａ　（１ｍＭ）を検定で採用した。因子Ｘを最終濃度 ５０μｇ／ｗ＋１となるよう添加した後、５．１０．１５分の間隔で、５０．１ ７１！の上滑を採取し、５５０μｊ！の５０ｍＭ）リス−ＨＣＪ、２２５ｍＭ　 ＮａＣｊ！、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，２）の溶液中に入れた１発色性因 子Ｘａ基質添加後（ＴＸ州、ビューモント、ヘレナラプ社、３．４ｍＭ　Ｓ−２ ２２２５０ｕｊり　、速度論的分析モジュールをつけたベフクマンＤＵ−３０分 光器で４０５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより、因子Ｘの活性を定量し た。

因子■／■ａ非存在下でインキュベートしたＪ８２細胞上清のＳ−２２２２加水 分解によるバンクグランドを各測定値から差引いた。抗体処理の阻害率は抗体と のブレインキュベーションなしの細胞に対して計算した。

ＭｏＡｂ　ＴＦ９−２Ｃ４及びＴＦ９−５Ｂ７によるＪ８２細胞の処理に対する 阻害曲線は、因子Ｘａ形成速度が、因子■結合を阻害したものと同様の抗体濃度 で阻害されることを示している（第１７図）。非阻害的（非中和性）ＭｏＡｂ　 ＴＦ９−１０ＨＩ　ＯはＩｇＧ濃度１０μｇ／ｍＡまで、凝血促進活性、因子〜 １／■ａ結合又は因子Ｘａ生成速度にほとんど影響を与えないし、また、コント ロールＭｏＡｂ　ＰＡｂ　１００は全く効果がない（データ示さず）。

２３、ｈｕＴＦｈポリペプチドの因子■／■ａへの競合的結合による、Ｊ８２細 胞上での因子Ｘ活性化の阻害光分野ではよく知られているように、凝血促進プロ テアーゼカスケードの細胞活性化は、消費性血栓出血症と呼ばれる種々の病気と 関連している。一般に、凝血促進プロテアーゼカスケードは、膜レセプター及び 基本的共因子、組織因子（ＴＦ）に対する因子■／■ａの高い親和性による発見 により、細胞表面で開始する。

ＴＦ及び因子■／■ａの二分子凝血促進複合体（ＴＦ：■／■ａ〕は、最終的に トロンビン形成及びフィブリンの析出につながる限定したタンパク質分解による 因子Ｘ及び■の活性化を起こす、さらに、凝血におけるＴＦの役割、ＴＦによる 凝集プロテアーゼカスケードの開始は、播種住血管内凝固及びトＣンボジエネシ スと関連する。ニーメツ（Ｎｉｅｍｅｔｚ　）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　）　 ４２巻、４７頁（１９７３年）及びベビラクア（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　）等・ ジャーナル・オフ・再りスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、）、１６０巻、６１８頁（１９８４年）、ＴＦは、炎症性仲介物に対する応答 及び細胞性免疫応答で、単球及び内皮細胞の表面で発現する重要なエフェクター 分子である。

本発明のｈｕＴＦｈポリペプチドが、因子■／■ａに結合し、それにより、因子 Ｘを活性化することができる、ＴＦ：■／■ａ複合体の形成を阻害する能力を研 究した。

ＴＢＳ中、１００μＭのｈｕＴＦポリペプチド類似物を含む溶液５０マイクロリ ツトル（μｍ）を、９６穴平底ポリスチレン検定プレートの各ウェル９６個に入 れ、ついでその各ウェルに、例３で述べたように単離した、ＴＢＳ中１ｎＭの濃 度に調整した因子■／■ａを含む溶液２５μｔを加え、さらに、ＴＢＳ中２０ｍ Ｍの塩化カルシウム２５μｌを加え、その混合物を３０分間室温に維持した。

ヒト膀胱がん細胞Ｊ８２細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンラ ン（ＡＴＣＣＨＴＢＩ　；ＭＤ州、ロックビル）から入手し、参考としてここに 組込まれているフェア（Ｆａｉｒ　）等の方法（ジャーナル・オフ・バイオロジ カル・ケミストリー）、２６２巻、１１６９２−１１６９８頁（１９８７年）） に従って培養した。

５０μｆｆ（７）ＴＢＳに５Ｘ１０’個のＪ８２細胞を悲濁し、上述の維持を行 った後、ポリスチレン検定プレートの各ウェルに入れた。その後、ただちに、フ ェア（Ｆａｉｒ　）等の報告のように（上述）単離した、ＴＢＳ中１１００ｎの 濃度の因子Ｘ２５μｋ及び、Ｘａ発色基質Ｓ−２２２２（１■／　＋ｍｉ＋ＴＢ Ｓ）５０．ｃ＋ｊ！を加え混合し、その混合物を２分間室温に維持して、発色反 応産物を含む？８液とした。

生成した発色産物量を、Ｖ−ｍａｘ９６穴スペクトロホトメータ（カリホルニア 、マウンテン・ビュー、モレキュラー・デバイス社）を用い、４０５ナノメータ ー（ｎｍ）での光学密度（０，Ｄ、）を測定して定量した。ポリペプチドの代り にＴＢＳを用いるか、又は、因子■無添加のコントロールも測定し最高及び最低 ＯＤ値を決定した。これら阻害の測定結果を第１０表に示す。

第１０表 ｈｕＴＦポ・リペプチドを用いたＪ８２細胞に関するＸ活性化の図書ｈｕＴＦポ リペプチド　光学密度１ ＰＢＳ　Ｏ，９６０土０．０８３ 因子■／■ａなし　０．　ＯＯＳ±０．００１ｐｌ−１８１，００７ｉ０．０８ ７ ｐｌ−３０１，０９８±０．０２８ ｐＨ−２８０，６８７＝０．０７１ ｐ２４　３５　０．４７７＝：０．０１７ｐ２６−４９　０．４３７＝０．０２ ０ｐ４０−７１　０．８１４±０．０５３ｐ７２−１０４　０．７８１：：０． ０４７ｐ９４−１２３　０．８１８＝０．０５５ｐ１２１−１５５　０．８８９ ＝！：０．０６７ｐ１４４−１５９　０．５０７＝＝０．０５３ｐ１４６−１６ ７　０．００４土０．００１ｐ１５７−１６９　０．３８９±０．０３５ｐ１６ １−１９０　０．６００±０．０２３ｐ１９０−２０９　０．６２５：０．０３ １ｐ２０４−２２６　０．７１５：０．０４２ｐ２４４−２６３　０．６１９： ０．０４７１、　もし、光学濃度（０，Ｄ、）が約０．５００以下なら、因子Ｘ の活性化の阻害は有意であると考えた。

本研究の結果は、ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆ　ｈポリペプチドル２４−３５、ｐ２６−４９ 、ｐ１４４−１５９、ｐ１４６−１６７及びｐ１５７−１６９は、因子■／■ａ に結合し、因子Ｘを活性化できる、１Ｆ：■／■ａ複合体の形成を阻害すること を示している。これらの結果は、本発明のｈｕＴＦ結合部位ポリペプチド類似物 が凝集を阻害するのに用いることができることを示している。

２４、抗ｈｕＴＦｈＭｏＡｂによる凝集の生体内での阻害しばしば、グラム陰性 細菌による腐敗症は、最終的に死に至らしめるショック状態を起こす、このヘモ スタチスシステムの乱れは、このショック状態の展開と密接に関係している。テ ィラー（Ｔａｙｌｏｒ　）等（ジャーナル・オプ・クリニカル・インベスチゲー ション（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）　７９巻、９１８〜８２５頁（ １９８７年））は、外的に加えられた活性化した、タンパク質Ｃ１天然の抗凝血 酵素、は、凝集応答及びヒしにおけるＬＤ、。。

の大腸菌濃度の致命的効果を妨害する。

本発明の抗凝集Ｍ　ｏ　Ａｂの生体内における凝集阻害能力を、ティラー（Ｔａ ｙｌｏｒ　）等（上述）によって報じられた腐敗ショックのヒトモデルを用いて 試験してみた０重さを計った７〜８のヒトを実験前−晩絶食し、実験の胡、ケタ ラン（筋肉注射、１４■／ｋｇ）で免疫化した。ついで、ベンドパルビタール酸 ナトリウムを、経皮カテーテルを通し、頭の静脈に投与し、軽いレベルの外科的 麻酔状態に維持した（約４５分毎２ｒｎｉ：／ｋｇ）。大腿部静脈を焦面的に露 出させ、血液採取の為１方の後足にカニュールを差込んだ。

経皮カテーテルは大腸菌及び例２０で示した、ＭｏＡｂＴＦ９−５゛Ｂ７を含む 試剤を与え、ヒトのＴＦと交差反応させるのに用いた。３０分間の平衡化時間の 後、この動物に約１０分間にわたって、ＭｏＡｂ　ＴＦ９−５Ｂ７　５００μｇ ／ｋｇ又は１５μｇ／眩（例７で述べたように単離し、ついで無菌生理食塩水に 透析し、０．５８μｇ／ｍｅの濃度としたもの）又は、無関係のＭｏＡｂ５００ μｇ／眩を与えた。

ＭｏＡｂ投与及び３０分間の平衡化の後、各動物は、ＬＤ、、。

の大ｍ菌の投与を受けた（約１９１６個、投与後約８〜１６時間で敗血性ショッ クのため死をもたらす量である）、大腸菌は２時間に渡り注入により投与した。

この研究結果を第１１表に示す。

第１１表 ヒトの敗血性ショックによる致死の生体内における阻止投　与　大腸菌 グループ　ＭｏＡｂ　μｇ／睦　凝血１　注　入　死ｌ　、　コントＵ−Ｉ　Ｔ Ｆ９−５Ｂ７　５００　Ｎｏｒｓ＋ａｌ　Ｎｏ　Ｎ。

■、　コン（ローＫ　）ＩＢ”　５００　Ｎｏｒｍａｌ　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ■、実 験　ＴＦ９−５Ｂ７　５００　Ｎｏｒｍａｌ　Ｙｅｓ　Ｎ。

ＴＦ９−５Ｂ７　１５０　Ｎｏｒｍａｌ　Ｙｅｓ　Ｎ。

１、血圧、凝集活性化及びフィブリン分解産物を含む種々のへモスタチスパラメ ータは、ＭｏＡｂ投与後、大腸菌注入前に測定した。

２、ＨＢは、ＴＦ９−５Ｂ７と同じ類及び亜類のＭｏＡｂであるが、無関係の抗 原と免疫反応を起こす。

第１１表にみられるとおり、ＭｏＡｂＴＦ９−５Ｂ７を受けたヒトはＬＤ、。。

の大腸菌の投与に対しても生存しつづけた。　ｒＩｏＡｂ１５０μｇ／ｋｇ及び ５００μｇ／ｋｇの両投与で保護された。さらに、コアグロパシーと関係する、 顕著な低血圧、凝集カスケード活性化およびフィブリンの分解は、ＭｏＡｂ　Ｔ Ｆ９−５Ｂ７を受けた動物で著しく緩和された。

２５、ヘモグロビン・アルファ鎖としての、５８ｋＤａ　ｈ　ｕＴＦヘテロダイ マー軽鎖の特徴 免疫親和性単離したＴＦをさらにウェスタン・プロント分析で特性を調べ、５８ ｋＤ　ｈｕＴＦヘテロダイマーの成分、すなわち、例４で述べた４　７ｋＤａ及 び１２．５ｋＤａタンパク質を同定した。

例６ｃで述べたように行った、ウェスタンプロット分析を、電気泳駐するサンプ ルとして、例９で述べたように調製した、免疫親和性により単離したｈｕＴＦ、 精製したヒトヘモグロビン、又は、分子量標準を用いて行った。指示されている ところではジスルフィド結合の還元のため、サンプルバンファの中に５０ｍＭジ チオスレイトールを含めた。ウェスタンプロットを、非免疫化ウサギＩｇＧ、従 来の方法で調製したウサギ抗ｈｕＴＦ　ＩｇＧ又は、ダコ（Ｄａｃｏ）（カリホ ルニア、サンタバーバラ）社から入手したウサギ抗ヒトヘモグロビンＩｇＧを用 いて、示されているように免疫反応した。最初の２つの１．Ｇ調製物は、例７で 述べたようにＳ離したＭＡＰＳ−ｎである。

上で述べたウェスタンプロフト分析の結果は、第１８図に示した。抗ｈｕＴＦ　 ＩｇＧは、還元型ｈｕＴＦの４７ｋＤａのバンドとのみ免疫反応を起こし、１２ ．５ｋＤａのバンドとは反応しなかったが（パネルＡ、レーン３）、一方、同１ ｇＧは、非還元型ｈｕＴＦ（Ｂ５８　ｋＤａ及び４７ｋＤａの両バンドと免疫反 応を起こした（パネルＢ２レーン４）、これらの結果は、５８ｋＤａヘテロダイ マーの４７ｋＤａ成分としてのｈ　ｕ　Ｔ　Ｆの同定と一致している。抗ヘモグ ロビンＩｇＧは、非還元型ｈｕＴＦサンプル中の５８ｋＤａバンドとのみ免疫反 応を起こし、４７ｋＤａのモノマーとは反応しなかった（パネルＢ２レーン４） 、しかし、抗ヘモグｏビア１ｇＧは、還元型のｈｕＴＦサンプル中の１２．５ｋ Ｄａバンドと免疫反応しくパネルＢ、レーン３）また、１２．５ｋＤａ（７）精 製したヒトヘモグロビン・タンパク質と免疫反応した（パネルＢ２レーン２）、 非免疫ウサギＩｇＧとの反応はなかった。

上記の結果は、非還元型ｈ　ｕ　Ｔ　Ｆの５８ｋＤａの分子は、ジスルフィド結 合でヘモグロビンと結合した４７ｋＤａｈｕＴＦからなるという結論を支持して いる。

従って、現在、例４で述べられている５８ｋＤａヘテロダイマーの１２．５ｋＤ ａ軽鎖成分は、ヘモグロビンのアルファ鎖であり、４７ｋＤａｈｕＴＦタンパク 質との会合は、ｈｕＴＦ単離操作のアーチファクトであると考えられている。

例１〜２５の結果のまとめと討論 ２つの異なる細胞融合体由来の、ヒト脳ＴＦに対する、２４種のＭｏＡｂライブ ラリーについて報じられている。各ＭｏＡｂの免疫特異性は、ドツトプロット、 ウェスタンプロット及びラジオイムノアンセイにより特徴づけられた。はとんど のＭｏＡｂは、全ての３条件下、ヒトの本来のＴＦ及び変性ＴＦと反応した。

ＭｏＡｂの１つ、ＴＦ８−５Ｇ９は、ＴＦタンパク質のルーチンな精製にうまく 使用することができる。それは組織抽出物由来のＴＦ活性を吸着し、ミリグラム 量の精製ヒ）ＴＦを一定して与える。

ＭｏＡｂの１つ以外の全ては、精製したヒト脳ＴＦの機能活性を強く中和する。

いくつかのＭｏＡｂは、ヒト及びサルのＴＦと交差反応をすることが分っている が、相同的因子■の存在下、ラット、ウサギ、子ウシ、イヌ、羊、又はブタのト ロンボプラスチンにより開始した因子■欠損ヒト血漿の凝集を、どの抗体も阻害 しなかった。さらに、ウサギ脳トロンボプラスチンによる正常なヒト血漿の凝集 開始は、どの抗体によっても阻害を受けず、このことは、ヒ）ＴＦ凝血活性の阻 害は、因子■／■ａを含む、可溶性血５１凝血タンパク質への抗体の妨害による ものではないという結論を支持する。

抗ＴＦによるＴＦ凝血活性の阻害に対する最も明解な原因は、因子■／■ａ結合 のブロックである。予想されるとおり、全部で２３個の抗凝血（中和性）ＭｏＡ ｂは、ＴＦの基本的レセプター機能と一致して、Ｊ８２細胞への因子■／■ａの 特異的結合を妨ぐ。さらに、このことは、因子■結合及び、因子Ｘａ形成速度の 阻害のハーフ・マキシマルが同じＩ　ｇ　Ｇ　ＴＦ４度のときに起こる、選択し た精製Ｍ　ｏ　Ａｂの投与滴定においても実証される。

ヒトＴＦに対するＭｏＡｂは、最近、カーマン（Ｃａｒｓｏｎ　）等（プラツト （Ｂｌｏｏｃｌ　）、７０巻、４９０頁（１９８７年））により、これを直接試 験したのではないが、因子■／■ａ結合の妨害によることは明白に、ＴＦ活性を 阻害するものであると報じられた。２４個のここで述べられているＭｏＡｂのう ちの２３個が、ＴＦ活性を強く中和するという知見は注目に値する０種のヒト凝 血タンパク質に対するＭｏＡｂを用いた当出願者の研究室で行った実験は、少数 の割合のものが機能活性を中和するというものである。基本的ＴＦとの交差反応 性が含む、反応性が各々異なることから、ハイプリドーマ全てが兄弟クローンで あるとは思えない。

さらに、進行中のエピトープマンピング研究は、この種のＭｏＡｂに少なくとも ３つの別々の非競合抗体結合部位が確認されることを示している。それゆえ、Ｔ Ｆに対するＭｏＡｂを中和する大部分のものは、機能にも関係するわずかな免疫 的に優勢なエピトープによるものでもないらしい；事実、ホブ（Ｂｏｐｐ　）等 により（モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏ］、）　２０巻 、４８３頁（１９８３年））ＴＦのアミノ酸配列は、多（の抗原活定基を含んで いることが報告されている。

小さいサイズのＴＦは、なぜ、そんなに多くの抗ＴＦＭｏＡｂが因子■／■ａ結 合をブロックするのかを部分的に説明している。

ＴＦは、ｃＤＮＡクローニングにより、グルコシル化を除いて、２５ｋＤａの細 胞外ドメインをもつことが予想されている。それゆえ抗体及び因子■／■ａ分子 は、より小さいＴＦの細胞外ドメインへの結合に立体障害を示しことになる。こ の立体障害仮説は、ＴＦ上の炭化水素鎖がおそらく機能には必要ないことから（ ナカムラ（ＮａｋａＩＩｌｕｒａ　）　、）ロンボヘモスタチス（Ｔｒｏｍ、　 Ｈｅｍｏｓｔ、　）５８巻、１３５頁（１９８７年））、コンカナバリーノＡは ＴＦ活性を阻害する（ビトリツク（Ｐｉｔｌｉｃｋ　）ジャーナル・オフ・クリ ニカル・インベスチゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）　５５ 巻、１７５頁（１９７５年））という観察と一致する。

それは、種々の細胞及びｕｆｆｌにより発現した因子■依存凝血活性は、同様の 機能をもつ、１つ以上の分子種に寄因するということに、いくらか関連している 。しかし、ＭｏＡｂ　ＴＦ８−５０９は粗液及び胎盤抽出物及び溶解した繊維芽 細胞、膀胱がん細胞及び末梢単核ｍ胞の凝血活性を定量的に阻害する。完全では ないが、これらの結果は、現にＴＦに寄因する細胞性凝血活性は、同一ではない ときも抗原的に関連しているという結論を支持している。

このことは、ＴＦに対する単一の遺伝子がおそらく存在しているという知見と一 致している。

最近、敗血性ショックの致死効果は、凝血プロテアーゼカスケードにおいて、中 間段階での役割を果している抗凝血タンパク質、活性化したタンパク質Ｃを注入 することにより、ヒヒにおいて妨ぐことができることが示されている０本研究は 、ＴＦ活性を阻害するＭｏＡｂは１．凝血プロテアーゼカスケードの開始のブロ ックにより、それらが、血管内凝血の病理学的活性化と通常関連している、血漿 凝血因子の消費を妨ぐので、生体内で、非常に特異性の高い抗凝血側であること を示している。

例４で述べた５８ｋＤａ型のｈｕＴＦは４７ｋＤａのＴＦタンパク質と、現在で は免疫化学的にまた部分的アミノ酸配列により、ヘモグロビンのアルファ鎖と同 定されている、およそ１２．５ｋＤａのポリペプチドの、ジスルフィド結合で結 合しているヘテロダイマーであることが示されている。５８ｋＤａのヘテロダイ マーが、単離の途中で形成されているらしいので、５８ｋＤａのバンドは、天然 の細胞性ＴＦのヘテロダイマー型であるという以前の推察は誤りであるだろう。

ヘモグロビンのアルファ鎖は、１つのシスティンをもち、またＴＦは、ｃＤＮＡ から、その細胞質ドメインに１つのシスティンを有することが予想される。また ＴＦは、細胞外ドメインには４個のシスティンをもつが、ＴＦ機能が還元により 失なわれることから、少なくとも２つが鎖内ジスルフィド結合に使われているは ずである。ＴＦの細胞質ドメイン中の１つのシスティンは、はとんどの細胞質ゾ ルタンパク質中のシスティンのように、還元型で維持されているだろう、この（ ＴＦの他のシスティンは、ありそうもない）システィンは、細胞溶解後、混合ジ スルフィド形成のため容易にアクセスでき、そして、単離操作間での酸化で、Ｔ Ｆの細胞質及びヘモグロビンのシスティン間でジスルフィド結合が形成すると提 唱される。この結論は、ヘテロダイマー形成は、明らかに時間依存性があり、脳 アセトン粉末由来のＴＦの界面活性剤抽出と、免疫親和性マトリックスへの結合 との間の時間を小さくすることが、得られるヘテロダイマーＴＦ量を減少させる 観察を支持する。推定される９　６ｋＤａのＴＦダイマーも、単離の際同様のメ カニズムで形成するであろう。

抗ヘモグロビン抗体カラムは、３つの５８ｋＤａのヘテロダイマーを特異的に結 合したが、免疫親和性で精製したＴＦ調製物中に観察できる高分子量種全てを定 量的に除くことはなかった。

４７ｋＤａ以上の分子量をもつ他の痕跡量のマイナーバンドは、抗ＴＦ抗体との 反応で観察された。５８ｋＤａバンドの一部を含む、これらマイナーな分子種は 、ＴＦと他の未同定タンパク質問で形成された、混合ジスルフィド結合物を示し ている。

特別の態様及び例を含む先の明細は、本発明の説明を意図したものであり、これ を限定するものではない、多くの他の変化や、修正が、本発明の精神や範囲を逸 脱することなく行うことができる。

ＭＥ　ＴＰＡＷＰＲＶＰＲＰ　ＥＴＡＶＡＲＴＬＬＬ　ＧＷＦＡＱＶＡＧＡｌｏ 　２０　３０　４０ ＳＧＴＴＮＴＶＡＡＹ　ＮＬＴＷ’ｌ’Ｃ３ＴＮＦＫ　Ｔ工ＬＥＷＥＰＫＰＶ　 ＮＱＶＹＴＶＱ工５ＴＫＳＧＤｂ”ＫＳＫＣＦ　ＹＴＴＤＴＥＣＤＬＴ　ＤＥ工 ＶＫＤＶＫＱＴ　ＹＬＡＲＶＦＳＹＰＡ９０　ユＤｏ　ユ１０　１２０ Ｇｋ”ＶＥＳＴＧＳＡＧ　ＥＰＬＹＥＮＳＰＥＦ　ＴＰＹＬＥＴＮＬＧＱ　ＰＴ 工ＱＳＦＥＱＶＧＳＳＳＧＫＫＴＡＫＴ　ＮＴＮＥＦＬＩＤＶＤ　ＫＧＥＮＹＣ ＦＳＶＱ　ＡＶＩＰＳＲＴＶＮＲＫＳＴＤＳＰＶＥＣＭ　ＧＱＥＸＧＥＦＲＥ工 ＦＹ工ＩＧＡ￥ＶＦＶ　ＶエエＬＶＩ工ＬＡ工ＳＬＦＪＣＲＫＡＧＶ　ＧＱＳＷ ＸＥＮＳＰＬ　ＮＶＳ浄書（内容に変更なし） 凝結時間（ｓｅｃｏｎｄｓ） ＦＩＧ、　６ 浄書（内容に変更なし） コ］ ％阻害率　ψ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ♂ 浄、＠（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１６ 浄書（内容に変更なし） ％阻害率 平成　年　月　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１００９９８３、補正をする者 事件との関係　出願人 住　所　東京都千代田区丸の内３丁目３番１号電話（代）　２１１−８７４１ 乳補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告 ｌｍｙｊｗｌｌｌｌｌｌＪＩ　Ａｌｌ１１”４６１４Ｍ　ｈａ、ＰＣτ／ニミミ ε／ＣＱ；Ｓε

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトの組織因子重鎖タンパク質をコードする構造遺伝子を限定する配列を 含む、わずか約１２，０００ヌクレオチド塩基対を含むＤＮＡ断片。
2. （２）上記構造遺伝子が、第１図の約１番から約２６３番の残基で表わされるア ミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする、請求の範囲（１）記載のＤＮ Ａ断片。
3. （３）上記構造遺伝子が、第２図の、約１３０番から約９１８番の塩基で表わさ れるヌクレオチド塩基配列を有する、請求の範囲（２）記載のＤＮＡ断片。
4. （４）上記構造遺伝子が、第１図の約１番から約２１９番の残基で表わされるア ミノ酸残基配列を有する可溶性ヒト組織因子重鎖タンパク質をコードする、請求 の範囲（１）記載のＤＮＡ断片。
5. （５）上記構造遺伝子が、第２図の、約１３０番から約７８６番の塩基で表わさ れるヌクレオチド塩基配列を有する、請求の範囲（４）記載のＤＮＡ断片。
6. （６）上記第１の配列の５′末端に連続し、かつ上記タンパク質のアミノ末端に 結合した、アミノ酸残基リーダ配列をコードする第２の配列も含み、かつ該第１ 及び第２のＤＮＡ配列がヒト組織因子重鎖前駆体タンパク質をコードする混成構 造遺伝子を定義する、請求の範囲（１）記載のＤＮＡ断片。
7. （７）上記混成構造遺伝子が、第１図の約１番から約２６３番の残基で表わされ るアミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする、請求の範囲（６）記載の ＤＮＡ断片。
8. （８）上記混成構造遺伝子が、第２図の約３４番から約９１８番の塩基で表わさ れるヌクレオチド塩基配列を有する、請求の範囲（７）記載のＤＮＡ断片。
9. （９）上記混成構造遺伝子が、第１図の約−３２番から約２１９番の残基で表わ されるアミノ酸残基配列を有する、可溶性ヒト組織因子重領タンパク質前駆体を コードする、請求の範囲（６）記載のＤＮＡ断片。
10. （１０）上記混成構造遺伝子が、第２図の約３４番から約７８６番の塩基で表わ されるヌクレオチド塩基前列を有する、請求の範囲（９）記載のＤＮＡ断片。
11. （１１）ヒト組織因子重鎖タンパク質をコードする構造遺伝子を定義する第１の ＤＮＡ断片に機能的に結合したベクターを含む組換えＤＮＡ分子。
12. （１２）上記構造遺伝子が、第１図の約１番から約２６３番の残基で表わされる アミノ酸残基配列を有するタンパク質をコードする、請求の範囲（１１）記載の 組換えＤＮＡ分子。
13. （１３）上記構造遺伝子が、第２図の約１３０番から約９１８番の塩基で表わさ れるヌクレオチド塩基配列を有する、請求の範囲（１１）記載の組換えＤＮＡ分 子。
14. （１４）さらに、上記第１の断片の５′末端に連続し、かつ上記タンパク質に結 合した、アミノ酸残基リーダー配列をコードし、かつ該第１及び第２のＤＮＡ断 片が、上記タンパク質の前駆体をコードする混成構造遺伝子を定義する、請求の 範囲（１１）記載の組換えＤＮＡ分子。
15. （１５）上記混成構造遺伝子が、第１図の約−３２番から約２６３番の残基で表 わされるアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有する、上記タンパク 質の前駆体をコードする、請求の範囲（１１）記載の組換えＤＮＡ分子。
16. （１６）上記混成構造遺伝子が、第２図の約３４番から約９１８番の塩基で表わ されるヌクレオチド塩基配列に対応するヌクレオチド塩基配列を有する、請求の 範囲（１５）記載の組換えＤＮＡ分子。
17. （１７）上記ベクターが上記第１及び第２のＤＮＡ断片の複製を指揮しうる、請 求の範囲（１１）記載の組換えＤＮＡ分子。
18. （１８）上記ベクターが、宿主細胞中、上記タンパク質を発現しうる、請求の範 囲（１１）記載の組換えＤＮＡ分子。
19. （１９）上記ベクターが、宿主細胞中、上記前駆体タンパク質を発現しうる、請 求の範囲（１４）記載の組換えＤＮＡ分子。
20. （２０）上記ベクターが、ｐＫＳＶ−１０であり、かつ、上記混成構造遺伝子が 、可溶型の上記前駆体タンパク質をコードし、かつ、第２図の３４番から７８６ 番の塩基で表わされるヌクレオチド配列を有する、請求の範囲（１９）記載の組 換えＤＮＡ分子。
21. （２１）わずか約５０アミノ酸残基を含み、かつ、−ＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴ− ， −ＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴ− からなる群から選ばれた式で表わされる配列に対応するアミノ酸残基を含む、ヒ ト組織因子結合部位ペプチド類似物。
22. （２２）上記ポリペプチドが、式： Ｈ−ＶＮＱＶＹＴＶＱＩＳＴ−ＯＨ で表わされる、請求の範囲（２１）記載のポリペプチド。
23. （２３）上記ポリペプチドが、式： Ｈ−ＬＹＹＷＫＳＳＳＳＧＫＫＴ−ＯＨで表わされる、請求の範囲（２１）記載 のポリペプチド。
24. （２４） からなる群から選ばれた式で表わされるヒト組織因子結合部位ポリペプチド類似 物。
25. （２５） からなる群から選ばれた式で表わされるヒト組織因子結合部位ポリペプチド類似 物。
26. （２６）ａ）ヒト組織因子重鎖タンパク質と免疫反応し、ｂ） からなる群から選ばれた式で表わされるポリペプチドと免疫反応し、かつ ｃ）第１図の第２０４番から第２２６番の部位で示される式で表わされるポリペ プチドと実質的に免疫反応しない、抗体分子を含む、抗体組成物。
27. （２７）上記抗体がラベルに結合している、請求の範囲（２６）記載の組成物。
28. （２８）上記抗体が、生理学的に許容しうる希釈剤中に存在する、請求の範囲（ ２６）記載の抗体組成物。
29. （２９）ヒト組織因子重鎖タンパク質及び第１図の２６番から４９番の残基で示 される式で表わされるポリペプチドと免疫反応する抗体分子を産生する、ＴＦ８ −５Ｇ９と命名されたハイブリドーマ。
30. （３０）請求の範囲（２９）記載のハイブリドーマにより産生される抗体分子を 含むモノクローナル抗体組成物。
31. （３１）ヒト組織因子重鎖タンパク質及び、第１図の第２６番から第４９番の残 基で示される式で表わされるポリペプチドと免疫反応する抗体分子を産生する、 ＴＦ９−１０Ｈ１０と命名された、ハイブリドーマ。
32. （３２）請求の範囲（３１）記載のハイブリドーマにより産生される抗体分子を 含むモノクローナル抗体組成物。
33. （３３）ヒト組織因子重鎖及び、第１図の第１４６番から第１６７番で示される 式で表わされるポリペプチドと免疫反応する抗体分子を産生する、ＴＦ９−６Ｂ ４と命名した、ハイブリドーマ。
34. （３４）請求の範囲（３３）記載のハイブリドーマにより産生される抗体分子を 含むモノクローナル抗体組成物。
35. （３５）ａ）身体サンプルを、ヒト組織因子重鎖タンパク質と混合し、免疫反応 混合物を作る； ｂ）この混合物を、上記抗体がサンプル中に存在するヒト組織因子と免疫反応し 、免疫反応産物を形成するのに十分な時間維持する、そして、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定する、以上、ａ）〜ｃ） のステップを含む、体液サンプル中のヒト組織因子重鎖タンパク質の存在を検定 する方法。
36. （３６）ａ）生理学的に許容しうる希釈剤及び、血栓中に存在するヒト組織因子 と効率よく免疫反応する、生体内指示手段と結合した、ハイブリドーマＴＦ９− １０Ｈ１０によって産生される、ある量の抗体分子を含むモノクローナル抗体組 成物を被検者に静脈投与する； ｂ）上記投与を受けた被検者を、上記抗体分子が、血栓の一部として生体内に存 在する組織因子と免疫反応し、免疫反応産物を形成するのに十分な、予め決めら れた時間維持する；そして、 ｃ）ステップｂ）で生成した免疫反応産物の存在を検定する、以上、ａ）〜ｃ） のステップを含む生体内の血栓を検出する方法。
37. （３７）存在するヒト組織因子と効率よく結合する、ＴＦ８−５Ｇ９及びＴＦ９ −６Ｂ４からなる群から選らんだハイブリドーマによって産生される、ある量の 抗体分子を含有する生理学的に許容される希釈剤を含む、モノクローナル抗体組 成物を、被検体に静脈投与することを含む、生体内におけるヒト組織因子の凝血 因子ＶＩＩ／ＶＩＩａへの結合能を中和する方法。
38. （３８）組成物中、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａと効率的に結合する量の、からなる群 から選ばれたポリペプチドを、含有する生理学的に許容された希釈剤を含むポリ ペプチド組成物を被検者に静脈投与することを含む、生体内におけるヒト組織因 子の凝血因子ＶＩＩ／ＶＩＩａへの結合を阻害する方法。
39. （３９）ａ）請求の範囲（２２）記載の抗体組成物を含有するパッケージを含む サンプル中に存在するヒト組織因子重鎖タンパク質の存在を検定するための、キ ットの形をした診断システム。
40. （４０）上記モノクローナル抗体分子を含む上記抗体組成物が、ａ）ＴＦ８−５ Ｇ９、 ｂ）ＴＦ９−６Ｂ４、 ｃ）ＴＦ９−１０Ｈ１０ からなる群から選ばれたハイブリドーマにより産生される、請求の範囲（３９） 記載の診断システム。
41. （４１）ａ）サンプルを、固体マトリックスに固定した、請求の範囲（１５）記 載のポリペプチドを含む固体サポートと混合し、結合反応混合物とする、 ｂ）上記結合反応混合物を、上記凝血因子が上記ポリペプチドと結合し、固相複 合体及び上清を形成するのに十分な時間維持する、 ｃ）上記複合体から上記上清を分離する、及びｄ）ステップｃ）の分離した複合 体から、上記凝血因子を回収する、 以上、ａ）〜ｄ）のステップを含む、サンプルから血液凝固因子ＶＩＩ／ＶＩＩ ａを単離する方法。
42. （４２）実質的に、ヒト組織因子軽鎖タンパク質を含まない生理学的活性のある ヒト組織因子重鎖タンパク質の水溶液を含む組成物。
43. （４３）上記生物学的活性のあるヒト組織因子重鎖タンパク質を、リン脂質中に 分散させた、請求の範囲（４２）記載の組成物。
44. （４４）上記溶液が、非イオン性界面活性剤を含む、請求の範囲（４２）記載の 組成物。
45. （４５）上記タンパク質が可溶性であり、かつ、第１図の第１番から第２１９番 の部位で表わされるアミノ酸残基配列を有する、請求の範囲（４２）記載の組成 物。
46. （４６）ａ）少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の、実質的にヒト組織因 子軽鎖タンパク質を含まない、生物学的活性のあるヒト組織因子重鎖タンパク質 の水溶液を含有する組成物を含むパッケージ、 を含む血管システム液体サンプル中での凝固能を検定するキットの形をした診断 システム。
47. （４７）上記重鎖タンパク質がリン脂質中に分散している、請求の範囲（４６） 記載の診断システム。
48. （４８）上記タンパク質が可溶性であり、かつ、第１図の第１番から第２１９番 の部位で表わされるアミノ酸残基配列を有する、請求の範囲（４６）記載の診断 システム。
49. （４９）ａ）ヒト組織因子重鎖タンパク質をコードする構造遺伝子を定義する第 １のＤＮＡ断片及び、第１のＤＮＡ断片と連続しており、かつ上記タンパク質に 結合する、アミノ酸残基リーダー配列をコードする第２のＤＮＡ断片で、該第１ 及び第２のＤＮＡ断片合せて上記タンパク質の前駆体をコードする混成構造遺伝 子を定しているＤＮＡ断片と機能的に結合する、ホ乳類細胞に適合する発現ベク ターを含む組換えＤＮＡ分子てトランスホームしたホ乳類細胞の栄養培地での培 養を開始する； ｂ）上記培養物を上記細胞が上記組換えＤＮＡ分子由来のタンパク質を発現し、 かつ、上記成熟タンパク質を形成するのに十分な時間、維持する、そして ｃ）上記培養物から、上記成熟タンパク質を回収する、以上、ａ）〜ｃ）のステ ップを含む、成熟ヒト組織因子重鎮タンパク質の陶製方法。
50. （５０）上記混成構造遺伝子が、第２図の第３４番から第７８６番の塩基で表わ されるヌクレオチド塩基配列を有する、請求の範囲（４９）記載の方法。
51. （５１）請求の範囲（４９）記載の方法により産生した、成熟ヒト組織因子重鎖 タンパク質を基本的に含む組成物。
52. （５２）請求の範囲（５０）記載の方法により産生した成熟ヒト組織因子重鎖タ ンパク質を基本的に含む組成物。
53. （５３）ハイブリドーマＴＦ８−５Ｇ９により産生される抗体分子を、投与時間 内に存在するヒト組織因子と効率よく結合できる量含有する、生理学的に許容さ れた希釈剤を含む、モノクローナル抗体組成物を、被検者に静脈投与することを 含む、ヒト組織因子の、凝血開始能を中和する方法。
54. （５４）ヒト組織因子重鎖タンパク質及び、第１図の第２６番から第４９番の残 基で示される式で表わされるポリペプチドと免疫反応する抗体分子を産生する、 ＴＦ９−５Ｂ７と命名されたハイブリドーマ。
55. （５５）請求の範囲（５４）記載のハイブリドーマにより産生される抗体分子を 含むモノクローナル抗体組成物。
56. （５６）ハイブリドーマＴＦ９−５Ｂ７により産生される抗体分子を含有する生 理学的に許容された希釈剤を含む治療に効果的な量のモノクローナル抗体組成物 を、被検者に投与することを含む、ヒト組織因子の凝血開始能を中和する方法。
57. （５７）ａ）ヒト組織因子重鎖タンパク質と免疫反応し、それにより、該タンパ ク質の因子ＶＩＩ／ＶＩＩａへの結合能を阻害し、かつｂ）ｈｕＴＦｈ：ＶＩＩ ／ＶＩＩ３複合体と免疫反応し、それにより、該複合体の因子Ｘ活性化能を阻害 する抗体分子を含む治療的に効果的量の、抗凝血モノクローナル抗体組成物を投 与することを含む凝血を阻害する方法。
58. （５８）上記抗体分子がさらに、ヒヒ組織因子と免疫反応を起こすことを特徴と する、請求の範囲（５７）記載の方法。