FI97813C - Monoklonaaliset vasta-ainekoostumukset ja monoklonaalisia vasta-aineita tuottavat hybridomat - Google Patents

Description

1 '97813

Monoklonaaliset vasta-ainekoostumukset ja monoklonaalisia vasta-aineita tuottavat hybridomat - Monoklonala antikroppskompositio-ner och hybridomer som producerar monoklonala antikroppar Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 885543

Oheinen hakemus on samanaikaisesti vireillä olevan, maaliskuun 31- päivänä 1987 jätetyn patenttihakemuksen, sarjanumero 033 047 ja kesäkuun 25. päivänä 1987 jätetyn patenttihakemuksen, sarjanumero 067 103, osittainen jatkohakemus.

Oheinen keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-molekvvliin (rDNA). jonka käsittämään rakenteelliseen geeniin on koodautunut ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostava proteiini (huTFh). Oheinen keksintö kohdistuu erityisemmin ilmentämisvektoriin, joka kykenee ilmentämään huTFh—proteiinia tämän vektorin sisältävissä isäntäsoluissa. Oheinen keksintö kohdistuu edelleen huTFh-proteiinin synteettiseen polypeptidianalogiin sekä mono-klonaalisiin vasta-aineisiin, jotka sitovat huTFh-proteiini a ja polypeptidianalogeja.

Veren hyytymiseen liittyy toisistaan riippuvien entsymaattis-ten, ko-faktoriin perustuvien, proteol yytt i st en ja geelin muodostavien reaktioiden sarja, joita reaktioita välittävät joukko solun ja plasman proteiineja, jotka tunnetaan hyytymistekijöinä. Tämä reaktiosarja voi käynnistyä, kun kudostekijänä (TF) tunnettu solureseptori sitoo hyytymistekijän VII tai sen johdannaisen, tekijän Vila, katalyyttisesti aktiivisen kompleksin muodostuessa. TF:n puuttuessa ja ilman jatkuvaa sitomista kompleksiksi tekijä VII/VIIa ei käynnistä hyytymistä. Näin ollen TF:n kemiallisten ja biologisten tunnusomaisten piirteiden selvittäminen on ilmeisen tärkeätä hyytymismekanismin ymmärtä— • mi seile.

Kudostekijä on kalvoon sitoutunut glykoproteiini, joka ei nor— maalisti esiinny kiertojärjestelmään liuenneena eikä ole plas-maproteiinien, tekijä VII/VIIa mukaan lukien, eikä muiden hyytymistekijöiden ulottuvilla. Vaikka kudostekijä ei ilmenekään tavallisesti verisuonijärjestelmän muodostavien solujen pinnalla, niin in-fektoivien aineiden komponentit, kuten bakteeri- 97813 Γ> peräiset 1ipopolysakkaridit, eräistä antigeenin stimuloimista T-avusta_iasol ui sta peräisin olevat 1 ym-f oki i ni t, eräät stimuloi-tuneet T—avustajasolut suoraan sekä immuuni kompleksit voivat kuitenkin indusoida sen ilmentymistä veri suonijärjestelmän monosyyteissä. Tietyt monosyytei stä/makro-f aagei sta peräisin olevat tulehduksen välittäjät, esimerkiksi interleukiini 1 ja tuumorin nekroosi teki jä oc sekä bakteeriperäinen 1ipopolysakka-ridi, voivat stimuloida verisuonten kosteata pintaa peittäviä endoteelisoluja siten, että ne ilmentävät TF—tekijää. TF:n ilmentyminen verisuonissa johtaa tyypillisesti verisuonen sisäiseen hyytymiseen monessa paikassa tai tukkeuman muodostumisen paikalliseen käynnistymiseen eli trombogeneesiin.

Kudostekijä ilmenee olennaisena osana eräiden verisuonten ulkopuolisten solujen pinnalla in vitro—vi1jelmissä, jotka käsittävät -fibroblasteja, eräitä toistaiseksi tunnistamattoman tyyppisiä aivosoluja sekä tiettyjä epiteelisoluja, joita estokerrok-sena toimivat peruskalvot erottavat kiertävän plasman proteiineista. TF:n läsnäolo näissä soluissa johtaa tukoksen muodostumiseen kudoksen vaurioituessa vapautuvan veren kanssa kosketukseen joutuessaan. Täten TF on se perusta, jonka varaan hemo-staattinen järjestelmä rakentuu.

Julkaisussa Howell. Am, J. Phvsi oi .. 51;1 (1912) esitettiin ensimmäisen kerran, että TF-tekijää sisältävä eristetty kudos-proteiinin preparaatti voi edistää hyytymistä ainoastaan ollessaan läsnä fosfoiipidi ja proteiinin (1ipoproteiinin) välisenä kompleksina. TF:n toiminnallisen esi hyydyttävän aktiivisuuden palauttaminen lipidoimalla eristetty proteiini uudestaan on ollut välttämätöntä, koska TF:ää sisältävän kudosproteiinin eristäminen johtaa tyypillisesti TF—proteiiniin normaalisti liittyvien -f os-f oi i pi di en poistumiseen. Lukuisat tutkijat ovat selvittäneet tätä aktiivisuuden palauttamista. Esimerkiksi -f os+ol i pi di n tyypin, -f osfol ipidin ja proteiinin välisen suhteen sekä käsittelyseoksessa detergentti— ja ioni koostumuksen on esitetty vaikuttavan hyydyttävän aktiivisuuden palautumiseen. Katso Nemerson, J. CIin. Invest.. 47:72 (1968); Nemerson, J. Clin. Invest.. 48:322 (1969); sekä Carson et ai.. Sei ence, 97813 O» 208:307 (1980).

Sekä eristettyä että uudestaan lipidoitua TFsää sisältävät proteiini preparaatit on valmistettu eri lajien kudoksista uuttamalla. Tähän saakka käytetyt menetelmät ovat olleet hankalia, ai kaavi eviä ja ne ovat johtaneet pieniin saantoihin, koska kudostekijää on läsnä vain erittäin pieninä määrinä luonnossa esiintyvissä kudoksisa. Yhteenveto perinteisistä menetelmistä on löydettävissä julkaisusta Nemerson et ai., Proa. Hem.

Thromb.. 6:237-261 (1982).

Tätä myöhemmin julkaisuissa Broze et ai., J. Biol. Chem..

3 260:10917-20 (1985), Bom et ai., Thromb. Res.. 42:655-645 (1986) sekä Guha et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USft. 83:299-302 (1986) on esitetty ihmisen kudostekijä (huTF)—proteiinin eristäminen siihen havaintoon perustuvalla menetelmällä, että delipidoitu kudostekijäproteiini kykenee sitomaan tekijän VII/VIIa, kun proteiini on tehty liukoiseksi ei-ionista deter— genttiä ja yhdistettä CaCl2 sisältävään vesiliuokseen. Tämän menetelmän, jossa käytetään tekijän VII/VIIa a-f-finiteettisor— benttia, käyttökelpoisuutta kudostekijäproteiinin eristämiseksi ei rajoita pelkästään vaikeus saada merkittäviä määriä eristettyä tekijää VII/VIIa, vaan myös tekijän VII/VIIa.

Broze et ai, edellä, ovat ehdottaneet, että huTF—teki jäi 1 e spesifisten monoklonaaliSten vasta-aineiden kehittämisellä ja niiden käytöllä immunoaffiniteetti in perustuvina sorbentteina voitaisiin välttää tekijän VII/VIIa rajallisesta saatavuudesta johtuvia ongelmia. Kirjal1isuudessa ei olla kuitenkaan esitetty lainkaan monoklonaalisi a anti-huTF vasta-aineita. Lisäksi kaksi naudan TF—tekijää vastaan muodostunutta monok1onaalista vasta-ainetta CCarson et ai., B1ood. 622: 156 (1985)3 ei immunoreagoi huTF: n kanssa (Guha et ai., edellä).

• 97813 4

Oheinen keksintö käsittää korkeintaan noin 12 000 nukleotidi-emäsparia käsittävän DNA-kappaleen, jonka sisältämään ketjuun on määräytynyt ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun (huTFh) muodostavaa proteiinia koodaava rakenteellinen geeni. Tämä rakenteellinen geeni koodaa edullisesti proteiinia, jonka aminohappo jäännös ten ketju on kuvion 1 mukainen noin jäännöksestä 1 noin jäännökseen 263. Edullisemmin, rakenteellisella geenillä on kuvion 2 mukainen nukleotidiemästen ketju noin emäksestä 130 noin emäkseen 918.

DNA-kappale käsittää myös ensimmäisen ketjun 5'-päähän rajoittuvan toisen ketjun, johon on koodautunut huTFh-proteiinin aminopäätteeseen kiinnittynyt aminohappojäännösten johtoketju. Ensimmäinen ja toinen DNA-ketju määrittävät yhdessä rakenteellisen yhdistelmägeenin, joka koodaa ihmisen kudostekijän raskaan ketjun esiasteproteiinia (pre-huTFh). Tämä rakenteellinen yhdistelmägeeni koodaa edullisesti proteiinia, jolla on kuviossa 1 esitetty aminohappojäännösten ketju noin jäännöksestä -32 noin jäännökseen 263. Edullisemmin, tällä rakenteellisella yhdistelmägeenillä on kuvion 2 mukainen nukleotidiemästen ketju noin emäksestä 34 noin emäkseen 918.

Keksintö käsittää myös yhdistelmä-DNA-molekyylin, joka käsittää sellaiseen ensimmäiseen DNA-kappaleeseen toiminnallisesti kytketyn vektorin, joka ensimmäinen DNA-kappale määrittää rakenteellisen, ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavaa proteiinia koodaavan geenin. Tämä yhdistelmä-DNA-molekyyli käsittää edullisesti lisäksi ensimmäisen kappaleen 5'-päätteeseen rajoittuvan toisen DNA-kappaleen, joka koodaa mainittuun proteiiniin kiinnittynyttä aminohappojäännösten johtoketjua; mainitun ensimmäisen ja toisen DNA-kappaleen määrittäessä yhdessä rakenteellisen yhdistelmägeenin, joka koodaa mainitun proteiinin esiastemuotoa.

Oheinen keksintö käsittää myös ihmisen kudostekijässä olevan sitomiskohdan polypeptidianalogin, joka käsittää korkeintaan noin 50 aminohappojäännöstä ja joka sisältää kaavan - 97813 5 -VNQVYT- esittämää ketjua vastaavan aminohappojäännösten ketjun.

Edullisemmin, oheinen keksintö käsittää ihmisen kudostekijässä olevan sitomiskohdan polypeptidianalogin, joka käsittää korkeintaan noin 50 aminohappojäännöstä ja joka sisältää seuraa-vien kaavojen mukaisten ketjujen joukosta valitun aminohappo-jäännösten ketjun: -VNQVYTVQIST- ja -LYYWKSSSSGKKT-.

Oheisen keksinnön eräs suoritusmuoto on vasta-ainevalmiste, joka käsittää vasta-ainemolekyylejä, jotka: a) immunoreagoivat ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin kanssa; b) immunoreagoivat seuraavien kaavojen H-EWEPKPVNQVYT-OH, H-EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-OH, H-VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH, H-RDVFGKDLIYTLYYWK-OH, H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK-OH, H-SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV-OH, H-SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV-OH, H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH, H-KSGDWKSKC-OH, H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH, H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENS PEFTPYLC-OH, H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH sekä H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH; mukaisten ketjujen joukosta valitun polypeptidin kanssa; sekä c) eivät immunoreagoi olennaisesti kuviossa l esitetyn kaavan, asemasta 204 asemaan 226, mukaisen polypeptidin kanssa.

Oheinen keksintö kohdistuu myös hybridomeihin TF8-5G9, TF9-10H10, TF9-5B7 ja TF9-6B4 sekä monoklonaalisten vasta-aineiden . 97813 6 seoksiin, jotka käsittävät näiden hybridomien tuottamia vasta-ainemolekyylejä.

Oheinen keksintö kohdistuu edelleen menetelmään ihmisen kudos-tekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnesteen näytteestä, jossa menetelmässä: a) ruumiinnesteestä otettuun näytteeseen sekoitetaan vasta-aineita, jotka immuunireagoivat ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin kanssa immuunireaktion seoksen muodostamiseksi; b) seosta säilytetään niin kauan, että nämä vasta-aineet ehtivät immuunireagoida näytteessä mahdollisesti läsnäolevan ihmisen kudostekijän kanssa immuunireaktion tuotteen muodostaen; ja c) vaiheessa b) mahdollisesti muodostuneen immuunireaktion tuotteen läsnäolo ilmaistaan.

Oheisen keksinnön eräs muu suoritusmuoto kohdistuu reagenssi-pakkauksena olevaan diagnoosijärjestelmään ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin läsnäolon määrittämiseksi näytteestä, joka reagenssipakkaus sisältää keksinnön mukaista vasta-ainevalmistetta. Tämä vasta-ainevalmiste käsittää edullisesti seuraavasta hybridomajoukosta: a) TF8-5G9, b) TF9-6B4, c) TF9-10H10 ja d) TF9-5B7 valitun hybridoman tuottamia monoklonaalisia vasta-ainemole-kyylejä.

Keksinnössä tarkastellaan samoin menetelmää veren hyytymistekijän VII/VIIa eristämiseksi näytteestä. Tämän menetelmän kä-sittämissä vaiheissa: a) näyte sekoitetaan kiinteään kantajaan, joka käsittää patenttivaatimuksen 15 mukaista polypeptidiä kiinteään matriisiin kiinnitettynä, mainitun sekoituksen muodostaessa sitovan reaktioseoksen; - 97813 7 b) mainittua sitovaa reaktioseosta ylläpidetään niin pitkän ajanjakson ajan, että mainittu hyytymistekijä ehtii sitoutua mainittuun polypeptidiin ja muodostaa kiinteänä faasina toimivan kompleksin ja supernatantin; c) mainittu supernatantti erotetaan mainitusta kompleksista; ja d) mainittu hyytymistekijä otetaan talteen vaiheessa c) erotetusta kompleksista.

Keksinnössä tarkastellaan edelleen valmistetta, joka käsittää biologisesti aktiivisen, ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin vesiliuosta, joka ei sisällä olennaisesti ihmisen kudostekijässä kevyen ketjun muodostavaa proteiinia. Tällainen biologisesti aktiivinen, ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostava proteiini on edullisesti dis-pergoitu fosfolipidiin tai ei-ioniseen detergenttiin.

Keksinnön kohteena on edelleen reagenssipakkauksena oleva diagnoosijärjestelmä verisuonijärjestelmästä saadun nestenäyt-teen hyytymiskyvyn määrittämiseksi. Siihen kuuluva pakkaus sisältää valmistetta, joka käsittää biologisesti aktiivisen, ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin vesiliuosta, joka ei sisällä olennaisesti ihmisen kudostekijässä kevyen ketjun muodostavaa proteiinia, jossa vesiliuoksessa mainittua raskaan ketjun muodostavaa proteiinia on läsnä määränä, joka riittää vähintään yhden määrityksen toteuttamiseen. Raskaan ketjun muodostava proteiini on edullisesti dispergoitu fosfolipidiin.

Keksintö käsittää lisäksi menetelmän täysin kehittyneen, ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin valmistamiseksi sekä tässä menetelmässä ilmentyneen proteiinituotteen. Tämän menetelmän käsittämissä vaiheissa: a) elatusalustassa käynnistetään sellaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä transformoitujen nisäkässolujen viljelmä, joka yhdistelmä-DNA-molekyyli käsittää mainittujen solujen kanssa yhteensopivan ilmentämisvektorin kytkettynä toiminnallisesti ensimmäiseen DNA-kappaleeseen, jonka määrittämä 97813 8 rakenteellinen geeni koodaa ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavaa proteiinia, sekä mainittuun ensimmäiseen kappaleeseen rajoittuvaan toiseen DNA-kappaleeseen, joka koodaa mainittuun proteiiniin kiinnittynyttä aminohappo j äännösten johtoketjua; mainitun ensimmäisen ja toisen DNA-kappaleen määrittäessä yhdessä rakenteellisen yh-distelmägeenin, joka koodaa mainitun proteiinin esiaste-muotoa; b) mainittua viljelmää pidetään yllä niin pitkän ajanjakson ajan, että mainitut solut ehtivät ilmentää mainittuun yh-distelmä-DNA-molekyyliin koodautunutta proteiinia ja muodostaa mainittua täysin kehittynyttä proteiinia; sekä c) mainittu täysin kehittynyt proteiini otetaan talteen mainitusta viljelmästä.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa paten t t ivaat imuks i s s a.

Piirustuksissa, jotka muodostavat tämän julkaisun osan: Kuvio 1 esittää aminohappojäännösten täydellistä ketjua ihmisen ku-dostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin täysin kehittyneessä muodossa ja esiastemuodossa (huTFh ja pre-huTFh, vastaavasti), esitettynä vasemmalta oikealle ja suunnassa ami-nopäästä karboksipäähän, käyttäen aminohappojäännösten yksikirjaimisia koodeja. Aminohappojäännösten ketju luonnossa ensisijaisesti esiintyvässä, täysin kehittyneessä proteiinimuo-dossa on numeroitu 1-263. Harvemmin esiintyvän, täysin kehittyneen muodon ketju alkaa aminohappojäännöksestä numero 3 ja 1oppuu j äännökseen 263.

Pre-huTFh-proteiinin johtoketjua, joka irtoaa kehittymisprosessin aikana, vastaava aminohappojäännösten ketju (esiasteen osa) on esitetty negatiivisilla numeroilla. Solun ulkopuolinen domeeni ja kalvon läpäisevä ankkurialue vastaavat jäännösten asemia 1-219 ja 220-242, vastaavasti.

97813 9

Kuvio 2 esittää nukleotidien järjestystä pre-huTFh- ja huTFh-proteiineja koodaavissa cDNA—molekyyleissä. esitettynä vasemmalta oikealle ja suunnassa 5?-päästä Z'-päähän, käyttäen nukleotidi emästen yksikirjaimisia koodeja. huTFh-proteiinin rakenteellinen geeni alkaa emäksestä 130 ja päättyy emäkseen 91S.

Lukukehys on esitetty sijoittamalla päätelty aminohappojäännös-ten ketju nukleotidi ketjun päälle siten, että kutakin amino-happojäännöstä edustava yksi ainoa kirjain sijaitsee vastaavan kodonin keskimmäisen emäksen yläpuolella.

Kuvio 3 on käyrä, joka havainnollistaa esimerkissä 2 kuvatulla tavalla huTF-esihyydyttäjän aktiivisuuden mittaamiseen käytettyä hyytymismääritystä. Kuviossa nähdään 1og-1og-käyränä ihmisen sitratoidun plasman koaguloitumisajän (hyytymisajän; se-kuntteina) riippuvuus ihmisen kudostekijän (huTF) Pitoisuudesta (pikogrammoina millilitraa kohden; po/ml).

Kuvio 4 esittää tekijän VII/VIIa affiniteetin perusteella eristetyn huTF:n, jota on käsitelty elektroforeettisesti 10 /. ooly-akryyliamidigeeli11ä, autof1uorogrammia. Ura A esittää 13=I-merkittyä huTF-tekijää, joka oli eristetty ja pelkistetty di — tiotreitoii11 a (DT7) ennen esimerkin 4 mukaisesti toteutettua elektroforeettista käsittelyä. Ura B esittää moiekyylipainon standardeja, joiden ilmeiset molekyylipainot esitetään kilo-daltoneina (k).

Kuvio 5 esittää tekijän VII/VIIa affiniteetin perusteella eristetyn huTF:n, jota on käsitelty el ektrof oreetti sesti 15 V. poly— akryyliamidigeeli11ä, autofluorogrammia. huTF:n eristäminen, merkitseminen x:2=I— i sotoopi 11 a ja el ektrof oreetti nen käsittely toteutettiin esimerkissä 4 esitetyllä tavalla. Ura A esittää eristettyä huTF-proteiinia DTTrllä pelkistämisen jälkeen. Ura B esittää samaa näytettä, joka on käsitelty elektroforeetti-sesti DTTrllä pelkistämättä. Ylempi ja alemoi vyöhyke (merkitty kirjaimin U ja L) vastaavat arviolta 58 ja 47 k:n kokoisia huTF-muotoja. Autofluorografiän jälkeen ylempi ja alempi vyöhyke leikattiin irti, kasteltiin uudestaan DTT:tä sisältävässä 97813 10 SDS-näytepuskurissa, istutettiin toisen 15-prosenttisen pol y-akryyl i ami di geel i n näytekoloon ja käsiteltiin elektroforeetti-sesti. Ura C osoittaa urasta B saadun alemman vyöhykkeen uutta elektroforeettista käsittelyä. Ura D esittää urasta B saadun ylemmän vyöhykkeen uutta el ektro-f oreett i sta käsittelyä. Proteiinit, joiden ilmeinen molekyy1ipaino on 12.5 ja 47 kilodalto-nia (k), on esitetty nuolilla.

Kuvio 6 esittää tekijän VII/VIIa a-f -f i ni t eet i n perusteella eristetyn huTF:n autof1uorogrammia, joka huTF ensin immuuniseostettiin huTF-spesifisellä monoklonaalisei 1 a vasta-aineella TF8-5G9 ja joka sitten käsiteltiin elektroforeettisesti 8-17 > prosentin gradientin käsittävällä polyakryyliamidigeeli11ä esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Ura A esittää 1==I-isotoopi11 a merkittyä huTF-proteiinia, joka käsiteltiin elektroforeetti-sesti DTT:llä pelkistäen. Ura B esittää samaa näytettä, joka käsiteltiin elektroforeettisesti pelkistämättä.

Kuvio 7 esittää tekijän VII/VIIa affiniteetin perusteella eristetyn huTF:n autof1uorogrammia, joka huTF oli käsitelty elektrof oreetti sesti 15 /. pol yakryyl i ami di geel i 11 ä. Eristäminen, merkitseminen 12SI-isotoopi11 a, pelkistäminen ja deglykosylaa-tio toteutettiin esimerkissä 4 kuvatulia tavalla. Ura 1 sisältää seuraavat, merkitsi minä elektroforeettisesti käsitellyt proteiinistandardit, joiden ilmeiset molekyylipainot (Mr) on esitetty ki1odaltoneina: lysotsyymi, 14.3: karboninen anhvd-raasi, 30,0; ovalburniini, 46,0; naudan seerumin albumiini, 69,0; fosforylaasi b, 92,5; sekä myosiini, 200,0, jotka kaikki saatiin yhtiöstä Amersham, Arlington Heights, IL. l2SI-huTF-proteiinia sisältävät näytteet käsiteltiin elektroforeettisesti joko DTT:n kanssa (urat 2 ja 3) tai ilman DTT:tä (urat 4 ja 5). Eräät näistä 1==I—huTF-proteiinia sisältävistä näytteistä deglykosyloi ti in (urat 3 ja 5) kun taas muita ei deglykosyloitu (urat 2 ja 4) ennen elektroforeesia.

Urissa 3 ja 5 ajetut, 12SI-huTF-proteiinia sisältävät näytteet deglykosyloi tiin ennen elektroforeesia, kun taas urissa 2 ja 4 ajettuja näytteitä ei deglykosyloitu.

97813 11

Kuvio 8 havainnoi 1 istaa immuuniaffiniteetin oerusteella eristetyn huTF:n autof1uorogrammia, joka huTF käsiteltiin elektro-foreettisesti 10 7. pol yakryyl i ami di geel i 11 ä esimerkissä 9 kuvatulla tavalla. Ura 1 sisältää seuraavat, merkitsi minä elekt-ro-f oreetti sesti käsitellyt proteiinistandardit, joiden ilmeiset molekyylipainot (Mr) on esitetty ki1odaitoneina: sytokromi c, 12,4; 1aktoglobuliini, 18.4; karboninen anhydraasi, 29,0; iak-taatti-dehydrogenaasi , 36,0; ovalbumiini, 43,0; glutamaatti-dehydrogenaasi, 55,0; sekä fos-forylaasi b, 95,5. jotka kaikki saatiin yhtiöstä Diversified Biotech (Newton Centre, MA).

Ura 2 sisältää noin 20 uq DTTrllä pelkistettyä proteiinia mää— t ritettynä BCA proteiinin määritysmenetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Smith et ai.. Anal. Biochem.. 150;76-85 (1985). huTF-protei i nin raskas ketju (hut-fh) nähdään selvästi ilmeisen molekyylipainon 47 kohdalla ja huTF:n kevyt ketju näkyy heikosti ilmeisen molekyylipainon 12,5 kohdalla. Proteiini saatiin näkyviin värjäämällä Coomassie-siniseilä julkaisussa Laemmlι, Nature. 277;680-685 (1970) esitetyllä tavalla.

Kuvio 9 on graafinen esitys, joka havainnollistaa annosvaste-käyränä sitä, miten huTFh—proteiinin oolypeptidi analogit, joita ei olla fosfoiipidoitu (ei lipidoitu), inihiboivat huTF:n käynnistämää hyytymistä. Ei —1ipidoitujen polypeptidi en erilaisista pitoisuuksista johtuva hyytymisen prosentuaalinen inhibitio mi — * tattiin esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Testattuihin poly- peptideihin kuuluivat p26-49 (Δ, TF26.49), pl21-155 (0, TF121.155), p146—167 (O, TF146.167) sekä D204-226 (3 , TF204.226).

Kuvio 10 on graafinen esitys, jossa nähdään annosvastekäyränä se, miten huTFh—proteiinin fosfoiipidoidut (lipidoidut) peptidi analogit inhiboivat nuTFrn käynnistämää hyytymistä. Prosentuaalinen inhibitio mitattiin samoilla menetelmillä ja samojen analogien tapauksessa kuin kuvion 9 yhteydessä.

Kuvio 11 esittää yhdistelmä-DNA-plasmideissa pCTF64, OCTF314 ja pCTF403 istutteina toimivien EcoRI—kappa!eiden restriktio— 12 97813 karttoja. Nämä istutteet ('—) esittävät niiden nukleotidi ketju-jen Däällekkäin meneviä osia, jotka ketjut yhdessä vastaavat pre-huTFh-geenin täydellistä nukleotidi ketjua. Erilliset istutteet käsittävät nukleotidijäännöksiä, jotka vastaavat vasemmalta oikealle ja suunnassa 5J-3? tarkasteltuna kuviossa 2 esitec-tyn nukleotidi ketjun emäsjäännöksiä 1-486 (läsnä plasmidissa pCTF64), jäännöksiä 135-775 (läsnä piasmidissa PCTF314) sekä jäännöksiä 776-1125 (läsnä piasmidissa pCTF403). Kuviossa esitetään samoin restriktioendonukleaasien pi 1kkomiskohtien arvioitu sijaintikohta istutteissa, joita käytettiin erilaisten, esimerkissä 16 kuvattujen yhdistelmä-DNA-molekyylien muodostamiseen. Kuviosta nähdään edelleen vastaavan pre-huTFh-proteii- . nin ja sen johtopepti di n (22.) ja kalvon läpäisevän, ehyenä esitetyn ankkuridomeenin (22) arvioitu sijäi nti kohta.

Kuvio 12 on graafinen esitys, jossa nähdään annosvastekävränä se, miten huTFh-proteiinien ei-fosfoiioidoidut (ei —1ipidoidut) polypeptidi analogit inhiboivat huTF:n käynnistämän hyytymisen. Ei-1ipidoitujen polvoeotidi en erilaisten, mol aarisuutena (M) esitettyjen pitoisuuksien aikaansaama hyytymisen prosentuaalinen inhibitio (%) mitattiin esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Tutkittuja polvpeptidejä olivat p24-35 (2), p26~49 (0), □152-169 (2) sekä Deptidit p40-71, p72-104, p94-123 ja ol61-189, joista yksikään ei saanut aikaan olennaista inhibitiota, ja joita merkitään yhteisesti täytetyllä ympyrällä (Θ).

/

Kuvio 13 on graafinen esitys, joka havainnollistaa TFS-5G9-vasta—ainevalmisteen aiheuttaman hyytymisen inhibition kinetiikkaa. Hyytymisen prosentuaalinen inhibitio (%) on esitetty erilaisten vasta-aineiden immuunireaktion aikojen funktiona, mitattuna esimerkissä 18 kuvatulla tavalla.

Kuvio 14 on graafinen esitys, jossa nähdään annosvasteena anti-huTF-vasta—aineiden aiheuttama, hu7F:n käynnistämän hvvtvmisen inhibitio. Monoklonaalisen anti-huTF-vasta-aineen TF8-5G9 erilaisten pitoisuuksien aiheuttama hyytymisen prosentuaalinen inhibitio kV.) mitattiin esimerkissä 19 esitetyllä tavalla.

97813 13

Kuvio 15 on graafinen esitys, jossa nähdään annosvasteena anti-huTF-vasta-aineiden aiheuttama, huTF:n käynnistämän hyytymisen inhibitio, kun huTF-proteiinin lähteenä on ihmisen fibroblasti-solulinjan GlilSBl soluhajote. Monokl onaal i sen anti -huTF-vasta-aineen TF8-569 erilaisten pitoisuuksien aiheuttama hyytymisen prosentuaalinen inhibitio (%) mitattiin esimerkissä 19 kuvatulla tavalla. Täyttämättömät ympyrät (0) edustavat TF8-5G9-vasta-ainetta ja täytetyt ympyrät (0) edustavat asiaan liittymätöntä vasta-ainetta.

Kuvio 16 esittää sitä, miten monoklonaalinen anti-TF—vasta-aine TF8—5G9 inhiboi ihmisen aivoista puhdistetun TF:n esi— koaguloivaa aktiivisuutta. Ihmisen aivoista puhdistetun ja fosfoiipidi vesikkeleihin sekoitetun TF:n hyydyttävä aktiivisuus määritettiin sen jälkeen, kun sitä oli ensin inkuboitu 30 minuuttia 37 eC:n lämpötilassa puhdistetun IgG:n erilaisten Di-toisuuksi en kanssa. Ympyrät edustavat anti —TF—vasta-ainetta TF8-5G9; kolmiot edustavat asiaan liittymätöntä, vertailuna toimivaa vasta—ainetta PAblOÖ. Tulokset on esitetty prosentuaalisena inhibitiona lisätyn vasta-aineen puuttuessa todetusta aktiivisuudesta laskien.

Kuvio 17 esittää sitä, miten puhdistetuilla monoklonaalisi 11 a anti—TF—vasta—ainei11 a käsitellyt virtsarakon viljellyt karsi — noomasolut J82 inhiboivat tekijän VII sitoutumista ja tekijän Xa muodostumista. Arvot, jotka liittyvät tekijän Xa muodostu— misnopeuden inhibitioon, on esitetty kolmioilla; arvot, jotka liittyvät tekijän VII sitoutumisen inhibitioon, on esitetty ympyröillä. Tulokset on esitetty prosentuaalisena inhibitiona ilman lisättyä vasta-ainetta inkuboidui11 a soluilla saaduista arvoista laskien. Palsta A: vasta-aineen TF9-2C4 vaikutus; palsta B: vasta-aineen TF9-5B7 vaikutus.

Kuvio 18 esittää i mmuuni af-f i ni t eeti n perusteella eristetyn huTFin analyysiä Wsternin täplien avulla, kuten kuviossa 25 esitetään. 15—prosentti set polyakryyliamidiqeelit kuormitettiin seuraavasti: ura 1 sisältää molekyylipainon standardeja, joiden ilmeiset molekyylipainot on esitetty palstan A vasemmalla duo- 14 97813 lella ki 1 octal toneina (k) ; ura 2 sisältää 1 ug:n ihmisen puhdistettua hemoglobiinia, joka on pelkistetty ennen elektroforeesia; ura 3 sisältää 0,5 ug eristettyä huTF—proteiinia, joka on pelkistetty ennen elektro-foreesia; ja ura 4 sisältää 0.5 · pg pelkistämätöntä ja eristettyä huTF-proteiinia. SDS-PAGE-käsittelyn jälkeen tuloksena olleet proteiinivyöhykkeet siir— rettiin el ektro-f oreetti sesti ni trosel 1 ui oosal 1 e. Täten muodostetut Westernin täplät saatettiin immuunireagoi maan affiniteetin perusteella puhdistetun, kaniinin anti-huTF IgG:n (0,2 ug/ml) (ura A), kaniinin anti-hemoglobiini IgG:n (1 pg/ml) (ura B) tai immunoimattoman kaniinin IgG:n (1 ug/ml) (ura C) kanssa. Immuuni värjättyjen vyöhykkeiden ilmeiset molekyylipa!-not on esitetty oikealla yksikössä kDa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Aminohappo; Kaikki ohessa tunnistetut aminohappojäännökset ovat luonnollisessa L-konfiguraatiossa. Polypeotidi en vakiintuneiden nimitysten, J. Biol. Chem.. 243:5557-59. (1969), mukai sesti aminohappojäännöksistä käytetään ohessa seuraavan vastaavuustaulukon mukaisia lyhennöksiä:

VASTAAVUUSTAULUKKO

Symbol i_ Ami nohappo 1-kirjäi minen 3-kirjäi minen Y Tyr L—tyrosiini G Gly glysiini F Phe L-fenyyliai aniini M Met L-metioniini A Ala L-alaniini S Ser L—seriini I Ile L-isoieusiini L Leu L-leusiini T Thr L—treoniini V Vai L-valiini P Pro L—proliini K Lys L-lysiini H Hi s L-histidiini -R 1H > Rilli l i i id 97813 15 O Gin L-glutamiini E Glu L-glutaamihappo W Trp L-tryptotaani R Arg L-arginiini D Asp L-aspartiinlhappo N Asn L-asparagiini C Cys L-kysteiini.

Huomattakoon, että kaikki aminohappojäännösten ketjut esitetään ohessa kaavoilla, joiden suunta vasemmalta oikealle on perinteinen suunta aminopäätteestä karboksipäättteeseen. Edelleen tulee huomata, että yhdysviiva aminohappojäännösten ketjun , alussa tai loDUSsa tarkoittaa sidosta radikaalin, kuten vedyn H ja hydroksyylin OH, kanssa amino— tai karboksipäätteessä, vastaavasti, tai yhdestä tai useammasta aminohappojäännöksestä muodostuvan muun, polypeptidi ketjussaan yhteensä korkeintaan noin 50 jäännöstä käsittävän ketjun kanssa.

Polypeptidi ia peptidi; Polypeptidi ja peptidi ovat käsitteitä, joita käytetään ohessa toistensa synonyymeinä, ja joilla tar— koitetaan korkeintaan noin 50 aminohappojäännöksen lineaarista sarjaa, jossa aminohappojäännökset ovat kiinnittyneet toisiinsa viereisten jäännösten ai fa-aminoryhmän ja karboksiryhmän välisellä peptidi sidoksel1 a.

Protei ini: Ohessa käytetyllä käsitteellä proteiini tarkoitetaan useamman kuin 50 aminohappojäännöksen lineaarista sarjaa, jossa jäännökset ovat kiinnittyneet toisiinsa samoin kuin polypepti— di ssä.

Nukleotidi; DNA:n tai RNA:n monomeerinen yksikkö, joka koostuu sokeriosasta (pentoosi ) , -f osf aat i sta sekä typpeä sisältävästä heterosyklisestä emäksestä. Tämä emäs on kytkeytynyt sokeri-osaan qlykosidisen hiilen (pentoosin 1'—hiili) välityksellä, ja emäksen sekä sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Kun tämä nukleosidi sisältää pentoosin 3·'— tai 5? -asemaan sitoutuneen •fosfaattiryhmän, niin sitä kutsutaan nukleotidiksi.

• 97813 16

Emäspari (bp): Adeniini n (A) ja tyrniini n (T) muodostama pari tai sytosiinin (C) ja guaniinin (6) muodostama pari kaksijuos-teisessa DNA-molekyylissä.

Elävissä organismeissa proteiinin tai polypeptidin aminohappo-jäännösten ketju liittyy suoraan geneettisen koodin välityksellä tätä proteiinia koodaavan rakenteellisen geenin deoksiribo-nukleiinihappoketjuun (DNA-ketjuun). Näin ollen rakenteellinen geeni voidaan määrittää aminohappojäännösten ketjun eli sen koodaaman proteiinin tai polypeptidin avulla.

Geneettisen koodin tärkeä ja hyvin tunnettu ominaisuus on sen , monimuotoisuus. Toisin sanoen useimpien, proteiinien valmista miseen osallistuvien aminohappojen tapauksessa enemmän kuin yksi koodaava nukleotiditripletti (kodoni) voi koodata tai edustaa tiettyä aminohappojäännöstä. Näin ollen monet erilaiset nukleotidi ketjut voivat koodata tiettyä aminohappojäännösten ketjua. Tällaisia nukleotidi ketjuja pidetään toiminnallisesti toisiaan vastaavina, koska ne voivat johtaa saman aminohappo-jäännösten ketjun muodostumiseen kaikissa organismeissa. Tietty nukleotidi ketju saattaa aika—ajoin sisältää puriinin tai pyri — midiinin metyloituneen muunnoksen. Tällainen metyloituminen ei vaikuta kuitenkaan koodaussuhteeseen millään tavalla.

Oheisen keksinnön mukaiset DNA-kappaleet ovat tunnettuja siitä, että ne sisältävät ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavaa proteiinia (huTFh) koodaavan DNA—ketjun. Eräässä suoritusmuodossa tämä DNA—kappale sisältää DNA-ketjun, johon on koodautunut ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin esiaste (pre-huTFh). Toisin sanoen, oheisen keksinnön mukaiset DNA-kappaleet ovat tunnettuja siitä, että niissä on läsnä huTFh:n tai edullisemmin pre-huTFh:n rakenteellinen geeni. Edelleen edullisia ovat DNA-kappaleet, joiden sisältämään, rakenteellisen geenin muodostavaan DNA-ketjuun on koodautunut liukoinen huTFh- tai liukoinen pre-huTFh-proteiini. Tämä geeni on edullisesti läsnä kodonien keskeytymättömänä lineaarisena sarjana, jonka kukin kodoni koodaa huTFh- tai pre-huTFh— proteiinissa esiintyvää aminohappojäännöstä, se on toisin sa— 97813 17 noen introneita käsittämätön geeni.

Täten oheisen keksinnön eräänä suoritusmuotona on DNA-ketju, joka koostuu olennaisesti suurin piirtein kuviossa 2 esitetyn ketjun 5'-päätteessä sijaitsevasta asemasta 130 sen 3'-päätteessä sijaitsevaan asemaan 918, ja joka kykenee ilmentämään huTFh-proteiinia. Oheisen keksinnön toisena suoritusmuotona on DNA—ketju, joka koostuu olennaisesti suurin piirtein kuviossa 2 esitetyn ketjun asemasta 34 noin sen asemaan 918, ja joka kykenee ilmentämään pre-huTFh-proteiinia.

Edullisesta liukoisesta huTFh-molekyylistä puuttuvat ne amino-happojäännökset, jotka ovat koodautuneet arviolta viimeiseen, j huTFh-proteiini a koodaavan DNA:n 5'—päätteessä sijaitsevaan 150 emäkseen. Näin ollen oheisen keksinnön eräänä muuna edullisena suoritusmuotona on DNA-kappale, joka koostuu suunnassa 5*-päätteestä 3’-päätteeseen olennaisesti kuviossa 2 esitetyn ketjun asemasta 130 suurin piirtein sen asemaan 756-801, ja joka kykenee ilmentämään liukoista huTFh—proteiinia. Esimerkkeinä edullisista DNA-ketjuista, jotka muodostavat liukoisen huTFh—oroteiinin rakenteei1isi a geenejä, mainittakoon ne, joilla on kuvion 2 mukainen, noin emäksestä 130 noin emäkseen 756, noin emäksestä 130 noin emäkseen 771, noin emäksestä 130 noin emäkseen 786 ja noin emäksestä 130 noin emäkseen 801 ulottuva nukleotidi emästen ketju.

Edulliset, liukoista pre—huTFh-proteiinia koodaavat DNA—kappaleet ovat samankaltaisia kuin liukoista huTFh—proteiinia koodaavat DNA-kappaleet, paitsi että niiden koodaamat proteiinit sisältävät aminopäätteessä johtoketjun, kuten esimerkiksi kuvion 1 mukaiset aminohappojäännökset -32 - 0. Täten edullinen, liukoista pre—huTFh—proteiinia koodaavan rakenteellisen geenin muodostava DNA-kappale koostuu olennaisesti suunnassa 5?-päätteestä 3’—päätteeseen noin kuviossa 2 esitetyn ketjun asemasta 34 suurin piirtein sen asemaan 756—801. Esimerkkeinä edullisista, liukoista pre—huTFh-proteiinia koodaavista DNA-kappa-leista ovat ne, joilla on kuviossa 2 esitetyn ketjun emäksestä 34 noin emäkseen 756, noin emäksestä 34 noin emäkseen 771, 97813 18 noin emäksestä 34 noin emäkseen 786 ja noin emäksestä 34 noin emäkseen 801 ulottuva nukleotidi ketju.

Kuten edellä esitettiin, keksinnössä tarkastellaan myös homologisia DNA- ja RNA-ketjuja, jotka koodaavat edellä esitettyjä huTFh- ja pre-huTFh-proteiineja, niiden liukoiset muodot mukaan luki en.

huTFh— ja pre—huTFh—proteiineja koodaavia DNA—kappalei ta voidaan syntetoida helposti kemiallisin tekniikoin, esimerkiksi •fos-fotriesterimenetelmäl 1 ä, joka esitetään julkaisussa Matteucci et ai., J. Am. Chem. Soc.. 103:3185 (1981). Ohessa • mainitut, alaan liittyvät julkaisut liitetään oheen viittauk sella. Luonnollisestikin, kun koodaava ketju syntetoidaan kemiallisesti, niin mikä tahansa toivottu muunnos voidaan toteuttaa yksinkertaisesti korvaamalla luonnollista aminohappo-jäännösten ketjua koodaava emäs jollakin sopivalla emäksellä. Edullisia ovat kuitenkin DNA-molekyylit, jotka sisältävät kuviossa 2 esitettyjen ketjujen suhteen täsmälleen homologisia ketjuja.

Olennaisesti huTFh- ja pre-huTFh-proteiineja koodaavista ra-kenteel1isista geeneistä koostuvia DNA-kappalei ta voidaan saada lisäksi näitä geenejä sisältävistä yhdistelmä-DNA-molekyyleis-tä. Esimerkiksi kukin plasmidi tyyppinen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli pCTF64, pCTF314 ja pCTF403 sisältää DNA—ketjuja, joihin on koodautunut huTFh— ja pre—huTFh—proteiinin eri osia, ja nämä yhdistelmä-DNA-molekyylit käsittävät yhdessä sen koko DNA-ketjun, joka on välttämätön kummankin proteiinin ilmentämiseen. Plasmidilla pCTF64, pCTF314 tai pCTF403 transformoidun Escherichia coli-bakteerin (E. coli) viljelmiä on talletettu 27. päivänä maaliskuuta 1987 Budapestin sopimuksen ehdoilla kantakokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), 12301

Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, ja niille annettiin seu-raavat tai 1etusnumerot 67370, 67368 ja 67369, vastaavasti.

huTFh- tai pre—huTFh-proteiinia koodaavan DNA-ketjun sisältävä DNA—kappale voidaan valmistaa kytkemällä toimivasti (liqatoi — 97813 19 maila) kustakin edellä talletetusta plasmidista saatuja asianmukaisia restriktiokappaleita toisiinsa hyvin tunnetuilla menetelmillä. Oheisen keksinnön mukaisissa, tällä tavalla tuotetuissa DNA-molekyy1eissä on tyypillisesti tarttuvat päät, eli "vapaana riippuvat" yksijuosteiset osat, jotka ulottuvat molekyylin kaksijuosteisen osan yli. Tarttuvien päiden läsnäolo oheisen keksinnön mukaisissa DNA-molekyyleissä on edullista.

Oheisessa keksinnössä tarkastellaan lisäksi edellä kuvattujen DNA-kappaleiden ribonukleiinihappoon (RNA) perustuvia vasti-nei ta.

j Oheisen keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA-molekyylit voidaan valmistaa kytkemällä oheisen keksinnön mukaiseen DNA—kappalee— seen toiminnallisesti vektori.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "vektori" tarkoitetaan DNA-mole-kyyliä, joka kykenee autonomiseen repiikoitumiseen solussa, ja johon toinen DNA-kappale voidaan kytkeä toiminnallisesti siten, että myös kiinnitetty kappale saadaan repiikoi tumaan. Vektoreita, jotka kykenevät ohjaamaan huTFh- ja pre-huTFh-gee-nien ilmentymistä, nimitetään ohessa “i1mentämisvektoreiksi". Näin ollen yhdistelmä-DNA-molekyyli irDNA) on hybridi-DNA-mole-kyyli, joka käsittää vähintään keksi sellaista nukkieotidi ketjua, jotka eivät normaalisti esiinny yhdessä luonnossa.

Vektorin, johon oheisen keksinnön mukainen DNA-kappale kytketään toiminnallisesti, valinta riippuu suoraan, kuten alalla hyvin tunnetaan, toivotuista toimintaominaisuuksista, esimer— kiksi proteiinin ilmentymisestä sekä trans-formoitavasta isäntä-solusta. Nämä rajoitukset ovat luontaisia yhdistelmä-DNA-mol e-kyylien muodostamiseen liittyvälle alalle. Oheisessa keksinnössä tarkasteltu vektori kykenee kuitenkin vähintään ohjaamaan DNA—kappaleiden sisältämän, huTFh— tai pre—huTFh—proteiinin rakenteellisen geenin, johon se on kytketty toiminnallisesti, repiikoitumista ja edullisesti myös ilmentymistä.

97813 20

Edullisissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukainen vektori sisältää prokariOGttisen repi ikoni n, eli DNA-ketjun, Joka kykenee ohjaamaan yhdistelmä-DNA-molekyylin autonomista replikoi tumista ja sen säilymistä kromosomien ulkopuolella prokari-oottisessa isäntäsolussa, esimerkiksi tällä vektorilla transformoidussa, isäntänä toimivassa bakteerisolussa. Tällaiset repi ikonit ovat alalla hyvin tunnettuja. Lisäksi ne suoritusmuodot, jotka käsittävät prokarioottisen reolikonin, sisältävät myös geenin, jonka ilmentyminen johtaa lääkeaineen vastustuskykyyn tällaisella vektorilla trans-f ormoi dussa bakteeri-isän-nässä. Tyypillisiä geenejä, jotka johtavat bakteerissa lääkeaineen vastustuskykyyn, ovat ampisi 11iinin tai tetrasykliim n vastustuskyvyn aikaansaavat geenit.

Ne vektorit, jotka sisältävät prokarioottisen replikonin, voivat myös sisältää orokarioottisen promoottori n, joka kykenee ohjaamaan huTFh- tai pre-huTFh-geenin ilmentymistä (kopioitumista ja luentaa) isäntänä toimivassa ja tällä vektorilla trans-f ormoi dussa bakteerisolussa, kuten E. col i-soi ussa. Promoottori on ilmentymistä säätelevä elementti, jonka muodostava DNA-ketju tekee mahdolliseksi RNA—polymeraasin sitoutumisen ja kopioinnin. Bakteeri-isäntien kanssa yhteensopivia Dromoot— tori ketjuja on tyypillisesti läsnä piasmidivektoreissa, jotka sisältävät sopivia restriktiokohtia oheisen keksinnön mukaisen DNA—kappal een istuttamista varten. Tällaisia tyypillisiä vek- * toriplasmideja ovat pUC8, pUC9, pBR322 ja pBR329, joita on saatavana yhtiöstä Bio—Rad Laboratories (Richmond, CA), sekä pPL ja pKK223, joita on saatavana yhtiöstä Pharmacia, Piscata-way, N.J.

Oheisen keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien muodostamiseen voidaan myös käyttää i1mentämisvektoreita, jotka sopivat yhteen eukarioottiSten solujen kanssa, edullisesti selkärankaisten eläinten solujen kanssa yhteensopivia ilmentämis-vektoreita. EukarioottiSten solujen i1mentämisvektorit ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on saatavana lukuisista kaupallisista lähteistä. Tyypillisesti käytetään sellaisia vektoreita, jotka sisältävät sopivia restriktiokohtia toivotun 97813 21 DNA-kappaleen istuttamista varten. Tyypillisiä tällaisia vektoreita ovat pSVL ja pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) sekä pTDTl (ATCC, no. 31255).

Edullisissa suoritusmuodoissa eukarioottisen solun ilmentämisvektori t, joita käytetään oheisen keksinnön mukaisten yhdistelmä—DNA-mol ekyvl i en muodostamiseen, käsittävät eukariootti-sessa solussa tehokkaan valikoitavan merkitsimen, edullisesti lääkeaineen vastustuskykyyn perustuvan valikoitavan merkitsi-men. Edullinen lääkeaineen vastustuskykyyn perustuva merkitsin on geeni, jonka ilmentyminen johtaa neomysiinin vastustuskykyyn, eli neomysiini -fosf orotrans-ferääsi —geeni (neo-geeni).

, Southern et ai., J. Mol. Appi. Senet.. 1_: 327-341 (1962).

Ohessa tarkastellaan myös retroviruksesta peräisin olevien ilmentämisvektoreiden käyttöä tämän keksinnön mukaisten rDNA-molekvylien muodostamiseksi. Ohessa käytetyllä käsitteellä "retroviruksesta peräisin oleva ilmentämisvektori" tarkoitetaan DNA-molekyyliä, joka sisältää retroviruksen perimän pitkästä päättävästä toistuvasta alueesta (LTR-alueesta) peräisin olevan promoottori ketjun.

Edullisissa suoritusmuodoissa tämä ilmentämisvektori on tyypillisesti retroviruksesta peräisin oleva ilmentämisvektori, joka on edullisesti kykenemätön repiikoi tumaan eukarioottisissa 1 soluissa. Retroviruksesta peräisin olevien vektoreiden muodos taminen ja käyttö on kuvattu julkaisussa Sorge et ai.. Mol . Cell. Biol.. 4:1730-37 (1984).

Lukuisia erilaisia menetelmiä on kehitetty DNA:n liittämiseksi toiminnallisesti vektoreihin tarttuvien, täydentävien vastin-päätteiden avulla. Esimerkiksi istutettavaan DNA—kappaleeseen ja vektori-DNA:hän voidaan lisätä toisiaan täydentäviä homo-polymeeri siä vastinpaloja. Tämän jälkeen vektori ja DNA-kappale yhdistetään täydentävien homopolymeeristen vastinhäntien välisillä vetysidoksi11 a yhdistelmä-DNA-molekyylien muodostamiseksi .

97813 22

Vaihtoehtoinen menetelmä DNA-kappaleen liittämiseksi vektorei-hin on käyttää synteettisiä kytkijöitä, jotka sisältävät yhden tai useampia restriktiokohtia. DNA-kappalettä, joka saadaan aikaan restriktioendonukleaasi11 a pilkkomalla edellä kuvatulla tavalla, käsitellään bakterio-f aagin T4 DNA-pol ymeraasi 11 a tai E. coli-bakteerin DNA-polymeraasi11 a I, jotka ovat entsyymejä, jotka poistavat ulostyöntyvät yksijuosteiset 3'-päätteet 3'-5’—eksonukleolyyttisei 1ä aktiivisuudellaan, ja jotka täyttävät sisäänjääneet 3'-päät polymeroivai 1 a aktiivisuudellaan. Näin ollen näiden aktiivisuuksien yhdistelmä tuottaa tylppäpäisiä DNA-kappalei ta. Tämän jälkeen tylppäpäisiä kappaleita inkuboi-daan kytkijämolekyylien suuren molaarisen ylimäärän kanssa i sellaisen entsyymin, kuten bakteriofaagin T4 DNA-1igaasin, läsnäollessa, joka entsyymi kykenee katalysoimaan tylppäpäisten DNA—molekyylien ligaatiota. Näin ollen reaktion tuotteet ovat DNA-kappalei ta, jotka käsittävät päissään polymeerisiä kytkijä-ketjuja. Nämä DNA-kappaleet pilkotaan sitten sopivalla restrik-tioentsyymi11ä ja ligatoidaan i1mentämisvektoriin, joka on pilkottu sellaisella entsyymillä, joka tuottaa tämän DNA—kappaleen päätteiden kanssa yhteensopivia päätteitä.

Erilaisia restriktioendonukleaasien kohtia sisältäviä synteettisiä kytkijöitä on saatavana kaupallisesti lukuisista lähteistä, joista mainittakoon International Biotechnologies, Inc.,

New Haven, CN.

"’Λ

Oheisessa keksinnössä tarkastellaan myös edellä kuvattujen yhdi stelmä-DNA-molekyyli en RNA-vasti nei ta.

Oheinen keksintö kohdistuu myös oheisen keksinnön mukaisella yhdistelmä—DNA—molekyyl i 11 ä, edullisesti huTFh:n tai pre-huTFh:n liukoista muotoa ilmentävällä rDNArlla, transformoituun isäntäsoluun. Isäntäsolu voi olla joko prokarioottinen tai eukarioottinen solu. Bakteerisolut ovat edullisia prokariootti-siä isäntäsoluja ja tyypillisiä ovat E. coli-kannat, kuten esimerkiksi E. coli-kanta DH5, joka on saatavana yhtiöstä Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. Edullisia eukar i oatti si a i säntäsol li ja ovat esimerkiksi hiiva- ja nisäkäs- 97813 23 solut, edullisesti selkärankaisten eläinten solut, kuten esimerkiksi hiirestä, rotasta tai apinasta peräisin olevat solut tai ihmisen -fibroblastinen solulinja. Edullisiin eukariootti-siin isäntäsoluihin kuuluvat kiinanhamsterin munasarjasolut (CHO—solut), joita on saatavana kantakokoelmasta ATCC tunnusnumerolla CCL61, sekä NIH sveitsiläisen hiiren alkion solut NIH/3T3, joita on saatavana kantakokoelmasta ATCC tunnusnumerolla CRL 1658. Asianmukaiset isäntäsolut transformoidaan oheisen keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyyli11ä hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen, jotka menetelmät tyyypi11isesti riippuvat käytetystä vektorityypistä. Prokarioottisten isäntä-solujen transformointia on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Cohen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 69:2110 (1972); sekä Maniatis et ai.. Molecular Clonine. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Selkärankaisten eläinten solujen transformointi a retroviruksista peräisin olevia vektoreita sisältävillä rDNA-molekyylei 11ä on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Sorge et ai.. Mol. Cel1

Bi oi.. 4:1730-37 (1984): Graham et ai.. Viro!.. 52:456 (1973); sekä Wigler et ai., Proc. Natl, Acad. Sei. USA. 76:1373-76 (1979).

Onnistuneesti transformoituneet solut, eli solut, jotka sisältävät oheisen keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin, voidaan tunnistaa hyvin tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkiksi solut, joita saadaan oheisen keksinnön mukainen rDNA istuttamalla, voidaan kloonata monoklonaalisten pesäkkeiden tuottamiseksi. Näiden pesäkkeiden solut voidaan ottaa talteen, hajottaa ja niiden DNA-sisäl1östä voidaan määrittää rDNA:n läsnäolo käyttäen esimerkiksi menetelmää, joka kuvataan julkaisussa Southern, J. Mol. Bi oi.. 98:503 (1975) tai Berent et ai.,

Bi otech. 3:208 (1985).

Sen lisäksi, että rDNA:n läsnäolo määritettäisiin suoraan, onnistunut transformaatio voidaan varmistaa hyvin tunnetuilla immunologisilla menetelmillä, kun rDNA kykenee ohjaamaan huTFhrn tai pre—huTFh:n ilmentymistä. Esimerkiksi ilmentämis— vektorilla onnistuneesti transformoidut solut tuottavat prote- 24 97813 iineja, joilla on huTFh- tai pre-huTFh-antigeeni syyttä. Transformoituneiksi epäillyistä soluista otetaan talteen näytteitä, joista määritetään huTFh tai pre-huTFh käyttäen noille antigeeneille spesifisiä vasta-aineita, esimerkiksi oheisen keksinnön mukaisten hybridomien tuottamia vasta-aineita.

Näin ollen itse transformoituneiden isäntäsoiujen lisäksi oheisessa keksinnössä tarkastellaan myös näiden solujen viljelmää elatusalustassa, erityisesti monoklonaalista (kloonin suhteen homogeenista) viljelmää tai monoklonaalisesta viljelmästä peräisin olevaa viljelmää. Tämä viljelmä sisältää edullisesti myös proteiinia, jolla on huTFh- tai pre-huTFh-antigeeni syyttä, ) ja edullisemmin biologisesti aktiivista huTFh-proteiinia.

Elatusalustat, joita voidaan käyttää transformoitujen isäntä-solujen viljelemiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on saatavana lukuisista kaupallisista lähteistä. Suoritusmuodoissa, joissa isäntäsoiu on nisäkässolu, käytetään edullisesti "seerumia sisältämätöntä" elatusalustaa.

Oheisen keksinnön eräs muu piirre kohdistuu menetelmään sellaisten proteiinien tuottamiseksi, joilla on huTFh:n antigeeni-syyttä. Proteiinit, joilla on huTFhrn anti geeni syyttä, ovat proteiineja, jotka immuunireagoivat luonnollisen kudostekijän indusoi mi en vasta-aineiden kanssa. Proteiineja, joilla on huTFhrn anti geeni syyttä, voidaan käyttää antigeeneinä ja vasta-aineiden tuottamiseen, joita antigeenejä ja vasta-aineita voidaan käyttää oheisen keksinnön mukaisissa diagnoosijärjestel-missä ja menetelmissä.

Kyseisessä menetelmässä käynnistetään oheisen keksinnön mukaisella yhdistelmä—DNA—molekyyli11ä, joka kykenee ilmentämään huTFh- tai pre-huTFh-proteiinia, edullisesti liukoista huTFh-tai liukoista pre-huTFh-proteiinia, transformoituja isäntä-soluja, edullisesti ihmisen soluja, sisältävää elatusalustaa käsittävä viljelmä. Tätä viljelmää pidetään yllä niin pitkän ajanjakson ajan, että transformoidut solut ehtivät ilmentää huTFh- tai pre-huTFh-proteiinia. Tämän jälkeen ilmentynyt pro- : . . sfl i ane i.; ,i ax . 97813 25 teiini otetaan talteen tästä viljelmästä. Edullisissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukaisilla menetelmillä tuotetuilla huTFh—proteiinei11 a on lisäksi huTFh:n biologista aktiivisuutta, eli ne kykenevät sitomaan tekijän VII/VI Ia. Nämä menetelmät käsittävät sellaisten isäntänä toimivien, trans-formoitujen ni säkässol u jen viljelemisen, jotka solut on trans-f ormoi tu näissä soluissa pre-huTFh-geeniä ilmentävällä yhdistelmä-DNA-mole-kyylillä. Viljeleminen johtaa pre-huTFh-proteiinin ilmentymiseen ja tämän jälkeen solun sisällä pre—huTFh:n luennan jälkeiseen muokkautumiseen, jolloin muodostuu biologisesti aktiivista huTFh-protei i ni a.

j Menetelmät ilmentyneen proteiinin ottamiseksi talteen viljel mästä ovat alalla hyvin tunnettuja ja ne käsittävät viljelmän proteiinia sisältävän osan jakamisen -fraktioiksi hyvin tunnetuilla biokemiallisilla tekniikoilla. Tässä viljelmässä läsnäolevien ilmentyneiden proteiinien eristämiseen voidaan käyttää esimerkiksi geelisuodatusta, geelikromatografiaa, ultrasuoda— tusta, elektrof oreesia, ioninvaihtoa, a-f-f ini teetti kromatogra-fiaa ja muita astaavia menetelmiä, jotka ovat tunnettuja proteiineja -fraktioihin jaettaessa. Tämän lisäksi i mmuuni kemi ai -lisiä menetelmiä, kuten immuuni a-f-f ini teetti a, immuuni adsorptiota ja muita vastaavia voidaan toteuttaa hyvin tunnetuilla tavoi11a.

r

Oheisessa keksinnössä tarkastellaan lisäksi oheisen keksinnön mukaisten rDNA—molekyylien ilmentämiä proteiinituotteita huTFh ja pre-huTFh. Edullisissa suoritusmuodoissa ilmentyneiden huTFh- ja pre—huTFh—tuotteiden aminohappojäännösten ketju vastaa kuviossa 1 esitettyjä jäännöksiä 1-263 ja -32-263, vastaavasti. Ilmentyneen proteiinin pituus on vähintään 90 X, edullisesti vähintään 95 X, pre—huTFh:n ja huTFh:n aminohappojäännösten ketjun, joka esitetään kuviossa 1, pituudesta.

Keksinnön eräässä muussa suoritusmuodossa tarkastellaan huTFh:n ja pre—huTFh:n liukoisia muotoja sekä valmisteita, jotka sisältävät liukoista huTFh— ja/tai liukoista pre—huTFh—proteiinia. Ohessa käytetty käsite "liukoinen" viittaa huTFh— ja pre-huTFh- - 97813 26 molekyyleihin, joiden tunnusomaisena piirteenä on se, että ne koostuvat olennaisesti luonnollisen huTFh- ja pre-huTFh-mole-kyylien solun ulkopuolisesta domeenista, eli huTFh— ja pre-huTFh—molekyylien siitä osasta, joka muodostuu kuviossa 1 esitetyn ketjun jäännöksen 220 suhteen aminopäätteen puoleisesta osasta. Näin ollen liukoinen huTFh ja liukoinen pre-huTFh eivät sisällä lainkaan olennaisia osia luonnollisiin molekyvleihin muodostuneesta, kalvon läpäisevästä ankkurialueesta (kuviossa 1 jäännökset 220-242). Huomattakoon, että ohessa käytetyt käsitteet "huTFh" ja "pre-huTFh" kattavat näiden proteiinien liukoiset muodot, ellei erityisesti toisin mainita.

> Koska liukoinen huTFh ja liukoinen pre—huTFh eivät sisällä hydrofobista, kalvon läpäisevää ankkuri aiuetta, niin ne eivät kasaannu olennaisesti -fysiologisesti siedetyissä vesiliuoksissa. Täten liukoinen huTFh ja liukoinen pre—huTFh ovat edelleen tunnettuja siitä, että niistä voidaan muodostaa vesiliuos käyttäen -fysiologisesti siedettävää laimenninta ja proteiinin pitoisuutena noin arvoa 0,1 pg/ml — 100 ng/ml, jolloin vähintään noin 70 paino-%, edullisesti noin 80 paino-7. ja edullisemmin noin 90 paino-% läsnäolevasta huTFh- tai pre—huTFh—proteiinista on ei-kasautuneessa (monomeerisessa) muodossa. Menetelmät protei i ni 1 i uoksessa läsnäolevan kasautuneen määrän määrittämiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä ovat esimerkiksi -fraktioihin jakaminen koon perusteella kromatografisesti ekskluusio- • kolonnia käyttäen.

Edullisessa liukoisessa huTFh-proteiinissa on kuviossa 1 esitetty aminohappojäännösten ketju noin aminopäätteen jäännöksestä 1 noin karboksipäätteen jäännökseen 209-224. Täten edullisia liukoisia huTFh-proteiineja ovat ne, joilla on kuviossa 1 esitetty aminohappojäännösten ketju noin jäännöksestä 1 noin jäännökseen 209, noin jäännöksestä 1 noin jäännökseen 214, noin jäännöksestä 1 noin jäännökseen 219 sekä noin jäännöksestä 1 noin jäännökseen 224.

Edullisessa liukoisessa pre-huTFh—proteiinissa on kuviossa 1 esitetty aminohappojäännösten ketju noin aminopäätteen jäännök— . 97813 27 sestä -32 noin karboksipäätteen jäännökseen 209-224. Täten edullisia liukoisia pre-huTFh-proteiineja ovat ne, joilla on kuviossa 1 esitetty aminohappojäännösten ketju noin jäännöksestä -32 noin jäännökseen 209, noin jäännöksestä -32 noin jäännökseen 214, noin jäännöksestä -32 noin jäännökseen 219 sekä noin jäännöksestä -32 noin jäännökseen 224.

Eräässä suoritusmuodossa ilmentyneet huTFh- ja pre-huTFh-tuotteet eivät ole glykosyloituneet, eli ne on tuotettu oheisen keksinnön mukaisella rDNA:11a transformoidussa prokariootti-sessa solussa. huTFh- ja pre-huTFh-proteiinin glykosyloitu-matonta muotoa voidaan käyttää immunogeenina sekä antigeeninä oheisen keksinnön mukaisessa diagnoosijärjestelmässä.

Eukarioottisessa solussa tuotetut huTFh- ja pre-huTFh-proteiinit ovat tyypillisesti glykosyloituneet ja ne ovat biologisesti aktiivisia sen lisäksi, että ne ovat antigeenisiä ja immunogeenisia. Ohessa käytetyllä käsitteellä "biologisesti aktiivinen" tarkoitetaan huTFh- tai pre-huTFh-proteiinia tai -polypeptidiä, joka kykenee indusoimaan tekijästä VII/VIIa riippuvaa hyytymistä.

Näin ollen oheisessa keksinnössä tarkastellaan valmistetta, joka käsittää biologisesti aktiivista huTFh-proteiinia, jossa ei ole olennaisesti ihmisen kudostekijässä kevyen ketjun muodostavaa proteiinia, sisältävän vesiliuoksen. Tämä valmiste ei myöskään sisällä olennaisesti sellaisia komponentteja kuten ionisia detergenttejä, esimerkiksi natriumdodekyylisulfaattia (SDS), polyakryyliamidia eikä kudoksesta peräisin olevia proteiineja, joiden ilmeinen molekyylipaino on vähemmän kuin noin 15 000 daltonia elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigee-lillä (SDS-PAGE) määritettynä.

huTFh-proteiinia sisältävät vesiliuokset sisältävät biologisesti aktiivista huTFh-proteiinia määränä, joka riittää verisuonijärjestelmästä otetun nestenäytteen, kuten veren tai verestä saatujen tuotteiden, esimerkiksi sitraatilla käsitellyn 97813 28 plasman, hyytymiskyvyn määrittämiseen. Käsitteellä "hyytymis-kyky" tarkoitetaan verisuonesta saadun nestenäytteen kykyä muodostaa hyytymä biologisesti aktiivisen huTFh—proteiinin läsnäollessa. huTFh—proteiinin tyypilliset pitoisuudet, jotka riittävät hyytymiskyvyn määrittämiseen, ovat noin 0,1 pg/ml -100 ng/ml, edullisesti noin 1 pg/ml - 10 ng/ml, ja edullisemmin noin 10 pg/ml - 1 ng/ml, kun näytteen ja huTFhrn väliset tilavuussuhteet ovat esimerkissä 2 esitetyn kaltaisia. Keksintö kohdistuu luonnollisestikin myös sellaisiin huTFh-proteiini a sisältäviin liuoksiin, joissa pitoisuudet ovat hyytymiskyvyn määrittämiseen tarvittavia pitoisuuksia suurempia, mutta jotka voidaan laimentaa edulliseen pitoisuuteen.

Edullisissa suoritusmuodoissa huTFh—proteiini a sisältävät vesi-liuokset käsittävät huTFh:n fosfol ipidi in tai ei-ioniseen de-tergenttiin di spergoi tuna. Fos-fol ipidin ja huTFh-protei inin tyypilliset painosuhteet ovat noin 5:1 - 12000:1, edullisesti noin 50:1 - 5000:1, ja edullisemmin noin 100:1 - 2500:1.

Kukin oheisen keksinnön mukainen polypeptidi käsittää korkeintaan noin 50, tavallisesti vähemmän kuin noin 35 ja edullisesti vähemmän kuin noin 25 aminohappojäännöstä, ja se käsittää vähintään noin 10 jäännöstä. Tämän lisäksi oheisen keksinnön mukaisten polypeptidi en tunnusomaisena piirteenä ovat niiden aminohappojäännösten ketju sekä uudet toiminnalliset ominaisuudet .

Täten, oheisen keksinnön mukaisen polypeptidin eräänä suoritusmuotona on huTFh:n sitorniskohdan käsittävä polypeptidi analogi, jonka tunnusomaisena piirteenä on osaksi sen kyky inhiboida täydellisesti huTF:n sitoutuminen veren hyytymistekijään VII/VIIa. Oheisen keksinnön mukainen sitorniskohdan käsittävä analogi sitoo edullisesti tekijän VII/VIIa aktivoitua kompleksia tällöin muodostamatta, eli hyytymistä käynnistämättä.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "kompleksi” tarkoitetaan spesifisen sitoutumisreaktion, kuten vasta-aineen ja antiqeenin tai reseptorin ja ligandin välisen reaktion tuotetta. Esimerkkeinä 97813 29 komplekseista mainittakoon immuunireaktion tuotteet sekä kudos-tekijän ja tekijän VII/VIIa välisen sitoutumisreaktion tuotteet, joista käytetään ohessa merkintää TF:VII/VIIa.

Edullisissa suoritusmuodoissa huTFh:n sitorniskohdan analogi käsittää vähintään seuraavan aminohappojäännösten ketjun: -VNQVYT-, joka edustaa aminohappojäännöksiä 30-35, kuten kuviossa 1 esitetään.

Edullisemmin, huTFhrn sitorniskohdan analogi käsittää vähintään yhden seuraavista aminohappojäännösten ketjuista: -VNQVYTVQIST- sekä -LYYWKSSSSGKKT-.

Nämä ketjut edustavat huTFh:n aminohappojaännöksiä 30—40 ja 155-167, vastaavasti, kuten kuviosta 1 todetaan.

Edelleen edullisemmin, huTFh:n sitorniskohdan analogi käsittää seuraavien ketjujen joukosta valitun aminohappojäännösten ketjun: -EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC-, —VFGKDLIYTLYYWKSS5SGKKT-, jotka edustavat aminohappojäännöksiä 26—49 sekä 146-167, vastaavasti , kuten kuviosta 1 todetaan.

Edullisia, huTFh:n sitorniskohdan polypeptidi analogeja ovat ne, joiden aminohappojäännösten ketju on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Ni mi tvs* Aminohappo jäännösten ketiu

p24—35 H-EWEPKPVNQVYT-OH

p26—49 H—EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC—OH

p144-159 H—RDVFGKDLIYTLYYWK—OH

p146-167 H—VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT-OH

p152-169 H-IYTLYYWKSSSSGKKTAK—OH

p157-169 H-YWKSSSSGKKTAK—OH

p161-189 H—SSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSV—OH

30 97813 * Kustakin polypeptidistä laboratoriossa käytetty nimitys edustaa kuvion 1 mukaista sisältyvää aminohappoJäännösten ketjua.

Polypeptidi en p26-49, pl46-167 ja pl61-189 tunnusomaisena piir— teenä on myös niiden kyky neutraloida (kilpailuun perustuva inhibitio) anti-huTFh-vasta-ainemolekyylien sitoutuminen huTFh-proteiiniin. Muita oheisen keksinnön mukaisia polypeptidejä, jotka kykenevät neutraloimaan anti—huTFh-vasta—aineiden sitoutumista huTFh-proteiiniin, on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 i

Ni mi tvs Aminohappojäännösten ketju

p1-30 H—SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV—OH

p40-71 H-TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY-OH

P41-49 H-KSGDWKSKC—OH

ρ5ώ-71 H-ECDLTDEIVKDVKQTY-OH

p72-1040- H-LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC-OH

Ρ94-123 H-YENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKV-OH

p190-209 H-QAVIPSRTVNRKSTDSPVEC-OH

* Laboratoriossa käytettyyn nimitykseen lisätty "C" tarkoittaa sitä, että kysteiinijäännös oli lisätty mainittuun ketjuun kytkijäksi proteiiniin konjugointia varten.

‘ Huomattakoon, ettei oheisen keksinnön mukaisen polypeptidin tarvitse olla täsmälleen samanlainen kuin aminohappoketju huTFh-proteiinissa, kunhan vain kyseiset polypeptidit kykenevät kilpailemaan luonnollisen kudostekijän kanssa sitoutumisesta tekijään VII/VIIa ja/tai kykenevät inhiboimaan ki1pai1 evästi anti-huTFh-vasta-ainemolekyylien sitoutumisen huTFh—proteii— niin. Näin ollen oheinen polypeptidi voi käsittää lukuisia muutoksia, kuten istutteita, häviämiä ja korvautumisia, jotka ovat joko ominaisuudet säilyttäviä tai säi1yttämättömiä, mikäli tällaisista muutoksista on jotakin etua polypeptidien käytölle.

!* m I Alit l i I M ; 97813 31

Ominaisuudet säilyttävä korvautuminen on sellainen, jossa yksi aminohappojäännös korvataan toisella, biologisesti samankaltaisella jäännöksellä. Esimerkkeinä ominaisuudet säilyttävistä korvautumisista voidaan mainita jonkin hydrofobisen jäännöksen, kuten isoieusiinin, valiinin, leusiinin tai metioniinin kor— vautuminen toinen toisinaan, tai jonkin polaarisen jäännöksen korvautuminen toisella polaarisella jäännöksellä, esimerkiksi arginiinin ja lysiinin, glutaamihapon ja aspartiinihapon tai glutamiinin ja asparagiinin välinen korvautuminen ja muut vastaavat. Käsite "ominaisuudet säilyttävä korvautuminen“ kattaa myös substituoituneen aminohapon käyttämisen alkuperäisen, substituoitumattoman aminohapon paikalla, edellyttäen, että tällaisella polypeptidi 11ä on myös välttämätöntä sitovaa aktiivi suutta.

Kun oheisen keksinnön mukaisessa polypeptidissä aminohappo-jäännösten ketju ei ole täysin samanlainen luonnollisen huTFh— ketjun kanssa yhdestä tai useammasta, ominaisuudet säilyttävästä tai säi1yttämättömästä korvautumisesta johtuen, niin tavallisesti korkeintaan noin 20 V. ja tavallisemmin korkeintaan 10 V. aminohapoista, niiden lukumäärästä laskien, on korvattu, lukuunottamatta sitä tapausta, jossa ylimääräisiä jäännöksiä on lisätty jompaan kumpaan päätteeseen "kytkijän" aikaansaamiseksi , jonka kytkijän avulla oheisen keksinnön mukainen poly— peptidi voidaan kiinnittää tarkoituksenmukaisesti merkki ainee— ' seen tai kiinteään matriisiin tai kantajaan. Merkkiaineet, kiinteät matriisit ja kantajat, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten polypeptidi en kanssa, kuvataan jäljempänä.

Aminohappojäännöksistä muodostuvat kytkijät ovat tavallisesti yhden jäännöksen pituisia ja niiden pituus voi olla 40 tai useampia jäännöksiä, niiden pituuden ollessa usein 1 - 10 jäännöstä. Tyypillisiä, kytkemiseen käytettyjä aminohappojäännöksiä ovat tyrosiini, kysteiini, lysiini, glutaamihappo ja aspartii-nihappo tai muut vastaavat. Tämän lisäksi tämän keksinnön mukainen polypeptidi ketju voi erota luonnollisesta ketjusta sellaisen muokkautuneen ketjun suhteen, jossa ketjussa päätteen NH2 on asyloitunut, esimerkiksi asetyloitunut, tai amidoitunut 97813 32 tioglykolihapol1 a, tai jossa päätteen karboksyyli on amidoitu-nut esimerkiksi ammoniakilla, metyyliamiini11 a, jne.

Kun oheisen keksinnön mukainen polypeptidi on kytketty kantajaan kytkijän välityksellä alalla kantajan ja hapteenin välisenä konjugaattina tunnetun kokonaisuuden muodostamiseksi, niin se kykenee indusoimaan huTFhrn kanssa immunoreaaoivia vasta-aineita. Immunologisen ristireaktiivisuuden hyvin vakiintunut periaate huomioon ottaen oheinen keksintö kohdistuu näin ollen myös taulukoissa 1 ja 2 esitettyjen polypeptidi en antigeenisestä samankaltaisiin muunnoksiin. "Anti geenisesti samankaltainen muunnos" on polypeptidi, joka käsittää taulukon 1 tai taulukon 2 mukaisesta polypeptidi stä vähintään kuudesta aminohappojäännöksestä muodostuvan ketjun osan, ja joka kykenee indusoimaan taulukon 1 tai 2 mukaisen polypeptidi n ja huTFh:n kanssa immuunireagoivia vasta—ainemolekyvlejä.

Oheisessa keksinnössä tarkastel1 aan myös valmistetta, joka käsittää huTFh:n sitorniskohdan polypeptidianalogia sisältävää vesiliuosta, jossa tämä polypeptidi on dispergoitu -fos-folipi — diin tai ei-ioniseen deterqentt i i n. Fos-f oi i pi di n ja polypeptidi anal opi n tyypillinen painosuhde on noin 5:1 - 200:1, edullisesti noin 30:1 — 80:1 ja edullisemmin noin 45:1 - 55:1. Edullisia huTFh:n sitorniskohdan polypeptidi analogeja, joita voidaan käyttää -f os-f oi i pi di i n di sperqoi tuna, on lueteltu taulukon 4 osassa II.

Oheisen keksinnön mukainen polypeptidi voidaan syntetoida millä tahansa polypeptidi ai an asiantuntijalle tutulla tekniikalla. Erinomainen yhteenveto monista käytettävissä olevista tekniikoista on löydettävissä teoksista J.M. Steward ja J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisko, 1969, sekä J. Meienho-fer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, sivu 46, Academic Press (New York), 1983, kiinteään -faasiin perustuvan pepti di synteesi n tapauksessa, sekä teoksesta E. Schroeder ja K. Kubke, "The Peptides", vol.l. Academic Press (New York), 1965, perinteisen, liuoksessa toteutetun synteesin tapauksessa.

97813 33

Ohessa käytetyllä käsitteellä "vasta-aine" ja sen erilaisilla kieliopillisilla muodoilla tarkoitetaan immunoglobu-liinimolekyylejä ja immunoglobuliinimolekyylien immunolo-gisesti aktiivisia osia, jotka molekyylit ovat vasta-aineen liittämiskohdan eli paratoopin sisältäviä molekyylejä. Esimerkkeinä vasta-aine-molekyyleistä mainittakoon täydelliset immunoglobuliinimolekyylit, olennaisesti täydelliset immunoglobuliinimolekyylit sekä immunoglobuliinimolekyylien ne osat, jotka sisältävät paratoopin, mukaan lukien alalla nimityksillä Fab, Fab', F(ab')2 ja F(v) tunnetut osat.

Oheisen keksinnön mukainen vasta-ainevalmiste on anti-pep-tidivasta-aine, joka on tunnettu siitä, että se sisältää huTFh:n ja vähintään yhden oheisen keksinnön mukaisen spesifisen polypeptidin kanssa immuunireagoivia vasta-ainemo-lekyylejä.

Esimerkiksi oheisen keksinnön mukainen vasta-ainevalmiste, joka sisältää huTFh:n sekä kudostekijän sitomiskohdan poly-peptidianalogin kanssa immuunireagoivia vasta-ainemolekyy-lejä, 97813 34 jotka eivät immuunireagoi olennaisesti peptidin p204-226 kanssa, kykenee neutraloimaan kudostekijän kykyä sitoa tekijää VII/VIIa. Täten edullisia vasta-ainevalmisteita ovat ne, jotka sisältävät huTFh:n sekä peptidin p26-49 tai pl46-167 kanssa immuunireagoi via vasta-ainemolekyylejä, ja jotka eivät immuuni-reagoi olennaisesti peptidin p204-226 kanssa.

Huomattakoon, että huTFhrta vastaan kehittyneet polyklonaaliset antiseerumit sisältävät vasta-aineita, jotka immuunireagoivat peptidin ρ204-22ό kanssa. Täten peptidiä p204-226 vastaan kohdistuvan immuunireaktiivisuuden olennainen puuttuminen on piirre, joka erottaa oheiset vasta-ainevalmisteet alalla jo kuvatuista valmisteista.

Oheisen keksinnön mukaista vasta-ainevalmi stetta tuotetaan tyypillisesti immunoimalla nisäkäs oheisen keksinnön mukaisella rokotteella, joka indusoi nisäkkäässä sellaisia vasta-ainemolekyylejä, joilla on asianmukaista immuunispesi-fisyyttä poly-peptidille. Tämän jälkeen vasta-ainemolekyylit otetaan talteen nisäkkäästä ja eristetään toivotussa määrin hyvin tunnetuilla tekniikoilla, kuten esimerkiksi kromatogra-f i sesti immuunia-f -f i — niteetin perusteella. Täten tuotettua vasta-ainevalmistetta voidaan käyttää mm. oheisen keksinnön mukaisissa diagnoosi-menetelmissä ja -järjestelmissä, joilla voidaan määrittää huTFh-protei ini ruumi innäytteestä.

Oheinen keksintö kohdistuu myös monoklonaalisiin vasta—aine-valmisteisiin. Monoklonaalinen vasta-ainevalmiste sisältää ilmaistavissa olevien rajojen puitteissa vain yhden tyyppistä vasta-aineen 1iittymiskohtaa, joka kykenee tehokkaasti sitomaan huTFh-proteiinia. Täten oheisen keksinnön mukaisella monoklo-naalisella vasta-ainevalmi steel 1 a on tyypillisesti vain yhtä huTFh-protei i ni i n kohdistuvaa sitovaa a-f-f i ni teetti a, vaikka se voikin sisältää vasta-aineita, jotka kykenevät sitomaan muita proteiineja kuin huTFh:ta. Eräässä suoritusmuodossa mono— klonaalinen vasta-ainevalmiste sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immuunireagoivat huTFh:n ja kudostekijän sitorniskohdan polypeptidi analogin, edullisesti polypeptidin p26-49 tai ρ14ό- 97813 35 167 kanssa.

Oheisen keksinnön eräs muu suoritusmuoto kohdistuu anti hyydyttäviin (neutraloiviin) MoAb-vasta-aineisiin, joiden sisältämät vasta-ainemolekyylit immuunireagoivat huTFh:n kanssa ja inhiboivat huTFh:n käynnistämää hyytymistä. Edullinen hyytymistä inhiboiva MoAb on lisäksi tunnettu siitä, että se immuunireagoi oheisen keksinnön mukaisen polypeptidin, edullisesti huTFhrn sitorniskohdan polypeptidianalogin, edullisemmin taulukossa 1 esitetyn polypeptidin kanssa.

Eräässä toisessa suoritusmuodossa anti hyydyttävä MoAb sisältää vasta-ainemolekyylejä, jotka immuunireagoivat huTFhsn sekä huTFhsn ja tekijän VII/VIIa välisen kompleksin kanssa ja inhiboivat (neutraloivat) huTFhsn käynnistämää hyytymistä. Edullinen anti hyydyttävä MoAb on lisäksi tunnettu siitä, että se immuunireagoi huTFh-proteiiniin liittyvän polypeptidin pl-30 tai p26-49 kanssa, ja ettei se edullisesti immuunireagoi huTFh-proteiiniin liittyvän polypeptidin p56-71 kanssa.

Oheisessa keksinnössä tarkastel1 aan samoin ei—neutraloivaa monoklonaalista vasta-ainevalmistetta, jonka sisältämät vasta-ainemolekyyl i t eivät neutraloi kudostekijän kykyä käynnistää hyytyminen. Tällainen valmiste sisältää edullisesti vasta-ainemolekyylejä, jotka immuunireagoivat hiTFh:n ja polypeptidin • pl-30 kanssa, ja joita hybridoma TF9-10H10 tuottaa (erittää).

Oheisen keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainevalmis-tetta voidaan tuottaa käynnistämällä monoklonaalinen hybridoma-viljelmä, joka käsittää vasta-ainemolekyylejä, jotka ovat asianmukaisesti spesifisiä pol ypepti di 11 e, erittävän hybridoman sisältävää elatusalustaa.

Viljelmää pidetään yllä sopivissa olosuhteissa ja sellaisen ajanjakson ajan, että hybridoma ehtii erittää vasta-ainemole-kyylejä alustaan. Tämän jälkeen vasta-aineita sisältävä alusta otetaan talteen. Tämän jälkeen vasta—ainemolekyyleiä voidaan eristää edelleen hyvin tunnetulla tekniikoilla.

97813 36 Näiden valmisteiden tuottamiseen käyttökelpoiset alustat ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on saatavana kaupallisesti, ja niihin kuuluvat esimerkiksi synteettiset vi1jelyalustat, sukusi itetyt hiiret ja muut vastaavat. Esimerkkinä synteetti-r sestä alustasta voidaan mainita Dulbecco:n olennainen vähim-mäisai usta CDMEM; Dulbecco et ai., Vi rol.. 8:396 (1959)1, johon on lisätty täydennökseksi 4,5 g/1 glukoosia, 20 mM glutamiinia ja 20 '/. si ki öastei sen vasikan seerumia. Esimerkkinä sukusiite— tystä hiirikannasta mainittakoon Balb/c. Edellä kuvatulla menetelmällä tuotettua monoklonaalista vasta-ainevalmistetta voidaan käyttää esimerkiksi diagnostiikassa ja hoitomenetelmissä, joissa huTFh—proteiinia sisältävän immuunireaktion tuotteen muodostuminen on toivottavaa.

Oheisen keksinnön mukaiset hybridomat ovat tunnettuja siitä, että ne tuottavat huTFh:n kanssa immuunireagoivia vasta-aine-molekyylejä. Edullinen hybridoma on lisäksi tunnettu siitä, että se tuottaa vasta—ainemolekyylejä, jotka inhiboivat huTFh:n käynnistämää hyytymistä ja jotka edullisesti immuunireagoivat oheisen keksinnön mukaisen polypeptidi n, edullisesti huTFh:n sitorniskohdan polypeptidianalogin, ja edullisemmin taulukossa 1 esitetyn polypeptidin kanssa. Edelleen muissa edullisissa suoritusmuodoissa anti hyydyttävä MoAb immuunireagoi muun korkeamman kädellisen eläimen kuin ihmisen TF:n kanssa.

Edelleen eräässä edullisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukainen hybridoma tuottaa vasta-ainemolekyylejä, jotka immuu— nireagoivat huTFhrn sekä huTFh:n ja tekijän VII/VIIa välisen kompleksin kanssa ja jotka neutraloivat huTFh:n käynnistämää hyytymistä. Hybridoman tuottamat vasta-aineet, jotka immuuni-reagoivat huTFhrn ja tekijän VII/VIIa välisen kompleksin kanssa, ovat edullisesti tunnettuja edelleen siitä, että mainitut vasta-ainemolekyylit kykenevät immuunireagoi maan huTFh-prote-iiniin liittyvän polypeptidin pl-30 tai p26—49, edullisesti molempien kanssa, ja edullisemmin että mainitut vasta-ainemole-kyylit eivät immuunireagoi poly-huTFh-polypeptidi n p56-71 kanssa.

97813 37

Menetelmät vasta-ainemolekyylejä, joilla on toivottua immuno-spesifisyyttä, eli jotka kykenevät immuunireagoimaan tietyn proteiinin ja/tai polypeptidin kanssa, tuottavien (erittävien) hybridomien tuottamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Erityisen käyttökelpoinen on hybridomatekniikka, joka on kuvattu julkaisussa Niman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:4949-4953 (1983). Edullisia hybridomia on esitetty esimerkin 13 taulukossa 5.

Hybridomaviljelmät TP8-5G9, TF9-6B4 ja TF9-10H10 on talletettu Budapestin sopimuksessa esitettyjen ehtojen mukaisesti kanta-kokoelmaan ATCC maaliskuun 27. päivänä 1987, ja niille annettiin seuraavat talletusnumerot, HB9382, HB9381 ja HB9383, vastaavasti .

Oheisen keksinnön mukainen, reagenssipakkauksena oleva diagnoosi järjestelmä sisältää vähintään yhteen määritykseen riittävän määrän oheisen keksinnön mukaista ilmentynyttä proteiinia, polypeptidiä, vasta-ainevalmistetta tai monoklonaalista vasta-ainevalmistetta erilleen pakattuna reagenssina. Järjestelmä sisältää tyypillisesti myös käyttöohjeet pakattua rea-genssia varten.

"Käyttöohjeet" käsittävät tyypillisesti selvän kuvauksen, josta ilmenevät reagenssin pitoisuus tai vähintään yksi määritysmenetelmän parametri, kuten keskenään sekoitettavan reagenssin ja näytteen suhteelliset määrät, reagenssia ja näytettä sisältävien seosten ylläpitoajat, lämpötila, pus-kuriolosuhteet ja muut vastaavat.

Edullisissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukainen diagnoosi järjestelmä sisältää edelleen merkkiainetta tai osoittajan, joka kykenee viestittämään reagenssilajeja sisältävän kompleksin muodostumisen.

38 97813

Ohessa käytetyillä käsitteillä "merkkiaine" ja "osoittaja" sekä niiden erilaisilla kieliopillisilla muodoilla tarkoitetaan yksittäisiä atomeja ja molekyylejä, jotka osallistuvat joko suoraan tai epäsuoraan i1maistavissa olevan, kompleksin läsnäolon osoittavan signaalin syntymiseen. "In vivo"-merkkiaineet tai osoittajat ovat sellaisia, joita voidaan käyttää ihmiskoh-teen elimistössä. Mikä tahansa merkkiaine tai osoittaja voidaan kytkeä tai sisällyttää ilmentyneeseen proteiiniin, polypepti-diin tai vasta—ainemolekyyliin, joka on osa oheisen keksinnön mukaista vasta-ainevalmistetta tai monoklonaalista vasta—aine-valmistetta, tai sitä voidaan käyttää erillisenä, ja näitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää yksinään tai yhdessä ' muiden reagenssien kanssa. Tällaiset merkkiaineet ovat sinänsä hyvin tunnettuja kliinisessä diagnoosikerniassa ja ne ovat tämän keksinnön osa ainoastaan sikäli, mikäli niitä käytetään yhdessä muuten uusien proteiinien, menetelmien ja/tai järjestelmien kanssa.

Merkkiaineiden kytkeminen, eli polypeptidi en ja proteiinien merkitseminen on alalla hyvin tunnettua. Esimerkiksi, hybri— doman tuottamat vasta-ainemolekyylit voidaan merkitä sisällyttämällä niihin aineenvaihdunnan avulla radioisotooppeja sisältäviä aminohappoja, joita on lisätty vi1jelyalustan komponenteiksi. Katso esimerkiksi julkaisu Galfre et ai., Meth

Enzymol.. 75:3—46 (1981). Erityisen käyttökelpoisia ovat tekniikat, joissa proteiini konjugoidaan tai kytketään aktivoitujen -f unkt i onaal i sten ryhmien avulla. Katso esimerkiksi julkaisut Aurameas, et ai-, Scand. J. Immunol., voi. 8, täyd. 7:7-23 (1978); Rodwel1 et ai., Biotech.. 3:889-894 (1984), sekä U5-patenttijulkai su 4 493 795.

Nämä diagnoosijärjestelmät voivat myös käsittää, edullisesti erillisenä pakkauksena, spesifistä sitovaa ainetta. "Spesifinen sitova aine" on molekyyliryhmä, joka kykenee sitomaan selektiivisesti oheisen keksinnön mukaisia reagenssi1ajeja, mutta joka itse ei ole oheisen keksinnön mukainen ilmentynyt proteiinituote, polypeptidi eikä vasta-ainemolekyyli. Esimerkkeinä spesifisistä sitovista aineista voidaan mainita vasta-ainemole- •I i - »Mih Silli liiddft : - 39 97813 kyylit, täydentävät vastinproteiinit tai niiden kappaleet, proteiini A, veren hyytymistekijä VII/VIIa, naudan kudostekijä ja muut vastaavat. Spesifinen sitova aine voi sitoa reagenssi-lajin edullisesti silloin, kun tämä laji on läsnä kompleksia osana.

Edullisissa suoritusmuodoissa tämä spesi-finen sitova aine on merkitty. Kuitenkin, mikäli tämä diagnoosijärjestelmä sisältää merkitsemätöntä spesifistä sitovaa ainetta, niin tätä ainetta käytetään tyypillisesti vahvistavana aineena tai reagenssina. Näissä suoritusmuodoissa tämä merkitty spesi-finen sitova aine kykenee sitomaan spesifisesti tämän vahvistavan aineen, mikäli tämä vahvistava aine on sitoutunut reagenssi1 ajia sisältävään kompleksi in.

Oheisen keksinnön mukaisia diagnostisia reagenssipakkauksia voidaan käyttää "ELISA"-määrityksessä huTFhrn läsnäolon tai määrän ilmaisemiseksi ruumiinnesteen, kuten seerumin, plasman tai virtsan näytteestä. "ELISA" tarkoittaa entsyymiin kytkettyyn immunosorbenttiin perustuvaa määritystä, jossa käytetään kiinteään faasiin sidottua vasta-ainetta tai antigeeniä sekä entsyymin ja antigeenin tai entsyymin ja vasta-aineen välistä konjugaattia näytteessä läsnäolevan antigeenin tai vasta-aineen ilmaisemiseksi ja sen määrän määrittämiseksi. Kuvaus ELISA-tekniikasta on löydettävissä teoksen D.P. Sites et ai., Basi c and Clinical Immunology. 4 laitos, kappaleesta 22 (julkaisija Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1982) sekä US-pa-tenttijulkaisuista 3 654 090; 3 850 752 ja 4 016 043, jotka kaikki liitetään oheen tällä viittauksella.

Näin ollen edullisissa suoritusmuodoissa oheisen keksinnön mukainen ilmentynyt proteiini, polypeptidi tai vasta—ainemole— kyyli voidaan kiinnittää kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi, joka kiinteä kantaja on pakattu erillisenä keksinnön kohteena olevassa diagnoosijärjestelmässä.

Reagenssi on tyypillisesti kiinnitetty kiinteään matriisiin adsorboimal1 a se vesipitoisesta väliaineesta, vaikkakin myös 97813 40 muita, alan asiantuntijalle tuttuja kiinnittämistapoja voidaan myös käyttää.

Tällaiset kiinteät matriisit ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaisia materiaaleja ovat esimerkiksi ristisidoksia käsittävä dekstraani, jota on saatavana tavaramerkkinä SEPHADEX yhtiöstä Pharmacia Fine Cemicals iPiscataway, NJ); agaroosi; polysty-reenihelmet, joiden halkaisija on noin 1 mikronista noin 5 millimetriin, ja joita on saatavana yhtiöstä Abbott Laboratories, North Chicago, IL; polyvinyylikloridi, polystyreeni, ristisidoksia käsittävä polyakryyliamidi, nitrosel1uloosaan tai nyloniin perustuvat rainat, kuten arkit, liuskat tai puikot; tai esimerkiksi polystyreenistä tai polyvinyylikloridista valmistetut putket, levyt tai mikrotiitterilevyn kolot.

Mihin tahansa ohessa kuvattuun diagnoosi järjestelmään kuuluva reagenssi1 aji, merkitty spesifinen sitova aine tai vahvistava reagenssi voi olla liuoksena tai nesteeseen dispergoituna tai olennaisesti kuivana jauheena, esimerkiksi lyo-f ilisoidussa muodossa. Mikäli osoittaja on entsyymi, niin diaanoosijärjestelmä voi myös käsittää erillisenä pakkauksena tämän entsyymin substraattia. Tämä diagnostisia määrityksiä varten tarkoitettu järjestelmä voi lisäksi sisältää kiinteän kantajan, kuten edellä kuvatun mikrotiitteri 1evyn, sekä yhden tai useampia pusku-„ reita erillisinä pakkauksina.

f

Ohesssa diagnoosijärjestelmi en yhteydessä mainitut pakkaukset ovat tavanomaisesti diagnoosijärjestelmissä käytettyjä pakkauksia. Tällaisia pakkauksia ovat esimerkiksi lasista ja muovista (esimerkiksi polyetyleenistä, polypropy1eenistä ja polykarbonaatista) valmistetut pullot, ampullit, muoviset ja muovi kelmulla päällystetyt kotelot ja muut vastaavat.

Oheisessa keksinnössä tarkastel1 aan kaikkia niitä menetelmiä, joilla saadaan ilmaistuksi huTFh tuottamalla oheisen keksinnön mukaisessa vasta-ainevalmisteessa tai monoklonaalisessa vasta-ainevalmisteessa läsnäolevaa ilmentynyttä proteiinia, poly-peptidiä tai vasta-ainemolekyyliä sisältävä kompleksi. Alan 97813 41 asiantuntijalle on selvää, että olemassa on lukuisia hyvin tunnettuja, kliinisiä, diagnostisia, kemiallisia toimenpiteitä, joita voidaan käyttää näiden kompleksien muodostamiseen. Täten, vaikka ohessa kuvataankin esimerkkejä tällaisista määritysmenetelmisä, niin keksintö ei kuitenkaan rajoitu niihin.

Erilaisia heterogeenisia ja homogeenisia määritysmenetelmiä, jotka perustuvat tai eivät perustu kilpailuun, voidaan käyttää huTFh:n läsnäolon ja edullisesti sen määrän määrittämiseksi ruumiinnäytteestä, edullisesti ruumiinnesteen näytteestä. Esimerkiksi nestemäistä ruumiinnesteen näytettä ja merkittyä polypeptidiä p26-49 sekoitetaan kiinteään kantajaan, joka käsittää hybridoman TF8-5G9 tai TF9-10H10 tuottamia vasta-ainemolekyylejä kiinnitettynä mikrotiitte-rilevyn kolojen sisäseinällään, jolloin saadaan aikaan kiinteän ja nestemäisen faasin käsittävä immuunireaktion seos. Tätä seosta ylläpidetään biologisen kokeen olosuhteissa sellaisen ajanjakson ajan, että näytteessä mahdollisesti läsnäoleva huTFh ja merkitty p26-49 ehtivät kil- 97813 42 pailla sitoutumisesta kiinteänä kantajana läsnäoleviin vasta-ainemolekyylei hi n ja muodostaa kiinteässä faasissa oleva immuunireaktion tuote. Tämän jälkeen sitoutumatta jäänyt merkitty p26-49 erotetaan immuunireaktion tuotteista. Sitten immuuni -reaktion tuotteeksi sitoutuneen merkityn polypeptidin ρ2ά-49 määrä määritetään, jolloin erotuksena saadaan mitta huTFhzn 1äsnäolosta.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on havainnollistaa oheista keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta.

Esimerkki 1

Kudostekijää sisältävän uutteen valmistaminen ihmisen aivoista

Ruumiinavauksesta saadut normaalit ihmisaivot joko käsiteltiin 12 tunnin sisällä tai niitä säilytettiin jäädytettyinä -SO °C:n lämpötilassa. Aivo— ja seikäydinkalvot (meninges) ja pikkuaivot (cerebellum) poistettiin ja aivojen loppuosa homogenoitiin yhtä suuressa tilavuudessa kylmää (0 °C) asetonia käyttäen Polytron-homogenisaattoria (Brinkman Instruments, Co., West-bury, N.Y). Tuloksena olevaan homogenaattiin sekoitettiin vielä 3 tilavuutta kylmää asetonia ja kudoksen kiintoaineesta muodostuva fraktio otettiin talteen suodattamalla käyttäen lasista sintterisuppi1oa. Asetoniin liukoista materiaalia uutettiin sintterille jääneestä kiintoaineesta vielä seitsemän kertaa, sekoittaen kiintoaine kulloinkin kahteen tilavuuteen kylmää asetonia ja suodattamalla tämän jälkeen. Viimeisen suodatuksen jälkeen jäännösasetonin annettiin haihtua sintteriin pidättyneestä kiintoaineesta ilmakehän paineessa yön aikana noin 20 eC:n lämpötilassa.

Sitten sintterille pidättynyt aivokudoksen kiintoaines uutettiin viiteen kertaan siten, että kiintoaineeseen sekoitettiin kulloinkin heptaanin ja butanolin 2:l-liuosta suhteessa 1 gramma kudoksen kiintoainesta 25 mi 11i1itrassa (ml) heptaani:-butanolia, minkä jälkeen seos suodatettiin kiintoaineen saamiseksi talteen. Viimeisen suodatuksen jälkeen aivokudoksen pidättynyt kiintoainesta kuivattiin jälleen yön yli noin 20 eC:n 97813 43 lämpötilassa ilmakehän paineessa, jolloin saatiin jauhemaista aivokudosta, josta lipidit oli poistettu, ja jota säilytettiin käyttöön saakka -80 eC:n lämpötilassa.

Tämän jälkeen 25 g jauhemaista aivokudosta sekoitettiin 500 ml:aan TS/EDTA-puskuria Cl 00 mi 11imol aarinen (mM) NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,02 V. natri umatsi di , 5 mM etyl eeni di ami i ni -tetraeti kkahappo (EDTA) , 0,1 7. (v/v) Triton X —100 (polyaryyli-etyleeni-9-oktyyl i-fenyyl ieetteri ) 3 ja saatua seosta sekoitettiin yön yli 4 eC:n lämpötilasa. Sitten seosta sentrifugoitiin nopeudella 15300>:g tunnin ajan. Tuloksena oleva kasauma sus-pendoitiin uudestaan 500 ml:aan A-puskuria C100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,02 7. natriumatsidi, 2 7. Triton X-100] lietteen muodostamiseksi. Sen jälkeen, kun lietettä oli sekoitettu tunnin ajan huoneen lämpötilassa, se sentrifugoiti in edellä esitetyllä tavalla. Tuloksena oleva supernatantti otettiin talteen, 1yofi1isoi ti in ja tehtiin myöhemmin liukoiseksi 100 ml:aan A-puskuria huTF—proteiinia sisältävän aivouuteliuok-sen muodostamiseksi.

Esimerkki 2

Hyytymiskoe huTF-proteiinin esi hyydyttävän aktiivisuuden määri ttämiseksi huTFh-proteiinin esi hyydyttävä aktiivisuus määritettiin yksi-‘ vaiheisessa hyytymiskokeessa, jonka aikana kaikkien reagenssien ja seosten lämpötila säilytettiin arvossa 37 eC. Ihmisen normaalin plasman seos sitratoitiin sekoittamal1 a 1 tilavuuteen plasmaa 1 tilavuus liuosta, joka sisälsi 20 mM natriumsitraatin dihydraattia ja 140 mM yhdistettä NaCl, pH 7,4. Sata mikrolit-raa näytettä, joka sisälsi huTF-proteiinia TBS/BSA-1iuoksel1 a (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 7. naudan seerumin albumiinia) laimennettuna, sekoitettiin 100 ui:aan sitratoitua plasmaa. Sitten tähän seokseen lisättiin 100 μΐ 25 mM CaCla-liuosta hyytymisreaktion seoksen muodostamiseksi, jota seosta pidettiin varovaisesti liikkeessä niin kauan, kunnes hyytyminen tapahtui. CaCl2-lisäyksen ja hyytymän muodostumisen välinen aika mitattiin. Sitten huTF:n aktiivisuudesta laaditiin stan- 44 97813 dardikäyrä piirtämällä laimennos sekuntteina mitatun hyytymis-ajan -funktiona. Esimerkki standardi käyrästä on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 3

Tekijää VII sisältävän kiinteän kantajan valmistaminen huTF:n eristämiseksi a-f -f ini teeti n perusteella

Ihmisen tekijä VII/VIIa eristettiin tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Fair, B1ood, 62:794—91 (1983), joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella. Tämä eristetty tekijä VII/-VI Ia aktivoitiin kiinteänä matriisina käytettyyn agaroosiin : kytkemistä varten di aiysoimal1 a 5 milligrammaa (mg) 0,1 M 2- (N—mor-f oi i i no) etaani sul-f oni happoa (MES) (pH 6,5) vastaan yön yli 4 °C:n lämpötilassa. Kaisiumklori di a lisättiin siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin 1 mM. Tämän jälkeen tekijään VII/VIIa sekoitettiin 4 ml aktivoituja agaroosi hei mi ä A-f-figel — 15 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) ja tuloksena olevaa kytkemisreaktion seosta jatkokäsitelti in pyörittämällä sitä 4 tuntia 4 eC:n lämpötilassa valmistajan (Biorad) suositusten mukai sesti.

Kiinteän kantajan pinnalla olevat liialliset, proteiinia sitovat kohdat salvattiin ravistelemalla kiinteätä kantajaa varovaisesti 0,1 M glysiinietyyliesterissä tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen kiinteä kantaja pestiin lasisen sintterisuppilon avulla peräjälkeen kulloinkin noin 20 ml:lla seuraavia liuoksia: (1) A-puskuri, (2) A-puskuri, joka sisältää 1 M NaCl , (3) A-puskuri, joka sisältää 5 mM EDTA sekä (4) A- puskuri, joka sisältää 1 mM yhdistettä CAC1 =,. Sitten ylimäärä nestettä poistettiin vakuumissa puolikuivan hiukkasmassan (kakun) muodostamiseksi.

Esimerkki 4 huTF: n eristäminen tekijään VII/VIIa kohdistuvan a-f-f i ni teet i n perusteel1 a il · · ia.» liiti lii i M ' 97813 45

Affigel-15-agaroosihelmiin (22,5 ml, Biorad) sekoitettiin 20 ml liuosta, joka sisälsi 0,1 li gl ysi i ni etyyl i esteri a ja 0,1 li MES-liuosta, pH 6,5, kytkentäreaktion seoksen muodostamiseksi. Tätä kytkentäreaktion seosta säilytettiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Tuloksena oleva konjugaatti pestiin lasisen sintterisuppi1 on avulla 4 kertaa 10 tilavuudella vakuumissa suodatettua puskuria 1 glysiinietyyliesteri-agaroosikakun muodostami seksi.

30 ml esimerkissä 1 valmistettua aivouutteen liuosta dialysoi-tiin yön yli 4 eC:n lämpötilassa 6 litraa A-puskuria, joka sisälsi 1 mli cal si umkl or i di a, vastaan. Dialysoitu aivouute : sekoitettiin glysiinietyyliesteri-agaroosikakkuun kiinteän ja nestemäisen -faasin käsittävän reakt i oseoksen muodostamiseksi. Sen jälkeen, kun reaktioseosta oli pidetty 2 tuntia huoneen lämpötilassa pyörittäen, kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin suodattamalla käyttäen lasista sintterisuppi1oa. Neste-faasi otettiin talteen ja siihen sekoitettiin tuotetta Trasylol (aprotiniini; Sigma Chemical Co-, St. Louis, MO) siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin 10 yksikköä/ml. Tämä talteenotettu nestefaasi sekoitettiin esimerkissä 3 valmistettuun, tekijää VII/VIIa ja agaroosia käsittävään kakkuun toisen, kiinteän ja nestemäisen faasin käsittävän seoksen muodostamiseksi.

Tätä seosta pidettiin yön yli 4 eC:n lämpötilassa ja sitä pyö- * ritettiin huTF—proteiinia ja tekijää VII/VIIa sisältävän, kiinteänä faasina olevan tuotteen muodostamiseksi. Tämän jälkeen kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin edellä esitetyllä tavalla suodattamal1 a. Lasiseen sintterisuppi1oon pidättynyt kiinteä faasi pestiin 25 ml :11a A-puskuria, joka sisältää 1 mM kaisiumklori di a. Sitten kiinteä faasi siirrettiin lasiseen sintrattuun kromatograf i akolonni in (0,5 15 cm; Biorad) ja se pestiin 6 ml :11a samaa pesupuskuria. Edellä mainittujen pesujen jälkeen kiinteään kantajaan mahdollisesti sitoutunut huTF irroitettiin (eluoitiin) pesemällä kiinteätä kantajaa, joka oli lasiseen sintrattuun kolonniin pidättyneenä, 5 mM EDTA sisältävällä A-puskuri11 a. Eluoituneesta materiaalista kerättiin 1 ml:n fraktioita ja kustakin fraktiosta määritettiin 97813 46 huTF:n läsnäolo esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. huTF-proteii-nia sisältävät -fraktiot yhdistettiin ja niitä dialysoitiin yön yli 4 ®C:n lämpötilassa 6 litraa TBS-liuosta (150 mM NaCl, 50 mM Tris—HC1, pH 7,5), joka sisälsi 1 7. tuotetta Triton X — 100, vastaan.

Tämän jälkeen muodostuneeseen di aiysaattiin sekoitettiin neljä tilavuutta kylmää asetonia huTF-proteiinin saostamiseksi. Sitten sakka otettiin talteen sentri-f ugoimal la nopeudella 5000 x g 30 minuutin ajan arviolta -10 ®C:n lämpötilassa. Tuloksena oleva kasauma kuivattiin typpi-i1makehässä. Tyypillinen saanto oli 2 ug huTF-proteiinia grammassa (kuivapaino) jauhemaista ' aivokudosta, josta lipidit oli poistettu.

Täten eristetystä huTF-proteiinista saatu näyte susoendoitiin TBS/Triton—1 iuokseen ja sitten se merkittiin isotoopilla Nax:2=I (Ιό mikrocurieta mikrogrammaa kohden, Amersham, Arlington Heights, IL) käyttäen jodogeenia valmistajan (Pierce Chemical Co., Rock-ford, IL) ohjeiden mukaisesti. Merkitsemisen jälkeen liiallinen, reagoimatta jäänyt l2sI erotettiin merkitystä huTF-protei ini sta poistamalla suolat kromatogra-f i sesti Sephadex G-25-kolonni 11 a (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) käyttäen TBS/-Tri ton-1i uosta.

Isotoopilla xasI merkittyä huTF-proteiinia sisältävät nävtteet '1 arvioitiin el ektrof oreetti sesti natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi geeliä (SDS-PAGE) tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Laemmli, Nature. 227:680-685 (1970). Näytepuskuriin sisällytettiin pitoisuudeksi 100 mM ditiotreitoiia (DTT, Sigma) niiden näytteiden tapauksessa, jotka arvioitiin pelkistävissä olosuhteissa. Immuunisaostaminen toteutettiin inkuboimalla l=ssI-huTF-protei inia ja TF8-559- tai PAb 100-hybridoman (ATCC TIB 115; hybridoma, joka tuottaa SV40-viruksen suurelle T-anti-geeni lie spesi-fistä ja ohessa negatiivisena vertailuna käytettyä vasta-ainetta) viljelmän supernatanttia (tilavuus 1/10 liuoksen tilavuudesta) yön yli 4 *C:n lämpötilassa liuoksessa, joka sisältää 1 7. Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl. Tämän jälkeen agaroosihei miin immobi1isoitua vuohen . 97813 47 anti-hiiri IgG:tä käytettiin immuunireaktion varsinaisten tuotteiden adsorboi mi seksi. Helmet pestiin huolellisesti samalla puskurilla ja sitoutunut 12SI-huTF eluoitiin keittämällä 5 minuuttia näytepuskur i ssa DTT: n kanssa tai ilman sitä. Proter-iinivyöhykkeet saatiin SDS-PAGE—käsittelyn jälkeen näkyviin auto-f 1 uorogra-f i sesti .

Kun eristettyyn huTF-proteiiniin liitettiin radioaktiivista jodia, kun se pelkistettiin DTTzllä ja analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä käyttäen 10 7. akryyliamidigeelejä, niin tällöin todettiin yksi ainoa pääasiallinen vyöhyke, jossa ilmeinen molekyylipaino oli 47 kD (kuvio 4). Kuitenkin, kun pelkistämä-tön huTF—proteiini analysoitiin samalla tavalla, niin tällöin saatiin kaksi arviolta 5B ja 47 kD:n vyöhykettä, joiden runsaus oli suhteellisen samansuuruinen (kuvio 5, ura B), mistä voidaan päätellä vähintään kahden erikokoisen muodon läsnäolo.

Mahdollinen selitys sille, että ilman pelkistämistä saatiin kaksi vyöhykettä, voisi olla, että suurempi, eli hitaammin liikkuva, vyöhyke on voimakkaammin glykosyloitunut, sisältää lisäksi muokkaamatonta proteiinia tai voi olla liittynyt muihin, disul-fidisidoksen avulla kytkeytyneisiin polypeptideihin. Vain yhden vyöhykkeen läsnäolo pelkistämisen jälkeen ei ole yhtäpitävää kahden ensimmäisen oletuksen kanssa. Viimeinen mahdollisuus vaikuttaa todennäköisimmältä, mutta pienistä koko-eroista johtuen ylimääräiset polypeptidi ketjut olisivat todennäköisesti riittävän pieniä kulkeutuakseen väririntaman mukana tai sen läheisyydessä, ja ne eivät erottuisi lO 7. akryyl i ami di — geeleissä pelkistämisen jälkeen. Pelkistetyn ja pelkistämättö— män huTF:n elektrof oreesi ssa 15 7. pol yakryyl i ami di geel ejä käyttäen ei kyetty toteamaan yhden erillisen kevyen ketjun läsnäoloa, vaikka tällöin havaittiinkin useita vähäisiä, nopeasti liikkuvia vyöhykkeitä (kuvio 5, urat A ja B). Nämä pienet, vähäiset polypeptidit saattavat edustaa kontaminoivia ketjuja, joita on havaittu aikaisemmin EBroze et ai., J. Bioi. Chem.. 260;10917—20 (1985) sekä Guha et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA. 83:299-302 (1986)1. Jotta nämä mahdollisuudet saataisiin erottumaan selvästi, 47 kD:n ja 58 kD:n vyöhykkeet leikattiin 48 irti pelkistämättömästä geelistä ja kumpikin niistä pelkistettiin ditiotreitoii11 a ja ne käsiteltiin toisistaan erillään el ektro-f oreetti sesti (SDS-PAGE) 15 V. akryyl i ami digeel i 11 ä (kuvio 5, urat C ja D). 58 ki1odaltöni n proteiini erosi 12,5 kD:n kevyeksi ketjuksi ja 47 kD:n raskaaksi ketjuksi. 47 kD:n proteiinia tarkasteltaessa todettiin ainoastaan molekyylipai-noitaan sama raskas ketju. Näin ollen molemmat muodot käsittivät raskaan ketjun, jotka käyttäytyivät samankaltaisesti SDS-PAGE— käsittelyssä.

Jotta kevyen ketjun läsnäolo saataisiin osoitetuksi suoraan, niin 13=I—huTF immuuni seostettiin huTF:lle spesifisellä mono-klonaalisei1 a vasta-aineella TF8-5G9 ja käsiteltiin elektro-foreettisesti pelkistävän aineen läsnäollessa. Pääasiallinen 47 kD:n vyöhyke havaittiin yhdessä erillisen, arviolta 12,5 kD:ta vastaavan vyöhykkeen kanssa (kuvio 6, ura A). Kun näyte käsiteltiin el ektro-f oreetti sesti ilman edeltävää pelkistämistä, niin tällöin saatiin arviolta 47 kD:ta ja 58 kD:ta vastaavat vyöhykkeet, muttei molekyylipainoltaan pienemmän polypeptidin vyöhykettä (kuvio 6, ura B). Pelkistämättömän huTF-proteiinin elektroforeesista saatiin myös pieniä määriä 90 kD:n proteiinia, joka on yhtäpitävä huTF:n raskaan ketjun dimeerin kanssa. Tällainen dimeeri on ehdotettu julkaisussa Bronze et ai., J. Biol. Chem.. 260:10917-20 (1985).

Jotta voitaisiin tutkia sitä mahdollisuutta, että huTF:n kevyt ketju on peräisin proteolyyttisesti raskaasta ketjusta, niin amnohappojäännösten järjestys SDS-PAGE-menetelmäl1ä eristetyn kevyen ja raskaan ketjun N-päätteessä määritettiin.

Raskas ja kevyt ketju erotettiin SDS-PAGE-menetelmäl1ä ja niistä muodostettiin sähköisesti täplä aktivoiduille, aminojohdan-naiseksi muunnetuille 1asikuitusuodattimi 11 e käyttäen suureen pH-arvoon perustuvaa menetelmää julkaisusta Abersold et ai., J. Bi oi. Chem.« 261:4229—4258 (1986). Suodatti mi 11 a olevat protei ini vyöhykkeet saatiin näkyviin -f 1 uoresenssi värjäyksen avulla (Abersold et ai., edellä), ne leikattiin irti ja jär— jestys niissä määritettiin vyöhykkeiden ollessa edelleen lasi- f· ·· ( «lii lit*·- 97813 49 kuituun sitoutuneena yhtiön Applied Biosystems järjestyksen määrittävällä 470Α-Ϊnstrumenti11 a, joka oli yhdistetty suoraan ("on-line") PTH-johdannaiSten HPLC-analyysiin. Vaihtoehtoisesti, proteiinivyöhykkeet saatiin näkyviin geelillä värjäämällä ne Coomassie-sinisei1ä ja ne eluoitiin sähköisesti järjestyksen määrittämistä varten. Molemmilla menetelmillä saatiin vastaavat tulokset.

huTF-proteiinin raskaan ketjun järjestyksen yksityiskohtainen määrittäminen johti jatkuvasti kahteen samanaikaiseen amino-happoketjuun karkeasti ottaen yhtä suurina moolimäärinä. Lähes kaikissa tapauksissa kukin aminohappojäännös esiintyi kaksi kertaa, kahden jakson päässä toisistaan. Tämä on selvä osoitus porrastuneista N-päätteistä huTF:n raskaan ketjun kahdessa muunnoksessa, jotka raskaat ketjut eroavat toisistaan pituuden suhteen N—päätteessä sijaitsevan kahden jäännöksen verran. Suuremman muunnoksen N—päätteeksi pääteltiin Ser—G1y-X-X—Asn— Thr Val-Ala-Ala—Tyr—X—Leu-Thr—Trp—Lys—Ser, missä X tarkoittaa täsmentämätöntä aminohappojäännöstä.

Järjestys kevyessä ketjussa yritettiin määrittää useita ker— toja, mutta näistä yrityksistä ei saatu lainkaan järjestykseen liittyvää tietoa, mikä on yhtäpitävää suojatun N-päätteen kanssa. huTF-proteiinin raskas ja kevyt ketju ovat kuitenkin antigeeni sesti erilaisia, sillä kaniinin kahden anti-huTF-anti-seerumin ja hiiren 28 monoklonaalisen vasta—aineen, jotka oli kehitetty eristettyä huTFh:ta vastaan, todettiin sitoutuvan pelkästään raskaaseen ketjuun. Näin ollen on epätodennäköistä, että kevyt ketju on raskaan ketjun proteolyyttinen kappale. Tämän lisäksi kevyt ketju ei reagoinut beetaa—mikroglobuliinia vastaan kehittyneen antiseerumin kanssa.

huTF-proteiinin kevyen, 12,5 kD:n ketjun merkitys on tällä hetkellä tuntematon. On epätodennäköistä, että se on muodostunut eristämisen aikana muokkautumalla satunnaisten disul-fidi-vaihtojen seurauksena, koska se on yksi ainoa erillinen molekyyli laji. Kun a-f-f ini teetin perusteella eristetty huTF käsiteltiin SDS—PAGE—menetelmäl1ä sitä pelkistämättä, niin huTF— 97813 50 aktiivisuus el noitui geeleistä sekä molekyylipainoltaan 5Θ kD:n muotoa että molekyylipainoltaan 47 kD:n muotoa vastaten.

Näitä kahta molekyylipainoa edustavia muotoja vastaavaa huTF— aktiivisuutta saatiin myös ilmaistuksi, kun aivojen raakauu— * tetta tai kohdusta osittain eristettyä uutetta käsiteltiin elektro-foreettisesti SDS-geel ei 11 ä (tietoja ei ole esitetty). Näissä kaikissa tapauksissa aktiivisuus riippui tekijästä VII, mikä on osoituksena huTF-spesi-fisestä aktiivisuudesta. Nämä havainnot osoittavat, että pelkkä huTFh kykenee aktivoimaan tekijän VII, ja ettei kevyttä ketjua tarvita tähän tehtävään.

On mielenkiintoista, että kevyt ketju on sitoutunut disul-fidi-sidoksi11a ainoastaan noin puoleen huTF:n raskaista ketjuista. Se joko puuttuu in vivo huTF—proteiinin merkittävästä osasta tai sitä on läsnä ei —kovalenttisi 11 a vuorovaikutuksilla liittyneenä, jotka vuorovaikutukset voidaan katkaista detergentei1-lä. huTF—proteiinin kevyt ketju on saattanut jäädä huomaamatta aikaisemmissa tutkimuksissa, koska sen pieni koko voi johtaa kulkeutumiseen väri rintaman mukana SDS-PABE-määrityksessä, ja koska huTF:n julkaistut analyysit on toteutettu pelkistämisen jälkeen. Ne rajalliset määrät, jotka saadaan eristetyiksi nykyisillä a-ffiniteettiin perustuvilla menetelmillä, vaikeuttavat ohessa seuraavan pienen polypeptidi ketjun ilmaisemista proteiini värjäyksen avulla.

Vaikka monomeerinen huTF käynnistääkin hyytymistä in vitro, niin huTF:n aiheuttama hyytymisen -fysiologinen käynnistyminen tapahtuu solujen pinnalla. Nyt saatetaan spekuloida, että kevyellä ketjulla on hienompi merkitys huTF:n toiminnassa tai järjestäytymisessä kuin mikä voidaan ilmaista yksinkertaisessa hyytymiskokeessa. Kevyt ketju voi esimerkiksi osallistua tekijän VII kaksi alayksikköä käsittävän reseptorin kokoamiseen, minkä on esitetty selittävän tekijän VII/VIIa sitoutumisessa kudostekijään havaitun ilmeisen positiivisen yhteistyökyvyn. Vaihtoehtoisesti, huTF-proteiinin järjestäytyminen rakenteellisiksi domeeneiksi solun pinnalla ja huTF-aktiivisuuden säätely solun pinnalla voi olla huTF-proteiinin kevyen ketjun välittä- (Hää * 97813 51 N-kytkeytyneiden oligosakkaridien merkitys selvitettiin degly-kosyloimalla 13=lI-huTF-näyte. Noin 12,74 nanogrammaa (ng) mer— kittyä huTF-proteiinia, Joka sisälsi arviolta 3,6 x 10s laskettua impulssia minuutissa (cpm), sekoitettiin 20 plsaan liuosta, Joka sisälsi 0,4 yksikköä glykopeptidaasia F (Boeh— ringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 20 md Tris-HC1 (pH 7,5), 10 md EDTA sekä 1 V. Triton X—100, ja tämän Jälkeen seosta pidettiin 16 tuntia 37 *C:n lämpötilassa. Deglyko— syloidut tuotteet analysoitiin sitten SDS—PAGE-menetelmäl1ä aikaisemmin kuvatulla tavalla.

Näistä deglykosylaatioon perustuvista tutkimuksista saadut, kuvion 7 urissa 4 Ja 5 näkyvät tulokset osoittavat, että 58 kD:ta vastaavan huTF—muodon suhteellinen molekyylipaino on suurempi 47 kD:ta vastaavaan muotoon verrattuna, koska siinä on läsnä ylimääräisiä proteiiniryhmiä, eli kevyt ketju.

Täten eristetty huTF lipidoitiin uudestaan sen esi hyydyttävän aktiivisuuden palauttamiseksi. Se kudostekijän ja lipidin välinen suhde, joka tarvitaan uudestaan lipidoidun, aktiivisuudeltaan mahdollisimman suuren kudostekijän aikaansaamiseksi, määritettiin empiirisesti liuottamalla edellä saatua eristettyä huTF-proteiinia erilaisina pitoisuuksina HBS-puskuri1luokseen (20 md Hepes, pH 6,0, 140 md NaCl, 0,01 7. natriumatsidi) , joka sisältää 0,1 7. BSA—protei i ni a. Nämä erilaiset huTF-laimennokset * lipidoitiin sitten uudestaan jäljempänä kuvatulla tavalla ja se suhde, joka tuotti suurimman taiteensaadun aktiivisuuden esimerkissä 2 kuvatulla hyytymiskokeella määritettynä, valmistettiin myöhempää käyttöä varten.

Lipidit, joilla huTF lipidoitiin uudestaan, valmistettiin uuttamalla kaniinin aivoista asetonilla saadusta jauheesta, jota saatiin yhtiöstä Sigma Chemical Co., St. Louis, dO. Tämä jauhe sekoitettiin heptaanin ja butanolin 2:1—seokseen (v/v) suhteessa 25 ml heptaani—butanoli—seosta yhteen grammaan jauhetta, ja täten saadun seoksen sisältämä kiintoaines otettiin talteen suodattamal1 a käyttäen lasista sintterisuppi1oa. Tämä uutto-prcsessi toistettiin 6 kertaa suodattimel1 e pidättyneellä 97813 52 kiintoaineella. Sitten pidättynyt kiintoaines kuivattiin pyörö— haihduttajalla, liuotettiin kloroformi in ja sitä säilytettiin -BO *C:n lämpötilassa. Osia kloroformi in liuotetusta kiintoaineesta kuivattiin tarpeen mukaan typpi-i1makehässä ja liuotettiin pitoisuudeksi 4 mg/ml natriumdeoksikoiaatin juuri valmistettuun 0,25 V. liuokseen kaniinin aivoista peräisin olevien fosfoiipidi en (RBPL) liuoksen muodostamiseksi.

Lipidointia varten 100 plraan kutakin huTF-1aimermosta sekoitettiin 100 μΐ RBPL-1iuosta, 0,76 ml HBS-liuosta, joka sisälsi 0,1 % naudan seerumin albumiinia (HBS/BSA), sekä 40 μΐ 100 mM kaisiumklori di 1luosta. Tätä seosta pidettiin 37 eC:n lämpö-• tilassa 2 tuntia ja sen sisältämä huTF—aktiivisuus määritettiin esimerkissä 2 kuvatulla hyytymiskokeella.

Es i mer k k i 5

Hybridomien ja monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen

Kaikki hybridomat tuotettiin käyttäen tutkimuslaitoksen Scripps Clinic and Research Institute eläinkokoelmasta saatujen, naaraspuolisten, 6—8 viikon ikäisten Balb/c—hiirten pernasoluja.

a. TF8-hiiren immunointi

Viisi mikrogrammaa (ug) esimerkissä 4 valmistettua, affiniteetin perusteella eristettyä huTF-proteiinia liuotettiin nor— maaliin suolaliuokseen pitoisuudeksi 100 ug/ml, tämä liuos yhdistettiin suhteessa 1:1 (v/v) yhtiöstä Ribi Immunochem

Research, Inc., Hamilton, MO, saatuun R—700-apuaineeseen ja seos emulgoitiin tämän jälkeen. Sitten tätä emulsiota injektoitiin ihon alaisesti (s.c.) TFS—hiireen.

TF8-hiiri rokotettiin samalla tavalla noin kaksi viikkoa myöhemmin käyttäen denaturoitua huTF-proteiim a ja R-700-apuai-netta sisältävää emulsiota. Denaturoitu huTF valmistettiin keittämällä 5 minuuttia TBS-1iuoksessa C150 mM CaCla, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)1, joka sisälsi 0,09 V. Triton X—100, 0,93 V. SDS, 0,2 M 2-merkaptoetanolia ja huTF-proteiinia pitoisuutena 270 μα/ml. Sitten denaturoitu huTF sekoitettiin yhtä suureen 97813 53 tilavuuteen normaalia suolaliuosta, joka sisälsi 0,6 mg/ml hiiren seerumin albumiinia. Tämän jälkeen 4 tilavuutta asetonia sekoitettiin denaturoidun huTF:n liuokseen ja tuloksena olevaa seosta säilytettiin yön yli -20 eC:n 1ämpöti1assa. Tuloksena oleva sakka otettiin talteen sentrifugoimal1 a sitä noin nopeudella 13000 x g 10 minuuttia, se pestiin kerran asetonin ja veden 4:1 (v/v>-1iuoksel1 a ja suspendoitiin sitten 200 pl:aan normaalia suolaliuosta pitoisuudeksi 0,1 mg/ml.

Noin neljä viikkoa alustavan injektion jälkeen 33 pg:aan affiniteetin perusteella eristettyä (denaturoimatonta) huTF-prote-iinia 0,1 ml:ssa normaalia suolaliuosta sekoitettiin 0,1 ml ; Freund:in täydellistä apuainetta (CFA) emulsion muodostami seksi. Sitten tätä emulsiota injektoitiin vatsaontelon sisäisesti (i.p.) TFS-hiireen.

Noin kahdeksan viikkoa alustavan injektion jälkeen injektoitiin suonen sisäisesti (i.v.) 15 pg affiniteetin perusteella eristettyä huTF-proteiinia fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja samanlainen huTF/PBS—rokoteannos annettiin i.v. 24 tuntia myöhemmin. TF8-hiiren pernasolut otettiin talteen kolmen vuorokauden kuluttua yhteensulauttamista varten.

b. TF9-hiiren immunointi

Hiiri TF9 immunoitiin rokottamalla samalla tavalla kuin hiiri TF8, paitsi että molemmissa Ribi-apuainetta käsittävissä injektioissa käytettiin huTF—proteiinia, joka oli denaturoitu ennen emulgointia. Tämän lisäksi ensimmäinen PBS-rokoteannos annettiin i.p. ja 4,5 kuukautta CFA:ta sisältävän rokoteannoksen antamisen jälkeen.

c. Hybridoman muodostaminen

Samaa menetelmää yhteensulauttamiseksi käytettiin sekä TF8-että TF9-hiiristä peräisin olevien pernasolujen tapauksessa. Noin 1x10® pernasolua kustakin hiirestä sekoitettiin 2::107, P3X63 Ag8.653.1—myeloomasoluun 200 pl:ssa fuusioväliainetta, joka käsitti 30 7. w/v pol yetyl eeni gl ykol i a (PE5 4000, ATCC 25322—68—3). Sen jälkeen, kun solut olivat sulautuneet yhteen.

54 97813 tuloksena olevat hybridomat siirrettiin 96 koloa käsittäville levyille, niitä viljeltiin HAT-alustassa (hypoksantiini, amino-pteriini ja tymidiini), minkä jälkeen ne seulottiin sen suhteen, kykenivätkö ne tuottamaan huTF:n kanssa reagoivia vastasi nemolekyy1e jä.

Sekä TF8- että TF9-hiiren pernasoluihin perustuvat yhteensu-1 aumat johtivat HAT-alustassa vastustuskykyisiin hybridoma-solujen klooneihin. TF8-yhteensulauma tuotti 907 HAT-vastustus-kykyistä hybridomaa kun taas TF9—yhteensulauma tuotti 348 HAT— vastustuskykyistä hybridomaa.

Esimerkki 6

Hybridomien seulominen anti—huTF—vasta—ainemolekyylien tuotannon suhteen

a. Kiinteään -faasiin perustuva Rl A

100 μΐ vuohen anti-hiiri IgG:tä, joka oli laimennettu pitoisuudeksi 20 pg/ml TBS-1iuoksel1 a, sekoitettiin taipuisasta vinyylistä valmistettujen, 96 koloa käsittävien Immulon—mikro-tiitteri1evyn koloihin (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) . Sitten näitä levyjä pidettiin 1 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, jotta IgG kykenisi adsorboitumaan kolojen seinämiin. Kolot pestiin kolmeen kertaan TBS-1iuoksel1 a, minkä jälkeen kuhunkin koloon laitettiin 100 μΐ TBS/Triton-seosta, joka sisälsi 3 7. ovalbumi i ni a, liiallisten proteiinin sitoutumiskohtien saipaamiseksi.

Koloja pidettiin tunnin ajan noin 20 °C:n 1ämpöti1assa, minkä jälkeen salpaava liuos poistettiin imulla. Kuhunkin koloon sekoitettiin 50 μΐ hybridomavi1jelmän supernatanttia. Tuloksena olevaa, kiinteän ja nestemäisen faasin käsittävää immuunireaktion seosta pidettiin 37 °C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan. Sitten kolot huuhdottiin kolmasti TBS-1iuoksel1 a ja liiallinen neste poistettiin imulla.

Kuhunkin koloon sekoitettiin 50 ui esimerkissä 4 valmistettua, 13=I-merkittyä huTF-proteiinia, joka sisälsi noin 1 ng huTF- B 1 a : 1 lllii lii** i l s 97813 55 proteiinia sekä arviolta 5x10s cpm TBS/Triton-seosta, kiinteän faasin ja nestemäisen faasin käsittävän toisen immuunireaktion seoksen muodostamiseksi, koloja pidettiin 2 tuntia 37 *C:n lämpötilassa ja sitten ne huuhdottiin kolmeen kertaan TBS/Triton-seoksel1 a kiinteään faasiin sitoutuneiden, iaaI-huTF—proteiinia sisältävien immuunireaktion tuotteiden eristämiseksi. Liiallinen neste poistettiin imulla ja kolojen annettiin kuivua. Kukin kolo leikattiin toisistaan erilleen ja kunkin kolon sisältämä *2=I määritettiin gammalaskuri11 a.

Taustan radioaktiivisuus (ei reaktiota huTF:n ja vasta—aineen välillä) oli keskimäärin noin 200—300 cpm koloa kohden, kun ; taas huTF:n ja vasta-aineen väliset positiiviset reaktiot tuot tivat 10000 cmp koloa kohden. Hybridomat, jotka todettiin kokeellisesti positiivisiksi anti—huTF—vasta-aineiden tuotannon suhteen, valittiin ja ne muodostavat oheisen keksinnön mukaiset hybridomat. Tämän jälkeen nämä hybridomat seulottiin alla esitetyllä tavalla pistemäisiin täpliin perustuvalla kokeella.

b. Pistemäisiin täpliin perustuva ELISA

Esimerkissä 4 valmistettu, asetonilla saostettu huTF uutettiin kahdesti asetonin ja veden 4:1-seoksel1 a (v/v). Jäljelle jäänyt sakka suspendoitiin uudestaan pitoisuudeksi 20 ug/ml TBS-liuok-seen. Tästä huTF-Ιiuoksesta otettiin 20 ng (1 ui), joka istutettiin BA83-nitrosel1 uioosapaperi11 e (Schleicher ja Schuell, Keene NH) sille liukenemattomalla musteella kirjoitetun numeron viereen. huTF-täplä kuivattiin ilmassa, minkä jälkeen erilliset täplät leikattiin rei’ityslaitteel1 a paperiympyröiksi. Erilliset paperi ympyrät upotettiin monikoloisen levyn erillisiin, BL0TT0-1iuosta sisältäviin koloihin CJohnson et ai., Gene.

Anal Tech. . 1_:3 (1934)1 ja niitä pidettiin 37 eC:n lämpötilas sa noin 1 tunnin ajan.

BLOTTO poistettiin koloista imulla, minkä jälkeen kuhunkin koloon lisättiin 200 μΐ hybridomavi1jelmän suDernatanttia. Sitten koloja pidettiin 37 °C:n lämpötilassa 2 tuntia. Paperi-ympyrät huuhdottiin kahdesti TBS-1iuoksel1 a, poistettiin koloista ja yhdistettiin yhteen suurempaan astiaan niiden huuhto- 97813 56 mi seksi vielä kerran TBS-1iuoksel1 a. Sitten liiallinen neste poistettiin säiliöstä.

Alkaliseen -fos-fataasiin konjugoitu anti-hiiri IgG, jota Proto-blot-reagenssipakkaus (Promega Biotech, Ann Arbor, MI) käsittää, laimennettiin suhteessa 1:5700 BL0TT0-1iuoksel1 a ja saatettiin kosketukseen paperi ympyröiden kanssa. Tätä Protoblot-liuosta pidettiin kosketuksessa ympyröiden kanssa 37 eC:n lämpötilassa 30 minuuttia. Sitten paperi ympyrät huuhdottiin kolmasti TBS-1 iuoksel 1 a. Sitoutunut alkalinen -fos-fataasi ilmaistiin paperi ympyröistä käyttäen Protoblot—reagenssipakkauksen sisältämiä kromogeenisi a substraatteja valmistajan ohjeiden ! mukaisesti.

c. Westernln täpliin perustuva määritys

Westermin täpliin perustuvaa määritystä varten noin 10 pg esimerkissä 4 kuvatulla tavalla eristettyä huTF—proteiinia liuotettiin näytepuskur i i n (2 7. SDS, 50 mM di ti otrei toi i a, 10 7. glyserolia, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8) ja keitettiin 5 minuuttia. Sitten tämä liuos käsiteltiin elektro-foreettisesti SDS— polyakryyliamidigeeli11ä käyttäen preparatiivista levymäistä geeliä tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Laemmli, Nature. 226:680 (1970), jotka menetelmät liitetään täten oheen tällä viittauksella. El ektro-f oreesi toteutettiin leveänä urana, jonka kumpaakin puolta reunustivat kapeat urat, jotka sisälsivät etukäteen värjättyjä molekyylipainostandardeja (Diversified Biotech, Newton Centre, MA). Sen jälkeen, kun elektroforeesi oli toteutettu ja kun täplät oli siirretty sähköisesti nitro-selluloosalle menetelmillä, jotka on kuvattu julkaisussa Towbin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:4350 (1979), ja jotka menetelmät liitetään oheen tällä viittauksella, täplä salvattiin liuoksella, joka sisältää 5 7. rasvatonta mai to jauhetta TBS-1iuoksessa, ja se kiinnitettiin jakosarjaan (Miniblotter; Immunetics, Cambridge, MA). Jakosarjan kuhunkin koloon laitettiin hybridomasolujen kahdeksasta viljelmästä yhdistämällä saatua supernatanttia ja sitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 eC:n lämpötilassa, minkä jälkeen täplä poistettiin ja huuhdottiin TBA-1 i uoksel 1 a (TBS, joka sisältää 0,02 7. natri umatsi di a) .

- 97813 57

Urat, joihin oli sitoutunut vasta-ainetta, saatiin näkyviin käyttäen ai kali seen f os-f ataasi i n konjugoitua toista vasta-ainetta, joka oli kehitetty kromogeenisei 1 a substraatilla (Proto-blot; Promega Biotech, Madison, WI) valmistajan ehdottamien menetelmien mukaisesti. Positiivisesta supernatanttiseoksesta peräisin olevat viljelmien supernatantit testattiin uudestaan toisistaan erillään 1 /8-1 aimennoksena 5 V. rasvatonta maitojauhetta sisältävässä TBA-1iuoksessa niiden erillisten, anti-huTF-vasta—aineita tuottavien hybridomakloonien tunnistamiseksi.

Hybridomat, jotka todettiin positiivisiksi anti-huTF-vasta-aineiden tuotannon suhteen, valikoitiin tunnusomaisten piirteiden 1isäselvittämistä varten. Esimerkiksi edellä mainitusta TF8-yhteensulautumasta saadut hybridomat 1uonnehditiin anti-huTF-vasta-ainetta tuottaviksi hybridomavi1jelmiksi, mikäli näiden hybridomavi1jelmi en supernatantit immuunireagoivat huTFrn kanssa esimerkissä 6b kuvatussa, pistemäiseen täplään perustuvassa määrityksessä sekä esimerkissä 6a kuvatussa, kiinteään -faasiin perustuvassa Rl A-määri tyksessä. Tällaisten tunnusomaisten piirteiden selvitys tuotti 4 TFS—hybridomasolu-linjaa, jotka on esitetty esimerkin 13 taulukossa 5.

TF9—yhteensulautumasta saadut hybridomat 1uonnehditiin anti-huTF-vasta-ainetta tuottaviksi hybridomavi1jelmiksi, mikäli näiden hybridomavi1jelmi en supernatantit immuunireagoivat huTF:n kanssa esimerkissä 6a kuvatussa, kiinteään -faasiin perustuvassa RlA—määrityksessä sekä esimerkissä 6c kuvatussa. Western:in täpliin perustuvassa määrityksessä. Tällaisten tunnusomaisten piirteiden selvitys tuotti 24 TF9—hybri domasol uliin jaa, joista suurin osa on esitetty esimerkin 13 taulukossa c*

Edellä esitetyillä seulontamenetelmillä valikoitujen erityisten hybridomien tuottamiin vasta-ainemolekyyleihin viitataan ohessa tunnuksilla, jotka osoittavat 1) immunoidun hiiren (eli TF8 tai TF9), josta pernasolut saatiin tiettyä yhteensulautumaa varten, sekä 2) 96 koloa käsittävän vi1jelylevyn, rivin ja kolon numeron, josta erityinen, HAT-alustal1 e vastustuskykyinen 97813 58 hybridomasolu eristettiin (esim. 5B7, 11D12, jne.). Tällainen spesi-finen viitetunnus voidaan esittää ohessa yhtenä sanana, yhdysviivalla erotettuna sanana tai kahtena sanana. Esimerkiksi seuraavat tunnukset viittaavat kolmen saman monoklonaalisen vasta-ai nemol ekyyl i n seokseen: TF8-5G9, TF8-5G9 ja T-F8—5G9.

Esimerkki 7

Immunoglobuliinin IgG eristäminen

Immunoglobuliini IgG eristettiin hiiren hybridomasoluiinjaa TF8-5G9 (ATCC-numero HB9382) sisältävän hiiren vesi vatsan nesteestä käyttäen yhtiön Biorad Laboratories MAPS 11-järjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetyn IgG:n proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen proteiinin määritysreagenssia BCA (Pierce Chemical Co.) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Esimerkki 8

Anti-huTF:ää sisältävän kiinteän kantajan valmistaminen huTF:n eristämiseksi immuuniaffiniteetin perusteella

Anti-huTF-vasta—aineet aktivoitiin kiinteänä matriisina toimivaan agaroosiin kytkemistä varten di aiysoimal1 a 16 tunnin ajan 4 °C:n lämpötilassa 10 mg MAPS—tekniikai 1 a eristettyä, esimer— kissa 7 kuvatulla tavalla valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta TF8-5G9 di aiyysipuskuri a (500 ml) vastaan, jonka koostumus oli 0,1 M MES, pH 6,5, ja joka vaihdettiin tänä aikana vähintään kerran. Sitten aktivoituihin TF8-5G9-vasta-aineisiin sekoitettiin 2 ml A-ffigel 10-agaroosihelmi ä (Biorad). ja tuloksena olevaa kytkentäreaktion seosta käsiteltiin valmistajan ohjeiden mukaisesti kiinteän TF8-5G9/agaroosikantajan muodos-tami seksi.

Sitten kiinteässä kantajassa olevat liialliset, proteiinia sitovat kohdat salvattiin, kantaja pestiin ja vakuumisuodatettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla TF8-5G9/agaroosikakun muodostami seksi.

97813 59

Esimerkki 9 huTF:n eristäminen immuunia-ffiniteetin perusteella

Esimerkissä 1 valmistettua aivouuteliuosta, joka vastaa noin ihmisaivojen puolikasta, eli noin 100 ml, dialysoitiin kolmen vuorokauden ajan 4 *C:n lämpötilassa A-puskuria vastaan, joka vaihdettiin kaksi kertaa, ja jota oli yhteensä 6 litraa. Sitten dialysoitua aivouutetta sentri f ugoi t i i n nopeudella 10 000 >: g 1,5 tuntia. Tuloksena oleva supernatantti sekoitettiin esimer— kissä 4 valmistettuun, glysiinietyyliesteri-agaroosikakkuun kiinteän ja nestemäisen -faasin käsittävän reaktioseoksen muodostamiseksi. Sen jälkeen, kun tätä seosta oli pidetty 2 tuntia huoneen lämpötilassa pyörittäen, kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin suodattamalla käyttäen lasista sintterisuppi1oa. huTF—proteiinia sisältävä nestefaasi otettiin talteen ja sekoitettiin esimerkissä 8 valmistettuun TF8-5G9/agaroosikakkuun kiinteän ja nestemäisen faasin sisältävän immuunireaktion seoksen muodostamiseksi.

Tätä immuunireaktion seosta pidettiin yön yli 4 eC:n lämpötilassa pyörittäen, jolloin muodostui kudostekijää sisältävä, kiinteänä faasina oleva immuunireaktion tuote. Sitten kiinteä ja nestemäinen faasi erotettiin suodattamalla edellä kuvatulla tavalla. Kiinteä faasi otettiin talteen ja pestiin 10 tilavuudella A—puskuria. Sitten kiinteä faasi siirrettiin lasiseen kromatografiakolonniin ja sitä pestiin peräkkäin (1) 2 tilavuudella 1 M NaCl-1iuosta, joka sisältää 1 7. tuotetta Triton X—100, ja (2) 2 tilavuudella 0,1 M glysiiniä, pH 4,0, joka sisältää 1 7. tuotetta Triton X-100.

Edellä esitettyjen pesujen jälkeen mahdollinen, kiinteään kantajaan immunologisesti sitoutunut huTF irrotettiin (eluoitiin) pesemällä kiinteätä kantajaa lasisen sintterisuppilon päällä 20 ml :11a 0,1 M glysiiniä, pH 2,5, sekä 1 7. tuotteella Triton X-100. Tämän jälkeen eluoitunut materiaali otettiin talteen, siitä määritettiin huTF, yhdistettiin ja dialysoitiin kuten esimerkissä 4 esitetään.

- 97813 60

Sitten dialysaattiin sekoitettiin neljä tilavuutta kylmää asetonia huTF—proteiinin saostamiseksi. Tämän jälkeen sakka otettiin talteen sentri-f ugoi mal 1 a nopeudella 5000 ;·; g 30 minuutin ajan noin -10 *C:n lämpötilassa. Tuloksena oleva kasauma kuivattiin typpi—ilmakehässä ja osa tästä kasaumasta analysoitiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeeli11ä (SDS-PAGE) denaturoivissa olosuhteissa.

Tämän analyysin tulokset, jotka on esitetty kuviossa 8, osoittavat, että huTF-protei inia voidaan eristää i mmuuni a-f i ni teet i n perusteella saannon ollessa 33 mg huTFhita 1ipidittömäksi tehdyn aivojauheen yhtä grammaa kohden.

Esimerkki 10

Hyytymisen inhibitio anti—huTF—vasta-ainei11 a

Kymmenen mikrolitraa hybridomavi1jelmän supernatanttia sekoitettiin 90 pl:aan HBS/BSA-1iuosta, joka sisälsi noin 2 ng esimerkissä 4 valmistettua, uudestaan lipidoitua huTF-proteiinia. Täten muodostettuja immuunireaktion seoksia pidettiin 37 eC:n lämpötilassa 30 minuuttia, jotta anti-huTF-vasta-ainemolekyylit voisivat sitoutua immunologisesti huTF-proteiiniin ja muodostaa immuunireaktion tuotteen. Tämän jälkeen immuunireaktion seoksista määritettiin huTF-proteiinin esi hyydyttävä aktiivisuus esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Negatiivisena vertailuna käytettiin asiaanliittymätöntä IgG-valmistetta anti-huTF-vasta— aineen sijasta.

Tehollinen huTF-pitoisuus ekstrapoloitiin standardi käyrästä, joka oli saatu esimerkissä 2 esitetyllä tavalla käyttäen inhibiittorin läsnäollessa mitattua hyytymisaikaa. Inhibitio ilmoitettiin tehollisen huTF-pitoisuuden ja käytetyn todellisen huTF-pitoisuuden prosentti suhteena. Ne monoklonaalisten vasta-ainemolekyylien valmisteet, jotka tuottivat vähintään 50-pro-senttisen inhibition, valittiin oheisen keksinnön mukaisiksi, neutraloivia vasta-ainemolekyylejä sisältäviksi valmisteiksi.

97813 61

Esimerkissä 5 kuvatulla tavalla eristettyä huTF-proteiini a vastaan muodostettujen hybridomien lukuisten viljelmien super— natanteista määritettiin edellä kuvatulla menetelmällä niiden kyky inhiboida hyytymisen käynnistyminen. Taulukossa 5 esitetään ne hybridomat, joiden todettiin inhiboivan merkittävästi hyytymisen käynnistyminen.

Hyytymisen inhibitio anti-huTF—vasta-ainei11 a on myös toteutettu käyttäen etukäteen muodostettuja, huTF:n ja tekijän VII välisiä komplekseja. Kymmeneen mikrolitraan, joka sisälsi noin 1 ng esimerkissä 4 valmistettua, uudestaan lipidoitua huTF-proteiinia, sekoitettiin 70 μΐ HBS/BSA—1iuosta, 10 μΐ 20 mli , kaisiumklori dia ja mikäli niin mainitaan, 25 ng esimerkissä 3 kuvatulla tavalla valmistettua tekijää VII 10 plrssa. Tätä seosta pidettiin 37 °C:n lämpötilassa 15 minuuttia, jotta huTF muodostaisi kompleksin minkä tahansa seoksessa saatavilla olevan tekijän VII kanssa. Sitten seokseen sekoitettiin vielä 10 μΐ liuosta, joka sisälsi noin 10 ng esimerkissä 7 kuvatulla tavalla valmistettua, MAPS-tekniikai1 a eristettyä monoklonaa-lista vasta-ainetta, ja tätä toista seosta pidettiin 37 'C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Sitten hyytymisen inhibitio tuloksena olevassa seoksessa määritettiin lisäämällä ensin 100 μΐ 20 mM kaisiumklori di a ja sitten 100 μΐ joko ihmisen sitratoitua plasmaa tai esimerkin 12 mukaisesti valmistettua plasmaa, josta tekijä VII oli poistettu, ja hyytymisaika mitattiin sekunt— teinä. Prosentuaalinen inhibitio ilmaistiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla, ja taulukossa 6a on esitetty näistä, huTF:n ja tekijän VII väliseen, etukäteen muodostettuun kompleksiin perustuvista inhibitiomäärityksistä saadut tulokset.

97813 62

Taulukko 6 huTFrn ja tekijän VII välisen kompleksin käynnistämän hyytymisen inhibitio anti-huTF-vasta-ainei11 a I Ihmisen sitratoidun plasman hyytyminen Vasta-aine Teki iä VII·=* Inhibi i ti o-7.

Nollanäyte* + 0 TF85G9to + 58

Vertai la*3 + 0 TF85G9 - 83

Vertailu - 0 1 II Ihmisen plasman, josta tekijä VII on poistettu, hyytyminen

Vasta-aine Tekijä VII Inhibi tio-7.

Nol1anäyte + 0 TF85G9 + 58

Vertailu + 0 * "Nol1anäyte" tarkoittaa, ettei kokeessa käytetty monoklonaa— lista vasta-ainetta.

0 "TFB5G9" tarkoittaa, että kokeessa käytetty vasta-aine oli hybridomasta TF85G9 eristetty monoklonaalinen vasta-aine.

= "Vertailu" tarkoittaa, että kokeessa käytetty vasta-aine oli asiaan liittymätön monoklonaalinen vasta-aine. d "+” tarkoittaa, että tekijää VII lisättiin ja sen annettiin muodostaa kompleksi puhdistetun huTF:n kanssa ennen vasta-aineen lisäämistä seokseen.

Hyytymisen inhibitiota anti-huTF-vasta-aineiden vaikutuksesta on tutkittu lisäksi olosuhteissa, joissa verrataan inhibitiota ennen TF:n liittymistä tekijään VII/VIIa TF:n ja tekijän VII/VIIa välisen kompleksin muodostamiseksi, sekä tämän liittymisen jälkeen.

Näissä tutkimuksissa hyytymisen inhiboi nti anti-huTFh-vasta-ainei11a käyttäen etukäteen muodostettuja, TF:n ja VII/VIIa:n välisiä komplekseja toteutettiin olennaisesti edellä esimerkissä 10 esitetyllä tavalla, paitsi että käytetty 10 μΐ mono- 97813 63 klonaalista vasta-ainetta sisältävää liuosta oli saatu hybrido— maviljelmän supernatantista eikä MAPS-tekniikai1 a eristettyjä monoklonaalisi a vasta-aineita sisältävästä liuoksesta. Vertailun vuoksi hyytymisen inhiboituminen anti—huTF-vasta-aineiden vaikutuksesta määritettiin muodostamalla näiden vasta-aineiden ja uudestaan lipidoidun huTF-proteiinin väliset immuuni kompleksit ennen sekoittamista sitratoituun, tekijää VII/VIIa sisältävään plasmaan, kuten edellä esimerkissä 10 esitetään.

Vaikka kaikki ohessa kuvatut vasta-aineet tutkittiinkin tällä vertailevaan inhibitioon perustuvalla määritysmenetelmällä, niin kuitenkin vain ne vasta-aineet, joilla inhibitioksi saatiin 60 7. tai enemmän, katsottiin merkittäviksi ajatellen kykyä inhiboida huTF:n ja tekijän VII/VIIa välisen kompleksin käynnistämää hyytymistä. Nämä MoAb-lajit ovat TF9-1B8, TF9-5B7, TF8-5C4, TFB-11D12 ja TF8-21F2.

Esimerkki 11

Polypeptidi en synteesi

Ohessa käytettyjä, huTFh-proteiinin eri alueita vastaavat poly-peptidit syntetoitiin kemiallisesti yhtiön Applied Biosystems peptidisyntetisaattori 11 a, malli 430A, käyttäen symmetristä anhydridimenetelmää julkaisusta Hagenmaier, et ai., Hoooe-Sevler’s Z. Physiol. Chem,. 353:1973 (1982). Taulukoissa 1 ja 2 lueteltujen polypeptidi en lisäksi täss esimerkissä syntetoitiin myös alla olevassa taulukossa 3 luetellut polypeptidit. jotka käsittävät oheisen keksinnön mukaisia, anti—polypeptidi — vasta-aineiden, jotka kykenevät reagoimaan huTFh-proteiinin kanssa, tuottamiseksi käyttökelpoisia polypeptidejä.

Taulukko 3

Antigeenisiä polypeptidejä

pl21-155 H-TKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTL-OH P204-226 H-DSPVECMGQEKGEFREIFYIIGA-OH p225-224 H—GAVVFVVIILVIILAISLHK—OH p245-263 H-CRKAGVGQSWKENSPLNVS—OH

97813 64

Esimerkki 12

Hyytymisen inhibit!o polypeptidi en vaikutuksesta

Oheisen keksinnön mukaisten poiypeptidien kyky inhiboida huTF:n käynnistämää hyytymistä määritettiin siten, että polypeptidejä inkuboitiin ensin tekijän Vll/VIIa ja kaisiumionien läsnäollessa, minkä jälkeen tätä seosta lisättiin tekijää Vll/VIIa sisältämättömään plasmaan ja hyytymisajat mitattiin.

Ihmisen tekijä Vll/VIIa eristettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Kymmenen mikrolitraa liuosta, joka sisälsi 200 ng tätä eristettyä tekijää Vll/VIIa mi 11i11trassa HBS/BSA-1i uosta, lisättiin liuokseen, joka sisälsi 100 ui HBS-liuosta, 20 μΐ 25 mM yhdistettä CaCl3 ja 100 μΐ TBS/Triton-seosta, joka sisälsi synteettistä polypeptidiä. Tällä tavalla valmistettiin lukuisia seoksia, jotka sisälsivät erilaisia pitoisuuksia poly-peptidiä, ja joita tämän jälkeen pidettiin 37 °C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistettu, uudestaan lipidoitu kudostekijä laimennettiin HBS/BSA-iiuok-sella siten, että 10 μΐ tuotti hyytymisajaksi arviolta 45 sekuntia esimerkissä 2 kuvatussa hyytymiskokeessa määritettynä. Edellä ylläpidettyyn seokseen lisättiin edelleen 10 μΐ uudestaan lipidoidun huTF-proteiinin laimennosta, 1O0 u 1 25 mM yhdistettä CaCla sekä lOO μΐ tekijää Vll/VIIa sisältämätöntä plasmaa (George King Bio-Medical, Inc., Overland Park, KA), joka oli laimennettu suhteessa 1 osa plasmaa 1,5 osaan HBS-liuosta. Sitten määritettiin hyytymisaika ja se esitettiin graafisesti esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Hyytymisajan pidennystä käytettiin osoittamaan synteettisen polypeptidin aikaansaamaa hyytymän inhibitiota. Prosentuaalinen inhibitio laskettiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla. Polypeptidejä, jotka saivat aikaan hyytymän vähintään 30-prosenttisen inhibition, pidettiin huTFhrn sitorniskohdan polypeptidi analogeina, eli polypeptideinä p26—49, ρ14ώ—1ό7 ja ρΐόΐ—139, kuten taulukon 4 osassa I on esitetty.

Vaihtoehtoisesti, edellä esitetyssä inhibitiokokeessa on käytetty tekijää Vll/VIIa sisältämätöntä plasmaa, joka on valmis- - 97813 65 tettu plasmasta, josta poistettiin tekijä VII/VIIa immuunia-f — f ini teetti in perustuvalla adsorptiolla monokl onaal i sten vasta-aineiden avulla. Ihmisen tekijää VII/VIIa torjuva monoklonaali-nen vasta-aine valmistettiin olennaisesti esimerkissä 5 kuvatulla tavalla, paitsi että immunogeenina käytettiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla eristettyä tekijää VII/VIIa huTF:n sijasta. Tuloksena olevat hybridomat arvioitiin ELISA-menetelmäl1ä sellaisen hybridoman tunnistamiseksi, joka hybridoma ei reagoi ihmisen veressä esiintyvien proteiinien proteiini 3, tekijä IX, tekijä X ja tekijä II kanssa, joita on saatavana yhtiöstä Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN. Tällainen hybridoma FV11.F1.2H3-3.2 on saatavana tutkijalta Dr. T.3.

Edqington (Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA). Immunoglobuliini IgG eristettiin hybridomaa FV11.F1-2H3- 3.2 sisältävän hiiren vesivatsasta ja eristetty IgG konjugoi-tiin kiinteään kantajaan esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Tuloksena olevaa, monoklonaalista anti-tekijä VII/VIIa-vasta-ainetta sisältävää kiinteätä kantajaa käytettiin tekijän VII/VIIa poistamiseksi yhdistämällä saadusta normaalista, sit-ratoidusta plasmasta käyttäen immuuni a-f + ini teetti i n perustuvaa menettelytapaa, joka on kuvattu esimerkissä 9, paitsi että plasmaa sisältävä neste-faasi otettiin taiteen ja säilytettiin.

Eräiden polypeptidi en kyky inhiboida hyytymistä kilpailuun perustuen, kun niitä käytetään lipidoidussa muodossa, varmistettiin edellä esitetyllä määrityksellä korvaamalla synteettistä polypeptidiä sisältävä liuos (100 μΐ) 100 ulilla lipidoi- tua synteettistä polypeptidiä.

Lipidoidut synteettiset peptidit valmistettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, jota käytettiin eristetyn huTFin lipidoimi-seksi uudestaan, paitsi että eristetty huTF korvattiin synteettisellä polypeptidi 11ä. Lipidin ja polypeptidin välisenä suhteena (w/w) käytettiin rutiininomaisesti arvoa 25:1. Lipi-doituja polypeptidejä, jotka saivat aikaan hyytymän vähintään 30-prosentti sen inhibition, pidettiin huTF'n:n si torni skohdan P°Iypepti di analogeina, kun ne ovat lipidoidussa muodossa, joita analogeja ovat taulukon 4 osassa II esitetyt polypeptidit.

97813 66

Taulukko 4 huTFrn käynnistämän hyytymisen inhibitio huTFh:n polypeptidi-analogien vaikutuksesta

Pepti di Inhibitio* Pitoisuus, uh I. Fos-f oi i pi doi mattomat peptidit p1-30 25.0 10 p26-49 88,8 10 p41—71 25,0 10 p40-49 25,0 10 p56-71 25,0 10 p72—104 25,0 10 i p94—123 20,0 10 p121-155 10,0 10 pl46-167 87,5 10 p161—189 32,5 10 p190-209 20,0 10 p204-226 20,0 10 puuttuu 0 - II. Fos-f oi i pi doi dut peptidit p1—30 81,0 10 p2o—40 B3,0 10 p40-71 65,0 10 p50—71 73,3 30 p94—123 93,7 10 p121-155 55,0 10 p146-167 80,0 10 p161—189 94,0 10 * Prosentuaalinen inhibitio, joka on määritetty esimerkissä 12 kuvatulla tavalla.

Kuvioissa 9 ja 10 esitetään esimerkkejä annos-vastekäyristä, jotka on saatu edellä kuvatuista, polypeptidiin perustuvista i nhi bi ti ot utki muksi st a.

97813 67

Esimerkki 13

Vasta-aineen ja huTF:n välisen immuunireaktion inhibitio poly-peptidien vaikutuksesta

Taipuisasta vinyylistä valmistettujen, 96 U-pohjäistä koloa käsittävien Immulon-1evyjen (Dynatech) kolot pinnoitettiin vuohen anti—hiiri IgBrllä (Boehringer Mannheim) esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, paitsi että proteiinin liiallisten sitoutumiskohtien salpaaminen toteutettiin 20 minuutin aikana 37 °C:n lämpötilassa.

Kuhunkin koloon laitettiin 50 ui hybridomavi1jelmän superna-I tanttia ja koloja pidettiin 1 tunti 37 °C:n lämpötilassa. Sit ten kolot huuhdottiin kolmeen kertaan TBS-1iuoksel1 a ja liiallinen neste poistettiin imulla.

Eristettyä huTF-protei i ni a valmistettiin i mmuuni a-f-f i ni teett i i n perustuvilla kolonneilla, kuten esimerkissä 9 on kuvattu. Tuloksena olevat, eristettyä huTF-proteiinia sisältävät asetoni-saostumat liuotettiin TBS/Triton—seokseen ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen proteiinien määritykseen sopivaa rea-genssia BCA (Pierce) valmistajan ohjeiden mukaisesti. huTF-proteiinissa olevat hii1ihydraattisivuryhmät biotinyloitiin käyttäen biotiini-hydratsidi a (ICN Biomedicals Inc., Plainview, NY) ja noudattaen menetelmiä, jotka on kuvattu julkaisussa 0'Shannessy et ai., Immunol . Letters. 8:273-277 (1984), jolloin saatiin biotinyloitu huTF—liuos.

Tämän jälkeen kuhunkin koloon laitettiin 50 μΐ biotinyloitua huTF-Ιiuosta, joka oli valmistettu pitoisuudeksi 60 nq/ml TBS/Triton-seokseen, sekä 5 μΜ synteettistä polypeptidiä, minkä jälkeen seosta pidettiin 1 tunnin ajan 37 ®C:n lämpötilassa. Sitten kolot huuhdottiin kolmeen kertaan TBS/Triton-seoksel1 a.

Kuhunkin koloon laitettiin 100 μΐ streptavidiiniin konjupoitua alkalista fos-fataasia (Detek I-alk, Enzo Biochem Inc., New York, NY), joka oli laimennettu suhteessa 1/100 TBS-1iuoksel1 a, joka sisälsi 5 mM EDT A, 0,5 7. in ton X—100 ja 1 ym BSA, minkä 97813 68 jälkeen koloja pidettiin 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa. Sitten kolot huuhdottiin neljään kertaan liuoksella, joka sisälsi 10 mM kalium-fos-faattia (pH 6,5), 2 7. BSA, 0,5 7. Triton X—100, 0,5 li natri umkl ori di a ja 1 mli EDTA, minkä jälkeen kolot huuhdottiin kertaalleen i lmai supuskuri 1 la CO, 1 li Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 li NaCl , 5 mli MgClaD.

Bitten kuhunkin koloon lisättiin 100 μΐ liuosta, joka sisälsi 2 mli E.—ni tro-f enyyl i-f os-f aatt i a i 1 mai supuskuri ssa, ja koloja pidettiin sitten 1 tunnin ajan 37 ®C:ssa. Tämän jälkeen kustakin kolosta mitattiin optinen absorbanssi aal1onmituudel1 a 405 nanometriä (nm) käyttäen mikrolevyjen mittauslaitetta Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Tulokset tästä kilpailevaan inhibitioon perustuvasta tutkimuksesta on esitetty taulukossa 5.

97813 69 ί

Taulukko 5

Peptidin _ia monoklonaal iSten vasta—aineiden väliset vuorovaikutukset iΛ r* p* r> ΙΛ VD co o θ'** O v f*· r* -π i i i i _ nil I I i i «-! ir <-i o M»b“ ivDO »-( φ <N T rv v φ n tutit «H cn v ^rinr'CT'-H— O. G. CL 0.0.0.0.0,0.0.0.

TF85G9 + TF811D12 4 TF85C4 + TF821F2 4 TF91D5 4 4 4 TF92C4 44 4 4 TF92F6 4 4 TF95C7 4 + 4 4 TF96B4 4 4 TF99C3 44 4 4 TF910C2 4 4 TF91F1 4 TF91E7 4 44 TF91B8 4 44 TF91B9 4 TF94D11 444 TF95G4 4 4 TF95B7 4 4 TF96G4 4 TF97E10 4 4 TF98E8 44 4 TF99E1 44 4 TF99B4 4 + TF96CBb 444 TF910H5b 4 4 TF99D6b + 4 TF910 H10b 44 4 - 97813 70 * Kukin monoklonaalinen vasta-aine (Mab) tuotettiin hybri-domalla, Jolla on sama tunnus. Kaikki monoklonaaliset vasta—aineet seulottiin käyttäen hybridomavi1jelmi en supernatantteja, kuten esimerkissä 13 on kuvattu.

Näitä vasta-aineita ei pidetty neutraloivina esimerkistä 10 saatujen tulosten mukaisesti. Kaikki muut vasta-aineet katsottiin neutraloiviksi näiden samojen tulosten mukaisesti .

Inhibitio katsottiin merkittäväksi, mikäli peptidin läsnäollessa mitattu absorbanssiarvo oli suurempi kuin tietylle vasta-aineelle polypeptidin puuttuessa saadun keskiarvon yksi stan- dardipoikkeama.

Esimerkki 14 huTF-proteiinin ilmaiseminen ruumiinnäytteestä kaksikohtaisei1 a ELISA-menetelmäl 1 ä huTF voidaan määrittää ruumiinnäytteestä, kuten verestä, plasmasta, syljestä, virtsasta, jne., käyttäen kahta monoklonaa-lista vasta-ainetta, jotka kykenevät sitomaan samanaikaisesti saman huTF-molekyylin.

Polystyreenistä valmistettujen, 96 U-poh jäistä koloa käsittävien immulon—levyjen (Dynatech) kolot pinnoitetaan vuohen anti-hiiri IgG:llä (Boehringer Mannheim) laittamalla ensin jokaiseen koloon 100 μΐ IgG:tä, joka on laimennettu pitoisuuteen 10 pg/ml TBS-1iuoksel1 a, minkä jälkeen tätä IqG-liuosta pidettiin kosketuksessa kolon kanssa yön yli 4 "C:n lämpötilassa. Kolot huuhdottiin kolmasti TBS-1iuoksel1 a ja sitten kuhunkin koloon lisättiin 100 μΐ TBS/Triton-seosta, joka sisälsi 3 V. BSA:ta. Koloja inkubDitiin 1 tunnin ajan 37 ®C:ssa, ne huuhdottiin kolmeen kertaan TBS-1iuoksel1 a ja sitten liiallinen neste pois-tett i in i mul1 a.

Kuhunkin koloon laitettiin 100 μΐ anti-huTF—vasta-ainemolekyy-lejä sisältävän viljelmän supernatanttia ensimmäisestä hybri— domasta TF9-6B4 ja koloja pidettiin sitten tunnin ajan 37 97813 71 °C:ssa. Sitten kolot huuhdottiin kolmasti TBS—1iuoksel1 a ja liiallinen neste poistettiin imulla.

Esimerkin 9 mukaisesti valmistettua, immuunia-f-f initeetin perusteella eristettyä ja asetonilla seostettua huTF-proteiinia liuotettiin TBS/Triton-seokseen. huTF-1iuoksesta valmistetaan laimennokset, joissa pitoisuus vaihteli alueella 5 ug/ml -0,5 ng/ml TBS/Triton-1iuosta, ja 100 ui tällaista laimennosta laitettiin Immulon—1evyn koloon. huTF-1iuoksia pidettiin kosketuksessa ensimmäisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten laimennokset poistettiin ja kolot huuhdottiin kolmasti TBS/Triton-seoksel1 a. Liiallinen neste poistettiin imulla.

Anti -huTF-vasta-ai neet eristettiin MAPS-te.kni i kai 1 a toisen hybridoman TF9-10H10 avulla saadusta vesivatsasta käyttäen esimerkissä 7 kuvattuja menetelmiä. Tuloksena olleesta vasta-aineliuoksesta mitattiin proteiini ja sen jälkeen se merkittiin biotinyloimal1 a, kuten esimerkissä 13 esitetään.

Tämä biotinyloitu anti-huTF-vasta-aine laimennettiin pitoisuuteen 60 ng/ml TBS/Triton-1iuosta ja 100 ui tätä liuosta laitettiin kuhunkin koloon. Koloja pidettiin 37 *C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne huuhdottiin kolmeen kertaan TBS/Triton-1i uoksella.

Sitten sitoutunut, biotinyloitu anti—huTF-vasta-aine ilmaistiin käyttäen esimerkissä 13 kuvattua Detek I-alk-järjestelmää.

Tässä määrityksessä ensimmäisenä ja toisena vasta-aineena käytettyjä monoklonaalisi a vasta-aineita voidaan vaihdella, kunhan vain nämä kaksi vasta-ainetta kykenevät sitoutumaan samanaikaisesti huTF-proteiiniin. Esimerkiksi mikäli TF9-6B4:ää on käytetty ensimmäisenä vasta-aineena, niin TF9-llD12:ta voidaan käyttää toisena vasta-aineena TF9—10H10:n asemesta. Täten oheisessa keksinnössä tarkastellaan kaikkien sellaisten vasta-aineiden yhdistelmää, jotka vasta-aineet kykenevät sitoutumaan samanaikaisesti tässä määrityksessä.

97813 72

Esimerkki 15

Koko pre-huTFh-proteiinia koodaavan ketjun sisältävän DNA-kap" paleen muodostaminen DNA-kappale, joka sisältää koko pre-huTFh—proteiinia koodaava° ketjun, voidaan muodostaa seuraavalla tavalla käyttäen yhdiS" telmäplasmideja pCTF64, pCTF403 ja pCTF314, joiden restriktio~~ kartat on esitetty kuviossa 11, sekä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Katso esimerkiksi Mani atis et ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, NY (1983).

Näiden kuviossa 11 esitettyjen yhdistelmä-DNA-plasmidien sisältämässä istutekappaleissa on EcoRI-kytkijä 5'-6GAA7TCC-3J (Col 1aborative Research, Lexington, MA) kummassakin päätteessä kloonausprosessin helpottamiseksi. Nämä kytkijäketjut eivät ole läsnä kuviossa 2 esitetyssä nukleotidi ketjussa, koska ne eivät ole luonnossa esiintyvän, huTFh-proteiinia koodaavan DNA-ketjun osa. Jotta seuraavat, yhdistelmä-DNA-moiekyylien muodostamiseen kohdistuvat kuvaukset olisivat selviä asiaan liittyvien huTFh DNA-ketjujen suhteen, niin pilkkomalla syntyneisiin, EcoRI-päätteen käsittäviin kappaleisiin, jotka näin ollen voivat sisältää näitä ylimääräisiä kytkijäketjuja, viitataan kuviossa 2 esitettyjen nukleotidi emästen numeroilla. Tulee ymmärtää, että nämä kappaleet voivat sisältää näitä yli— " määräisiä ketjuja päätteissään.

P1 asmidi pCTF64 pilkottiin restr i kti oendonukl eaasei 11 a EcoRI ja DralII. jolloin saatiin DNA-kappale, jonka sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua emäsjäännök-sestä 1 jäännökseen 296. Täten aikaansaatu, 302 nukleotidi-emäsparia (bp) käsittävä kappale eristettiin koon perusteella fraktioimalla agaroosi geel i ä käyttäen, minkä jälkeen se detos--foryloitiin käsittelemällä alkalisella fosfataasilla.

F1asmidi pCTF403 pilkottiin restriktioendonukleaasi11 a EcoRI sellaisen DNA-kappaleen tuottamiseksi, jonka kappaleen sisältämä nukleQtidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jään- 97813 73 nöksestä 776 Jäännökseen 1125. Tuloksena ollut 352 emäsparin kappale eristettiin koon perusteella -fraktioimal1 a käyttäen agaroosi geeli ä.

Plasmidi pCTF314 pilkottiin restriktioendonukleaasi11 a EcoRI ja tuloksena ollut 647 emäsparin kappale eristettiin koon perusteella -fraktioimalla. Tämän kappaleen sisältämä nukleotidi-ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 135 jäännökseen 775. Tämä 647 emäsparin ketju eristettiin koon perusteella -fraktioimalla ja se der os-f oryl oi ti i n alkalisella -fos-fa-taasi11a.

Sitten 352 emäsparin kappale ja de-fos+oryloitu 647 emäsparin kappale kytketään toimivasti toisiinsa (1igatoidaan) T4 DNA— ligaasilla toteutetulla reaktiolla, jolloin saadaan 999 emäs-parin kappale, jonka nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 135 jäännökseen 1125. Sitten tämä 999 emäsparin kappale pilkotaan restri kt i oendonukleaasi11 a Dra111, jolloin tämä 999 emäsparin kappale katkeaa kuviossa 2 esitettyjen emäsjäännösten 296 ja 297 välisestä asemasta, jolloin saadaan 168 emäsparin suuruinen kappale ja 831 emäsparin suuruinen kappale. Sitten de-f os-f oryl oi t li 302 emäsparin kappale ja 831 £xnäsparin kappale kytketään toimivasti T4 DNA-1 igaasi 11 a, jolloin saadaan 1125 emäsparin kappale, jonka sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 1 jäännökseen 1125.

Kloonaava plasmidivektori pUCS tehdään lineaariseksi pilkkomalla entsyymillä EcoRI. Edellä valmistettu 1133 emäsparin kappale ja EcoRI-pi1kottu vektori kytketään toimivasti T4 DNA-ligaasilla, jolloin saadaan rengasmainen yhdistelmä-DNA-mole-kyyli pUC-pre-huTFh.

E. coli-kanta RR1 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) transformoidaan pUC-pre-huTFh-molekyyli11ä ja onnistuneet trans-f ormanti t valikoidaan ampi si 11 i i ni n vastustuskyvyn perusteeel 1 a. Sitten valikoidut trans-f ormanti t kloonataan ja seulotaan rakenteellisen pre—huTFh-geenin käsittävän yhdistelmä—DNA-mol ekyyl i n läsnäolon suhteen.

97813 74

Seulominen rakenteellisen pre—huTFh-geenin käsittävien yhdis-telmä-DNA-molekyylien läsnäolon suhteen toteutetaan pilkkomalla kunkin valikoidun transformantin rDNA entsyymillä EcoRI Tuloksena olevat EcoRI—kappaleet erotetaan kuvioksi koon perusteella agaroosigeeli11ä. Koimivyöhykkeisen kuvion, jossa vyöhykkeet vastaavat 352, 781 ja 2682 emäsparin suuruisia kappaleita, tuottavat yhdistelmä—DNA—kappaleet sisältävät rakenteellisen pre—huTFh—geenin. E. coli RRl-transformantit, joiden rDNA tuottaa entsyyymin EcoRI vaikutuksesta edellä kuvatun pi 1kkoutumis-kuvion, sisältävät oheisen keksinnön mukaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin ja ne valikoidaan (otetaan talteen).

)

Seuraavalla tavalla muodostetaan DNA—kappale, joka sisältää olennaisen osan pre-huTFh:ta koodaavasta ketjusta, solun ulkopuolinen ankkurialue mukaan lukien, mutta jonka karboksipäätteestä puuttuu kalvon läpäisevä ankkurialue, ja joka siis näin ollen koodaa liukoista huTFh-proteiinia.

Plasmidi pCTF64 pilkotaan restriktioendonukleaasi11 a EcoRI, jolloin saatavan DNA—kappaleen sisältämä nukleotidiketjun vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 1 jäännökseen 486. Täten muodostunut, 486 nukleotidiemäsparia (bp) käsittävä kappale eristetään koon perusteella -f rakt i oi mal 1 a käyttäen agaroosigeel i ä, minkä jälkeen se def os-f oryl oi daan alkalisella fosfataasi11 a käsittelemällä. Sitten defosfory1 oitu 486 emäs-parin kappale pilkotaan restriktioendonukleaasi11 a DraiII. joka katkaisee tämän 486 emäsparia käsittävän kappaleen kuviossa 2 esitettyjen emäsjäännösten 296 ja 297 välisestä asemasta, jolloin saadaan 296 emäsjäännöksen kappale ja 190 emäsjäännök-sen kappale. 296 emäsjäännöstä käsittävä kappale eristetään koon perusteella fraktioimal1 a käyttäen agaroosigeeliä.

Plasmidi pCTF314 pilkotaan restriktioendonukleaasi11 a EcoRI. jolloin saatavan DNA-kappaleen sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 135 jäännökseen 775. Tuloksena oleva 641 emäsparin kappale eristetään koon perusteella fraktioimal1 a käyttäen agaroosigeeliä, minkä jälkeen 97813 75 se defosforyloidaan käsittelemällä alkalisella -f ostat aasi 11 a. Sitten detosforyloitu 641 emäsparin kappale pilkotaan entsyymillä Dral11. joka katkaisee tämän 641 emäsparia käsittävän kappaleen kuviossa 2 esitettyjen jäännösten 296 ja 297 välisestä asemasta, jolloin saadaan 162 emäsparin kappale ja 479 emäsparin kappale. 479 emäsparia käsittävä kappale eristetään koon perusteella traktioimal1 a käyttäen agaroosigeeliä.

Sitten edellä valmistetut, 296 emäsparia ja 479 emäsparia käsittävät kappaleet kytketään toimivasti (1igatoidaan) T4 DNA-ligaasilla toteutetulla reaktiolla, jolloin saadussa 775 emäs-parin kappaleessa on sovittava nukleotidi ketju, joka vastaa , kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 1 jäännökseen 775.

Kloonaava plasmidi vektori pUC8 tehdään 1ineaariseksi entsyymillä EcoRI pilkkomalla. Edellä valmistettu 775 emäsparin kappale ja EcoRI-pi1kottu vektori kytketään toimivasti T4 DNA— ligaasilla, jolloin saadaan muodostumaan rengasmainen yhdis— telmä-DNA-molekyyli pUC-pre-huTFh-T.

E. coii-kanta RR1 transformoidaan muodosteella pUC-pre—huTFh-T ja ampisilliinille vastustuskykyiset transformantit, eli muodosteen pUC-pre—huTFh-T sisältävät kloonit, valikoidaan.

Yhdistelmä-DNA-molekyyli pUC-pre-huTFh-T pilkotaan entsyymillä EcoRI ja tuloksena oleva 775 emäsparin kappale eristetään koon perusteella fraktioimal1 a.

Synteettiset oiigonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju:

5’-AATTTAGAGAATAAGAATTCGGG-3’ sekä 3’—ATCTCTTATTCTTAAGCCC—5J

muodostetaan menetelmillä, jotka on kuvattu julkaisuissa Caru-thers et ai., J. Am. Chem. Soc.. 103:51S5 (1981) sekä Gait et ai., Cold Soring Harbor Symp. Quant. Biol.. 47:393 (1983), paitsi että tällä tavalla valmistettuja oiigonukleotidejä ei fosforyloida polynukleotidikinaasi11 a, millä voidaan estää näiden oiigonukleotidi en toimiva kytkeytyminen (liqaatio) toi- 97813 76 siinsa. Nämä oiigonukleotidit yhdistetään tarttuvan EcoRI-päät-teen sekä tylpän päätteen sisältävän kaksijuosteisen DNA-kyt-kiJäkappaleen muodostamiseksi menetelmillä. Jotka on kuvattu julkaisussa Rotherstein et ai.. Methods in Enzvmol.. 68:98 (1979). Sitten tämä kytkijäkappale kytketään toimivasti muo-dosteesta pUC-pre-huTFh-T saatuun 775 emäsparin kappaleeseen, jolloin saadaan muodostetuksi 817 emäsparin kappale, joka sisältää yhden emäspariutuneen kappaleen 775 emäsparin kappaleen kummassakin päässä. Sitten tuloksena oleva 817 emäsparin kappale pilkotaan entsyymillä EcoRI tämän 817 emäsparia käsittävän kappaleen kummankin päätteen muuntamiseksi tylpästä päätteestä tarttuvaksi EcoRI—päätteeksi. jolloin saadaan 805 emäsparia käsittävä kappale. Tämä tuloksena oleva 805 emäsparin kappale eristetään koon perusteella fraktioimalla käyttäen agaroosi-geeli ä.

Kloonaava plasmidi vektori pUCIB tehdään lineaariseksi pilkkomalla entsyymillä EcoRI. Edellä valmistettu 805 emäsparin kappale ja entsyymillä EcoRI pilkottu vektori kytketään toimivasti T4 DNA-ligaasin avulla, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen yhdistelmä-DNA-molekyyli pUC-pre-huTFh-TR.

E. coli-kanta RR1 transformoidaan muodosteella pUC-pre-huTFh-TR ja ampisi 11iini11 e vastustuskykyiset transformantit, eli muodosteen pUC-pre—huTFh-TR sisältävät kloonit, valikoidaan.

Esimerkki 16 huTFh-proteiinin tuottaminen ilmentämällä huTFh:ta koodaavia yhdi stelmä-DNA-ketjuja

Yhdistelmä-huTFh-proteiinin tuottaminen yhdistelmä-DNA-mole-kyylejä ilmentämällä voidaan toteuttaa lukuisissa ilmentämis-järjestelmissä, joista voidaan mainita prokarioottiset bakteerisolut, muiden kuin selkärankaisten organismien eukarioot-tiset solut sekä korkeampien eläinten (seikärankaisten) eukari-oottiset solut. Esimerkkeinä tällaisista i1mentämisjärjestel-mistä voidaan mainita E. coli. 5. cerevisiae aekä kiinanhams-terin munasarjasolut (CHO), vastaavasti.

- 97813 77 a. pre-huTFh-proteiinin ilmentyminen E. coli-bakteerissa Yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka kykenee ilmentämään rakenteellista pre-huTFh-geeniä E. coli-soiuissa. voidaan muodostaa eristämällä pre—huTFh-geenin sisältävä DNA-kappale esimerkissä 15 valmistetusta yhdistelmä—DNA—molekyylistä pUC-pre-huTFh ja kytkemällä tämä kappale toimivasti prokarioottiseen ilmentämis-vektori in.

Yhdi stelmä-DNA-mol ekyyl i pL)C-pre—huTFh pilkotaan entsyymillä EcoRI sellaisissa olosuhteissa, että vain osa plasmidissa läsnäolevista EcoRI-kohdista katkeavat. Tämä osittaiseen pi 1k-; koutumiseen johtava menettelytapa on kuvattu yksityiskohtai semmin teoksessa Mani atis et ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY ¢1982). Näistä osittaisen EcoRI-pi 1kkoutumisen tuotteista eristetään koon perusteella fraktioimal 1 a 1133 emäsoarin kappale, jonka sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 1 jäännökseen 1125.

Prokarioottinen ilmentämisvektori pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) tehdään lineaariseksi entsyymillä EcoRI pilkkomalla. Tämä pilkottu vektori ja 1133 emäsparia käsittävä, rakenteet 1isen pre-huTFh-geenin sisältävä kappale kytketään toimivasti käyttäen T4 DNA-1igaasia, jolloin saadaan ! muodostetuksi rengasmainen yhdistelmä-DNA-molekyyli pKK-pre- huTFh.

E. coli—kanta RR1 transformoidaan muodosteella pKK—pre—huTFh ja ampisi 11iini11 e vastustuskykyiset transformantit, eli muo-dosteen pKK—pre—huTFh sisältävät kloonit, valikoidaan.

b. huTFh-proteiinin ilmentäminen E. coli-bakteerissa

Yhdistelmä—DNA—molekyyli, joka kykenee ilmentämään huTF-geenin E. coli-bakteerissa. muodostetaan manipuloimalla esimerkissä 16a valmistettua 1133 emäsparin kappaletta. Tämä kappale de-fosforyloidaan ensin ai kali sei la fosfataasi 11 a ja sitten se pilkotaan restriktioendonukleaasi11 a 9b vl. Tuloksena oleva.

73 97813 964 emäsparia käsittävä kappale sisältää nukleotidi ketjun, joka vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 164 jäännökseen 1125, ja se eristetään koon perusteella -fraktioimalla.

Synteettiset oiigonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju: 5’-AATTGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3’ j a 3’—CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG—5' valmistetaan edellä esitetyllä tavalla ja ne yhdistetään emäs-pareittain tarttuvat EcoRI— ja Bbvl—päät käsittävän kaksijuos-teisen kytkevän DNA-kappaleen muodostamiseksi menetelmillä, jotka on esitetty julkaisussa Rotherstein et ai-. Methods in i Enzymol., 68:98 (1979). Kytkijä kytketään toimivasti ensin 964 emäsparin kappaleeseen 1008 emäsparia käsittävän kappaleen muodostamiseksi. Sitten 1008 emäsparin kappale kytketään toimivasti entsyymillä EcoRI pilkottuun vektoriin pKK223-3 käyttäen T4 DNA—1igaasia, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen yhdistel mä-DNA-molekyyli pHH-huTFh.

Yhdistelmä-DNA-molekyy1i pKK—huTFh eroaa muodosteesta pKK-pre— huTFh ainoastaan siinä suhteessa, että (1) siitä puuttuu jäännöksestä 1 jäännökseen 129 ulottuva kappale, ja (2) uusi me-tioniinikodoni kytketään toimivasti ennen jäännöstä 130 siten, että proteiinin ilmentyminen (luenta) alkaa tästä istutetusta meti onii ni kodoni sta.

Yhdistelmä-DNA-molekyylit pKK-pre-huTFh ja pKK-huTFh istutetaan prokarioottiseen isäntäjärjestelmaan, joka on yhteensopiva tämän isännän sisältämään rakenteelliseen geeniin koodautuneen huTFh— tai pre—proteiinin ilmentymisen kanssa. Esimerkkinä tällaisen järjestelmän sisältävistä isäntäsoluista on E. co1i — kanta RR1. Isäntä transformoidaan yhdistelmä-DNA-molekyyli11ä, sitä viljellään olosuhteissa, jotka sallivat solujen kasvun sekä yhdistelmä—DNA:n ilmentymisen, minkä jälkeen ilmentynyt proteiini otetaan talteen hyvin tunnetuilla tekniikoilla.

97813 79 c. pre-huTFh-proteiinin ilmentäminen CHO-soluissa

Yhdistelmä—DNA—molekyyli, joka kykenee ilmentämään pre-huTFh-geenin selkärankaisten soluissa, muodostetaan käyttäen esimerkissä 16a valmistettua 1133 emäsparin kappaletta.

Synteettiset oiigonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju: 57—AATTCCCGGG-37 j a 57 —GATCCCCGGG—37 tuotetaan menetelmillä, jotka on esitetty edellä mainituissa julkaisuissa Caruthers et ai. ja Gait et ai. Sitten oligonuk-leotidiset sovittajaketjut kytketään 1133 emäsparia käsittävän ) kappaleen kumpaankin päätteeseen käyttäen menetelmiä, jotka on kuvattu julkaisussa Rotherstein et ai.. Methods in Enzymol.. 68:98 (1979). Tällä tavalla tässä 1133 emäsparin kappaleessa läsnäolevat tarttuvat EcoRI-päätteet saadaan muunnetuksi tarttuviksi BolII-päätteiksi.

Eukarioottinen, apinavirukseen (SV40) perustuva ilmentämisvek-tori pKSV-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) tehdään 1ineaariseksi pilkkomalla restriktioendonukleaasi11 a Bol11.

BollI—sovitettu 1133 emäsparin kappale ja BqI11—pi 1kottu vektori kytketään toimivasti käyttäen T4 DNA-1igaasia, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen vhdistelmä—DNA—molekyyli pSV-pre—huTFh.

E. coli-kanta RR1 trans-f ormoi daan muodosteella pSV-pre-huTFh ja onnistuneet trans-f ormanti t valitaan ampi si 11 i ini n vastustuskyvyn perusteella ja kloonataan. Sitten valikoidut trans-f ormanti t kloonataan ja seulotaan muodosteen pSV-pre—huTFh läsnäolon suhteen määrittämällä kustakin kloonista ilmentyneen pre-huTFh-proteiinin läsnäolo käyttäen monoklonaalista vasta—ainetta TF8-559.

d. huTFh-proteiinin ilmentäminen CHO—soluissa

Yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka kykenee ilmentämään huTFn-geenin ni säkässolui ssa, muodostetaan pilkkomalls esimerkissä 16c muodostettu pSV—pre—huTFh restriktioendonukleaasi11 a Bol11. Tul ok- 97813 80 sena oleva 1153 emäsparia käsittävä kappale eristetään koon perusteella -fraktioimalla, minkä jälkeen se pilkotaan restrik-tioendonukleaasi11 a Bbvl. Tuloksena oleva, 974 emäsparia käsittävä kappale sisältää sovittavan nukleotidi ketjun, joka vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 164 jäännökseen 1125, ja se eristetään koon perusteella -fraktioimalla.

Synteettiset oiigonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju: 5? -6ATC6ACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3·’ 3’ -CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5-’ valmistetaan edellä kuvatulla tavalla ja ne yhdistetään emäs-pareittain kaksijuosteisen kytkevän DNA-kappaleen muodostamiseksi, joka kappale sisältää tarttuvan BqIII-päätteen ja tarttuvan Bbvl-päätteen. Sitten kytkijä kytketään toimivasti 974 emäsparia käsittävään kappaleeseen käyttäen T4 DNA-1igaasia, jolloin saadaan muodostetuksi 1018 emäsparin kappale, jonka sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 130 jäännökseen 1125.

Ilmentävä plasmidi vektori pKSV-10 tehdään lineaariseksi pilkkomalla entsyymi lä Bgl.II, minkä jälkeen se kytketään toimivasti 1018 emäsparia käsittävään kappaleeseen käyttäen T4 DNA-liqaa-sia, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen yhdistelmä— DNA—molekyyli pSV—huTFh.

"v

Yhdistelmä-DNA-molekyylit pSV-pre-huTFh ja pSV-huTFh viedään eukarioottiseen isäntäjärjestelmään, joka sopii yhteen sen sisältämään rakenteelliseen geeniin koodautuneen huTFh- tai pre-huTFh-proteiinin ilmentymisen kanssa. Esimerkkinä tällaisen järjestelmän sisältävistä isäntäsoluista voidaan mainita CHQ-solut.

Isäntä trans-f ektoidaan yhdi stelmä-DNA-molekyyl i 1 lä ja pysyvät trans-f ormanti t valikoidaan hyvin tunnetuilla tekniikoilla.

Katso esimerkiksi julkaisut Graham et ai., Virol. 52:456 (1973) sekä Southern et ai., J. Mol. Appi, Genet.. 1^:327-341 (1982). Transformoituja isäntäsoluja viljellään olosuhteissa.

97813 81 jotka sallivat solun kasvamisen sekä yhdistelmä-DNA:n ilmentymisen, minkä jälkeen ilmentynyt proteiini otetaan talteen hyvin tunnetuilla tekniikoilla.

e. pre-huTFh—proteiinin ilmentäminen hiivassa

Yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka kykenee ilmentämään pre-huTFh-geenin 5. cerevisiae-hiivassa. muodostetaan valmistamalla oli-gonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju: 5’—AATTCCCGGG—3’ ja 5’—CGCCCGGG-3' minkä jälkeen ne kytketään esimerkissä 16a valmistetun, 1133 emäsparia käsittävän kappaleen päätteisiin edellä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla muodostetussa sovittajakappaleessa on tarttuvat C1ai—päätteet.

Hiivan i1mentämisvektori pTDTl (American Type Tissue Collection, no. ATCC 31255) tehdään lineaariseksi pilkkomalla res— triktioendonukleaasi11 a Cl ai. Edellä saatu, Cl ai-sovi tettu 1133 emäsparin kappale ja entsyymillä Cl ai pilkottu vektori kytketään toimivasti käyttäen T4 DNA-1igaasia, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen yhdistelmä—DNA—molekyyli pY—pre-huTFh.

E. coli-kanta RR1 transformoidaan muodosteella pY-pre-huTFh ja transformantit, jotka ilmentävät rakenteellisen pre—huTFh— - geenin, tunnistetaan ja valikoidaan esimerkissä 16a kuvatulla tavalla.

-f. huTFh—protei ini n ilmentäminen hiivassa

Yhdistelmä-DNA-molekyyli, joka kykenee ilmentämään rakenteilleen huTFh-geenin S. cerevisiae—hiivassa. muodostetaan pilkkomalla pY-pre-huTFh entsyymillä Cl ai. jolloin saadaan 1151 emäs-paria käsittävä kappale, jonka sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua jäännöksestä 1 jäännökseen 1125.

Sen jälkeen, kun tämä 1151 emäsparin kappale on eristetty koon perusteella fraktioimalla, se pilkotaan entsyymillä Bbvl 979 emäsparia käsittävän kappaleen tuottamiseksi, jonka kappaleen sisältämä nukleotidi ketju vastaa kuviossa 2 esitettyä ketjua 97813 82 jäännöksestä 164 jäännökseen 1125. Tämä 978 emäsparia käsittävä kappale eristetään sitten koon perusteella -fraktioimalla.

Synteettiset oiigonukleotidi set sovittajakappaleet, joilla on ketju: 5’—CGGACATGTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATT-3' j a 3’-CTGTACAGTCCGTGATGTTTATGACACCGTCGTATATTAAATTG-5’ muodostetaan ja kiinnitetään emäspareiksi edekkä kuvatulla tavalla, jolloin saadaan muodostumaan tarttuvat Cl ai- ja Bbv-päätteet käsittävät DNA—sovittajakappaleet. Tämä sovittaja-kappale kytketään ensin toimivasti 978 emäsparia käsittävään kappaleeseen 1020 emäsparia käsittävän kappaleen muodostamiseksi. Sitten tämä 1020 emäsparin kappale kytketään entsyymillä Cl ai pilkottuun vektoriin pTDTl, joka on valmistettu esimerkissä 16e kuvatulla tavalla käyttäen T4 DNA—1igaasia, jolloin saadaan muodostetuksi rengasmainen yhdistelmä-DNA-molekyyli pY-huTFh.

Yhdistelmä-DNA—molekyylit pY-pre-huTFh ja pY-huTFh viedään isäntäjärjestelmänä toimivaan hiivaan, joka kykenee ilmentämään sen sisältämään rakenteelliseen geeniin koodautuneen huTFh— tai pre—huTFh—proteiinin. Esimerkkinä tällaisen järjestelmän sisältävistä isäntäsolui sta voidaan mainita S. cerevisiae— soiut.

>

Isäntä transformoidaan yhdistelmä—DNA—molekyyli11ä ja sitä viljellään vaiikointiaiustassa onnistuneesti transformoitujen solujen eristämiseksi hyvin tunnetuilla tekniikoilla. Katso esimerkiksi Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75:1929 (1978); sekä Miyajima et ai., Mol. Cell. Biol.. 4:407 (1984). Transformoituja soluja viljellään olosuhteissa, jotka sallivat solujen kasvun sekä yhdistelmä-DNA:n ilmentymisen, minkä jäl-• keen ilmentynyt proteiini otetaan talteen hyvin tunnetuilla tekni i koi 11a.

97813 83 g. Liukoisen huTFh—proteiinin tuottaminen ilmentämällä huTFh-proteiinia koodaavia yhdistelmä—DNA-ketjuja

Liukoisen huTFh-proteiinin ilmentäminen yhdistelmä—DNA-mole— kyyleillä voidaan toteuttaa lukuisissa ilmentämiseen sopivissa väliaineissa tavalla, joka on kuvattu esimerkissä 16 pre-huTFh- ja huTFh-proteiinin yhteydessä. Tässä esimerkissä, sen kohdassa a tuotetaan 1133 emäsparia käsittävä, rakenteellisen pre-huTFh—geenin sisältävä kappale, jossa on tarttuvat EcoRI— päät, minkä jälkeen tätä kappaletta manipuloidaan kohdissa b—f siten, että tuloksena olevat vektorit kykenevät ilmentämään joko pre-huTFh- tai huTFh-proteiinia kolmessa esimerkkeinä esitetyssä i1mentämisjärjestelmässä, eli E. coli-, S. cere-vi si ae- sekä CHO-soluissa. Samalla tavalla esimerkissä 16a valmistettua, liukoisen pre—huTFh-proteiinin rakenteellisen geenin sisältävää 805 emäsparin kappaletta, jossa on tarttuvat EcoRI-päät. manipuloidaan esimerkeissä 16b—f kuvatuilla menetelmillä sellaisten i1mentämisvektoreiden tuottamiseksi, jotka vektorit kykenevät ilmentämään joko pre—huTFh—proteiinin tai huTFh-proteiinin liukoista muotoa (eli pre-huTFh-TR tai huTFh-TR) näissä samoissa i1mentämisjärjestelmissä.

Esimerkki 17

Hyytymisen inhibitio polypeptidi en p24-35 ja pl59-169 vaikutuksesta

Polypeptidit p24-35 ja pl59—169, joiden aminohappojäännösten ketjut on esitetty taulukossa 7, syntetoidaan esimerkissä 11 kuvatulla tavalla.

Taulukko 7

Ni mi tvs1 Aminohappojäännösten ket in

p24—35 H-EWEPKPVNQVYT-OH

p159-169 H-IYTLYYWKSSSS5KKTAK-QH

Kustakin polypeptidistä 1aboratoriossa käytetty nimitys edustaa kuvion 1 mukaiseen ketjuun sisältyvää aminohappo-jäännösten ketjua.

97813 84 Tämän jälkeen määritettiin polypeptidi en p24-35 ja pl59-169 kyky inhiboida kilpailuun perustuen huTF-proteiinin käynnistämää hyytymistä esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty kuviossa 12 ja ne osoittavat, että p24-35 ja pl59-169 kykenevät inhiboimaan huTF-proteiinin käynnistämän hyytymisen 45- ja 25-prosenttisesti, vastaavasti, kun niitä käytetään 10 μΜ:η pitoisuutena. Huomattakoon, että tässä tutkimuksessa taustasta johtuva inhibitio esimerkiksi kuviossa 12 täytetyllä ympyrällä merkittyjen peptidien tapauksessa oli vähäisempää kuin taulukossa 4 esitetyssä tutkimuksessa. Tuloksena todetaan, että polypeptidit, jotka tuottavat tässä tutkimuksessa hyytymän vähintään 20-prosenttisen inhi-; bition 10 μΜ:η pitoisuutena, katsottiin huTF:n sitorniskohdan polypepti di analogei ksi .

Täten, polypeptidit p24-35 ja pl59-169 edustavat oheisen keksinnön mukaisia, huTFh-proteiinin sitorniskohdan polypeptidi-analogeja. Samoin huomattakoon, että polypeptidi 11ä p24-35 saadut tulokset osoittavat, ottaen huomioon polypeptidi 11ä p25-49 saadut samankaltaiset tulokset, että huTFh:ssa läsnäoleva tekijän VII/VIIa sitomiskohta voidaan muodostaa siitä aminohappojäännösten ketjusta, joka on yhteinen näille kahdelle polypeptidi 11 e, eli kuviossa 1 esitetyistä jäännöksistä 30-35 (-VNQVYT-).

*

Esimerkki 18

Anti—huTF—vasta—aineista johtuvan hyytymisen inhibition kinetiikka

Jotta saataisiin määritetyksi se aika, jonka kuluessa anti-huTF-vasta-aineet kykenivät inhiboimaan huTF:n käynnistämän hyytymisen, niin ajan ja inhibition etenemisen välinen riippuvuus mitattiin käyttäen esimerkissä 10 kuvattua inhibitio— koetta.

Arviolta 1 ng esimerkissä 7 valmistettua, MAPS-tekniikai1 a eristettyä monoklonaalista TF8-5G9-vasta-ainetta sekoitettiin lOO plzaan HBS/BS-1iuosta, jossa oli arviolta 1 nq esimerkissä 97813 85 4 kuvatulla tavalla valmistettua, uudestaan lipidoitua huTF-proteiinia. Tällä tavalla muodostettuja erilaisia seoksia pidettiin 37 eC:n lämpötilassa eripituisia aikoja, noin 1 minuutista noin 60 minuuttiin, jolloin anti-huTF-vasta-ainemolekyyli kykeni sitoutumaan immunologisesti huTF-proteiiniin ja muodostamaan immuunireaktion tuotteen. Kuviossa 13 täsmennettyinä aikoina kustakin seoksesta määritettiin sitten huTF:n esihyy-dyttävä aktiivisuus esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, minkä jälkeen prosentuaalinen inhibitio ilmoitettiin esimerkissä 10 esitetyllä tavalla.

Kuviossa 13 nähdään tällaisesta kineettisestä mittauksesta saadut tulokset, jotka osoittavat, että huTF-proteiinin käynnistämän hyytymisen inhiboituminen yli 65-prosenttisesti tapahtui alle 10 minuutissa tässä kokeessa käytetyillä vasta-aineen ja puhdistetun huTF-proteiinin pitoisuuksilla. Oletetaan, että nopeampi ja täydellisempi inhibitio olisi seurauksena anti— huTF-vasta-aineen suuremmista pitoisuuksista.

Esimerkki 19 huTF-proteiinin käynnistämän hyytymisen inhibition, jonka anti-huTF-vasta-aineet saavat aikaan, annosvaste

Oheisen keksinnön mukaisten anti —huTF—vasta-aineiden kyky inhiboida huTF:n käynnistämää hyytymistä eräällä alueella vai h-tel eviä vasta-aineannoksia käytettäessä määritettiin esimer— kissa 10 kuvatuilla menetelmillä, joita muunnettiin kuitenkin seuraavalla tavalla. Yksi ng esimerkissä 4 valmistettua, uudestaan lipidoitua huTF—proteiinia sekoitettiin 0,1 ml:aan HBS/BSA-seosta, joka sisälsi erilaisia määriä esimerkissä 7 kuvatulla tavalla eristettyä monoklonaalista TF8-5G9—vasta-ainetta. Täten vai mistettuja seoksia pidettiin yllä immuunireaktion tuotteiden muodostamiseksi, minkä jälkeen niistä määritettiin huTF:n esi hyydyttävä aktiivisuus esimerkissä 10 kuvatulla tavalla.

Kuviossa 14 esitetään tällaisesta annos-vaste-määrityksestä saadut tulokset, jotka osoittavat, että inhibitio on puolet 8¾ 97813 maksimista anti—huTF—pitoisuuden ollessa arviolta 1—5 ng/ml tässä kokeessa käytettyjen huTF-pitoisuuksien tapauksessa.

Samankaltainen annosvaste saatiin käyttäen huTF:n lähteenä hajotettuja ihmissoluja.

Ihmisen -f i brobl ast i soi u jen linjaa GM1381 (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) viljeltiin Dulbeccon muokatussa Eagle-alListassa (DMEM, Gibco Laboratories, Grand Island, NY), johon oli lisätty täydennökseksi 2 mM glutamiinia, 5 7. si ki öastei sen vasikan seerumia sekä antibiootteja, 37 eC:n lämpötilassa ilmakehässä, joka sisältää 7 7. (v/v) hiilidioksidia. GM1381-soluja ? kasvatettiin ja ne otettiin talteen ja 30 « 10“· solun kasauma saatiin sentri-fugoimal 1 a, ja se pakastettiin -70 *C:n lämpötilassa. Tämä jäätynyt kasauma sulatettiin nopeasti lisäämällä siihen 9 ml 15 mM beeta-oktyyliglukopyranosidi a (Sigma) HN-puskurissa (25 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) ja seosta pidettiin 37 eC:n lämpötilassa 10 minuuttia solujen hajottamiseksi, minkä jälkeen siihen lisättiin 18 ml HN-puskuria soiuhajotteen muodostamiseksi.

Esimerkissä 7 kuvatulla tavalla eristettyä monoklonaalista vasta-ainetta TF8-5G9 laimennettiin 0,01 7. BSA-1 iuoksel 1 a (Sigma, RIA—laatu) siten, että saatiin kuviossa 15 täsmennettyjä erilaisia annoksia. Sitten 25 μΐ kutakin vasta-ainelai -? mennosta sekoitettiin 225 pl:aan edellä valmistettua soluha- jotetta ja saatuja seoksia pidettiin 37 *C:ssa 60 minuuttia, jotta vasta-aine voisi immuuni reagoi da soluhajotteessä mahdollisesti läsnäolevan huTF—proteiinin kanssa ja muodostaa immuunireaktion tuotteen. Sitten 50 μΐ 25 mM CaCl3—1iuosta sekoitettiin 50 pl:aan immuunireaktion tuotetta sisältävää liuosta, minkä jälkeen siihen lisättiin 50 μΐ ihmisestä saatLia sitratoitua plasmaa hyytymisen käynnistämiseksi. Näin muodostuneita seoksia pidettiin 37 °C:n lämpötilassa ja se aika, joka kului plasman lisäämisen ja hyytymän muodostumisen välillä, mitattiin. Tehollinen huTF-pitoisuus ja prosentuaalinen inhibi-tio laskettiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla.

il H i *M< lii * M

97813 87

Kuviossa 15 esitetään tulokset, jotka saatiin annosvasteeseen liittyvästä inhibitiomäärityksestä käytettäessä ihmisen GM1381-solujen hajotetta huTF:n lähteenä. Nämä tulokset osoittavat, että anti-huTF-vasta-aine TF8-5G9 aiheuttaa puolet suurimmasta mahdollisesta huTF—proteiinin, jonka lähteenä on toiminut tällainen soluhajote, inhibitiosta vasta-aineen pitoisuuden ollessa arviolta 8-10 ng/ml.

Esimerkki 20

MoAb-lajien ristireaktiivisuus muusta kuin ihmisestä peräisin olevan kudostekijän kanssa

Kudostekijä eristettiin joko aivokudoksesta (rotta, kaniini, härkä, koira, lammas, porsas ja paviaani) tai kudosvi1jelmän soluista Ca-f r i kkal ai sen vihreän marakatin munuai ssol ui sta (C0S)1. Kudokset tai solut sulatettiin, niistä poistettiin kalvot, ne hienonnettiin, homogenoitiin kylmässä asetonissa, jota oli 1 ml yhtä kudosgrammaa kohden, ja suodatettiin vakuu-missa Whatman-paperin no. 1 läpi. Kiintoaines suspendoiti in uudestaan asetoniin ja suodatettiin vielä viiteen kertaan, minkä jälkeen se kuivattiin yön aikaa ilmassa ja sitä säilytettiin -30 eC:n lämpötilassa. Asetoni jauheet, jotka käsittivät 16—19 7. ai kuperäi sestä märkäpai nosta, jauhettiin huhmareella ja suspendoi ti in uudestaan 5 V.zn pitoisuudeksi (w/v) TBS-1 luokseen, joka sisälsi 5 mmol/1 EDTA, ja näitä seoksia sekoitettiin • tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Kiintoaines otettiin tal teen sentri-f ugoimal la sitä nopeudella 10 000 x g 30 minuuttia 20 eC:n lämpötilassa, ja TF—proteiinia sisältävät kalvot saatiin talteen sentri-fugoimalla supernatanttia nopeudella 100 00O >: g tunnin ajan. Kasauma suspendoi ti i n uudestaan TBS—liuokseen ja sitä säilytettiin -80 °C:n lämpötilassa.

Vasta-aineen kyky inhiboida eläimen TF-proteiinia (kudosten TF—aktiivisuutta sisältäviä raakauutteita) määritettiin seu— raavalla tavalla. Yhtä suuria tilavuuksia TF-proteiinia (1 mg/ml) ja hybridoman supernatanttia (laimennettu suhteessa 1/10 TBS/BSA—1iuoksel1 a) inkuboitiin yhdessä 2 tuntia 37 °C:ssa. jäljelle jäänyt TF—aktiivisuus mitattiin lisäämällä 38 97813 100 μΐ tätä inkubointi seosta 50 μΐ:aan ihmisen plasmaa, josta tekijä VII oli poistettu, ja johon oli lisätty 50 μΐ 50 mM kaisiumkloridia CaCls- Seosta pidettiin 1 minuutti 37 *C:n lämpötilassa, minkä jälkeen siihen lisättiin 50 μΐ homologisen lajin seerumia 1/10-laimennoksena tekijän VII lähteeksi, ja hyytymän muodostumiseen kuluva aika määritettiin kahdesta rin-nakkai snäytteestä.

Kahdeksantoista (IS) 24:sta MoAb-lajista inhiboi paviaanin aivoista saadun TF:n tai a-f ri kkal ai sen vihreän marakatin mu-nuaissolujen uutteen esi hyydyttävää aktiivisuutta (taulukko 8). Yhdelläkään MoAb-lajilla ei kuitenkaan todettu ristireak— ‘ tiivisuutta rotan, kaniinin, naudan, koiran, lampaan tai poi— saan TF-proteiinin kanssa, eli yksikään niistä ei inhiboinut näiden TF-preparaattien kykyä nopeuttaa ihmisplasman, josta tekijä VII oli poistettu, rekalsifioitumisaikaa homologisen tekijän VI lähteen läsnäollessa- Yksikään näistä vasta-aineista ei inhiboinut kaniinin TF—proteiinin esi hyydyttävää aktiivisuutta normaalilla ihmisplasmalla määritettäessä.

'.a ia.t, mu i.t ti» 97813 89

Taulukko S

Mo.b gl»IPin Inhibitio-i Eläin-TF:n R NR uyyf.3 yTT_inhibitio i-' e-3 Ci IgC^.Ä B2UZ ♦ * 4· 56 57 __

Ic4-5C3 22287 4- -4- 99 8Q __ TTä-liriT IgC^x '.29453 ♦ 99 82 4-?_i4 — IS"-.^.·* i2__;2 4· -4 -4 93 83 w » TT?w 1—5 Τζ^^ιΧ 32 4· 4 + 95 76 ΐΓ=-1ΖΓ ΖςΖ\_,χ · 222SS * 4 4 97 »o ' u‘» TT?-L33 IgCj.,* 22232 + 4 + 98 83 w\ ^-•129 222—2 4 44 97 84 « 3 ^?-2Ci. Igi^.x 24423 4 4 4 97 78 «3 **1· 5 T^O^pjc 2/^^i + + φ 97 7? y ? TTr-iCll Ις·^, X 2299«. 4 4 4 97 81 w^3 779-5C4 I5C i_, λ 24073 4 4 4 97 53 ι^-·5—* Ιςΰ^.« 25629 4 4 4 97 7— m * C9-5C7 IgC^.x 24543 4 4 4 96 72 w» ΤΓ9-534 IgCi^.x 17394 4 4 4 96 og*· w , 2T?-«Ci IgC^.x 24055 '4 4 4 95 7g „*^ —: ?-5C9 Χςΰι^,χ 8054 4 44 9* 47 __ 4; Ϊ-7Ζ13 Χςνΐ^,χ 8022 4 4 4 97 *iy __ - -31*2 Χ^ΰι^,χ 4922— 4 4 4 97 76 «7 ΤΓ9-9Π IrCL ,x 12159 4 f f 90 71 w, i-:?-?C3 l5Ci_,x 20222 4 ’ 4 4 97 82 u 3 TTr-934 Ις£ι_,χ 2272S · 4 4 4 95 82 «3 77?-LCC2 Χς\3ι_,χ 22592 4· 4 4- 98 71 u 3 14· * 1CH13 Ιςΰ^,χ Z45S2 -4 -4 4 0 2C*- __ PA21C0 IgCl.x 1929 - - 0 o* 97813 90 x Mikäli toisin ei mainita, kaikki tulokset saatiin käyttäen hybridomakudosvi1jelmien supernatantteja 1:10-1 aimennok-sena. Radioimmuunimääritysten tulokset esitetään impulsseina minuutissa (cpm) käyttäen 12SI-merkittyä TF-prote-iinia Ja 1aktoperoksidaasia.

3 Westernin täplät toteutettiin käyttäen joko pelkistettyä (R) tai pelkistämätöntä (NR) TF—proteiinia.

3 Ihmisen plasman hyytymisen, jota ihmisaivoista puhdistettu TF indusoi, inhibitio.

* Se, miten spesi-risen, 13SI-merkityn tekijän Vll/VIIa sitoutuminen J82-soluihin inhiboituu. Eräissä tapauksissa (tähti) viljelmien supernatant!t 1/10-1 aimennoksena eivät f inhiboineet merkittävästi tekijän Vll/VIIa sitoutumista, ja tulokset on esitetty puhdistetulle IgGzlle pitoisuutena 10 pg/ml.

* Ihmisen plasman hyytymisen, jota paviaanin aivoista saatu raakauute (B) tai hajotetut COS-solut (M) indusoivat, inhibitio. Lajia edustava kirjain merkittiin näkyviin, mikäli MoAb inhiboi esi hyydyttävää aktiivisuutta 60 V. tai enemmän.

Monilla erilaisilla ihmissolui 11 a ja -kudoksilla esiintyvän esi hyydyttävän aktiivisuuden inhibitiota tutkittiin yksityiskohtaisemmin käyttäen MoAb-lajia TF3-5G9. TFB-5G9 neutraloi puhdistetun, uudestaan lipidoidun ihmis—TF—proteiinin toimi — _ vuutta enemmän kuin 90 kun IgG-pitoisuus oli yhtäsuuri tai suurempi kuin 1 ug/ml (kuvio 16). Samoin osoitettiin tämän MoAb—lajin kyky inhiboida ihmissolujen hajätteen ja kudoksista saatujen raakauutteiden esihyydyttävää aktiivisuutta (taulukko 9). TF8—5G9 IgG—pitoisuutena 10 pg/ml inhiboi kvantitatiivisesti > 80—prosentti a aivoista ja istukasta asetonilla saatujen raakajauheiden sekä ihmisen fibroblasti en, virtsarakon karsi-noomasolujen ja endotoksiini11 a stimuloidun ääreisveren yksitumaisten solujen esi hyydyttävästä aktiivisuudesta.

97813 91

Taulukko 9

Erilaisten solujen ja kudosten esi hyydyttävän aktiivisuuden inhibitio monoklonaalisen vasta-aineen TF8-5G9 vaikutuksesta TF-akt i i vi suus (inhibitio-/'.)1

Ilman vasta- TF-akti i vi suuden lähdea ainetta_PAb 100_TF8-5G9

Ihmisaivoista puhdistettu TF 1569 1520 (3) 245 (84)

Aivoista saatu raakauute 2059 2059 (0) 411 (SO)

Istukasta saatu raakauute 1287 1344 (0) 159 (88) GM1381~f ibroblastit (hajote) 990 966 (2) 143 (86)

Ihmisen monosyytit (hajote) 2893 2745 (5) 176 (94)

Virtsarakon karsinoomasolut 882 902 (O) 93 (89) J82 (hajote)

Kaniinin tromboplastiini 2108 2108 (0) 2157 (0) 1 Ihmisaivoista puhdistettu TF laitettiin 1ipidi vesikkeliin ennen testaamista.

a Kahdessa oikeanpuoleisessa palstassa luetellaan jäännös-TF—aktiivisuus mi 11iyksikköinä mitattuna esitetyllä, puhdistetulla Ig6:llä käsittelemisen jälkeen, ja nämä tulokset ovat kahdesta määrityksestä saatuja keskiarvoja. Näytteitä ja 10 yg/ml IgGstä inkuboitiin yhdessä 30 minuuttia 37 eC:ssa ennen jäännös-TF-aktiivisuuden mittaamista. Suluissa olevat arvot tarkoittavat prosentuaalista inhibitiota, joka ‘ on kussakin tapauksessa laskettu samasta, mutta vasta- aineella käsittelemättömästä näytteestä mitatuista aktiivi suusyksi koi stä.

Esimerkki 21

Tekijän VII sitoutumiseen kohdistuvat tutkimukset

Koska tekijän VII/VIIa sitoutuminen TF-proteiiniin on edellytyksenä toimivan, esihyydyttävän TF:VII/VIIa-kompleksin muodostumiselle, niin tässä esimerkissä tarkasteltiin taulukossa 8 lueteltujen MoAb-lajien kykyä neutraloida TF-aktiivisuutta salpaamalla tekijän VII/VIIa sitoutuminen TF-proteiiniin.

97813 92

Tekijän VII sitoutumiseen virtsarakon karsinoomasolujen J82 pinnalle, mitä ihmisen kudostekijä välittää, liittyvät tunnusomaiset piirteet on selvitetty yksityiskohtaisesti. Fair et ai., J. Bi oi. Chem.. 262:11692 (1987). Näin ollen MoAb-lajien vaikutusta solun pinnalla esiintyvän huTF:VII/VIIa-komoleksin muodostumiseen tutkittiin inkuboimalla J82-soluja alustavasti vasta-aineen kanssa, minkä jälkeen 13SI-tekijän VH/VIIa spesifinen sitoutuminen kvantitoi ti in.

J82-solut viljeltiin yhtenäiseksi kerrokseksi 12-koloi si 11 a vi1jelylevyi11ä noudattaen menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Fair et ai., J. Bi oi. Chem.. 262:11692 (1987), ne pestiin A—puskurilla (137 mM NaCl, 4 mM KC1, 11 mmol/1 glukoosia, 5 mM natriumatsidia, 10 mli HEPES, pH 7,45) ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37 °C:n lämpötilassa 0,7 ml:ssa A—puskuria, joka sisälsi puhdistettua MoAb IqG:tä tai hybridomavi1jelmän super natanttia laimennoksena 1/10. Kaisiumkloridia ja x==I-tekijää VII/VIIa lisättiin siten, että niiden lopullinen pitoisuus oli 5 mM ja 1 nM vastaavasti, ja niitä inkuboitiin solujen kanssa edelleen 2 tuntia 37 ®C:n lämpötilassa. Sitten solujen monokerrokset pestiin 5h kylmällä B—puskurilla (140 mM NaCl, 0,5 7. BSA, 5 mM Tris-HCl, pH 7,45), ne hajotettiin 1 ml: aan liuosta, joka sisälsi 0,2 M NaOH, 1 7. SDS, 10 mM EDTA, ja ha-jote laskettiin gammalaskuri11 a. Spesifinen sitoutuminen määritettiin vähentämällä epäspesifisesti sitoutunut radioaktiivisuus ( 13!SI-teki jä VII/VIIa, joka oli liittynyt soluihin merkitsemättömän tekijän VII/VIIa 100-kertaisen molaarisen ylimäärän läsnäollessa). Spesifisen sitoutumisen prosentuaalinen inhibitio määritettiin MoAb-1ajei11 a käsiteltyjen J82-solujen tapauksessa vertai 1usolujen suhteen, joita vertai 1usoluja oli käsitelty 9 osalla puskuria A ja 1 osalla vi 1 jel yal Listaa.

Kun tekijä VII/VIIa on sitoutunut TF-proteiiniin, se ei tavallisesti sisäisty, mutta jotta voitaisiin välttyä siltä, että TF sisäistyy vasta-aineen sitoutumisen indusoi mana, JS2-solut myrkytettiin aineenvaihdunnal1isesti 5 mM natriumatsidi 1 la. Samankaltaisia tuloksia saatiin, olipa solut käsitelty atsi-di11 a tai ei.

97813 93 Tämän tutkimukset tulokset on esitetty edellä olevassa taulukossa 8. Kaikki 23 MoAb-lajia, jotka inhiboivat TF-aktiivi-suutta, salpasivat myös tekijän VII/VIIa sitoutumisen. Odotetusti se MoAb, joka ei inhiboinut TF-aktiivisuutta, eli TF9-10H10, ei myöskään salvannut tekijän VII sitoutumista.

Esimerkki 22

Tekijän Xa muodostumisen inhibitio JB2-solujen vaikutuksesta

Tekijän Xa muodostumisen, jonka huTF:VII/VIIa-kompleksi saa aikaan J82-solujen pinnalla, nopeus kvantitoitiin kahdella rinnakkaisnäytteel1ä käyttäen moni koi oi seen vi1jelylevyyn perustuvaa määritystä, joka on kuvattu julkaisussa Fair et ai., J. Bi oi. Chem.. 262:11692 (1987), ja johon tehtiin kuitenkin seuraavat muutokset. Soluja viljeltiin 12—koi oi si 11 a levyillä ja niitä inkuboitiin alustavasti 2 tunnin ajan 37 *C:ssa MoAb-lajeista puhdistetun IgG—fraktion erilaisten pitoisuuksien kanssa ennen määrityksen ai oittamista, kuten aikaisemmin on kuvattu tekijän VII/VIIa ja J82-solujen välisen sitoutumisen yhteydessä. Tässä määrityksessä käytettiin vain yhtä tekijän VII/VIIa pitoisuutta (1 mM). 5, 10 ja 15 minuuttia sen jälkeen,

kun tekijää X oii lisätty lopulliseksi pitoisuudeksi 50 ug/ml, 50 μΐ supernatantti a poistettiin ja se lisättiin 550 ui:aan liuosta, joka sisältää 50 mM Tris—HCi, 225 mM NaCl, 50 mM EDTA (pH 8,2). Tekijän Xa kromogeenisen substraatin (50 ui 3,4 mM

S-2222, Helena Labs, Beaumont, TX) lisäämisen jälkeen tekijän Xa aktiivisuus kvantitoi tiin mittaamalla absorbanssin suureneminen aallonpituudella 405 nm käyttäen Beckman DU-30-spektro--fotom etriä ja kineettistä anal yysi tapaa. Kustakin määri tyksestä vähennettiin tuotteen S-2222 taustahajoaminen J82-solujen, joita oli viljelty ilman tekijää VII/VIIa, supernatanti n vaikutuksesta. Vasta-ainekäsittelyn aiheuttama prosentuaalinen ‘ inhibitio laskettiin sellaisten solujen avulla, joita soluja ei oltu inkuboitu alustavasti vasta-aineen kanssa.

Inhibitiokäyrät, jotka saatiin käsittelemällä J82-soluja MoAb-lajeiila TF9-2C4 ja TF9-5B7 osoittavat, että Vasta-aineen pitoisuudet inhiboivat tekijän Xa muodostumisnopeutta samalla 97813 94 tavalla kuin ne, jotka Inhiboivat tekijän VII sitoutumista (kuvio 17). Inhibitiota aiheuttamattomalla (ei-neutraloivai 1 a) MoAb-laji1la TF9-10H10 oli vain vähäistä vaikutusta, mikäli lainkaan, esi hyydyttävään aktiivisuuteen, tekijän Vll/VIIa sitoutumiseen tai tekijän Xa syntymisnopeuteen IgG-pitoisuuden ollessa korkeintaan 10 ug/ml vertailuna toimivan MoAb-lajin PAb 100 tavoin (ei esitetty).

Esimerkki 23

Tekijän X aktivoitumisen inhibitio JS2-solujen pinnalla johtuen huTFh-polypeptidi en kilpailevasta sitoutumisesta tekijään Vll/VIIa i

Kuten alalla hyvin tunnetaan, hyydyttävien proteaasikaskadien aktivoitumiseen solussa liittyy joukko heterogeenisiä häiriöitä, joita nimitetään vaihtelevasti kuluttaviksi tukos-veren-vuotohäirioiksi. Hyydyttävä proteaasikaskadi käynnistyy tavallisimmin solujen pinnalla siten, että tekijä Vll/VIIa ja olennainen kofaktori, eli kudostekijä TF, kulkeutuvat suuren affiniteetti nsa ansiosta kaivoreseptoriinsa. Tämä kudostekijan TF ja tekijän Vll/VIIa välinen kaksi molekyvlinen, esihyydyttävä kompleksi CTF:VII/VIIaU aktivoi tekijät X ja IX rajoitetun proteolyysin seurauksena, mikä johtaa lopulta trombiinin muodostumiseen ja fibriinin kasautumiseen. Sen lisäksi, että TF— proteiini on merkittävä verenvuodon tyrehoyttämisessä, TF—pro— ’ teiinin on todettu käynnistävän hyydyttävää proteaasikaskadia verisuonten sisäisessä hajapesäkkeisessä hyytymisessä sekä verihiutaleiden syntymisessä. Niemetz et ai., B1ood. 42:47 (1973) ja Bevilacqua et ai., J. E>:p. Med. . 160: 61B (19B4). TF on tärkeä vaikuttajamolekyyli, joka esiintyy monosyyttien ja endoteelisoiujen pinnalla tulehdusväiittäjien aiheuttamana sekä soluun liittyvissä immuunivasteissa.

Oheisessa esimerkissä tutkittiin oheisen keksinnön mukaisten huTFh-polypeptidi en kykyä sitoutua tekijään Vll/VIIa ja näin ollen inhiboida TF:VII/VIIa-kompleksin, joka kykenee aktivoimaan tekijän X, muodostumista.

97813 95

Polystyreenistä valmistetun, 96 tasapohjaista koloa käsittävän määrityslevyn kuhunkin koloon lisättiin 50 μΐ liuosta, joka sisälsi huTF:n polypeptidianalogia pitoisuutena 100 μΜ TBS-liuoksessa. Sitten kuhunkin koloon sekoitettiin 25 μΐ liuosta, joka sisälsi esimerkissä 3 kuvatulla tavalla eristettyä tekijää VII/VIIa pitoisuutena 1 nli TBS-1 i uoksessa, ja niihin lisättiin edelleen 25 μΐ 20 mM kai siumkioridia TBS-1iuoksessa, ja tuloksena ollutta seosta pidettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia.

Ihmisen virtsarakossa esiintyvän karsinooman soluja J82 saatiin kantakokoelmasta American Type Culture Collection (ATCC HTB , 1; Rockville, MD) ja niitä viljeltiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Fair et ai., J- Bi oi. Chem.. 262:11692-11698 (1987). Tämä menetelmä liitetään oheen tällä viittauk-sella.

5 x 10* J82-solua suspendoidaan 50 ui:aan TBS-iiuosta ja tätä suspensiota lisätään polystyreenistä valmistetun määritysievyn jokaiseen koloon edellä kuvatun käsittelyn jälkeen. Välittömästi tämän jälkeen koloihin lisättiin 25 μΐ tekijää X, joka on eristetty julkaisussa Fair et ai., J. Bi oi. Chem..

262:11692-11698 (1987) kuvatulla tavalla, ja jonka pitoisuus oli 100 nM TBS-1iuoksessa, sekä 50 ui tekijän Xa kromogeenista substraattia S-2222 (1 mg/ml TBS-1iuoksessa), ja tuloksena ’ olevaa seosta pidettiin kaksi minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin muodostumaan kromogeenisen reaktiotuotteen sisältävä liuos.

Tämän muodostuneen kromogeenisen tuotteen määrä määritettiin mittaamalla optinen tiheys (0D) aal1onpituudella 405 nanometriä (nm) käyttäen 96-koloisen levyn V-max-spektro-f otometri ä (Moie-' cular Devices, Mountain View, Kai i -f orni a) . Vertai 1 unäyttei ssä PBS-liuosta käytettiin polypeptidin sijasta tai tekijää VII ei lisätty lainkaan, jotta saataisiin määritetyksi suurin ja pienin mahdollinen 0D-arvo. Nämä mitatut inhibitiotulokset esitetään taulukossa 10.

97813 96

Taulukko 10

Tekijän X aktivoitumisen inhibitio JB2-solujen pinnalla käyttäen huTF-polypeptidejä huTFh-polvoeptidi Optinen tiheys* PBS 0,960 ± 0,083

Ilman tekijää VII/VIIa 0,005 ± 0,001 pl-18 1,007 ± 0,087 pl-30 1,098 ± 0,028 pii-28 0,687 ± 0,071 p24—35 0,477 ± 0,017 p26—49 0,437 ± 0,020 p40-71 0,B14 ± 0,053 ) p72-104 0,781 ± 0,047 p94-123 0,818 ± 0,055 pl21—155 0,889 ± 0,067 p144-159 0,507 ± 0,053 p146-167 0,004 ± 0,001 p157-169 0,389 ± 0,035 p161-190 0,600 ± 0,023 p190-209 0,625 ± 0,031 p204-226 0,715 ± 0,042 p244-263 0,619 ± 0,047 1 Tekijän X aktivoitumisen (Xa:n muodostumisen) inhibitio katsottiin merkittäväksi, mikäli optinen tiheys (0D) oli noin 0,55 tai sitä vähemmän.

Tästä tutkimuksesta saadut tulokset osoittavat, että huTFh-polypeptidit p24—35, p26—49, pl44—159, pl46—167 ja p157—169 sitoutuvat tekijään VII/VIIa ja inhiboivat sen kyvyn muodostaa TF:VII/VIIa-kompleksi, joka voi aktivoida tekijän X. Nämä tulokset osoittavat, että oheisen keksinnön mukaista, huTFh-pro-teiinin sitorniskohdan polypeptidi analogia voidaan käyttää hyytymisen inhiboimi seen.

97813 97

Esimerkki 54

Hyytymisen inhibitio in vivo anti-huTFh-MoAb-1ajei11 a

Gram—negatiivisten bakteereiden aiheuttamaan verenmyrkytykseen (sepsis) liittyy usein shokkitila, joka voi lopulta johtaa kuolemaan. Verenvuotoja tukahduttavan järjestelmän häiriöt liittyvät läheisesti tämän shokkitilan kehittymiseen. Julkaisussa Taylor et ai., J. Olin. Invest.. 79:918-825 (19Θ7) on osoitettu, että ulkoapäin annettu aktivoitu proteiini C, joka on 1uonnossa esiintyvä, hyytymistä torjuva entsyymi, estää paviaaneissa E. coli-bakteeri n LDioo-pitoi suuksi en aiheuttamat veren hyytymishäiriöt ja tappavat vaikutukset.

Oheisen keksinnön mukaisen, hyytymistä torjuvan MoAb-lajin kykyä inhiboida hyytymistä in vivo tutkittiin käyttäen septisen shokin paviaanimal1ia, joka on kuvattu edellä mainitussa julkaisussa Taylor et ai. Paviaaneja, jotka painoivat 7-8 kg, pidettiin ravinnotta yön yli ennen tutkimusta, ja ne tehtiin liikkumattomiksi tutkimuspäivän aamuna ketamiinilla (14 mg/kg, annettu lihaksen sisäisesti). Sitten eläimille annettiin nat-riumpentobarbitaalia pään laskimoon ihon läpäisevällä katetrilla kevyen kirurgisen nukutustilan ylläpitämiseksi (2 mg/kg noin joka 45 minuutti). Takaraajan reisi laskimo paljastettiin aseptisesti ja siihen laitettiin kanyyli veren ottamista var— ten. Ihon läpäisevän katetrin kautta annettiin infuusiona E. coli-bakteereita ja muita aineita, mukaan lukien MoAb TF9-5B7, jonka todettiin esimerkissä 20 ristireagoi van paviaanin TF:n kanssa. 30 minuutin pituisen tasapainottumisjakson jälkeen eläimille annettiin in-fuusiona noin 10 minuutin ajan joko 500 pg/kg tai 150 ug/kg MoAb—lajia TF9-5B7 (eristetty esimerkissä 7 kuvatulla tavalla MAPS-tekniikai 1 a, ja dialysoitu sitten normaalia steriiliä suolaliuosta vastaan pitoisuudeksi 0,58 pg/ml) tai 500 μα/kg asiaan liittymätöntä MoAb-lajia.

MoAb-vasta-aineen ja 30 minuutin pituisen tasapainottumisjakson jälkeen kullekin eläimelle annettiin LDioo-annas E. coli-bak— teereita (noin 1010 organismia, joka määrä johtaa kuolemaan septisen shokin seurauksena noin 8-1ό tunnin kuluttua infuusion 97813 98 jälkeen). E. col i —bakteeri t annettiin infuusiona kahden tunnin pituisen ajanjakson aikana. Tästä tutkimuksesta saadut tulokset esitetään taulukossa 11.

Taulukko 11

Kuolettavan septisen shokin pysäyttäminen in vivo paviaaneissa

Annos, Veren E. coli-

Ryhmä MoAb uq/kq hyytyminen1 i nfuusi o Kuol emä I Vertailu TF9—5B7 500 normaali ei ei II Vertailu HB* 500 normaali kyllä kyllä III Tutkimus TF9—5B7 500 normaali kyllä ei TF9-5B7 150 normaali kyllä ei 1 Erilaiset, veren hyytymiseen liittyvät parametrit, kuten verenpaine, hyytymisen aktivoituminen ja fibriinin hajoamistuotteet, määritettiin MoAb:n antamisen jälkeen mutta ennen E. coli-infuusiota- * HB on saman luokan ja alaluokan MoAb kuin TF9-5B7, mutta se immuuni reagoi asiaan liittymättömän antigeenin kanssa.

Kuten taulukosta 11 voidaan nähdä, MoAb—lajia TF9—5B7 saaneet paviaanit pysyivat elossa E. coli-bakteerin LDioo-annokselle altistumisesta huolimatta. Sekä 150 μ/kg että 500 uq/kq suuruinen MoAb—annos suojasi eläimet. Tämän lisäksi veren hyytymishäiriöihin liittyvä hyvin alhainen verenpaine, hyydyttävän 1- kaskadin aktivoituminen sekä -fibriinin hajoaminen vaimenivat huomattavasti eläimissä, joille annettiin MoAb-lajia TF9-5B7.

Esimerkki 25 buTF—heterodimeerin, jonka molekyylipaino on 58 kD, kevyen ketjun toteaminen tunnusomaisten piirteiden perusteella hemoglobiinin alfa-ketjuksi

Immuuni affiniteetin perusteella eristetyn huTF:n tunnusomaisia piirteitä selvitettiin edelleen Western:in täpliin perustuvalla analyysillä 58 kD:n huTF-heterodimeerissä läsnäolevien rakenne-komponenttien, nimittäin esimerkissä 4 kuvattujen 47 kD:n ja 12,5 kD:n suuruisten proteiinien tunnistamiseksi.

97813 99

Western:in täpliin perustuva analyysi toteutettiin esimerkissä 6c kuvatulla tavalla käyttäen esimerkissä 9 esitetyllä tavalla valmistettua, immuuniaffiniteetin perusteella eristettyä huTF-proteiinia, ihmisestä puhdistettua hemoglobiinia tai molekyyli-painojen standardeja näytteinä, jotka käsiteltiin elektro-fo-reettisesti. Mikäli niin mainitaan, 50 mM di tiotreitoiia sisällytettiin näytepuskuri in di sul -f i di sidosten pelkistämiseksi. Western:in täplät immuunireagoi tiin esitetyllä tavalla käyttäen immunoimattoman kaniinin IgGstä, hyvin tunnetuilla menetelmillä valmistettua kaniinin anti-huTF-IgG:tä tai kaniinin anti-ihmisen hemoglobiini IgG:tä, jota saatiin yhtiöstä Dako (Santa Barbara, Kai i -f orni a) . Ensimmäiset kaksi IgG—vai mi stetta oli eristetty MAPS-II-tekniikai 1 a, kuten esimerkissä 7 kuvataan.

Edellä esitetystä. Western:in täpliin perustuvasta analyysistä saadut tulokset esitetään kuviossa 18. Anti-huTF IgG immuuni-reagoi ainoastaan pelkistetyn huTF:n molekyylipainoa 47 kD vastaavan vyöhykkeen kanssa, muttei 12,5 kD:tä vastaavan vyöhykkeen kanssa (palsta A, ura 3), kun taas sama IgG immuuni-reagoi pelkistämättömän huTF—proteiinin sekä 58 kD:tä ja 47 kD:tä vastaavan muodon kanssa (palsta A, ura 4). Nämä tulokset ovat yhtäpitävät sen havainnon kanssa, että huTF on 58 kD:ta vastaavan heterodimeerin 47 kD:n suuruinen komponentti. Anti-hemoglobiini -IgG immuunireagoi Wstern:in täplissä ainoastaan 5B kD:ta vastaavan vyöhykkeen kanssa pelkistämättömän huTF— * näytteen tapauksessa eikä 47 kD:ta vastaavan monomeerin kanssa (palsta B, ura 4). Anti—hemoglobii1i-IgG immuunireagoi kuitenkin 12,5 kD:ta vastaavan vyöhykkeen kanssa pelkistetyn huTF-näytteen tapauksessa (palsta B, ura 3) ja se immuunireagoi ihmisestä puhdistetun 12,5 kD:n hemoglobiiniproteiinin kanssa (palsta B, ura 2). Määrityksessä ei todettu reaktiivisuutta immunoimattoman kaniinin IgG:n kanssa.

Edellä esitetyt tulokset tukevat sitä johtopäätelmää, että pelkistämättömän huTF:n 58 kD-muoto koostuu 47 kD:n huTF-pro-teiinista, joka on sitoutunut disulfidi sidoksi11 a hemoglobiiniin.

97813 100 Näin ollen tällä hetkellä oletetaan, että esimerkissä 4 kuvatun 58 kD:n heterodimeerin kevyenä ketjuna esiintyvä 12,5 kD:n komponentti on hemoglobiinin al-fa-ketju, ja että sen liittyminen 47 kD:n huTF-proteiiniin on huTFh-proteiinin eristämis-prosessin aiheuttama keinotekoinen muunnos.

Yhteenveto esimerkeissä 1-25 saaduista tuloksista ia niiden tarkastelu

Ohessa kuvataan 24 ihmisen aivoista eristettyä TF-proteiinia torjuvaa MoAb-lajia käsittävä kirjasto, jotka lajit on saatu kahdesta erilaisesta solujen yhteensulautumasta. Kunkin MoAb— , lajin immunologinen spesifisyys selvitettiin pistetäplään ja

Western:in täplään perustuvalla määritysmenetelmällä sekä radioimmuunikokeella. Useimmat MoAb—lajit reagoivat ihmisen TF:n kanssa jokaisen kolmen määrityksen mukaisissa olosuhteissa ja sekä luonnollisen että denaturoidun TF:n kanssa. Yhtä näistä MoAb—1 ajeista, TF8-5G9, on käytetty onnistuneesti TF—proteiinin rutiininomaiseen puhdistamiseen. Se adsorboi kvantitatiivisesti TF-aktiivisuuden kudosuutteista ja se tuottaa säännöllisesti ihmisen puhdasta TF-proteiinia milligrammojen suuruisina määrinä.

Kaikki MoAb-lajit yhtä lukuunottamatta neutraloivat voimakkaasti ihmisen aivoista saadun puhtaan TF-proteiinin toi min-‘ nallista aktiivisuutta. Vaikka usean MoAb-lajin todettiinkin risti reagoi van paviaanista ja apinasta saadun TF:n kanssa, niin yksikään vasta-aine ei kuitenkaan inhiboinut tekijää VII sisältämättömän ihmisplasman hyytymistä, joka käynnistettiin rotan, kaniinin, naudan, koiran, lampaan tai porsaan trombo-plastiinilla homologisen tekijän VII läsnäollessa. Lisäksi yksikään näistä MoAb-1ajeista ei inhiboinut normaalin ihmisplasman hyytymistä, joka oli käynnistetty kaniinin aivoista saadulla tromboplastiini 11 a, mikä tukee sitä johtopäätöstä, ettei ihmisen TF—proteiinin esi hyydyttävän aktiivisuuden in— hibitio johdu vasta-aineiden ja plasmassa läsnäolevien liukoisten hyydyttävien proteiinien, tekijä VII/VIIa mukaan lukien, välisestä vuorovaikutuksesta.

97813 101

Yksinkertaisin tapa, jolla anti-TF-vasta-aineet inhiboivat TF:n esi hyydyttävää aktiivisuutta, on tekijän VII/VIIa sitoutumisen salpaaminen. Odotetusti kaikki 24 hyytymistä vastustavaa (neutraloivaa) MoAb-lajia estivät tekijän VII/VIIa spesifisen sitoutumisen JS2-solui hi n, mikä on yhtäpitävää TF-prote-iinin pääasiallisen reseptori tehtävän kanssa. Tämä korostui edelleen valittujen puhtaiden MoAb-lajien annostitrauksessa, jossa puolet tekijän VII sitoutumisen suurimmasta mahdollisesta inhibitiosta ja puolet tekijän Xa muodostumisen suurimmasta mahdollisesta inhibitiosta todettiin samankaltaisella IgS-pi toi suudel1 a.

Ihmisen TF:ää torjuvan MoAb-lajin on kuvattu jokin aika sitten julkaisussa Carson et ai.. Blood. 70:490 (1987), inhiboivan TF:n aktiivisuutta, ilmeisesti häiritsemällä tekijän VII/VIIa sitoutumista, vaikkei sitä tutkittukaan suoraan. Se havainto, että 23 ohessa kuvatusta 24 MoAb-lajista neutraloi voimakkaasti TF-aktiivisuutta, on merkittävä. Oheisen hakijan laboratoriossa erilaisia ihmisen hyydyttäviä proteiineja vastustavilla MoAb-lajeilla saadun kokemuksen mukaisesti ainoastaan pieni osa neutraloi toiminnallista aktiivisuutta. On eoätodennäköisxä, että kaikki hybriöomat ovat sisärkiooneja, koska niiden reaktiivisuuksissa, mukaan lukien ristireaktiivisuus kädellisistä eläimistä peräisin olevan TF:n kanssa, esiintyy eroja. Lisäksi parhaillaan meneillä olevat epitooppien kartoitustutkimukset osoittavat, että tämä MoAb-lajien joukko tunnistaa vähintään kolme erillistä, keskenään ki1pai1ematonta vasta-aineen sito-miskohtaa. Näin ollen TF-proteiinia vastustavien, neutraloivien MoAb-lajien suuri osuus ei todennäköisesti voi olla seurauksena muutamasta immunologisesti hallitsevasta epitoopista, jotka myös osallistuvat toimintaan. TF-proteiinin aminohappoketjun on todellakin päätelty julkaisussa Hopp et ai.. Mol. Immunol.. 20:483 (1983) esitetyllä menetelmällä sisältävän lukuisia antigeenisiä determinantteja.

TF-proteiinin pieni koko voi selittää osaltaan sen, miksi niin moni anti-TF MoAb-laji salpaa tekijän VII/VIIa sitoutumisen. cDNA-kloonauksen perusteella ollaan ennsutettu, että TF-pro- 102 97813 teiinissa on 25 kD:n kokoinen solun ulkopuolinen domeeni, gly-kosyloitumista mukaan lukematta. Täten vasta-aine- ja tekijä Vll/VIla-molekyylit voivat aiheuttaa steerisiä esteitä sitoutumisessa TF-proteiinin huomattavasti pienempään solun ulkopuoliseen domeeniin. Tämä steerisiin esteisiin perustuva hypoteesi on yhtäpitävä sen havainnon kanssa, että konkanavaliini inhiboi TF-aktiivisuutta [Pitlick, J. Clin. Invest.. 55:175 (1975)], koska TF-proteiinissa läsnäolevat hiilihydraattiryh-mät eivät todennäköisesti ole toiminnan edellytys. [Nakamuru, Throm. Hemost.. £8:135 (1987)].

Tiettyä huomiota kiinnitettiin siihen, että eri solujen ja kudosten ilmentämä, tekijästä VII riippuva esihyydyttävä aktiivisuus voisi myös liittyä TF:n kaltaisten, toiminnaltaan samankaltaisen proteiinien useampaan kuin yhteen molekyylila-jiin. MoAb TF8-5G9 inhiboi kuitenkin kvantitatiivisesti aivoista ja istukasta saatujen raakauutteiden sekä hajotettujen fibroblastien, virtsarakon karsinoomasolujen ja ääreisveren yksitumaisten solujen esihyydyttävän aktiivisuuden. Vaikka nämä tulokset eivät olekaan täydelliset, niin ne kuitenkin tukevat sitä johtopäätelmää, että tällä hetkellä TF-proteiiniin liitetyt esihyydyttävät soluaktiivisuudet ovat antigeenisestä toistensa kaltaisia, mikäli ne eivät ole identtisiä. Tämä on yhtäpitävää sen havainnon kanssa, että olemassa on todennäköisesti vain yksi geeni TF-proteiinia varten.

Esimerkissä 4 kuvattu huTF-proteiinin 58 kD-muoto osoitettiin ohessa 47 kD:n TF-proteiinin ja arviolta 12,5 kD:n polypepti-din väliseksi, disulfidisidoksilla sitoutuneeksi heterodimee-riksi. Mainittu polypeptidi on sittemmin tunnistettu immuuni-kemiallisesti sekä osittaisen aminohappoketjun perusteella hemoglobiinin alfa-ketjuksi. Aikaisempi oletus, että tämä 58 kD:ta vastaava vyöhyke voisi olla solu-TF-proteiinin luonnossa esiintyvä heterodimeerinen muoto, on todennäköisesti väärä, koska on todennäköistä, että tämä 58 kD:n heterodimeeri muodostuu eristämisen aikana.

Hemoglobiinin alfa-ketjussa on vain yksi kysteiini ja cDNA-molekyylistä voidaan päätellä, että TF-proteiinissa on myös vain 97813 103 yksi kysteiini sen sytoplasmisessa domeenissa. TF-proteiinissa on lisäksi neljä kysteiiniä sen solun ulkopuolisessa domeenissa, mutta vähintään kahden niistä täytyy osallistua ketjun sisäisiin disulfidisidoksiin, koska TF:n toimivuus häviää pelkistämisen jälkeen. TF-proteiinin sytoplasmisessa domeenissa oleva ainoa kysteiini pysyy todennäköisesti pelkistyneenä useimmissa sytosolisissa proteiineissa esiintyvien kysteiinien tavoin. Tämä kysteiini (tai epätodennäköisemmin, TF:n muu kysteiini) saattaa muodostaa helposti sekadisulfidin solun hajoamisen jälkeen, ja oletetaan, että eristystoimenpiteen aikana tapahtuva hapettuminen johtaa disulfidisidoksen muodostumiseen TF-proteiinin sytoplasmisessa domeenissa sijaitsevan kysteii-nijäännöksen ja hemoglobiinin välille. Tätä johtopäätöstä tukee se havainto, että heterodimeerin muodostuminen riippuu ilmeisesti ajasta siten, että kun uuttoprosessin, jossa TF uutetaan detergentillä aivoista asetonilla saadusta jauheesta, ja immuuniaffiniteetin matriisiin sitomisen välinen aika on mahdollisimman lyhyt, niin saadun heterodimeerisen TF:n määrä pienenee. Oletettu 96 kD:n TFdimeeri voi myös muodostua samankaltaisella mekanismilla eristämisen aikana.

Anti-hemoglobiini-vasta-aineeseen perustuva kolonni sitoi spesifisesti 58 kD:n heterodimeerin, mutta se ei poistanut kvantitatiivisesti kaikkia niitä molekyylipainoltaan suurempia lajeja, joita todettiin immuuniaffinieetin perusteella puhdistetuissa TF-preparaateissa. Edelleen havaittiin hyvin pieniä määriä muita vähäisiä vyöhykkeitä, joissa molekyylipaino oli suurempi kuin 47 kD, ja jotka reagoivat anti-TF-vasta-aineiden kanssa. Nämä vähäisemmät lajit, mukaan lukien osa 58 kD:ta vastaavasta vyöhykkeestä, voivat vastata sekadisulfideja, jotka ovat muodostuneet TF:n ja muiden tunnistamattomien proteiinien välille.

Edellä esitetyn kuvauksen, erityiset suoritusmuodot ja esimerkit mukaan lukien, tarkoitus on havainnollistaa oheista keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta. Lukuisia muunnoksia ja muokkauksia voidaan tehdä oheisen keksinnön hengestä ja tavoitteista kuitenkaan poikkeamatta.

Claims (8)

104 97813

1. Hybridoma TF8-5G9, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla HB 9382.

2. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että vasta-ainemolekyylit on tuotettu patenttivaatimuksen 1 mukaisella hybridomalla, ja että vasta-ainemolekyylit (a) immunoreagoivat ihmisen kudostekijän raskaan ketjun proteiinin kanssa, (b) immunoreagoivat polypeptidin kanssa, jolla on sekvenssi: H-Glu-Pro-Lys-Pro-Val-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile- Ser-Thr-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-OH, ja (c) inhiboivat ihmisen kudostekijän kykyä käynnistää koagu-laatio.

3. Hybridoma TF9-10H10, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla HB 9383.

4. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että vasta-ainemolekyylit on tuotettu patenttivaatimuksen 3 mukaisella hybridomalla, ja että vasta-ainemolekyylit (a) immunoreagoivat ihmisen kudostekijän raskaan ketjun proteiinin kanssa, (b) immunoreagoivat polypeptidin kanssa, jolla on sekvenssi: H-Glu-Pro-Lys-Pro-Val-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile- Ser-Thr-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-OH, ja (c) eivät inhiboi ihmisen kudostekijän kykyä käynnistää koa-gulaatio.

5. Hybridoma TF9-5B7, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC talletusnumerolla HB 9658.

6. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että vasta-ainemolekyylit on tuotettu patenttivaatimuksen 5 mukaisella hybridomalla, ja että vasta-ainemolekyylit (a) immunoreagoivat ihmisen kudostekijän raskaan ketjun proteiinin kanssa, (b) immunoreagoivat polypeptidin kanssa, jolla on sekvenssi: il IHt HIM 1144« 97813 H-Glu-Pro-Lys-Pro-Val-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gin-Ile-Ser-Thr-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-OH, j a (c) inhiboivat ihmisen kudostekijän kykyä käynnistää koagu-laatio.

7. Menetelmä ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnesteen näytteestä, tunnettu siitä, että menetelmässä: (a) ruumiinnesteestä otettuun näytteeseen sekoitetaan patenttivaatimuksen 2, 4 tai 6 mukaista vasta-ainekoostumusta, jotka vasta-aineet immuunireagoivat ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin kanssa immuunireaktion seoksen muodostamiseksi; (b) seosta säilytetään niin kauan, että nämä vasta-aineet ehtivät immuunireagoida näytteessä mahdollisesti läsnäolevan ihmisen kudostekijän kanssa immuunireaktion tuotteen muodostaen; ja (c) vaiheessa (b) mahdollisesti muodostuneen immuunireaktion tuotteen läsnäolo ilmaistaan.

8. Reagenssipakkauksena oleva diagnoosijärjestelmä ihmisen kudostekijässä raskaan ketjun muodostavan proteiinin läsnäolon määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että diagnoosijärjestelmä käsittää jonkin patenttivaatimuksen 2, 4 tai 6 mukaista vasta-ainekoostumusta sisältävän pakkauksen. 97813