NO305211B1 - DNA-segment som koder for et l°selig human vevsfaktor-tungkjedeprotein, samt rekombinant DNA-molekyl omfattende segmentet - Google Patents

Description

Beskrivelse

Krysshenvisning til beslektet søknad

Foreliggende er en continuation-in-part-søknad av samtidige løpende søknader nr. 033.047 innlevert 31. mars 1987 og søknad nr. 067.103 innlevert 25. juni 1987.

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et rekombinant DNA-molekyl som bærer et strukturelt gen som koder for det tung-kjedete protein fra human vevsfaktor (huTFh). Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke huTFh i vertsceller inneholdende denne vektor.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Levringen av blod innbefatter en serie kaskader av enzym-, kofaktor-, proteolytiske og gelerings-reaksjoner formidlet av en gruppe av cellulære og plasmaproteiner kjent som koaguleringsfaktorer. Initiering av denne kaskade kan finne sted når den cellulære reseptor kjent som vevfaktor (TF), binder koagulasjonsfaktor VII eller dens derivat,

faktor Vila, under dannelse av et katalytisk aktivt kompleks. I fravær av TF og uten fortsatt binding i et kompleks, initierer faktor VII/Vila ikke koagulering. Den kjemiske og biologiske karakterisering av TF er således klart viktig for å forstå mekanismen ved koagulering.

Vevfaktor er et membranbundet glycoprotein som

ikke normalt finnes løselig i sirkulasjonen eller som er tilgjengelig for plasmaproteiner innbefattende faktor VII/Vila og de andre koagulasjonsfaktorer. Mens vevfaktor ikke normalt uttrykkes på overflaten av celler som danner vaskulaturen, kan dens ekspresjon av monocytter innen vaskulaturen fremkalles av bestanddeler av infektiøse midler slik som bakterielt lipopolysaccharid, lymfokiner avledet fra enkelte antigen-stimulerte T-hjelperceller, direkte av

enkelte stimulerte T-hjelperceller, og immune komplekser. Visse inflammatoriske formidlere av monocytt/makrofag-opprinnelse, f.eks. interleukin 1 og tumornekrosefaktor alfa, såvel som bakterielt lipopolysaccharid, kan stimulere endotelialceller som innstiller den humorale overflate av blodkar til å uttrykke TF. Ekspresjon av TF i det vaskulære felt resulterer typisk i utbredt intravaskulær koagulering eller lokalisert initiering av levring, dvs. trombogenese.

Vevfaktor uttrykkes vesentlig på overflaten av enkelte ekstravaskulære celler i in vitro-kultur innbefattende fibroblaster, enkelte hittil ikke identifiserte typer av hjerneceller, og visse epitelier som separeres fra de sirkulerende plasmaproteiner av basalmembranbarriærer. Nærværet av TF på disse celler resulterer i klumpdannelse etter kontakt med blod som et resultat av vevskade. TF er således den grunnleggende faktor på hvilken det hemostat-iske system initieres.

Artikkelen av Howell, Am. J. Physiol., 31:1 (1912) var den første til å foreslå at et isolert vevprotein-preparat inneholdende TF kunne aktivere koagulering bare når det var til stede som et fosfolipidprotein-(lipoprotein) kompleks. Rekonstituering av den funksjonelle prokoagulerende aktivitet av TF ved relipidering av det isolerte protein har vært nødvendig fordi isolering av TF-holdig vevprotein resulterer typisk i fjerning av fosfolipidene som normalt er assosiert med TF-proteinet, og en slik rekonstituering er blitt studert av et utall forskere. Eksempelvis er gjenvinning av koagulerende aktivitet blitt rapportert å være influert av fosfolipidtypen, forholdet mellom fosfolipid og protein, og detergenten og den ioniske sammensetning av rekonstitueringsblandingen. Se Nemerson,

J. Clin. Invest., 47-72 (1968); Nemerson, J. Clin. Invest., 48-322 (1969); og Carson et al., Science, 208:307 (1980).

Både isolerte og relipiderte TF-holdige proteinpreparater er blitt fremstilt ved ekstraksjon fra vevene av forskjellige arter. Historisk sett var de anvendte metoder vanskelige, tidkrevende og resulterte i lave utbytter fordi vevfaktor bare er til stede i ekstremt små mengder i naturlig forekommende vev. For en gjennomgang av de klassiske metoder henvises til Nemerson et al., Prog. Hem. Thromb., 6:237-261 (1982).

Mer nylig har Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985), Brom et al., Thromb. Res., 42:635-643

(1986) og Guha et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 83:299-302 (1986), rapportert isolering av humant vevfaktor (huTF)-protein under anvendelse av en metode basert på den oppdagelse at delipidert vevfaktorprotein kan binde faktor VII/Vila når proteinet er oppløst i en vandig løs-ning inneholdende en ikke-ionisk detergent og CaC^. Imidlertid er anvendeligheten av denne metode som anvender en faktor VII/VIIa-affinitetssorbent som et middel for isolering av vevfaktorprotein, begrenset ikke bare av vanskelig-heten ved å oppnå signifikante mengder av isolert faktor VII/Vila, men også av labiliteten av faktor VII/Vila.

Broze et al., supra, har foreslått at utviklingen av monoklonale antistoffer som er spesifikke for huTF, og deres anvendelse som immunoaffinitetssorbenter kunne omgå problemer forårsaket av den begrensede tilgjengelighet av faktor faktor VII/Vila. Imidlertid er ingen anti-huTF monoklonale antistoffer blitt rapportert i litteraturen. Enn videre immunoreagerer ikke to monoklonale antistoffer dannet mot kveg TF [Carson et al., Blood, 662-156 (1985)] med huTF (Guha et al., supra).

Kort sammendrag av oppfinnelsen

I en utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse

i betraktning DNA-segment omfattende ikke mer enn ca. 12.000 nucleotid-basepar, innbefattende en sekvens som definerer et strukturelt gen som koder for et tungkjedet vevfaktorprotein (huTFh). Fortrinnsvis koder det strukturelle gen for et protein med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca. rest 1 til ca. rest 263. Fortrinnsvis har det strukturelle gen en nucleotid-

basesekvens representert ved figur 2, fra ca. base 130 til ca. base 918.

I foretrukne utførelsesformer innbefatter DNA-segmentet også en andre sekvens tilstøtende 5'-enden av den første sekvens og som koder for en aminosyrerest-ledersekvens bundet til aminoenden av huTFh-proteinet. Den første og andre DNA-sekvens definerer sammen et sammensatt strukturelt gen som koder for et humant, tungkjedet vevfaktor-forløperprotein (pre-huTFh). Fortrinnsvis koder det sammensatte, strukturelle gen for et protein med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca. rest -32 til ca. rest 263. Mer foretrukket har det sammensatte, strukturelle gen en nucleotidbasesekvens representert ved figur 2 fra ca. base 34 til ca. base 918.

I en annen utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse i betraktning et rekombinant DNA-molekyl omfattende en vektor operativt kjedet til et første DNA-segment som definerer et strukturelt gen som koder for et humant, tungkjedet vevfaktorprotein. Fortrinnsvis innbefatter det rekombinante DNA-molekyl enn videre et andre DNA-segment tilstøtende 5'-enden av første segment og som koder for en aminosyrerest-ledersekvens bundet til angitte protein, idet angitte første og andre DNA-segmenter sammen definerer et sammensatt strukturelt gen som koder for en forløperform av angitte protein.

Kort sammendrag av tegningene

I tegningene som utgjør en del av beskrivelsen: illustrerer figur 1 den komplette aminosyrerestsekvens av de modne og forløperformene av humane, tungkjedede vev-faktorproteiner (huTFh og pre-huTFh), vist fra venstre til høyre og i retningen fra aminoenden til carboxyenden under anvendelse av énbokstavs-aminosyrerestkode. Aminosyrerestsekvensen av den dominerende, naturlig forekommende protein-form er nummerert 1 til 263. Sekvensen av de mindre forekommende modne former starter ved aminosyrerest nr. 3 og ender ved rest 263.

Aminosyrerestsekvensen svarende til ledersekvensen (forløperdelen) av pre-huTFh-proteinet som fjernes under mod-ningsprosessen, er angitt ved negative tall. Det ekstracellulære område og transmembran-ankerregionen svarer til reststillinger 1 til 219 og 220 til 242.

Figur 2 illustrerer nucleotidsekvensen av et cDNA

som koder for pre-huTFh-og huTFh-proteinene, vist fra venstre til høyre og i retning fra 5<1->enden til 3'-enden under anvendelse av énbokstavs-nucleotidbasekoden. Det strukturelle gen for huTFh begynner ved base 130 og ender ved base 918.

Leserammen er antydet ved plassering av den utledede aminosyrerestsekvens over nucleotidsekvensen slik at den enkle bokstav som representerer hver aminosyrerest, er lokalisert over den midtre base i det tilsvarende kodon. Figur 3 er en kurve som illustrerer koagulasjonsbestemmelsen anvendt for å måle huTF prokoagulerende aktivitet som beskrevet i eksempel 2. En log-log-kurve er vist for human citrert plasmakoaguleringstid (levring) i sekunder mot human vevfaktorkonsentrasjon (huTF) i picogram pr. milliliter (pg/ml).

Figur 4 illustrerer et autofluorogram av

faktor VII/Vila affinitets-isolert huTF, elektroforese-

125 behandlet i en 10% polyacrylamidgel. Felt A viser I-merket huTF som ble isolert og redusert med dithiothreitol (DTT) før elektroforese som beskrevet i eksempel 4. Felt B viser molekylvektstandarder med tilsynelatende molekylvekter angitt i kilodalton (k).

Figur 5 illustrerer et autofluorogram av

faktor VII/Vila affinitets-isolert huTF, elektroforesebehandlet i 15% polyacrylamidgeler. Isolering, merking med 125

I og elektroforese av huTF ble foretatt som beskrevet i eksempel 4. Felt A viser det isolerte huTF etter reduksjon med DTT. Felt B viser den samme prøve elektroforesebehandlet uten reduksjon med DTT. De øvre og nedre bånd (merket U og L) svarer til de tilnærmede 58 og 47 k størrelsesformer av huTF. Etter autofluorografi ble de øvre og nedre bånd skåret ut, rehydratisert i SDS prøvebuffer inneholdende DTT, innført i prøvebrønnen av en andre 15% polyacrylamidgel og underkastet elektroforese. Felt C viser re-elektroforesen av det nedre bånd erholdt fra felt B. Felt D viser re-elektroforesen av det øvre bånd erholdt fra felt B. Proteinene med tilsynelatende molekylvekt på 12,5 og 47 kilodalton (k), er antydet med piler.

Figur 6 illustrerer et autofluorogram av faktor VII/Vila affinitets-isolert huTF som først ble immunoutfelt med det huTF-spesifikke, monoklonale antistoff TF8-5G9 og deretter elektroforesebehandlet i en 8 til 17% polyacryl-amidgradientgel som beskrevet i eksempel 4. Felt A viser 125 I-merket huTF elektroforesebehandlet ved reduksjon med DTT. Felt B viser samme prøve elektroforesebehandlet uten reduksjon.

Figur 7 illustrerer et autofluorogram av faktor VII/Vila affinitets-isolert huTF elektroforesebehandlet i

125

15% polyacrylamidgeler. Isolering, merking med I, reduksjon og deglycosylering ble utført som beskrevet i eksempel 4. Felt 1 inneholder følgende proteinstandarder elektroforesebehandlet som markører med tilsynelatende molekylvekter (Mr) angitt i kilodalton; lysozym, 14,3; carbonsyreanhydrase, 30,0; ovalbumin, 46,0; kvegserumalbumin, 69,0; fosforylase b, 92,5; og myosin, 200,0, alle

125

erholdt fra Amersham, Arlington Heights, IL. I-huTF-holdige prøver ble elektroforesebehandlet enten med DTT (felt 2 og 3) eller uten DTT (felt 4 og 5). Enkelte av disse<125>I-huTF-holdige prøver ble deglycosylert (felt 3 og 5), mens andre ikke ble deglycosylert (felt 2 og 4) før elektroforesen.

125

De I-huTF-holdige prøver k^ørt i felt 3 og 5,

ble deglycosylert før elektroforesen, mens de i felt 2 og 4 ikke ble.

Figur 8 illustrerer et autofluorogram av immuno-affinitets-isolert huTF, elektroforesebehandlet i 10% polyacrylamidgeler som beskrevet i eksempel 9. Felt 1 inneholder følgende proteinstandarder elektroforesebehandlet som markører med tilsynelatende molekylvekter (Mr) angitt i kilodalton; cytokrom c, 12,4; lactoglobulin, 18,4; carbonsyreanhydrase, 29,0; lactat-dehydrogenase, 36,0; ovalbumin, 43,0; glutamat-dehydrogenase, 55,0; og fosforylase b, 95,5.

Felt 2 inneholder ca. 20 ] ig protein, bestemt under anvendelse av BCA-proteinbestemmelsesmetoden ifølge Smith et al., Anal. Bioch., 150:76-85 (1985), og redusert under anvendelse av DTT. huTF tungkjede (huTFh) er klart synlig ved ca. 47 Mr, og huTF lettkjede er svakt synlig ved ca. 12,5 Mr. Proteinet ble synliggjort med Coomassie blåbeising som beskrevet av Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970). Figur 9 er en kurve som illustrerer doserespons-kurven av inhibering av huTF-initiert koagulering med ikke-fosfolipiderte (ikke-lipiderte) polypeptidanaloger av huTFh. Prosentvis inhibering av koagulasjon ved forskjellige konsentrasjoner av ikke-lipiderte polypeptider ble målt som beskrevet i eksempel 12. De testede polypeptider innbefatter p26-49 (A, TF26,49), pl21-155 (0, TF121,155), pl46-167 («, TF146,167)ogp204-226 (■ , TF204,226). Figur 10 er en kurve som illustrerer doserespons-kurven av inhibering av huTF-initiert koagulering av fosfo-lipiderte (lipiderte) polypeptidanaloger av huTFh. Prosent-vise inhiberinger ble målt ved de samme metoder og for de samme analoger som beskrevet i figur 9. Figur 11 illustrerer restriksjonskartene av EcoRI-segmentinnskuddene innen de rekombinante DNA-plasmider pCTF64, pCTF314 og pCTF403. Innskuddene (»-♦) representerer overlappende deler av nucleotidsekvenser som sammen til-svarer den komplette nucleotidsekvens av pre-huTFh-genet. Individuelt innbefatter innskuddene nucleotidrester som til-svarer fra venstre til høyre og i retningen fra 5' til 3' til den nucleotidsekvens som er vist i figur 2 fra baserest 1-486 (inneholdt i pCTF64), rester 135-775 (inneholdt i pCTF314) og rester 776-1125 (inneholdt i pCTF403). Også vist er den tilnærmede lokalisering av restriksjonsendonuclease-splittingsseter innen de innskudd som ble anvendt ved konstruksjon av de forskjellige rekombinante DNA-molekyler som er beskrevet i eksempel 16. Ytterligere angitt er den tilnærmede lokalisering av det tilsvarende pre-huTFh-protein med dets lederpeptid ( ) og transmembran-forankringsområde ( Vs/ sA ) vist intakt. Figur 12 er en kurve som illustrerer doserespons-kurven av inhibering av huTF-initiert koagulering med ikke- fosfolipiderte (ikke-lipiderte) polypeptidanaloger av huTFh. Prosentvis inhibering (%) av koagulasjon med forskjellige konsentrasjoner uttrykt i molaritet (M) av ikke-lipiderte polypeptider ble målt som beskrevet i eksempel 12. De under-søkte polypeptider innbefatter p24-35 (A)/p25-49 (0), pl52-169 (□) og peptidene p40-71, p72-104, p94-123 og pl61-189 som alle ikke fremkalte noen vesentlig inhibering og kollektivt er indikert ved den lukkede sirkel (•). Figur 13 er en kurve som illustrerer kinetikken ved inhibering av koagulasjon med et TF8-5G9 antistoffpreparat. Prosentvis inhibering (%) av koagulasjon er nedtegnet over forskjellige antistoff-immunoreaksjonstider målt som beskrevet i eksempel 18.

Figur 14 er en kurve som illustrerer doseresponsen

av inhibering av huTF-initiert koagulasjon med anti-huTF-antistoffer. Prosentvis (%) inhibering av koagulasjon med forskjellige konsentrasjoner av det anti-huTF monoklonale antistoff TF8-5G9 ble målt som beskrevet i eksempel 19.

Figur 15 er en kurve som illustrerer doseresponsen

av inhibering av huTF-initiert koagulering med anti-huTF-antistoffer hvori kilden av huTF er et humant cellelysat av fibroblastcellelinjen GM1381. Prosentvis inhibering (%) av koagulasjon med forskjellige konsentrasjoner av det anti-huTF monoklonale antistoff TF8-5G9, ble målt som beskrevet i eksempel 19. Åpne sirkler (0) betegner TF8-5G9 antistoff, og lukkede sirkler (•) betegner et irrelevant antistoff. Figur 16 illustrerer inhibering av den prokoagulerende aktivitet av renset, human hjerne-TF med anti-TF monoklonalt antistoff TF8-5G9. Den levrende aktivitet av renset, human hjerne-TF rekonstituert i fosfolipidvesikler, ble bestemt etter preinkubering i 30 minutter ved 37°C med varierende konsentrasjoner av renset IgG. Sirkler gjelder anti-TF antistoff TF8-5G9; trekanter angår det irrelevante kontrollantistoff PAblOO. Dataene er uttrykt som prosent inhibering i forhold til aktiviteten observert i fravær av tilsatt antistoff. Figur 17 illustrerer inhiberingsfaktor VII som bindes til, og faktor Xa-dannelse, av dyrkede J82 blære carcinomaceller behandlet med renset anti-TF monoklonale antistoffer. Verdier for inhiberingen av graden av faktor Xa-dannelse er representert ved trekanter; verdier for inhibering av faktor VII-binding er representert ved sirkler. Dataene er uttrykt som prosentvis inhibering i forhold til verdiene erholdt for celler inkubert uten tilsatt antistoff. Felt A, effekten av antistoff TF9-2C4; felt B, effekten av antistoff TF9-5B7.

Figur 18 illustrerer en Western blot-analyse av immunoaffinitetsisolert huTF som beskrevet i eksempel 25.

15% polyacrylamidgeler ble fylt som følger: felt 1 inneholder molekylvektstandarder med tilsynelatende molekylvekter angitt til venstre for felt A i kilodalton (k);

felt 2 inneholder 1 \ ig renset, humant hemoglobin redusert før elektroforese; felt 3 inneholder 0,5 yg isolert huTF redusert før elektroforese; og felt 4 inneholder 0,5 yg ikke-redusert og isolert huTF. Etter SDS-PAGE ble de resulterende proteinbånd elektroforetisk overført til nitro-cellulose. De således dannede Western-avtrykk ble immuno-reagert med 0,2 ug/ ml affinitetsrenset, kanin-anti-huTF IgG (felt A), 1 yg/ml kanin-anti-hemoglobin IgG (felt B) eller 1 ug/ml ikke-immunt kanin IgG (felt C). Tilsynelatende molekylvekter av immunobeisede bånd er angitt i kDA til høyre.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Aminosyre: Alle aminosyrerester identifisert her, er

i den naturlige L-konfigurasjon. I overensstemmelse med standard polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243:3557-59,

(1969), er forkortelser for aminosyrerester vist i etter-følgende overensstemmelseStabell:

OVERENSSTEMMELSESTABELL

Det skal bemerkes at alle aminosyrerestsekvenser er representert her ved formler hvis venstre-til-høyre-orientering er i konvensjonell retning fra aminoenden til carboxyenden. Enn videre skal det bemerkes at en strek ved begynnelsen eller enden av en aminosyrerestsekvens indikerer en binding til et radikal slik som H og OH (hydrogen og hydroxyl) ved amino- og carboxy-endene, eller en ytterligere sekvens på én eller flere aminosyrerester opptil totalt ca. 50 rester i polypeptidkjeden.

Polypeptid og peptid: Polypeptid og peptid er utrykk som anvendes om hverandre her for å angi en lineær serie av ikke mer enn ca. 50 aminosyrerester bundet den ene til den andre med peptidbindinger mellom alfa-amino- og carboxygrupper av tilstøtende rester.

Protein: Protein er et uttrykk anvendt her for å angi en lineær serie på mer enn 50 aminosyrerester bundet den ene til den andre som i et polypeptid.

Nucleotid: En monomer enhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerdel (pentose), et fosfat og en nitrogen-holdig, heterocyklisk base. Basen er kjedet til sukker-gruppen via det glycosidiske carbon (l'-carbon av pentosen), og denne kombinasjon av base og sukker er et nucleosid.

Når nucleosidet inneholder en fosfatgruppe bundet til 3'-eller 5 *-stillingen av pentosen, angis det som et nucleotid.

Basepar (bp): Et fellesskap av adenin (A) med thymin (T), eller av cytosin (C) med guanin (G) i et dobbeltstrenget DNA-molekyl.

B. DNA- segmenter

I levende organismer er aminosyrerestsekvensen av et protein eller polypeptid direkte beslektet via den genetiske kode med deoxyribonucleinsyre- (DNA) sekvensen av det strukturelle gen som koder for proteinet. Således kan et strukturelt gen være definert uttrykt ved aminosyrerestsekvensen, dvs. protein eller polypeptid, for hvilke det koder.

Et viktig og velkjent trekk ved den genetiske kode er dens overflod. For de fleste av aminosyrene anvendt for å fremstille proteiner, kan således mer enn én kodende nucleotidtriplett (kodon) kode for eller angi en bestemt aminosyrerest. Et utall forskjellige nucleotidsekvenser kan derfor kode for en bestemt aminosyrerestsekvens. Slike nucleotidsekvenser betraktes som funksjonelt ekvivalente da de kan resultere i produksjon av samme aminosyrerestsekvens i alle organismer. Leilighetsvis kan en methylert variant av et purin eller pyrimidin være inkorporert i en gitt nucleotidsekvens. Imidlertid påvirker slike methyleringer ikke det kodende forhold på noen som helst måte.

DNA-segmentene ifølge foreliggende oppfinnelse erkarakterisertsom å innbefatte en DNA-sekvens som koder et humant, tungkjedet vevfaktorprotein (huTFh). I foretrukne utførelsesformer innbefatter DNA-segmentet en DNA-sekvens som koder et humant, tungkjedet vevfaktor-forløperprotein (pre-huTFh). DNA-segmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er såledeskarakterisert vednærvær av et huTFh, eller fortrinnsvis et pre-huTFh-strukturelt gen. Ytterligere foretrukket er DNA-segmenter som innbefatter en DNA-sekvens som danner et strukturelt gen som koder for et løselig huTFh eller løselig pre-huTFh-protéin. Fortrinnsvis er genet til stede som en uavbrutt, lineær serie av kodoner hvori hvert kodon koder for en aminosyrerest som finnes i huTFh eller pre-huTFh-proteinet, dvs. et gen fritt for introner.

Således utgjør et DNA-segment bestående hovedsakelig av den sekvens som er vist i figur 2 fra stilling 130 ved dets 5'-ende til ca. stilling 918 ved dets 3'-ende, og som er i stand til å uttrykke huTFh, en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. Et DNA-segment bestående hovedsakelig av sekvensen vist i figur 2 fra stilling 34 til stilling 918 og som er i stand til å uttrykke pre-huTFh, utgjør en annen utførelsesform av oppfinnelsen.

Et foretrukket løselig huTFh-molekyl mangler amino-syrerestene kodet av de siste ca. 150 baser ved 5<1->enden av det DNA som koder for huTFh. Således utgjør et DNA-segment bestående hovedsakelig av sekvensen vist i figur 2 fra ca. stilling 130 ved dets 5'-ende til ca. stilling 756 via ca.

stilling 801 ved dets 3'-ende, og som er i stand til å uttrykke løselig huTFh, en ytterligere foretrukket utfør-elsesform av foreliggende oppfinnelse. Eksempler på foretrukne DNA-segmenter som danner løselig huTFh-strukturelle gener, er de som har en nucleotidbasesekvens representert ved figur 2 fra ca. base 130 til ca. base 756, fra ca.

base 130 til ca. base 771, fra ca. base 130 til ca. base 786, og fra ca. base 130 til ca. base 801.

Foretrukne DNA-segmenter som koder for et løselig pre-huTFh, er lik de som koder for løselig huTFh, bortsett fra at de koder for proteiner inneholdende en aminoterminal ledersekvens slik som aminosyrerester -32 til 0 som vist i figur 1. Således består et foretrukket DNA-segment som danner et strukturelt gen som koder for løselig pre-huTFh, hovedsakelig av den sekvens som er vist i figur 2 fra ca.

stilling 34 ved dets 5'-ende til ca. stilling 756 via ca.

stilling 801 ved dets 3'-ende. Eksempler på foretrukne, løselige pre-huTFh-kodende DNA-segmenter, er de som har en nucleotidbasesekvens representert ved figur 2 fra ca.

base 34 til ca. base 756, fra ca. base 34 til ca. base 771, fra ca. base 34 til ca. base 786, og fra ca. base 34 til ca. base 801.

Homologe DNA- og RNA-sekvenser som koder for de ovenfor angitte huTFh og pre-huTFh-proteiner, innbefattende deres løselige former, er også tatt i betraktning som tidligere diskutert.

DNA-segmenter som koder for huTFh og pre-huTFh-proteiner kan lett syntetiseres ved kjemiske teknikker, f.eks. ved fosfortriestermetoden ifølge Matteucci et al.,

J. Am. Chem. Soc, 103:3185 (1981). (Beskrivelsene av kjent teknikk angitt her, inkorporeres ved referanse). Ved kjemisk syntetisering av den kodende sekvens kan selvsagt enhver ønsket modifisering foretas enkelt ved å anvende de egnede baser istedenfor de som koder for den naturlige aminosyrerestsekvens. DNA-molekyler innbefattende sekvenser eksakt homologe med de som er vist i figur 2, er imidlertid foretrukne.

Enn videre kan DNA-segmenter bestående hovedsakelig av strukturelle gener som koder for huTFh- og pre-huTFh-proteiner, erholdes fra rekombinante DNA-molekyler inneholdende disse gener. Eksempelvis inneholder de rekombinante DNA-molekyler av plasmidtype pCTF64, pCTF314 og pCTF403, DNA-sekvenser som kqder for forskjellige deler av huTFh- og pre-huTFh-proteiner, og utviser sammen den hele sekvens av DNA som er nødvendig for ekspresjon av hvert protein. Kulturer av Escherichia coli (E. coli) transformert med enten pCTF64, pCTF314 eller pCTF403, er blitt deponert ifølge Budapest-traktatens krav ved American Type Culture Collection, (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, den 27. mars 1987 og ble gitt følgende deponeringsnummere 67370, 67368 og 67369.

Et DNA-segment som innbefatter en DNA-sekvens som koder for huTFh eller pre-huTFh, kan fremstilles ved operativ kjeding (ligering) av egnede restriksjonsfragmenter fra hvert av de ovenfor deponerte plasmider under anvendelse av velkjente metoder. DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen fremstilt på denne måte, har typisk kohesive ender, dvs. "overhengende" enkeltstrengede proteiner som strekker seg utover den dobbeltstrengede del av molekylet. Nærvær av kohesive .ender på DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen er foretrukket.

Også tatt i betraktning ifølge oppfinnelsen er ribonucleinsyre- (RNA) ekvivalenter av de ovenfor beskrevne DNA-segmenter.

C. Rekombinante DNA- molekyler

De rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved operativ kjeding av en vektor til et DNA-segment ifølge oppfinnelsen.

Som anvendt her, angir uttrykket "vektor" et DNA-molekyl som er i stand til autonom replikasjon i en celle og til hvilken et annet DNA-segment kan operativt kjedes for å bevirke replikasjon av det bundne segment. Vektorer som er i stand til å lede ekspresjonen av huTFh-og pre-huTFh-gener, angis her som "ekspresjonsvektorer". Et rekombinant DNA-molekyl (rDNA) er således et hybrid DNA-molekyl omfattende minst to nucleotidsekvenser som ikke normalt finnes sammen i naturen.

Valget av vektor til hvilken et DNA-segment ifølge oppfinnelsen operativt kjedes, avhenger direkte, hvilket er velkjent innen faget, av de ønskede funksjonelle egen-skaper, eksempelvis proteinekspresjon og den vertcelle som skal transformeres, og disse er begrensninger tilhørende faget når det gjelder konstruksjonen av rekombinante DNA-molekyler. En vektor ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid i det minste i stand til å lede replikasjonen,

og fortrinnsvis også ekspresjon, av huTFh eller pre-huTFh strukturelle gener innbefattet i DNA-segmenter til hvilke den er operativt kjedet.

I foretrukne utførelsesformer innbefatter en vektor tatt i betraktning ifølge oppfinnelsen, et prokaryotisk replikon, dvs. en DNA-sekvens som har evne til å lede autonom replikasjon og opprettholdelse av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosomalt i en prokaryotisk vertcelle, slik som en bakteriell vertcelle transformert dermed. Slike replikoner er velkjente innen faget. Disse utførelses-former som innbefatter et prokaryotisk replikon, innbefatter i tillegg et gen hvis ekspresjon gir legemiddelresistens til en bakteriell vert transformert dermed. Typiske bakterielle legemiddelresistente gener er de som gir resistens overfor ampicillin eller tetracyclin.

De vektorer som innbefatter et prokaryotisk replikon, kan også innbefatte en prokaryotisk promoter som er i stand til å lede ekspresjon (transkripsjon og translasjon) av huTFh- eller pre-huTFh-genene i en bakteriell vertcelle,

slik som E. coli, transformert dermed. En promoter er et ekspresjonskontrollelement dannet av en DNA-sekvens som muliggjør at binding av RNA-polymerase og transkripsjon kan finne sted. Promotersekvenser som er forenlige med bakterielle verter, tilveiebringes typisk i plasmidvektorer inneholdende hensiktsmessige restriksjonsseter for innskudd av et DNA-segment ifølge oppfinnelsen. Typiske slike vektorplasmider er pUC8, pUC9, pBR322 og pBR329 tilgjengelige fra Biorad Laboratories, (Richmond, CA) og pPL og pKK223 tilgjengelige fra Pharmacia, Piscataway, N.J.

Ekspresjonsvektorer forenlige med eukaryotiske celler, fortrinnsvis de som er forenlige med virveldyrceller, kan også anvendes for å danne de rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Eukaryotisk celleekspresjonsvektorer er velkjente innen faget og er tilgjengelige fra flere kommersielle kilder. Typisk tilveiebringes slike vektorer inneholdende hensiktsmessige restriksjonsseter for innskudd av det ønskede DNA-segment. Typiske slike vektorer er pSVL og pKSV-10, pBPV-l/pML2d og pTDTl (ATCC, nr. 31255).

I foretrukne utførelsesformer innbefatter de eukaryotiske celleekspresjonsvektorer anvendt for å konstruere de rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen, en utvelg-elsesmarkør som er effektiv i en eukaryotisk celle, fortrinnsvis en legemiddelresistent utvelgelsesmarkør. En foretrukket legemiddelresistent markør er genet hvis ekspresjon resulterer i neomycinresistens, dvs. neomycinfosfotransferase-(neo) genet. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341

(1982).

Anvendelse av retrovirale ekspresjonsvektorer for å danne rekombinant DNA ifølge oppfinnelsen, er også tatt i betraktning. Som anvendt her, angir uttrykket "retroviral ekspresjonsvektor" et DNA-molekyl som innbefatter en promoter-sekvens avledet fra den lange, terminale gjentagelsesregion (LTR) av et retrovirusgenom.

I foretrukne utførelsesformer er ekspresjonsvektoren typisk en retroviral ekspresjonsvektor som fortrinnsvis er replikasjonsinkompetent i eukaryote celler. Konstruksjonen og anvendelse av retrovirale vektorer er blitt beskrevet av Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37 (1984).

Et utall metoder er blitt utviklet for operativt å kjede DNA til vektorer via komplementære kohesive ender. Eksempelvis kan komplementære homopolymere strenger tilsettes til det DNA-segment som skal innskytes, og til vektor-DNA. Vektoren og DNA-segmentet forbindes deretter ved hydrogenbind-ing mellom de komplementære, homopolymere haler under dannelse av rekombinante DNA-molekyler.

Syntetiske linkere inneholdende ett eller flere restriksjonsseter, tilveiebringer en alternativ metode for forbinding av DNA-segmentet til vektorer. DNA-segmentet dannet ved endonuklease-restriksjonsoppslutning som tidligere beskrevet, behandles med bakteriofag T4 DNA polymerase eller E. coli DNA polymerase I, dvs. enzymer som fjerner utstående 3', enkeltstrengede ender med deres 3'-5'-exonucleolytiske aktiviteter og fyller inn utskårne 3'-ender med deres polymeriser-ende aktiviteter. Kombinasjonen av disse aktiviteter danner derfor butt-endede DNA-segmenter. De butt-endede segmenter inkuberes deretter med et stort molart overskudd av linker-molekyler i nærvær av et enzym som er i stand til å katalysere ligeringen av butt-endede DNA-molekyler slik som bakteriofag T4 DNA ligase. Produktene av reaksjonen er således DNA-segmenter som bærer polymere kjedesekvenser ved deres ender. Disse DNA-segmenter splittes deretter med det egnede restrik-sjonsenzym og ligeres til en ekspresjonsvektor som er blitt splittet med et enzym som produserer ender som er forenlige med de av DNA-segmentet.

Syntetiske linkere inneholdende et utall av restrik-sjonsendonukleaseseter, er kommersielt tilgjengelige fra et utall av kilder, innbefattende International Biotechnologies1, Inc., New Haven, CN.

Også tatt i betraktning ifølge oppfinnelsen er RNA-ekvivalenter av de ovenfor beskrevne rekombinante DNA-molekyler.

D. Transformerte celler og kulturer

Verteeller kan transformeres med et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et rDNA som er i stand til å uttrykke en løselig form av huTFh eller pre-huTFh. Vertcellen kan enten være prokaryotisk eller eukaryotisk. Bakterielle celler er fortrinnsvis prokaryotiske vertceller og er typisk en stamme av E. coli, slik som f.eks. E. coli-stamme DH5 tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. Foretrukne eukaryote vertceller innbefatter gjær og pattedyrceller, fortrinnsvis virveldyrceller slik som de fra en mus, rotte, ape eller human fibroblastcellelinje. Foretrukne eukaryotiske vertceller innbefatter kinesiske hamster-ovarieceller (CHO) tilgjengelig fra ATCC som CCL61 og MIH sveitsiske museembryoceller NIH/3T3 tilgjengelig fra ATCC som CRL 1658. Transformasjon av egnede celleverter med et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen utføres etter velkjente metoder som typisk avhenger av typen av den anvendte vektor. Med hensyn til transformasjon av prokaryotiske vertceller henvises eksempelvis til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69:2110 (1972); og Maniatis et al., Molecular Cloning, å Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Med hensyn til transformasjon av virveldyrceller med retrovirale vektorer inneholdende rDNA, henvises det eksempelvis til Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730-37

(1984); Graham et al., Virol., 52:456 (1973); og Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1979).

Vellykkede transformerte celler, dvs. celler som inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, kan identifiseres ved velkjente teknikker. Eksempelvis kan celler resulterende fra innføring av et rekombinant DNA ifølge oppfinnelsen krones for å produsere monoklonale kolonier. Celler fra disse kolonier kan høstes, lyseres og deres DNA-innhold undersøkes med hensyn til nærvær av rekombinant DNA under anvendelse av en metode som den som er beskrevet av Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) eller Berent et al., Biotech., 3:208 (1985).

I tillegg til direkte bestemmelse med hensyn til nærvær av rekombinant DNA kan vellykket transformasjon bekreftes ved velkjente immunologiske metoder når dette DNA er i stand til å lede ekspresjon av huTFh eller pre-huTFh. Eksempelvis utviser celler som er vellykket transformert med en ekspresjonsvektor, proteiner som utviser huTFh- eller pre-huTFh-antigenisitet. Prøver av celler som mistenkes for å være transformert, høstes og bestemmes med hensyn til huTFh eller pre-huTFh under anvendelse av antistoffer som er spesifikke for disse antigener, slik som de som produseres av et hybridom ifølge oppfinnelsen.

Næringsmedier som er anvendbare for dyrkning av transformerte vertceller, er velkjente innen faget og kan erholdes fra flere kommersielle kilder. I utførelsesformer hvori vertcellen er fra et pattedyr, anvendes fortrinnsvis et "serumfritt" medium.

E. Metoder for fremstilling av huTFh- og pre- huTFh-proteiner

Proteiner som utviser huTFh-antigenisitet, er proteiner som immunoreagerer med antistoffer fremkalt av naturlig vevsfaktor. Proteiner som utviser huTFh-antigenisitet, er anvendbare som antigener og for dannelse av antistoffer, som kan anvendes i diagnostiske systemer og metoder.

Proteinene kan fremstilles ved initiering av en kultur omfattende et næringsmedium inneholdende vertceller, fortrinnsvis humane celler, transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen som er i stand til å uttrykke et huTFh-eller pre-huTFh-protein, fortrinnsvis et løselig huTFh,eller løselig pre-huTFh-protein. Kulturen opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til at de transformerte celler får uttrykke et huTFh- eller pre-huTFh-protein. Det uttrykte protein fjernes deretter fra kulturen. De fremstilte huTFh-proteiner utviser dessuten huTFh biologisk aktivitet, dvs. evnen til å binde faktor VII/Vila. Disse metoder innbefatter dyrkning av pattedyrvertceller transformert med et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke pre-huTFh-genet i cellene. Dyrkningen resulterer i ekspresjon av pre-huTFh-proteinet og etterfølgende intracellulær, post-translasjonell modifisering av pre-huTFh under dannelse av et biologisk aktivt huTFh-protein.

Metoder for gjenvinning av et uttrykt protein fra en kultur er velkjent innen faget og innbefatter fraksjonering av den proteinhoIdige del av kulturen, under anvendelse av velkjente biokjemiske teknikker. Eksempelvis kan metoder for gelfiltrering, gelkromatografi, ultrafiltrering, elektroforese, ionebytting, affinitetskromatografi og lignende, som er kjent for proteinfraksjoneringer, anvendes for å.isolere de uttrykte proteiner funnet i kulturen. I tillegg kan immunokjemiske metoder slik som immunoaffinitet, immuno-adsorpsjon og lignende, utføres under anvendelse av velkjente metoder.

F. huTFh- og pre- huFTh- proteinpreparater oa ekspre-s i onsprodukter

Det rekombinante DNA ifølge oppfinnelsen produserer huTFh- og pre-huTFh-proteinekspresjonsprodukter. I foretrukne utførelsesformer har huTFh- og pre-huTFh-ekspresjonsproduktene en aminosyresekvens svarende til rester 1 til 263 og -32 til 263 som vist i figur 1. Fortrinnsvis er det uttrykte protein minst 90 %, mer fordelaktig minst 95 %, av lengden av den pre-huTFh-aminosyrerestsekvenslengde som er vist i figur 1.

I en annen utførelsesform tas løselige former av huTFh og pre-huTFh og sammensetninger inneholdende løselig huTFh og/eller løselig pre-huTFh i betraktning. Uttrykket

"løselig" som anvendt her, angir huTFh- og pre-huTFh-molekylerkarakterisertsom bestående hovedsakelig av det ekstracellulære område av de naturlige huTFh- og pre-huTFh-molekyler, dvs. den del av huTFh- og pre-huTFh-molekylene som er aminoterminal til rest 220 som vist i figur 1. Løselig huTFh og løselig pre-huTFh inneholder derfor ikke noen vesentlig

del av transmembran-ankerregionen dannet i de naturlige molekyler (rest 220-242 som vist i figur 1). Det skal bemerkes at uttrykkene "huTFh" og "pre-huTFh" som anvendt her, tar i betraktning og innbefatter, med mindre annet spesifikt er angitt, de løselige former av disse proteiner.

Fordi løselig huTFh og løselig pre-huTFh ikke inneholder en hydrofob transmembran-ankerregion, aggregerer de ikke. vesentlig i fysiologisk akseptable, vandige løsninger. Løselig huTFh og løselig pre-huTFh er derfor ytterligerekarakterisert vedderes evne til å danne en vandig løsning, under anvendelse av et fysiologisk akseptabelt fortynnings-middel, ved proteinkonsentrasjon på 0,1 pg/ml til 100 ng/ml, hvori minst ca. 70, fortrinnsvis ca. 80, og helst ca. 90 vekt% av det tilstedeværende huTFh- eller pre-huTFh-protein er i ikke-aggregert (monomer) form. Metoder for bestemmelse av mengden av aggregering tilstedeværende i en proteinløsning, er vel kjent innen faget og innbefatter størr-elsesfraksjonering ved eksklusjons-kolonnekromatografi.

Et foretrukket, løselig huTFh-protein har en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca. rest 1 ved sin aminoende til ca. rest 209 til ca. rest 224 ved sin carboxyende. De foretrukne, løseligehuTFh-proteiner er således de som har en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca. rest 1 til ca. rest 209, fra ca. rest 1 til ca. rest 214, fra ca. rest 1 til ca. rest 219, og fra ca. rest 1 til ca. rest 224.

Et foretrukket, løselig pre-huTFh-protein har en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca.

rest -32 ved dets aminoende til ca. rest 209, via ca.

rest 224 ved dets carboxyende. Således er foretrukne, løse-lige pre-huTFh-proteiner de som har en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra ca. rest -32 til ca. rest 209, fra ca. rest -32 til ca. rest 214, fra ca. rest -32 til ca. rest 219, og fra ca. rest -32 til ca. rest 224.

I en utførelsesform er huTFh-og pre-huTFh-ekspresjonsproduktene ikke glycosylerte, dvs. de fremstilles i en prokaryotisk celle transformert med det rekombinante DNA ifølge oppfinnelsen. En ikke-glykosylert form av huTFh og pre-huTFh er anvendbar som et immunogen og som et antigen i et inokulum og diagnostisk system.

Eksempler

1• Fremstilling av vevfaktor- holdig, humant

h j erneekstrakt

Normale, humane hjerner erholdt ved autopsi, ble enten bearbeidet innen 12 timer eller lagret fryst ved -80 grader Celsius (C). Meninger og lillehjernen ble fjernet, og de gjenværende hjernedeler ble homogenisert i et likt volum kald (0 grader C) aceton under anvendelse av en "Poly-tron" homogenisator. Det resulterende homogenisat ble blandet med ytterligere 3 volumer kald aceton, og vev-faststoff-fraksjonen ble fjernet ved filtrering under anvendelse av en sintret glasstrakt. Acetonløselige materialer ble ekstrahert fra det gjenværende, faste materiale ytterligere syv ganger, hver gang ved blanding med to volumer kald aceton og etter-følgende filtrering. Etter sluttfiltreringen ble restacetonet fordampet ved atmosfæretrykk fra det tilbakeholdte, faste materiale over natten ved 20 °C.

Det gjenværende hjernevev-faststoff ble deretter underkastet 5 ekstraksjoner, hver utført ved blanding av de faste materialer med en 2:1 heptan:butanolløsning i et forhold på 1 gram vev-faststoff pr. 25 milliliter (ml) heptan:butanol, etterfulgt av filtrering for å fjerne de faste materialer. Etter den sluttelige filtrering ble det gjenværende hjernevev-faststoff igjen tørket over natten ved 20°C under atmosfæretrykk under dannelse av et delipidert hjernevevpulver som ble lagret ved -80°C inntil det ble anvendt.

25 g av hjernevevpulveret ble deretter blandet med 500 ml TS/EDTA buffer [100 millimolar (mM) NaCl, 50 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 0,02% natriumazid, 5 mM ethylendiamintetra-eddiksyre (EDTA), 0,1% (v/v) "Triton" X-100 (polyacryl-ethylen 9 octylfenylether)] og ble omrørt over natten ved 4°C. Blandingen ble deretter sentrifugert ved 15.300 x g i 1 time. Den resulterende pellet ble resuspendert i 500 ml buffer A [100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,02% natriumazid, 2% "Triton" X-100] under dannelse av en opp-slemming. Etter omrøring i 1 time ved romtemperatur ble oppsleminingen sentrifugert som beskrevet ovenfor. Den resulterende supernatant ble gjenvunnet, lyofilisert og deretter oppløst i 100 ml buffer A under dannelse av en huTF-holdig hjerneekstraktløsning.

2. Koagulasjonsbestemmelse for å måle huTF

prokoagulerende aktivitet

huTF prokoagulerende aktivitet ble målt i en éntrinns-koagulasjonsbestemmelse utført med alle reagenser og blandingen opprettholdt ved 37°C. En ansamling av normalt, humant plasma ble citrert ved blanding av 1 volum plasma med 1 volum av en løsning inneholdende 20 mM natriumcitrat-dihydrat og 140 mM NaCl, pH 7,4. 100 mikroliter av en prøve inneholdende huTF fortynnet i TBS/BSA løsning (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% kvegserumalbumin) ble blandet med 100 yl av det citrerte plasma. 100 yl av en 25 mM CaCl2-løsning ble deretter tilblandet under dannelse av en koagu-las jonsreaksjonsblanding som ble forsiktig ristet inntil koagulering fant sted. Tiden mellom tilsetning av CaC^ og klumpdannelse ble målt. En standardkurve av huTF-aktivitet ble deretter konstruert ved å nedtegne fortynning mot koa-gulas jonstid i sekunder. En eksempelvis standardkurve er vist i figur 3.

3. Fremstilling av en faktor VII- holdig fast bærer

for affinitetsisolering av huTF

Human faktor VII/Vila ble isolert som beskrevet av Fair, Blood, 62:784-91 (1983), som inkorporeres herved ved referanse. Denne isolerte faktor VII/Vila ble aktivert for kobling til en fast agarosematrise ved dialyering av 5 milligram (mg) mot 0,1 M 2-(N-morfolino)-ethansulfonsyre (MES) (pH 6,5) over natten ved 4°C. Calciumklorid ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Faktor VII/Vila ble deretter blandet med 4 ml "AffiGel-15" aktiverte agaroseperler, og den resulterende koblings-reaksjonsblanding ble bearbeidet ved rotasjon i 4 timer ved 4 °C i henhold til fabrikantens anbefalinger.

Overskudd av proteinbindingsseter på den faste bærer ble blokkert ved forsiktig omrøring av den faste bærer i 0,1 M glycinethylester i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble den faste bærer vasket i rekkefølge på en sintret glasstrakt med ca. 20 ml hver av (1) buffer A, (2) buffer A inneholdende 1 M NaCl, (3) buffer A inneholdende 5 mM EDTA og (4) buffer A inneholdende 1 mM CaC^. Overskudd av væske ble deretter fjernet ved vakuum under dannelse av en halv-tørr, partikkelformet masse (kake).

4. Faktor VII/ VIIa- affinitetsisolering av huTF

20 ml av en løsning inneholdende 0,1 M glycinethylester og 0,1 M MES, pH 6,5, ble blandet med 22,5 ml "Affigel-15" agaroseperler (Biorad) under dannelse av en koblingsreaksjonsblanding. Koblingsreaksjonsblandingen ble opprettholdt ved romtemperatur i 1 time. Det resulterende konjugat ble vasket på en sintret glasstrakt 4 ganger med 10 volumer buffer 1 filtrert under vakuum, under dannelse av en glycinetherester-agarosekake. 30 ml hjerneekstraktløsning fremstilt i eksempel 1, ble dialysert over natten ved 4°C mot 6 liter av buffer A inneholdende 1 mM calciumklorid. Dialysert hjerneekstrakt ble blandet med glycinethylester-agarosekaken under dannelse av en fast-væskefasereaksjonsblanding. Etter å ha vært holdt i 2 timer ved romtemperatur under rotasjon, ble den faste fase og væskefasen separert ved filtrering under anvendelse av en sintret glasstrakt. Væskefasen ble gjenvunnet og blandet med "Trasylol" ("aprotinin") til en sluttkonsentrasjon på 10 enheter pr. ml. Den gjenvunde væskefase ble blandet med faktorVII/VIIa/agarosekaken fremstilt i eksempel 3 under dannelse av en andre fast/væskefaseblanding.

Denne blanding ble opprettholdt over natten ved 4°C under rotasjon for å tillate dannelse av et huTF-faktor VII/VIIa-holdig fast fase-produkt. Den faste fase og væskefasen ble deretter separert ved filtrering som tidligere beskrevet. Den faste fase bibeholdt på den sintrede glasstrakt, ble vasket med 25 ml buffer A inneholdende 1 mM calciumklorid. Den faste fase ble deretter overført til en sintret glasskromatografikolonne (0,5 x 10 cm; Biorad) og ble vasket med 6 ml av samme vaskebuffer. Ethvert huTF bundet til den faste bærer etter de ovenfor angitte vaskinger, ble deretter frigitt (eluert) ved vasking av den faste bærer mens den ble bibeholdt på den sintrede glasskolonne, med buffer å inneholdende 5 mM EDTA. Eluert materiale ble oppsamlet i 1 ml fraksjoner, og hver fraksjon ble bestemt med hensyn til nærværet av huTF som beskrevet i eksempel 2. huTF-holdige fraksjoner ble oppsamlet og dialysert over natten mot 6 liter TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) inneholdende

1 % "Triton" X-100 (TBS/Triton) ved 4 °C.

Det således dannede dialysat ble deretter blandet med 4 volumer kald aceton for å utfelle huTF-proteinet. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering ved 5 000 x g i 30 minutter ved ca. -10 °C. Den resulterende pellet ble tørket under nitrogen. Typiske utbytter var 2 ug huTF pr. gram (tørrvekt) av delipidert hjernevevpulver.

En prøve av det således dannede, isolerte huTF, ble suspendert i TBS/Triton og ble deretter merket med Na125I

(16 mikrocurie pr. mikrogram) under anvendelse av jodogen i henhold til fabrikantens spesifikasjoner. Etter merking ble overskudd uomsatt<125>I separert fra merket huTF ved avsalt-ningskromatografi på "Sephadex" G25 under anvendelse av TBS/Triton.

<125>I-merkede huTF-holdige prøver ble bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) i henhold til Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970). Dithiothreitol (DTT) ble innbefattet i prøvebufferen til

100 mM for de prøver som ble bestemt under reduserende betingelser. Immunoutfellinger ble foretatt ved inkubering over natten ved 4 °C av<125>I-huTF i 1 % "Triton" X100, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl med 1/10 volum TF8-5G9 eller PAb 100 (ATCC TIB 115; et hybridom som produserer et SV40 stort T-antigen spesifikt antistoff anvendt her som en negativ kontroll) hybridomkultur-supernatant. Geite-anti-muselgG immobilisert på agaroseperler ble deretter anvendt for å adsorbere de primære immunoreaksjonsprodukter. Perlene ble vasket grundig med samme buffer, og det bundne125I-huTF ble eluert ved kokning i 5 minutter i prøvebuffer med eller uten DTT. Proteinbånd ble synliggjort etter SDS-PAGE ved auto-

fluorografi.

Når isolert huTF ble radiojodert, redusert med DTT og analysert ved SDS-PAGE på 10% acrylamidgeler, ble et enkelt hovedbånd med en tilsynelatende molekylærmasse på 47 kDa observert (figur 4). Når uredusert huTF på lignende måte ble analysert, ble imidlertid to bånd på ca. 58 og 47 kDa observert i relativt like mengder (figur 5, felt B), som antyder minst to forskjellige størrelsesformer.

Mulige forklaringer for de to bånd observert i fravær av reduksjon, kan være at det større, dvs. langsommere, vandrende bånd, kan være sterkere glycosylert, kan utvise ytterligere ikke-bearbeidet protein, eller kan være assosiert med ytterligere, disulfid-bindingskjedede polypeptider. Nærvær av et enkelt bånd etter reduksjon var ikke i overensstemmelse med de første to antagelser. Den siste mulighet syntes å være mest sannsynlig, men på grunn av den lille størrelsesforskjell vil ytterligere polypeptidkjeder sannsynligvis være tilstrekkelig små til å vandre til eller nær fargefronten og ikke bli oppløst av 10% acrylamidgeler etter reduksjon. Elektroforese av redusert og ikke-redusert huTF på 15% polyacrylamidgeler mislyktes i å vise en enkel, adskilt, lett kjede, selv om flere mindre, hurtig vandrende bånd ble observert (figur 5, felt A og B). Disse små, mindre polypeptider kan representere forurensninger som tidligere er blitt observert [Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985) og Guha et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:299-302 (1986)]. For klart å løse mulighetene ble 47 kDa-og 58 kDa-båndene skåret ut fra den ikke-reduserte gel, og hver ble redusert med dithiothreitol og individuelt underkastet SDS-PAGE på en 15% acrylamidgel (figur 5,

felt C og D). 58 kDa-proteinet ble oppløst som en 12,5 kDa lettkjede og en 47 kDa tungkjede. Når 47 kDa-proteinet ble undersøkt, ble bare en tung kjede med samme molekylvekt observert. Begge former utviste således tunge kjeder med lignende adferd på SDS-PAGE.

For å demonstrere nærvær av den lette kjede direkte, 125

ble I-huTF immunoutfelt med det huTF-spesifikke, monoklonale antistoff TF8-5G9 og underkastet elektroforese i nærvær av reduksjonsmiddel. Hoved 47 kDa-båndet ble observert sammen med et adskilt bånd på ca. 12,5 kDa (figur 6, felt A). Elektroforese av prøven uten foregående reduksjon ga bånd på ca. 47 kDa og 58 kDa, men ikke noe lavmolekylært polypeptid (figur 6, felt B). Elektroforese av ikke-redusert huTF ga også mindre mengder av 90 kDa-protein, i overensstemmelse med en dimer av huTF tungkjede som er blitt antydet av Broze et al., J. Biol. Chem., 260:10917-20 (1985).

For å undersøke muligheten for at huTF-lettkjeden kunne være avledet proteolytisk fra den tunge kjede, ble de SDS-PAGE-isolerte, lette og tunge kjeder underkastet en N-terminal aminosyresekvensanalyse.

Lette og tunge kjeder ble oppløst på SDS-PAGE og elektroavtrykt på aktivert, amino-derivatisert fiberglass-filtere under anvendelse av den høye pH-metoden ifølge Abersold et al., J. Biol. Chem., 261:4229-4238 (1986). Proteinbåndene ble synliggjort på avtrykkene ved fluorescent beising Abersold et al., supra, ble utskåret og sekvens-analysert, fremdeles bundet til fiberglasset, i en Applied Biosystems 470A proteinsekvensanalysator med tilkoblet HPLC-analyse av PTH-derivater. Alternativt ble proteinbåndene synliggjort på gelen ved beising ved Coomassie blue og elektroeluert for sekvensanalyse. Begge metoder ga ekvivalente resultater.

Mikrosekvensering av huTF-tungkjeden resulterte gjennomført i to samtidige aminosyresekvenser i grovt regnet ekvimolare mengder. I praktisk talt alle tilfeller fremkom hver aminosyrerest to ganger, to sykluser adskilt fra hverandre. Dette er et klart bevis for forskjøvede N-ender av to varianter av huTF-tungkjeden som avviker i lengde ved N-enden med to rester. N-enden av den større variant ble utledet til å være Ser-Gly-X-X-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr-X-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser, hvori X representerer en uspesifisert aminosyrerest.

Flere forsøk på å sekvensere den lette kjede ga

I ■ -

ingen sekvensinformasjon, i overensstemmelse med en blokkert N-ende. Den tunge og lette kjede av huTF er imidlertid antigenisk distinkt, da to kanin-anti-huTF-antisera og 28 murine, monoklonale antistoffer dannet mot isolert huTFh, alle ble funnet å bindes til den tunge kjede alene. Det er derfor usannsynlig at den lette kjede er et proteolytisk fragment av den tunge kjede. I tillegg reagerte ikke den lette kjede med antisera overfor beta~2mikroglobulin.

Betydningen av den 12,5 kDa huTF lette kjede er for tiden ukjent. Det er usannsynlig at den er avledet kunstig under isolering ved vilkårlig disulfidbinding, da det er en enkel, adskilt, molekylær art. Når affinitetsisolert huTF ble underkastet SDS-PAGE uten reduksjon, ble huTF-aktivitet eluert fra geler svarende til både 58 kDa og 47 kDA molekyl-vektformene. huTF-aktivitet svarende til disse to molekyl-vektformer, ble også påvist når urene hjerne- eller delvis isolerte placentalekstrakter ble underkastet elektroforese på SDS-geler (data ikke vist). I alle tilfeller var aktiviteten faktor VII-avhengig, som således indikerer huTF-spesifikk aktivitet. Disse observasjoner indikerer at huTFh alene kan aktivere faktor VII og at den lette kjede ikke er nødvendig for denne funksjon.

Det er av interesse at den lette kjede er disulfid-bundet til bare ca. halvparten av de huTF tunge kjeder. Enten er den fraværende i in vivo fra en signifikant del av huTF, eller er tilstede, men assosiert via ikke-covalente interaksjoner som kan avbrytes av detergenter. Den lette kjede av huTF kan ha passert uobservert i tidligere studier fordi dens lille størrelse vil resultere i vandring til fargefronten i SDS-PAGE, og fordi publiserte analyser av huTF er blitt utført etter reduksjon. De begrensede mengder som kan isoleres under anvendelse av foreliggende affini-tetsmetoder, gjør det vanskelig å påvise en assosiert liten polypeptidkjede ved proteinbeising.

Selv om monomert huTF vil initiere koagulasjon

in vitro, finner det sted fysiologisk initiering av koagula-

sjonen av huTF på celleoverflater. Man kan spekulere på om den lette kjede kan spille en mer innviklet rolle i huTF-funksjonen eller organiseringen enn det som kan påvises ved en direkte koagulasjonsbestemmelse. Eksempelvis kan den lette kjede være involvert i sammensetningen av to-subenhet-reseptoren for faktor VII som er blitt antatt å forklare den tilsynelatende positive sam-aktivitet av binding av faktor VII/Vila til vevfaktor. Alternativt kan organisering av huTF i strukturelle områder på celleoverflaten og reguler-ing av huTF-aktiviteten på celleoverflater være formidlet av huTF-lettkjedemolekylet.

Rollen som spilles av N-kjedede oligosaccharider,

ble undersøkt ved deglycosylering av en prøve av<125>I-huTF. Ca. 12,74 nanogram (ng) av merket huTF inneholdende ca.

5

3,6 x 10 slag pr. minutt (cpm), ble blandet med 20 yl av en løsning inneholdende 0,4 enheter "Glycopeptidase F" 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA og 1 % "Triton " X-100, og ble deretter opprettholdt i 16 timer ved 37 °C. De deglykosyl-erte produkter ble deretter analysert ved SDS-PAGE som tidligere beskrevet.

Resultatene av deglycosyleringsstudiene vist i figur 7, felt 4 og 5, indikerer at 58 kDa-formen av huTF utviser et større relativt molekyl enn 47 kDa-formen på grunn av nærvær av addisjonsproteindeler, dvs. den lette kjede.

Således isolert huTF ble relipidert for å rekonsti-tuere dens prokoagulerende aktivitet. Vevfaktor:lipid-forholdet som er nødvendig for å tilveiebringe et relipidert vevfaktorprodukt med maksimal aktivitet, ble empirisk bestemt ved oppløsning av det isolerte huTF erholdt ovenfor, til forskjellige konsentrasjoner i HBS bufferløsning (20 mM Hepés, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% natriumazid) inneholdende 0,1% BSA. De forskjellige huTF-fortynninger ble deretter relipidert som beskrevet i det etterfølgende, og det forhold som produserte den høyest gjenvundne aktivitet som bestemt i koagulasjons-bestemmelsene beskrevet i eksempel 2, ble deretter fremstilt for senere bruk.

Lipider for relipidering av huTF ble fremstilt ved ekstrahering av disse fra kaninhjerne-acetonpulver erholdt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Pulveret ble blandet med heptan:butanol (2:1, v/v) i et forhold på 25 ml heptan-butanol pr. gram pulver, og de faste materialer inneholdt deri, ble gjenvunnet ved filtrering under anvendelse av en sintret glasstrakt. Denne ekstraksjonsprosess ble gjentatt 6 ganger på det tilbakeholdte, faste materiale. Det gjenværende faste materiale ble deretter tørket ved roto-fordampning, ble oppløst i kloroform og lagret ved -80°C. Etter behov ble porsjoner av det kloroform-oppløste, faste materiale tørket under nitrogen og oppløst til en konsentrasjon på 4 mg/ml i en løsning av friskt fremstilt 0,25% natriumdeoxycholat under dannelse av en kaninhjerne-fosfolipidløsning (RBPL).

For relipidering ble 100 yl av hver huTF-fortynning blandet med 100 yl RBPL-løsning, 0,76 ml HBS-løsning inneholdende 0,1% kvegserumalbumin (HBS/BSA) og 40 yl av en 100 mM kadmiumkloridløsning. Denne blanding ble opprettholdt ved 37°C i 2 timer, og aktiviteten av huTF inneholdt deri, ble bestemt ved koagulasjonsbestemmelsen beskrevet i eksempel 2.

7. Isolering av immunoglobulin IgG

Immunoglobulin IgG ble isolert fra ascitesvæske av

en mus inneholdende musehybridomcellelinje TF8-5G9 (ATCC

nr. HB9382) under anvendelse av et Biorad Laboratories MAPS II-system i henhold til fabrikantens instruksjoner. Protein-konsentrasjonen av det isolerte IgG ble bestemt under anvendelse av BCA protein-bestemmelsesreagens i henhold til fabrikantens spesifikasjoner.

8. Fremstilling av en anti- huTF- holdig fast bærer

for immunoaffinitetsisolerinq av huTF Anti-huTF-antistoffer ble aktivert for kobling til

en fast agarosematrise ved dialysering av 10 mg MAPS-isolert TF8-5G9 monoklonalt antistoff, fremstilt som beskrevet i eksempel 7, mot 500 ml av en dialysebuffer bestående av 0,1 M MES, pH 6,5, i 16 timer ved 4°C med minst én forandring av dialysebufferen. De aktiverte TF8-5G9-antistoffer ble

deretter blandet med 2 ml "AffiGel-10" agaroseperler, og den resulterende koblings-reaksjonsblanding ble bearbeidet i henhold til fabrikantens instruksjoner under dannelse av en fast TF8-5G9/agarosebærer.

Overskudd av proteinbindende seter på den faste bærer ble deretter blokkert, vasket og vakuumfiltrert som beskrevet i eksempel 3, under dannelse av en TF8-5G9/agarosekake.

9. Immunoaffinitetsisolering av huTF

Hjerneekstraktløsning ekvivalent med ca. halvparten av en human hjerne, dvs. ca. 100 ml, og fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble dialysert over tre dager med to for-andringer mot totalt 6 liter buffer A ved 4°C. Det dialyserte hjerneekstrakt ble deretter sentrifugert ved 10.000 x g i 1,5 time. Den resulterende supernatant ble blandet med glycin-ethylester-agarosekaken fremstilt i eksempel 4, under dannelse av en fast-væskefase-reaksjonsblanding. Etter å ha blitt opprettholdt i 2 timer ved romtemperatur under omrøring, ble den faste og væskeformige fase separert ved filtrering under anvendelse av en sintret glasstrakt. Den huTF-holdige væskefase ble gjenvunnet og"blandet med TF8-5G9/agarosekaken fremstilt i eksempel 8 under dannelse av en fast/væskefase-immunoreaksjonsblanding.

Immunoreaksjonsblandingen ble opprettholdt over natten ved 4°C under rotasjon for å muliggjøre dannelse av et vevfaktor-holdig, fast fase-immunoreaksjonsprodukt. Den faste og væskeformige fase ble deretter separert ved filtrering som tidligere beskrevet. Den faste fase ble bibeholdt og deretter vasket med 10 volumer av buffer A. Den faste fase ble deretter overført til en glasskromatografikolonne og vasket i rekkefølge med (1) 2 volumer 1 M NaCl inneholdende 1% "Triton" X-100, og (2) 2 volumer 0,1 M glycin, pH 4,0, inneholdende 1% "Triton" X-100.

Ethvert huTF immunologisk bundet til den faste bærer etter de ovenfor angitte vaskinger, ble deretter frigitt (eluert) ved vasking av den faste bærer mens den ble holdt på en sintret glasstrakt, med 20 ml 0,1 M glycin, pH 2,5, og

1% "Triton" X-100. Eluert materiale ble deretter oppsamlet, bestemt med hensyn til huTF, samlet og dialysert, alt som beskrevet i eksempel 4.

Dialysatet ble deretter blandet med fire volumer kald aceton for å utfelle huTF-protein. Bunnfallet ble deretter oppsamlet ved sentrifugering ved 5.000 x g i 30 minutter ved ca. -10°C. Den resulterende pellet ble tørket under nitrogen, og en del av pelleten ble analysert ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under denaturerende betingelser.

Resultatene av denne analyse, vist i figur 8, indikerer at huTFh kan immunoaffinitetsisoleres med et ut-bytte på 33 mg huTFh pr. gram delipidert hjernepulver. 10. Inhibering av koagulasjon med anti- huTF-antistoffer 10 mikroliter av en hybridomkultursupernatant ble blandet med 90 yl HBS/BSA inneholdende ca. 2 ng av det relipiderte huTF fremstilt i eksempel 4. De således dannede immunoreaksjonsblandinger ble opprettholdt ved 37°C i 30 minutter for å tillate at anti-huTF-antistoffmolekylene fikk immunologisk binde huTF og danne et immunoreaksjonsprodukt. Immunoreaksjonsblandingene ble deretter bestemt med hensyn til huTF-prokoagulerende aktivitet som beskrevet i eksempel 2. Et irrelevant IgG-preparat ble anvendt istedenfor anti-huTF-antistoff som en negativ kontroll.

En effektiv huTF-konsentrasjon ble ekstrapolert fra standardkurven dannet som i eksempel 2 under anvendelse av levringstiden målt i nærvær av inhibitor. Inhiberingen ble uttrykt som et prosentvis forhold av den effektive huTF-konsentrasjon over den virkelig anvendte huTF-konsentrasjon. Monoklonale antistoffmolekylpreparater som fremkaller minst 50% inhibering, ble valgt som nøytraliserende antistoffmolekylpreparater ifølge oppfinnelsen.

Utallige kultursupernatanter fra hybridomer dannet mot isolert huTF som beskrevet i eksempel 5, ble målt ved

den ovenfor angitte prosedyre med hensyn til deres evne til å inhibere initiering av koagulering. Disse hybridomer som ble funnet å signifikant inhibere initieringen av koagulasjon, er identifisert i tabell 5.

Inhibering av koagulajon med anti-huTF-antistoffer ble også utført under anvendelse av fordannede huTF-

faktor VII-komplekser. 10 yl inneholdende ca. 1 ng relipidert huTF fremstilt i eksempel 4, ble blandet med 70 yl

HBS/BSA, 10 Ul 20 mM calciumklorid, og hvor det er angitt, 10 ul inneholdende ca. 25 ng faktor VII fremstilt som beskrevet i eksempel 3. Denne blanding ble opprettholdt ved 37°C i 15 minutter for å tillate at huTF fikk danne et kompleks med enhver faktor VII tilgjengelig i blandingen. Deretter ble 10 pl løsning ytterligere tilblandet, inneholdende ca. 10 ng MAPS-isolert, monoklonalt antistoff fremstilt som beskrevet i eksempel 7, og denne andre tilblanding ble opprettholdt ved 37°C i 30 minutter. Inhibering av koagulasjon ble deretter målt i den resulterende blanding ved tilsetning først av 100 pl 20 mM calciumklorid, etterfulgt av 100 pl av enten humant, citrert plasma eller faktor VII uttømt plasma fremstilt som beskrevet i eksempel 12, og levringstiden ble observert i sekunder. Prosent inhibering ble uttrykt som beskrevet i eksempel 10, og resultatene av disse inhiberinger med fordannet huTF-faktor VII-kompleks er vist i tabell 6a.

Ytterligere studier av inhibering av koagulasjon med anti-huTF-antistoffer er blitt utført under betingelser som sammenligner inhibering før og etter TF er blitt assosiert med faktor VII/Vila under dannelse av et TF:faktor VII/VIIa-kompleks.

I disse studier ble inhiberingen av koagulasjon med anti-huTFh-antistoffer under anvendelse av fordannede TF:VII/VIIa-komplekser utført hovedsakelig som beskrevet ovenfor i eksempel 10, bortsett fra at den anvendte 10 pl monoklonale antistoff-holdige løsning var hybridomkultur-supernatant istedenfor en MAPS-isolert, monoklonal anti-stof f-holdig løsning. Til sammenligning ble inhibering av koagulasjon med anti-huTF-antistoffer bedømt ved dannelse av immunokomplekser mellom disse antistoffer og relipidert huTF før blanding med citrert plasma inneholdende

faktor VII/Vila som beskrevet ovenfor i eksempel 10.

Selv om alle for tiden beskrevne antistoffer ble

undersøkt ved denne sammenlignende inhiberingsbestemmelse, ble bare de som utviste større enn ca. seksti prosent (60%) inhibering, betraktet som signifikante med hensyn til evne til å inhibere koagulasjon initiert med et huTF:VII/VIIa-kompleks. Disse MoAb-er er TF9-1B8, TF9-5B7, TF8-5C4, TF8-11D12 og TF8-21F2.

15. Konstruksjon av et DNA- segment inneholdende

den hele pre- huTFh- kodende sekvens

Et DNA-segment inneholdende den hele pre-huTFh-kodende sekvens, kan konstrueres på følgende måte under anvendelse av rekombinante plasmider pCTF64, pCTF403 og pCTF314 hvis restriksjonskart er vist i figur 11, og prose-dyrer som er velkjente innen faget. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1983).

Innskuddsegmentene inneholdt innen de rekombinante DNA-plasmider vist i figur 11, har EcoRI-linkeren 5<1->GGAATTCC-3<1>(Collaborative Research, Lexington, MA) ved hver ende for å lette kloningsprosessen. Disse kjeder sekvenser er ikke til stede i nucleotidsekvensen vist i figur 2 ettersom de ikke er noen del av den naturlig forekommende huTFh DNA-kodende sekvens. For at de etterfølgende beskrivelser av konstruksjon av rekombinante DNA-molekyler skal bli klare med hensyn til de involverte huTFh DNA-sekvenser, vil segmenter dannet ved oppslutninger som innbefatter EcoRI-ender og som således kan inneholde disse ytterligere kjedersekvenser, bli henvist til med nucleotid-basetallet vist i figur 2. Det skal forstås at segmentene kan inneholde disse ytterligere sekvenser ved sine ender.

Plasmid pCTF64 oppsluttes med restriksjonsendonucle-asene EcoRI og Dralll under dannelse av et DNA-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra baserest 1 til rest 296. Det 302 nucleotid basepar- (bp) segment som således dannes, isoleres ved størr-elsesfraksjoner under anvendelse av en agarosegel, og det fosforyleres deretter ved behandling av alkalisk fosfatase.

Plasmid pCTF403 oppsluttes med restriksjonsendonuclease EcoRI under dannelse av et DNA-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 776 til rest 1125. Det resulterende 352 bp-segment isoleres ved størrelsesfraksjonering under anvendelse av en agarosegel.

Plasmid pCTF314 oppsluttes med restriksjonsendonuclease EcoRI, og det resulterende 647 bp-segment isoleres ved størrelsesfraksjonering. Dette segment innbefatter en nucleotidsekvens som svarer til sekvensen vist i figur 2 fra rest 135 til rest 775. 647 bp-segmentet isoleres ved størr-elsesfraks jonering og defosforyleres med alkalisk fosfatase.

352 bp-segmentet og det defosforylerte 647 bp-segment kjedes deretter operativt (ligeres) ved omsetning med T4 DNA-ligase under dannelse av et 999 bp-segment som har en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 135 til rest 1125. 999 bp-segmentet oppsluttes deretter med restriksjonsendonuclease Dralll som spalter 999 bp-segmentet ved en stilling mellom baserest 296 og 297 vist i figur 2, og danner derved et 168 bp-segment og et 831 bp-segment.

Det defosforylerte 302 bp-segment og 831 bp-segmentet kjedes deretter operativt under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av et 1125 bp-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 1

til rest 1125.

Den klonende plasmidvektor pUC8 lineariseres deretter ved oppslutning med EcoRI. Det ovenfor fremstilte 1133 bp-segment og den EcoRI-oppsluttede vektor kjedes operativt under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pUC-pre-huTFh.

E. coli stamme RRl (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) transformeres med pUC-pre-huTFh, og vellykkede transformanter velges på basis av ampicillinresistens. De utvalgte transformanter klones deretter og screenes med hensyn til nærvær av et rekombinant DNA-molekyl som har det pre-huTFh strukturelle gen.

Screening med hensyn til nærvær av rekombinante DNA-molekyler som har det pre-huTFh strukturelle gen, utføres ved oppslutning av rDNA fra hver utvalgt transformant med EcoRI. De resulterende EcoRI-fragmenter oppløses i et mønster i henhold til størrelse på en agarosegel. Rekombinante DNA-molekyler som fremkaller et tre-båndsmønster svarende til DNA-segmenter på 352 bp, 781 bp og 2682 bp, inneholder det pre-huTFh strukturelle gen. E. coli RRl-transformanter som har rDNA som fremkaller det ovenfor beskrevne EcoRI-oppslutningsmønster, inneholder et rekombinant DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen og utvelges (gjenvinnes).

Et DNA-segment inneholdende en vesentlig del av den pre-huTFh-kodende sekvens innbefattende den ekstracellulære ankerregion, men som mangler transmembran-ankerregionen ved carboxyenden, og som derved koder for et løselig huTFh-protein, konstrueres på følgende måte.

Plasmid pCTF64 oppsluttes med restriksjonsendonuclease EcoRI under dannelse av et DNA-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 1 til rest 486. 486 nucleotidbasepar- (bp) segmentet som således dannes, isoleres ved størrelsesfraksjonering under anvendelse av en agarosegel og defosforyleres deretter ved behandling med alkalisk fosfatase. Det defosforylerte 486 bp-segment oppsluttes deretter med restriksjonsendonuclease Dralll som spalter 486 bp-segmentet ved en stilling mellom baserest 296 og 297 som vist i figur 2, som derved danner et 296 bp-segment og et 190 bp-segment. 296 bp-segmentet isoleres ved størrelsesfraksjonering under anvendelse av en agarosegel.

Plasmid pCTF314 oppsluttes med restriksjonsendonuclease EcoRI under dannelse av et DNA-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 135 til rest 775. Det resulterende 641 bp-segment isoleres ved størrelsesfraksjonering under anvendelse av en agarosegel og defosforyleres deretter ved behandling med alkalisk fosfatase. Det defosforylerte 641 bp-segment oppsluttes deretter med Dralll som spalter 641 bp-segmentet ved en stilling mellom baserest 296 og 297 vist i figur 2, og danner derved et 162 bp-segment og et 479 bp-segment.

479 bp-segmentet isoleres ved størrelsesfraksjonering under anvendelse av en agarosegel.

De ovenfor fremstilte segmenter av 296 bp og 479 bp kjedes deretter operativt (ligeres) ved omsetning med T4 DNA-ligase under dannelse av et 775 bp-segment med en nucleotid overgangssekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 1 til rest 775.

Den klonende plasmidvektor pUC18 lineariseres ved oppslutning med EcoRI. Det ovenfor fremstilte 775 bp-segment og den EcoRI-oppsluttede vektor kjedes operativt under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pUC-pre-huTFh-T.

E. coli RR1 transformeres med pUC-pre-huTFh-T, og ampicillinresistente transformanter, dvs. kloner inneholdende pUC-pre-huTFh-T, utvelges.

Rekombinant DNA-molekyl pUC-pre-huTFh-T oppsluttes med EcoRI, og det resulterende 775 bp-segment isoleres ved størrelsesfraksjonering.

Syntetiske oligonucleotid-overgangssegmenter med

'sekvensene:

5'-AATTTAGAGAATAAGAATTCGGG-3', og

3'-ATCTCTTATTCTTAAGCCC-5'

fremstilles i henhold til metodene ifølge Caruthers et al., J. Am. Chem. Soc, 103:3185 (1981), og Gait et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:393 (1983) bortsett fra at de således fremstilte oligonucleotider ikke fosforyleres med polynucleotidkinase for å forhindre operativ kjeding (ligering) av disse oligonucleotider til hverandre. Oligo-nucleotidene herdes under dannelse av et dobbeltstrenget DNA-kjedersegment inneholdende en kohesiv EcoRI-ende og en stump ende, i henhold til metodene ifølge Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Dette kjedersegment kjedes deretter operativt til 775 bp-segmentet erholdt fra pUC-pre-huTFh-T under dannelse av et 817 bp-segment inneholdende et herdet segment ved hver ende av 775 bp-segmentet.

Det resulterende 817 bp-segment oppsluttes deretter med EcoRI for å omdanne hver ende av 817 bp-segmentet fra butt til EcoRI cohesiv, under dannelse av et 805 bp-segment.

Det resulterende 817 bp-segment isoleres ved størrelsesfrak-sjonering under anvendelse av en agarosegel.

Den klonende plasmidvektor pUC18 lineariseres ved oppslutning med EcoRI. Det ovenfor fremstilte 805 bp-segment og den EcoRI-oppsluttede vektor kjedes operativt under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pUC-pre-huTFh-TR.

E. coli RR1 transformeres med pUC-pre-huTFh-TR, og ampicillinresistente transformanter, dvs. kloner inneholdende pUC-pre-huTFh-TR, utvelges.

16. Produksjon av huTFh ved ekspresjon av rekombinant

huTFh- kodende sekvenser

Ekspresjon av rekombinant huTFh fra rekombinante DNA-molekyler kan utføres i et utall ekspresjonsmedier innbefattende prokaryotiske bakterieceller, ikke-hvirveldyr eukaryotiske celler og høyere (hvirveldyr) eukaryotiske celler. Eksempler på slike ekspresjonsmedier er E. coli, S. cerevisiae og kinesiske hamsterovarie- (CHO) celler.

a. Ekspresjon av pre- huTFh i E. coli

Et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke det pre-huTFh strukturelle gen i C. coli-celler, kan konstrueres ved isolering av et pre-huTFh gen-holdig DNA-segment fra det pUC-pre-huTFh rekombinante DNA-molekyl fremstilt i eksempel 15, og ved operativt å kjede dette segment til en prokaryotisk ekspresjonsvektor.

Rekombinant DNA-molekyl pUC-pre-huTFh oppsluttes med EcoRI under betingelser slik at enkelte tilstedeværende, men ikke alle EcoRI-seter i plasmidet splittes. Denne partielle oppslutningsprosedyre er beskrevet mere i detalj i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982). Et 1133 bp-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 1 til rest 1125, isoleres fra de EcoRI partielle oppslutningsprodukter ved størrelsesfraksjonering.

Den prokaryotiske ekspresjonsvektor pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) lineariseres ved oppslutning med EcoRI. Den oppsluttede vektor og 1133 bp pre-huTFh strukturelle gen-holdige segment kjedes operativt under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pKK-pre-huTFh.

E. coli RR1 ble transformert med pKK-pre-huTFh, og ampicillinresistente transformanter, dvs. kloner inneholdende pKK-pre-huTFh, ble utvalgt.

b. Ekspresjon av huTFh i E. coli

Et rekombinant DNA-molekyl som var i stand til å uttrykke huTF-genet i E. coli, ble konstruert ved mani-pulering av 1133 bp-segmentet fremstilt i eksempel 16a. Dette segment ble først defosforylert med alkalisk fosfatase og deretter oppsluttet med restriksjonsendonuclease Bbvl. Det resulterende 964 bp-segment innbefatter en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2, fra rest 164 til rest 1125, og ble isolert ved størrelsesfrak-sjonering.

Syntetiske oligonucleotid-overgangssegmenter med sekvensene:

ble fremstilt som tidligere beskrevet og herdet under dannelse av et dobbeltstrenget DNA-kjedersegment inneholdende cohesive EcoRI- og Bbvl-ender i henhold til metodene ifølge Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). Kjederen ble operativt kjedet først til 964 bp-segmentet under dannelse av et 1008 bp-segment. 1008 bp-segmentet ble deretter operativt kjedet til den EcoRI-oppsluttede vektor pKK223-3 under anvendelse av T4 DNA-ligase, under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pKK-huTFh.

Rekombinant DNA-molekyl pKK-huTFh avviker fra pKK-pre-huTFh bare ved at (1) et segment fra rest 1 til rest 129 er utelatt, og (2) et nytt methioninkodon er operativt kjedet før rest 130 slik at proteinekspresjon (translasjon) begynner ved det innskutte methioninkodon.

De rekombinante DNA-molekyler pKK-pre-huTFh og pKK-huTFh ble innført i et prokaryotisk vertmedium forenlig med ekspresjon av huTFh- eller pre-huTFh-proteinet kodet av det strukturelle gen inneholdt deri. Eksempler på vertceller inneholdende et slikt medium, er E. coli stamme RR1. Verten transformeres med det rekombinante DNA-molekyl,

dyrkes under betingelser som er forenlige med cellevekst og ekspresjon av rekombinant DNA, og det uttrykte protein høstes etter velkjente teknikker.

c. Ekspresjon av pre- huTFh i CHO- celler

Et rekombinant DNA-molekyl i stand til å uttrykke pre-huTFh-genet i hvirveldyrceller, ble konstruert under anvendelse av 1133 bp-segmentet fremstilt i eksempel 16a.

Syntetiske oligonucleotid-overgangs- (tilpasnings) segmenter med sekvensene:

ble fremstilt under anvendelse av metodene ifølge Caruthers et al., supra og Gait et al., supra. Oligonucleotid-tilpas-

ningssegmentene ble deretter kjedet til hver ende av 1133 bp-segmentet under anvendelse av metodene beskrevet av Rotherstein et al., Methods in Enzymol., 68:98 (1979). De EcoRI cohesive ender som opprinnelig var til stede på

1133 bp-segmentet, ble deretter omdannet til Bglll cohesive ender.

Den eukaryotiske apevirus- (SV40) baserte ekspresjonsvektor pKSV-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), ble linearisert ved oppslutning med restriksjonsendonuclease Bglll. Det Bglll-tilpassede 1133 bp-segment og den Bglll-oppsluttede vektor ble operativt kjedet under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pSV-pre-huTFh.

E. coli RRl ble transformert med pSV-pre-huTFh, og vellykkede transformanter ble valgt på basis av ampicillinresistens og klonet. De valgte transformanter ble deretter klonet og screenet med hensyn til nærvær av pSV-pre-huTFh ved bestemmelse av hver klon med hensyn til nærvær av uttrykt pre-huTFh-protein under anvendelse av monokl<p>nalt antistoff TF8-5G9.

d. Ekspresjon av huTFh i CHO- celler

Rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke huTFh-genet i pattedyrceller, ble konstruert ved oppslutning av pSV-pre-huTFh fra eksempel 16c med restriksjonsendonuclease Bglll. Det resulterende 1153 bp-segment ble isolert ved størrelsesfraksjonering og deretter oppsluttet med res-triks jonsendonuclease Bbvl. Det resulterende 974 bp-segment innbefatter en nucleotid-overgangs- (tilpasnings) sekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 164 til rest 1125, og ble isolert ved størrelsesfraksjonering.

Syntetiske oligonucleotid-tilpasningssegmenter med sekvensene:

ble fremstilt som tidligere beskrevet og herdet under dannelse av et dobbelstrenget DNA-kjedersegment inneholdende cohesive Bglll og Bbvl cohesive ender. Kjederen ble deretter operativt kjedet til 974 bp-segmentet under anvendelse av T4 DNA-ligase, under dannelse av et 1018 bp-segment innbefattende en nucleotid sekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 130 til rest 1125.

Plasmid-ekspresjonsvektoren pKSV-10 ble linearisert ved oppslutning med Bglll og ble deretter operativt kjedet til 1018 bp-segmentet under anvendelse av T4 DNA-ligase, under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pSV-huTFh.

De rekombinante DNA-molekyler pSV-pre-huTFh og pSV-huTFh ble innført i et eukaryotisk vertmedium forenlig med ekspresjon av huTFh- eller pre-huTFh-proteinet kodet av det strukturelle gen inneholdt deri. Eksempler på vertceller inneholdende et slikt medium, er CHO-celler.

Verten ble transfisert med det rekombinante DNA-molekyl, og stabile transformanter ble utvalgt etter velkjente teknikker. Se f.eks. Graham et al., Virol., 52:456

(1973); og Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341

(1982). Transformerte vertceller ble dyrket under betingelser forenlige med cellevekst og ekspresjon av det rekombinante DNA, og det uttrykte protein ble høstet etter velkjente teknikker.

e. Ekspresjon av pre- huTFh i gjær

Et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke pre-huTFh-genet i S. cerevisiae, ble konstruert ved fremstilling av oligonucleotid-tilpasningssegmenter med sekvensen:

og kjeding av disse til endene av 1133 bp-segmentet ifølge eksempel 16a som tidligere beskrevet. Det således tilpassede segment har Clal cohesiv ende.

Gjærekspresjonsvektoren, pTDTl (American Type Tissue Collection nr. ATCC 31255) ble linearisert ved oppslutning med restriksjonsendonuclease Clal. Det ovenfor angitte Clal-tilpassede 1133 bp-segment og den Clal-oppsluttede vektor ble operativt kjedet under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pY-pre-huTFh.

E. coli RR1 ble transformert med pre-huTFh, og transformanter som uttrykte det pre-huTFh strukturelle gen, ble identifisert og utvalgt som beskrevet i eksempel 16c.

f. Ekspresjon av huTFh i gjær

Et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å uttrykke det huTFh strukturelle gen i S. cerevisiae, ble konstruert ved oppslutning av pY-pre-huTFh med Clal under dannelse av et 1151 bp-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 1

til rest 1125. Etter isolering ved størrelsesfraksjonering ble 1151 bp-segmentet oppsluttet med det Bbvl under dannelse av et 978 bp-segment innbefattende en nucleotidsekvens svarende til sekvensen vist i figur 2 fra rest 164 til rest 1125. 978 bp-segmentet ble deretter isolert ved størrelsesfrak-sjonering.

Syntetiske oligonucleotid-tilpasningssegmenter med sekvensene:

ble fremstilt og herdet som tidligere beskrevet, under dannelse av DNA-tilpasningssegmenter med Clal og Bbvl cohesive ender. Tilpasningssegmentet ble først operativt kjedet til 978 bp-segmentet under dannelse av 1020 bp-segmentet. 120 bp-segmentet ble deretter kjedet til den Clal-oppsluttede pTDTl vektor, fremstilt som beskrevet i 16e., under anvendelse av T4 DNA-ligase under dannelse av det sirkulære, rekombinante DNA-molekyl pY-huTFh.

De rekombinante DNA-molekyler pY-pre-huTFh og pY-huTFh ble innført i et gjærvertmedium forenlig med ekspresjon av huTFh eller pre-huTFh kodet av det strukturelle gen inneholdt deri. Eksempler på vertceller inneholdende et slikt

medium, er S. cerevisiae-celler.

Verten ble transformert med det rekombinante DNA-molekyl og dyrket i utvalgt medium for å isolere vellykket transformerte celler etter velkjente teknikker. Se f.eks. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:1929 (1978); og Miyajima et al., Mol. Cell. Biol., 4:407 (1984). Transformerte celler ble dyrket under betingelser som er forenlige med cellevekst og ekspresjon av det rekombinante DNA, og det uttrykte protein ble høstet etter velkjente teknikker.

g. Produksjon av løselig huTFh ved ekspresjon av rekombinante huTFh- kodende sekvenser Ekspresjonen av løselig huTFh fra rekombinante DNA-molekyler kan utføres i et utall ekspresjonsmedier på lignende måte som beskrevet i eksempel 16 for pre-huTFh og huTFh. I dette eksempel fremstilles et 1133 bp pre-huTFh strukturelt gen-holdig segment med EcoRI cohesive ender i eksempel 16a og manipuleres deretter i eksempel 16b-f, resulterende i vektorer som er i stand til å uttrykke enten pre-huTFh eller huTFh i tre eksempelvise ekspresjonsmedier, É. coli, S. cerevisiae og CHO-celler. På lignende måte manipuleres det 805 bp-segment inneholdende et løselig pre-huTFh strukturelt gen med EcoRI cohesive ender og fremstilt i eksempel 16a,

i henhold til metodene beskrevet i eksempel 16b-f, for å danne ekspresjonsvektorer som er i stand til å uttrykke en løselig form av enten pre-huTFh eller huTFh (dvs. pre-huTFh-TR eller huTFh-TR) i disse samme ekspresjonsmedier.

17. Inhibering av koagulasjon med polypeptider

P24- 35 og p! 59- 169

Polypeptider p24-35 og pl59-169 hvis aminosyrerestsekvens er vist i tabell 7, ble syntetisert som beskrevet i eksempel 11.

Polypeptid p24-35 og pl59-169 ble deretter undersøkt med hensyn til deres evne til konkurrerende å inhibere huTF-initiert koagulering som beskrevet i eksempel 12. Resultatene av denne studie er vist i figur 12 og indikerer at p24-35 og pl59-169 er i stand til å inhibere 45% og 25% av den huTF-initierte koagulering når de anvendes ved 10 yM konsentrasjoner. Det skal bemerkes at i denne studie var bakgrunnsinhiberinger slik som for de peptider indikert med en lukket sirkel i figur 12, lavere enn studien vist i tabell 4. Som et resultat av dette ble polypeptider som fremkalte minst en 20% inhibering av koagulering ved en konsentrasjon på 10 yM i denne studie, betraktet som huTF-bindingssete-polypeptidanaloger.

Polypeptid p24-35 og pl59-169 representerer således huTFh polypeptidbindings-seteanaloger ifølge oppfinnelsen. Det skal så bemerkes at resultatene erholdt med p24-35, sett i lys av lignende resultater erholdt med polypeptid p25-49, indikerer at et huTFh-faktor VII/Vila bindingssete kan dannes av den aminosyrerestsekvens de to polypeptider har til felles, dvs. rest 30-35 som vist i figur 1 (-VNQVYT-). 25. Karakterisering av den lette kjede av 58 kDa huTF- heterodimeren som hemoqlobin- alfakjede Immunoaffinitetsisolert huTF ble ytterligerekarakterisert vedWestern blot-analyse for å identifisere kompon-entartene av 58 kDa huTF-heterodimeren, nemlig 47 kDa-og 12,5 kDa-proteinene beskrevet i eksempel 4.

Western blot-analyse, utført som beskrevet i eksempel 6c, ble utført under anvendelse av immunoaffinitetsisolert huTF fremstilt som beskrevet i eksempel 9, renset, humant hemoglobin, eller molekylvektstandarder som prøvene som ble elektroforesebehandlet. Hvor det er angitt, ble 50 mM dithiolthreitol innbefattet i prøvebufferen for reduksjon av disulfidbindingene. Western blot ble immunoomsatt som indikert under anvendelse av ikke-immunt kanin-IgG, kanin-anti-huTF-IgG fremstilt under anvendelse av velkjente metoder, eller kanin-anti-humant hemoglobin-IgG erholdt fra Dako (Santa Barbara, California). De første to IgG-preparater ble MAPS-II-isolert som beskrevet i eksempel 7.

Resultater fra den ovenfor angitte Western blot-analyse er vist i figur 18. Anti-huTF-IgG immunoreagerte bare med 47 kDa-båndet av redusert huTF, og ikke 12,5 kDa-båndet (felt A, spor 3), mens samme IgG immunoreagerte både med 58 kDa og 47 kDa-formene av ikke-redusert huTF (felt A, spor 4). Disse resultater er i overensstemmelse med en identifikasjon av huTF som 47 kDa-kompoennten av 58 kDa-heterodimeren. Anti-hemoglobin-IgG immunoreagerte på

Western blot bare med 58 kDa-båndet i den ikke-reduserte huTF-prøve, og ikke med 47 kDa-monomeren (felt B, spor 4). Imidlertid immunoreagerte anti-hemoglobin-IgG med 12,5 kDa-båndet i den reduserte huTf-prøve (felt B, spor 3) og immunoreagerte med 12,5 kDa renset, humant hemoglobinprotein (felt B, spor 2). Det var ingen reaktivitet med et ikke-immunt kanin IgG.

De ovenfor angitte resultater støtter den konklusjon at 58 kDa-formen av ikke-redusert huTF består av 47 kDa huTF-proteinet disulfid-kjedet til hemoglobin.

Det er således nå antatt at 12,5 kDa lettkjede-komponenten av 58 kDa heterodimeren beskrevet i eksempel 4, er alfakjeden av hemoglobin, og at dens assosiasjon med 47 kDa huTF-proteinet er et kunstig resultat av huTFh-isoleringsprosedyren.

Sammendrag og diskusjon av resultatene fra eksempel 1- 25

Et bibliotek på 24 MoAb-er overfor humant hjerne-TF, erholdt fra 2 forskjellige cellefusjoner, er blitt beskrevet. Immunospesifisiteten for hvert MoAb blekarakterisert ved.flekkavtrykk, Western blot og radioimmunobestemm-else. De fleste MoAb-er reagerte med humant TF under alle tre betingelser, og med både naturlig og denaturert TF. En av MoAb-ene, TF8-5G9, har vært anvendt med hell for rutine-messig rensing av TF-proteinet. Det adsorberer kvantitativt TF-aktivitet fra vevekstrakter og gir gjennomført, renset, humant TF i milligramsmengder.

Alle bortsett fra en av MoAb-ene nøytraliserte sterkt den funksjonelle aktivitet av renset, humant hjerne-TF. Selv om flere MoAb-er ble funnet å kryssreagere med TF fra bavian og ape, inhiberte ingen av antistoffene koagulasjonen av faktor VII-manglende humant plasma initiert med rotte, kanin, kveg, hund, sau eller svinethromboplastin i nærvær av homolog faktor VII. Enn videre ble initieringen av koagulasjon av normalt, humant plasma med kaninhjerne-thrombo-plastin ikke inhibert av noen av disse MoAb-er, hvilket understøtter den konklusjon at inhiberingen av human TF-prokoagulerende aktivitet ikke skyldtes interferens av antistoffene med løselige plasmakoagulasjonsproteiner, innbefattende faktor VII/Vila.

Den mest direkte basis for inhiberingen av TF-prokoagulerende aktivitet med anti-TF-antistoffene er blokkering av faktor VII/VIIa-binding. Som forventet, opp-hevet alle 23 antikoagulerende (nøytraliserende) MoAb-er den spesifikke binding av faktor VII/Vila til J82-celler,

i overensstemmelse med den primære reseptorfunksjon av TF. Dette ble ytterligere dokumentert ved dosetitrering av valgte, rensede MoAb-er hvori halv-maksimal inhibering av faktor VII-binding og halv-maksimal inhibering av graden av faktor Xa-dannelse fant sted ved like IgG-konsentrasjoner.

Et MoAb overfor humant TF er nylig blitt beskrevet av Carson et al., Blood, 70:490 (1987) som å inhibere TF-aktivitet, tilsynelatende ved interferering med faktor Vll/VIIa-binding, selv om dette ikke ble undersøkt direkte. Den observasjon av 23 av 24 av den her beskrevne MoAb-er sterkt nøytraliserte TF-aktivitet, er bemerkelsesverdig. Erfaringer gjort i søkerens laboratorium med MoAb-er overfor et utall humane koagulasjonsproteiner, har vært at bare en liten mengde nøytraliserer funksjonell aktivitet. Det er usannsynlig at hybridomene alle er søskenkloner på grunn av forskjellene i deres reaktiviteter, innbefattende kryss-reaktiviteter med primat-TF. I tillegg indikerer pågående epitopekartleggingsstudier at minst tre distinkte, ikke-konkurrerende antistoffbindingsseter gjenkjennes av dette panel av MoAb-er. Den store del av nøytraliserende MoAb-er overfor TF skyldes derfor sannsynligvis ikke konsekvensen av noen få immunodominante epitoper som også deltar i funk-sjonen, idet TF-aminosyresekvensen kan forutsis ved metoden ifølge Hopp et al., Mol. Immunol., 20:483 (1983) å inneholde multiple, antigeniske determinanter.

Den lille størrelse av TF kan delvis forklare hvor-for så mange anti-TF MoAb-er blokkerte faktor VII/VIIa-binding. TF kan forutsis fra cDNA-kloning å ha et 25 kDa ekstracellulært område som utelukker glycosylering. Antistoff og faktor Vll/VIIa-molekyler kan derfor utvise sterisk hindring ved binding til det meget mindre ekstracellulære område av TF. Hypotesen med sterisk hindring er i overensstemmelse med den observasjon at concanavalin A inhiberer TF-aktivitet, [Pitlick, J. Clin. Invest., 55:175 (1975] da carbohydratgruppene på TF sannsynligvis ikke er nødvendig for funksjon [Nakamura, Throm. Hemost., 58:135 (1987)].

Det var en viss bekymring for at faktor VII-avhengig prokoagulerende aktivitet uttrykt av forskjellige celler og vev, kunne tilskrives mer enn én molekylær art av TF-lignende proteiner med lignende funksjon. Imidlertid inhiberte MoAb TF8-5G9 kvantitativt den prokoagulerende aktivitet av uren hjerne- og placentale ekstrakter, og lyserte fibroblastere, blærecarcinomaceller og perifere blodmononucleære celler. Selv om disse resultater ikke var uttømmende, understøtter de den konklusjon at cellulære prokoagulerende aktiviteter som for tiden tilskrives TF, er antigenisk relatert, om ikke identisk. Dette er i overensstemmelse med den observasjon at det sannsynligvis er et enkelt gen for TF.

Nylig er det blitt demonstrert at de letale effekter av septisk sjokk kan forhindres i bavianer med infusjon av aktivert protein C, et antikoagulerende protein som virker ved mellomtrinn i koagulasjonsproteasekaskaden. Foreliggende studier indikerer at MoAb-er som inhiberer TF-aktivitet,

er meget spesifikke, in vivo-antikoagulerende midler, da de ved blokkering av initieringen av koagulasjonsproteasekaskaden forhindrer forbruk av plasmakoagulasjonsfaktorer som normalt er assosiert med patologisk aktivering av intravaskulær koagulasjon. 58 kDa-formen av huTF beskrevet i eksempel 4, ble her vist å være en disulfid-kjedet heterodimer av 47 kDa TF-proteinet og et ca. 12,5 kDa polypeptid, nå identifisert immunokjemisk og ved partiell aminosyresekvens som alfakjeden av hemoglobin. Tidligere spekulasjon over at 58 kDa-bånd kan utgjøre en naturlig forekommende, heterodimer form av cellulær TF, er sannsynligvis ikke korrekt, ettersom det er sannsynlig at 58 kDa-heterodimeren dannes under isolering.

Alfakjeden av hemoglobin har et enkelt cystein, og

TF kan forutsis ut fra cDNA å ha et enkelt cystein i sitt cytoplasmiske område. TF har også fire cysteiner i sitt ekstracellulære område, men minst to må være involvert i disulfid-intrakjedebindinger da TF-funksjon tapes etter reduksjon. Det enkle cystein i det cytoplasmiske område av TF er sannsynlig, slik som cysteiner i de fleste cytosoliske proteiner, opprettholdt i redusert tilstand. Dette (eller mindre sannsynlig, annet cystein av TF) kan være lett tilgjengelig for blandet disulfiddannelse etter cellelyse, og det er foreslått at oxydasjon under isoleringsprosedyren resulterer i dannelse av en disulfidbinding mellom cystein-resten av det cytoplasmiske område av TF og hemoglobin. Støtte for denne konklusjon er den observasjon at heterodimer-dannelsen tilsynelatende er tidsavhengig, i det at minimer-ing av tiden mellom detergentekstraksjon av TF fra hjerne- acetonpulver og binding til immunoaffinitetsmatrisen redus-erer mengden av erholdt heterodimer TF. Den antatte 96 kDA TF-dimer kan også dannes ved en lignende mekanisme under isolering.

En anti-hemoglobin-antistoffkolonne bandt spesifikt

58 kDa-heterpdimeren, men fjernet ikke kvantitativt alle

de høymolekylære arter observert i de immunoaffinitets-rensede TF-preparater. Spormengder av andre mindre bånd med molekylvekter over 47 kDa, ble observert som reagerte med anti-TF-antistoffer. Disse mindre arter, innbefattende en del av 58 kDa-båndet, kan representere blandede disulfider dannet mellom TF og andre ikke-identifiserte proteiner.

Claims (8)

1. Isolert DNA-segment, karakterisert vedat det omfatter sekvensen med 1125 basepar ifølge figur 2, innbefattende en sekvens som definerer et strukturelt gen som koder for et løselig human vevsfaktor-tungkj edeprotein.

2. DNA-segment ifølge krav 1,karakterisert vedat angitte, strukturelle gen koder for et protein med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra rest 1 til rest 263.

3. DNA-segment ifølge krav 1,karakterisert vedat angitte, strukturelle gen koder for et løselig human vevsfaktor-tungkjedeprotein med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra rest 1 til rest 219.

4. DNA-segment ifølge krav 1,karakterisert vedat det også innbefatter en andre sekvens tilstøtende 5'-enden av første sekvens, og som koder for en aminosyrerest-ledersekvens bundet til aminoenden av angitte protein, idet angitte første og andre DNA-sekvenser sammen definerer et sammensatt, strukturelt gen som koder for et human vevsfaktor-tungkjede-forløperprotein.

5. DNA-segment ifølge krav 4,karakterisert vedat angitte, sammensatte, strukturelle gen koder for et protein med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra rest -32 til rest 263.

6. DNA-segment ifølge krav 4,karakterisert vedat angitte, sammensatte, strukturelle gen koder for en løselig, human vevsfaktor-tungkjede-proteinforløper med en aminosyrerestsekvens representert ved figur 1 fra rest -32 til rest 219.

7. DNA-segment ifølge krav 6,karakterisert vedat angitte, sammensatte, strukturelle gen har en nukleotidbasesekvens representert ved figur 2 fra base 34 til base 786.

8. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert vedat det omfatter en vektor operativt kjedet til et første DNA-segment ifølge krav 1 som definerer et strukturelt gen som koder for et human vevsfaktor-tungkj edeprotein.