NO874292L - Fremgangsmaate for fremstilling av forbindelser som er analoge med faktor viii-c. - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av forbindelser som er analoge med faktor viii-c.Info
- Publication number
- NO874292L NO874292L NO874292A NO874292A NO874292L NO 874292 L NO874292 L NO 874292L NO 874292 A NO874292 A NO 874292A NO 874292 A NO874292 A NO 874292A NO 874292 L NO874292 L NO 874292L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- factor viii
- analogue
- dna
- sequence
- cdna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 61
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 24
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 24
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 13
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 7
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 5
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000015930 Lon proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000026686 chromosomal inheritance Diseases 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår området for struk-turell genkloning og anvendelsen av slike gener i den rekombinante DNA-styrte syntese av ønskede proteinforbindelser. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen nye analoger med faktor VIII prokoagulerende aktivitetsprotein (faktor VIII-C), dets rekombinante DNA-styrte syntese og anvendelse i behandlingen av koagulasjonssykdommer, som hemofili.
Rekombinante DNA-teknikker er alminnelig kjent.
Se Methods in Enzymology, (Academic Press), vol. 65 og 68
(1979); 100 og 101 (1983) og de anførte referanser deri,
som alle er innbefattet heri ved referanse. En omfattende teknisk beskrivelse som omhandler mest vanlig anvendte, rekombinante DNA-fremgangsmåter, finnes i Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Gener som koder for forskjellige polypeptider, kan klones
ved å inkorporere et DNA-fragment som koder for polypeptidet i et rekombinant DNA-uttrykksmiddel, f.eks. bakterie- eller virusvektorer, og ved å transformere en passende vert, vanligvis en Escherichia coli (E. coli) cellelinje, og isolering av kloner som inkorporerer de rekombinante vektorer. Slike kloner kan dyrkes og anvendes for å fremstille det ønskede polypeptid i en stor skala.
Blandinger av mRNA fra eukaryotiske celler ved anvendelse av en serie av tre enzymatiske reaksjoner for å syntetisere dobbelttrådede DNA-kopier av hele gener som er komplementære til denne mRNA-blanding, er isolert. I den første reaksjon transkriberes mRNA ved dannelse av en enkelttrådet, komplementær DNA (ss-cDNA) ved hjelp av en RNA-
styrt DNA-polymerase, også benevnt revers-transkriptase. Revers-transkriptase syntetiserer DNA i 5'-3'-retningen, anvender deoxyribonucleosid-5'-trifosfater som forstadier,
og krever både et templat og en utgangstråd hvor den sist-nevnte må ha en fri 3<1->hydroxylende. Revers-transkrip-taseprodukter, enten de er delvis eller fullstendige kopier av mRNA-templatet, har ofte korte, delvis dobbelttrådede hårnåler ("løkker") ved sine 3'-ender. I den andre reaksjon kan disse "hårnålsløkker" utnyttes som utgangs-
materiale for DNA-polymeraser. På forhånd dannet DNA er påkrevet både som et templat og som et utgangsmateriale ved virkningen av DNA-polymerase. DNA-polymerasen krever tilstedeværelsen av en DNA-tråd med en fri 3<1->hydroxylgruppe til hvilken nye nucleotidrester tilføyes for å forlenge kjeden i 5'-3<1->retningen. Produktene av slike sekvensielle revers-transkriptase-og DNA-polymerasereaksjoner inneholder fremdeles en løkke ved én ende. Spissen av løkken eller "foldepunktet" av den dobbelttrådede DNA som således er skapt, er vesentlig et enkelttrådet segment. I den tredje reaksjon spaltes dette enkelttrådede segment med den enkelttrådede, spesifikke nuclease Sl ved dannelse av et "butt-ende" dobbelt DNA-segment. Denne alminnelige fremgangsmåte er anvendelig for enhver mRNA-blanding og er beskrevet av Buell, et al., J. Biol. Chem. 253;2483 (1978).
Den dannede dobbelttrådede cDNA (ds-cDNA) blanding føyes inn i kloningsuttrykksmidler ved hjelp av enhver av mange kjente fremgangsmåter som avhenger i det minste delvis av det spesielle uttrykksmiddel som anvendes. Forskjellige innføyingsfremgangsmåter beskrives meget detaljert i Methods In Enzymology, 6_8:16-18 og i referansene anført deri.
Når først DNA-segmentet er innføyd, anvendes klon-ingsuttrykksmidlet for å transformere en passende vert. Disse kloningsuttrykksmidler overfører vanligvis en antibiotisk motstandsdyktig egenskap til verten. Slike verter er vanligvis prokaryotiske eller eukaryotiske celler. På dette stadium inneholder bare noen få av de transformerte eller transfiserte verter den ønskede cDNA. Summen av alle transformerte eller transfiserte verter utgjør et "gen-bibliotek". Det samlede ds-cDNA-bibliotek som er skapt ved hjelp av denne fremgangsmåte, tilveiebringer en represen-tativ prøve av kodeinformasjonen som er til stede i mRNA-blandingen som anvendes som startmateriale.
Dersom en passende oligonucleotidsekvens er tilgjengelig, kan den anvendes for å identifisere kloner av interesse, som beskrevet i det følgende. Individuelle transformerte eller transfiserte celler dyrkes som kolonier på nitrocellulose-filtrerpapir. Disse kolonier lyses, det således frigjorte DNA festes kovalent til filtrerpapiret ved oppvarming, og arket inkuberes med en merket oligonucleotidprobe. Probesekvensen er komplementær til det strukturelle gen av interesse. Proben hybridiserer med ds-cDNA som det er komplementært til og identifiseres ved autoradiografi. Klonene karakteriseres for å identifisere en klon som inneholder alle de strukturelle informasjoner for det ønskede protein. Nucleinsyresekvensen som koder for proteinet av interesse, isoleres og innføyes på nytt i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren bringer det klonede gen under den regulerende kontroll av en spesifikk prokaryotisk eller eukaryotisk kontrollfaktor som tillater den effektive ekspresjon (transkripsjon og translasjon) av den klonede ds-cDNA med full lengde. Denne alminnelige fremgangsmåte er således bare anvendelig for de proteiner hvor minst en del av deres aminosyre- eller DNA-sekvens er kjent og for hvilke en oligonucleotidprobe er tilgjengelig. Se Maniatis, et al., supra.
I den senere tid er det utviklet fremgangsmåter for
å identifisere spesifikke kloner ved tilsetning av antistoffer spesifikke for det aktuelle, innkodede protein til bakteriekolonier. Denne fremgangsmåte kan bare anvendes med "ekspresjonsvektor" kloningsuttrykksmidler fordi opp-bygning av produktproteinet er påkrevet. Det strukturelle gen tilføyes til vektoren i umiddelbar nærhet av det regulerende gen som er lyset enten ved hjelp av vektoren eller ved hjelp av kjemiske fremgangsmåter, og proteinet påvises ved hjelp av det spesifikke antistoff og et merkingssystem, f.eks. enzym-immunanalyse. Et eksempel på dette er lambda gt-^-systemet beskrevet av Young og Davis, Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA, 80:1194-1198 (1983) og Young og
Davis, Science, _2_2:778 (1983).
Normalt, humant blodplasma inneholder et kompleks av to proteiner referert til som faktor Vlll-komplekset. En bestanddel av faktor Vlll-komplekset har antihemofil faktor prokoagulerende aktivitet og betegnes faktor VIII-C. En mangel i faktor VIII-C er karakteristisk for hemofili, en sykdom som overføres ved X-kromosomal arvelighet.
Det foreligger lite informasjon i litteraturen omkring faktor VIII-C-analoger. Analoger til faktor VIII-C kan karakteriseres ved forskjeller i nucleinsyre- eller aminosyresekvensen av faktor VIII-C som publisert i Gitschier, et al., [Nature, 312:326-330 (1984)] og av
Wood, et al., [Nature, 312:330-337 (1984)]. Slike analoger kan oppstå fra en mutasjon i den genetiske kode, fra alternativ mRNA-spleising, eller fra post-translasjonelle modifikasjoner. Ingen slike faktor VIII-C-analoger er hittil isolert eller genetisk fremstilt.
Faktor VIII-C har terapeutisk verdi på grunn av sin evne til å korrigere koaguleringsmangelen hos pasienter med hemofili. Uheldigvis er de tilgjengelige fremgangsmåter for å erholde faktor VIII-C, begrenset til fraksjonering av humant plasma, som beskrevet ovenfor. Fremstilling av faktor VIII-C ved plasmafraksjonering tilveiebringer bare begrensede mengder som varierer fra fremstilling til fremstilling, den er kostbar og utsetter de mottagende hemofile pasienter for risikoen for å erverve blodoverførte syk-dommer som hepatitt og ervervet immunmangelsyndrom (AIDS).
Faktor VIII-C-analoger vil kunne tilveiebringe et alternativt middel for anvendelse i behandlingen av hemofili. Analoger kan vise seg å være mer effektive enn naturlig faktor VIII-C i gjenopprettelsen av en normal koagulasjons-kaskade. For det andre vil fremstilling av faktor VIII-C-analoger via rekombinant DNA-teknologi, redusere risiko for sykdomsoverføring forbundet med plasmafraksjonerte produkter. Mens administrasjonen av en genetisk fremstilt analog hvis sekundære eller tertiære struktur er tilstrekkelig forskjellig fra naturlig faktor VIII-C, kan føre til
et immunsvar, ventes ikke naturlige analoger å utløse dette svar. Genetisk fremstilte analoger med faktor VIII-C vil derfor kunne tilveiebringe et pålitelig og lett tilgjengelig, terapeutisk middel for anvendelse i behandlingen av hemofili.
Ved å erkjenne og overvinne de ovenfor beskrevne problemer, har den foreliggende oppfinnelse gjort det mulig å tilveiebringe store mengder lett tilgjengelige faktor VIII-C-analoger. Dette er oppnådd med nucleinsyrer og antistoffer som reagerer spesifikt med den faktor VIII-C-analoge kodingssekvens av det faktor VIII-C-analoge proteinmolekyl eller faktor VIII-C-proteinmolekylet (eller fragmenter derav); ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for å fremstille klonings-uttrykksmidler som koder for faktor VIII-C-analogene, og fremgangsmåter for sikteana-lyse/isolering for gjenvinnelse av human faktor VIII-C-analoger vesentlig uten innhold av andre proteiner av human opprinnelse.
Følgelig tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse human faktor VIII-C-analoger eller de fragmenter som er vesentlig uten innhold av andre proteiner av human opprinnelse.
Faktor VIII-C-analogene fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker i vertceller eller andre selvkopierende systemer og tilveiebringes i vesentlig ren tilstand. Det tilveiebringes også fremgangsmåter og forbindelser for fremstilling av de ovenfor beskrevne faktor VIII-C-analoger såvel som terapeutiske forbindelser og anvendelser for faktor VIII-C-analogene eller underenhetene, i behandlingen av koagulasjonssykdommer hos mennesker og dyr.
Oppfinnelsen tilveiebringer videre replikerbare ekspresjonsvektorer inkorporert med en DNA-sekvens som koder for faktor VIII-C-analoger og vertcelle eller cellefrie, selvreplikerende systemer som er transformert eller trans-fisert derved. Vertsystemet er vanligvis av prokaryotisk opprinnelse, f.eks. E. coli eller B. subtilis, eller eukaryotiske celler.
Faktor VIII-C-analogene fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter (a) fremstilling av en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for en faktor VIII-C-analog i en egnet vertcelle eller et cellefritt, replikerende system; (b) transformasjon av dette vertsystemet for å erholde et rekombinant vertsystem; (c) opprettholdelse av dette rekombinante vertsystem under betingelser som muliggjør ekspresjon av DNA-sekvensen som koder for faktor VIII-C-analogen slik at denne fremstilles; og (d) utvinning av faktor VIII-C-analogen. Den replikerbare ekspresjonsvektor som koder for faktor VIII-C-analogen, fremstilles fra en dobbelttrådet, komplementær DNA- (ds-cDNA) forbindelse som er typisk for et budbringer-RNA-forråd inneholdende budbringer for faktor VIII-C og som inkorporerer DNA fra ds-cDNA-forrådet i replikerbare ekspresjonsvektorer. Den foretrukne fremgangsmåte for utvinning av faktor VIII-C-analoger innbefatter omsetning av proteinene uttrykt ved det rekombinante vertsystem med en reaksjonsblanding som innbefatter minst ett bindingsprotein spesifikt for faktor VIII-C-analogen.
I de medfølgende tegninger viser figur 1 fremstilling av cDNA fra mRNA. Figur 2 viser fremstilling av et cDNA-bibliotek og derpå følgende utsortering med henblikk på FVIIIC-spesifikke kloner. Figur 3 er et diagram som viser sammensetningen av faktor VIII-C med full lengde. Figur 4A viser tegningen av et faktor VIII-protein. Figur 4B viser den komplette faktor VIII-cDNA og den følgende variant. Figurene 5-9 viser DNA-sekvensen av sammensatt faktor VIII-C i full lengde. Figurene 10-14 viser DNA-sekvensen av naturlig forekommende faktor VIII-C-analog med utslettelse av Exon 4. Figurene 15-18 viser DNA-sekvensen av genetisk fremstilt faktor VIII-C-analog med en større del av Exon 14 utslettet. Figurene 19-22 viser DNA-sekvensen av genetisk fremstilt faktor VIII-C-analog med utslettelse av Exon 4 og 14. Figur 23 viser plasmider anvendt i den foreliggende oppfinnelse.
Figur 24 viser plasmid pl82-4-ATG-C.
Figur 25 viser plasmider p-261-26 og pl88-3.
"Faktor VIII-C-analog" som anvendt heri, betegner humane faktor VIII-C-analoger, eller underenheter derav, fremstilt i in vitro celledyrkningssystemer, i bioaktive former med evne til å sette i gang blodkoagulasjon på samme måte som faktor VIII-C som naturlig er til stede i humant plasma.
Analoger med faktor VIII-C-analoger kan være til stede i naturen. Disse variasjoner kan karakteriseres ved forskjell(er) i nucleotidsekvensen av det strukturelle gen som koder for proteiner med den samme biologiske funksjon. Disse variasjoner kan også oppstå fra vekslende mRNA-spleisingsmønstre. Det er mulig å fremstille analoger med en enkel eller mange aminosyresubstitusjoner, utslettelser, addisjoner, eller erstatninger. Alle slike variasjoner, modifikasjoner og analoger (naturlig avledet, syntetisk eller genetisk fremstilt) som gir som følger derivater av faktor VIII-C som bibeholder de biologisk aktive egenskaper til naturlig faktor VIII-C, er innbefattet innen rammen av den foreliggende oppfinnelse. Analogen kan være et rekombinant-avledet protein som er identisk med analoger identifisert i cDNA-biblioteker, eller nylig fremstilte analoger som ikke har noen motstykker in vivo.
"Ekspresjonsvektorer" angår vektorer som er i stand til å transkribere og oversette DNA-sekvenser inneholdt deri, hvor slike sekvenser er bundet til andre regulerende sekvenser som er i stand til å utføre sin ekspresjon. Disse ekspresjonsvektorer må være replikerbare i vert-organismene eller systemene enten som episomer, bakteriofager, eller som en uløselig del av det kromosomale DNA.
En ekspresjonsvektor som er spesielt egnet for fremstilling av human faktor VIII-C-analoger, er bakteriofager som er vira som vanligvis holder til i og replikerer i bakterier. Spesielt egnede fager for dette formål er lambda 9^-^ q~°9gt^-fagen, beskrevet av Young og Davis, supra. Lamba gt^1er en generell rekombinant DNA-ekspresjonsvektor som er i stand til å fremstille polypeptider spesifisert av det inn-satte DNA.
For å oppnå minst mulig nedbrytning ved tilførsel av en syntetisk analog med lactose (IPTG), syntetiseres fremmede proteiner eller deler derav sammensmeltet med det prokaryotiske protein B-galactosidase.Anvendelsen av vertceller som mangler nedbrytningsveier for protein, kan også øke levetiden av nye proteiner fremstilt fra de tilførte lambda gt-^-kloner. Riktig ekspresjon av fremmed DNA i lambda gt^-kloner avhenger av den riktige orientering og avlesningsramme for det tilføyde DNA med hensyn til B-galactosidasepromoteren og ribosomets bindingssete.
En annen type ekspresjonsvektor som er anvendelig
i rekombinant DNA-teknikker, er et plasmid - en sirkulær, ikke-integrert (ekstra-kromosomal), dobbelttrådet DNA-løkke. Enhver annen form for ekspresjonsvektor som virker på til-svarende måte, er egnet for anvendelse i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Rekombinante vektorer og metodikk fremlagt heri,
er egnet for anvendelse i vertceller som dekker et bredt område av prokaryotiske og eukaryotiske organismer. Prokaryotiske organismer foretrekkes for kloning av DNA-sekvenser og i fremstillingen av vektorer. E. coli K12 stamme HB101 (ATCC nr. 33694) er spesielt egnet. Selvsagt kan andre mikrobielle stammer anvendes, vektorer som inneholder replikasjon og kontrollsekvens som stammer fra arter som er forenlige med vertcellen eller systemet, anvendes i forbindelse med disse verter. Vektoren inneholder vanligvis et begynnelsespunkt for replikasjon og likeledes karakteristika som er i stand til å tilveiebringe fenotypisk utvelgelse i transformerte celler. F.eks. kan E. coli transformeres ved anvendelse av vektoren pBR322 som inneholder gener for ampicillin og tetracyclinresistens [Bolivar, et al., Gene, 2:95 (1977)].
Disse gener for antibiotisk resistens tilveiebringer et middel for å identifisere transformerte celler. Ekspresjonsvektoren kan også inneholde kontrollfaktorer som kan anvendes av vektoren for ekspresjon av dens egne proteiner. Vanlige prokaryotiske kontrollfaktorer anvendt for ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser i E. coli, omfatter promoterene og regulatorsekvensene som stammer fra B-galactosidase og tryptofan-(trp) operonene til E. coli, såvel som pR- og pL-promoterene til bakteriofag lambda. Kombinasjoner av disse faktorer er også anvendt (f.eks. TAC som er en sammensmeltning av trp-promoteren med lactose-operatoren). Andre promoterer er også oppdaget og anvendt,
og detaljer angående deres nucleotidsekvenser er publisert, noe som gjør det mulig for en dyktig tekniker å kombinere og nytte dem funksjonelt.
I tillegg til prokaryoter kan eukaryotiske mikrober, som gjærkulturer, også anvendes. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest vanlig anvendte blant eukaryotiske mikroorganismer, selv om et antall av andre stammer er vanlig tilgjengelige. Egnede promotingssekvenser i gjærvektorer omfatter promoterene til 3-fosfoglycerat-kinase eller andre glycolytiske enzymer. Egnede ekspresjonsvektorer kan inneholde avslutningssignaler som tilveiebringer polyadenylering og avslutning av det klonede gen mRNA. Enhver vektor som inneholder en gjær-forenlig promoter, et begynnelsespunkt for replikasjon og en passende avslut-ningssekvens, er egnet for ekspresjon av faktor VIII-C-analoger .
I tillegg til mikroorganismer kan cellekulturer
som stammer fra flercellulære organismer, også anvendes som verter. I prinsippet er enhver slik cellekultur anvendelig enten den stammer fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Imidlertid har celler fra hvirveldyr vært gjenstand for størst interesse, og formering av hvirveldyrceller i kultur (vevskultur) er i de senere år blitt en rutinefremgangsmåte. Eksempler på slike egnede verter er VERO, HeLa, mus C127, kinesisk hamsterovarium (CHO), W138, BHK, COS-7 og MDCK cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis et begynnelsespunkt for replikasjon, en promoter beliggende foran genet som skal uttrykkes, sammen med de
nødvendige ribosom-bindingsseter, RNA-spleisingsseter, polyadenyleringssete og transkripsjonal avslutningsekvens.
For anvendelse i pattedyrceller tilveiebringes ofte kontrollfunksjonene på ekspresjonsvektorene av virusmateriale. F.eks. stammer vanlig anvendte promoterer fra polyoma, Adenovirus 2, og oftest fra Simian Virus 40 (SV40). Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å anvende promoter-eller kontrollsekvenser som er naturlig tilknyttet den ønskede gensekvens forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertsystemet. For å øke transkripsjonshastig-heten kan eukaryotiske forsterkersekvenser også tilsettes forbindelsen. Disse sekvenser kan erholdes fra mange forskjellige animalske celler, animalske vira eller oncogeniske retrovira slik som musesarcomviruset.
Et begynnelsespunkt for replikasjon kan tilveiebringes enten ved at sammensetningen av vektoren omfatter et eksogent begynnelsespunkt slik som det som tilveiebringes av SV40 eller andre viruskilder, eller det kan tilveiebringes av vertcellens kromosomale replikasjonsmekanisme. Dersom vektoren er integrert i vertcellekromosomet, er den sist beskrevne mulighet tilstrekkelig.
Spesifikt for eksemplet inneholdt i den foreliggende oppfinnelse, er det bovine papillomavirus (BPV). Anvendelse av BPV-DNA som en virusvektor er godt dokumentert og var opprinnelig basert på observasjonen at virusgenomet vedvarer som et ekstrakromosomalt plasmid i transformerte celler (Law, M.-F., D.R. Lowry, I. Dvoretzky og P.M. Howley, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_8_: 2727-2731, 1981). I denne form opprettholdes det klonede gen i en ensartet sekvens-omgivelse av BpV-minikromosomet og dermed elimineres potensielle problemer tilknyttet integreringen av det klonede DNA i inaktive områder av vertkromosomet. Denne egenskap ble fullt utnyttet ved tilveiebringelsen av BPV-skyttelvektorer som er i stand til replikasjon i prokaryotiske og eukaryotiske celler [Sarver, N., J.C. Byrne og
P.M. Howley, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79(13):4030-4034, 1982; og Kushner, P.J., B.B. Levinson og H.M. Goodman,
J. Mol. Appl. Genet., JL(6) : 527-528 , 1982 ]. Slike vektorer er effektive ved å styre den regulerte ekspresjon fra induserende promoterer og ved å uttrykke genprodukter bestemt for intra- og ekstracellulær plassering. Vektorer som kan anvendes som egnede startmaterialer for fremstillingen av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i US patent 4.419.446, hvis innhold er innbefattet heri ved referanse.
Vertceller kan fremstille human faktor VIII-C-analoger som kan ha mange forskjellige kjemiske sammenset-ninger. Proteinet fremstilles med methionin som dens første aminosyre (tilstedeværende i kraft av ATG-startsignal-kodonet som naturlig er til stede ved begynnelsen av det strukturelle gen) eller føyet inn før et segment av det strukturelle gen). Proteinet kan også være spaltet intra-eller ekstracellulært, derved fremkalles aminosyren som finnes naturlig ved aminoenden av proteinet. Proteinet kan fremstilles sammen med enten dets signal-polypeptid eller et annet, konjugert protein enn det konvensjonelle signal-polypeptid; konjugatets signal-polypeptid er spesifikt spaltbart i en intra- eller ekstracellulær omgivelse. Endelig kan faktor VIII-C-analoger fremstilles ved direkte ekspresjon i fullt utviklet tilstand uten nødvendigheten av å spalte bort noe uvedkommende polypeptid.
Rekombinante vertceller er celler som er transformert med vektorer fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-fremgangsmåter. Som definert heri, er faktor VIII-C-analoger fremstilt som en konsekvens av denne transformasjon. Faktor VIII-C-analoger eller dens underenheter fremstilt av slike celler, refereres til som "rekombinant faktor VIII-C-analoger".
Fremgangsmåtene beskrevet i det følgende, er bare noen av et stort antall veletablerte fremgangsmåter for å fremstille spesifikke reagenser som er egnet i den foreliggende oppfinnelse. De vanlige fremgangsmåter for erholdelse av en budbringer RNA- (mRNA) blanding er å fremstille en ekstrakt fra en vevsprøve eller å dyrke celler som frem stiller det ønskede protein, og å ekstrahere mRNA ved en fremgangsmåte som den fremlagt av Cirgwin, et al., Biochemistry, 1_8 : 5294 (1979). mRNA anrikes ved poly(A) mRNA-holdig materiale ved kromatografi på oligo- (dT) cellu-lose av poly(U)-Sepharose, etterfulgt av eluering av den poly(A)-holdige mRNA-anrikede fraksjon.
Den ovenfor beskrevne poly(A)-holdige mRNA-anrikede fraksjon anvendes for å syntetisere en enkelttrådet, komplementær cDNA (ss-cDNA) ved anvendelse av revers-transkriptase. Som en følge av DNA-syntese dannes en hårnåls-løkke ved 3'-enden av DNA som vil igangsette syntesen av den andre DNA-tråd. Under egnede betingelser anvendes denne hårnålsløkke for å fremkalle syntese av den andre tråd under tilstedeværelse av DNA-polymerase og nucleotid-trifosfater.
Det dannede dobbelttrådede cDNA (ds-cDNA) føyes inn i ekspresjonsvektoren ved hjelp av hver av mange kjente fremgangsmåter. Vanligvis kan disse fremgangsmåter finnes i Maniatis, supra, og Methods In Enzymology, vol. 65 og 68
(1980); og vol. 100 og 101 (1983). Vanligvis lineariseres vektoren ved hjelp av minst én restriksjonsendonuclease som vil danne minst to butte eller sammenhengende ender. ds-cDNA ligeres med eller føyes sammen med vektor-innføy-elses setet.
Dersom prokaryotiske celler eller andre celler som inneholder betydelige mengder celleveggmateriale anvendes, er den vanligste fremgangsmåte for transformasjon med ekspresjonsvektoren forhåndsbehandling med calciumklorid som beskrevet av Cohen, R.N., et al., Proe. Nat'1. Sei. USA, 6_9:2110 (1972). Dersom celler uten celleveggbarrierer anvendes som vertceller, utføres transfeksjon ved hjelp av calciumfosfat-bunnfellingsfremgangsmåten beskrevet av Graham og Van der Eb, Virology, 6_2 : 456 (1973). Andre fremgangsmåter for innføring av DNA i celler som kjerneinjeksjon eller protoplast-sammensmeltning, er også anvendt med vellykket resultat. Organismene dyrkes deretter i selektive media og proteiner som danner den innkodede ekspresjons-
vektor.
Kloner som inneholder deler av eller hele cDNA som koder for faktor VIII-C-analoger, identifiseres med spesifikke antistoffer rettet mot deler av eller hele det faktor VIII-C-analoge protein. Denne identifiserings fremgangsmåte krever at ds-cDNA føyes inn i en vektor som inneholder egnede regulatoriske nucleinsyresekvenser i direkte tilknytning til innføyelsessetet. Disse regulatoriske sekvenser setter i gang transkripsjon og translasjon av de ds-cDNA-molekyler som er innføyd i vektoren. De kloner som inneholder faktor VIII-C-analoge cDNA-sekvenser korrekt plassert i forhold til de regulatoriske sekvenser, syntetiserer deler av eller hele det faktor VIII-C-analoge protein. Slike kloner påvises ved anvendelse av egnede, spesifikke antistoffer. Et slikt kloningssystem er lambda gen-systemet som først ble beskrevet av Young og Davis, supra.
Kloner som inneholder den fullstendige sekvens for faktor VIII-C-analoger, identifiseres ved anvendelse av cDNA-innføyelsen av de faktor VIII-C-analoge rekombinanter isolert i løpet av den innledende utsortering av det rekombinante lambda gt-^-cDNA-bibliotek som en probe. Fremgangsmåter for bestemmelse av nucleotidsekvenser anvendes for å bestemme sekvensen av aminosyrer som er innkodet av cDNA-fragmentene. Denne informasjon kan anvendes for å bestemme identiteten av cDNA-kloner som spesifikke for human faktor VIII-C-analoger ved sammenligning med den kjente aminosyresekvens for aminoenden i faktor VIII-C (Gitshier et al., og Wood et al., supra). Alternativt kan identifikasjon bekreftes ved anvendelse av fremgangsmåter som "Northern blot"-analyser og hybrid-utvalgt translasjon, eller ved sammenligning med faktor VIII-C-kloner fra andre arter, f.eks. mus og rotte.
Detaljert beskrivelse av tegningene
Figur 4
Tegning av FVIII cDNA- variant ( delta FVIII)
A. FVIII protein: Den øverste figur avbilder det fullstendige FVIII-proteinmolekyl med de forskjellige A-, B- og C-områder. Den nedre figur avbilder det konstruerte, beskårede delta FVIII-proteinmolekyl. B-området er fritt for aminosyrerester 747-1560. Trombin-spaltningssetene som avbilder B-området (740/741 og 1689/1690), forblir intakte.
B. FVIII- cDNA: Den øverste linje viser det fullstendige FVIII-cDNA som starter ved methionin-innlednings-kodonet (ATG) og ender ved translasjons-avslutningskodonet (TGA). Restriksjonssetene EcoRl, Sphl og BamHl angir posisjonene anvendt for å konstruere det utslettede (delta FVIII)-cDNA.
Den nedre figur viser den dannede variant. Den utslettede variant (delta FVIII) inneholder en intern, tilgrensende utslettelse som spenner over nucleotidene nt 2296-4737 (se figur 15-18).
Figur 23
Et cDNA-bibliotek ble bygget opp i lambda gtll fra polyA-utvalgt RNA (Ricca, upublisert) fra voksen lever, og en serie av overlappende kloner omfattende alle utenom - 500 bp av EX14-området, ble identifisert og sekvensbestemt. Et genomlignende klon med - 3000 bp omspennende det manglende område, ble isolert i EMBL3. Dette genomlignende klon og de egnede cDNA-kloner ble satt sammen til FVIII med full lengde inneholdende alle 26 exoner, og klonet i pGEM2 (Promega). Det dannede plasmid ble betegnet pl81-7. De følgende plasmider beskriver det anvendte oppbygningsskjerna for å frembringe en utslettelse i exon 14-området av FVIII DNA. Nummereringssystemet som anvendes overalt, baseres på at bp nr. 1 representerer A i ATG-translasjons-innledningskodonet.
pl59-l: Dette plasmid inneholder det fullstendige 5'-område (4744 bp) av FVIII og i tillegg 20 bp i motsatt retning av ATG-startkodonet. 5'-enden er modifisert til et Xhol-gjenkjennelsessete med syntetiske linkere (sam-
arbeidende forskning) for etterfølgende kloning. 3<1->enden er avgrenset av FVIII BamHl-sete (nt 4744).
pl67-2: pl59-l ble spaltet for å kompletteres med Sphl (nt 3936) etterfulgt av en delvis fordøyelse med EcoRl (nt 2290). Det påfølgende mellomrom ble fylt igjen med det følgende syntetiske oligonucleotid inneholdende kohesive EcoRl- og Sphl-ender (5-3) og et internt BamHl-sete :
Sekvensen fra EcoRl-til BamHl-setene er identisk
med nucleotider 2290-2295 etterfulgt av nucleotider 4738-4744 i FVIII-kart.
pl82-4: Et plasmid inneholdende det fullstendig sammensatte FVIII-cDNA (pl81-7), ble spaltet med BamHl, og det dannede, store fragment, fritt for det interne BamHl-fragment (nt 1870-4744), ble renset to ganger elektroforetisk i agarosegel og gjenvunnet ved elektroeluering. Plasmid pl67-x ble spaltet med BamHl, det lille, interne fragment inneholdende utslettelsen i exon 14, ble renset på lignende måte og deretter ligert til det store BamHl-fragment av pl81-7. DNA ble anvendt for å transformere kompetent E. coli HB101 og plasmid-DNA isolert fra flere ampicillin-resistente transformanter analysert ved restriksjonskart-legging, for å identifisere plasmider som skjuler den muterte DNA med BamHl-fragmentet i den riktige orientering. Plasmid-DNA ble renset, og sekvensen tvers igjennom det muterte område ble bekreftet ved hjelp av Maxam Gilbert-sekvensbestemmelse. De tydelige karakteristiske trekk for pl82-x omfatter en 2442 bp intern utslettelse i exon 14
(nt 2296-4737); 20 bp i motsatt retning og 214 bp i samme retning i forhold til FVIIIC-kodingsområdet, og et Xhol-sete ved 5'- og 3'-endene.
Figur 24
pl82-4-ATG-C: For å øke translasjonseffektiviteten ble området som omgir ATC-kodonet, erstattet med syntetisk oligonucleotid tilpasset en alminnelig godtatt 'AUG'-sekvens (Kozak 1984), men forøvrig identisk med FVIII-sekvensen. Dette ble oppnådd ved spaltning av pl82-4 ved Aatll-setet beliggende i pGEM2-sekvensen i motsatt retning av FVTII-innføyelsen, og Sacl (nt 15, figur 2). Det store fragment som manglet AatII/Sacl-fragmentet, ble renset og ligert til det syntetiske oligonucleotid vist nedenunder, som inneholder en intern, alminnelig godtatt ATG-sekvens, kohesive Aatll- og Sacl-terminaler (5-3) og internt Xhol-sete 20 bp i motsatt retning av ATG-kodonet
Figur 25
p-261-26: delta FVTII-innføyelsen ble gjenvunnet som et Xhol-fragment fra pl82-4-ATG-C og klonet i BPV-skyttelvektor pl43-7. Den dannede, rekombinante vektor, p261-26, inneholder de følgende genetiske bestanddeler beskrevet i retning mot urviseren: BPV-genom manglende 1485 bp fra dets ikke-transformerende område (nt 5473-6958 i BPV-kart, Chen, 1982); PML2d-sekvens, Moloney murint sarcom-virus(MSV)-forsterker; etterfulgt av muse-metallothionein-promoter (begge beskrevet i Sarver, et al., 1985); delta FVIII DNA-innføyelse fra pl82-ATG-C; og RNA-utviklende signaler fra SV40-genom (beskrevet i Sarver, et al., 1985).
pl88-3: Denne ekspresjonsvektor er identisk med p261-26 med unntak av at en FVIII cDNA-innføyelse (fra pl82-4) er tilstede i full lengde istedenfor den utslettede versjon.
Supernatante medier fra vilkårlig utvalgte transformerte linjer ble analysert med henblikk på delta FVIII biologisk aktivitet, definert som aktivitet som vil korrigere koagulasjonsdefekten i FVIII-manglende plasma. Akti-viteten uttrykkes som koagulasjonstiden påkrevet for dannelsen av en synlig fibrinklump i faktor Vlll-manglende plasma ved tilsetningen av prøver inneholdende faktor VIII-aktivitet. En kortere koagulasjonstid viser en større faktor Vlll-aktivitet i en gitt prøve. Anvendt i forbindelse med referanseprøver med kjente aktivitetsnivåer (U/ml), avpasses koagulasjonstiden til faktor VIII-C-aktivitets-nivået. Som vist ovenfor, varierer koagulasjonsaktivi-tetene i disse isolater fra 0,93-1,325 U/ml medier. Normale nivåer av sirkulerende FVIII er definert som 1 U/ml.
Det rekombinante delta FVIII-protein ble også vist
å kunne nøytraliseres av monoklonalt antistoff rettet mot 72 kd carboxy-underenheten av proteinet, og inhiberes av EDTA (SmM) som skyldes chelatering av CA + 2-ioner som er nødvendige for assosiasjonen av de forskjellige peptider i de aktive molekyler, og å aktiveres av trombin (ti ganger økning i aktivitet innen ett minutts inkubasjon ved 37°C).
Beskrivelse av koagulasjonsbestemmelse
1. Fremstilling av reagenser: Alle bestemmelser ble utført i 12 x 75 polystyrenrør (American Scientific
Products) . Faktor VTII-C-manglende plasma (George King Biomedical, Inc., Overland Park, KS) ble fjernet fra dypfryser ved -70°C, tint ved 37°C og overført til 12 x 75 polystyrenrør. Actin (aktivert cefaloplastin, lagret ved 4°C) ble overført til 12 x 75 rør og plassert på is inntil anvendelse. En oppløsning av 35 mM calciumklorid ble forvarmet ved 37°C. Normalt referanseplasma (George King Biomedicals) ble tint eller rekondisjonert på samme måte som med hver giverprøve, og plassert på is inntil anvendelse. 2. Beskrivelse: Umiddelbart før anvendelse ble en egnet fortynning av referanseoppløsningen tillaget i citrat-albuminbuffer (CAB, 14,3 mM Na-citrat/12,8 mM NaCl/6,1 mM Na-azid/0,5% albumin, pH 6,7) som ga en faktor VIII-c-konsentrasjon på 1 U/ml. En ytterligere fortynningsserie på 1:20, 1:40, 1:80 og 1:160 ble tillaget i CAB-oppløsning. Til en kyvette som var forvarmet ved 37°C og i hurtig rekkefølge, ble tilsatt 100 ul faktor VIII-C-manglende plasma, 100 ul actin og 100 pl 1:20 fortynning av referanseoppløsningen. Fremgangsmåten ble gjentatt for de gjenværende fortynninger med 90 sekunders inter-valler .
Hver blanding ble inkubert i nøyaktig 5 minutter. Koagulasjonskaskaden ble igangsatt med tilsetningen av
100 Ul forvarmet calciumklorid (35 mM), og den påkrevede tid for dannelsen av en fibrinklump ble omhyggelig kon-trollert .
Ved analyse av en testprøve med større innhold enn 0,4 U/ml, ble den samme fortynning som for referansen anvendt. Ved prøver som inneholdt mindre enn 0,4 U/ml, ble det anvendt en dobbelt fortynningsserie som startet med 1:5. Alle prøver ble behandlet som beskrevet ovenfor.
3. Beregninger: En standardkurve erholdes ved sammenligning av koagulasjonstider med faktor VIII-C-aktivitet i referanseprøver. Koagulasjonstider ved hver fortynning er inntegnet langs ordinaten på et log-log papir, og de resi- proke verdier av fortynningen er inntegnet langs abscissen. En egnet testlinje inntegnes. De erholdte resultater med prøvene inntegnes i samme grafen, og en mest velegnet linje som også går parallelt med referanselinjen, inntegnes. Forholdet mellom fortynninger for referansen og prøvene som gir den samme koagulasjonstid, bestemmes. Dette forhold multipliseres deretter med den fastsatte aktivitet for referansen for å erholde aktivitet/ml i prøven.
Eksempler
A. Fremstilling av total RNA
Total RNA (budbringer-RNA, ribosomal-RNA og trans-port-RNA) ble ekstrahert fra friske, humane, endotele celler fra navlestrengvene, vesentlig som beskrevet av Chirgwin, supra, (1979). Cellepelleter ble homogenisert i 15 volumer av en oppløsning inneholdende 4 M guanidin-thiocyanat, 25 mM natriumcitrat med pH 7,0, 0,5% N-lauryl-sarcosin, 0,1 M 2-mercaptoethanol og 0,2% "Antifoam A". Homogenatet ble sentrifugert ved 6.000 rpm i en Sorvall GSA rotor i 15 minutter ved 10°C. Den supernatante væske ble justert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre, og RNA ble bunnfelt med 0,75 volumer ethanol ved -20°C i 2 timer.
RNA ble oppsamlet ved sentrifugering og oppløst i 7,5 M guanidin-hydroklorid inneholdende 2 mM natriumcitrat og 5 mM dithiotreitol. Etterfulgt av to ytterligere bunnfell-inger ved anvendelse av 0,5 volumer ethanol ble det rester-ende guanidin-hydroklorid ekstrahert fra bunnfallet med absolutt ethanol. RNA ble oppløst i sterilt vann, uopp-løselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og pelleten ble re-ekstrahert med vann. RNA ble justert til 0,2 M kaliumacetat og bunnfelt ved tilsetning av 2,5 volumer ethanol ved -20°C over natten.
B. Fremstilling av poly( A)- holdig RNA
Det totale RNA-bunnfall, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble oppløst ved en konsentrasjon av 40 A2gQ-enheter i 20 mM HEPES-buffer (pH 7,2) inneholdende 10 mM EDTA og 1% SDS, oppvarmet til 65°C i 10 minutter, deretter hurtig avkjølt til 25°C. RNA-oppløsningen ble deretter fortynnet med et like stort volum vann, og natriumklorid ble tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon på 300 mM NaCl. Prøver inneholdende inntil 24.000 A„,^enheter RNA, ble kromato-2 60
grafert på poly(U)-Sepharose under anvendelse av standard-fremgangsmåter. Poly(A)-holdig RNA ble eluert med 90% formamid inneholdende 1 mM HEPES buffer (pH 7,2), og 2 mM EDTA. Eluatet ble justert til 0,24 M NaCl, og RNA ble bunnfelt med 2,5 volumer ethanol ved -20°C.
C. Fremstilling av cDNA- kloner i lambda gt-^
De fulgte fremgangsmåter for den enzymatiske reaksjon er vist i figur 1. mRNA (20 ug) ble kopiert inn i ds-cDNA ved hjelp av revers transkriptase og DNA-polymerase I nøyaktig som beskrevet av Buell, et al., supra, og Wildensen, et al., J. Biol. Chem., 253:2483 (1978). ds-cDNA ble avsaltet på "Sephadex" G-50, og de eluerte volumfrak-sjoner ble videre renset på en "Elutip"-D-kolonne (Schleicher&Schuell, Kenne, NH) ved etterfølgelse av fabrikantens anvisninger. ds-cDNA ble gjort butt-endet ved inkubasjon med Sl-nuclease, [Ricca, et al., J. Biol. Chem. 256:10362 (1981)]. Reaksjonsblandingen besto av 0,2 M natriumacetat (pH 4,5), 0,4 (M) natriumklorid, 2,5 mM sink-acetat og 0,1 enhet av Sl nuclease pr. ng ds-cDNA, tillaget til et endelig reaksjonsvolum på 100 ul. ds-cDNA ble inkubert ved 37°C i 1 time, ekstrahert med fenol:kloroform og deretter avsaltet på en "Sephadex G-50" kolonne som beskrevet ovenfor.
ds-cDNA ble deretter behandlet med EcoRI-methylase og DNA-polymerase I (Klenow) under anvendelse av reaksjons-betingelser i Maniatis (supra). cDNA ble nok en gang avsaltet på en "Sephadex" G-50 som beskrevet ovenfor, og deretter ligert til 0,5 g fosforylert EcoRl-linkere ved anvendelse av T^DNA-ligase (Maniatis, supra). DNA som inneholdt mer enn 1.000 baser, ble eluert fra gelen, gjenvunnet
ved binding til en "Elutip"-D-kolonne eluert med 1 M NaCl og deretter oppsamlet ved ethanolbunnfelling.
Som vist i figur 2, ble DNA-fragmentene deretter innføyet i EcoRI-spaltet og fosfatase-behandlet lambda gt-^ ved anvendelse av DNA-ligase for å fremstille et bibliotek med omtrent 12 millioner fat av hvilke 50% inneholder inn-føyelser (dvs. 6 millioner klare plakker på x-gal-plater). Biblioteket ble forsterket ved fremstilling av platelagre
ved 42°C på E. coli Y1088 [supE supF metB trpR hsdR~ hsdm<+>tonA21 strA lacU169 proc::Tn5 (pMC9)]. Forsterkningsfrem-gangsmåter er beskrevet i Maniatis, (supra). Viktige karakteristika for denne stamme, beskrevet av Young og Davis, omfatter (1) supF (påkrevet suppresjon av fag-amber-mutasjonen i S-genet), (2) hsdR hsdm<+>(nødvendig for å forhindre restriksjon av fremmed DNA forut for modifikasjon av verten), (3) lacUl69 (en utslettelse av lac-operonet som reduserer vert-fag-rekombinasjon og som er nødvendig for å skille mellom lambda gt-^rekombinanter og ikke-rekombinanter), og (4) pMC9 (et lacl-bærende pBR322-derivat som undertrykker, i fravær av et induksjonsmiddel, ekspresjonen av fremmede gener som kan være ugunstige for fag og/eller cellevekst). Rekken av det forsterkede bibliotek ble bestemt å være 8 x 10"^ pfu/ml. Albumin cDNA-kloner representerer 3-5% av de klare plakker i biblioteket bedømt ved hjelp av hybridisering med én "nick-translatert albumin-cDNA-klon.
D. Identifikasjon av kloner inneholdende faktor VIII-C-sekvens
For å utsortere fra biblioteket med henblikk på faktor VIII-C antigene determinanter som fremstiller kloner, ble 1,1 x 10 lambda gt.^rekombinant fag (70.000 pfu/plakk, 160 plater), utspredt på et underlag av E. coli Yol090 [lacU'169 proA<+>lon araDl39 strA supF [ trpC22: : TnlO] (pMC9) ] og inkubert ved 42°C i 3 timer. Denne vert mangler lon-protease som derved reduserer nedbrytningen av uttrykt fremmedprotein. Nitrocellulosefiltere som på forhånd var mettet med 10 mM isopropyl-thio-B-d-galactopyranosid (IPTG) og tørket, ble lagt oppå platene. Platene ble deretter overflyttet til en inkubator ved 37°C over natten. Fordi IPTG er et induksjonsmiddel for lacZ-transkripsjon,
er ekspresjonen av fremmed DNA-innføyelser i lambda gt-^ under vanlig kontroll med lacZ-transkripsjon, og er som sådan også indusert. Posisjonen av filtrene ble merket med en nål, filtrene ble fjernet, vasket med TBS-buffer (20 mM Tris,
pH 7,5 og 500 mM NaCl) og inkubert i TBS med tilsetning av 3% gelatin i 30 minutter ved romtemperatur.
Filtrene ble deretter inkubert ved romtemperatur over natten i en 1:100 fortynning av et emu-polyklonalt antistoff rettet mot faktor VIII-C i en buffer bestående av 1% gelatin i TBS. Antistoffet ble fremstilt som beskrevet av Fulcher og Zimmerman, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, _7_9:1648 (1984).
Etter 2 gangers vask i 30 minutter med TBS ved romtemperatur ble filtrene deretter inkubert med en 1:200 fortynning av kanin anti-emu IgG. Etter ytterligere to 30 minutters vaskinger med TBS ble filtrene inkubert med en 1:2.000 fortynning av pepperrotperoxydase (HRP)-konjugert geit anti-kanin-antisera (Bio-Rad, Richmond, CA). Filtrene ble deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur og vasket to ganger i 30 minutter i TBS. Filtrene ble inkubert ved romtemperatur i HRP-farvefremkallingsoppløsning som beskrevet i den medfølgende litteratur fra Bio-Rad.
26 antatt positive plakker ble identifisert.
En plugg med diameter 4 mm med beliggenhet ved farve-utviklingssignalet ble fjernet fra platene og inkubert i 10 mM Tris HC1, pH 7,5, og 10 mM MgSO. over natten. Omtrent
•10 3 plakk-dannende enheter (PFU) ble utplatet på nytt på
90 mm plater og utsortert på nytt som beskrevet ovenfor.
5 kloner forble positive gjennom den andre syklus av utsortering. Denne fremgangsmåte med ny utplating og ny utsortering ble gjentatt inntil alle plakker på platen dannet et signal.
Fag-DNA ble isolert fra hver av de 5 kloner. Res triksjonsendonuclease-spaltningsanalyse viste at de 5 kloner var identiske og sannsynligvis fremkom som en artefakt av forsterkningsfremgangsmåten.
cDNA-innføyelsen fra en av klonene ble fjernet ved anvendelse av en kombinasjon av restriksjonsenzymene EcoRl og Pvul. EcoRI-setet til høyre for den klonede cDNA viste seg uventet å mangle i alle 5 kloner; derfor ble Pvul som spalter ved den omtrentlige posisjon 20066 Kb i lambda gt-^, anvendt i kombinasjon med EcoRl. cDNA-innføyelsen (lengde omtrent 1,2 kilobaser) ble subklonet mellom Pvul og EcoRI-setene i pSP64 og deretter anvendt som en probe for
å utsortere fra lambda gt^-biblioteket på nytt og et humant, placentalt genombibliotek fremstilt i bakteriofag EMBL3.
En serie overlappende kloner med utstrekning til 5'-og 3'-retningen av de opprinnelige antistoff-positive kloner, og omfattende faktor VIII-C med full lengde, ble således identifisert. Det fullstendige sett av overlappende kloner ble sekvensanalysert og deretter satt sammen til en cDNA-klon med full lengde, som vist skjematisk i figur 3. DNA-sekvensen av det sammensatte faktor VIII-C kodingsområde med full lengde er gitt i figurene 5-9. Vår betegnelse for denne klon er pd delta BPV/F8C-20 (pl88-3).
Under sammensetningen av faktor VIII-C-sekvensen
med full lengde ble en cDNA-klon identifisert i hvilken nucleotidene som omfatter hele Exon 4 (nucleotider 389-601 i Gitschier, et al., supra), manglet. Utslettelsen kartlagt
i faktor VIII-C-analogen er nøyaktig og komplett ved at den består av 213 basepar som alle omfatter Exon 4. Utslettelsen strekker seg ikke inn i noe annet exon og er ikke en delmengde av Exon 4. I tillegg fører utslettelsen av de 213 basepar til fjernelsen av nøyaktig 71 aminosyrer fra det endelige faktor VIII-C-protein. Således bevarer denne utslettelse den åpne avlesningsramme av cDNA ved at amino-syreinnholdet og sekvensen av den gjenværende del av faktor VIII-C-peptidet er identisk med naturlig faktor VIII-C. Den komplette DNA-sekvens av denne faktor VIII-C-analog
(pd BPV/F8C-20-Ex4) er vist i figurene 10-14.
To kilder for Exon 4-utslettelsen oppdaget i dette cDNA, er mulig: (1) et in vitro artefakt-kloningstilfelle, eller (2) en naturlig forekommende mRNA fra hvilken denne cDNA er transkribert. Artefakte utslettelser er tilfeldige, variable i størrelse og ikke-konserverende. I beste fall fører de til et mutant protein med lignende biologisk virkning som det naturlige protein. Oftest fører de imidlertid til ikke-funksjonelle proteiner eller til for tid-lig avslutning av translasjonsprosessen. Den presise, komplette og konserverende natur av denne utslettelse tyder på at denne cDNA er den reverse transkripsjon av en naturlig forekommende mRNA som fulgte som et resultat av en alternativ in vivo-spleising av faktor VIII-C RNA. Figurene 10-14 avbilder derfor det som antas å være en naturlig forekommende faktor VIII-C-analog.
Andre faktor VIII-C-analoger er fremstilt genetisk. Sekvensen av to slike analoger er gitt i figurene 15-18
og figurene 12-22. Som vist i figurene 4 og 15-18, er det fremstilt en faktor VIII-C-analog DNA hvori nucleotidene 2296-4737 (som nummerert i figurene 5-9) er fjernet. Dette område inneholder en stor del av, men ikke alt, utslettet Exon 14. Utslettelsen er inneholdt i Exon 14-området og innkoder en del av faktor VIII-C-molekylet som er fjernet under trombinaktivering av faktor VIII-C under koagulasjonskaskaden. Vår betegnelse for denne klon er pd delta BPV/delta F8C-ATG-C (26126) .
En andre faktor VIII-C-analog er fremstilt hvori Exon 4-utslettelsen og den fremstilte utslettelse av meste-parten av Exon 14 er kombinert, som fører til cDNA med sekvens vist i figurene 19-22.
E. Fremstilling av ekspresjonsvektor
De sammensatte faktor VIII-C-analoge kodingssekvenser vist i figurene 10-14, figurene 15-18 og figurene 19-22,
ble innføyd i en bovin papillomavirus (BPV)-basert skyttel-vektor fremstilt ved Meloy Laboratories, Inc. Et skjematisk restriksjonskart av den følgende pdBPV/faktor VIII-C-analoge,
rekombinante DNA er vist i figur 25. En detaljert beskrivelse av de generiske bestanddeler i pdBPV/faktor VIII-C-analogen gis i det følgende. Bestanddelene er beskrevet i en retning med urviseren og begynner med 5<1->enden av
BPV DNA.
BPV DNA: Det fullstendige BPV-genom (tidlige og sene områder) fra hvilke sekvensen mellom nucleotider 5463
og 6958 var utslettet, er inneholdt i denne sammensetning. Denne sekvens ble vist å kunne unnværes for cellulær transformasjon og ekstrakromosomal replikasjon (Sarver, upublis-erte resultater). Hindlll-gjenkjennelsessekvensen ved ut-slettelsessetet er fjernet.
pML2Dl: Dette pBR322-derivat mangler sekvensene (1095-2485) som hemmer replikasjon av det prokaryotiske DNA
i pattedyrceller [Lusky og Botchan, Nature 293:79 (1981)]. Det opprinnelige pML2 ble videre modifisert ved utslettelse av sekvensene mellom Hindlll og Sali (hhv. 29 og 651, i pBR322-kartet). Det opprinnelige Hindlll-setet ble omdannet til et BamHl-sete, mens det opprinnelige Sall-sete ble beholdt.
M- MSV- forsterker: Det Moloney murine sarcomavirus-forsterkerfragment strekker seg fra Hinfl (base 141) til Xbal (base 525)-setet i den provirale, lange, terminale gjen-tagelse [ (Dhar, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77 : 3937
(1980)]. Begge seter ble omdannet til BamHI-seter med syntetiske linkere for å lette kloning.
M- MT- promoter : Muse-metallothionein-promoteren
er Kpnl [omtrent (-)300] til Bglll [(+)365]-fragmentet med CAP-setet (mRNA-startsete) ved (+)301. Bglll-setet ble omdannet til et Xhol-sete med syntetiske linkere for å lette kloning. Fordi kodingsområdet av M-MT-genet begynner med avlesningsretningen (ved +374) fra 3<1->enden (posisjon +365) av den heri beskrevne promoter, dannes det ingen sammen-smeltningsprodukter.
Faktor VIII- C- analog- innføyelse: Utledning av den fullstendige faktor VIII-C-cDNA (uten de fleste Exon 14-kodingssekvenser) er beskrevet i detalj i avsnitt D ovenfor. Innføyelsen inneholder 20 basepar 5' mot avlesningsretningen av det første ATG-kodon i faktor VIII-C-sekvensen, sekvensen koder for signalpeptidet, kodingsområdet, et translasjons-avslutningskodon, og 214 basepar av faktor VIII-C 3'-flanker-ende sekvenser. Fragmentet avsluttes med et PvuII-sete.
5'- og 3'-endene ble modifisert til Xhol-seter (med hhv. syntetiske oligonucleotider og syntetiske linkere) for å lette etterfølgende kloning. Dette fragment inneholder også en konsensus-ATG-sekvens (M. Kozak nucleic acid Research 12:857-872 (1984)).
SV40 polyadenyleringssete: De SV40-avledede RNA-fremstillende bestanddeler består av et sammensmeltet fragment som omfatter to ikke-tilstøtende områder av SV40-genomet. Et 610 basepar-område (4710 - 4100 på SV40-kartet) inneholder et intron (66 bp) fra det tidlige området av virusgenomet. Dette er sammensmeltet til et baseparfragment med 237 baser (2770 - 2533 på SV40-kartet) som inneholder polyadenyleringssignalet ved posisjon 2586. Bglll-setet ved 5<1->enden ble omdannet til et Xhol-sete med syntetiske linkere for å tillate etterfølgende ligering. BamHI-setet ved 3<1->enden ligeres til BamHl ved 5'-enden av BPV-genomet for å fullstendiggjøre den sirkulære struktur. pd delta BPV/delta FVIII.ATG.c (p261-26) har 15433 basepar.
F. Ekspresjon av faktor VIII- C- analoger i pattedyrceller
Muse-Cl27-celler [Lowry, D.R., et al., J. Virol,2J5-.72 (1978)] ble opprettholdt i Dulbecco modifisert Eagle medium supplert med penicillin (10 U/ml), streptomycin
(100 ug/ml) og 10% varmeinaktivert, bovint fosterserum
(GIBCO).
DNA-transformasjon ble utført ved anvendelse av fremgangsmåten som omfatter bunnfelling med calcium
(Graham og van der Eb, supra) etterfulgt av en dimethyl-sulfoxyd- [Stowe og Wolkie, J. Gen. Virol., 32:447 (1976)] eller glycerol-forsterkning [Frost og Williams, Virology, £1:39-50 (1978)]. En 2X DNA-CaCl2-oppløsning [1 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (pH 7,9), 0,1 mM
ethylendiamintetraacetat (EDTA), 250 mM CaCl2, 25 ug kalve-thymus-DNA pr. ml, 2,5 ug rekombinant DNA pr. ml] ble tilsatt til et likt volum 2X HBS-oppløsning (IX HBS = 140 mM NaCl,
25 mM HEPES [N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre], 0,75 mM natriumfosfat, pH 7,1), og DNA-bunnfallet ble til-
latt å dannes ved romtemperatur i løpet av en 45 minutters periode. Porsjoner som representerer 1 ug av det rekombinante DNA, ble tilsatt til cellekulturene i 60 mm petri-skåler inneholdende 4 ml friskt medium, og inkubasjon ble opprettholdt ved 37°C i 4 timer. Etter at mediet ble skiftet, ble cellene behandlet enten med 1 ml 25% dimethyl-sulfoxyd i HBS i 4 minutter ved romtemperatur, eller med 15% glycerol i HBS i 2 minutter ved romtemperatur. Mono-
lagene ble på nytt vasket og på nytt tilført næring med friskt medium.
Tilstedeværelsen av faktor VIII-C-analog cDNA i fremstilte celler ble bekreftet ved ti Southern blot f-DNA-
analyse, og sekvensen ble bekreftet ved den dideoxy-kjede-avsluttende DNA-sekvensanalyseteknikk [Sanger, et al.,
Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7^4 : 5463-5467 (1977)]. Ekspresjon
av faktor VIII-C-anlogt protein ble bekreftet ved "Northern blot"-RNA-analyse og ved in vitro translasjon av RNA. RNA ble enten utvunnet fra faktor VIII-C-analoge fremstilte celler, eller ble erholdt fra et in vitro transkripsjonssystem basert på SP6-fremgangsmåten [Melton, et al., Nuc. Acids Res., L2:7035-7056 (1984)]. Dette ble etterfulgt av immun-bunnfellinger, konkurrerende bunnfelling av ekstracellulære og intracellulære proteiner fremstilt av rekombinante celler, koagulasjonsbestemmelser og bestemmelser av biologisk aktivitet.
Deponering av stammer anvendelige ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse
En deponering av biologisk rene kulturer av følgende stammer ble gjort hos American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, og det angitte deponeringsnummer ble anført etter vellykket testing av levedyktighet. Adgang til denne kultur vil være tilgjengelig
mens søknaden om patent pågår, for den som får tillatelse av det ovenfor nevnte Culture Collection byrå. Denne kultur vil forbli permanent tilgjengelig i et tidsrom på minst 5 år etter den siste anmodning om levering av en prøve, og i alle tilfelle i en periode på minst 30 år etter deponerings-datoen. Dersom kulturen skulle bli ikke-levedyktig eller uforvarende bli ødelagt, vil den erstattes med en levedyktig kultur(er) med den samme taksonomiske beskrivelse.
Vedlagt samtidig med innsendelse av denne søknad under de ovenfor nevnte betingelser: pd delta BPV/delta F8C-ATG-C (p261-26).
Claims (13)
1. Human faktor VIII-C-analog, karakterisert ved at den ikke inneholder andre proteiner av human opprinnelse.
2. Human faktor VIII-C-analog ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen av genet som koder for analogen, fremlegges i figurene 10-14.
3. Human faktor VIII-C-analog ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen av genet som koder for analogen, fremlegges i figurene 15-18.
4. Human faktor VIII-C-analog ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen av genet som koder for analogen, fremlegges i figurene 19-22.
5. Human faktor VIII-C-analog ifølge krav 1, karakterisert ved at sekvensen av genet som koder for analogen, fremlegges i figurene 5-9 med unntak av ett eller flere exoner eller deler derav.
6. En cDNA-klon,
karakterisert ved den fullstendige sekvens for analogen ifølge krav 1.
7. En cDNA-klon,
karakterisert ved den fullstendige sekvens for analogen ifølge krav 2, 3 eller 4.
8. En cDNA-klon,
karakterisert ved den fullstendige sekvens for analogen ifølge krav 5.
9. En selv-replikerende ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den er i stand til å uttrykke, i et in vitro dyrkningssystem, analogen ifølge krav 1 (p. 261-118).
10. Et celle- eller cellefritt, selv-replikerende system, karakterisert ved at det er transformert med vektoren ifølge krav 9.
11. Fremgangsmåte for fremstilling av faktor VIII-C-analoger ,
karakterisert ved (a) fremstilling av en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for en faktor VIII-C-analog i en egnet vertcelle eller i et egnet, cellefritt, replikerende system; (b) transformasjon av vertsystemet til et rekombinant vertsystem; (c) opprettholdelse av det rekombinante vertsystem under betingelser som muliggjør ekspresjon av DNA-sekvensen som koder for faktor VIII-C-analogen slik at denne fremstilles; og (d) utvinning av faktor VIII-C-analogen.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for faktor VIII-C-analogen, er som fremlagt i figurene 5-9 med unntak av ett eller flere exoner eller deler derav.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for faktor VIII-C-analogen, er som fremlagt i figurene 10-14, 15-18 eller 19-22.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91915386A | 1986-10-15 | 1986-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO874292D0 NO874292D0 (no) | 1987-10-14 |
| NO874292L true NO874292L (no) | 1988-04-18 |
Family
ID=25441601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO874292A NO874292L (no) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Fremgangsmaate for fremstilling av forbindelser som er analoge med faktor viii-c. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0265778A1 (no) |
| JP (1) | JPS6456696A (no) |
| AU (1) | AU614497B2 (no) |
| DK (1) | DK539587A (no) |
| FI (1) | FI874546A (no) |
| IL (1) | IL84168A0 (no) |
| NO (1) | NO874292L (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR910006424B1 (ko) * | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| US5595886A (en) * | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US6060447A (en) * | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| IE69026B1 (en) * | 1987-06-12 | 1996-08-07 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| EP0294910B1 (en) * | 1987-06-12 | 1996-09-11 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity, process for their preparation using genetically engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| FR2619314B1 (fr) * | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
| JP2810744B2 (ja) * | 1989-07-04 | 1998-10-15 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｆ▲ｖｉｉｉ▼活性を有する蛋白質および／またはｆ▲ｖｉｉｉ▼誘導体の製造法 |
| DK53792D0 (da) * | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| EP1707634A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-04 | Octapharma AG | Method for isolation of recombinantly produced proteins |
| EP1739179A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| WO2011095604A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh | Half-life prolongation of proteins |
| KR20140084208A (ko) | 2011-10-18 | 2014-07-04 | 시에스엘 리미티드 | 정제된 인자 ｖｉｉｉ의 재구성 후의 안정성을 향상시키는 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122004000028I1 (de) * | 1984-01-12 | 2004-09-30 | Chiron Corp | F}r Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen. |
| ATE72838T1 (de) * | 1985-04-12 | 1992-03-15 | Genetics Inst | Neue prokoagulierungsproteine. |
| IL83192A (en) * | 1986-07-18 | 1992-11-15 | Gist Brocades Nv | Method for the preparation of proteins with factor viii activity by microbial host cells;expression vectors,host cells,antibodies |
-
1987
- 1987-10-13 IL IL84168A patent/IL84168A0/xx unknown
- 1987-10-14 AU AU79816/87A patent/AU614497B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-14 NO NO874292A patent/NO874292L/no unknown
- 1987-10-14 EP EP87115043A patent/EP0265778A1/en not_active Withdrawn
- 1987-10-15 JP JP62258484A patent/JPS6456696A/ja active Pending
- 1987-10-15 DK DK539587A patent/DK539587A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-10-15 FI FI874546A patent/FI874546A/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU614497B2 (en) | 1991-09-05 |
| FI874546A (fi) | 1988-04-16 |
| AU7981687A (en) | 1988-04-21 |
| IL84168A0 (en) | 1988-03-31 |
| FI874546A0 (fi) | 1987-10-15 |
| DK539587A (da) | 1988-04-16 |
| EP0265778A1 (en) | 1988-05-04 |
| DK539587D0 (da) | 1987-10-15 |
| NO874292D0 (no) | 1987-10-14 |
| JPS6456696A (en) | 1989-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0090505B1 (en) | Human antithrombin iii, dna sequences therefor, expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby, a process for expressing human antithrombin iii, and pharmaceutical compositions comprising it | |
| DK175807B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af human vækstfaktor fra endotheliale celler | |
| KR970002915B1 (ko) | 제ⅷ인자 활성을 가지는 신규한 단백질 : 유전공학-제조 세포를 사용하는 그의 제조방법 및 그것을 함유하는 의약 조성물 | |
| Verweij et al. | Full‐length von Willebrand factor (vWF) cDNA encodes a highly repetitive protein considerably larger than the mature vWF subunit. | |
| Tillmann et al. | cDNA clones of the auxin‐binding protein from corn coleoptiles (Zea mays L.): isolation and characterization by immunological methods. | |
| US5700778A (en) | Conotoxins I | |
| US4689318A (en) | GRF analogs | |
| US5149637A (en) | Recombinant Factor VIIIC fragments | |
| NO874292L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av forbindelser som er analoge med faktor viii-c. | |
| US4517294A (en) | Human antithrombin III | |
| NO179253B (no) | Rekombinant DNA-sekvens som koder for humant proapolipoprotein A-I, ekspresjonsvektorer, cellekulturer samt fremgangsmåte for fremstilling av proteinet | |
| NO309041B1 (no) | DNA-sekvens, rekombinant ekspresjonsvektor og vertscelle omfattende DNA-sekvensen, samt fremgangsmÕte for fremstilling av human faktor VIII-derivat | |
| EP0255771A1 (en) | Recombinant dna encoding mature human protein s. | |
| NO308174B1 (no) | DNA-sekvens som koder for et biologisk aktivt rekombinant menneskefaktor VIII-derivat, rekombinant ekspresjonsvektor og vertscelle omfattende DNA-sekvensen, samt fremgangsmÕte for fremstilling av menneskefaktor VIII-derivat | |
| NO305211B1 (no) | DNA-segment som koder for et l°selig human vevsfaktor-tungkjedeprotein, samt rekombinant DNA-molekyl omfattende segmentet | |
| US4886748A (en) | DNA encoding flagellin and vector having the same | |
| JPH09135691A (ja) | 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法 | |
| CZ171492A3 (en) | Polypeptide, process of its preparation, pharmaceutical composition containing thereof and its use as an intermediate for insulin preparation | |
| US5238919A (en) | Peptides that inhibit von Willebrand Factor binding to the platelet SPIB receptor | |
| US4980456A (en) | Recombinant factor VIIIC derived fragments | |
| US5900476A (en) | Therapeutic domains of van Willebrand factor | |
| US5777073A (en) | Cyclic CRF antagonist peptides | |
| AU665034B2 (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
| US4632981A (en) | Human antithrombin III | |
| JPS6122023A (ja) | ヒト因子８−ｃとこれを作る製法及び組成物 |