JP2810744B2 - F▲viii▼活性を有する蛋白質および/またはf▲viii▼誘導体の製造法 - Google Patents

F▲viii▼活性を有する蛋白質および/またはf▲viii▼誘導体の製造法

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JP2810744B2 JP1507715A JP50771589A JP2810744B2 JP 2810744 B2 JP2810744 B2 JP 2810744B2 JP 1507715 A JP1507715 A JP 1507715A JP 50771589 A JP50771589 A JP 50771589A JP 2810744 B2 JP2810744 B2 JP 2810744B2
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745Blood coagulation or fibrinolysis factors
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳類細胞をインビトロで培養することに
よるF VIII活性を有する蛋白質および/又はF VIII誘導
体を生産する方法に関する。
出血疾患血友病Aは、第VIII因子(F VIII)の欠乏に
よって引きおこされる。F VIIIは、血漿から単離できる
糖タンパク質である(米国特許4,650,858)。精製したF
VIIIは、血友病Aの治療に用いられる。遺伝子工学手
法を用いることにより、F VIIIを合成することが可能で
ある(EPO160,457、WO85/01961、US570,062)。哺乳類
細胞中で産生され得るF VIIIの量は、他のヒト蛋白質に
比較して相当に低い。蛋白質の量は、もしもF VIIIの端
を切り取った変異体が生合成されるか(WO86/06101、DK
3442/87)、又はもしもサブユニット(F VIII重鎖およ
びF VIII軽鎖)が一緒に生産されると増大する(US822,
989)。また、別個に生産されたサブユニットから活性F
VIIIをインビトロで組立てることも可能である(DK295
7/86)。上述の形態のF VIIIは、全てヒトF VIIIの特
徴:生合成における活性、トロンビンにより活性化可能
および血友病の犬における生物学的活性を有する。
哺乳類は、一部は体温を37℃近くに一定に保つ能力に
よって特徴づけられている。F VIIIは体内を該温度で循
環しており、更に血清含有培地(これは模擬の体液)中
で培養することにより、F VIIIが最適安定性を有するこ
とが期待される。血清のない培地中で生産されるF VIII
は相当に不安定であるが、しかしそれにもかゝわらず培
地から血清を放出させることは魅力的である。更にWO87
/04187はF VIIIが担体タンパク質フオンウレブラント因
子(FWF)の添加により血清のない培地中で安定化され
得ることを開示する。DK3594/87はF VIIIがまたリポタ
ンパク質の添加により血清のない培地中で安定化され得
ることを示している。これらの安定化剤は、血清含有培
地中で著るしい効果は示さない。
驚くべきことに、37℃の未満、より正確に33℃の未満
の温度で哺乳動物の細胞を培養することにより、端を切
り取ったF VIII変異体の収率およびF VIII由来サブユニ
ット(特にF VIII重鎖)の収率は、血清含有および血清
なしの媒地の双方において劇的に増加する。
10℃〜32℃の温度、より好ましくは25℃〜30℃、最も
好ましくは27℃の温度で培養することが好ましい。
更に、驚くべきことに以下の内容が見出された。すな
わち、収率が培地帯留時間を通常の24〜72時間(この時
間は通常哺乳動物の細胞からの最適収率を与える)未満
に短かくすることにより上昇する。低い増殖温度と短い
培地帯留時間の組合せ効果は、F VIII重鎖の場合に特に
著るしく、この場合収率は25倍に上昇する。
低温度および短い培地帯留時間でのF VIII重鎖(HC)
の収率増加は、通常の増殖条件で生成物の不安定性に関
係し得る。第1表はF VIII重鎖が37℃でF VIII軽鎖に結
合する能力を失うことを示している。第1図はF VIII重
鎖が37℃で凝集体を形成することを示している。これら
の凝正集体は、還元の際、分解し得る。端を切り取った
F VIIIの変異体は、F VIII−HCと同様に挙動し更に高温
度で凝集体を形成する。しかし、低温での収率増加は、
また凝正集体における減少よりも他の因子によりもたら
され得る。例えば、蛋白分解に対するより大きな抵抗性
はより重要であろう。
好ましい宿主細胞には哺乳類細胞、例えばCHO細胞、C
OS−7猿細胞、メラノーマ細胞系統、例えばボウエス
(Bowes)細胞、マウスL−929細胞3T3系統、Balb−c
又はNIHマウス、BHK又はHAKハムスター細胞系統等が含
まれる。
実施例は以下の内容を示している。すなわち、端を切
り取ったF VIII変異体、F VIII重鎖、F VIIIおよび2種
のサブユニットの各々をコードするプラスミドで同時移
入された細胞から得られたF VIIIの収率は低温度で増加
する。
プラスミド由来F VIII−HC(300U/ml)を、0.05%BC
A、50mMのTris、0.1MのNacl、0.02%のNaN3、150μMの
2−MECpH7.4)中で4倍に希釈し次いで22℃および37℃
でインキュベートした。0,4,24時間に試料を−80℃で凍
結した。試料を投入し次いでウエスタン(Western)ブ
ロット中(未沸とう)減少および未減少を分析した。更
に、試料を300倍に希釈し次いでF VIII−LCとの組合せ
に対して試験した(WO88/00210)。
本発明を図面を参照しつつ更に説明する。第1図は22
℃および37℃でインキュベートされるF VIII−HCのウエ
スタン(Western)ブロットを示す(試料は第1表に記
載のものと同じ)。
プラスミドの記載 プラスミド 記載 pPR49 VIII変異体をコードするcDNA(こおにおいて、8
80個のアミノ酸がB−領域において欠損している)(変
異体はPCT特許出願、公開番号WO86/06101中、pLA−2プ
ラスミドによりコードされるものと同一である)が、発
現ベクターpSV7dに挿入されている(トルエット等、198
5年、DNA;333〜349) pPR60 VIII因子変異体をコードするcDNA(ここにおい
て、Arg−740はSer−1690に直接融合している)がpSV7d
に挿入されている。
pSVF8−92E 92KDペプチド(重鎖)由来のVIII因子がpS
V7dに挿入されている。
pSVF−8−80K 80KDペプチド(軽鎖)由来のVIII因子
がpSV7dに挿入されている。
例1 VIII因子の活性による蛋白質の収率に対する増殖温度の
効果 発現プラスミドpPR49およびpPR60を、リン酸カルシウ
ム法(グラーハムおよびファンデルエブ、1973年、Viro
logy52;456〜467)を用い、DNAクローニング、プラクテ
ィカルアプローチ、Vol.I+II/IRLプレスに記載された
変法を用いCOS−7猿の細胞に移入した。(各プラスミ
ドは合計で8個の5cmの皿に移入した:37℃および27℃の
各々での発現に対して2回測定される2個の皿であっ
て、血清含有培地(10%)を有する;更に血清なしの培
地を有する同数の皿)。移入後16時間めに、培地を変換
した;半分の皿を血清なし培地に移した。移入後40時間
めに、培地を交換し次いで半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した。更に24時間後、培地を採取し次いでVI
II因子の活性をKabiコーテスト発色分析法を用いて測定
した。結果を第2表に示す。
例2 CHO細胞系統からVIII因子重鎖の収率に関する低増殖温
度および短培地帯留時間の組合せ効果 CHO(中国産ハムスターの卵巣)細胞系統DUKX−B11
(ウルラウベおよびカゼン、1980年、pNAS77;4216〜422
0)(これは、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子
内で突然変異されている)をプラスミドpSVF8−92Eおよ
便pSVF−80Kおよびジヒドロフォレートレダクターゼを
コードするプラスミドと共に同時移入した。(これらの
同時移入は米国特許出願82,989に記載されている)。
この方法で、クローン(10C2D2)を単離し、37℃で増
殖した場合、軽鎖(LC)よりも重鎖(HC)を10倍生産す
ることを特徴とする。
10C2D2を27℃で増殖すると、HCの収率はLCの収率に関
して見られるように劇的に上昇する(第3表)。
培地帯留時間をわずか2時間に短縮することにより、
1日当たりのHCの収率増が達成される(表4): 例3 10C2D2を用いる28〜30℃でのオプティセルバイオリアク
ター内でのF VIII:HCの生産 オプティセルバイオリアクター内の細胞をセラミック
スマトリックス、オプティコア上で培養し、次いで培養
培地をオプティコア内を循環させる。酸素濃度、pH、培
地供給および回収は全てシステムにより測定され更に制
御される。
平均培地循環時間は5時間であった(750mlの容器お
よびオプティコア内で1時間当たり/50mlの容量)。培
養液を5℃で集め次いで−80℃で24時間毎に凍結させ
た。
融合近くまで(酸素消費速度により測定)細胞を培養
し次いでF VIII:HCの調製に対し温度を28〜30℃に下げ
た。
細胞を調製温度で1000時間保持した。酸素消費速度
は、温度が37℃から30℃におよび30℃から28℃に低下す
ると2,3時間内に減少した。しかし各々の時間に酸素消
費速度は再たび徐々に増加した。かくして、細胞は1000
時間よりもより長い期間に対してさえもより低温で保持
できる。
第5表に、培地組成および供給/回収量並びいくつか
の回収試料に対するF VIII:HCレベルを示す。
例4 COS−7猿の細胞からVIII因子軽鎖の収率に対する低培
殖温度の効果 VIII因子軽鎖をコードするpPR77と指定される発現プ
ラスミドを例1に記載したと同様にCOS−7細胞に移入
した。プラスミドを4個の5cm皿に移入した:2個の皿に
ついて各々37℃および27℃での発現に対し2回測定し
た。培地(DMEM+10%FCS)を移入後16時間および40時
間めに交換した(40時間で半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した)。更に24時間後、培地を集めた。第VI
II因子軽鎖の含量を例2に記載の如く測定した、結果を
第6表に示す。
例5 第VIII因子の二種のサブユニット:重鎖および軽鎖の各
々をコードするプラスミドを移入されたCHO細胞からの
第VIII活性を有する蛋白質−錯体の収率に関する低増殖
温度の効果 DHFR(−)CHO細胞系統(G.ウルラウブ等、Proc.Nat
l.Sci.,USA 77;4216〜4220,1980)に第VIII因子の軽鎖
およびdhfr遺伝子をコードするプラスミドを先ず移入し
た。DHFR(+)細胞を選択することにより、安定な軽鎖
生産体を単離した。この新しい細胞系統に、第VIII因子
の重鎖(およびdhfr遺伝子)をコードするプラスミドお
よびネオ遺伝子をコードするプラスミド(pSV2neo;P.J.
サザンおよびP.ベルク、Journal of Molecular and App
lied Genetics ;327〜341,1982)を同時移入した。移
入体を1ml当たり700μgのゲネチシン(G418 Sulphate,
Gibco)を含有する培地中で単離した。第一のプールか
らの細胞を、0.1μMのMTXを含有する培地内に直接増殖
させた。2つのT−80フラスコ(フラスコAおよびフラ
スコB)内でこのようにして単離した細胞に播種した。
融合の際、培地(DMEK+10%DFCS+700μgゲネチシン/
ml+0.1μM MTX)を交換し(10ml)次いでフラスコを37
℃で24時間インキュベートし、しかる後培地試料を集め
た。
培地を新たにし次いでフラスコBを27℃のインキュベ
ーターに移した。再たび、フラスコを24時間インキュベ
ートし、引き続き培地試料を集め更に培地を新たにし
た。この手順を更に2日間くりかえした(フラスコAは
未だ37℃であり、フラスコBも未だ27℃であった)。第
VIII因子の活性をカビ(kabi)コーテスト発色分析法に
より測定した。結果を第7表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12P 21/02 CA(STN)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】F VIIIを産生する哺乳類細胞のインビトロ
    培養によるF VIII活性を有する蛋白質および/又はF VI
    II誘導体の生産方法であって、該培養を25〜30℃の温度
    で行うことを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】前記温度が27℃である、請求の範囲第1項
    記載の方法。
  3. 【請求項3】生産されるF VIII誘導体が92.5KDフラグメ
    ント又は重鎖である、請求の範囲第1項又は第2項に記
    載の方法。
  4. 【請求項4】生産されるF VIII誘導体が80KDフラグメン
    ト又は軽鎖である、請求の範囲第1項又は第2項に記載
    の方法。
  5. 【請求項5】生成物が、F VIIIの2つのサブユニット、
    すなわち重鎖および軽鎖の各々をコードするプラスミド
    が移入された細胞から得られるF VIII活性を有する蛋白
    質−複合体である、請求の範囲第1項又は第2項に記載
    の方法。
  6. 【請求項6】用いた哺乳類細胞が、COS細胞、CHO細胞又
    はBHK細胞である、請求の範囲第1〜5項のいずれかに
    記載の方法。
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