JP2810744B2 - Ｆ▲ｖｉｉｉ▼活性を有する蛋白質および／またはｆ▲ｖｉｉｉ▼誘導体の製造法 - Google Patents
Ｆ▲ｖｉｉｉ▼活性を有する蛋白質および／またはｆ▲ｖｉｉｉ▼誘導体の製造法Info
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- JP2810744B2 JP2810744B2 JP1507715A JP50771589A JP2810744B2 JP 2810744 B2 JP2810744 B2 JP 2810744B2 JP 1507715 A JP1507715 A JP 1507715A JP 50771589 A JP50771589 A JP 50771589A JP 2810744 B2 JP2810744 B2 JP 2810744B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳類細胞をインビトロで培養することに
よるF VIII活性を有する蛋白質および／又はF VIII誘導
体を生産する方法に関する。
よるF VIII活性を有する蛋白質および／又はF VIII誘導
体を生産する方法に関する。
出血疾患血友病Ａは、第VIII因子（F VIII）の欠乏に
よって引きおこされる。F VIIIは、血漿から単離できる
糖タンパク質である（米国特許4,650,858）。精製したF
VIIIは、血友病Ａの治療に用いられる。遺伝子工学手
法を用いることにより、F VIIIを合成することが可能で
ある（EPO160,457、WO85/01961、US570,062）。哺乳類
細胞中で産生され得るF VIIIの量は、他のヒト蛋白質に
比較して相当に低い。蛋白質の量は、もしもF VIIIの端
を切り取った変異体が生合成されるか（WO86/06101、DK
3442/87）、又はもしもサブユニット（F VIII重鎖およ
びF VIII軽鎖）が一緒に生産されると増大する（US822,
989）。また、別個に生産されたサブユニットから活性F
VIIIをインビトロで組立てることも可能である（DK295
7/86）。上述の形態のF VIIIは、全てヒトF VIIIの特
徴：生合成における活性、トロンビンにより活性化可能
および血友病の犬における生物学的活性を有する。
よって引きおこされる。F VIIIは、血漿から単離できる
糖タンパク質である（米国特許4,650,858）。精製したF
VIIIは、血友病Ａの治療に用いられる。遺伝子工学手
法を用いることにより、F VIIIを合成することが可能で
ある（EPO160,457、WO85/01961、US570,062）。哺乳類
細胞中で産生され得るF VIIIの量は、他のヒト蛋白質に
比較して相当に低い。蛋白質の量は、もしもF VIIIの端
を切り取った変異体が生合成されるか（WO86/06101、DK
3442/87）、又はもしもサブユニット（F VIII重鎖およ
びF VIII軽鎖）が一緒に生産されると増大する（US822,
989）。また、別個に生産されたサブユニットから活性F
VIIIをインビトロで組立てることも可能である（DK295
7/86）。上述の形態のF VIIIは、全てヒトF VIIIの特
徴：生合成における活性、トロンビンにより活性化可能
および血友病の犬における生物学的活性を有する。
哺乳類は、一部は体温を37℃近くに一定に保つ能力に
よって特徴づけられている。F VIIIは体内を該温度で循
環しており、更に血清含有培地（これは模擬の体液）中
で培養することにより、F VIIIが最適安定性を有するこ
とが期待される。血清のない培地中で生産されるF VIII
は相当に不安定であるが、しかしそれにもかゝわらず培
地から血清を放出させることは魅力的である。更にWO87
/04187はF VIIIが担体タンパク質フオンウレブラント因
子（FWF）の添加により血清のない培地中で安定化され
得ることを開示する。DK3594/87はF VIIIがまたリポタ
ンパク質の添加により血清のない培地中で安定化され得
ることを示している。これらの安定化剤は、血清含有培
地中で著るしい効果は示さない。
よって特徴づけられている。F VIIIは体内を該温度で循
環しており、更に血清含有培地（これは模擬の体液）中
で培養することにより、F VIIIが最適安定性を有するこ
とが期待される。血清のない培地中で生産されるF VIII
は相当に不安定であるが、しかしそれにもかゝわらず培
地から血清を放出させることは魅力的である。更にWO87
/04187はF VIIIが担体タンパク質フオンウレブラント因
子（FWF）の添加により血清のない培地中で安定化され
得ることを開示する。DK3594/87はF VIIIがまたリポタ
ンパク質の添加により血清のない培地中で安定化され得
ることを示している。これらの安定化剤は、血清含有培
地中で著るしい効果は示さない。
驚くべきことに、37℃の未満、より正確に33℃の未満
の温度で哺乳動物の細胞を培養することにより、端を切
り取ったF VIII変異体の収率およびF VIII由来サブユニ
ット（特にF VIII重鎖）の収率は、血清含有および血清
なしの媒地の双方において劇的に増加する。
の温度で哺乳動物の細胞を培養することにより、端を切
り取ったF VIII変異体の収率およびF VIII由来サブユニ
ット（特にF VIII重鎖）の収率は、血清含有および血清
なしの媒地の双方において劇的に増加する。
10℃〜32℃の温度、より好ましくは25℃〜30℃、最も
好ましくは27℃の温度で培養することが好ましい。
好ましくは27℃の温度で培養することが好ましい。
更に、驚くべきことに以下の内容が見出された。すな
わち、収率が培地帯留時間を通常の24〜72時間（この時
間は通常哺乳動物の細胞からの最適収率を与える）未満
に短かくすることにより上昇する。低い増殖温度と短い
培地帯留時間の組合せ効果は、F VIII重鎖の場合に特に
著るしく、この場合収率は25倍に上昇する。
わち、収率が培地帯留時間を通常の24〜72時間（この時
間は通常哺乳動物の細胞からの最適収率を与える）未満
に短かくすることにより上昇する。低い増殖温度と短い
培地帯留時間の組合せ効果は、F VIII重鎖の場合に特に
著るしく、この場合収率は25倍に上昇する。
低温度および短い培地帯留時間でのF VIII重鎖（HC）
の収率増加は、通常の増殖条件で生成物の不安定性に関
係し得る。第１表はF VIII重鎖が37℃でF VIII軽鎖に結
合する能力を失うことを示している。第１図はF VIII重
鎖が37℃で凝集体を形成することを示している。これら
の凝正集体は、還元の際、分解し得る。端を切り取った
F VIIIの変異体は、F VIII−HCと同様に挙動し更に高温
度で凝集体を形成する。しかし、低温での収率増加は、
また凝正集体における減少よりも他の因子によりもたら
され得る。例えば、蛋白分解に対するより大きな抵抗性
はより重要であろう。
の収率増加は、通常の増殖条件で生成物の不安定性に関
係し得る。第１表はF VIII重鎖が37℃でF VIII軽鎖に結
合する能力を失うことを示している。第１図はF VIII重
鎖が37℃で凝集体を形成することを示している。これら
の凝正集体は、還元の際、分解し得る。端を切り取った
F VIIIの変異体は、F VIII−HCと同様に挙動し更に高温
度で凝集体を形成する。しかし、低温での収率増加は、
また凝正集体における減少よりも他の因子によりもたら
され得る。例えば、蛋白分解に対するより大きな抵抗性
はより重要であろう。
好ましい宿主細胞には哺乳類細胞、例えばCHO細胞、C
OS−７猿細胞、メラノーマ細胞系統、例えばボウエス
（Bowes）細胞、マウスＬ−929細胞3T3系統、Balb−ｃ
又はNIHマウス、BHK又はHAKハムスター細胞系統等が含
まれる。
OS−７猿細胞、メラノーマ細胞系統、例えばボウエス
（Bowes）細胞、マウスＬ−929細胞3T3系統、Balb−ｃ
又はNIHマウス、BHK又はHAKハムスター細胞系統等が含
まれる。
実施例は以下の内容を示している。すなわち、端を切
り取ったF VIII変異体、F VIII重鎖、F VIIIおよび２種
のサブユニットの各々をコードするプラスミドで同時移
入された細胞から得られたF VIIIの収率は低温度で増加
する。
り取ったF VIII変異体、F VIII重鎖、F VIIIおよび２種
のサブユニットの各々をコードするプラスミドで同時移
入された細胞から得られたF VIIIの収率は低温度で増加
する。
プラスミド由来F VIII−HC（300U/ml）を、0.05％BC
A、50mMのTris、0.1MのNacl、0.02％のNaN3、150μＭの
２−MECpH7.4）中で４倍に希釈し次いで22℃および37℃
でインキュベートした。0,4,24時間に試料を−80℃で凍
結した。試料を投入し次いでウエスタン（Western）ブ
ロット中（未沸とう）減少および未減少を分析した。更
に、試料を300倍に希釈し次いでF VIII−LCとの組合せ
に対して試験した（WO88/00210）。
A、50mMのTris、0.1MのNacl、0.02％のNaN3、150μＭの
２−MECpH7.4）中で４倍に希釈し次いで22℃および37℃
でインキュベートした。0,4,24時間に試料を−80℃で凍
結した。試料を投入し次いでウエスタン（Western）ブ
ロット中（未沸とう）減少および未減少を分析した。更
に、試料を300倍に希釈し次いでF VIII−LCとの組合せ
に対して試験した（WO88/00210）。
本発明を図面を参照しつつ更に説明する。第１図は22
℃および37℃でインキュベートされるF VIII−HCのウエ
スタン（Western）ブロットを示す（試料は第１表に記
載のものと同じ）。
℃および37℃でインキュベートされるF VIII−HCのウエ
スタン（Western）ブロットを示す（試料は第１表に記
載のものと同じ）。
プラスミドの記載 プラスミド 記載 pPR49 VIII変異体をコードするcDNA（こおにおいて、8
80個のアミノ酸がＢ−領域において欠損している）（変
異体はPCT特許出願、公開番号WO86/06101中、pLA−２プ
ラスミドによりコードされるものと同一である）が、発
現ベクターpSV7dに挿入されている（トルエット等、198
5年、DNA４;333〜349） pPR60 VIII因子変異体をコードするcDNA（ここにおい
て、Arg−740はSer−1690に直接融合している）がpSV7d
に挿入されている。
80個のアミノ酸がＢ−領域において欠損している）（変
異体はPCT特許出願、公開番号WO86/06101中、pLA−２プ
ラスミドによりコードされるものと同一である）が、発
現ベクターpSV7dに挿入されている（トルエット等、198
5年、DNA４;333〜349） pPR60 VIII因子変異体をコードするcDNA（ここにおい
て、Arg−740はSer−1690に直接融合している）がpSV7d
に挿入されている。
pSVF8−92E 92KDペプチド（重鎖）由来のVIII因子がpS
V7dに挿入されている。
V7dに挿入されている。
pSVF−８−80K 80KDペプチド（軽鎖）由来のVIII因子
がpSV7dに挿入されている。
がpSV7dに挿入されている。
例１ VIII因子の活性による蛋白質の収率に対する増殖温度の
効果 発現プラスミドpPR49およびpPR60を、リン酸カルシウ
ム法（グラーハムおよびファンデルエブ、1973年、Viro
logy52;456〜467）を用い、DNAクローニング、プラクテ
ィカルアプローチ、Vol.I＋II/IRLプレスに記載された
変法を用いCOS−７猿の細胞に移入した。（各プラスミ
ドは合計で８個の5cmの皿に移入した:37℃および27℃の
各々での発現に対して２回測定される２個の皿であっ
て、血清含有培地（10％）を有する；更に血清なしの培
地を有する同数の皿）。移入後16時間めに、培地を変換
した；半分の皿を血清なし培地に移した。移入後40時間
めに、培地を交換し次いで半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した。更に24時間後、培地を採取し次いでVI
II因子の活性をKabiコーテスト発色分析法を用いて測定
した。結果を第２表に示す。
効果 発現プラスミドpPR49およびpPR60を、リン酸カルシウ
ム法（グラーハムおよびファンデルエブ、1973年、Viro
logy52;456〜467）を用い、DNAクローニング、プラクテ
ィカルアプローチ、Vol.I＋II/IRLプレスに記載された
変法を用いCOS−７猿の細胞に移入した。（各プラスミ
ドは合計で８個の5cmの皿に移入した:37℃および27℃の
各々での発現に対して２回測定される２個の皿であっ
て、血清含有培地（10％）を有する；更に血清なしの培
地を有する同数の皿）。移入後16時間めに、培地を変換
した；半分の皿を血清なし培地に移した。移入後40時間
めに、培地を交換し次いで半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した。更に24時間後、培地を採取し次いでVI
II因子の活性をKabiコーテスト発色分析法を用いて測定
した。結果を第２表に示す。
例２ CHO細胞系統からVIII因子重鎖の収率に関する低増殖温
度および短培地帯留時間の組合せ効果 CHO（中国産ハムスターの卵巣）細胞系統DUKX−B11
（ウルラウベおよびカゼン、1980年、pNAS77;4216〜422
0）（これは、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子
内で突然変異されている）をプラスミドpSVF8−92Eおよ
便pSVF−80Kおよびジヒドロフォレートレダクターゼを
コードするプラスミドと共に同時移入した。（これらの
同時移入は米国特許出願82,989に記載されている）。
度および短培地帯留時間の組合せ効果 CHO（中国産ハムスターの卵巣）細胞系統DUKX−B11
（ウルラウベおよびカゼン、1980年、pNAS77;4216〜422
0）（これは、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子
内で突然変異されている）をプラスミドpSVF8−92Eおよ
便pSVF−80Kおよびジヒドロフォレートレダクターゼを
コードするプラスミドと共に同時移入した。（これらの
同時移入は米国特許出願82,989に記載されている）。
この方法で、クローン（10C2D2）を単離し、37℃で増
殖した場合、軽鎖（LC）よりも重鎖（HC）を10倍生産す
ることを特徴とする。
殖した場合、軽鎖（LC）よりも重鎖（HC）を10倍生産す
ることを特徴とする。
10C2D2を27℃で増殖すると、HCの収率はLCの収率に関
して見られるように劇的に上昇する（第３表）。
して見られるように劇的に上昇する（第３表）。
培地帯留時間をわずか２時間に短縮することにより、
１日当たりのHCの収率増が達成される（表４）： 例３ 10C2D2を用いる28〜30℃でのオプティセルバイオリアク
ター内でのF VIII:HCの生産 オプティセルバイオリアクター内の細胞をセラミック
スマトリックス、オプティコア上で培養し、次いで培養
培地をオプティコア内を循環させる。酸素濃度、pH、培
地供給および回収は全てシステムにより測定され更に制
御される。
１日当たりのHCの収率増が達成される（表４）： 例３ 10C2D2を用いる28〜30℃でのオプティセルバイオリアク
ター内でのF VIII:HCの生産 オプティセルバイオリアクター内の細胞をセラミック
スマトリックス、オプティコア上で培養し、次いで培養
培地をオプティコア内を循環させる。酸素濃度、pH、培
地供給および回収は全てシステムにより測定され更に制
御される。
平均培地循環時間は５時間であった（750mlの容器お
よびオプティコア内で１時間当たり/50mlの容量）。培
養液を５℃で集め次いで−80℃で24時間毎に凍結させ
た。
よびオプティコア内で１時間当たり/50mlの容量）。培
養液を５℃で集め次いで−80℃で24時間毎に凍結させ
た。
融合近くまで（酸素消費速度により測定）細胞を培養
し次いでF VIII:HCの調製に対し温度を28〜30℃に下げ
た。
し次いでF VIII:HCの調製に対し温度を28〜30℃に下げ
た。
細胞を調製温度で1000時間保持した。酸素消費速度
は、温度が37℃から30℃におよび30℃から28℃に低下す
ると2,3時間内に減少した。しかし各々の時間に酸素消
費速度は再たび徐々に増加した。かくして、細胞は1000
時間よりもより長い期間に対してさえもより低温で保持
できる。
は、温度が37℃から30℃におよび30℃から28℃に低下す
ると2,3時間内に減少した。しかし各々の時間に酸素消
費速度は再たび徐々に増加した。かくして、細胞は1000
時間よりもより長い期間に対してさえもより低温で保持
できる。
第５表に、培地組成および供給／回収量並びいくつか
の回収試料に対するF VIII:HCレベルを示す。
の回収試料に対するF VIII:HCレベルを示す。
例４ COS−７猿の細胞からVIII因子軽鎖の収率に対する低培
殖温度の効果 VIII因子軽鎖をコードするpPR77と指定される発現プ
ラスミドを例１に記載したと同様にCOS−７細胞に移入
した。プラスミドを４個の5cm皿に移入した:2個の皿に
ついて各々37℃および27℃での発現に対し２回測定し
た。培地（DMEM＋10％FCS）を移入後16時間および40時
間めに交換した（40時間で半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した）。更に24時間後、培地を集めた。第VI
II因子軽鎖の含量を例２に記載の如く測定した、結果を
第６表に示す。
殖温度の効果 VIII因子軽鎖をコードするpPR77と指定される発現プ
ラスミドを例１に記載したと同様にCOS−７細胞に移入
した。プラスミドを４個の5cm皿に移入した:2個の皿に
ついて各々37℃および27℃での発現に対し２回測定し
た。培地（DMEM＋10％FCS）を移入後16時間および40時
間めに交換した（40時間で半分の皿を27℃のインキュベ
ーターに移した）。更に24時間後、培地を集めた。第VI
II因子軽鎖の含量を例２に記載の如く測定した、結果を
第６表に示す。
例５ 第VIII因子の二種のサブユニット：重鎖および軽鎖の各
々をコードするプラスミドを移入されたCHO細胞からの
第VIII活性を有する蛋白質−錯体の収率に関する低増殖
温度の効果 DHFR（−）CHO細胞系統（G.ウルラウブ等、Proc.Nat
l.Sci.,USA 77;4216〜4220,1980）に第VIII因子の軽鎖
およびdhfr遺伝子をコードするプラスミドを先ず移入し
た。DHFR（＋）細胞を選択することにより、安定な軽鎖
生産体を単離した。この新しい細胞系統に、第VIII因子
の重鎖（およびdhfr遺伝子）をコードするプラスミドお
よびネオ遺伝子をコードするプラスミド（pSV2neo;P.J.
サザンおよびP.ベルク、Journal of Molecular and App
lied Genetics １;327〜341,1982）を同時移入した。移
入体を1ml当たり700μｇのゲネチシン（G418 Sulphate,
Gibco）を含有する培地中で単離した。第一のプールか
らの細胞を、0.1μＭのMTXを含有する培地内に直接増殖
させた。２つのＴ−80フラスコ（フラスコＡおよびフラ
スコＢ）内でこのようにして単離した細胞に播種した。
融合の際、培地（DMEK＋10％DFCS＋700μｇゲネチシン/
ml＋0.1μM MTX）を交換し（10ml）次いでフラスコを37
℃で24時間インキュベートし、しかる後培地試料を集め
た。
々をコードするプラスミドを移入されたCHO細胞からの
第VIII活性を有する蛋白質−錯体の収率に関する低増殖
温度の効果 DHFR（−）CHO細胞系統（G.ウルラウブ等、Proc.Nat
l.Sci.,USA 77;4216〜4220,1980）に第VIII因子の軽鎖
およびdhfr遺伝子をコードするプラスミドを先ず移入し
た。DHFR（＋）細胞を選択することにより、安定な軽鎖
生産体を単離した。この新しい細胞系統に、第VIII因子
の重鎖（およびdhfr遺伝子）をコードするプラスミドお
よびネオ遺伝子をコードするプラスミド（pSV2neo;P.J.
サザンおよびP.ベルク、Journal of Molecular and App
lied Genetics １;327〜341,1982）を同時移入した。移
入体を1ml当たり700μｇのゲネチシン（G418 Sulphate,
Gibco）を含有する培地中で単離した。第一のプールか
らの細胞を、0.1μＭのMTXを含有する培地内に直接増殖
させた。２つのＴ−80フラスコ（フラスコＡおよびフラ
スコＢ）内でこのようにして単離した細胞に播種した。
融合の際、培地（DMEK＋10％DFCS＋700μｇゲネチシン/
ml＋0.1μM MTX）を交換し（10ml）次いでフラスコを37
℃で24時間インキュベートし、しかる後培地試料を集め
た。
培地を新たにし次いでフラスコＢを27℃のインキュベ
ーターに移した。再たび、フラスコを24時間インキュベ
ートし、引き続き培地試料を集め更に培地を新たにし
た。この手順を更に２日間くりかえした（フラスコＡは
未だ37℃であり、フラスコＢも未だ27℃であった）。第
VIII因子の活性をカビ（kabi）コーテスト発色分析法に
より測定した。結果を第７表に示す。
ーターに移した。再たび、フラスコを24時間インキュベ
ートし、引き続き培地試料を集め更に培地を新たにし
た。この手順を更に２日間くりかえした（フラスコＡは
未だ37℃であり、フラスコＢも未だ27℃であった）。第
VIII因子の活性をカビ（kabi）コーテスト発色分析法に
より測定した。結果を第７表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/02 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】F VIIIを産生する哺乳類細胞のインビトロ
培養によるF VIII活性を有する蛋白質および／又はF VI
II誘導体の生産方法であって、該培養を25〜30℃の温度
で行うことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記温度が27℃である、請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項３】生産されるF VIII誘導体が92.5KDフラグメ
ント又は重鎖である、請求の範囲第１項又は第２項に記
載の方法。 - 【請求項４】生産されるF VIII誘導体が80KDフラグメン
ト又は軽鎖である、請求の範囲第１項又は第２項に記載
の方法。 - 【請求項５】生成物が、F VIIIの２つのサブユニット、
すなわち重鎖および軽鎖の各々をコードするプラスミド
が移入された細胞から得られるF VIII活性を有する蛋白
質−複合体である、請求の範囲第１項又は第２項に記載
の方法。 - 【請求項６】用いた哺乳類細胞が、COS細胞、CHO細胞又
はBHK細胞である、請求の範囲第１〜５項のいずれかに
記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/DK1989/000168 WO1991000347A1 (en) | 1989-07-04 | 1989-07-04 | Method of producing proteins with fviii activity and/or fviii derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506448A JPH04506448A (ja) | 1992-11-12 |
| JP2810744B2 true JP2810744B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=8153554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1507715A Expired - Lifetime JP2810744B2 (ja) | 1989-07-04 | 1989-07-04 | Ｆ▲ｖｉｉｉ▼活性を有する蛋白質および／またはｆ▲ｖｉｉｉ▼誘導体の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0480923B1 (ja) |
| JP (1) | JP2810744B2 (ja) |
| FI (1) | FI94148C (ja) |
| NO (1) | NO300428B1 (ja) |
| WO (1) | WO1991000347A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4306813B2 (ja) | 1995-09-19 | 2009-08-05 | アスビオファーマ株式会社 | 動物細胞の新規培養方法 |
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