FI94148B - Menetelmä tuottaa proteiineja, joissa on FVIII-aktiivisuutta ja/tai FVIII-johdannaisia - Google Patents

Description

941 48

Menetelmä tuottaa proteiineja, joissa on FVIII-aktiivisuut-ta ja/tai FVIII-johdannaisia - Metod för produktion av pro-teiner med FVIII aktivitet och/eller FVIII derivat 5 Tämä keksintö koskee menetelmää tuottaa proteiineja, joissa on FVIII-aktiivisuutta ja/tai FVIII-johdannaisia, nisäkäs-solujen in vitro viljelmällä.

Verenvuodon häiriö Hemofilia A aiheutuu faktori VIII:n 10 (FVIII) puuttumisesta. FVIII on glykoproteiini, jota voidaan eristää veriplasmasta (US. nr. 4650858). Puhdistettua FVIIIraa käytetään Hemofilia A:n käsittelyyn. Käyttämällä geeniteknologiaa on mahdollista syntetisoida FVIII (EPO 160457, WO 85/01961, US 570062). FVIII:n määrä, joka voi-15 daan tuottaa nisäkässoluissa, on melko alhainen verrattuna muihin ihmisen proteiineihin. Proteiinin määrää voidaan lisätä, jos FVIII:n lyhennettyjä muunnelmia syntetisoidaan biologisesti (WO 86/06101, DK 3442/87) tai, jos kaksi a-layksikköä (FVIII raskas ketju ja FVIII kevyt ketju) tuote-20 taan yhdessä (US 822989). On myös mahdollista yhdistää in vitro aktiivinen FVIII erikseen tuotetuista alayksiköistä (DK 2957/86). Kaikilla edellä mainituilla FVIII-muodoilla on ihmisen FVIIIin luonteenominaisuudet: aktiivisuutta bio-määrityksissä, voidaan aktivoida trombiinilla ja biologista 25 aktiivisuutta hemofiliakoirissa.

« <

Nisäkkäitä voidaan osittain kuvata niiden kyvyllä pitää va-kioruumiinlämpötilaa lähellä 37*C:ta. Siksi nisäkässoluja yleensä kasvatetaan in vitro 37*C:ssa. FVIII kiertää kehossa 30 tuossa lämpötilassa ja kasvattamalla seerumia sisältävässä alustassa (joka matkii kehon nestettä) voidaan odottaa, että FVIII:llä on optimaalinen stabiilisuus. Seerumivapaassa alustassa tuotettu FVIII on melko epästabiili, mutta siitä huolimatta on houkuttelevaa poistaa seerumi alustasta ja WO 35 87/04187 osoittaa, että FVIII voidaan stabiloida seerumiva

paassa alustassa lisäämällä kantajaproteiinia, jolla on Willebrand-faktori (vWF). DK 3594/87 osoittaa, että FVIII

94148 2 voidaan myös stabiloida seerumivapaassa alustassa lisäämällä lipoproteiineja. Näillä stabiloivilla aineilla ei ole mainittavaa vaikutusta seerumia sisältävässä alustassa.

5 Yllättäen on havittu, että kasvattamalla nisäkässoluja lämpötiloissa, jotka ovat alle 37’C, tarkemmin alle 33*C, lyhennettyjen FVIII-muunnelmien ja FVIII:sta saatujen alayksiköiden (etenkin FVIII raskas ketju) saannot, lisääntyvät drastisesti, sekä alustassa, jossa on seerumia että seeru-10 mivapaassa alustassa.

Kasvatus on edullista suorittaa lämpötilassa 10-32‘C, edullisemmin lämpötilassa 25-30‘c ja edullisimmin 27*C:ssa.

15 Lisäksi yllättäen on ilmennyt, että saannot lisääntyvät lyhentämällä alustassa oloaikaa alle tavallisen 24-72 h, joka tavallisesti antaa optimaaliset saannot nisäkässoluista.

On edullista käyttää 30 h tai alle alustassa oloaikaa, e-20 dullisemmin 24 h tai alle, jopa edullisemmin 10 h tai alle ja edullisimmin alle 4 h.

Alhaisen kasvatuslämpötilan ja lyhyen alustassa oloajan yhdistetty vaikutus on erityisen ilmeinen FVIII raskaan ket-25 jun tapauksessa, jolloin saantoa voidaan nostaa 25 kertai- ” sesti.

FVIII raskaan ketjun (HC) kasvanut saanto alhaisessa lämpötilassa ja lyhyessä alustassa oloaikana voi kuulua lähei-30 sesti yhteen tuotteen epästabiilisuuteen normaaleissa kas vatusolosuhteissa. Taulukko 1 osoittaa, että FVIII raskas ketju 37*C:ssa menettää kykynsä yhtyä FVIII:n kevyen ketjun kanssa. Kuvio 1 osoittaa, että FVIII raskas ketju muodostaa aggregaatteja 37'C:ssa. Nämä aggregaatit voidaan liuottaa 35 pelkistämisen jälkeen. FVIII lyhennetyt muunnelmat voivat käyttäytyä kuten FVIII-HC ja muodostaa aggregaatteja korkeassa lämpötilassa. Kohonneen saannon alhaisessa lämpöti- >1 3 94148 lassa voi kuitenkin aiheuttaa myös muut tekijät kuin aggre-gaation väheneminen. Esimerkiksi suurempi resistenssi pro-teolyyttistä hajotusta vastaan saattaisi olla tärkeä.

5 Edullisiin isäntäsoluihin kuuluvat nisäkässolut, kuten CHO-solut, COS-7 apinan solut, melanoomasolulinjät, kuten Bowes-solut, hiiren L-929-solujen 3T3-linjat, Balb-c- tai NIH-hiiret, BHK- tai HAK-hamsterisolulinjät ja sen kaltaiset.

10

Esimerkit osoittavat, että lyhennettyjen FVIII-muunnelmien, FVIII raskaan ketjun, FVIII kevyen ketjun ja FVIII:n, joka on saatu soluista, jotka on transfektoitu samanaikaisesti plasmideilla, jotka koodaavat jokaista kahta alayksikköä, 15 saannot lisääntyvät alhaisessa lämpötilassa.

Taulukko 1 20 Rivi FVIII-HC-näytteen SDS-PAGE- Laimennetun näytteen inkubaatio käsittely FVIII:C mU/ml (kuvio 1) yhtymiskyky 25 5 Oh, 37'C pelkistetty

6 4 h, 37'C

7 26 h, 37'C

·.. 30 8 Oh, 37'C ei-pelkist. 10,4 9 4 h, 37'C - 4,0 10 26 h, 37'C - <0,5 35 11 26 h, 22'C ei-pelkist. 8,3 12 4 h, 22'C - 8,6 13 0 h, 22'C - 10,6 40 14 26 h, 22'C pelkistetty

15 4 h, 22'C

16 0 h, 22'C

45 19 MP-markkerit 94148 4

Plasma, joka saatiin FVIII-HC:stä (300 U/ml), laimennettiin 4-kertaisesti 0,05 % BSAissa, 50 mM trisissä, 0,1 M NaCl: ssä, 0,02 % NaN,:ssa, 150 μΜ 2-ME:ssä, pH 7,4 ja inkuboitiin 22'C:ssa ja 37‘Cissa. t=0, 4, 24 h näytteet jäädytettiin 5 -80'Cissa. Näytteet sulatettiin ja analysoitiin (keittämättä) pelkistettynä ja ei-pelkistettynä Western blotissa. Lisäksi näytteet laimennettiin 300-kertaisesti ja yhtyminen FVIII-LC:hen testattiin (WO 88/00210).

10 Keksintöä selitetään lisää viittaamalla piirroksiin, joissa kuvio 1 osoittaa FVIII-HC:n Western biotin, joka on inku-boitu 22'C:ssa ja 37*C:ssa (näytteet ovat samat kuin taulukossa 1) .

15 Plasmidien kuvaus

Plasmidi Kuvaus pPR49 cDNA, joka koodaa faktori VIII muunnosta, josta on deletoitu 880 aminohappoa B-alueelta (muunnos on identtinen pLA-2-plasroidin koo- 20 daaman muunnoksen kanssa PTC-patenttihake- muksessa, julkaisunr. W0 86/06101), on inser-toitu ekspressiovektoriin pSV7d (Truett et ai., 1985, DNA 4; 333-349).

pPR60 cDNA, joka koodaa faktori VIII muunnosta, 25 jossa Arg-740 on fuusioitu suoraan Ser-1690: een, on insertoitu pSV7d:hen. pSVF8-92E cDNA, joka koodaa faktori Villistä saatua 92 kD peptidiä (raskas ketju), on insertoitu pSV7d:hen.

30 pSVF8-80K cDNA, joka koodaa faktori Villistä saatua 80 kD peptidiä (kevyt ketju), on insertoitu pSV7d:hen.

• ·

II

5 94148

Esimerkki 1

Kasvatuslämpötilan vaikutus proteiinien, joissa on faktori VIII-aktiivisuutta. saantoon 5

Ekspressioplasmidit pPR49 ja pPR60 transfektoitiin COS-7 apinan soluihin (Gluzman, 1981, Cell 23: 175-182) käyttämällä kalsiumfosfaattitekniikkaa (Graham ja van der Eb, 1973, Virology 52; 456-467) muunnelmin, jotka on kuvattu: 10 DNA Cloning, a Practical Approach, Voi. I+II/IRL Press.

(Jokainen plasmidi transfektoitiin yhteensä kahdeksaan 5 cm maljaan: 2 kertaa 2 maljaa tarkoitettu ekspressoimaan 37*C:ssa ja 27*C:ssa, vastaavasti, seerumia sisältävässä alustassa (10 %) ja sama määrä maljoja seerumivapaassa a-15 lustassa). 16 h transfektion jälkeen alustat vaihdettiin; puolet maljoista siirrettiin seerumivapaaseen alustaan. 40 h transfektion jälkeen alustat vaihdettiin; puolet maljoista siirrettiin 27'C:een inkubaattoriin. Vielä 24 h kuluttua alustat kerättiin ja faktori VIII-aktiivisuus määritettiin 20 käyttämällä Kabi coatest kromogeenistä määritysmenetelmää. Tulokset on luetteloitu taulukossa 2:

Taulukko 2 25

Plasmidi Lämpöt. Kromogeeninen aktiivisuus (mU/ml/d) ·. (*C) + seerumi - seerumi 30 pPR49 37 1023 277 ,, 37 1028 248 ,, 27 1862 1051 , , 27 1695 977 35 pPR60 37 89 >138 , , 37 104 >138 ,, 27 336 387 , , 27 322 401 40 ____ 6 941 48

Esimerkki 2

Alhaisen kasvatuslämpötilan ja lyhyen alustassa oloajan yhdistetty vaikutus CHO-solulinian faktori VIII raskaan 5 ketjun saantoon CHO- (Chinese Hamster Ovary) solulinja DUKX-B11, Urlaub ja Chasin, 1980, PNAS 77; 4216-4220), joka oli mutagenisoitu dihydrofolaattireduktaasigeenistä, transfektoitiin yhdessä 10 plasmidin pSVF8-92E:n ja pSVF8-80K:n kanssa plus dihydrofo-laattireduktaasia koodaava plasmidi. (Nämä yhteis-transfek-tiot kuvataan US patenttihakemuksessa nr. 82989).

Tällöin eristettiin klooni (10C2D2), joka on luonnehdittu 15 tuottamaan 10-kertaisesti enemmän raskasta ketjua (HC) kuin kevyttä ketjua (LC), kun sitä kasvatetaan 37'C:ssa. Kun 10C2D2 kasvatetaan 27*C:ssa, kohoaa HC:n saanto dramaattisesti nähtynä suhteessa LC:n saantoon (katso taulukko 3).

20 Taulukko 3 Lämpöt. Kasvatus- Alustan til./T-80- HC:Ag* LC:Ag* 25 (*C) aika (h) pullo (ml) (U/ml) (U/ml) 37 24 Ϊ0 372 0,36 27 24 10 18,4 0,28 t · ‘ 30 * HC:Ag ja LC:Ag mitattiin spesifisillä immunomäärityksil-lä (Nordfang et ai., 1988, Br. J. Haematol. 68; 307-312; Nordfang et ai., 1985, Thromb. Haemostas. 53:346-350).

35 Lyhentämällä alustassa oloaikaa vain 2 h saadaan suurempi HC-saanto päivää kohti (taulukko 4):

II

7 94148

Taulukko 4 5 Lämpöt. Kasvatus- Alustan til./T-80- HC:Ag LC:Ag ('O aika (h) pullo (ml) (U/ml) (U/ml/d) 37 24 1Ö 3T2 3T2 10 27 24 10 18,4 18,4 27 2 10 7,5 90 27 2 3 24,0 288 15

Esimerkki 3 FVIII:HC:n tuotto Opticell bioreaktorissa 28-30*C:ssa 10C2-D2:11a 20 Soluja kasvatetaan Opticell bioreaktorissa keraamisella matriisilla, Opticore, ja kasvatusalustaa kierrätetään Opticoren läpi. Systeemi mittaa ja kontrolloi happipitoisuuden, pH:n, alustan syötön ja keräyksen.

25 Keskimääräinen alustan kierrätysaika oli 5 h (150 ml/h tilavuus säiliössä + Opticore 750 ml). Solut kerättiin 5*C:ssa ja jäädytettiin joka 24 h -80'C:ssa.

Soluja kasvatettiin 37*C:ssa, kunnes melkein yhdessä (mitat-30 tu hapenkulutusnopeudesta) ja lämpötilaa alennettiin 28-30’C:een FVIII:HC:n tuottamiseksi.

Soluja pidettiin tuottolämpötilassa 1000 h. Hapenkulutusno-peus laski muutamassa tunnissa, kun lämpötilaa alennettiin 35 37'C:sta 30'C:een ja 30*C:sta 28*C:een, mutta joka kerta hapenkulutusnopeus kasvoi asteittain jälleen. Täten soluja voitiin pitää alemmassa lämpötilassa jopa pidempään kuin 1000 h.

40 Taulukossa 5 on osoitettu alustan koostumus ja syöttö/ke- räystilavuudet samoin kuin FVIII:HC-tasot joillekin keräys-näytteille.

8 94148

Taulukko 5 5 "

h lämpötila- Alusta Syöttö/ FVIII:HC FVIII:HC

muutoksen keräys U/ml U/d jälkeen ml/h

28-30‘C

10 __ DMEH +

1 % ITS

408 + 2 % FCS 100 15,1 36240 432 + 2 % FCS 150 10,9 39240 15 456 + 2 % NCS 150 11,0 39600 20 Esimerkki 4

Alhaisen kasvatuslämpötilan vaikutus COS-7 apinan solujen faktori VIII kevyen ketjun saantoon

Ekspressioplasmidi, jota merkitään pPR77, joka koodaa fak-25 tori VIII kevyttä ketjua, transfektoitiin COS-7-soluihin samalla lailla kuin esimerkissä 1 on kuvattu. Plasmidi transfektoitiin neljään 5 cm maljaan: 2 kertaa 2 maljaa tarkoitettu ekspressoimaan 37*C:ssa ja 27'C:ssa, vastaavasti. Alustat (DMEM + 10 % FCS) vaihdettiin 16 ja 40 h trans-30 fektion jälkeen (40 h:ssa puolet maljoista siirrettiin 27^:ββη inkubaattoriin). Alustaa kerättiin vielä 24 h. Faktori VIII kevyen ketjun sisältö määritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Tulokset on annettu taulukossa 6.

35 Taulukko 6 Lämpöt. (*C) LC:Ag (U/ml/d) 40 ___ 37 0,33 37 0,30 27 1,25 45 27 0,85

II

9 94148

Esimerkki 5

Alhaisen kasvatuslämpötilan vaikutus proteiinikompleksiin, jossa on faktori VIII-aktiivisuutta CHO-soluista, jotka on 5 transfektoitu plasmideilla, jotka koodaavat kumpaakin faktorin VIII kahta alayksikköä: raskasta ketjua ja kevyttä ketjua, saantoon DHFR(-) CHO-solulinja DG44 {cf. G. Urlaub et ai., Proc.

10 Natl. Sei., USA 77: 4216-4220, 1980) transfektoitiin ensin plasmidilla, joka koodaa faktorin VIII kevyttä ketjua ja dhfr-geeniä. Selektoimalla DHFR(+)-solut eristettiin stabiili kevyen ketjun tuottaja. Tämä uusi solulinja transfek-toitiin samanaikaisesti plasmidilla, joka koodaa faktorin 15 VIII raskasta ketjua (ja dhfr-geeniä) ja plasmidilla, joka koodaa neo-geeniä (pSV2neo; P.J. Southern ja P. Berg, Journal of Molecular and Applied Genetics 1; 327-342, 1982). Transfektantit eristettiin alustasta, jossa oli 700 pg genetisiiniä/ml (G418 sulfaatti, Gibco). Solut ensimmäi-20 sestä keräyksestä lisättiin suoraan alustaan, jossa oli 0,1 pM MTX:ää. Tällä tavoin eristetyt solut ympättiin T-80-pulloihin, joita kutsuttiin A ja B. Kun solut olivat yhtyneet, alustat (DMEM + 10 % DFCS + 700 pg genetisiini/ml + 0,1 pM MTX) vaihdettiin (10 ml) ja pulloja inkuboitiin 24 h 25 37*C:ssa, jonka jälkeen kerättiin näytteet. Alustat uudis- “ tettiin ja B-pullo siirrettiin 27'C:een inkubaattoriin. Pul loja inkuboitiin jälleen 24 h, jonka jälkeen alustanäyt-teet kerättiin ja alustat uusittiin. Tätä menettelytapaa toistettiin vielä kaksi päivää (A-pullo vielä 37'C:ssa ja B-30 pullo vielä 27*C:ssa). Faktori VIII-aktiivisuus määritettiin Kabi coatest kromogeenisellä määritysmenetelmällä. Tulokset on annettu taulukossa 7.

94148 10

Taulukko 7 5 d Lämpöt. (*C) Kromogeeninen aktiivisuus (U/ml/d) 10 Pullo A: 1 37 0,42 2 37 0,77 3 37 0,84 4 37 1,0 15 Pullo B: 1 37 0,50 2 27 1,20 3 27 1,72 4 27 3,2 20

II

Claims (7)

1. 94148
2. 1. Menetelmä proteiinien, joissa on FVIII-aktiivisuutta ja/tai FVIII-johdannaisia, tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan in vitro nisäkässoluja alle 33°C:n lämpötilassa. 5
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on 25-30°C.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että lämpötila on 27°C.
5. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotettu FVIII-johdannainen on 92,5 kD fragmentti tai "raskas ketju". 15
6. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotettu FVIII-johdannainen on 80 kD fragmentti tai "kevyt ketju". '20 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu tuote on proteiinikompleksi, jossa on FVIII-aktiivisuutta, joka on saatu soluista, jotka on transfektoitu plasmideilla, jotka koodaavat kumpaakin FVIII:n alayksikköä: raskasta ketjua ja kevyttä ketjua. 25
7. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetyt nisäkässolut ovat COS-soluja, CHO-soluja tai BHK-soluja. 941 48